CN108130315B

CN108130315B - H3n2亚型猪流感病毒细胞适应株及其制备的灭活疫苗和应用

Info

Publication number: CN108130315B
Application number: CN201711387981.XA
Authority: CN
Inventors: 王静; 赵辉; 柴华; 张智明; 闫冰; 梁宛楠; 于鑫; 赵刚; 孙晓峰; 张凤强
Original assignee: Harbin Pharmaceutical Group Bio Vaccine Co ltd
Current assignee: Harbin Pharmaceutical Group Bio Vaccine Co ltd
Priority date: 2017-12-20
Filing date: 2017-12-20
Publication date: 2021-08-13
Anticipated expiration: 2037-12-20
Also published as: CN108130315A

Abstract

本发明公开了一株H3N2亚型猪流感病毒细胞适应株及其制备的灭活疫苗和应用。本发明首先公开了一株H3N2亚型猪流感病毒细胞适应株SIV‑H3N2‑HLJ株，其微生物保藏编号为CGMCC No.14740。本发明进一步公开了所述H3N2亚型猪流感病毒细胞适应株SIV‑H3N2‑HLJ株在制备预防猪流感的疫苗中的应用。本发明还公开了一种预防猪流感的疫苗组合物，包括：预防上有效量的灭活的所述H3N2亚型猪流感病毒细胞适应株SIV‑H3N2‑HLJ株和药学上可接受的佐剂。本发明所述细胞适应株SIV‑H3N2‑HLJ株具有良好的免疫原性，能对猪提供良好的免疫保护，可作为H3N2亚型猪流感防控的候选疫苗株。

Description

H3N2亚型猪流感病毒细胞适应株及其制备的灭活疫苗和应用

技术领域

本发明涉及一株H3N2亚型猪流感病毒细胞适应株，还涉及所述H3N2亚型猪流感病毒细胞适应株制备的灭活疫苗及在预防猪流感中的应用，属于H3N2亚型猪流感病毒的分离及应用领域。

背景技术

猪流感(Swine influenza，SI)是由A型流感病毒引起的一种急性、热性、高度接触性呼吸道传染病。该病传染性强、发病率高，其临床症状表现为咳嗽、喷嚏、流涕、体温升高、呼吸困难和食欲下降、延迟出栏等。单纯感染死亡率不高，但会对猪的生长性能造成不良的影响；与其他病原混合感染，会使病情加重，死亡率增高，给养猪业造成严重经济损失，是危害中国养猪业较为严重的传染病之一。在中国猪群中，H3N2亚型猪流感病毒是最主要流行的猪流感之一。

对于H3N2亚型猪流感的防控尚无特别有效的手段，主要通过免疫接种进行预防。目前所研制并已商品化的主要是由鸡胚繁殖、辅以佐剂的H1和H3亚型单价或双价灭活疫苗。这类疫苗可以刺激机体产生IgG，对于阻止病毒感染和减轻临床症状十分重要，其保护率高、安全性好，无毒力返强的危险。但由于其采用鸡胚进行疫苗制备，不仅生产成本比较昂贵，还需要处理鸡胚废弃物，存在散毒的危险，因此用细胞进行疫苗的制备将更加廉价和安全。另外，SIV灭活疫苗需要克服异源保护力差、流行毒株抗原性更新快等问题，制备的疫苗需要流行的毒株来进行及时更新，以保证灭活效果。因此，进行现地流行株的分离、细胞适应株的筛选，对于H3N2亚型猪流感的有效防控具有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是提供一株H3N2亚型猪流感病毒细胞适应株；

本发明所要解决的第二个技术问题是提供所述H3N2亚型猪流感病毒细胞适应株制备的灭活疫苗及其在预防猪流感中的应用。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

本发明从黑龙江某猪场疑似猪流感发病的猪鼻拭子和肺脏组织中，分离得到一株猪流感病毒。血清学鉴定结果表明，该毒株样品仅能被H3亚型特异性血清中和，确定该毒株为H3亚型猪流感病毒。本发明利用猪流感H1、H3、N1和N2的分型鉴定引物对分离的病毒进行RT-PCR鉴定，结果仅H3和N2两对引物扩增出与预期扩增大小一致的片段。

本发明将分离的猪流感病毒进行3轮蚀斑克隆纯化，纯化后将分离的毒株命名为猪流感病毒SIV-H3N2-HLJ株。本发明对纯化的病毒进行红细胞凝集价和病毒含量的测定，结果猪流感病毒SIV-H3N2-HLJ株的红细胞凝集价为1:1024，病毒含量为10^7.50EID₅₀/mL。

本发明将纯化的猪流感病毒SIV-H3N2-HLJ株接种MDCK细胞进行大量细胞适应性培养，当传代至第6代时，病毒的红细胞凝集价逐渐稳定，为1:256，获得了一株细胞适应株。本发明将上述猪流感病毒SIV-H3N2-HLJ株细胞适应株接种于MDCK细胞，对培养条件进行优化，结果当病毒接种量为1％、吸附时间为1.5h、TPCK-胰酶的终浓度为2.5μg/ml、血清浓度为1％的条件下获得病毒液的红细胞凝集价最高，为1:512。

本发明进一步克隆了猪流感病毒SIV-H3N2-HLJ株细胞适应株的HA基因和NA基因并进行测序及序列分析。测序结果表明，猪流感病毒SIV-H3N2-HLJ株细胞适应株HA基因ORF核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，NA基因ORF核苷酸序列为SEQ ID No.2所示。对HA和NA基因的遗传进化树分析结果表明，该毒株为H3N2亚型猪流感病毒，命名为A/Swine/HeiLongjiang/8/2015(H3N2)株，简称SIV-H3N2-HLJ株。对猪的致病力试验结果表明，健康易感猪注射细胞适应株SIV-H3N2-HLJ株，有4/5的猪发病。

本发明将所述H3N2亚型猪流感病毒细胞适应株SIV-H3N2-HLJ株提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC No.14740；分类命名为：H3N2亚型猪流感病毒。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是2017年11月16日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明进一步公开了所述的H3N2亚型猪流感病毒细胞适应株SIV-H3N2-HLJ株在制备预防猪流感的疫苗中的应用。

本发明还公开了一种预防猪流感的疫苗组合物，包括：预防上有效量的灭活的所述H3N2亚型猪流感病毒细胞适应株SIV-H3N2-HLJ株和药学上可接受的佐剂。

本发明还公开了一种H3N2亚型猪流感灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：(1)增殖所述H3N2亚型猪流感病毒细胞适应株SIV-H3N2-HLJ株，收获病毒液；(2)将病毒液加入灭活剂进行灭活；(3)将灭活的病毒液与佐剂混合，乳化，即得。

其中，步骤(1)用MDCK细胞增殖所述H3N2亚型猪流感病毒细胞适应株SIV-H3N2-HLJ株。所述增殖的方式包括：将H3N2亚型猪流感病毒细胞适应株SIV-H3N2-HLJ株接种MDCK细胞进行转瓶培养，或者将H3N2亚型猪流感病毒细胞适应株SIV-H3N2-HLJ株接种在生物反应器中悬浮培养的MDCK细胞，进行悬浮培养。

作为本发明的优选技术方案，步骤(1)采用生物反应器悬浮培养MDCK细胞，增殖所述H3N2亚型猪流感病毒细胞适应株SIV-H3N2-HLJ株；更优选的，所述生物反应器的参数包括：转速为50-80r/min，溶氧度为50-80％，pH值为7.0-7.2；所述H3N2亚型猪流感病毒细胞适应株SIV-H3N2-HLJ株的接毒量为1％(v/v，与生物反应器中添加细胞混悬液总体积的体积比)。

进一步的，步骤(1)所述采用生物反应器悬浮培养MDCK细胞，增殖所述H3N2亚型猪流感病毒细胞适应株SIV-H3N2-HLJ株，包括：

(a)将MDCK细胞调整细胞浓度至4-6×10⁶cells/ml，加入一级生物反应器，使细胞浓度达到0.5-1.0×10⁶cells/ml，调整生物反应器搅拌转速为50-80r/min，溶氧为50-80％，pH值7.0-7.2，37℃培养48-72h；

(b)待细胞密度达4.0-6.0×10⁶cells/ml时，将一级生物反应器培养的MDCK细胞接种至二级生物反应器，使细胞密度为0.5-1.0×10⁶cells/ml，调整生物反应器搅拌转速为50-80r/min，溶氧为50-80％，pH值为7.0-7.2，37℃培养，待细胞密度达1.5-2.0×10⁶cells/ml时，进行病毒接种；

(c)按1％接毒量(v/v，与生物反应器中添加细胞混悬液总体积的体积比)接种所述H3N2亚型猪流感病毒细胞适应株SIV-H3N2-HLJ株，并加入终浓度为2.5μg/ml的TPCK-胰酶，调整生物反应器搅拌转速为50-80r/min，溶氧为50-80％，pH值为7.0-7.2，37℃继续培养；当80％以上细胞病变时收获病毒液，即得。所述收获病毒液具体包括：反复冻融细胞2次后，在常温下用连续离心机以5000-10000r/min离心，去除细胞碎片，收集上清，即得。置2-8℃保存，不超过30日。

本发明所述H3N2亚型猪流感灭活疫苗的制备方法，步骤(1)需对病毒液的红细胞凝集价和病毒含量进行测定，将病毒含量合格的病毒液进行灭活。步骤(2)所述灭活剂为二乙烯亚胺(BEI)；优选的，按照g/mL计，所述灭活剂的终浓度为0.2％。步骤(2)所述灭活为30℃灭活36h，然后加入终浓度0.2％(g/mL)的硫代硫酸钠溶液终止灭活。步骤(3)按照体积比计，灭活的病毒液：佐剂＝9：1。优选的，步骤(3)所述佐剂为Montanide ISA 15A VG佐剂。所述乳化的方法为：先将水相加入乳化罐内慢速搅拌，然后缓慢加入油相佐剂，加完后以800r/min搅拌30分钟，再静止30分钟，即制备成H3N2亚型猪流感灭活疫苗。

本发明所述H3N2亚型猪流感灭活疫苗的制备方法中，使用的MDCK细胞是改造后可以直接进行悬浮培养的细胞，MDCK细胞在生物反应器中进行悬浮培养，不需要生长在微载体上，避免使用微载体而产生较高的成本。悬浮细胞培养是具有更多优势的病毒培养方式。

本发明对所述生物反应器，包括一级生物反应器和二级生物反应器的型号没有特殊限制，本领域能够用于细胞培养的生物反应器均适用于本发明。作为本发明的优选技术方案，所述一级生物反应器为AP20-II型-10L，(荷兰Applikon公司)；所述二级生物反应器为TXHBIO-30F-TC(天信和(苏州)生物科技有限公司)。

本发明利用生物反应器培养的H3N2亚型猪流感病毒细胞适应株SIV-H3N2-HLJ株病毒液，其TCID₅₀为10^7.33/mL，利用转瓶培养的H3N2亚型猪流感病毒细胞适应株SIV-H3N2-HLJ株的TCID₅₀为10^6.67/mL。比较可见，本发明利用生物反应器培养的H3N2亚型猪流感病毒细胞适应株SIV-H3N2-HLJ株比转瓶培养获得的病毒效价显著提高。

本发明还公开了所述制备方法制备得到的H3N2亚型猪流感灭活疫苗。

本发明制备得到的H3N2亚型猪流感灭活疫苗为水包油型疫苗，疫苗中所含H3N2亚型猪流感病毒细胞适应株SIV-H3N2-HLJ株≥10^7.00TCID₅₀/头份。

安全性评价结果表明，本发明制备的H3N2亚型猪流感灭活疫苗对易感仔猪的安全性良好。免疫效力评价结果表明，本发明制备的H3N2亚型猪流感灭活疫苗可有效地诱导特异性抗体的生成，免疫效果良好，能完全抵抗该亚型流感病毒的攻击，对猪提供良好的免疫保护；疫苗接种1次，免疫期不小于4个月，可使猪在整个生长周期内免受H3N2亚型猪流感病毒感染。

本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：

本发明从疑似猪流感发病的猪鼻拭子和肺脏组织中分离到一株猪流感病毒，对该分离株进行大量细胞适应性培养获得了一株H3N2亚型猪流感病毒细胞适应株SIV-H3N2-HLJ株，该毒株为强毒株，而且具有良好的免疫原性，能够有效地诱导特异性抗体的生成，对猪提供良好的免疫保护。本发明利用生物反应器悬浮培养的MDCK细胞增殖的H3N2亚型猪流感病毒细胞适应株SIV-H3N2-HLJ株比转瓶培养获得的病毒效价显著提高。因此，利用悬浮细胞培养H3N2亚型猪流感病毒细胞适应株SIV-H3N2-HLJ株，制备灭活疫苗的生产成本更低，安全性更高。本发明所述H3N2亚型猪流感病毒细胞适应株SIV-H3N2-HLJ株可作为H3N2亚型猪流感防控的候选疫苗株。

附图说明

图1为猪流感分离株电镜观察结果；

图2为猪流感HA亚型鉴定结果；其中，M：DL 2000；H1U/L扩增：1：待检样品；2：H1阳性质粒；3：阴性对照；H3U/L扩增：4：待检样品；5：H3阳性质粒；6：阴性对照；

图3为猪流感NA亚型鉴定结果；其中，M：DL 2000；N1U/L扩增：1：待检样品；2：N1阳性质粒；3：阴性对照；N2U/L扩增：4：待检样品；5：N2阳性质粒；6阴性对照；

图4为猪流感H3HA基因全长扩增结果；其中，M：DL 2000Maker；1：第2代分离株；2：H3亚型参考毒株；3：阴性对照；

图5为猪流感N2NA基因全长扩增结果；其中，M：DL 2000Maker；1：第2代分离株；2：N2亚型参考毒株；3：N2亚型阴性对照；

图6为H3N2亚型猪流感病毒细胞适应株SIV-H3N2-HLJ株HA基因遗传进化树；

图7为H3N2亚型猪流感病毒细胞适应株SIV-H3N2-HLJ株NA基因遗传进化树。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

实施例1H3N2亚型猪流感病毒毒株的分离和鉴定

1、鸡胚和病料

SPF鸡胚，购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司；病料采集于黑龙江某猪场疑似猪流感发病的鼻拭子和肺脏组织。将病料使用研磨器研磨，反复冻融3次后，与PBS(0.1mol/L，pH 7.2)以1:5(V/V)混合后，3000r/min离心15min，取上清，经0.22μm滤膜除菌后，-70℃保存备用。

2、病毒分离

将上述上清液经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚5枚，0.2ml/胚，35℃孵化箱中(湿度保持为60～65％)培养，每日检胚2次，24小时内死亡的鸡胚弃去，24小时后死亡的鸡胚随时收获，至72小时，取出全部鸡胚，置2～8℃冷却12小时，分别收获鸡胚液，留样进行红细胞凝集试验。对于第1代凝集价阴性的按以上方法盲传3代，如仍为阴性则弃去，阳性样品-70℃以下保存备用。结果在盲传1代时，得到一株具有血凝性的细胞培养物。培养物送哈尔滨兽医研究所进行电镜鉴定，结果见图1。

3、病毒的鉴定

3.1血清学鉴定

将上述红细胞凝集阳性的样品配制成4HAU抗原，通过猪流感H1亚型特异性抗血清(HI效价为1:640)、H3亚型特异性抗血清(HI效价为1:640)、H5亚型特异性抗血清(HI效价为1:320)和H9亚型特异性抗血清(HI效价为1:320)进行红细胞凝集抑制试验进行血清学鉴定，结果该样品仅能被H3亚型特异性血清中和，确定为H3亚型猪流感病毒。

3.2RT-PCR法鉴定

将上述分离的病毒用RT-PCR法进行鉴定。参照齐海涛等人的研究成果合成了猪流感H1、H3、N1和N2的分型鉴定引物，所扩增片段大小依次为320bp、750bp、738bp和498bp。所合成的引物序列见表1。引物由上海生物工程有限公司合成。

将提取的RNA经过反转录后，进行PCR鉴定。PCR扩增反应体系(50ul体系)：

表1猪流感亚型分型鉴定引物

PCR反应条件：94℃预变性5min，进入循环，94℃变性，1min；53℃退火，1min；72℃延伸，1min；30个循环后，72℃，延伸10min，4℃终止循环。

结果表明，RT-PCR扩增仅H3和N2两对引物扩增出与预期扩增大小一致的片段，而H1和N1两对引物均未扩增出相应的片段，结果见图2和图3。本发明将分离的猪流感病毒暂命名为猪流感病毒SIV-H3N2-HLJ株。

4、病毒的纯化

将猪流感病毒SIV-H3N2-HLJ株病毒液用生理盐水做10倍系列稀释，取其中的10^-5、10^-6、10^-7和10^-8 4个稀释度，接种于10日龄SPF鸡胚，每个稀释度作4个重复，0.1ml/孔。35℃恒温培养箱培养，逐日观察。培养72天后，对每个胚进行红细胞凝集价测定，挑出最高稀释度的具有红细胞凝集价的胚液，按上述方法进行第2轮克隆纯化，共进行3轮。纯化后将分离的毒株命名为猪流感病毒SIV-H3N2-HLJ株，对纯化的病毒进行红细胞凝集价和病毒含量的测定，结果，SIV-H3N2-HLJ株的红细胞凝集价为1:1024，病毒含量为10^7.50EID₅₀/mL。

5、SIV-H3N2-HLJ株病毒的细胞适应及培养条件的优化

将纯化的SIV-H3N2-HLJ株病毒，按照10％的接毒量接种长满单层的MDCK细胞，在35℃、TPCK胰酶终浓度为2.0μg/ml、含2％的胎牛血清的DMEM培养液中培养，逐日观察病变，72小时后，收获。冻融2次后，测定红细胞凝集价并按上述方法进行传代。当传代至第6代时，病毒的红细胞凝集价逐渐稳定，为1:256。

将上述猪流感病毒SIV-H3N2-HLJ株细胞适应株，接种于MDCK细胞，通过比较不同的病毒接种量(0.5％、1.0％、1.5％、2.0％和3.0％)、不同的病毒吸附时间(0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、2.5h)、不同的TPCK-胰酶添加浓度(1.0μg/ml、1.5μg/ml、2.0μg/ml、2.5μg/ml、3.0μg/ml)以及不同的血清浓度(0.5％、1％、1.5％和2.0％)，确定其最佳的培养条件；对不同条件培养的病毒以红细胞凝集(HA)方法检测病毒滴度。结果，当病毒接种量为1％、吸附时间为1.5h、TPCK-胰酶的终浓度为2.5μg/ml及血清浓度为1％的条件下获得病毒液的红细胞凝集价最高，为1:512。

6、猪流感病毒SIV-H3N2-HLJ株HA基因和NA基因的克隆、测序及序列分析

PCR扩增反应体系(50ul体系)：

PCR反应条件：94℃预变性5min，进入循环，94℃变性，1min；56℃退火，1min；72℃延伸，1min；30个循环后，72℃，延伸10min，4℃终止循环。

结果表明，PCR分别扩增出一条1700bp和1400bp左右的条带，与预期扩增的片段大小一致，结果见图4和图5。

将上述PCR扩增的产物纯化后，回收目的片段，克隆至pMD-18T载体，筛选出阳性克隆后，送invitrogen公司进行测序。测序结果表明，猪流感病毒SIV-H3N2-HLJ株细胞适应株HA基因ORF核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，NA基因ORF核苷酸序列为SEQ ID No.2所示。对测序结果进行遗传进化树的构建，结果见图6和图7，可知所分离的毒株为H3N2亚型猪流感病毒，命名为A/Swine/HeiLongjiang/8/2015(H3N2)株，简称SIV-H3N2-HLJ株。

7、对猪的致病力试验

用4～6周龄的健康易感猪5头，各经气管注射毒种4.0ml(每毫升病毒含量≥10^7.0EID₅₀)。攻毒后，每日定时测温1次，连测5日，并观察记录流感样临床症状；攻毒后1～3日，对每头猪每日采集1次鼻拭子，鼻拭子样品各经尿囊腔接种10～11日龄SPF鸡胚5枚，每胚0.2ml，置35℃继续孵育观察72小时，逐个收获鸡胚液，分别测定红细胞凝集价，每头猪的鼻拭子样品接种鸡胚中有1枚鸡胚液红细胞凝集价不低于1:16，即判为病毒分离阳性，对分离阴性的样品，盲传1代后再进行判定；攻毒后5日，剖检，观察肺脏病理变化。临床症状、病毒分离及肺部病变3个指标中有2个指标为阳性则判定为发病。结果表明，有4/5的猪发病(表2)。

本发明将所述H3N2亚型猪流感病毒细胞适应株SIV-H3N2-HLJ株提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC No.14740。

表2H3N2亚型猪流感病毒攻毒试验结果

注：“-”阴性；“+”阳性；临床症状、病毒分离和肺脏病变3个指标中有2个指标阳性即判为发病。

实施例2用生物反应器培养猪流感H3N2亚型病毒的生产工艺

1)细胞的筛选与复苏

MDCK细胞在培养传代时，逐渐降低培养液中血清的含量，最终获得能适应无血清培养基培养的细胞，建立无血清培养的细胞种子批。将上述细胞在摇瓶中进行全悬浮适应培养，并通过单细胞克隆筛选，最终获得一株可适应全悬浮培养的MDCK细胞系(所述MDCK细胞系由哈药集团生物疫苗有限公司选育并对外出售)。

将冻存的MDCK细胞从液氮中取出后，立即置37℃水浴中快速融化，用吸管转移至75ml细胞瓶中，加入适量的DMEM培养液(含6％胎牛血清)，置37℃恒温培养箱静止培养。一般情况下，48h可形成良好细胞单层，然后按1:3～1:5比例进行传代。

2)一级生物反应器细胞培养

当上述培养的细胞达到一定数量后，调整细胞浓度至4～6×10⁶cells/ml，按一定比例加入一级生物反应器(AP20-II型-10L，荷兰Applikon公司)，使细胞浓度达到0.5～1.0×10⁶cells/ml，调整生物反应器搅拌转速为50～80r/min，溶氧为50～80％，pH值7.0～7.2，在37℃培养48～72h，待细胞密度达4.0～6.0×10⁶cells/ml时，接种到二级生物反应器扩大，进行扩大细胞培养。

3)二级生物反应器培养

将一级生物反应器细胞按一定比例接种至二级生物反应器(TXHBIO-30F-TC，天信和(苏州)生物科技有限公司)，扩大培养，使细胞密度为0.5～1.0×10⁶cells/ml，调整生物反应器搅拌转速为50～80r/min，溶氧为50～80％，pH值7.0～7.2，待细胞密度达1.5～2.0×10⁶cells/ml时，进行病毒接种。

4)接种

当生物反应器中细胞密度达到1.5～2.0×10⁶cells/ml时，按1％接毒量(v/v，与生物反应器中添加细胞混悬液总体积的体积比)接种H3N2亚型猪流感病毒细胞适应株SIV-H3N2-HLJ株，并加入终浓度为2.5μg/ml的TPCK-胰酶，调整生物反应器搅拌转速为50～80r/min，溶氧为50～80％，pH为7.0～7.2，37℃继续培养。

5)观察和收获

接毒后培养72～96h，逐日取样观察细胞病变状况。当80％以上细胞病变时收获。反复冻融2次后，在常温下用连续离心机以5000～10000r/min离心，去除细胞碎片，收集上清。置2～8℃保存，不超过30日。

6)收获病毒滴度的测定

以DMEM培养液将培养得到的H3N2亚型猪流感病毒细胞适应株SIV-H3N2-HLJ株病毒液作连续10倍稀释，即10^-1、10^-2……10^-8，每个稀释度取100μL加入96孔细胞培养板的孔中，随后加入经胰蛋白酶-EDTA消化分散的MDCK细胞悬液，每孔100μL(细胞含量以3×10⁵/mL左右为宜)，每个稀释度作6个重复，并设正常细胞培养对照，置5％CO₂培养箱中，37℃培养，逐日观察细胞病变和对照，共观察2～4日，并记录细胞病变的孔数，按照Reed-Muench法计算病毒的TCID₅₀；同时以相同的方法对用转瓶培养的H3N2亚型猪流感病毒细胞适应株SIV-H3N2-HLJ株病毒液进行TCID₅₀测定，以此作为对照组。结果表明，利用生物反应器培养的H3N2亚型猪流感病毒细胞适应株SIV-H3N2-HLJ株病毒液其TCID₅₀为10^7.33/mL，利用转瓶培养的H3N2亚型猪流感病毒细胞适应株SIV-H3N2-HLJ株，即对照组的TCID₅₀为10^6.67/mL。由此可见，本发明利用生物反应器培养的H3N2亚型猪流感病毒细胞适应株SIV-H3N2-HLJ株比转瓶培养获得的病毒效价显著提高。

实施例3猪流感H3N2亚型灭活疫苗的制备及其安全性和免疫效力的评价

1)制苗用病毒液的制备

采用实施例2所制备的病毒液作为制备疫苗用病毒液。

2)病毒灭活剂疫苗制备

将上述收获的病毒液加入终浓度为0.2％(m/v，g/mL)的BEI，30℃灭活36h后，加入终浓度为0.2％(m/v，g/mL)的硫代硫酸钠。将灭活检验合格的H3N2亚型猪流感病毒细胞适应株SIV-H3N2-HLJ株病毒液，按照与Montanide ISA 15A VG佐剂＝9:1(v/v)的比例混合，先将水相加入乳化罐内慢速搅拌，然后缓慢加入油相佐剂，加完后以800r/min搅拌30分钟，再静止30分钟，制备成猪流感H3N2亚型灭活疫苗。

3)疫苗的安全性评价

用4～6周龄的健康易感猪5头，各经颈部肌肉接种疫苗4.0ml，连续观察14日，应全部健活，且不出现由疫苗引起的局部或全身不良反应。结果疫苗免疫组的易感仔猪均没有任何不良反应。

4)疫苗的免疫效力评价

本发明采用血清学方法对疫苗的免疫效力进行评价。用4～6周龄的健康易感猪5头，各经颈部肌肉接种疫苗2.0ml，接种后14日，以相同剂量加强免疫1次。另设对照猪5头。在免疫前、首免后7d、14d、21d、28d、60d、90d、120d和150d对所有猪进行采血，分离血清，测定血清中猪流感H3亚型HI抗体效价，结果见表3。当血清中H3亚型HI抗体≥1:160时，能完全抵抗该亚型流感病毒的攻击。由疫苗的血清学评价结果表明，本发明制备的疫苗可以对猪提供良好的免疫保护。

表3免疫后不同时间H3亚型HI抗体测定

注：“-”HI血清抗体阴性。

SEQUENCE LISTING

<110> 哈药集团生物疫苗有限公司

<120> H3N2亚型猪流感病毒细胞适应株及其制备的灭活疫苗和应用

<130> HLJ-3002-170914A

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1701

<212> DNA

<213> swine influenza virus

<400> 1

atgaagacta tcattgcttt gagctacatt ttatgtctgg ctttcgctca aaaacttccc 60

ggaaatgaca acagcacggc aacgctgtgc ctgggacacc atgcagtgcc aaacggaacg 120

ctagtgaaaa caatcacgaa tgaccaaatt gaagtgacta atgctactga gctggttcag 180

agttcctcaa caggtagaat atgcgacagt cctcaccaaa tccttgatgg agaaaactgc 240

acactgatag atgctctatt gggagaccca cattgtgatg gcttccaaaa taaggaatgg 300

gacctttttg ttgaacgcag caaagcctac agcaactgtt acccttatga tgtgccggat 360

tatgcctccc ttaggtcact agttgcctca tccggcaccc tggagtttaa caatgaaagc 420

ttcaattgga ctggagtcgc tcagaatgga acaagctctg cttgcaaaag gagatctatt 480

aacagtttct ttagtagatt gaattggttg caccaattaa aatacagata tccagcactg 540

aacgtgacta tgccaaacaa tgacaaattt gacaaattgt acatttgggg ggttcaccac 600

ccgagtacgg acagtgacca aatcagcgta tatgcccaag catcagggag agtcacagtc 660

tctaccaaaa gaagccaaca aactgtaatc ccgaatatcg gatccagacc ctgggtaagg 720

ggtatctcca gcagaataag catctattgg acaatagtaa aaccgggaga catacttttg 780

attaacagca cagggaatct aattgctcct cggggttact tcaaaatacg aagtgggaaa 840

agctcaataa tgaggtcaga tgcacccatt ggcaaatgcc attctgaatg catcactcca 900

aatggaagca ttcccaatga caaaccattt caaaatgtaa acaggatcac atatggggcc 960

tgtcccagat atgttaagca aaacactctg aaattggcaa cagggatgcg gaatgtacca 1020

gagaaacaaa ctagaggcat attcggcgca atcgcgggtt tcatagaaaa tggttgggag 1080

ggaatgatgg acggttggta cggtttcagg catcaaaatt ctgagggcac aggacaagca 1140

gcagatctta aaagcactca agcagcaatc aaccaaatca acgggaaact gaataagtta 1200

atcgagaaaa cgaacgagaa attccatcaa attgaaaaag aattctcaga agtagaaggg 1260

agaattcagg acctcgagaa atatgttgag gacactaaaa tagatctctg gtcgtacaac 1320

gcggagcttc ttgttgccct ggagaaccaa catacaattg atctaactga ctcagaaatg 1380

aacaaactgt ttgaaagaac aaggaagcaa ctgagagaaa atgctgagga tatgggcaat 1440

ggttgtttca aaatatacca caaatgtgac aatgcctgca tagggtcaat cagaaatgga 1500

acttatgacc atgatgtata cagagacgaa gcattaaaca accggttcca gatcaaaggt 1560

gttgagctga agtcaggata caaagattgg atcctatgga tttcctttgc catatcatgt 1620

tttttgcttt gtgttgtttt gctggggttc attatgtggg cctgccaaaa aggcaacatt 1680

aggtgcaaca tttgcatttg a 1701

<210> 2

<211> 1410

<212> DNA

<213> swine influenza virus

<400> 2

atgaatccaa atcaaaagat aataacgatt ggctctgttt ctctcaccat tgccacaata 60

tgcttcctta tgcaaattgc catcctggta actactgtaa cattgcattt caagcaatat 120

gaatgcaact cccccccaaa caaccaagtg atgctgtgtg aaccaacaat aatagaaaga 180

aacataacag agatagtgta tctgaccaac accaccatag agaaggaaat atgccccaaa 240

ctagcagaat acagaaattg gtcaaagccg caatgtaaca ttacaggatt tgcacctttt 300

tctaaggaca attcgattcg gctttccgct ggtggggaca tctgggtgac aagagaacct 360

tacgtgtcat gcgatcctga caagtgttat caatttgccc ttggacaggg aacaacacta 420

aacaacgggc attcaaatga cacagtacat gataggaccc cttatcggac cctattgatg 480

aatgagttgg gtgttccatt tcatttggga accaagcaag tgtgcatagc atggtccagc 540

tcaagttgtc acgatggaaa agcatggctg catgtttgtg taacggggga tgatgaaaat 600

gcaactgcta gcttcattta caatgggagg cttgtagata gtattggttc atggtccaaa 660

aaaatcctca ggacccagga gtcggaatgc gtttgtatca atggaacttg tacagtagta 720

atgactgatg ggagtgcttc aggaaaagct gatactaaaa tactattcat tgaggagggg 780

aaaatcgttc atactagccc attgtcagga agtgctcagc atgtcgagga gtgctcctgt 840

tatcctcgat atcctggtgt cagatgtgtc tgcagagaca actggaaagg ctccaatagg 900

cccatcgtag atataaatgt aaaggattat agcattgttt ccagttatgt gtgctcagga 960

cttgttggag acacacccag aaaaaacgac agctccagca gtagccattg cttggatcct 1020

aacaatgagg aaggtggtca tggagtgaaa ggctgggcct ttgatgatgg aaatgacgtg 1080

tggatgggaa gaacgatcag cgagaagtca cgctcaggat atgaaacctt caaagtcatt 1140

gaaggctggt ccaaacctaa ctccaaattg cagataaata ggcaagtcat agttgacaga 1200

ggtaataggt ccggttattc tggtattttc tctgttgaag gcaaaagctg catcaatcgg 1260

tgcttttatg tggagttgat aaggggaagg aaacaggaaa ctgaagtctt gtggacctca 1320

aacagtattg ttgtgttttg tggcacctca ggtacatatg gaacaggctc atggcctgat 1380

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<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 3

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<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 4

ctgcattytg rtagagactt tgtt 24

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 5

cagcaactgt tacccttatg 20

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 6

tgcctctagt ttgtttctct ggta 24

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 7

tctcacttgg aatgcagaac ct 22

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 8

tttagttctt cctatccaaa cacca 25

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 9

agcccattgt caggaagtg 19

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 10

tcaacagaga aaataccaga ataac 25

Claims

1.一株H3N2亚型猪流感病毒细胞适应株SIV-H3N2-HLJ株，其特征在于，其微生物保藏编号为：CGMCC No.14740。

2.权利要求1所述的H3N2亚型猪流感病毒细胞适应株SIV-H3N2-HLJ株在制备预防猪流感的疫苗中的应用。

3.一种预防猪流感的疫苗组合物，其特征在于，包括：预防上有效量的灭活的权利要求1所述H3N2亚型猪流感病毒细胞适应株SIV-H3N2-HLJ株和药学上可接受的佐剂。

4.一种H3N2亚型猪流感灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)增殖权利要求1所述H3N2亚型猪流感病毒细胞适应株SIV-H3N2-HLJ株，收获病毒液；(2)将病毒液加入灭活剂进行灭活；(3)将灭活的病毒液与佐剂混合，乳化，即得。

5.按照权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)用MDCK细胞增殖权利要求1所述H3N2亚型猪流感病毒细胞适应株SIV-H3N2-HLJ株。

6.按照权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)采用生物反应器悬浮培养MDCK细胞，增殖权利要求1所述H3N2亚型猪流感病毒细胞适应株SIV-H3N2-HLJ株。

7.按照权利要求6所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)采用生物反应器悬浮培养MDCK细胞的参数包括：转速为50-80r/min，溶氧度为50-80％，pH值为7.0-7.2；按体积比计，所述H3N2亚型猪流感病毒细胞适应株SIV-H3N2-HLJ株的接毒量为1％。

8.按照权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述采用生物反应器悬浮培养MDCK细胞，增殖权利要求1所述H3N2亚型猪流感病毒细胞适应株SIV-H3N2-HLJ株，包括：

(c)按1％接毒量接种权利要求1所述H3N2亚型猪流感病毒细胞适应株SIV-H3N2-HLJ株，并加入终浓度为2.5μg/ml的TPCK-胰酶，调整生物反应器搅拌转速为50-80r/min，溶氧为50-80％，pH值为7.0-7.2，37℃继续培养；当80％以上细胞病变时收获病毒液，即得。

9.按照权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)所述灭活剂为二乙烯亚胺；按照g/mL计，所述灭活剂的终浓度为0.2％；

步骤(2)所述灭活为30℃灭活36h。

10.按照权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)按照体积比计，灭活的病毒液：佐剂＝9：1；

步骤(3)所述佐剂为Montanide ISA 15A VG佐剂。

11.权利要求4至10任何一项所述制备方法制备得到的H3N2亚型猪流感灭活疫苗。