CN105749272A

CN105749272A - 表达大熊猫犬瘟热病毒h、f基因重组山羊痘病毒的疫苗、其制备方法及免疫应用方法

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Publication number: CN105749272A
Application number: CN201610130651.1A
Authority: CN
Inventors: 陈武; 程松; 罗满林; 郑敏; 黄勉; 吴其锐; 彭仕明; 单芬; 李婉萍; 张晓明; 植广林; 张马龙; 陈绚姣; 党楠楠; 梁玉珍; 左珂菁; 李少基
Original assignee: GUANGZHOU ZOO
Current assignee: GUANGZHOU ZOO
Priority date: 2016-03-08
Filing date: 2016-03-08
Publication date: 2016-07-13
Anticipated expiration: 2036-03-08
Also published as: CN105749272B

Abstract

本发明公开了一种表达大熊猫犬瘟热病毒H或F基因重组山羊痘病毒的疫苗，疫苗中含有以山羊痘病毒为载体，分别转染表达大熊猫犬瘟热病毒H或F基因的重组转移载体质粒pTKHEg或pTKFEg而获得的重组山羊痘病毒vpTKHEg或vpTKFEg，其中重组山羊痘病毒vpTKHEg包含如序列表SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，重组山羊痘病毒vpTKFEg包含如序列表SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。本发明所研制的疫苗具有安全、高效、生产成本低廉等优点，为犬瘟热的防制奠定基础。

Description

表达大熊猫犬瘟热病毒H、F基因重组山羊痘病毒的疫苗、其制备方法及免疫应用方法

技术领域

本发明涉及重组病毒技术领域，尤其涉及表达大熊猫犬瘟热病毒H、F基因重组山羊痘病毒的构建技术领域。

背景技术

犬瘟热(Canine Distemper,CD)是由犬瘟热病毒(Canine Distemper Virus,CDV)引起的是一种急性、高度接触性传染病。CDV是负链单股不分节的RNA，属于副黏病毒科、麻疹病毒属成员，经常引起犬科、鼬科、浣熊科及猫科等多种动物发病，发病率几乎可以达到100％，其临床症状多样，极易继发细菌、病毒感染或二次感染经济损失惨重，死亡率可高达80％，素有“毁灭性传染病”之称。近年来，CD的宿主范围不断地扩大，己经延伸到大熊猫、日本猕猴和部分海洋哺乳动物，甚至人也有感染CDV的报道^[2]，Mee等从患Hagets病人的组织中检测出CDV核酸。CDV极有可能成为第二种由犬感染人的病毒，因此引起了动物学界和医学界的密切关注。CDV对大熊猫、小熊猫也具高度感染性，已成为威胁大熊猫、小熊猫种群数量和生命安全的第一大烈性传染病。

犬瘟热病毒为有囊膜的单股、负链、不分节段的RNA病毒,全长15,616个核苷酸，从3’到5’依次为3’前导序列、核蛋白基因(N)、磷蛋白基因(P)、基质蛋白基因(M)、融合蛋白基因(F)、附着或血凝蛋白基因(H)、大L蛋白基因(L)和5’导序列。最新研究表明CDV囊膜两个糖蛋白质(H，F)是宿主免疫系统的主要目的抗原，是产生中和抗体的重要抗原之一。H蛋白基因由1947个核糖核苷酸组成，位于病毒基因组的7053-8999nt处，是CDV与细胞受体结合的蛋白，决定了病毒的细胞嗜性，同时介导了机体内重要的抗病毒免疫应答。系统发生树分析表明在麻疹病毒属的所有结构蛋白中H蛋白是各种毒株变异性最高的基因。目前分析认为，CDV的基因型与地理位置有关。新分离的CDV H蛋白的变异可能是近来暴发CD的重要原因。F蛋白基因位于基因组的4845-7049nt处，F蛋白功能为直接与细胞膜作用，从而诱导细胞膜融合。融合序列在麻疹病毒属中是相当保守的，该序列可能与病毒间出现的交叉保护现象有关。F蛋白诱导的免疫反应能阻止病毒感染，并且在有病毒增殖的情况下抑制症状的发生。在麻疹病毒成员中，CDV，MV和RPV群特异性表位主要是在F蛋白上，为异型免疫的主要交叉抗原。此外，在犬瘟热病毒F蛋白上存在着两个重要的辅助性T淋巴细胞表位，此辅助性T细胞表位可能是犬抗原提呈细胞(APCs)最优先识别和提呈的位点。因此，H、F蛋白在犬瘟热的免疫预防起着重要作用。

目前，预防CD的疫苗包括灭活苗、MV异型免疫疫苗、弱毒疫苗。虽然灭活苗和弱毒疫苗在控制犬瘟热上有一定作用，但随着使用的广泛，也出现了很多不足，灭活苗免疫效果低、抗体水平低等缺点；MV疫苗不能提供持久的免疫力；目前，主要使用弱毒苗，弱毒苗可引起免疫抑制和中枢神经系统的损坏，随着犬瘟热病毒宿主谱日趋扩大，弱毒疫苗可能会导致某些易感动物致死并带来毒力返强的危险，受母源抗体影响等。此外，病毒自身的变异也可能导致疫病的流行，因此研制出持久高效的、安全的、实用的新型疫苗疫苗迫在眉切，重组活载体疫苗是近年来研究比较热的新型疫苗，在犬瘟热的免疫与防方面取得很大进展。

由于CDV的感染呈世界性分布，并且可在大量的不相关的动物种族中进行种间传播，从目前的技术和方法上，消灭CD是不可能的。目前，预防CD的疫苗包括灭活苗、MV异型免疫疫苗、弱毒疫苗。此外，人们已开始使用新技术研制新型疫苗，包括基因工程亚单位苗、重组活载体疫苗以及基因工程疫苗等。目前国内外在犬瘟热重组疫苗中使用的载体主要是痘病毒和腺病毒载体。痘病毒载体由于可以感染非分裂期细胞，容纳外源性目的基因片段大，免疫反应小等特点越来越受到人们的重视，因此选用山羊痘病毒载体作为基因重组疫苗构建的新载体具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于开发研制出更加安全、高效的、生产成本低廉的新型犬瘟热基因重组疫苗，为犬瘟热的防制奠定基础。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种表达大熊猫犬瘟热病毒H或F基因重组山羊痘病毒的疫苗，疫苗中含有以山羊痘病毒为载体，分别转染表达大熊猫犬瘟热病毒H或F基因的重组转移载体质粒pTK-H-Eg或pTK-F-Eg而获得的重组山羊痘病毒vpTK-H-Eg或vpTK-F-Eg，其中重组山羊痘病毒vpTK-H-Eg包含如序列表SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，重组山羊痘病毒vpTK-F-Eg包含如序列表SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

大熊猫犬瘟热病毒H基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，大熊猫犬瘟热病毒F基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

一种制备如上任一所述的疫苗的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)扩增出大熊猫犬瘟热病毒H基因序列和F基因序列，对其抗原保守结构和识别区域进行修饰，克隆入PUC57载体获得含H、F基因的PUC57-H，PUC57-F载体，PUC57-H的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，PUC57-F的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；

(2)构建转移载体骨架pMDTK-PEL:首先用限制性内切酶EcoR I消化pMDTK-PEL-EGFP，回收大片段再补平，接着用限制性内切酶Sma I消化，回收3480bp的pMDTK-PEL片段，然后用T4连接酶连接，使其自身环化，获得转移载体质粒pMDTK-PEL，将其转化到DH5a，测序正确，转移载体质粒命名为pMDTK-PEL；

(3)构建重组转移载体质粒pMDTK-PELH与pMDTK-PELF:

用BamHI与NotI内切酶消化pMDTK-pEL获得线性载体，回收大片段；同时用BamHI与NotI内切酶消化PUC57-H，回收小片段目的基因；将回收的目的基因与载体通过T4DNA连接酶连接，然后转化，摇菌，经菌液PCR、双酶切、测序鉴定正确，命名为pMDTK-PELH；

用BamHI与NotI内切酶消化pMDTK-PEL获得载体，回收大片段；同时用BamHI与NotI内切酶消化PUC57-F,回收小片段目的基因；将回收的目的基因与载体通过T4DNA连接酶连接，然后转化，摇菌，经菌液PCR、双酶切、测序鉴定正确，命名为pMDTK-PELF；

(4)构建转移载体质粒pTK-H-Eg和pTK-F-Eg:

用限制性内切酶Sal I分别消化pMDTK-PELH及pMDTK-PELF,用补平酶Klenow Fragment消化回收的pMDTK-PELH与pMDTK-PELF，用限制性内切酶Sac I消化重组转移载体质粒pMDTK-PELH与pMDTK-PELF补平后的回收产物，获得转移载体质粒pTK-H-Eg和pTK-F-Eg，氨基酸序列分别如序列表SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2所示；

(5)制备及培养原代犊牛睾丸细胞并使用于GTPV AV41的增殖；

(6)制备重组GTPV,将步骤(4)获得的转移载体质粒pTK-H-Eg和pTK-F-Eg接毒感染GTPV,筛选并纯化，获得重组病毒vpTK-H-Eg和vpTK-F-Eg。

进一步地，步骤(2)包括：

1)用限制性内切酶EcoR I消化pMDTK-PEL-EGFP，回收大片断；

2)用补平酶Klenow Fragment消化所回收的大片断；

3)用限制性内切酶Sam I消化步骤2)中的产物并回收3480bp的pMDTK-PEL片断；

4)采用T4DNA连接酶使pMDTK-PEL自身环化连接；

5)制备DH5α感受态细胞；

6)步骤4)所得到的环化连接产物转化DH5α感受态细胞，经培养得到重组的转移载体骨架pMDTK-PEL。

本发明还提供了一种由上述方法所制得的重组病毒vpTK-H-Eg和vpTK-F-Eg用作犬瘟热弱毒疫苗的免疫方法。

所述免疫方法采用肌肉免疫方式，初次免疫第四周后进行加强免疫。

本发明是在前期扩增出大熊猫犬瘟热病毒H基因序列和F基因序列，并对其抗原保守结构和识别区域进行修饰，成功克隆入PUC57载体上进行的，获得含H、F基因PUC57-H，PUC57-F载体后，以山羊痘病毒为载体，构建表达大熊猫犬瘟热病毒H、F基因重组山羊痘病毒，通过细胞水平和动物模型的检测，研究其成为新型高效的犬瘟热疫苗的可能性。

实验结果显示，本发明具有如下优点：

1.山羊痘病毒载体由于可以感染非分裂期细胞，容纳外源性目的基因片段大，免疫反应小等特点，越来越受到人们的重视。其主要具有如下优点：1)羊痘病毒载体仅能产生一过性流产性复制，且复制在胞浆内进行，对接种动物非常安全；2)外源基因整合及表达的效率高；3)痘病毒载体具有容纳外源性目的基因片段大等优点。因此我们选用羊痘病毒载体作为我们基因重组疫苗构建的新载体，通过检索未发现世界曾有文献报道。

2.由于CDV的变异以及传统的疫苗对野生动物的保护性不强，导致免疫效果不理想，在前期实验中扩增出大熊猫犬瘟热病毒H基因序列和F基因序列，通过生物学软件进行序列比对分析，对其抗原保守结构和识别区域进行修饰，增强其免疫效果和免疫能力，并将其分别成功克隆入PUC57载体上；最后将含有H基因与F基因的表达盒通过同源重组的方法分别构建到山羊痘病毒载体中，通过细胞水平和动物模型检测其成为新型高效的犬瘟热疫苗的可能性。

3.以山羊痘病毒作为载体表达外源基因能够最大程度接近编码蛋白的天然状态，保持蛋白的抗原性，并且具有较高的表达效率；GTPV活载体疫苗不需佐剂即可免疫动物，诱导机体产生比较广泛的免疫，包括细胞免疫、体液免疫和局部黏膜免疫，是所有疫苗形式中最为理想的免疫方式，是当今与未来疫苗研制与开发的主要方向之一。

4.由于GTPV活载体疫苗在其他哺乳动物中为一过性感染不能进行有效的复制，具有宿主限制性，不会造成病毒在免疫个体中或未免疫群体及整个环境的交差传播，具有很高的安全性。

附图说明

图1是重组转移载体质粒pTK-H-Eg的构建流程图。

图2是重组转移载体质粒pTK-F-Eg的构建流程图。

图3是转移载体pMDTK-PEL-EGFP的EcoRI酶切图。M：DNA Marker DL5000；1：pMDTK-PEL-EGFP单酶切产物。

图4是转移载体pMDTK-pEL-EGFP的EcoRI、SmaI酶切图。M：DNA Marker DL5000；1-2：pMDTK-PEL-EGFP双酶切产物。

图5是重组转移载体pMDTK-PELH的PCR鉴定图。M：DNA Marker DL2000；M：DNAMarker DL2000；

1：阴性对照；2-3：H基因的PCR产物。

图6是重组转移载体pMDTK-PELF的PCR鉴定图。1：阴性对照；2-3：F基因的PCR产物。

图7是重组转移载体pMDTK-PELH的HindIII酶切图。M：DNA Marker DL5000；1-2：pMDTK-PELH单酶切产物。

图8是重组转移载体pMDTK-PELH的HindIII、SacI酶切图。M：DNA Marker DL5000；1-2：pMDTK-PELH双酶切产物。

图9是重组转移载体pTK-Eg的SmaI、SacI双酶切图。M：DNA Marker DL5000；1-2：pTK-Eg双酶切产物。

图10是重组转移载体pTK-H-Eg的H与EGFP基因的鉴定图。1、5：阴性对照；2-4：EGFP基因的PCR产物；6-8：H基因的PCR产物；M：DNA Marker DL2000。

图11是重组转移载体pMDTK-PELF的SalI酶切图。M：DNA Marker DL5000；1-2：pMDTK-PELF单酶切产物。

图12是重组转移载体pMDTK-PELF的SalI、SacI酶切图。M：DNA Marker DL5000；1-2：pMDTK-PELF双酶切产物。

图13是重组转移载体pTK-Eg的SmaI、SacI双酶切图。M：DNAMarker DL5000；1-2：pTK-Eg双酶切产物。

图14是重组转移载体pTK-F-Eg的F与EGFP基因的鉴定图。1、5：阴性对照；2-4：EGFP基因的PCR产物；6-8：F基因的PCR产物；M：DNA Marker DL2000。

图15是重组质粒pTK-H-Eg转染BHK细胞96h后的绿色荧光图，A为AV41与pTK-H-Eg共转染96h后的图，B为明场下的对照。

图16是重组质粒pTK-F-Eg转染BHK细胞96h后的绿色荧光图，C：AV41与pTK-F-Eg共转染96h后的图；D为明场下的对照。

图17是Vero细胞中重组病毒vpTK-H-Eg的第5轮筛选图。

图18是Vero细胞中重组病毒vpTK-H-Eg的第10轮筛选图。

图19是Vero细胞中重组病毒vpTK-F-Eg的第5轮筛选图。

图20是Vero细胞中重组病毒vpTK-F-Eg的第10轮筛选图。

图21是重组病毒vpTK-H-Eg PCR的鉴定结果，M：DNA Marker DL2000；1、3、5、7：TK基因引物扩增第1、5、10轮vpTK-H-Eg，筛选产物；2、4、6、8：EGFP基因引物扩增第1、5、10轮vpTK-H-Eg筛选产物。

图22是重组病毒vpTK-F-Eg PCR的鉴定结果，M：DNA Marker DL2000；1、3、5、7：EGFP基因引物扩增第1、5、10轮vpTK-F-Eg，筛选产物；2、4、6、8：TK基因引物扩增第1、5、10轮vpTK-F-Eg筛选产物。

图23是Western blot检测重组病毒感染BHK细胞表达的H、F蛋白,M：蛋白Maker；1：亲本病毒GTPV AV41感染BHK细胞；2：重组病毒vpTK-H-Eg感染的BHK细胞；3：重组病毒vpTK-F-Eg感染的BHK细胞。

具体实施方式

1试验材料

1.1质粒

携带EGFP基因和gpt基因的GTPV重组转移质粒pMDTK-PEL-EGFP与pTK-Eg由广西动物疫病预防控制中心保存。上述载体的来源，其信息可见文献“郑敏,梁晟,郑彦梓,兰彬,韦显凯,苏娇秀,郑列丰,李常挺.TK基因重组缺陷山羊痘病毒构建及其生物学特性鉴定.南方农业学报,2013,09:1552-1557。

1.2细胞和毒株

感受态细胞DH5α和Vero细胞和BHK细胞可以从商业渠道获得，本发明的获得于华南农业大学传染病教研室。牛睾丸细胞由本实验室自行制备。GTPV AV41由广西动物疫病预防控制中心保存。

1.3试剂和试剂盒

限制性内切酶SalI、SmaI、HindIII、SacI以及Klenow Fragment补平酶购自Fermantas公司；OPTI-MEM、DMEM低糖与高糖细胞培养液、0.25％细胞胰酶消化液、胎牛血清、HiPurePlasmind Midiprep Kit无内毒素质粒中量抽提试剂盒、脂质体转染试剂Lipofectamine^TM3000 reagent、ExpressLink T4DNA Ligase为Invitrigen公司产品；氨苄青霉素，DNA MarkerDL2000、DNA Marker DL5000均为TaKaRa公司产品；琼脂糖凝胶BIOWEST公司产品；25cm²、75cm²细胞培养瓶、6孔、12孔细胞培养板；DNA凝胶回收试剂盒购自OMEGA公司。

1.4主要仪器设备

2试验方法

2.1基因的扩增

大熊猫犬瘟热病毒H与F基因序列是从分离鉴定出的大熊猫犬瘟热病毒中扩增出来的，并对其抗原保守结构和识别区域进行修饰，增强其免疫能力，进行定点修饰，在设计基因序列时，并均在3′端插入Not1限制性内切酶位点，5′端插入BamH1限制性内切酶位点，在两个基因序列的起始密码子ATG前均加入利于真核表达的Kozak序列，在起始密码子ATG后加入分子甘氨酸(GGA)，满足KozaK序列+4位的G使ATG成为最佳翻译起始信号和增强转录效率，且GGA对蛋白的免疫原性和生物学特性影响不大，基因序列基因终止密码子TGA后均加痘病毒转录终止信号序列。H全长基因为1861bp,如序列表SEQ ID NO3所示，F全长基因为2024bp，如序列表SEQ ID NO.4所示，用PCR方法与双酶切鉴定以及测序验证，检测并抽提质粒测序，证明质粒中插入片段完全正确。

2.2引物设计与合成

根据GenBank上已公布的EGFP与GTPV TK基因组序列以及合成的H与F的全基因组序列，利用分子生物学软件设计合成了4对引物。EGFP、H、F的引物用于鉴定重组质粒，目的片段大小分别为601bp、587bp、784bp；GTPV TK用于鉴定重组毒，目的片段大小为456bp。引物序列分别为:

EGFP-UP:5’-CTGACCCTGAAGTTCATCTG-3’；

EGFP-DW:5’-GTGTTCTGCTGGTAGTGGTC-3’；

H-UP:5’-ATAGATGTCTTGACACCGCTCTT-3’；

H-DW:5’-GTACATACCTTGGCTTTGGAACT-3’；

F-UP:5’-GGTAGGAGACAAAGGCGTTT-3’；

F-DW:5’-CGAGCACAGGATGAAGTATC-3’；

TK-UP:5’-TATCTGCCATGTCAACAACTTTA-3’；

TK-DW:5’-CTAACTCGTGTCTGATACCCATT-3’；

以上引物由北京睿博兴科生物技术有限公司合成。

2.3转移载体骨架的pMDTK-PEL的构建

首先用限制性内切酶EcoR I消化pMDTK-PEL-EGFP，回收大片段再补平，接着用限制性内切酶SmaI消化，回收3480bp的pMDTK-PEL片段，然后用T4连接酶连接，使其自身环化，获得转移载体质粒pMDTK-PEL，然后转化，测序正确，转移载体质粒命名为pMDTK-PEL。

2.3.1转移载体质粒pMDTK-PEL-EGFP酶切与回收

用限制性内切酶EcoR I消化pMDTK-PEL-EGFP，反应体系如下表1所示：

表1

反应条件：用移液器吹打充分混匀，瞬时离心，37℃水浴锅中反应5min，反应完毕,用1％琼脂糖凝胶跑电泳，将上述酶切产物用OMEGA公司的Gel Extraction Kit进行回收，具体操作如下：

(1)将20μL的酶切产物与1％琼脂糖凝胶中进行电泳。

(2)用干净的手术刀片切割要回收的DNA凝胶块(DNA暴露于紫外线的时间不要超过30s)，放入预先称重好的1.5mL离心管中称重，计算凝胶块的净重。

(3)按每100mg琼脂糖凝胶加入100μL Binding Buffer的比例，加入适量的BindingBuffer，混匀后55℃～60℃水浴7-10min或直到凝胶彻底融化，期间每隔2-3min震荡混匀一次。

(4)将试剂盒中的HiBind DNA spin-column放入2mL收集管中，把融化的凝胶溶液转移至HiBind DNA spin-column中，12000r/min离心1min，弃去滤液。

(5)加入300μL Binding Buffer，12000r/min离心1min，弃去滤液。

(6)加入700μL Washing Buffer，室温静置2min-3min，12000r/min离心1min，弃去滤液。

(7)重复步骤(6)一次。

(8)12000r/min空管离心1min。

(9)将HiBind DNA spin-column装入一个新的1.5mL离心管上，加入30μL DNA ElutionBuffer，室温静置1min。

(10)12000r/min离心1min，离心管中的液体即含有回收的DNA片段，可直接进行后续试验或-20℃保存备用。

2.3.2转移载体质粒pMDTK-PEL-EGFP补平与回收

用补平酶Klenow Fragment消化2.3.1回收的pMDTK-PEL-EGFP，反应体系如下表2所示：

表2

反应条件：漩涡震荡混匀，然后在37℃水浴锅中反应10min，在75℃水浴锅中10min，使其酶失活。反应完毕,用1％琼脂糖凝胶跑电泳，将上述酶切产物用OMEGA公司的GelExtraction Kit进行回收，具体操作方法和步骤参照2.3.1进行。

2.3.3转移载体质粒pMDTK-PEL-EGFP补平后的酶切与回收

用限制性内切酶Sma I消化转移载体质粒pMDTK-PEL-EGFP补平后的，反应体系如下表3所示：

表3

反应条件：用移液器吹打充分混匀，瞬时离心，37℃水浴锅中反应5min，反应完毕后，用1％琼脂糖凝胶跑电泳，将上述酶切产物用OMEGA公司的Gel Extraction Kit进行回收，具体操作方法和步骤参照2.3.1进行。

2.3.4转移载体pMDTK-PEL的自身环化连接

自身环化连接反应体系如下表4所示：

表4

反应条件：轻轻漩涡震荡混匀，在室温下反应5min。直接用于后续试验。

2.3.5 DH5α感受态细胞的制备

(1)取出-80℃冰箱保存的DH5α大肠杆菌，划线接种于LB固体平板，37℃培养过夜，挑取单菌落接种于5mL LB液体培养基中，37℃250r/min培养12h左右，此为一级培养。

(2)吸取一级培养菌液1mL接种于100mL新鲜LB液体培养基中，37℃，250r/min培养3h左右，使细菌进入对数生长期(OD600nm＝0.6左右)，此为二级培养。

(3)将二级培养菌液转移至50mL离心管，冰浴30min。

(4)4℃4000r/min离心10min，弃上清，倒置离心管以尽量排干液体。

(5)加入约5mL预冷的0.1mol/LCaCl₂溶液重悬细菌沉淀，再加入约15mL预冷的0.1mol/LCaCl₂溶液，冰浴10min。

(6)4℃4000r/min离心10min，弃上清，加入约4mL预冷的0.1mol/LCaCl₂溶液重悬细菌沉淀，4℃过夜。

(7)次日按15％比例加入灭菌甘油，每管150μL分装到1.5mL离心管中，-80℃冰箱保存备用。

2.3.6连接产物pMDTK-PEL转化DH5α感受态细胞

(1)从-80℃冰箱取出保存的DH5α感受态细胞，迅速手搓融化，用无菌吸头吸出100μL到1.5mL离心管中，置于冰水浴中，加入10μL连接产物，轻轻吹打混匀，冰水浴中作用30min。

(2)42℃水浴锅中热应激90s，期间不摇动。

(3)快速转移至冰浴中2min。

(4)向1.5mL离心管中加入800μL 37℃预热的LB液体培养基(不加氨苄青霉素)，37℃200r/min培养45～60min。

(5)12000r/min离心30s，弃去大部分上清，余下约80μL液体，重悬细菌沉淀。

(6)将重悬菌液均匀涂布于含氨苄青霉素(100ug/mL)的LB固体培养基上，放入37℃培养箱中正面放置培养约15min，待液体完全吸收后将平板倒置培养12～16h。

2.3.7重组质粒pMDTK-PEL的小量抽提

挑取单菌落接种于含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB液体培养基中，37℃250r/min培养12～16h。按照OMEGA公司的质粒小量抽提试剂盒说明书进行。具体步骤如下：

(1)取1mL～5mL培养过夜的菌液至2mL离心管中，12000r/min离心1min，弃上清。

(2)在细菌沉淀中加入250μL SolutionⅠ，涡旋震荡至彻底重悬。

(3)加入250μL SolutionⅡ，立即温和颠倒离心管5～10次混匀，使菌体充分裂解直至形成透亮的溶液，室温静置2min。

(4)加入350μL SolutionⅢ，立即温和颠倒离心管5～10次混匀，直至形成白色絮状沉淀，12000r/min离心10min.

(5)小心吸取上清转移至DNA吸附柱中(吸附柱置于收集管上)，12000r/min离心1min，弃去液体。

(6)加入500μL Buffer HB，12000r/min离心1min，弃去液体。

(7)加入700μL DNA Washing Buffer，12000r/min离心1min，弃去液体。

(8)重复步骤(7)一次。

(9)12000r/min空管离心1min。

将吸附柱装在一新的1.5mL离心管中，加入30μL DNA Elution Buffer，室温静置1min，12000r/min离心1min洗脱，-20℃保存备用。

其中，

SolutionⅠ：组分浓度25mM Tris-HCL(PH 8.0),10mM EDTA,50mM Glucose

1.量取下列溶液，置于1L烧杯中。

2.高温高压灭菌后，4℃保存。

3.使用前每50ml的SolutionⅠ中加入2ml的RNase A(20mg/ml)。

SolutionⅡ:组分浓度200mM NaOH，1％(W/V)SDS

1.量取下列溶液，置于500ml烧杯中。

10％SDS 50ml

2 N NaOH 50ml

2.加灭菌水定容至500ml，充分混匀

3.室温保存。

SolutionⅢ组分浓度：3M KOAc,5MCH3COOH

1.量取下试剂，置于500ml烧杯中。

KOAc 147g

CH3COOH 57.5ml

2.加入300ml去离子水后搅拌溶解。

3.加去离子水将溶液定容至500ml。

4.高温高压灭菌后，4℃保存。

2.3.8重组质粒pMDTK-PEL的序列测定

将PCR鉴定为阳性的重组质粒送北京睿博兴科生物技术有限公司广州测序部进行测序，测序比对正确，将重组转移载体质粒命名为pMDTK-PEL。

2.4重组转移载体质粒pMDTK-PELH与pMDTK-PELF的构建

用BamHI与NotI内切酶消化pMDTK-PEL获得线性载体，回收大片段。同时用BamHI与NotI内切酶消化PUC57-H，回收小片段。将回收的目的基因与载体通过T4DNA连接酶连接，然后转化，摇菌。经菌液PCR、双酶切、测序鉴定正确，命名为pMDTK-PELH。

用BamHI与NotI内切酶消化pMDTK-pEL获得载体，回收大片段。同时用BamHI与NotI内切酶消化PUC57-F,回收小片段。将回收的目的基因与载体通过T4DNA连接酶连接，然后转化，摇菌。经菌液PCR、双酶切、测序鉴定正确，命名为pMDTK-PELF。

其中获得线性载体pMDTK-PEL酶切体系如下表5所示：

表5

反应条件：用移液器吹打充分混匀，瞬时离心，37℃水浴锅中反应30min，反应完毕后，用1％琼脂糖凝胶跑电泳，将上述酶切产物用OMEGA公司的Gel Extraction Kit进行回收，具体操作方法和步骤参照2.3.1进行。

获得H与F基因的酶切体系如下表6所示：

表6

2.4.1目的基因H、F与载体pMDTK-PEL连接

参照ExpressLink T4DNA Ligase的Invitrigen公司产品载体试剂盒的使用说明书，将上述PCR回收产物在0.2mL的PCR管中进行连接反应，体系如下表7所示：

表7

用移液器吹打充分混匀，瞬时离心，25℃5min，直接用于后续实验。

2.4.2连接产物pMDTK-PELH与pMDTK-PELF转化DH5α感受态细胞

具体操作方法和步骤参照2.3.6进行。

2.4.3重组质粒pMDTK-PELH与pMDTK-PELF的小量抽提

具体操作方法和步骤参照2.3.7进行。

2.4.4重组质粒pMDTK-PELH与pMDTK-PELF的序列测定

将PCR鉴定为阳性的重组质粒送北京睿博兴科生物技术有限公司广州测序部进行测序，测序比对正确，将重组转移载体质粒命名为pMDTK-PELH与pMDTK-PELF。

2.5重组转移载体质粒pTK-H-Eg和pTK-F-Eg的构建

2.5.1转移载体质粒pMDTK-PELH酶切与回收

用限制性内切酶Sal I消化pMDTK-PELH，反应体系如下表8所示：

表8

反应条件：用移液器吹打充分混匀，瞬时离心，37℃水浴锅中反应5min，反应完毕后,用1％琼脂糖凝胶跑电泳，将上述酶切产物用OMEGA公司的Gel Extraction Kit进行回收，具体操作方法和步骤参照2.3.1进行。

2.5.2转移载体质粒pMDTK-PELH补平与回收

用补平酶Klenow Fragment消化2.5.1回收的pMDTK-PEL-EGFP，反应体系如下：

表9

2.5.3表达盒PELH的获得

用限制性内切酶Sac I消化2.5.2回收的pMDTK-PELH，反应体系如下表10所示：

表10

反应条件：用移液器吹打充分混匀，瞬时离心，37℃水浴锅中反应5min，反应完毕后,用1％琼脂糖凝胶跑电泳，将上述酶切产物用OMEGA公司的Gel Extraction Kit进行回收，获得表达盒PELH,具体操作方法和步骤参照2.3.1进行。

2.5.4转移载体质粒pMDTK-PELF酶切与回收

用限制性内切酶HindIII消化pMDTK-PELF，反应体系如下表11所示：

表11

2.5.5转移载体质粒pMDTK-PELF补平与回收

参照2.5.2,

用补平酶Klenow Fragment消化2.5.4回收的pMDTK-PELF，反应体系如下：

表12

反应条件：漩涡震荡混匀，然后在37℃水浴锅中反应10min，在75℃水浴锅中10min，使其酶失活。反应完毕,用1％琼脂糖凝胶跑电泳，将上述酶切产物用OMEGA公司的GelExtraction Kit进行回收。

2.5.6表达盒PELF的获得

参照2.5.3,用限制性内切酶Sac I消化2.5.5回收的pMDTK-PELF，反应体系如下表13所示：

表13

反应条件：用移液器吹打充分混匀，瞬时离心，37℃水浴锅中反应5min，反应完毕后,用1％琼脂糖凝胶跑电泳，将上述酶切产物用OMEGA公司的Gel Extraction Kit进行回收，获得表达盒PELF,具体操作方法和步骤参考2.3.1进行。

2.5.7表达盒PELH、PELF与载体pTK-Eg连接

参照ExpressLink T4DNA Ligase的Invitrigen公司产品载体试剂盒的使用说明书，将2.5.3与2.5.6获得的表达盒PELH、PELF分别在0.2mL的PCR管中进行连接反应，体系如下表14所示：

表14

用移液器吹打充分混匀，瞬时离心，25℃15min，直接用于后续实验。

2.5.2连接产物pTK-H-Eg和pTK-F-Eg转化DH5α感受态细胞

具体操作方法和步骤参照2.3.6进行。

2.5.3重组质粒pTK-H-Eg和pTK-F-Eg的小量抽提

具体操作方法和步骤参照2.3.7进行。

2.5.4重组质粒pTK-H-Eg和pTK-F-Eg的序列测定

将PCR鉴定为阳性的重组质粒送北京睿博兴科生物技术有限公司广州测序部进行测序，测序比对正确，将重组转移载体质粒命名为pTK-H-Eg和pTK-F-Eg。

2.5.5无内毒素重组质粒pTK-H-Eg和pTK-F-Eg的中量制备

采用Invitrigen公司的无内毒素中量质粒提取试剂盒HiPure Plasmind Midiprep Kit无内毒素质粒中量抽提试剂盒提取转染用的质粒，具体操作步骤如下：

(1)收集氨苄培养液过夜培养菌液50mL，4℃条件下,4000xg离心10min，弃去上清液。

(2)加入4mL Buffer R3(已经加入RNA酶)溶液，将菌体沉淀悬浮，并吹打均匀。

(3)加入4mL Buffer L7，上下轻轻颠倒4-5次，使其充分混匀，不要涡旋震荡，室温下裂解5min。

(4)加入4mL Buffer N3，立即上下轻轻颠倒4-5次，使其充分混匀，不要涡旋震荡，室温下12000xg离心30min。

(5)取出试剂盒中的吸附柱，加入10mL平衡液EQ1，使其自然流出进行平衡。

(6)将步骤(4)中的上清液加入平衡过的吸附柱，使其自然流出，弃去滤液。

(7)向吸附柱中加入2x10mL Wash Buffer清洗吸附柱，使其自然流出，弃去滤液。

(8)向吸附柱中加入5mL Elution Buffer进行洗脱，洗脱液用无菌的10mL EP管接着，弃掉柱子。

(9)加入3.5mL的异丙醇，混匀，洗涤。

(10)4℃，12000xg离心30min，小心弃去上清。

(11)加入3mL 70％的乙醇，使其重悬。

(12)4℃，12000xg离心5min，小心弃去上清。

(13)在超净台里风干10min后,将DNA溶解于100uL的无内毒素的Buffer TE溶液,即获得高浓度的质粒。

取出5uL质粒，采用核酸蛋白分析仪测定所抽提质粒的浓度,为下一步转染作准备。

2.6原代犊牛睾丸(bovine testicle，BT)细胞的制备

参照《中华人民共和国兽用生物制品规程》(2005年)制作原代、次代BT细胞。选用初生犊牛，以无菌手术摘取睾丸，剥弃鞘膜及白膜，剪成1～2mm小块，用Hank’S液洗3～4次，按睾丸组织量的10倍加入0.25％胰酶溶液，置37℃水浴中消化，至睾丸组织块呈蓬松状，弃胰酶液，用吸管吹打法分散细胞并用细胞生长液10％MEM稀释成每毫升含100万左右细胞数，分装，放37℃5％CO2的培养箱中静置培养，2～4d即可长成单层。

将生长良好的原代细胞，倒去生长液，加入原生长液量1/10的EDTA-胰酶分散液，消化1～2min，待细胞呈雪花状时，倒去分散液。先用少许生长液吹打细胞，然后按1:2～1:3的分种率，补足生长液。混匀、分装，置37℃静置培养。

2.7山羊痘病毒GTPV AV41的增殖及病毒滴度的测定

以0.25％胰蛋白酶消化BT细胞，加入含10％犊牛血清的DMEM培养液分装于细胞培养瓶静止培养，24h贴壁形成单层后，倾去培养液。将GTPV AV41种毒用维持液稀释后，取1mL病毒稀释液加入细胞单层上，于37℃吸附2h，补加5mL含2％犊牛血清的DMEM维持液，37℃继续培养，病变达70％-80％以上时，将细胞反复冻融3次回收，保存于负80℃备用。

用含有2％犊牛血清的DMEM维持液将收获的种毒以10^-1～10^-7系列稀释后按每孔100μL接种已长成80-90％的BT细胞的96孔板，每滴度接8孔，留下一列对照；5％CO2 37℃培养6-7d，每天观察并记录出现病变孔数，最后采用Karber法计算GTPV AV41病毒在BT细胞中的TCID₅₀。

2.8重组GTPV的制备、纯化和鉴定

2.8.1同源重组

6孔板中BHK细胞长满80-90％时，按MOI(感染复数)值为0.05，感染GTPV 2h。

在接毒时，培养液使用含2％血清，但不含抗生素的OPTI-MEM。然后采用脂质体Lipofectamine^TM 3000进行转染，具体操作步骤按照Lipofectamine^TM 3000说明书进行：

(1)将5.0ug质粒pTK-H-Eg加入盛有125μL无血清、无抗生素的OPTI-MEM的无菌1.5mL EP管中，充分混匀，获得质粒稀释液。

(2)然后往步骤1中获得质粒稀释液中加入10uL的P3000试剂(Invitrigen公司的脂质体转染试剂Lipofectamine^TM 3000中的试剂)。

(3)吸取3.75uL的Lipofectamine^TM 3000加入盛有125μL无血清、无抗生素的OPTI-MEM的无菌1.5mL EP管中，轻轻混匀。

(4)将稀释后Lipofectamine^TM 3000缓慢加入(步骤(2)中的)质粒稀释液中,混匀,室温孵育5min，获得质粒-脂质体混合物。

(5)然后将质粒-脂质体混合物按250μL/孔比例加入到生产良好的BHK细胞的6孔板中，留一孔做空白对照，前后左右轻轻摇匀，使混合物充分与BHK细胞接触。放置37℃5％CO₂培养箱。

(6)转染6-8h后，并吸弃转染试剂，用PBS洗涤一次，然后加入2mL病毒维持液进行37℃5％CO2培养。

换液后，按MOI(感染复数)值为0.05，每孔加入亲本病毒GTPV AV41 150uL，37℃5％CO2继续培养，在第3d，BHK细胞开始出现病变，之后每天观察细胞病变，大约第5d，80％的细胞出现病变，将细胞和病毒液反复冻融三次，即收获转染病毒液，-80℃保存备用。

2.8.2重组病毒的加压筛选和纯化

6孔板中Vero细胞长满80-90％时，用gpt选择培养基(DMEM，2％血清，25μg/mL MPA，250μg/mL xanthine，15μg/mL hypoxanthine)事先处理12～24h。

将收取的转染病毒液取出，在4℃12000xg离心5min，然后用0.22um过滤器过滤。吸弃培养基，用PBS洗涤2遍，每孔加入200μL病毒液，感作2h后，更换为gpt选择培养基37℃5％CO2培养。第2～3d出现病变后，在荧光显微镜下，看是否有荧光斑出现，并在荧光斑的地方做好标记，用含胰酶的无菌滤纸片挑出有荧光的蚀斑；放入加有200ul的2mL的EP管中,反复吹打，使滤纸片上的细胞脱落，然后反复冻融三次。将Vero细胞传代于一个12孔板中,待细胞长到70-80％时,加入上一轮的蚀斑病毒，然后继续筛选和蚀斑纯。同时提取重组GTPV DNA，用EGFP基因引物对EGFP1和EGFP2进行PCR鉴定。

筛选过程中,收集1，5，10代重组毒并取出250uL的病毒液，抽提重组GTPV DNA，用GTPV TK与EGFP基因的引物进行扩增鉴定，直到扩出的基因组不再有野毒的基因组,且重组毒有目的条带，表明己经纯化完全，具体方法和反应程序同上。鉴定正确后，并将获得的重组病毒命名为vpTK-H-Eg与vpTK-F-Eg

2.9重组病毒vpTK-H-Eg与vpTK-F-Eg的Western blot鉴定

分别将亲本毒GTPV AV41、重组病毒vPK-H-Eg与vPK-F-Eg分别感染的单层BHK细胞裂解后，加入50μl的1×SDS上样缓冲液，充分混合后，100℃水浴10min，然后进行SDS-PAGE电泳，再将PAGE胶上的蛋白转到尼龙膜上，转膜完成后，5％脱脂乳封闭1h，然后洗涤3次，再以犬瘟热阳性血清作为一抗孵育过夜，同样洗涤3次，再用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG为二抗孵育1h，洗涤三次，加入底物后显色。

2.10重组病毒免疫效果评估

2.10.1小鼠的免疫试验

将4周龄的小鼠分为4组，每组10只，重组病毒vpTK-H-Eg、vpTK-F-Eg以及vPK-H-Eg+vPK-F-Eg混合病毒液(1：1)约为10⁸TCID₅₀/100μL(半数组织培养感染剂量)经肌肉免疫，每只接种剂量150uL，第4组设为对照组，采用相同剂量与免疫方式免疫犬瘟热弱毒疫苗，初次免疫第四周后均以相同方式进行加强免疫。初次免疫和加强免疫两周后采取小鼠的血，进行间接ELISA测定抗体浓度。

通过间接ELISA方阵试验确定纯化的重组病毒最适抗原包被浓度为5μg/mL。以此浓度包被96孔ELISA板，4℃过夜包被；次日取出用1％BSA室温封闭1h后，加入待检血清与阴、阳血清进行倍比稀释，于25℃放置1h，随后再以1:4000稀释的HRP标记山羊抗鼠IgG为二抗进行间接ELISA检测。

2.10.2犬的免疫试验及中和抗体检测

将12周龄比格犬分为4组，每组5只，重组病毒vpTK-H-Eg、vpTK-F-Eg、以及vpTK-H-Eg与vpTK-F-Eg混合病毒液(1：1)约为10⁹TCID₅₀/100μL(半数组织培养感染剂量)经肌肉免疫，第4组设为对照组，采用相同剂量与免疫方式免疫犬瘟热弱毒疫苗，初次免疫后第4周和第8周以相同方式进行加强免疫。采集免疫后每周犬的血液，分离血清进行荧光抗体病毒中和试验(FAVN)检测中和抗体水平，检测重组病毒的加强免疫效果。

血清样品经56℃水浴灭活补体，进行自4倍至128倍的2倍倍比稀释，与含100个TCID50的vpTK-H-Eg(vpTK-F-Eg)病毒等体积混合，37℃孵育1h后在96孔板中每孔加入100μLVero细胞悬液。每个样品作4个重复，同时设阳性、阴性血清对照。于感染72h后用荧光显微镜观察结果。以能保护50％细胞孔不出现病变的血清最高稀释倍数作为被检血清的病毒中和抗体(virus neutralize antibody,VNA)滴度。

3实验结果

3.1 GTPV AV41的病毒滴度测定结果

将GTPV AV41接种BT细胞，病毒液回收后测TCID₅₀，GTPV AV41的TCID₅₀结果见表15。

表15

3.2载体质粒pMDTK-PEL的构建结果

用限制性内切酶EcoRI单酶切载体质粒pMDTK-PEL-EGFP，1％琼脂糖电泳可以看到4200bp左右的条带。见图3，与预期相符。然后回收补平，在SmaI酶切，1％琼脂糖电泳可见3480bp与720bp左右的两条带，均与预期相符。见图4。

3.3重组转移载体质粒pMDTK-PELH与pMDTK-PELF的构建结果

用BamH1与Not1消化pMDTK-PEL获得载体，和同样经BamH1与Not1消化的PUC57-H，获得H基因，将H基因构建到pMDTK-PEL载体中。用H基因的上下游引物鉴定为阳性的菌液，见图5，送测序验证正确，将质粒命名为pMDTK-PELH。

用BamH1与NotI消化pMDTK-PEL获得载体，和同样经BamH1与Not1消化的PUC57-F，获得F基因，将F基因构建到pMDTK-PEL载体中。用F基因的上下游引物鉴定为阳性的菌液，见图6，送测序验证正确，将质粒命名为pMDTK-PELF。

3.4重组转移载体质粒pTK-H-Eg与pTK-F-Eg的构建结果

用限制性内切酶HindIII单酶切重组转移载体质粒pMDTK-PELH，1％琼脂糖电泳图片可以见到5330bp左右的条带，与理论大小相符，见图7，然后补平，胶回收，再用限制性内切酶SacI单酶切回收的片段，1％琼脂糖电泳图片可以见到1900bp与3430bp左右的两条带，见图图8。

然后用限制性内切酶SmaI与SacI双酶切pTK-Eg转移载体质粒，可以见到5000bp左右的条带，与预期的相符，见图9。将表达盒PELH构建到pTK-Eg载体中。用H基因与EGFP基因的上下游引物鉴定为阳性的菌液，见图10，送测序验证正确，将质粒命名为pTK-H-Eg。

用限制性内切酶SalI单酶切重组转移载体质粒pMDTK-pELF，1％琼脂糖电泳图片可以见到5495bp左右的条带，与理论大小相符，见图11，接着补平，胶回收，再用限制性内切酶SacI单酶切回收的片段，1％琼脂糖电泳图片可以见到2060bp与3435bp左右的两条带，见图12。

然后用限制性内切酶SmaI与SacI双酶切pTK-Eg转移载体质粒,可以见到5000bp左右的条带，与预期的相符，见图13。将表达盒PELF构建到pTK-Eg载体中。用F基因与EGFP基因的上下游引物鉴定为阳性的菌液，见图14，送测序验证正确，将质粒命名为pTK-F-Eg。3.5重组病毒vpTK-H-Eg和vpTK-F-Eg的制备结果

GTPV AV41感染BHK细胞、分别转染重组质粒vpTK-H-Eg与vpTK-F-Eg，获得重组病毒vpTK-H-Eg和vpTK-F-Eg。转染96h后在荧光显微镜下观察，发现绿色荧光。见图15、图16。

3.6重组病毒vpTK-H-Eg和vpTK-F-Eg纯化的结果

根据报告基因EGFP的表达情况，筛选重组病毒蚀斑，并将单个蚀斑反复冻融后接种12孔板Vero细胞进行下一轮的筛选，经过10轮蚀斑纯化，可见病毒蚀形成的斑均带有绿色荧光。见图17、图18、图19、图20。

3.7重组病毒vpTK-H-Eg和vpTK-F-Eg鉴定的结果

收取1、5、10筛选的重组病毒细胞培养物，提取总DNA，用EGFP基因引物和GTPV AV41TK基因引物进行PCR鉴定。结果是，亲本毒株GTPV AV41可以扩增出约601bp的片段，而第1、5轮筛选时重组病毒培养物可以扩增出601bp和414bp片段，第10轮筛选重组病毒培养物只能扩增出414bp片段，见图21、图22。将PCR产物测序，结果与预期序列相一致。表明经过10轮加压筛选后，两个重组毒株已获得纯化，不含有亲本病毒。并将获得的两株重组病毒分别命名为vpTK-H-Eg与vpTK-F-Eg。

3.8重组病毒vpTK-H-Eg与vpTK-F-Eg的Western blot结果

重组病毒vpTK-H-Eg、vpTK-F-Eg与亲本毒株GTPV AV41分别感染BHK细胞，裂解物进行SDS-PAGE电泳后转印，以抗CDV的鼠高免血清为一抗、辣根过氧化酶标记羊抗鼠IgG为二抗做Western blot检测，图23中显示分子量约为60KD的条带与重组病毒vpTK-F-Eg感染BHK细胞所表达的F0前体蛋白大小相符。重组病毒vpTK-H-Eg感染的BHK细胞中检测到一个85KD的条带，这与理论值相符，在亲本毒株GTPV感染的BHK细胞中均未检测到CDV F和H蛋白的特异性产物。这些结果表明CDV F和H抗原分别在重组的GTPV AV41感染的细胞中均获得了正确表达。

3.9重组病毒免疫试验结果

3.9.1小鼠的免疫试验结果

分别单独接种重组病毒vpTK-H-Eg、vpTK-F-Eg，vpTK-H-Eg与vpTK-F-Eg混合病毒液于4周龄的小鼠，初次免疫15d后以相同方式进行加强免疫。同时设亲本毒株GTPV AV41接种的小鼠作阴性对照组。第3次免疫15d后，采血制备血清，对采集的血清样品利用间接ELISA试验方法检测抗体滴度。结果显示：初次免疫亲本毒株GTPV AV41所免疫小鼠的血清OD值为阴性，未检测到特异性IgG抗体。单独接种vpTK-H-Eg、vpTK-F-Eg组小鼠在初次免疫15d后，血清中的特异性IgG含量达到2135ng/mL、623ng/mL。加强免疫两次后，血清中的特异性IgG含量达到52970ng/mL、11250ng/mL。vpTK-H-Eg与vpTK-F-Eg联合接种15d后，小鼠血清中抗CDV的IgG抗体含量2125ng/mL、加强免疫两次后，小鼠血清中抗CDV的IgG浓度达到53063ng/mL。这些结果显示，vpTK-H-Eg诱导特异性IgG反应能力显著高于亲本毒株GTPV AV41(^**P<0.01)和vpTK-F-Eg(^**P<0.01)，vpTK-H-Eg单独免疫和vpTK-H-Eg+vpTK-F-Eg联合免疫诱导的特异性IgG水平无显著差异；两次加强免疫对诱导特异性IgG水平有显著的增强作用(^**P<0.05)。

3.9.2犬的免疫试验结果

分别单独接种重组病毒vpTK-H-Eg、vpTK-F-Eg，vpTK-H-Eg与vpTK-F-Eg混合病毒液于12周龄的比格犬，初次免疫15d后以相同方式进行加强免疫。同时设亲本毒株GTPV AV41免疫作为对照组，通过中和试验对所采集血样的中和抗体滴度(VNA)进行检测。结果显示，在初次免疫和加强免疫后，犬血清中均未检测到亲本毒株GTPV AV41诱导的抗CDV中和抗体，vpTK-H-Eg、vpTK-F-Eg单独免疫和vpTK-H-Eg+vpTK-F-Eg联合免疫在初次免疫后诱导的CDV中和抗体效价较低。而加强免疫一周后便分别达到1:64、1:38和1：68，中和抗体滴度显著高于初次免疫后的滴度(^**P<0.01)，14d后便迅速降低；再次加强免疫后中和抗体水平再次升高。这些结果显示，vpTK-H-Eg诱导CDV中和抗体的能力显著高于亲本毒株GTPV AV41(^**P<0.01)和vpTK-F-Eg(^**P<0.01)，vpTK-H-Eg单独免疫和vpTK-H-Eg+vpTK-F-Eg联合免疫诱导的CDV中和抗体水平无显著差异；两次免疫对犬中和抗体反应同样具有显著的增强作用(^**P<0.01)。

Claims

1.一种表达大熊猫犬瘟热病毒H或F基因重组山羊痘病毒的疫苗，其特征在于疫苗中含有以山羊痘病毒为载体，分别转染表达大熊猫犬瘟热病毒H或F基因的重组转移载体质粒pTK-H-Eg或pTK-F-Eg而获得的重组山羊痘病毒vpTK-H-Eg或vpTK-F-Eg，其中重组山羊痘病毒vpTK-H-Eg包含如序列表SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，重组山羊痘病毒vpTK-F-Eg包含如序列表SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于：大熊猫犬瘟热病毒H基因的氨基酸序列如SEQID NO.3所示，大熊猫犬瘟热病毒F基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

3.一种制备如权利要求1或2任一所述的疫苗的方法，其特征在于包括以下步骤：

(3)构建重组转移载体质粒pMDTK-PELH与pMDTK-PELF:

(4)构建转移载体质粒pTK-H-Eg和pTK-F-Eg:

用限制性内切酶Sal I分别消化pMDTK-PELH及pMDTK-PELF,用补平酶Klenow Fragment消化回收的pMDTK-PELH与pMDTK-PELF，用限制性内切酶Sac I消化重组转移载体质粒pMDTK-PELH与pMDTK-PELF补平后的回收产物，获得转移载体质粒pTK-H-Eg和pTK-F-Eg，其氨基酸序列分别如序列表SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2所示；

(5)制备及培养原代犊牛睾丸细胞并使用于GTPV AV41的增殖；

(6)制备重组GTPV,将步骤(4)获得的转移载体质粒pTK-H-Eg和pTK-F-Eg接毒感染GTPVAV41,筛选并纯化，获得重组病毒vpTK-H-Eg和vpTK-F-Eg。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(2)包括：

1)用限制性内切酶EcoR I消化pMDTK-PEL-EGFP，回收大片断；

2)用补平酶Klenow Fragment消化所回收的大片断；

4)采用T4DNA连接酶使pMDTK-PEL自身环化连接；

5)制备DH5α感受态细胞；

5.由权利要求3或4所述的方法所制得的重组病毒vpTK-H-Eg和vpTK-F-Eg用作犬瘟热弱毒疫苗的免疫方法。

6.根据权利要求5所述的免疫方法，其特征在于：所述免疫方法采用肌肉免疫方式，初次免疫第四周后进行加强免疫。