CN112294952A - 一种鸡新城疫、h9亚型禽流感和禽腺病毒三联灭活疫苗 - Google Patents

一种鸡新城疫、h9亚型禽流感和禽腺病毒三联灭活疫苗 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种鸡新城疫、禽流感和禽腺病毒三联灭活疫苗及其制备方法，属于禽类疫苗领域。本发明的制备方法包括：以灭活后的鸡新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒、Fiber‑2蛋白为活性成分，加上药学上可接受的免疫佐剂及其它辅助性成分，即得；所述鸡新城疫病毒是通过鸭胚视网膜全悬浮细胞培养得到的；所述H9亚型禽流感病毒是通过MDCK细胞培养得到的。本发明的疫苗具有良好的安全性，以及优于传统鸡胚疫苗的保护率，在疫苗产业中具有良好应用前景。

Description

一种鸡新城疫、H9亚型禽流感和禽腺病毒三联灭活疫苗
技术领域
本发明属于禽类疫苗领域。
背景技术
鸡新城疫(Newcastle disease，ND)是对养禽业危害最大的病毒性传染病之一，该病被世界动物卫生组织(OIE)列为A类传染病，给世界各国的养禽业造成了巨大损失。系统的分子流行病学调查结果显示，近年来我国ND流行毒株以基因VII型为主，与我国目前广泛使用的疫苗株La Sota和Clone 30等存在明显差异，虽然鸡群在整个饲养期内进行过多次常规疫苗免疫，但仍有感染强毒株引起流行的可能性，临床上主要表现为非典型性ND的发生，证实目前所使用疫苗的免疫保护力不足，因此开发免疫原性更好、与目前流行株更匹配的疫苗已经成为ND疫苗研发的趋势和当务之急。
我国自1994年报道鸡群中发生H9亚型禽流感以来，该病在我国大多数省份流行，尽管各级农业部门和养禽企业采取了多种防治措施，但该病对养禽业仍造成了巨大的损失。
禽腺病毒(Fowl adenovirus，FAdV)属于禽腺病毒科禽腺病毒属，能够引起鸡心包积液-包涵体肝炎综合征的主要是I群4型禽腺病毒(FAdV-4)，2015年，我国安徽、河南和山东等省份鸡群中相继爆发了以心包积液、肝脏肿大出血等特征病变的疾病，经鉴定为FAdV-4引起，其致死率甚至可达80％，给养殖业造成巨大的经济损失。目前，国内尚无商品化的疫苗用来防控此疾病。Fiber-2蛋白作为FAdV-4的主要保护性抗原，是研究FAdV-4亚单位疫苗最佳选择。
目前鸡新城疫、H9亚型禽流感和禽腺病毒三联灭活疫苗的生产依赖鸡胚培养新城疫、H9亚型禽流感病毒。鸡胚生产鸡新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒需要大量的易感鸡胚，成本较高，病毒产量易受鸡胚的来源、品质等因素影响，疫苗纯度差，生产周期长，工作繁重，导致能源的极大消耗，收获病毒后，产生大量带毒废胚体，造成大量废弃物，且如果处理不彻底，存在散毒风险。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种新的鸡新城疫、禽流感和禽腺病毒三联灭活疫苗及其制备方法。
本发明的技术方案包括：
一种鸡新城疫、禽流感和禽腺病毒三联灭活疫苗制备方法，其特征在于，它是以灭活后的鸡新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒、Fiber-2蛋白为活性成分，加上药学上可接受的免疫佐剂及其它辅助性成分，即得；
所述鸡新城疫病毒是通过鸭胚视网膜全悬浮细胞培养得到的；
所述H9亚型禽流感病毒是通过MDCK细胞培养得到的。
前述的三联灭活疫苗制备方法，包括如下步骤：
1)病毒培养：使用鸭胚视网膜全悬浮细胞培养鸡新城疫病毒，使用MDCK细胞培养H9亚型禽流感病毒；
2)病毒灭活；
3)油相制备：注射用白油94～98体积份，加入司本-802～6体积份，灭菌；
4)水相制备：将灭活病毒与Fiber-2蛋白分别溶于水，配成蛋白含量为300-420μg/ml，按(1-2)∶(1-2)∶(1-2)的体积比混合，取混合后得抗原液，94～99体积份抗原液与1～6体积份吐温-80混合；
5)乳化：水相和油相按1∶(1.5～3)的体积比混合乳化。
前述的三联灭活疫苗制备方法，步骤1)培养至HA效价不低于8log2时，收获病毒液。
前述的三联灭活疫苗制备方法，步骤2)的灭活方式为甲醛灭活。
前述的三联灭活疫苗制备方法，步骤2)还包括对病毒进行超滤浓缩。
前述的三联灭活疫苗制备方法，步骤3)的白油为94体积份；
和/或，步骤3)中司本-80位6体积份；
和/或，步骤4)中蛋白含量为360μg/ml；
和/或，步骤4)中的体积比为1∶1∶1；
和/或，步骤4)中96体积份的抗原液与4体积份的吐温-80混合；
和/或，步骤5)中的水相和油相的体积比是1∶2。
前述的三联灭活疫苗制备方法，步骤1)中新城疫病毒为aSG10株；和/或，H9禽流感病毒为G株。
前述的三联灭活疫苗制备方法，步骤1)中新城疫病毒的制备方法为：
将鸭胚视网膜全悬浮细胞在逐级放大传代培养；当细胞密度为8.0×106/ml以上时，新城疫病毒，同时添加DMEM培养基，使DMEM培养基浓度被稀释至原浓度的10％～20％；每日添加终浓度为3-7μg/ml的胰酶，在温度为33～37℃条件下培养，收毒即可；
优选地，所述DMEM培养基浓度被稀释至原浓度的15％；
优选地，所述胰酶终浓度为5μg/ml；
优选地，温度为35℃。
如前述的三联灭活疫苗制备方法，步骤1)中禽流感病毒的制备方法如下：
将MDCK细胞逐级放大培养；当细胞密度为(5-7)×106/ml时，接种H9亚型禽流感病毒，同时添加终浓度为4-8μg/ml的胰酶溶液，每日添加一次相同剂量的胰酶溶液，培养48h，取样检测HA效检，当HA效价不低于8log2时，收获病毒液；冻融3次，备用；
优选地，所述胰酶的添加终浓度为6μg/ml。
前述任一方法制备得到的三联疫苗。
本发明具有如下有益效果：
1)本发明的安全性和传统的鸡胚疫苗一致，不会引起鸡的不良反应。
2)本发明相比传统鸡胚苗具有更高的保护率。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过具体实施方式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
实施例1本发明的三联疫苗制备
1 NDV细胞毒制备
将AGE1细胞(鸭胚视网膜全悬浮细胞)逐级放大传代至7L的生物反应器中，培养液体积为4～5L，pH值设置为7.15，溶氧值设置为60％，转速设置为150r/min，37℃培养。当细胞密度为8.0×106/ml以上时，以0.0001MOI接种NDV aSG10株病毒，同时添加DMEM培养基，使DMEM培养基浓度被稀释至原浓度的15％；以及添加终浓度为5μg/ml的胰酶溶液，每日添加一次相同剂量的胰酶溶液，将培养温度调至35℃，培养72h，取样检测HA效检，当HA效价不低于8log2时，收获病毒液。冻融3次，备用。
2 H9亚型禽流感细胞毒制备
将MDCK细胞逐级放大传代至7L的生物反应器中，培养液体积为4～5L，pH值设置为7.0，溶氧值设置为50％，转速设置为130r/min，37℃培养。当细胞密度为(5-7)×106/ml时，按照0.01MOI接种H9亚型禽流感G株病毒，同时添加终浓度为6μg/ml的胰酶溶液，每日添加一次相同剂量的胰酶溶液，培养48h，取样检测HA效检，当HA效价不低于8log2时，收获病毒液。冻融3次，备用。
3 Fiber-2蛋白溶液的制备
取BL21(DE3)-Fiber-2株菌液，经发酵液、诱导表达后，收集诱导后的菌液，使用高压均质裂解后，按照经PEG沉淀方法纯化获得Fiber-2蛋白溶液，备用。
4病毒液的浓缩和灭活
取NDV aSG10株病毒液和H9亚型AIV G株病毒液，应用美国Pall Corporation超滤系统，100KD的超滤膜，进行3倍浓缩。对于NDV aSG10株病毒液，加入终浓度为0.1％的甲醛，37℃灭活20h；对于H9亚型AIV G株病毒液，加入终浓度为0.2％的甲醛，37℃灭活24h。Fiber-2蛋白溶液加入终浓度为0.05％的甲醛溶液，4℃灭活48h。
5油相制备
取优质注射用白油94体积份，边加边搅拌，直到完全透明，再加入司本-80(Span-80)6体积份，充分混匀，高压灭菌备用。
6水相制备
分别取灭活后的病毒液以及Fiber-2蛋白溶液稀释至蛋白含量为360μg/ml。按体积1∶1∶1比例混合，取混合后的抗原液96份，加入4份灭菌吐温-80，充分搅拌，直到吐温-80完全溶解。
7乳化分装
水相与油相按1∶2比例，先将油相输入乳化罐中搅拌再缓慢加入水相，继续搅拌使油相与水相充分混匀，然后通过剪切机在线乳化，终止前加入1％硫柳汞溶液，使其最终浓度为0.01％。将乳化好的疫苗定量分装，加盖密封，并粘贴标签。置2～8℃保存。
8性状检验
外观：为均匀乳剂。
剂型：取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，除第1滴外，均不扩散，表明乳化效果良好，为油包水型疫苗。
稳定性：吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相不超过0.5ml，符合《中国兽药典》附录规定，表明稳定性良好。
实施例2本发明的三联疫苗制备
1 NDV细胞毒制备
将AGE1细胞(鸭胚视网膜全悬浮细胞)逐级放大传代至7L的生物反应器中，培养液体积为4～5L，pH值设置为7.15，溶氧值设置为60％，转速设置为150r/min，37℃培养。当细胞密度为8.0×106/ml以上时，以0.0001MOI接种NDV aSG10株病毒，同时添加DMEM培养基，使DMEM培养基浓度被稀释至原浓度的10％；以及添加终浓度为3μg/ml的胰酶溶液，每日添加一次相同剂量的胰酶溶液，将培养温度调至36℃，培养72h，取样检测HA效检，当HA效价不低于8log2时，收获病毒液。冻融3次，备用。
2 H9亚型禽流感细胞毒制备
将MDCK细胞逐级放大传代至7L的生物反应器中，培养液体积为4～5L，pH值设置为7.0，溶氧值设置为50％，转速设置为130r/min，33℃培养。当细胞密度为(5-7)×106/ml时，按照0.01MOI接种H9亚型禽流感G株病毒，同时添加终浓度为4μg/ml的胰酶溶液，每日添加一次相同剂量的胰酶溶液，培养48h，取样检测HA效检，当HA效价不低于8log2时，收获病毒液。冻融3次，备用。
3 Fiber-2蛋白溶液的制备
取BL21(DE3)-Fiber-2株菌液，经发酵诱导表达后，收集诱导后的菌液，使用高压均质裂解后，按照经PEG沉淀方法纯化获得Fiber-2蛋白溶液，备用。
4病毒液的浓缩和灭活
取NDV aSG10株病毒液和H9亚型AIV G株病毒液，应用美国Pall Corporation超滤系统，100KD的超滤膜，进行3倍浓缩。对于NDV aSG10株病毒液，加入终浓度为0.1％的甲醛，37℃灭活20h；对于H9亚型AIVG株病毒液，加入终浓度为0.2％的甲醛，37℃灭活24h。Fiber-2蛋白溶液加入终浓度为0.05％的甲醛溶液，4℃灭活48h。
5油相制备
取优质注射用白油98体积份，边加边搅拌，直到完全透明，再加入司本-80(Span-80)2体积份，充分混匀，高压灭菌备用。
6水相制备
分别取灭活后的病毒液以及Fiber-2蛋白溶液稀释至蛋白含量为420μg/ml。按体积1∶2∶1比例混合，取混合后的抗原液94份，加入6份灭菌吐温-80，充分搅拌，直到吐温-80完全溶解。
7乳化分装
水相与油相按1∶3比例，先将油相输入乳化罐中搅拌再缓慢加入水相，继续搅拌使油相与水相充分混匀，然后通过剪切机在线乳化，终止前加入1％硫柳汞溶液，使其最终浓度为0.01％。将乳化好的疫苗定量分装，加盖密封，并粘贴标签。置2～8℃保存。
8性状检验
外观：为均匀乳剂。
剂型：取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，除第1滴外，均不扩散，表明乳化效果良好，为油包水型疫苗。
稳定性：吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相不超过0.5ml，符合《中国兽药典》附录规定，表明稳定性良好。
实施例3本发明的三联疫苗制备
1 NDV细胞毒制备
将AGE1细胞(鸭胚视网膜全悬浮细胞)逐级放大传代至7L的生物反应器中，培养液体积为4～5L，pH值设置为7.15，溶氧值设置为60％，转速设置为150r/min，37℃培养。当细胞密度为8.0×106/ml以上时，以0.0001MOI接种NDV aSG10株病毒，同时添加DMEM培养基，使DMEM培养基浓度被稀释至原浓度的20％；以及添加终浓度为7μg/ml的胰酶溶液，每日添加一次相同剂量的胰酶溶液，将培养温度调至37℃，培养72h，取样检测HA效检，当HA效价不低于8log2时，收获病毒液。冻融3次，备用。
2H9亚型禽流感细胞毒制备
将MDCK细胞逐级放大传代至7L的生物反应器中，培养液体积为4～5L，pH值设置为7.0，溶氧值设置为50％，转速设置为130r/min，37℃培养。当细胞密度为(5-7)×106/ml时，按照0.01MOI接种H9亚型禽流感G株病毒，同时添加终浓度为8μg/ml的胰酶溶液，每日添加一次相同剂量的胰酶溶液，培养48h，取样检测HA效检，当HA效价不低于8log2时，收获病毒液。冻融3次，备用。
3Fiber-2蛋白溶液的制备
取BL21(DE3)-Fiber-2株菌液，经发酵、诱导表达后，收集诱导后的菌液，使用高压均质裂解后，按照经PEG沉淀方法纯化获得Fiber-2蛋白溶液，备用。
4病毒液的浓缩和灭活
取NDV aSG10株病毒液和H9亚型AIV G株病毒液，应用美国Pall Corporation超滤系统，100KD的超滤膜，进行3倍浓缩。对于NDV aSG10株病毒液，加入终浓度为0.1％的甲醛，37℃灭活20h；对于H9亚型AIV G株病毒液，加入终浓度为0.2％的甲醛，37℃灭活24h。Fiber-2蛋白溶液加入终浓度为0.05％的甲醛溶液，4℃灭活48h。
5油相制备
取优质注射用白油96体积份，边加边搅拌，直到完全透明，再加入司本-80(Span-80)4体积份，充分混匀，高压灭菌备用。
6水相制备
分别取灭活后的病毒液以及Fiber-2蛋白溶液稀释至蛋白含量为300μg/ml。按体积2∶1∶2比例混合，取混合后的抗原液99体积份，加入1体积份灭菌吐温-80，充分搅拌，直到吐温-80完全溶解。
7乳化分装
水相与油相按1∶1.5比例，先将油相输入乳化罐中搅拌再缓慢加入水相，继续搅拌使油相与水相充分混匀，然后通过剪切机在线乳化，终止前加入1％硫柳汞溶液，使其最终浓度为0.01％。将乳化好的疫苗定量分装，加盖密封，并粘贴标签。置2～8℃保存。
8性状检验
外观：为均匀乳剂。
剂型：取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，除第1滴外，均不扩散，表明乳化效果良好，为油包水型疫苗。
稳定性：吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相不超过0.5ml，符合《中国兽药典》附录规定，表明稳定性良好。
以下将以实验例的形式对本发明进一步说明。
试验例1与鸡胚苗安全检验对比试验
使用7日龄的SPF鸡40只，随机平均分为4组，10只/组，其中2组分别经颈部皮下、腿部肌肉注射途径接种新型疫苗1.0ml，另外2组，分别分别经颈部皮下、腿部肌肉注射途径接种传统鸡胚疫苗1.0ml。观察14日，均未出现由疫苗引起的局部和全身不良反应。表明制备的新型三联疫苗与传统的鸡胚疫苗安全性均良好，结果如表1所示。
表1疫苗接种SPF鸡的安全试验
Figure BDA0002154414900000071
试验例2与鸡胚苗效力检验对比试验
本部分涉及的HI抗体检测方法如下：
1血凝抑制(HI)试验操作方法
1.1 HI抗原工作液配制
1.1.1 HI抗原血凝价测定取96孔V型微量反应板1块，每孔加25μlPBS(0.01mol/L，pH值7.2～7.4)，第一排加25μl抗原，并做4个重复孔，然后将抗原进行2倍系列稀释，稀释后每孔加入25μl PBS，最后再加入1％鸡红细胞悬液25μl，用微量振荡器混匀，室温下静置30分钟后判定结果。以使100％红细胞凝集的抗原最高稀释倍数作为判定终点。
1.1.2 4HA单位抗原的配制根据测定的HI抗原HA效价，用PBS配制4HA单位抗原。将配制好的4HA单位抗原用PBS稀释，使其稀释度为1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7。在每一稀释度的25μl抗原中加25μl PBS，再加入1％鸡红细胞悬液25μl，混匀，室温静置30分钟后判定结果。如果1∶4稀释为100％红细胞凝集终点，表明配制的是4HA单位抗原；如果100％红细胞凝集终点是1∶5或1∶6，表明配制的4HA单位抗原实际上是高于4个单位；如果100％红细胞凝集终点是1∶2或1∶3，表明配制的4HA单位抗原实际上是低于4个单位。应根据结果适当调整使抗原工作液为4HA单位。
1.2 HI试验
1.2.1取96孔V型微量反应板，每孔加25μl PBS。
1.2.2分别吸取25μl待检血清，加至每块板的第一列各相应孔内，并在每块板上设阳性血清和阴性血清对照，然后作2倍系列稀释。
1.2.3分别向各孔中加入含4HA单位的抗原25μl，室温下静置30分钟。
1.2.4每孔中加入1％鸡红细胞悬液25μl，轻轻混匀，室温下静置30分钟。
1.2.5结果判定将反应板倾斜，凡血清反应孔与红细胞对照孔中红细胞以同样速度从孔底流淌者判为血凝抑制。当阴性血清HI抗体效价不高于1∶4、阳性血清HI抗体效价与已知抗体效价相比误差不超过1个滴度时，试验成立。以完全抑制4HA单位抗原的血清最高稀释度作为HI抗体效价。
2新城疫效力检验部分
用35日龄的SPF鸡20只，平均分为2组，10只/组，各颈部皮下注射新型疫苗和鸡胚苗，20μl/只，另设5只同日龄SPF鸡不免疫作对照。免疫后28日各试验组分别采血分离血清，检测HI抗体并进行比较分析。同时用NDV强毒株(SG10株)通过肌肉途径进行攻毒。结果免疫后28日的新型疫苗的HI抗体平均滴度略优于鸡胚苗，用NDV强毒株(SG10株)攻毒后，2种疫苗的保护率均不低于9/10，结果见表2。
表2鸡新城疫部分效力比对试验结果
Figure BDA0002154414900000081
注：“/”表示无此项。
3禽流感效力检验部分
用21日龄SPF鸡20只，平均分为2组，10只/组，分别经颈部皮下注射新型疫苗和鸡胚苗，0.25ml/只，另设5只同日龄SPF鸡不免疫作对照。免疫后21日各试验组分别采血分离血清，检测HI抗体，同时用H9亚型AIV G株进行翅静脉攻毒。结果，免疫后21日的新型疫苗HI抗体滴度明显高于鸡胚苗，用G株攻毒后，保护率均不低于9/10，检测具体结果见表3。
表3禽流感部分免疫21日后的效力检验结果
Figure BDA0002154414900000082
3禽腺病毒病效力检验部分
用21日龄SPF鸡20只，平均分为2组，10只/组，分别经颈部皮下注射新型疫苗和鸡胚苗，0.25ml/只，另取5只不免疫作对照。免疫后21日，每只鸡分别采血，分离血清，测定琼扩抗体效价。同时每只鸡翅静脉注射I群禽腺病毒(4型)HB1501株病毒液进行攻毒。结果，免疫后21日的2种疫苗的AGP抗体呈阳性率及保护率均为10/10，无差异，检测具体结果见表4。
表4禽腺病毒部分免疫21日后的效力检验结果
Figure BDA0002154414900000083
综上，本发明采用细胞悬浮培养的方法培养鸡新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒，与禽腺病毒Fiber-2蛋白结合，制备成三联灭活疫苗，能够达到与鸡胚苗同等的安全性，更能在新城疫与H9亚型禽流感的临床保护能力上超过鸡胚苗。结合本发明细胞悬浮培养病毒对传统鸡胚培养病毒的诸多天然优势(细胞培养效率高、更环保)，本发明的三联疫苗及其制备方法具有十分良好的应用前景。

Claims (10)

1.一种鸡新城疫、禽流感和禽腺病毒三联灭活疫苗制备方法，其特征在于，它是以灭活后的鸡新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒、Fiber-2蛋白为活性成分，加上药学上可接受的免疫佐剂及其它辅助性成分，即得；
所述鸡新城疫病毒是通过鸭胚视网膜全悬浮细胞培养得到的；
所述H9亚型禽流感病毒是通过MDCK细胞培养得到的。
2.如权利要求1所述的三联灭活疫苗制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)病毒培养：使用鸭胚视网膜全悬浮细胞培养鸡新城疫病毒，使用MDCK细胞培养H9亚型禽流感病毒；
2)病毒灭活；
3)油相制备：注射用白油94～98体积份，加入司本-80 2～6体积份，灭菌；
4)水相制备：将灭活病毒与Fiber-2蛋白分别溶于水，配成蛋白含量为300-420μg/ml，按(1-2)∶(1-2)∶(1-2)的体积比混合，取混合后得抗原液，94～99体积份抗原液与1～6体积份吐温-80混合；
5)乳化∶水相和油相按1∶(1.5～3)的体积比混合乳化。
3.如权利要求2所述的三联灭活疫苗制备方法，其特征在于，步骤1)培养至HA效价不低于8log2时，收获病毒液。
4.如权利要求2所述的三联灭活疫苗制备方法，其特征在于，步骤2)的灭活方式为甲醛灭活。
5.如权利要求2所述的三联灭活疫苗制备方法，其特征在于，步骤2)还包括对病毒进行超滤浓缩。
6.如权利要求2所述的三联灭活疫苗制备方法，其特征在于，
步骤3)的白油为94重量份；
和/或，步骤3)中司本-80位6重量份；
和/或，步骤4)中蛋白含量为360μg/ml；
和/或，步骤4)中的体积比为1∶1∶1；
和/或，步骤4)中96体积份的抗原液与4体积份的吐温-80混合；
和/或，步骤5)中的水相和油相的体积比是1∶2。
7.如权利要求2所述的三联灭活疫苗制备方法，其特征在于，步骤1)中新城疫病毒为aSG10株；和/或，H9禽流感病毒为G株。
8.如权利要求2所述的三联灭活疫苗制备方法，其特征在于，步骤1)中新城疫病毒的制备方法为：
将鸭胚视网膜全悬浮细胞在逐级放大传代培养；当细胞密度为8.0×106/ml以上时，新城疫病毒，同时添加DMEM培养基，使DMEM培养基浓度被稀释至原浓度的10％～20％；每日添加终浓度为3-7μg/ml的胰酶，在温度为33～37℃条件下培养，收毒即可；
优选地，所述DMEM培养基浓度被稀释至原浓度的15％；
优选地，所述胰酶终浓度为5μg/ml；
优选地，温度为35℃。
9.如权利要求2所述的三联灭活疫苗制备方法，其特征在于，步骤1)中禽流感病毒的制备方法如下：
将MDCK细胞逐级放大培养；当细胞密度为(5-7)×106/ml时，接种H9亚型禽流感病毒，同时添加终浓度为4-8μg/ml的胰酶溶液，每日添加一次相同剂量的胰酶溶液，培养48h，取样检测HA效检，当HA效价不低于8log2时，收获病毒液；冻融3次，备用；
优选地，所述胰酶的添加终浓度为6μg/ml。
10.权利要求1-9任一所述方法制备得到的三联疫苗。
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