CN104001167A - 全悬浮培养细胞制造禽流感灭活疫苗工艺及产品 - Google Patents
全悬浮培养细胞制造禽流感灭活疫苗工艺及产品 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104001167A CN104001167A CN201410212197.5A CN201410212197A CN104001167A CN 104001167 A CN104001167 A CN 104001167A CN 201410212197 A CN201410212197 A CN 201410212197A CN 104001167 A CN104001167 A CN 104001167A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- avian influenza
- culture
- cell
- full
- virus
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Abstract
本发明涉及全悬浮培养细胞制造禽流感灭活疫苗工艺及产品，利用全悬浮培养MDCK细胞接种禽流感病毒，将收获的禽流感病毒液澄清、灭活、除菌、浓缩纯化、乳化后制备成禽流感灭活疫苗产品。与现有技术相比，本发明工艺优化，成本低，在保障病毒滴度的情况下，通过本发明能够使MDCK细胞培养密度大幅提高，从而易于实现规模的放大化，使禽流感病毒大量增殖；相较于现有的载体悬浮培养，本发明不需要载体介入，从而大幅降低了污染风险；本发明高效地解决了“鸡胚法”污染率高、抗原产量低、生产周期长，SPF鸡胚供应不足等问题；适于反应器细胞悬浮培养技术在禽流感行业的推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及疫苗的制备方法及产品，尤其涉及全悬浮培养细胞制造禽流感灭活疫苗工艺以及由此工艺获得的产品。
背景技术
目前，禽流感灭活疫苗及其他动物流感疫苗的生产主要依靠传统的“鸡胚法”工艺实现。“鸡胚法”制取疫苗的技术由来已久，最初于20世纪50年代开发，工人将病毒注入鸡胚中，让病毒伴随鸡胚的发育自然繁殖，等鸡胚发育3天左右，工人要把一个个蛋壳打开，逐个收集抗原，一般来说，生产一批疫苗的抗原往往需要几万枚鸡蛋，工作量大。虽然目前以鸡蛋制取疫苗的工艺经过发展演变，已经不再是一个完全人工的操作过程，但很多生产环节依然无法超越人工介入的局限性，潜在的高污染风险、抗原产量低、生产周期长等方面也亟待改观。此外，在实际的生产过程中，“鸡胚法”除去技术本身存在缺陷，还有一个值得关注的焦点就是SPF鸡胚供应量的制约以及成本问题，大多数的禽流感灭活疫苗并非全部由SPF鸡胚制造，而是用普通鸡胚生产的灭活疫苗，由于卵黄抗体的存在导致的抗原量不足，直接影响疫苗的质量，常常会造成免疫失败。
当前，在技术改进方面，反应器细胞悬浮培养技术在动物疫苗生产领域的研发和应用正成为行业技术革新、产业升级的重要内容。在我国，农业部公告第1708号中明确规定，自2012年2月1日起，各省级兽医行政管理部门停止转瓶培养生产方式的兽用细胞苗生产线项目兽药GMP验收申请。该公告对动物疫苗生产技术升级做出了强制性规定。细胞悬浮培养工艺技术在疫苗生产中的应用不仅能提高疫苗抗原产量，缩短疫苗生产周期，降低生产成本，而且规模化、自动化的反应器疫苗生产平台有效保证每批疫苗质量的稳定性和可靠性。
细胞悬浮培养根据细胞是否贴壁分为无载体的悬浮细胞培养(全悬浮)和贴壁细胞微载体悬浮培养。细胞微载体悬浮培养即细胞贴附在微载体上，再借助搅拌系统悬浮在培养液中培养。载体培养本质上还是贴壁培养，技术难度低，适用于难以驯化为全悬浮的细胞，而且载体培养在成本、细胞密度、操作简便性和工业放大等方面有重大的先天缺陷，其最大培养体积不超过300升，这限制了该技术的大规模化应用。而大规模化是生物反应器的根本优势，1000升以上的培养规模才能充分发挥其规模效应，小于此培养规模的生产线在人力成本、污染风险方面相比传统转瓶技术无明显提高。
近来，研究发现MDCK细胞对禽流感病毒敏感，经过培养优化，病毒滴度高于鸡胚。如现有技术中的发明专利ZL201010159741.6，其公开了一种H9N2亚型禽流感灭活疫苗的制备方法及产品，其技术要点主要涉及病毒适应细胞系的筛选、确定、驯化，病毒适应细胞的初级扩增培养和连续培养、接种病毒培养制备病毒液以及最终的灭活及疫苗产品的制备，主要采用微载体技术悬浮培养MDCK细胞生产禽流感灭活疫苗。但受载体放大工艺等限制，其无法满足规模化工业化生产优质禽流感灭活疫苗的需求。
发明内容
本发明的一个目的是，针对现有技术存在的问题，提供全悬浮培养细胞制造禽流感灭活疫苗工艺，满足规模化工业化生产的需要，并且，保证所生产的禽流感灭活疫苗在安全性及效力等方面均表现为优质。
本发明的另一个目的在于，提供一种禽流感灭活疫苗产品，该产品利用全悬浮培养细胞制造禽流感灭活疫苗工艺进行生产，制得的产品在安全性及效力等方面均有高质表现。
本发明解决问题的技术方案是：提供全悬浮培养细胞制造禽流感灭活疫苗工艺，包括如下步骤：
(1)全悬浮培养MDCK细胞；
(2)利用步骤(1)培养的MDCK细胞全悬浮培养生产禽流感病毒；
(3)禽流感病毒液的澄清、灭活、除菌、浓缩纯化；
(4)将收获的病毒液乳化制成疫苗成品。
进一步地，按照本发明的全悬浮培养细胞制造禽流感灭活疫苗工艺，在步骤(1)中，所述的全悬浮培养MDCK细胞，通过以下培养条件制得：全悬浮MDCK细胞以0.5×106个/ml的密度接种生物反应器，MDCK细胞培养温度为36～37℃，pH值为6.8～7.2，溶氧为40％～70％。
进一步地，按照本发明的全悬浮培养细胞制造禽流感灭活疫苗工艺，在所述步骤(2)中，利用步骤(1)培养的MDCK细胞全悬浮培养生产禽流感病毒的方法为：接种前MDCK细胞密度要大于3.0×106个/ml，利用旋转过滤器截留细胞更换培养基，最终更换为含0.5～2.0％新生牛血清的营养液，禽流感病毒接种入反应器中，接种剂量为培养基终体积的1.0～5.0％，其中，禽流感病毒培养温度为32℃～37℃；禽流感病毒培养pH值为6.8～7.2，溶氧为40％～70％；累计培养36～72h，收获病毒液。
优选地，按照本发明的全悬浮培养细胞制造禽流感灭活疫苗工艺，在所述步骤(1)中，接种生物反应器的全悬浮MDCK细胞通过以下方法制备：从液氮中取出冻存的全悬浮MDCK细胞株，直接用摇瓶悬浮培养传代，扩增至生物反应器所需体积和浓度。
优选地，按照本发明的全悬浮培养细胞制造禽流感灭活疫苗工艺，所述的用于禽流感病毒生产接种的禽流感种毒为H5N1亚型；较佳地，采用H5N1亚型禽流感病毒为种毒时，禽流感病毒培养温度如下：接种后6～10h内36～37℃，大于10h后34～36℃。
优选地，按照本发明的全悬浮培养细胞制造禽流感灭活疫苗工艺，所述的用于禽流感病毒生产接种的禽流感种毒为H5N1重组疫苗毒的鸡胚毒；较佳地，采用H5N1重组疫苗毒的鸡胚毒为种毒时，禽流感病毒培养温度如下：接种后6～10h内36～37℃，大于10h后34～36℃。
优选地，按照本发明的全悬浮培养细胞制造禽流感灭活疫苗工艺，所述的用于禽流感病毒生产接种的禽流感种毒为H9N2亚型禽流感病毒。较佳地，采用H9N2鸡胚毒，以H9N2鸡胚毒为种毒时，禽流感病毒培养温度为32～34℃。
优选地，按照本发明的全悬浮培养细胞制造禽流感灭活疫苗工艺，所述的病毒液的浓缩灭活纯化工艺包括澄清、超滤浓缩、灭活和除菌步骤。
优选地，按照本发明的全悬浮培养细胞制造禽流感灭活疫苗工艺，所述禽流感病毒液的澄清是通过连续流离心机离心完成。
优选地，按照本发明的全悬浮培养细胞制造禽流感灭活疫苗工艺，所述禽流感病毒液的浓缩纯化为超滤浓缩纯化，通过750K中空纤维超滤浓缩系统完成。
优选地，按照本发明的全悬浮培养细胞制造禽流感灭活疫苗工艺，所述禽流感病毒液的灭活通过甲醛灭活，所述禽流感病毒液的除菌采用0.2um的囊式滤器过滤除菌。
本发明还提供一种禽流感灭活疫苗，其通过本发明所述的全悬浮培养细胞制造禽流感灭活疫苗工艺得到。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：工艺优化，成本低，在保障病毒滴度的情况下，通过本发明能够使MDCK细胞培养密度大幅提高，从而易于实现规模的放大化，使禽流感病毒的大量增殖；相较于现有的载体悬浮培养，本发明不需要载体介入，从而大幅降低了污染风险；本发明高效地解决了“鸡胚法”污染率高、抗原产量低、生产周期长，SPF鸡胚供应不足等问题；适于反应器细胞悬浮培养技术在禽流感行业的推广应用。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
在下面的描述中，除非特别说明，“％”均表示重量百分数，即“wt％”。
在本发明中，所谓的“禽流感”(Bird Flu或Avian Influenza)是由禽流感病毒(AIV)引起的一种急性传染病，目前已知其可以感染人类。
本发明所述的“灭活疫苗”是一种采用物理方法、化学方法等杀死病原生物而制得的用于预防接种的生物制品。
在本发明中，全悬浮培养细胞制造禽流感灭活疫苗工艺，利用MDCK细胞接种禽流感病毒，将收获的禽流感病毒液制备成禽流感灭活疫苗产品；包括如下步骤：
(1)全悬浮培养MDCK细胞；
(2)利用步骤(1)培养的MDCK细胞全悬浮培养生产禽流感病毒；
(3)禽流感病毒液的澄清、灭活、除菌、浓缩纯化；
(4)将收获的病毒液乳化制成疫苗成品。
按照本发明的全悬浮培养细胞制造禽流感灭活疫苗工艺，在步骤(1)中，所述的全悬浮培养MDCK细胞，优选通过以下培养条件制得：全悬浮MDCK细胞以0.5×106个/ml的密度接种生物反应器，MDCK细胞培养温度为36～37℃，pH值为6.8～7.2，溶氧为40％～70％。较佳地，在所述步骤(1)中，接种生物反应器的全悬浮MDCK细胞通过以下方法制备：从液氮中取出冻存的全悬浮MDCK细胞株，直接用摇瓶悬浮培养传代，扩增至生物反应器所需体积和浓度。
按照本发明的全悬浮培养细胞制造禽流感灭活疫苗工艺，在所述步骤(2)中，利用步骤(1)培养的MDCK细胞全悬浮培养生产禽流感病毒优选的方法为：接种前MDCK细胞密度要大于3.0×106个/ml，利用旋转过滤器将培养基更换为含0.5～2.0％新生牛血清的营养液，禽流感病毒接种入反应器中，接种剂量为培养基终体积的1.0～5.0％，其中，禽流感病毒培养温度为32℃～37℃；禽流感病毒培养pH值为6.8～7.2，溶氧为40％～70％；累计培养36～72h，收获病毒液。
按照本发明的全悬浮培养细胞制造禽流感灭活疫苗工艺，所述的用于禽流感病毒生产接种的禽流感种毒优选为H5N1亚型禽流感病毒；优选地，采用H5N1重组疫苗毒的鸡胚毒；较佳地，在采用上述种毒时，禽流感病毒培养温度如下：接种后6～10h内36～37℃，大于10h后35～36℃。
按照本发明的全悬浮培养细胞制造禽流感灭活疫苗工艺，所述的用于禽流感病毒生产接种的禽流感种毒为H9N2亚型禽流感病毒；优选地，采用H9N2鸡胚毒；较佳地，在采用上述种毒时，禽流感病毒培养温度为32～34℃培养。
按照本发明的全悬浮培养细胞制造禽流感灭活疫苗工艺，所述禽流感病毒液的澄清是优选通过连续流离心机离心完成。
按照本发明的全悬浮培养细胞制造禽流感灭活疫苗工艺，所述禽流感病毒液的浓缩纯化为超滤浓缩纯化，优选通过750K中空纤维超滤浓缩系统完成。
按照本发明的全悬浮培养细胞制造禽流感灭活疫苗工艺，所述禽流感病毒液的灭活优选通过甲醛灭活，所述禽流感病毒液的除菌优选采用0.2um的囊式滤器过滤除菌。
本发明的禽流感灭活疫苗，其通过本发明所述的全悬浮培养细胞制造禽流感灭活疫苗工艺得到。
采用本发明的全悬浮培养细胞制造禽流感灭活疫苗工艺，能够实现禽流感灭活疫苗的大规模生产。
下面将详细描述本发明的制备工艺。
(1)全悬浮培养MDCK细胞
(1.1)MDCK细胞的摇瓶悬浮培养
取出两支液氮冻存的悬浮MDCK细胞，快速融化后，直接加入500ml摇瓶中补充悬浮营养液至200ml，置于36～37℃悬浮培养，细胞生长60～72小时后，按照1:3～1:5的比例传代至其他摇瓶中，扩增至反应器所需体积；
(1.2)MDCK细胞的反应器悬浮培养
(1.2.1)20L以上反应器中的MDCK细胞悬浮培养
将步骤(1)中摇瓶悬浮培养的MDCK细胞稀释至0.5×106个/ml后接种至20L以上(20L指工作体积，以下提到的所有反应器体积均为工作体积，反应器工作体积为实际罐体体积的2/3)生物反应器，补充悬浮营养液，细胞培养温度设为为36～37℃，pH值为6.8～7.2，溶氧为40％～70％；细胞培养48小时后采样，用台盼兰染色法检测细胞密度和活力，当细胞密度大于3.0×106个/ml时，活力大于90％时转至100L以上反应器悬浮培养；
(1.2.2)100L以上反应器中的MDCK细胞悬浮培养
将步骤(1.2.1)中反应器悬浮培养的MDCK细胞稀释至0.5×106/个ml后接种至100L生物反应器，补充悬浮营养液,细胞培养温度设为36～37℃，pH值为6.8～7.2，溶氧为40％～70％；细胞培养48小时后采样，用台盼兰染色法检测细胞密度和活力，当细胞密度大于3.0×106/个ml时，活力大于90％时转至500L反应器悬浮培养；
(1.2.3)500L以上反应器中的MDCK细胞悬浮培养
将步骤(1.2.2)中反应器悬浮培养的MDCK细胞稀释至0.5×106/个ml接种至500L以上生物反应器，补充悬浮营养液，细胞培养温度设为为36～37℃，pH值为6.8～7.2，溶氧为40％～70％；细胞培养48小时后采样，用台盼兰染色法检测细胞密度和活力，当细胞密度大于3.0×106/个ml时，活力大于90％时转至病毒培养反应器罐。
(2)利用步骤(1)培养的MDCK细胞全悬浮培养生产禽流感病毒
采用两组由步骤(1.2.3)最后培养的MDCK细胞进行全悬浮培养生产禽流感病毒，即，将两罐500L反应器悬浮培养的MDCK细胞转至1000L以上病毒培养反应器罐，将细胞培养温度设为36℃～37℃，pH值为6.8～7.2，溶氧为40％～70％；采用旋转过滤器截留细胞，用无血清悬浮细胞生长营养液更换掉500L细胞生长营养液，领取30L生产用禽流感种毒(H5N1亚型或H9N2亚型)接入反应器，其中H5N1亚型禽流感接毒后6～10h内设置病毒培养温度为36～37℃，10h后设为35～36℃，H9N2亚型禽流感接毒后设置病毒培养温度为32～34℃，pH值为6.8～7.2，溶氧为40％～70％；从接毒24h起每隔4h采样检测细胞密度和活力，当细胞密度小于0.6×106个/ml，活力≤25％时收获禽流感病毒液。
(3)禽流感病毒液的澄清、灭活、除菌、浓缩纯化
将步骤(3)收获的禽流感病毒液利用连续流离心机离心，得到的澄清液转入灭活罐中，用终浓度为2‰甲醛灭活，灭活后抗原利用中空纤维超滤浓缩系统，参照灭活前抗原液的体积，对抗原进行5～10倍浓缩纯化。
(4)将收获的病毒液乳化制成疫苗成品
抗原经检验合格后，参照其HA效价利用磷酸盐缓冲液稀释为水相，将水相和矿物油佐剂以1：2比例充分混合乳化，将检验合格的半成品定量分装。
(5)成品检验
对成品疫苗按照《重组禽流感病毒(H5N1亚型)灭活疫苗(细胞源，Re-6株)制造及检验试行规程》或者《禽流感(H9亚型)制造及检验试行规程》进行性状、装量检查、无菌检验、安全检验、效力检验、甲醛和汞类防腐剂残留量测定，检测结果均符合国家质量标准。
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。在下述具体实施例中，H5N1Re-6鸡胚毒是由H5N1Re-6重组毒接种鸡胚获得的种毒，由哈药集团生物疫苗有限公司提供；所述的H9N2(JY株)鸡胚毒由哈药集团生物疫苗有限公司提供。
实施例1
全悬浮培养细胞制造禽流感灭活疫苗，包括如下步骤：
(1)全悬浮培养MDCK细胞
(1.1)MDCK细胞的摇瓶悬浮培养
取出两支液氮冻存的悬浮MDCK细胞，快速融化后，直接加入500ml摇瓶中补充悬浮营养液至200ml，置于37℃悬浮培养，细胞生长60小时后，按照1:3的比例传代至其他摇瓶中，扩增至反应器所需体积；
(1.2)MDCK细胞的反应器悬浮培养
(1.2.1)20L反应器中的MDCK细胞悬浮培养
将步骤(1.1)中摇瓶悬浮培养的MDCK细胞稀释至0.5×106个/ml后接种至20L生物反应器，补充悬浮营养液，细胞培养温度设为36℃，pH值为7.2，溶氧为40％；细胞培养48小时后采样，用台盼兰染色法检测细胞密度和活力，当细胞密度大于3.0×106个/ml时，活力大于90％时转至100L反应器悬浮培养；
(1.2.2)100L反应器中的MDCK细胞悬浮培养
将步骤(1.2.1)中反应器悬浮培养的MDCK细胞稀释至0.5×106/个ml后接种至100L生物反应器，补充悬浮营养液，细胞培养温度设为36℃，pH值为7.2，溶氧为40％；细胞培养48小时后采样，用台盼兰染色法检测细胞密度和活力，当细胞密度大于3.0×106/个ml时，活力大于90％时转至500L反应器悬浮培养；
(1.2.3)500L反应器中的MDCK细胞悬浮培养
将步骤(1.2.2)中100L反应器悬浮培养的MDCK细胞稀释至0.5×106/个ml接种至500L生物反应器，补充悬浮营养液，细胞培养温度设为36℃，pH值为7.2，溶氧为40％；细胞培养48小时后采样，用台盼兰染色法检测细胞密度和活力，当细胞密度大于3.0×106/个ml时，活力大于90％时转至病毒培养反应器罐。
(2)利用步骤(1)培养的MDCK细胞全悬浮培养生产禽流感病毒
采用两组由步骤(1.2.3)最后培养的MDCK细胞进行全悬浮培养生产禽流感病毒，即，将两罐500L反应器悬浮培养的MDCK细胞转至1000L病毒培养反应器罐，将细胞培养温度设为36℃，pH值为7.2，溶氧为40％；用旋转过滤器截留细胞，用无血清悬浮细胞生长营养液更换掉500L细胞生长营养液，领取30L生产用H5N1亚型禽流感病毒接入反应器，接毒后6h内设置病毒培养温度为36℃，10h后设为35℃，pH值为7.2，溶氧为40％；从接毒24h起每隔4h采样检测细胞密度和活力，当细胞密度小于0.6×106个/ml，活力≤25％时收获禽流感病毒液。
(3)禽流感病毒液的澄清、灭活、除菌、浓缩纯化
将步骤(3)收获的禽流感病毒液利用连续流离心机离心，得到的澄清液转入灭活罐中，用终浓度为2‰甲醛灭活，灭活后抗原利用中空纤维超滤浓缩系统，参照灭活前抗原液的体积，对抗原进行5～10倍浓缩纯化。
(4)将收获的病毒液乳化制成疫苗成品
抗原经检验合格后，参照其HA效价利用磷酸盐缓冲液稀释为水相，将水相和矿物油佐剂以1：2比例充分混合乳化，将检验合格的半成品定量分装。
(5)成品检验
对成品疫苗按照《重组禽流感病毒(H5N1亚型)灭活疫苗(细胞源，Re-6株)制造及检验试行规程》进行性状、装量检查、无菌检验、安全检验、效力检验、甲醛和汞类防腐剂残留量测定，检测结果均符合国家质量标准，具体见表一至表五。
实施例2
全悬浮培养细胞制造禽流感灭活疫苗，包括如下步骤：
(1)全悬浮培养MDCK细胞
(1.1)MDCK细胞的摇瓶悬浮培养
取出两支液氮冻存的悬浮MDCK细胞，快速融化后，直接加入500ml摇瓶中补充悬浮营养液至200ml，置于37℃悬浮培养，细胞生长72小时后，按照1:5的比例传代至其他摇瓶中，扩增至反应器所需体积；
(1.2)MDCK细胞的反应器悬浮培养
(1.2.1)20L反应器中的MDCK细胞悬浮培养
将步骤(1.1)中摇瓶悬浮培养的MDCK细胞稀释至0.5×106个/ml后接种至20L生物反应器，补充悬浮营养液，细胞培养温度设为36℃，pH值为7.2，溶氧为60％；细胞培养48小时后采样，用台盼兰染色法检测细胞密度和活力，当细胞密度大于3.0×106个/ml时，活力大于90％时转至100L反应器悬浮培养；
(1.2.2)100L反应器中的MDCK细胞悬浮培养
将步骤(1.2.1)中反应器悬浮培养的MDCK细胞稀释至0.5×106/个ml后接种至100L生物反应器，补充悬浮营养液，细胞培养温度设为36℃，pH值为7.2，溶氧为60％，；细胞培养48小时后采样，用台盼兰染色法检测细胞密度和活力，当细胞密度大于3.0×106/个ml时，活力大于90％时转至500L反应器悬浮培养；
(1.2.3)500L反应器中的MDCK细胞悬浮培养
将步骤(1.2.2)中100L反应器悬浮培养的MDCK细胞稀释至0.5×106/个ml接种至500L生物反应器，补充悬浮营养液，细胞培养温度设为36℃，pH值为7.2，溶氧为60％，；细胞培养48小时后采样，用台盼兰染色法检测细胞密度和活力，当细胞密度大于3.0×106/个ml时，活力大于90％时转至病毒培养反应器罐。
(2)利用步骤(1)培养的MDCK细胞全悬浮培养生产禽流感病毒
采用两组由步骤(1.2.3)最后培养的MDCK细胞进行全悬浮培养生产禽流感病毒，即，将两罐500L反应器悬浮培养的MDCK细胞转至1000L病毒培养反应器罐，将细胞培养温度设为36℃，pH值为7.2，溶氧为60％；采用用旋转过滤器截留细胞，用无血清悬浮细胞生长营养液更换掉500L细胞生长营养液，领取30L生产用H5N1亚型禽流感病毒接入反应器，接毒后8h内设置病毒培养温度为37℃，10h后设为36℃，pH值为7.2，溶氧为60％；从接毒24h起每隔4h采样检测细胞密度和活力，当细胞密度小于0.6×106个/ml，活力≤25％时收获禽流感病毒液。
(3)禽流感病毒液的澄清、灭活、除菌、浓缩纯化同实施例1。
(4)将收获的病毒液乳化制成疫苗成品同实施例1。
(5)成品检验
对成品疫苗按照《重组禽流感病毒(H5N1亚型)灭活疫苗(细胞源，Re-6株)制造及检验试行规程》进行性状、装量检查、无菌检验、安全检验、效力检验、甲醛和汞类防腐剂残留量测定，检测结果均符合国家质量标准，具体见表一至表五。
实施例3
全悬浮培养细胞制造禽流感灭活疫苗，包括如下步骤：
(1)全悬浮培养MDCK细胞
(1.1)MDCK细胞的摇瓶悬浮培养
取出两支液氮冻存的悬浮MDCK细胞，快速融化后，直接加入500ml摇瓶中补充悬浮营养液至200ml，置于36.5℃悬浮培养，细胞生长60小时后，按照1:4的比例传代至其他摇瓶中，扩增至反应器所需体积；
(1.2)MDCK细胞的反应器悬浮培养
(1.2.1)20L反应器中的MDCK细胞悬浮培养
将步骤(1.1)中摇瓶悬浮培养的MDCK细胞稀释至0.5×106个/ml后接种至20L生物反应器，补充悬浮营养液，细胞培养温度设为36.5℃，pH值为6.8，溶氧为40％；细胞培养48小时后采样，用台盼兰染色法检测细胞密度和活力，当细胞密度大于3.0×106个/ml时，活力大于90％时转至100L反应器悬浮培养；
(1.2.2)100L反应器中的MDCK细胞悬浮培养
将步骤(1.2.1)中反应器悬浮培养的MDCK细胞稀释至0.5×106/个ml后接种至100L生物反应器，补充悬浮营养液，细胞培养温度设为36.5℃，pH值为6.8，溶氧为40％；细胞培养48小时后采样，用台盼兰染色法检测细胞密度和活力，当细胞密度大于3.0×106/个ml时，活力大于90％时转至500L反应器悬浮培养；
(1.2.3)500L反应器中的MDCK细胞悬浮培养
将步骤(1.2.2)中100L反应器悬浮培养的MDCK细胞稀释至0.5×106/个ml接种至500L生物反应器，补充悬浮营养液，细胞培养温度设为36.5℃，pH值为6.8，溶氧为40％；细胞培养48小时后采样，用台盼兰染色法检测细胞密度和活力，当细胞密度大于3.0×106/个ml时，活力大于90％时转至病毒培养反应器罐。
(2)利用步骤(1)培养的MDCK细胞全悬浮培养生产禽流感病毒
采用两组由步骤(1.2.3)最后培养的MDCK细胞进行全悬浮培养生产禽流感病毒，即，将两罐500L反应器悬浮培养的MDCK细胞转至1000L病毒培养反应器罐，将细胞培养温度设为36.5℃，pH值为6.8，溶氧为40％；用旋转过滤器截留细胞，用无血清悬浮细胞生长营养液更换掉500L细胞生长营养液，领取30L生产用H5N1亚型禽流感病毒接入反应器，接毒后6h内设置病毒培养温度为36.5℃，10h后设为35.5℃，pH值为6.8，溶氧为40％；从接毒24h起每隔4h采样检测细胞密度和活力，当细胞密度小于0.6×106个/ml，活力≤25％时收获禽流感病毒液。
(3)禽流感病毒液的澄清、灭活、除菌、浓缩纯化
将步骤(3)收获的禽流感病毒液利用连续流离心机离心，得到的澄清液转入灭活罐中，用终浓度为2‰甲醛灭活，灭活后抗原利用中空纤维超滤浓缩系统，参照灭活前抗原液的体积，对抗原进行5～10倍浓缩纯化。
(4)将收获的病毒液乳化制成疫苗成品
抗原经检验合格后，参照其HA效价利用磷酸盐缓冲液稀释为水相，将水相和矿物油佐剂以1：2比例充分混合乳化，将检验合格的半成品定量分装。
(5)成品检验
对成品疫苗按照《重组禽流感病毒(H5N1亚型)灭活疫苗(细胞源，Re-6株)制造及检验试行规程》进行性状、装量检查、无菌检验、安全检验、效力检验、甲醛和汞类防腐剂残留量测定，检测结果均符合国家质量标准，具体见表一至表五。
实施例4
全悬浮培养细胞制造禽流感灭活疫苗，包括如下步骤：
(1)全悬浮培养MDCK细胞
(1.1)MDCK细胞的摇瓶悬浮培养
取出两支液氮冻存的悬浮MDCK细胞，快速融化后，直接加入500ml摇瓶中补充悬浮营养液至200ml，置于37℃悬浮培养，细胞生长72小时后，按照1:4的比例传代至其他摇瓶中，扩增至反应器所需体积；
(1.2)MDCK细胞的反应器悬浮培养
(1.2.1)20L反应器中的MDCK细胞悬浮培养
将步骤(1.1)中摇瓶悬浮培养的MDCK细胞稀释至0.5×106个/ml后接种至20L生物反应器，补充悬浮营养液，细胞培养温度设为37℃，pH值为7.2，溶氧为70％；细胞培养48小时后采样，用台盼兰染色法检测细胞密度和活力，当细胞密度大于3.0×106个/ml时，活力大于90％时转至100L反应器悬浮培养；
(1.2.2)100L反应器中的MDCK细胞悬浮培养
将步骤(1.2.1)中反应器悬浮培养的MDCK细胞稀释至0.5×106/个ml后接种至100L生物反应器，补充悬浮营养液，细胞培养温度设为37℃，pH值为7.2，溶氧为70％；细胞培养48小时后采样，用台盼兰染色法检测细胞密度和活力，当细胞密度大于3.0×106/个ml时，活力大于90％时转至500L反应器悬浮培养；
(1.2.3)500L反应器中的MDCK细胞悬浮培养
将步骤(1.2.2)中100L反应器悬浮培养的MDCK细胞稀释至0.5×106/个ml接种至500L生物反应器，补充悬浮营养液，细胞培养温度设为37℃，PH值为7.2，溶氧为70％，；细胞培养48小时后采样，用台盼兰染色法检测细胞密度和活力，当细胞密度大于3.0×106/个ml时，活力大于90％时转至病毒培养反应器罐。
(2)利用步骤(1)培养的MDCK细胞全悬浮培养生产禽流感病毒
采用两组由步骤1.2.3最后培养的MDCK细胞进行全悬浮培养生产禽流感病毒，即，将两罐500L反应器悬浮培养的MDCK细胞转至1000L病毒培养反应器罐，将细胞培养温度设为37℃，pH值为7.2，溶氧为70％；采用旋转过滤器截留细胞，用无血清悬浮细胞生长营养液更换掉500L细胞生长营养液，领取30L生产用H5N1亚型禽流感病毒接入反应器，接毒后8h内设置病毒培养温度为37℃，10h后设为36℃，pH值为7.2，溶氧为70％；从接毒24h起每隔4h采样检测细胞密度和活力，当细胞密度小于0.6×106个/ml，活力≤25％时收获禽流感病毒液。
(3)禽流感病毒液的澄清、灭活、除菌、浓缩纯化同实施例1。
(4)将收获的病毒液乳化制成疫苗成品同实施例1。
(5)成品检验
对成品疫苗按照《重组禽流感病毒(H5N1亚型)灭活疫苗(细胞源，Re-6株)制造及检验试行规程》进行性状、装量检查、无菌检验、安全检验、效力检验、甲醛和汞类防腐剂残留量测定，检测结果均符合国家质量标准，具体见表一至表五。
实施例5
以禽流感H5N1Re-6鸡胚种毒为用于禽流感病毒接种的禽流感种毒，通过全悬浮培养细胞制造禽流感灭活疫苗的基本工艺步骤同实施例1。所得疫苗成品检验中，按照《重组禽流感病毒(H5N1亚型)灭活疫苗(细胞源，Re-6株)制造及检验试行规程》进行性状、装量检查、无菌检验、安全检验、效力检验、甲醛和汞类防腐剂残留量测定，检测结果均符合国家质量标准，具体见表一至表五。
实施例6
以禽流感H5N1Re-6鸡胚种毒为用于禽流感病毒接种的禽流感种毒，通过全悬浮培养细胞制造禽流感灭活疫苗的基本工艺步骤同实施例2。所得疫苗成品检验中，按照《重组禽流感病毒(H5N1亚型)灭活疫苗(细胞源，Re-6株)制造及检验试行规程》进行性状、装量检查、无菌检验、安全检验、效力检验、甲醛和汞类防腐剂残留量测定，检测结果均符合国家质量标准，具体见表一至表五。
实施例7
全悬浮培养细胞制造禽流感灭活疫苗，包括如下步骤：
(1)全悬浮培养MDCK细胞
(1.1)MDCK细胞的摇瓶悬浮培养
取出两支液氮冻存的悬浮MDCK细胞，快速融化后，直接加入500ml摇瓶中补充悬浮营养液至200ml，置于36℃悬浮培养，细胞生长60小时后，按照1:3的比例传代至其他摇瓶中，扩增至反应器所需体积；
(1.2)MDCK细胞的反应器悬浮培养
(1.2.1)20L反应器中的MDCK细胞悬浮培养
将步骤(1.1)中摇瓶悬浮培养的MDCK细胞稀释至0.5×106个/ml后接种至20L生物反应器，补充悬浮营养液，细胞培养温度设为36℃，pH值为7.2，溶氧为40％；细胞培养48小时后采样，用台盼兰染色法检测细胞密度和活力，当细胞密度大于3.0×106个/ml时，活力大于90％时转至100L反应器悬浮培养；
(1.2.2)100L反应器中的MDCK细胞悬浮培养
将步骤(1.2.1)中反应器悬浮培养的MDCK细胞稀释至0.5×106/个ml后接种至100L生物反应器，补充悬浮营养液，细胞培养温度设为36℃，pH值为7.2，溶氧为40％；细胞培养48小时后采样，用台盼兰染色法检测细胞密度和活力，当细胞密度大于3.0×106/个ml时，活力大于90％时转至500L反应器悬浮培养；
(1.2.3)500L反应器中的MDCK细胞悬浮培养
将步骤(1.2.2)中100L反应器悬浮培养的MDCK细胞稀释至0.5×106/个ml接种至500L生物反应器，补充悬浮营养液，细胞培养温度设为36℃，pH值为7.2，溶氧为40％；细胞培养48小时后采样，用台盼兰染色法检测细胞密度和活力，当细胞密度大于3.0×106/个ml时，活力大于90％时转至病毒培养反应器罐。
(2)利用步骤(1)培养的MDCK细胞全悬浮培养生产禽流感病毒
采用两组由步骤(1.2.3)最后培养的MDCK细胞进行全悬浮培养生产禽流感病毒，即，将两罐500L反应器悬浮培养的MDCK细胞转至1000L病毒培养反应器罐，将细胞培养温度设为36℃，pH值为7.2，溶氧为40％；采用旋转过滤器截留细胞，用无血清悬浮细胞生长营养液更换掉500L细胞生长营养液，领取30L生产用H9N2亚型禽流感病毒鸡胚种毒接入反应器，接毒后设置病毒培养温度为32℃，PH值为7.2，溶氧为40％；从接毒24h起每隔4h采样检测细胞密度和活力，当细胞密度小于0.6×106个/ml，活力≤25％时收获禽流感病毒液。
(3)禽流感病毒液的澄清、灭活、除菌、浓缩纯化
将步骤(3)收获的禽流感病毒液利用连续流离心机离心，得到的澄清液转入灭活罐中，用终浓度为2‰甲醛灭活，灭活后抗原利用中空纤维超滤浓缩系统，参照灭活前抗原液的体积，对抗原进行5-10倍浓缩纯化。
(4)将收获的病毒液乳化制成疫苗成品
抗原经检验合格后，参照其HA效价利用磷酸盐缓冲液稀释为水相，将水相和矿物油佐剂以1：2比例充分混合乳化，将检验合格的半成品定量分装。
(5)成品检验
对成品疫苗按照《禽流感(H9亚型)制造及检验试行规程》进行性状、装量检查、无菌检验、安全检验、效力检验、甲醛和汞类防腐剂残留量测定，检测结果均符合国家质量标准，具体见表一至表五。
实施例8
全悬浮培养细胞制造禽流感灭活疫苗，包括如下步骤：
(1)全悬浮培养MDCK细胞
(1.1)MDCK细胞的摇瓶悬浮培养
取出两支液氮冻存的悬浮MDCK细胞，快速融化后，直接加入500ml摇瓶中补充悬浮营养液至200ml，置于37℃悬浮培养，细胞生长72小时后，按照1:5的比例传代至其他摇瓶中，扩增至反应器所需体积；
(1.2)MDCK细胞的反应器悬浮培养
(1.2.1)20L反应器中的MDCK细胞悬浮培养
将步骤(1.1)中摇瓶悬浮培养的MDCK细胞稀释至0.5×106个/ml后接种至20L生物反应器，补充悬浮营养液，细胞培养温度设为37℃，pH值为6.8，溶氧为60％；细胞培养48小时后采样，用台盼兰染色法检测细胞密度和活力，当细胞密度大于3.0×106个/ml时，活力大于90％时转至100L反应器悬浮培养；
(1.2.2)100L反应器中的MDCK细胞悬浮培养
将步骤(1.2.1)中反应器悬浮培养的MDCK细胞稀释至0.5×106/个ml后接种至100L生物反应器，补充悬浮营养液，细胞培养温度设为37℃，pH值为6.8，溶氧为60％；细胞培养48小时后采样，用台盼兰染色法检测细胞密度和活力，当细胞密度大于3.0×106/个ml时，活力大于90％时转至500L反应器悬浮培养；
(1.2.3)500L反应器中的MDCK细胞悬浮培养
将步骤(1.2.2)中100L反应器悬浮培养的MDCK细胞稀释至0.5×106/个ml接种至500L生物反应器，补充悬浮营养液，细胞培养温度设为37℃，pH值为6.8，溶氧为60％；细胞培养48小时后采样，用台盼兰染色法检测细胞密度和活力，当细胞密度大于3.0×106/个ml时，活力大于90％时转至病毒培养反应器罐。
(2)利用步骤(1)培养的MDCK细胞全悬浮培养生产禽流感病毒
采用两组由步骤(1.2.3)最后培养的MDCK细胞进行全悬浮培养生产禽流感病毒，即，将两罐500L反应器悬浮培养的MDCK细胞转至1000L病毒培养反应器罐，将细胞培养温度设为37℃，pH值为6.8，溶氧为60％；采用用旋转过滤器截流细胞，用无血清悬浮细胞生长营养液更换掉500L细胞生长营养液，领取30L生产用H9亚型禽流感病毒接入反应器，接毒后设置病毒培养温度为34℃，pH值为6.8，溶氧为60％；从接毒24h起每隔4h采样检测细胞密度和活力，当细胞密度小于0.6×106个/ml，活力≤25％时收获禽流感病毒液。
(3)禽流感病毒液的澄清、灭活、除菌、浓缩纯化同实施例5。
(4)将收获的病毒液乳化制成疫苗成品同实施例5。
(5)成品检验
对成品疫苗按照《禽流感(H9亚型)制造及检验试行规程》进行性状、装量检查、无菌检验、安全检验、效力检验、甲醛和汞类防腐剂残留量测定，检测结果均符合国家质量标准，具体见表一至表五。
基于上述实施例，具体以H9N2(JY株)鸡胚毒为用于禽流感病毒接种的禽流感种毒进行测试，通过全悬浮培养细胞制造禽流感灭活疫苗的基本工艺步骤同实施例7。所得疫苗成品检验中，按照《禽流感(H9亚型)制造及检验试行规程》进行性状、装量检查、无菌检验、安全检验、效力检验、甲醛和汞类防腐剂残留量测定，检测结果均符合国家质量标准，检测结果同实施例7。
本发明不限于上述实施方式，本领域技术人员所做出的对上述实施方式任何显而易见的改进或变更，都不会超出本发明的构思和所附权利要求的保护范围。
表1性状检验结果
表2无菌检验结果
| 疫苗成品 | 检验项目 | 检验情况 | 最终判定 |
| 实施例1 | 无菌检验 | 无菌生长 | 合格 |
| 实施例2 | 无菌检验 | 无菌生长 | 合格 |
| 实施例3 | 无菌检验 | 无菌生长 | 合格 |
| 实施例4 | 无菌检验 | 无菌生长 | 合格 |
| 实施例5 | 无菌检验 | 无菌生长 | 合格 |
| 实施例6 | 无菌检验 | 无菌生长 | 合格 |
| 实施例7 | 无菌检验 | 无菌生长 | 合格 |
| 实施例8 | 无菌检验 | 无菌生长 | 合格 |
表3安全检验结果
| 疫苗成品 | 检验动物 | 检验情况 | 最终判定 |
| 实施例1 | 24日龄SPF鸡 | 10/10健活，无任何异常 | 合格 |
| 实施例2 | 23日龄SPF鸡 | 10/10健活，无任何异常 | 合格 |
| 实施例3 | 24日龄SPF鸡 | 10/10健活，无任何异常 | 合格 |
| 实施例4 | 26日龄SPF鸡 | 10/10健活，无任何异常 | 合格 |
| 实施例5 | 23日龄SPF鸡 | 10/10健活，无任何异常 | 合格 |
| 实施例6 | 25日龄SPF鸡 | 10/10健活，无任何异常 | 合格 |
| 实施例7 | 12日龄SPF鸡 | 10/10健活，无任何异常 | 合格 |
| 实施例8 | 13日龄SPF鸡 | 10/10健活，无任何异常 | 合格 |
表4效力检验结果
表5甲醛、汞类防腐剂残留量测定结果
Claims (9)
1.全悬浮培养细胞制造禽流感灭活疫苗工艺，其特征在于，包括如下步骤：
(1)全悬浮培养MDCK细胞；
(2)利用步骤(1)培养的MDCK细胞全悬浮培养生产禽流感病毒；
(3)禽流感病毒液的澄清、灭活、除菌、浓缩纯化；
(4)将收获的病毒液乳化制成疫苗成品。
2.根据权利要求1所述的全悬浮培养细胞制造禽流感灭活疫苗工艺，其特征在于：
在步骤(1)中，所述的全悬浮培养MDCK细胞，通过以下培养条件制得：全悬浮MDCK细胞以0.5×106个/ml的密度接种生物反应器，MDCK细胞培养温度为36～37℃，pH值为6.8～7.2，溶氧为40％～70％。
3.根据权利要求1或2所述的全悬浮培养细胞制造禽流感灭活疫苗工艺，其特征在于：
在所述步骤(2)中，利用步骤(1)培养的MDCK细胞全悬浮培养生产禽流感病毒的方法为：接种前MDCK细胞密度要大于3.0×106个/ml，利用旋转过滤器截留细胞，更换培养基，最终为含0.5～2.0％新生牛血清的营养液，将禽流感病毒接种入反应器中，接种剂量为培养基终体积的1.0～5.0％，其中，禽流感病毒培养温度为32℃～37℃；禽流感病毒培养pH值为6.8～7.2，溶氧为40％～70％；累计培养36～72h，收获病毒液。
4.根据权利要求2所述的全悬浮培养细胞制造禽流感灭活疫苗工艺，其特征在于：在所述步骤(1)中，接种生物反应器的全悬浮MDCK细胞通过以下方法制备：从液氮中取出冻存的全悬浮MDCK细胞株，直接用摇瓶悬浮培养传代，扩增至生物反应器所需体积和浓度。
5.根据权利要求3所述的全悬浮培养细胞制造禽流感灭活疫苗工艺，其特征在于：所述的用于禽流感病毒接种的禽流感种毒为H5N1亚型或者H9N2亚型。
6.根据权利要求3所述的全悬浮培养细胞制造禽流感灭活疫苗工艺，其特征在于：所述的用于禽流感病毒生产接种的禽流感种毒为H5N1鸡胚毒或者H9N2鸡胚毒。
7.根据权利要求3所述的全悬浮培养细胞制造禽流感灭活疫苗工艺，其特征在于：所述禽流感病毒液的澄清是通过连续流离心机离心完成；所述禽流感病毒液的浓缩纯化为超滤浓缩纯化，通过750K中空纤维超滤浓缩系统完成。
8.根据权利要求3所述的全悬浮培养细胞制造禽流感灭活疫苗工艺，其特征在于：所述禽流感病毒液的灭活通过甲醛灭活，所述禽流感病毒液的除菌采用0.2um的囊式滤器过滤除菌。
9.一种禽流感灭活疫苗，其特征在于：其通过权利要求1～8任一项所述的工艺得到。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410212197.5A CN104001167A (zh) | 2014-05-19 | 2014-05-19 | 全悬浮培养细胞制造禽流感灭活疫苗工艺及产品 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410212197.5A CN104001167A (zh) | 2014-05-19 | 2014-05-19 | 全悬浮培养细胞制造禽流感灭活疫苗工艺及产品 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104001167A true CN104001167A (zh) | 2014-08-27 |
Family
ID=51362252
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410212197.5A Pending CN104001167A (zh) | 2014-05-19 | 2014-05-19 | 全悬浮培养细胞制造禽流感灭活疫苗工艺及产品 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104001167A (zh) |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108130315A (zh) * | 2017-12-20 | 2018-06-08 | 哈药集团生物疫苗有限公司 | H3n2亚型猪流感病毒细胞适应株及其制备的灭活疫苗和应用 |
| CN108220221A (zh) * | 2017-12-22 | 2018-06-29 | 吉林冠界生物技术有限公司 | 一种全悬浮细胞培养重组禽流感亚型病毒的方法 |
| CN110283791A (zh) * | 2019-06-25 | 2019-09-27 | 山东诸子生物科技有限公司 | 一种培养新城疫、禽流感病毒并制备新流二联疫苗的方法 |
| CN111454915A (zh) * | 2020-03-10 | 2020-07-28 | 成都天邦生物制品有限公司 | 一种h9亚型禽流感病毒分离鉴定方法 |
| CN111676185A (zh) * | 2020-06-29 | 2020-09-18 | 肇庆大华农生物药品有限公司 | 一种全悬浮培养型mdck细胞系的驯化方法 |
| CN111714626A (zh) * | 2020-06-30 | 2020-09-29 | 肇庆大华农生物药品有限公司 | 一种采用mdck细胞系生产禽流感疫苗的方法及其制品 |
| CN112294952A (zh) * | 2019-08-02 | 2021-02-02 | 成都天邦生物制品有限公司 | 一种鸡新城疫、h9亚型禽流感和禽腺病毒三联灭活疫苗 |
| CN115960842A (zh) * | 2022-11-26 | 2023-04-14 | 哈尔滨维科生物技术有限公司 | 一种提高重组禽流感病毒感染鸡胚能力的方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101818131A (zh) * | 2010-02-01 | 2010-09-01 | 成都天邦生物制品有限公司 | 一种流感病毒疫苗的生产方法 |
| CN101816785A (zh) * | 2010-04-29 | 2010-09-01 | 扬州优邦生物制药有限公司 | 一种h9n2亚型禽流感灭活疫苗的制备方法及产品 |
| CN102453700A (zh) * | 2010-10-18 | 2012-05-16 | 北京清大天一科技有限公司 | 悬浮培养mdck细胞及利用其生产病毒疫苗的方法 |
-
2014
- 2014-05-19 CN CN201410212197.5A patent/CN104001167A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101818131A (zh) * | 2010-02-01 | 2010-09-01 | 成都天邦生物制品有限公司 | 一种流感病毒疫苗的生产方法 |
| CN101816785A (zh) * | 2010-04-29 | 2010-09-01 | 扬州优邦生物制药有限公司 | 一种h9n2亚型禽流感灭活疫苗的制备方法及产品 |
| CN102453700A (zh) * | 2010-10-18 | 2012-05-16 | 北京清大天一科技有限公司 | 悬浮培养mdck细胞及利用其生产病毒疫苗的方法 |
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108130315A (zh) * | 2017-12-20 | 2018-06-08 | 哈药集团生物疫苗有限公司 | H3n2亚型猪流感病毒细胞适应株及其制备的灭活疫苗和应用 |
| CN108130315B (zh) * | 2017-12-20 | 2021-08-13 | 哈药集团生物疫苗有限公司 | H3n2亚型猪流感病毒细胞适应株及其制备的灭活疫苗和应用 |
| CN108220221A (zh) * | 2017-12-22 | 2018-06-29 | 吉林冠界生物技术有限公司 | 一种全悬浮细胞培养重组禽流感亚型病毒的方法 |
| CN110283791A (zh) * | 2019-06-25 | 2019-09-27 | 山东诸子生物科技有限公司 | 一种培养新城疫、禽流感病毒并制备新流二联疫苗的方法 |
| CN112294952A (zh) * | 2019-08-02 | 2021-02-02 | 成都天邦生物制品有限公司 | 一种鸡新城疫、h9亚型禽流感和禽腺病毒三联灭活疫苗 |
| CN111454915A (zh) * | 2020-03-10 | 2020-07-28 | 成都天邦生物制品有限公司 | 一种h9亚型禽流感病毒分离鉴定方法 |
| CN111454915B (zh) * | 2020-03-10 | 2023-11-10 | 成都史纪生物制药有限公司 | 一种h9亚型禽流感病毒分离鉴定方法 |
| CN111676185A (zh) * | 2020-06-29 | 2020-09-18 | 肇庆大华农生物药品有限公司 | 一种全悬浮培养型mdck细胞系的驯化方法 |
| CN111714626A (zh) * | 2020-06-30 | 2020-09-29 | 肇庆大华农生物药品有限公司 | 一种采用mdck细胞系生产禽流感疫苗的方法及其制品 |
| CN115960842A (zh) * | 2022-11-26 | 2023-04-14 | 哈尔滨维科生物技术有限公司 | 一种提高重组禽流感病毒感染鸡胚能力的方法 |
| CN115960842B (zh) * | 2022-11-26 | 2023-09-01 | 哈尔滨维科生物技术有限公司 | 一种提高重组禽流感病毒感染鸡胚能力的方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104001167A (zh) | 全悬浮培养细胞制造禽流感灭活疫苗工艺及产品 | |
| CN102816732B (zh) | 适应全悬浮无血清培养的mdck细胞系及其在培养流感病毒、生产流感病毒疫苗中的应用 | |
| CN101979517B (zh) | 一种利用生物反应器大规模生产流感病毒的方法 | |
| CN102258777B (zh) | 用鸡胚源细胞系繁殖传染性法氏囊病毒制备灭活疫苗和联苗的方法 | |
| CN107460156A (zh) | 无血清全悬浮mdck细胞株及其在生产流感病毒中的应用 | |
| CN110093307A (zh) | 适应无血清悬浮培养的bhk-21-sc细胞株和用该细胞株制备疫苗抗原的方法 | |
| CN101979519A (zh) | 一种制备伪狂犬病疫苗的方法 | |
| CN102178946B (zh) | Bhk-21细胞无血清悬浮培养技术在口蹄疫疫苗生产中的应用 | |
| CN101979515A (zh) | 兽用狂犬病病毒与疫苗及二者的生产方法 | |
| CN102133398A (zh) | 应用生物反应器工业化生产动物流感疫苗的方法 | |
| CN108721615B (zh) | 一种制备鸭坦布苏病毒病灭活疫苗的方法及其疫苗 | |
| CN103013930B (zh) | 一种鸡新城疫、传染性支气管炎病毒同胚增殖的培养方法 | |
| CN104726392B (zh) | 一种制备无血清培养的悬浮哺乳动物细胞系的方法、及其制备的细胞系和应用 | |
| CN102861329A (zh) | 一种利用生物反应器生产犬细小病毒灭活疫苗的方法 | |
| CN104338127A (zh) | 一种h9n2亚型禽流感灭活疫苗的生产方法及其制品 | |
| CN104027798B (zh) | 一种全悬浮细胞培养生产猪圆环病毒2型抗原的方法 | |
| CN103386127B (zh) | 用鸡胚传代细胞系和生物反应器培养新城疫病毒制备疫苗的方法 | |
| CN102886043B (zh) | 猪乙型脑炎病毒与猪细小病毒二联灭活疫苗及其制备方法 | |
| CN104593335B (zh) | 低血清培养Marc‑145细胞生产猪繁殖与呼吸道综合征CH‑1R株病毒的方法 | |
| CN111714626A (zh) | 一种采用mdck细胞系生产禽流感疫苗的方法及其制品 | |
| CN102657859A (zh) | 利用球形微载体生物反应器培养细胞生产禽流感疫苗的方法 | |
| CN105288610A (zh) | 一种禽流感灭活疫苗生产工艺及产品 | |
| CN104630159A (zh) | 低血清培养st细胞生产猪瘟c株病毒的方法 | |
| CN108159412A (zh) | 一种生产细胞源鸡新城疫、禽流感二联灭活疫苗的方法及其产品 | |
| CN109679900B (zh) | 禽流感疫苗的制备方法及其产品 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20140827 |