CN110452889B - 一种表达bvdv-e0的重组牛肠道病毒的构建方法与初步应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种表达BVDV‑E⁰的重组牛肠道病毒的构建方法及其初步应用，所述感染性克隆毒株是通过反向遗传操作的方法获得BEV BJ101毒株的全长cDNA克隆并获得拯救毒株rBEV后，将BVDV的E0序列插入到BEV全长cDNA中，获得可稳定表达外源基因E0的重组牛肠道病毒。所述rBEV‑E0重组病毒的初步应用，将分离纯化后的重组病毒免疫6～8周龄的SPF级别的Balb/c雌鼠，在不同时间点收集其血清样本进行检测，小鼠不但可以稳定表达E0蛋白，并能对其产生有效的免疫应答。本发明的重组病毒可同时用于BEV和BVDV的防控，也为其他外源基因提供了合适的的rBEV插入位点，为后续外源基因的插入、重组病毒的制备等研究提供有效的技术平台。

Description

一种表达BVDV-E0的重组牛肠道病毒的构建方法与初步应用

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，涉及一种重组牛肠道病毒，尤其涉及一种表达BVDV-E⁰的重组牛肠道病毒(表达牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)E0蛋白)的构建方法及其初步应用。

背景技术

20世纪50年代首次从牛体内分离到BEV，随后在负鼠、宽吻海豚、骆驼和羊驼等动物体内也分离到该病毒。BEV的病原性不明显，感染宿主后引起腹泻、呼吸困难和繁殖障碍。BEV为单股正链RNA病毒，属于肠病毒属，小RNA病毒科。肠道病毒属共12种型，BEV属于肠道病毒E型或F型。BEV基因组大小约7500bp，基因组包含5’非编码区、ORF、3’非编码，ORF编码结构蛋白(P1区编码的 VP1,VP2,VP3和VP4)、非结构蛋白(P2区编码的2A,2B,2C以及P3区编码的3A,3B,3C和3D)。目前研究表明BEV具有稳定的物理性状、能够抵抗肠道酸性环境、可通过肠道途径进入宿主体内，且该病毒无毒力或毒力较弱。这些特性使BEV成为较好的疫苗候选载体。

牛病毒性腹泻/粘膜病是由牛病毒性腹泻病毒引起的传染病,各种年龄的牛均易感染、以犊牛易感性最高,给我国乃至全球养殖产业带来了严重的经济损失。在BVDV病毒的结构蛋白中,E0蛋白保守性很高,并含有中和表位,产生的中和抗体具有中和BVDV的能力，被认为是BVDV亚单位疫苗的重要靶标抗原。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的就在于提供一种表达BVDV-E⁰的重组牛肠道病毒的构建方法及其初步应用。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的：

本发明包括牛肠道病毒，所述牛肠道病毒的感染性克隆毒株是BEV BJ101 株的克隆毒株，具有SEQ ID NO.1所示的全基因序列，其特征在于：所述感染性克隆毒株是通过反向遗传操作的方法获得BEV BJ101毒株的全长cDNA克隆并获得拯救毒株rBEV后，将优化后的牛病毒性腹泻病毒E0序列插入到BEV全长 cDNA中，获得可稳定表达外源基因E0的重组牛肠道病毒，所述E0序列具有如SEQ ID NO.2所示。

具体地，在所述BEV全长cDNA的非结构蛋白2C和3A之间插入优化后的牛病毒性腹泻病毒E0序列。

进一步地，所述牛病毒性腹泻病毒的E0基因的优化包括在构建好的含有 GpBSK-rBEV的质粒的2A和3C基因序列之间插入牛病毒性腹泻病毒的E0基因，对E0的基因序列先进行哺乳动物密码子优化，再在其5’端添加合成GCCGGCCGC NotI酶切位点序列，在其3’端添加合成TCTAGA XbaI酶切位点序列(SEQ ID NO.2所示)，以便于通过NotI、XbaI双酶切后与引入NotI、XbaI双酶切位点的GpBSK-rBEV的质粒进行连接。

具体地，在构建好的含有GpBSK-rBEV的质粒的2C和3A基因序列之间通过重叠PCR的方法引入NotI和XbaI双酶切位点.所述重叠延伸PCR引物包括3 对引物对，分别为：P23-F,P23-2AF和EcoR5-R，从5’端到3’端，引物对的具体序列如下：

P23-F:

GCAATAGGCGTTATAACATTGGGAACGTCCTCGAGGCACTCTTCCAGGGCGGCCGCTACCCATACGA C

P23-2AF:

GGCGGCCGCTACCCATACGACGTCCCAGACTACGCTTCTAGACTGACCACATTGGGCCCAGTTTGCTACAAACCCCTC

EcoR5-R:

CCAGGGCCTCCAAGCCTTCAGTAC

作为优选，所述GpBSK-rBEV质粒为插入全长BEV BJ101全基因序列的GpBSK 重组载体。

具体地，如权利要求1所述的一种表达BVDV-E⁰的重组牛肠道病毒动物实验的免疫应答的应用。

本发明的有益效果在于：

本发明对表达BVDV-E⁰的重组牛肠道病毒的初步应用，将分离纯化后的重组病毒免疫6～8周龄的SPF级别的Balb/c雌鼠，在不同时间点收集其血清样本进行检测，小鼠不但可以稳定表达E0蛋白，并能对其产生有效的免疫应答。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对发明作进一步详细说明。

图1为重叠PCR引入双酶切位点的核酸电泳结果图；

图2为pUC57-E0和GpBSK-rBEV双酶切结果图；

图3为正常细胞和接毒的病变细胞的对比图；

图4为重组病毒rBEV-E⁰进行核酸电泳检测结果图；

图5A为重组病毒rBEV-E⁰和rBEV进行Western Blot鉴定结果中的VP1条带图；

图5B为重组病毒rBEV-E⁰和rBEV进行Western Blot鉴定结果图中的E0条带图；

图6为rBEV-E⁰感染细胞IFA检测结果图；

图7为rBEV-E⁰磷钨酸负染电镜结果图；

图8为重组病毒rBEV-E⁰的一步生长曲线图；

图9为重组病毒免疫小鼠后产生VP1抗体的ELISA检测结果；

图10重组病毒免疫小鼠后产生E0抗体的ELISA检测结果。

具体实施方式

本实施例中，未注明具体条件的实验方法，均为常规实验方法。如《精编分子生物学实验指南》(F.M奥斯伯R布伦特R.E.金斯顿D.D穆尔等主编，金由辛.包慧中.赵丽云等译校.北京：科学出版社，2008)中所述的方法进行。

实施例1表达BVDV-E⁰的重组牛肠道病毒基因组全长cDNA克隆的构建与鉴定1.GpBSK-rBEV质粒的2C和3A基因序列之间引入双酶切位点

在构建好的含有GpBSK-rBEV的质粒的2C和3A基因序列之间通过重叠PCR 的方法引入NotI和XbaI双酶切位点，引物见表1。首先以GpBSK-rBEV质粒为模板，以P23-2AF和EcoR5-R为引物(预扩增片段长度1270bp)，按照

HS(Premix)的说明书进行PCR，扩增产物通过10倍稀释后取1ul 作为模板，以P23-F和EcoR5-R为引物(预扩增片段长度1317bp)，再使用

HS(Premix)进行PCR，核酸电泳结果如图1所示，纯化PCR产物后，在利用XhoI和EcoRV限制性内切酶对其进行双酶切(酶切体系如下：1μg，重组质粒；10μL，5×CutSmart buffer；1μL，XhoI；1μL，EcoRV；加入 RNase Free dH₂O至50μL。37℃酶切反应3h，65℃20min使限制性内切酶失活，冰上冷却，琼脂糖凝胶回收纯化)最后通过T4连接酶与同样经过XhoI 和EcoRV双酶切的GpBSK-rBEV的质粒进行连接，获得了在2C和3A基因序列之间引入NotI和XbaI双酶切位点的GpBSK-rBEV质粒。

表1重叠PCR引物

2.基因合成牛病毒性腹泻病毒的E0基因

在构建好的含有GpBSK-rBEV的质粒的2A和3C基因序列之间插入牛病毒性腹泻病毒的E0基因，对E0的基因序列(SEQ ID NO.1所示)进行哺乳动物密码子优化，在其5’端添加合成GCCGGCCGC NotI酶切位点序列，在其3’端添加合成TCTAGA XbaI酶切位点序列，将整个合成的基因序列连接到pUC57质粒载体上，命名为pUC57-E0，这样以便于通过NotI、XbaI双酶切后与引入NotI、 XbaI双酶切位点的GpBSK-rBEV的质粒进行连接。

2.构建GpBSK-rBEV-E0质粒

如图2所示，对pUC57-E0质粒和GpBSK-rBEV质粒分别进行NotI、XbaI双酶切，酶切体系如下：1ug，重组质粒；10μL，5×CutSmart buffer；1μL， NotI；1μL，XbaI；加入RNaseFree dH₂O至50μL，37℃酶切反应3h，65℃ 20min使限制性内切酶失活，冰上冷却，经纯化后用T4连接酶16℃连接过夜，转入JM109感受态细胞中，挑选阳性克隆并进行测序，将正确的质粒命名为GpBSK-rBEV-E0。

3重组质粒线性化及纯化

3.1重组质粒的大量制备

将鉴定阳性的菌液扩大培养200mL，按照艾德莱PhasePrep EndoFree Maxi Kit说明书提取质粒，具体操作步骤如下：菌液装入离心管中，10000g 4℃离心5min，弃掉上清。加入5mL P1溶液(已经加入RNase A),充分混匀细菌悬液，室温放置5min。加入5mL P2溶液，缓慢上下倒立离心管8次，切忌剧烈晃动引起基因组DNA断裂，室温放置5min直到菌液变得清凉粘稠。加入5mL P3溶液，立即颠倒混匀溶液，有白色絮状物出现，12000g 4℃离心10min，将上清移入新的离心管中。加入10mL异丙醇溶液，充分混匀液体，12000g 4℃离心10min，缓慢倒掉上清，沥干液体。加入5mL 70％乙醇溶液，12000g 4℃ 10min，倒掉上清，待沉淀干燥。加入1.4mL P1溶液，吹打管底和沉淀溶解质粒，将溶液移入到2个新的1.5mL的EP管中，60℃水浴15min消化残留RNA。取55μLA液，混合均匀，加入80μL刚刚融化的内毒素清除剂，充分混匀，冰浴10min，中间晃动几次。42℃水浴5min，12000g温室离心5min，溶液分为两层，吸取上层水相至新的1.5mL的EP管中，注意不要吸到蓝色含有内毒素等杂质的油相。加入750μL的B溶液，慢慢混合，12000g 4℃离心10min，弃上清。加入1mL 70％乙醇，12000g 4℃离心2min，弃上清，重复此步骤一次，沥干液体，彻底去除乙醇。加入50μL TE，充分吹打溶解质粒。

3.2重组质粒单酶切线性化

通过EcoR I对全长重组质粒GpBSK-rBEV-E0进行线性化。酶切体系如下： 10μg，重组质粒；40μL，5×CutSmart buffer；8μL，EcoRI-HF；加入RNase Free dH₂O至200μL。37℃酶切反应3h，65℃20min使限制性内切酶失活，冰上冷却，琼脂糖凝胶回收线性质粒。

3.3乙醇沉淀回收线性化DNA

应用乙醇沉淀回收方法纯化重组质粒单酶切产物，具体步骤如下：加入1/10 体积的预冷的乙酸钠溶液(3mol/L，pH5.2)和2倍体积的预冷无水乙醇溶液，混匀后，-80℃作用30min。12000r/min 4℃离心30min，在超净台中小心去除上清。加入1mL 70％乙醇溶液，12000r/min 4℃离心5min，弃掉上清，重复此操作，之后沥干溶液，使乙醇充分挥发。加入20μL RNase Free dH₂O充分溶解DNA，测量DNA浓度，当OD₂₆₀/₂₈₀为1.8～2.0时用于下一步转染，-80℃保存备用。

4.转染

4.1细胞培养

将能够稳定表达T7聚合酶的BSR细胞系(BSR-T7细胞系)复苏于10％的 DMEM细胞培养液中，传代培养至其生长稳定，接种到六孔板中进行后续转染实验。

4.2转染BSR细胞系

将线性化的GpBSK-rBEV转染BSR-T7细胞系，按照jetPRIME操作方法进行转染，具体按照说明说操作步骤：将BSR-T7细胞接种到六孔板中，待细胞融合度为80％时，清洗细胞完毕后，每孔加入2mL 2％DMEM。取200μL jetPRIME buffer至灭菌的1.5mL的EP管中，加入2μg的DNA，轻轻混匀。加入4μL jetPRIME，轻轻混合均匀，低速离心10s，室温反应10min。取200μL以上试剂滴加至六孔板中，轻轻混匀，放在37℃5％细胞培养箱中培养。6h后换成2％DMEM的维持液，每隔12h观察转染效果，待有BEV典型细胞病变时收获毒处理，如图3所示为正常细胞和接毒的病变细胞的对比图。

5重组病毒rBEV-E0的鉴定

5.1重组病毒的传代培养

将获得的重组病毒在MDBK细胞上进行传代培养，待出现CPE后，收获的病毒培养液-80℃保存。

5.2PCR鉴定

提取重组病毒的基因组，进行反转录。设计BEV的特异性检测引物(BEV-F/R) 和能够扩增E0的检测引物(E0-F/R)(表2)，利用康为世纪生物技术有限公司的2×TaqMasterMix(Dye)进行PCR，具体操作步骤如下：反应体系(25μL， 2×Taq MasterMix(Dye)；2μL，M-F(10μM)；2μL，M-R(10μM)；2μL， cDNA；19μL，ddH₂O)。反应程序(94℃，2min；30个循环×(94℃,30s；55℃， 30s；72℃，24s)；72℃，2min)。

表2检测BVDV-E0和BEV-VP1基因的引物

如图4所示，PCR产物进行胶回收，送苏州金唯智公司测序。琼脂糖凝胶电泳观察结果表明：重组病毒既能扩增出BEV的特异性检测片段，又能扩增出含有E0的片段。

5.3重组病毒基因组测序

使用上述表2能够扩增病毒全基因组的引物，利用Q5High-Fidelity PCR Kit扩增病毒基因组，将纯化后的PCR产物连接pEASY-Blunt zero载体，转化入JM109感受态中，挑选阳性质粒测序。测序结果表明，重组病毒与rBEV相比，只是多插入了E0基因。

5.4Western Blot鉴定

本发明应用Western Blot方法鉴定重组牛肠道病毒。具体操作步骤如下所述：将rBEV-E0和rBEV病毒液接种到在六孔板中生长状态良好的MDBK细胞上。病毒接种12h后倒掉培养液，用冰浴的PBS溶液清洗细胞三遍。向每孔中加入200μL的RPIA(添加2μL蛋白酶抑制剂)，混匀放在冰上裂解30min，期间轻晃几次。将反应液转移到新的1.5mL的EP管中，12000r/min 4℃离心 5min，收集上清。80μL溶液与20μL的5×变性液充分混匀，沸水加热10min，其余蛋白样品-80℃保存。

每孔上样10μL，进行SDS-PAGE电泳，结束后进行湿转，按顺序组装：负极(黑色)-滤纸-胶-NC膜-滤纸-正极(红色)(事先将膜、滤纸用转印缓冲液浸润)，组装好将其放入转印槽中，添加转印缓冲液，将整个转印装置置于冰浴环境中，350mA转印约1.5h。

转印结束后，将NC膜取出，用TBST冲洗3次，一共15min。将NC膜放到5％脱脂乳溶液中，4℃作用8h。之后取出NC膜，用TBST洗涤3次，5min/ 次，加入TBST稀释的鼠源抗VP1的4B2单抗，置于摇床中80r/min 25℃反应 2h。一抗反应结束后，取出NC膜，用TBST洗涤3次，5min/次，加入TBST稀释的HRP标记山羊抗小鼠IgG(H+L)，置于摇床中80r/min 25℃反应1h。配置显色液，在干净的15mL离心管中依次加入2mL Buffer、100μL溶液A、100μL 溶液B和100μL溶液C，充分混匀，避光放置。待二抗反应结束后，取出NC膜，用TBST洗涤3次，5min/次，在阴暗处将显色液覆盖在NC膜上，条带出现后加入去离子水进行观察并记录结果。如图5A和图5B所示，结果表明：重组病毒rBEV-E0既可以观察到VP1条带(图5A)，又可以观察到E0条带(图5B)，而rBEV只有VP1条带而没有E0条带(图5A和图5B)。

5.5间接免疫荧光鉴定

将MDBK细胞接种于48孔板中，待细胞长成单层后接毒，同时设立未接毒的细胞作为阴性对照，24h后，弃去培养液，加入冰浴的PBS清洗细胞3次，加入200μL4％甲醛4℃固定30min，弃去固定液，加入PBS清洗3次，5min/次，加入100μL鼠源抗VP1的4B2单抗，37℃作用1h，加入PBS清洗3次，5min/ 次，加入PBS 100倍稀释的FITC标记山羊抗小鼠IgG(H+L)，37℃孵育1h，避光保存，如图6所示，用荧光显微镜观察结果表明:重组毒可观察到特异性荧光，而对照组没有荧光，说明病毒rBEV-E0拯救成功。

5.6电镜观察

将分离纯化后的拯救病毒在MDBK细胞上培养，出现80％CPE后收获500mL病毒液，先通过4℃差速离心：4000r/min 10min，8000r/min 10min，12000r/min 10min，去除杂质，再经过0.22um滤器过滤，之后用浓缩杯浓缩病毒液到15mL，然后经过分子筛纯化病毒，最后再用10kD的浓缩管将病毒液浓缩到2mL，浓缩好的病毒液交由中国农科院加工所做透射电镜观察。如图7所示电镜观察到BEV 的病毒颗粒，没有囊膜，直径为25～30nm的球形。

5.7拯救病毒TCID₅₀测定

测定拯救病毒在MDBK细胞上的半数感染量，将经过纯化并且稳定传代的第 10代拯救病毒用无血清DMEM做10倍倍比梯度稀释(10^-1～10^-11)，然后将每个稀释度的病毒液分别加入到96孔细胞培养板上，100μL/孔，每个稀释度重复7 孔，无血清DMEM做阴性对照。放到细胞培养箱中感染1h后，弃上清，1×PBS 清洗，加入100μL含2％胎牛血清DMEM维持液培养。逐日观察至48h，记录每个稀释度出现病变的情况。按Reed-Muench法计算病毒的TCID₅₀。结果表明拯救病毒的TCID₅₀为10-6/0.1mL。

5.8拯救病毒生长曲线测定

将亲本毒和重组病毒rBEV-E0按照100TCID₅₀分别接种于MDBK细胞上，37℃作用2h，用PBS洗去未吸附的病毒，加入含有2％FBS的DMEM培养基，在接毒后3、6、12、24、36和48h取样，反复冻融3次，收获病毒液，测定取样时间的病毒TCID₅₀并制作病毒的生长曲线。如图8所示，结果表明重组病毒与亲本毒具有相似的生长特性。

小鼠感染模型的建立

将18只6～8周龄Balb/c雌鼠随机分为两组，每组6只。试验组每只腹腔注射108TCID₅₀的rBEV-E0病毒液，阳性对照组免疫相同剂量的BVDV，同时设立空白对照组，每天观察小鼠活动情况。在免前第0d，免后第7、14、21、28d 时取小鼠血液分离血清，进行BEV-VP1和BVDV-E0抗体的ELISA检测。以OD₄₅₀值为纵坐标，攻毒天数为横坐标，如图9和图10所示，实验组(rBEV-E0)和阳性对照组(rBEV)免后7天均出现VP1抗体，其中rBEV在第14-21天达到较高的抗体水平，rBEV-E0在第21天前后才达到与其相应的抗体水平。对于E0抗体的检测，在检测的时间点里抗体水平与阳性对照相近，但均低一些，综上， rBEV-E0免疫小鼠产生了有效的免疫应答。

以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围内。

序列表

<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

<120> 一种表达BVDV-E⁰的重组牛肠道病毒的构建方法与初步应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 7409

<212> DNA

<213> 牛肠道病毒BJ101毒株(Bovine enterovirus BJ101)

<400> 1

ttaaaacagc ctgggggttg tacccacccc tggggcccac gcggcgccag tactctggtt 60

cgattagaac ctttgtacgc ctgttttccc ctcccttaaa caaattaaga tctctgccaa 120

tgtggggagt agtccgactc cgcaccgata cgtcgcacca gcagaccggt tcgcttagga 180

cccttctgcg gattggtatg agtccctctc ccgaaactta gaagtttgga caaaccgacc 240

aataggtgcg tggcatccag ccatgttacg gtcaagcacc tctgtttccc cggtcagaaa 300

tgatcgttac ccgccctacc cactacgaaa agcctattaa ccattgaaag tgatgaggag 360

ttgcgctcag ccatgacccc gatggtagct ctgagggatg gagctcgcag ttcccccgtg 420

gtaacacggt tgcttgctcg cgtgtgccct tgggttcgac catttggtcg ttcactccaa 480

atcatcgtaa atggccaaga gccaattgtg ctggggaggt tttcctccgg agccgtgaat 540

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tctattattt ggtatcattc tacaatacct cagaacttac ggttgagctc attgatttcc 780

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ctacgattac aacacaagaa gcagccaaca tttgcgttgc ctacggagtc tggccatcca 1140

aattgtccga tcatgacgca acgtccgttg ataaaccaac tgaaccaggc gtaagtgctg 1200

agcgcttcta caccctgcgc tcgaaggctt gggaagcgaa cagcacgggc tggtactgga 1260

aattgcccga cgccttgaac aacacaggca tgttcggcca aaacgcacag ttccactata 1320

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ggactagtct tggcaatgcc ctcatctacc cgcaccagtg gattaacctg aggacgaata 1560

attcagctac cctgatcctg ccgtatgtga atgccatccc aatggactca gccatacgcc 1620

actcaaactg gacacttgca atcatcccag tcgctgctct gaagtatgca gcggacacca 1680

ccccactagt cccaatcacc gtgaccatcg caccaatgga gactgaatat aatgggttga 1740

ggagagccat tgcctccaat cagggactgc ctactaaacc gggaccaggt tcgtatcaat 1800

tcatgaccag tgatgaggat tccacgcctt gcatacttcc tgatttccaa ccaactcccg 1860

agatattcat acctggggag gttaccaacc tactccagat agcccaggtg gaatcaatcg 1920

tggaagccaa caacattagg gatgccacgg gtgttgagcg ctatgttatc ccagttagtg 1980

ttcaggacgc gcttgactca cagatttatg ttctgaagct agaactgggt ggagccggac 2040

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acacgccccc aggaggagat atgccccgca atagagagga ggcgatgcta ggtacccatg 2220

ttatatggga ctttggtttg cagtcatcca taacacttgt tgtgccgtgg atttccgcgt 2280

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gcattatcat gttagtcgcc gcacaaccca acttctcatt taggattcag aaagacaggg 2460

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atgagagtat gatcgagacg cgcaccatcg tccccaccca tggcgtgcac gagactagtg 2700

tggagagttt ctatggaaga tctgccctcg ttggcatggt tactttgccc cccggttcgc 2760

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caaattttta tgatggctac gcccgcttca tggacacaag cccggacaga tacggcctac 3120

tcccgagtaa ctttcttggc cttatgtatt tcaggtgtct tgaggatacc acagataatg 3180

ttaggtttcg catctatgcg aagatcaaac acacgagatg ctggattcct agggcacccc 3240

gccaagcacc atataagaag aggtacaatc ttgtgtttga tgggaccacc gataagatct 3300

gcaccgatcg atcctccctg accacattgg gcccatttgg acaacagcaa ggggcagctt 3360

atgttggtag ctacaagata gtcaacagac acttagccag ttacaaagat tgggagaatg 3420

aggtatggca atcctatcag agggatcttc tcgtcaccag agttgatgct catggttgcg 3480

acaccatcgc cagatgtaat tgtaggagtg gtgtttacta ttgtaagtcc aggaacaagc 3540

actaccctat tgtagttacc cccccttcca tttttaaaat tgaggccaat gattattacc 3600

ctgagagaat gcaaacccac atcctccttg gaattggctt cgctgaacca ggtgattgtg 3660

gaggccttct tcgctgtgaa catggcgtaa tgggcatcct cacggttgga ggtggtgacc 3720

tggtgggctt cgccgacatt cgtgatttgc tttggattga agatgatgcc atggagcagg 3780

gcattaccga ttatgttcaa cagctcggga atgcctttgg cgcgggcttt actgccgaaa 3840

ttgccaatta taccaatcaa ctcagagaca tgcttattgg gtctgattca gtggtggaaa 3900

agattatccg agccctagtg aggctcgtct cagctctggt tatagttgtg agaaatcacc 3960

aggacttggt cactgtaggt gcaacccttg ccctccttgg gtgcgagggg tccccctgga 4020

aatggctcaa gaggaaggtg tgtcaagtct tagggataaa catggctgag aagcagtcag 4080

ataattggat gaagaaattt accgagatgt gtaacgcatt tcgcgggctt gattggattg 4140

cggcaaagat ttctaagttc attgagtggc ttaaacagaa aatcctcccc gagcttaagg 4200

aaagagccga gtttgtgaag aatctgaagc agctcccatt attggaggca caggttaaca 4260

ctctggagca ctcctccgca agtcaggaaa aacaagaaca attgtttgga aatatccaat 4320

atctagccca ccactgcagg aagaacgcac cactttacgc agcagaggca aagagagtct 4380

atcaccttga gaagcgcgtt ctcggagcca tgcagttcaa gaccaagaat cgcattgaac 4440

ctgtatgcgc cctaatacac gggtccccgg gtaccggtaa gtccctcgct accatgatag 4500

taggcagaaa gcttgctgaa tatgagggtt cagatgtcta ctccttgcca cccgaccctg 4560

accattttga tggctaccaa caacaggctg ttgtagttat ggatgatctg ctgcagaacc 4620

cagatggaaa ggacatgact ttgttttgtc aaatggtgtc aaccgcacct ttcactgttc 4680

caatggccgc tcttgaagac aaggggaagt tatttacttc gaagtttgtg ctggcctcta 4740

ccaatgctgg acaggtcacg ccgcctaccg tggctgatta taaggcactc caacgcaggt 4800

tcttctttga ttgtgatatt gaaatccaga aagagtacaa gcgcaacggc gttaccttgg 4860

acgttgctaa ggccactgag acttgcgagg attgctcccc tgttaatttc aagaagtgca 4920

tgcctctgat ttgcggcaag gcccttcaat tgaagtccag aaagggagat ggaatgagat 4980

acagcttgga caccctcata tcagaattac gccgtgagag caataggcgt tataacattg 5040

ggaacgtcct cgaggcactc ttccagggcc cagtttgcta caaacccctc aggattgagg 5100

tgcacgagga ggaacccgct ccctcggcca ttagtgatct tttgcaggct gttgacagcg 5160

aggaagtccg agagtactgt cgttccaagg gctggattgt agaggagaga gtcactgagc 5220

tacgccttga gcgcaacgtc aaccgcgccc ttgccatcgt gcagagtgtc tccctagttg 5280

ccgctgtagc agggacgatc tatattgtct acagactgtt ttcaggcatg cagggaccct 5340

attctggtat tggcacgaat tatgccacaa agaaacccgt ggtgaggcaa gtacagacgc 5400

agggcccact ttttgacttc ggcgtctcct tgttgaagaa aaatattaga acggtgaaga 5460

cagagagtgg ggagttcaca gcccttggtg tctatgacac agtgatagta ctcccgcgcc 5520

attctatgcc tggcaaaaca attgaaatga acggcaagac agtggaagtg cttgatgcat 5580

atgacttgaa tgacaagaca gacacctcct tggagctaac cattgtgaaa cttaaaatca 5640

atgagaaatt tagagatatt agggccatga tcccggacca gatcactgat tacaatgagg 5700

ccatagtggt ggttaatacc tcctattacc cacagctttt tatgccggtt ggcagagtga 5760

aggattatgg atttcttaac ctagctggcc gccccactca cagagtcctg atgtatgagt 5820

tcccgacaaa ggcgggccag tgtggtggtg tggtggtcag catgggcaag attgttggca 5880

tccacgtagg gggaaacggt gcgcaaggct ttgcagcctc gttactccgc cgttacttta 5940

ccgccgagca aggccaaata gagtacatgg agaagagcag ggatgccggt ttcccggtaa 6000

ttaatgcccc cactcaaacc aagcttgagc ctagtgtttt ccatgatgtt ttcccgggtg 6060

ttaaagaacc agccgtcctg cataagaagg ataagaggct aaaggtcaat tttgaggatg 6120

ccctcttttc aaaatatatt ggcaatgtgc aaagagatat gccagaggag ttgcttatag 6180

ctattgatca ttattcagag caactcaaaa tgctaaatat tgatcctagg cccatatcca 6240

tggaggatgc catttatggt actgaaggct tggaggccct ggatttgggc actagtgcag 6300

gttacccata tgttgcaatg ggaatcaaga aaagagacat tctaaacaag gaaaccagag 6360

atgtgtctaa gatgcaagaa tgcataaaca agtatggcct caatttgccc atggtcactt 6420

atgtgaaaga tgagctcagg gcaccagaca agatagctaa gggaaaaagt cgcctcattg 6480

aggcgtccag cttgaatgat tctgtggcaa tgcgatgcta ttttggaaat ttgtacaaag 6540

cctttcacac caatcccggc acaatcagcg ggtgtgcagt tggttgcgac cctgaaacct 6600

tctggagtaa gatacccgtt atgatggatg gtgagttatt tggatttgat tatactgcct 6660

atgatgcaag cctctccccg atgtggtttc acgccttggc tgaggtgcta agaagaatag 6720

gattcgtgga gtgcaagcat tttattgatc aactttgctg cagccaccac ctgttcatgg 6780

ataagcatta ttatgttgtg ggcggcatgc catctggctg ctctggaacc tccatcttca 6840

attccatgat caacaacctg ataattcgga ccctaatcct tacagtctac aaaaacattg 6900

atttggatga cctcaagata attgcctacg gtgacgacgt tttggcttcg tacccgtatg 6960

aaattgacgc cagcctcctt gctgaagctg gtaagagttt cgggctaatc atgactccac 7020

cagacaagtc cgacactttt gttaagttaa cctgggacaa cgtcaccttt ttgaagagga 7080

agtttgtgcg cgatgcgcga taccccttcc ttgttcatcc ggtcatggat atggcgaaca 7140

tccatgagtc cattcgctgg acaaaagatc ccagacacac tgaagatcat gtacgctcac 7200

tgtgcttatt ggcttggcac tgcggtgaga aggagtacaa tgagtttata gaaaagattc 7260

gaaccgtccc tgtcggtcgt gccctgcact taccctcatt caaggcactt gagaggaaat 7320

ggtacgattc tttttaatta agtggccaac ttgatgatcc ggttcaatta gcttcaaatt 7380

ggcattaata cacccaccgg atggggtgt 7409

<210> 2

<211> 696

<212> DNA

<213> 牛病毒性腹泻病毒E0基因(优化Bovine viral diarrhea virus-E0)

<400> 2

gccggccgcg agaacatcac ccagtggaac ctgcaggaca acggcaccga gggcatccag 60

agggccatgt tccagagggg cgtgaacagg agcctgcacg gcatctggcc cgagaagatc 120

tgcaccggag tgcccagcca tctggccacc gacaccgagc tgaaggccat ccacggcatg 180

atggacgcca gcgagaagac caactacaca tgctgcaggc tgcagaggca cgagtggaac 240

aagcacggat ggtgcaactg gtacaacatc gagccctgga tcctgctgat gaacaagacc 300

caggccaatc tgaccgaggg ccagcccctg agagaatgcg ccgtgacctg caggtacgac 360

aggaacagcg acctgaacgt ggtgacccag gccagagaca gccccacccc tctgacaggc 420

tgcaagaagg gcaagaactt cagcttcgct ggcatcctcg tgcagggccc ctgcaatttc 480

gagattgccg tgtccgacgt cctgttcaag gagcaggact gcaccagcgt gatccaggac 540

accgctcact acctggtgga cggcatgacc aacaccctgg agtccgctag gcagggcaca 600

gccaagctga ccacctggct gggaaagcag ctgagaatcc tgggcaagaa gctggagaac 660

aagtccaaga cctggttcgg cgcctacgcc tctaga 696

Claims (2)

1.一种表达牛病毒性腹泻病毒E0基因的BEV重组病毒，其特征在于：所述BEV重组病毒为BEV BJ101株的感染性克隆毒株，BEV BJ101株的全基因序列如SEQ ID NO.1所示，所述感染性克隆毒株是通过反向遗传操作的方法获得BEV BJ101毒株的全长cDNA克隆并获得拯救毒株rBEV后，将优化后的牛病毒性腹泻病毒E0序列插入到BEV全长cDNA的非结构蛋白2C和3A之间，获得可稳定表达外源基因E0的重组牛肠道病毒，所述优化后的牛病毒性腹泻病毒E0序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的一种表达牛病毒性腹泻病毒E0基因的BEV重组病毒,其特征在于:所述牛病毒性腹泻病毒E0基因的优化包括，对E0基因序列先进性哺乳动物密码子优化，再在其5’端添加合成GCCGGCCGC NotI酶切位点序列，在其3’端添加合成TCTAGA XbaI酶切位点序列，以便于通过NotI、XbaI双酶切后与引入NotI、XbaI双酶切位点的GpBSK-rBEV的质粒进行连接，所述GpBSK-rBEV质粒为插入全长BEV BJ101全基因序列的GpBSK重组载体。

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