CN110917343B

CN110917343B - 一种新城疫与传染性法氏囊病二联亚单位疫苗

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Publication number: CN110917343B
Application number: CN201911240278.5A
Authority: CN
Inventors: 钱晶; 王永山; 欧阳伟; 马孙婷; 王晓丽; 夏兴霞; 王晶宇; 诸玉梅
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-12-06
Filing date: 2019-12-06
Publication date: 2023-09-26
Anticipated expiration: 2039-12-06
Also published as: CN110917343A

Abstract

本发明公开了一种新城疫与传染性法氏囊病二联亚单位疫苗，属于兽用生物制品领域。本发明的亚单位疫苗是以新城疫病毒样颗粒和传染性法氏囊病病毒样颗粒作为抗原，是通过重组杆状病毒(rBV‑NDV‑HN+F+M和rBV‑IBDV‑doubleVP2)感染昆虫细胞后，经提纯灭活处理制备而成。本发明制备的亚单位疫苗免疫鸡群能够快速产生特异性抗体，可用于预防鸡新城疫病毒和传染性法氏囊病病毒的感染。试验表明，本发明的亚单位疫苗在预防新城疫病毒强毒株感染和在预防传染性法氏囊病病毒感染中较商品疫苗具有更好的免疫保护效力。

Description

一种新城疫与传染性法氏囊病二联亚单位疫苗

技术领域

本发明公开了一种新城疫与传染性法氏囊病二联亚单位疫苗，属于兽用生物制品领域。

背景技术

新城疫(ND)是由新城疫病毒(NDV)强毒株感染引起的一种急性、高度接触性禽类烈性传染病，是《国家中长期动物疫病防治规划(2012—2020年)》中优先防制的一类动物疫病之一。传染性法氏囊病(IBD)是由传染性法氏囊病病病毒(IBDV)引起的以侵害幼禽法氏囊为主要特征的免疫抑制性传染病，是危害养鸡业的主要疫病。近年来，虽然ND和IBD疫苗的广泛使用，使疫病的爆发流行明显减少，但是出现了非典型性症状、免疫带毒、免疫失败、区域流行以及混合感染等流行新特点，直接及间接造成的经济损失巨大，防控面临着新挑战，寻求防控ND和IBD已成为亟待解决的重大科学与生产实际问题。

分子流行病学研究结果表明，我国目前流行的NDV以基因VI型(鸽群)和VII型(鸡、鸭、鹅群)为主，而IBDV多为自然重配的变异株；不同地区、不同时间分离的NDV和IBDV在抗原性、致病性和毒力存在着差异。目前，我国仍采用疫苗接种为主的防控策略。然而，现有的ND和IBD疫苗存在外源病毒污染、抗原性不匹配、免疫效果不佳以及工艺繁琐等问题。另外，商品化活疫苗在禽群中频繁使用，导致局部地区病毒污染严重，不利于疫病的净化。

病毒样颗粒(VLPs)保留了天然病毒颗粒的空间构象、诱导中和抗体的抗原表位以及重复且高密度展示抗原表位，表现为更强的免疫原性，能够诱导有效的免疫应答，具有安全、高效的特点。这些优势使得VLPs成为开发新型亚单位疫苗的热点和趋势。这类亚单位疫苗不含有核酸物质，不存在潜在的病毒致病基因，安全性更高，可以减少禽流感全病毒疫苗免疫对病毒变异带来的压力，减少病毒的变异；另外，接种后能快速产生特异性抗体，所产生的免疫应答也能与野毒感染相区分，有利于疫病的控制、净化和消灭。因此，研制安全、高效、与流行株抗原性相匹配的新型疫苗已成为当务之急，这对保障养禽业的持续健康发展具有重要现实意义。

发明内容

技术问题

本发明的目的是提供一种新城疫与传染性法氏囊病二联亚单位疫苗，研制安全、高效、与流行株抗原性相匹配的新型疫苗，用于预防鸡新城疫病毒和传染性法氏囊病病毒的感染。

技术方案

为达到以上目的，是通过以下技术方案实现的：

一种新城疫与传染性法氏囊病二联亚单位疫苗，该疫苗包含有抗原和免疫佐剂，其中抗原为新城疫病毒样颗粒和传染性法氏囊病病毒样颗粒，免疫佐剂为矿物油。所述的新城疫病毒样颗粒和传染性法氏囊病病毒样颗粒是通过两种重组杆状病毒分别感染昆虫细胞后，经提纯灭活处理制备而成。所述的两种重组杆状病毒分别携带有用于编码新城疫病毒HN、F、M蛋白的串联核苷酸片段和编码传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的重复串联核苷酸片段，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。

所述的新城疫病毒样颗粒和传染性法氏囊病病毒样颗粒的蛋白质量比为1:1，每羽份所述的疫苗中新城疫病毒样颗粒的蛋白含量≥5μg，传染性法氏囊病病毒样颗粒的蛋白含量≥5μg，抗原与免疫佐剂的体积比为1:1。

新城疫与传染性法氏囊病二联亚单位疫苗制备工艺中的提纯灭活处理包括BEI灭活工艺和硫酸铵梯度沉淀法纯化工艺。其中，BEI灭活浓度为0.5％、灭活时间为24小时；纯化新城疫病毒样颗粒和传染性法氏囊病病毒样颗粒的硫酸铵梯度分别是50％-30％和60％-40％。

用所述的一种新城疫与传染性法氏囊病二联亚单位疫苗可以应用在预防鸡新城疫病毒和传染性法氏囊病病毒的感染。

有益效果

本发明研制了一种安全、高效、与流行株抗原性相匹配的新型疫苗。本发明用当前流行株的保护性抗原序列，通过昆虫-杆状病毒表达系统制备新城疫病毒样颗粒和传染性法氏囊病病毒样颗粒，利用高效表达蛋白的High-Five昆虫细胞株，采用BEI灭活法和硫酸铵梯度沉淀法确定灭活纯化参数，节约了生产成本，适用于大规模生产。本发明制备的亚单位疫苗不含有核酸物质，安全性极高，免疫动物能够快速产生特异性抗体，可用于预防鸡新城疫病毒和传染性法氏囊病病毒的感染。其优点如下：

1.本发明所述的新城疫病毒样颗粒是通过重组杆状病毒rBV-NDV-HN+F+M感染昆虫细胞后，经提纯灭活处理制备而成。其中重组杆状病毒rBV-NDV-HN+F+M编码新城疫病毒HN、F、M蛋白的核苷酸片段是相互串联而成，各基因间采用T2A剪切肽进行连接，实现了新城疫病毒三种结构蛋白的独立表达并自组装成新城疫病毒样颗粒，该策略构建新城疫病毒样颗粒属首次公开。

2.本发明所述的传染性法氏囊病病毒样颗粒是通过重组杆状病毒rBV-IBDV-doubleVP2感染昆虫细胞后，经提纯灭活处理制备而成。其中重组杆状病毒rBV-IBDV-doubleVP2编码两个传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的核苷酸片段是重复串联而成，各基因间采用T2A剪切肽进行连接，实现了传染性法氏囊病病毒结构蛋白的独立表达并自组装成传染性法氏囊病病毒样颗粒，该策略构建传染性法氏囊病病毒颗粒属首次公开。

3.本发明采用高效表达新城疫病毒样颗粒和传染性法氏囊病病毒样颗粒的High-Five昆虫细胞株，用重组杆状病毒分别感染相应细胞株的感染周期为56-64小时、产量为90-130mg/L。

4.本发明所述的提纯灭活处理包括BEI灭活工艺和硫酸铵梯度沉淀法纯化工艺。其中，BEI全名为二乙烯亚胺，其原理是破坏病毒核酸而不破坏蛋白质，并保持病毒抗原性，相比于传统甲醛灭活方式更有优势。采用硫酸铵梯度沉淀法较传统方法(蔗糖密度梯度离心法、分子筛法、凝胶过滤法等)更为方便快捷且成本不高，并且根据纯化病毒样颗粒的理化性质，本发明确定纯化新城疫病毒样颗粒和传染性法氏囊病病毒样颗粒的硫酸铵梯度分别是50％-30％和60％-40％。因此，采用所述的提纯灭活处理能保证疫苗的安全性、抗原性以及生产实用性，适用于大规模化生产。

具体实施方式

(一)病毒样颗粒的制备

1.重组杆状病毒rBV-NDV-HN+F+M的构建

将当前流行VII型NDV强毒NA-1株(GenBank登录号：DQ659677。丁壮，等.新城疫流行病学新特点及鹅新城疫防控策略.中国兽医学报,2015,35(1):38-40.)中M、F、HN基因序列信息，人工合成经昆虫细胞密码子优化的核酸序列(由通用生物系统(安徽)有限公司合成)，各基因间核苷酸片段是相互串联，采用T2A剪切肽进行连接而成NDV-HN+F+M，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1。在其人工合成序列两端分别引入EcoR I和Not I酶切位点。随后，将人工合成序列与穿梭质粒pFastBac1^TM(赛默飞世尔科技公司产品)分别进行EcoR I和Not I(宝日医生物技术(北京)有限公司产品)酶切消化，经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，采用凝胶回收试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司产品)分别回收片段，在T4连接酶(宝日医生物技术(北京)有限公司产品)的连接作用下，4℃孵育16小时，转化至E.coli DH5α感受态(宝日医生物技术(北京)有限公司产品)中，获得重组穿梭质粒pFastBac1-NDV-HN+F+M。将该重组穿梭质粒转化至E.coli DH10 Bac感受态细胞(赛默飞世尔科技公司产品)中，使其进行同源重组，经含有三抗(卡那霉素终浓度100μg/ml、庆大霉素终浓度50μg/ml、四环素终浓度70μg/ml)的IPTG条件筛选培养基(IPTG终浓度24mg/ml，X-Gal终浓度20mg/ml，该筛选培养基可通过菌落形成颜色判定是否发生同源重组，白色菌落即代表重组成功，蓝色菌落则未成功)培养筛选48小时，挑取白斑，获得重组杆粒rBacmid-NDV-HN+F+M。将该重组杆粒通过脂质体介导转染法(X-tremeGENE HP DNA transfection Reagent，Roche公司产品)转染至昆虫Sf9细胞(赛默飞世尔科技公司产品)，转染96小时待细胞病变后，收集细胞上清液即为第一代重组杆状病毒，接着继续将第一代重组杆状病毒接种昆虫Sf9细胞，同样培养条件下，收集第二代重组杆状病毒，以此类推，收集至第四代重组杆状病毒，并将其命名为rBV-NDV-HN+F+M，保存-20℃备用。

2.重组杆状病毒rBV-IBDV-doubleVP2的构建

将当前流行IBDV变异Cu1株(GenBank登录号：D00867.1。王永山，等.近期引起免疫失败的传染性腔上囊病病毒VP2基因的分子特征[J].中国兽医科学,2008,38(12):1013-1019.)中VP2基因序列信息，人工合成经昆虫细胞密码子优化的核酸序列(由通用生物系统(安徽)有限公司合成)，VP2基因间核苷酸片段重复串联而成，采用T2A剪切肽进行连接而成IBDV-doubleVP2，其核苷酸序列为SEQ ID NO：2。参照上述重组杆状病毒的构建方式(见本发明“具体实施方式，(一)病毒样颗粒的制备，1.重组杆状病毒rBV-NDV-HN+F+M的构建”章节内容)构建获得重组杆状病毒rBV-IBDV-doubleVP2，保存-20℃备用。

3.高效表达细胞株的筛选

将上述重组杆状病毒rBV-NDV-HN+F+M和rBV-IBDV-doubleVP2分别用昆虫Sf9细胞和High-Five昆虫细胞(购自赛默飞世尔科技公司。High-Five昆虫细胞(BTI-TN-5B1-4)是从亲代Trichopulsiani细胞系分离得到的克隆，通常用于使用杆状病毒表达载体系统的重组蛋白表达，这种细胞能进行无血清悬浮培养，显著节省了与无血清和/或悬浮培养时的培养物驯化相关的时间和经费。)进行病毒滴度测定(检测试剂盒为BacPAK^TM BaculovirusRapid Titer Kit，购自宝日医生物技术(北京)有限公司)，其中无血清培养基为ExpressFive^TM SFM(赛默飞世尔科技公司产品)。结果显示，用昆虫Sf9细胞培养重组杆状病毒rBV-NDV-HN+F+M和rBV-IBDV-doubleVP2，其病毒滴度分别为6×10⁶IFU/mL和3×10⁷IFU/mL，其感染时间分别为96小时和84小时；用High-Five昆虫细胞培养重组杆状病毒rBV-NDV-HN+F+M和rBV-IBDV-doubleVP2，其病毒滴度分别为1×10⁸IFU/mL和2×10⁹IFU/mL，其感染时间分别为64小时和56小时。采用High-Five昆虫细胞可明显提高重组杆状病毒rBV-NDV-HN+F+M和rBV-IBDV-doubleVP2的病毒滴度，缩短感染时间。

重组杆状病毒rBV-NDV-HN+F+M的蛋白表达测定采用血凝试验(具体步骤参照中华人民共和国国家标准《GB/T16550-2008新城疫诊断技术》，发布日：2008-12-31，实施日：2009-05-01，发布机构：中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局、中国国家标准化管理委员会)；重组杆状病毒rBV-IBDV-doubleVP2的蛋白表达测定采用琼脂扩散试验(参照《禽病学》，刁有祥主编，《中国农业科学技术出版社》，第84页第14-17行，2.琼脂扩散试验(AGP))。根据测定结果，感染重组杆状病毒rBV-NDV-HN+F+M的High-Five昆虫细胞上清测定的血凝活性由6 log₂(感染昆虫Sf9细胞的上清)提升至9 log₂；感染重组杆状病毒rBV-IBDV-doubleVP2的High-Five昆虫细胞上清测定的琼脂扩散效价由5 log₂(感染昆虫Sf9细胞的上清)提升至7 log₂。采用High-Five昆虫细胞可明显提高重组杆状病毒rBV-NDV-HN+F+M和rBV-IBDV-doubleVP2感染细胞后细胞上清的蛋白表达。

4.新城疫病毒样颗粒的制备

将筛选的High-Five细胞株扩大培养至500mL悬浮培养瓶(赛默飞世尔科技公司产品)中，于28℃、120r/min摇床培养，待细胞密度达到5×10⁶个/mL时，取重组杆状病毒rBV-NDV-HN+F+M以MOI＝0.5(感染复数)感染细胞，继续培养64小时，收集细胞培养上清，经8000r/min离心30分钟，去除大的细胞碎片。加入灭活剂BEI(BEI全名为二乙烯亚胺，其原理是破坏病毒核酸而不破坏蛋白质，并保持病毒抗原性，相比于传统甲醛灭活方式更有优势。购自Sigma公司)，使其终浓度为0.5％，作用24小时后，取液进行灭活检验(将液接种细胞观察96小时后细胞是否出现病变，重复三次，均无出现细胞病变后确定灭活成功)。根据收集液体积(以500mL为例)，先加入150g硫酸铵分析纯(国药集团化学试剂有限公司)使其终浓度为30％，充分混匀4小时后，8000r/min离心30分钟，保留上清液(此步骤可去除较大分子量的杆状病毒)，再加入250g硫酸铵分析纯，使其终浓度为50％，充分混匀4小时后，8000r/min离心30分钟，保留沉淀(沉淀中含有所需的新城疫病毒样颗粒)，用1mL的PBS液(磷酸盐缓冲液，pH7.2)重悬沉淀，经BCA蛋白定量检测试剂盒(赛默飞世尔科技公司产品)测定其浓度为65mg/mL，经血凝试验测定其血凝效价为18 log₂，-70℃保存备用。其中产量计算公式为产量＝[纯化浓度(65mg/mL)×重悬体积(1mL)]/培养体积(0.5L)＝130mg/L。

本发明纯化的新城疫病毒样颗粒产量达130mg/L，相比于已公开的专利(丁壮，钱晶，丁佳欣，徐小洪，袁乾亮，武淑婷，尹仁福.一种新城疫病毒样颗粒、制备方法及其应用，专利申请号：201611183096.5，申请日：2016年12月20日.)所采用不连续20％-40％-60％蔗糖密度梯度纯化的新城疫病毒样颗粒血凝效价为2¹⁰(也可理解为10 log₂)，本发明纯化的新城疫病毒样颗粒血凝效价为18 log₂(也可理解为2¹⁸)，极大提高了其产量，这是由于本专利在种毒(重组杆状病毒rBV-NDV-HN+F+M)、细胞株筛选(High-Five昆虫细胞)以及纯化工艺(50％-30％硫酸铵梯度沉淀法)等方面的优化所获得的。

5.传染性法氏囊病病毒样颗粒的制备

将筛选的High-Five-VP2细胞株扩大培养至500mL悬浮培养瓶(赛默飞世尔科技公司产品)中，于28℃、120r/min摇床培养，待细胞密度达到5×10⁶个/mL时，取重组杆状病毒rBV-IBDV-doubleVP2以MOI＝1(感染复数)感染细胞，继续培养56小时，收集细胞培养上清，经8000r/min离心30分钟，去除大的细胞碎片。加入灭活剂BEI(Sigma公司产品)，使其终浓度为0.5％，作用24小时后，取液进行灭活检验。根据收集液体积(以500mL为例)，先加入200g硫酸铵分析纯(国药集团化学试剂有限公司)使其终浓度为40％，充分混匀4小时后，8000r/min离心30分钟，保留上清液(此步骤可去除较大分子量的杆状病毒)，再加入300g硫酸铵分析纯，使其终浓度为60％，充分混匀4小时后，8000r/min离心30分钟，保留沉淀(沉淀中含有所需的传染性法氏囊病病毒样颗粒)，用1mL的PBS液(磷酸盐缓冲液，pH7.2)重悬沉淀，经BCA蛋白定量检测试剂盒(赛默飞世尔科技公司产品)测定其浓度为45mg/mL，经琼脂扩散试验测定其琼脂扩散效价为14 log₂，-70℃保存备用。其中产量计算公式为产量＝[纯化浓度(45mg/mL)×重悬体积(1mL)]/培养体积(0.5L)＝90mg/L。

本发明纯化的传染性法氏囊病病毒样颗粒产量达90mg/L，极大提高了其产量，这是由于本专利在种毒(重组杆状病毒rBV-IBDV-doubleVP2)、细胞株筛选(High-Five昆虫细胞)以及纯化工艺(60％-40％硫酸铵梯度沉淀法)等方面的优化所获得的。

(二)新城疫与传染性法氏囊病二联亚单位疫苗的制备

1.亚单位疫苗制备

1.1抗原准备

取制备的新城疫病毒样颗粒和传染性法氏囊病病毒样颗粒进行适当稀释，将其蛋白质量比设定为1:1，与相应佐剂进行乳化。

1.2油佐剂疫苗配制

油相制备按照注射用矿物油(也叫白油)(见《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》附录343页)96份、司本-804份、硬脂酸铝2份(以上材料均购自南京天邦生物科技有限公司)的比例配置油相。取硬脂酸铝，用少量注射用白油混合，加热融化至半透明状，再与全量司本-80及剩余注射用白油混合均匀，经121℃灭菌15分钟，冷却至室温备用。水相制备取制备的抗原稀释液，按照抗原稀释液的加入吐温-80乳化。将水相和油相按照1:1(体积比v/v)比例进行乳化，1000r/min乳化10分钟。每羽份所述的疫苗中新城疫病毒样颗粒的蛋白含量≥5μg，传染性法氏囊病病毒样颗粒的蛋白含量≥5μg。最终获得的新城疫与传染性法氏囊病二联亚单位疫苗进行下一步成品检测。

2.亚单位疫苗成品检测

2.1性状外观

外观为白色乳状液；剂型为油包水型；稳定性为37℃可保存30天，而后破乳；粘度适中(使其垂直自然流出，15秒内累计滴出1mL乳液)。

2.2无菌检测

无菌检测按《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》附录301页进行，结果：无菌生长。

2.3安全检测

用3周龄SPF鸡10只(购自济南赛斯家禽科技有限公司)，皮下、肌肉注射亚单位疫苗2羽份(0.4mL)，观察14天。鸡全部存活，剖检注射部位，无因疫苗注射引起的严重局部反应，，疫苗接种组鸡生长情况与对照组差异不显著。

2.4效力检测

用3日龄SPF鸡10只(购自济南赛斯家禽科技有限公司)，皮下、肌肉注射亚单位疫苗1羽份(0.2mL)，同时设立同类商品疫苗(鸡新城疫、传染性法氏囊病二联灭活疫苗(LaSota株+SD株)，购自青岛易邦生物工程有限公司)和空白对照各10只。3天、7天、14天、28天后，采集各组血清并测定血清(HI和AGP)抗体效价。结果见表1和表2：亚单位疫苗组的HI和AGP抗体效价在免疫后第3天即可产生，早于商品疫苗组，且后续维持期与商品疫苗组相当。

表1新城疫病毒血凝抑制(HI)抗体检测(单位：log₂)

表2传染性法氏囊病病毒琼脂扩散(AGP)抗体检测(单位：log₂)

(三)新城疫与传染性法氏囊病二联亚单位疫苗的应用

1.免疫方案

用3日龄SPF鸡20只(购自济南赛斯家禽科技有限公司)，皮下注射亚单位疫苗1羽份(0.2mL)，同时设立同类商品疫苗(鸡新城疫、传染性法氏囊病二联灭活疫苗(LaSota株+SD株)，购自青岛易邦生物工程有限公司)和空白对照各20只；免疫后14天后加强免疫一次。

2.攻毒保护试验

2.1对新城疫的免疫保护

末次免疫后21天，各组分别取10只鸡进行新城疫强毒株(毒株为Herts3/33，购自中国兽医药品监察所)攻毒，滴鼻途径感染0.1mL(含1×10⁶EID₅₀病毒)。攻毒后7天内观察鸡存活情况，在第7天采集鸡喉头和泄殖腔棉拭子，并将两者上清混合液接种9日龄SPF鸡胚(购自济南赛斯家禽科技有限公司)5枚，72小时后收集鸡胚尿囊液，测定其血凝HA效价。每份混合棉拭子样品接种的5枚鸡胚中只要有1枚鸡胚的尿囊液HA效价高于或等于4log₂，即可判定为病毒分离阳性；若所有5枚鸡胚的尿囊液HA效价低于4log₂，则判定为病毒分离阴性。

结果表明，除空白对照组攻毒后鸡全部死亡，本发明的亚单位疫苗组和商品疫苗组鸡全部存活。本发明的亚单位疫苗组10只鸡病毒分离均为阴性；商品疫苗组7只鸡病毒分离为阴性，3只鸡病毒分离为阳性。由此可见，本发明的亚单位疫苗在预防新城疫病毒强毒株感染中较商品疫苗具有更好的免疫保护效力。

2.2对传染性法氏囊病的免疫保护

末次免疫后21天，各组分别取10只鸡进行传染性法氏囊病病毒BC6-85株(购自中国兽医药品监察所)攻毒，口服途径感染0.2mL(含2×10⁶TCID₅₀病毒)。攻毒后7天内观察鸡存活情况，在第7天采集鸡法氏囊组织，观察其法氏囊组织是否有病变情况(病变主要包括法氏囊是否呈胶冻样水肿、是否呈紫葡萄样出血、是否呈奶油样坏死等)。

结果表明，空白对照组攻毒后有6只鸡死亡、4只存活；本发明的亚单位疫苗组和商品疫苗组鸡全部存活。本发明的亚单位疫苗组10只鸡的法氏囊组织未见明显病变；空白组4只存活鸡法氏囊组织可见明显病变(胶冻样水肿1个、紫葡萄样出血3个)；商品疫苗组5只鸡的法氏囊组织未见明显病变、另5只鸡法氏囊组织可见明显病变(胶冻样水肿2个、紫葡萄样出血2个、奶油样坏死1个)。由此可见，本发明的亚单位疫苗在预防传染性法氏囊病病毒感染中较商品疫苗具有更好的免疫保护效力。

本发明的亚单位疫苗是以新城疫病毒样颗粒和传染性法氏囊病病病毒样颗粒作为抗原，是通过重组杆状病毒(rBV-NDV-HN+F+M和rBV-IBDV-doubleVP2)感染昆虫细胞后，经提纯灭活处理制备而成。其中重组杆状病毒rBV-NDV-HN+F+M携带有用于编码新城疫病毒HN、F、M蛋白的串联核苷酸片段NDV-HN+F+M，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1；重组杆状病毒rBV-IBDV-doubleVP2携带有用于编码传染性法氏囊病病毒毒VP2蛋白的重复串联核苷酸片段IBDV-doubleVP2，其核苷酸序列为SEQ ID NO：2。本发明采用用于生产病毒样颗粒的易感昆虫细胞，感染周期短、产量高；采用硫酸铵梯度沉淀法优化了抗原纯化工艺，节约了生产成本，适用于大规模生产。试验表明，本发明的亚单位疫苗在预防新城疫病毒强毒株感染和在预防传染性法氏囊病病毒感染中较商品疫苗具有更好的免疫保护效力。

本发明研制的亚单位疫苗安全、高效、与流行株抗原性相匹配的新型疫苗免疫鸡群能够快速产生特异性抗体，可用于预防鸡新城疫病毒和传染性法氏囊病病毒的感染。

SEQ ID NO：1

SEQ ID NO：2

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序列表

<110> 江苏省农业科学院

<120> 一种新城疫与传染性法氏囊病二联亚单位疫苗

<141> 2023-07-03

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4575

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

atggactcat ctaggactat tggactctac ttcgactccg ccctcccctc gtcttcgctg 60

ttggcattcc cgattgtttt gcaggatacc ggtgacggca agaaacagat cactcctcaa 120

taccgcattc agcgtctgga tagctggacc gactctaagg aagattcagt cttcatcacc 180

acttacggct tcatcttcca aattggaaac gaggaagcca ctgttggcgt gattaacgat 240

aaccctcgcc acgagctgct ctccagcgct atgctctgct tgggtagcgt gcccaacgac 300

ggcgatctgg tcgaactcgc tcgcgcctgt ctgaccatgg tggtcactcg taagaaatct 360

gctacaaaca cggagaggat cgtcttctca gttgtgcaag cacccagagt gctccagagt 420

tgcatggtcg ttgccaaccg ctactcttca gtgaacgctg tcaagcatgt taaagcccca 480

gagaagatcc cgggatcggg caccctcgaa tacaaagtga acttcgtcag tttgactgtg 540

gtcccacgcc gtgacgtgta ccgcatcccg actgctgttc tgaaagtgag cggaagttcg 600

ctctacaacc tggctctcaa cgtcacaatt gacgtcgatg ttgaccctaa gtctcccttg 660

gtgaagtcac tgagtaaatc ggattccggt tactacgcaa acttgttcct gcacatcggc 720

ctgatggcta cagttgacaa gaaaggaaag aaagtgacgt tcgataagat cgaggaaaaa 780

attaggagac tcaacttgag tgtcggactc tcggacgttt tgggtccatc agtgctggtc 840

aaggcaaggg gtgcgagaac aaaattgctg gctccgttct tctccagctc tggcacggcc 900

tgttacccta tcgcaaacgc gtccccccaa gtcgcaaaga ttttgtggtc ccagaccgcg 960

cacctgcgta gcgttaaggt gatcattcaa gctggtacac agagggctgt cgctgttacg 1020

gctgaccatg aggtgacctc cacaaagatt gagaaaagac acgccatcgc taaatacaac 1080

cccttccgta aagagggcag aggaagtctg ctgacatgcg gtgacgtcga ggagaatcct 1140

ggcccaatgg gttcgaagcc atccacccgc atcccagctc cgctcatgtt gatcactcgt 1200

attatgctga tcctcggatg catccgcttg acctccagcc tggacggtcg tcctctggct 1260

gccgcaggca tcgtggtcac tggagataag gctgtcaacg tttacacctc ttcacagact 1320

ggctcaatca ttgtcaaact gctccctaac atgcccaagg acaaagaggc ctgtgcaagg 1380

gcgccattgg aagcctacaa cagaacactg accactttgc tgacgccgct cggtgactca 1440

attaggaaga tccagggatc cgtgagcacc tctggtggcc gccgtcaaaa aagattcatt 1500

ggagctgtta tcggtagtgt ggcactggga gtcgcgacag cggctcaaat cacggccgca 1560

gcggctctga ttcaggctaa ccaaaacgcc gcaaacattc tccgcatcaa ggaatccatc 1620

gcggctacaa acgaggccgt tcacgaagtg acggacggat tgagccagct gtctgtggca 1680

gtcggcaaga tgcagcaatt cgtcaacgac caattcaaca acacagctcg tgagctcgat 1740

tgcatcaaaa ttacgcagca agttggagtg gagttgaacc tgtacctcac agaactgaca 1800

acggtgttcg gtcctcagat cacctccccc gctctcacac agttgacgat ccaagcactg 1860

tacaacctcg cgggtggtaa catggactac ctcttgacca agctgggcat cggaaacaac 1920

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tgccgctgtg cggaccctcc cggaatcatt tcacagaact acggagaggc tgtgagtctc 2400

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tccatcagca ggtctagagt tacgagagtg tcaagttcgt ccaccaaagc cgcatacaca 4440

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<210> 2

<211> 2778

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

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aagaacctgg tcacagaata cggccgattt gacccagggg ccatgaacta cactaaattg 1200

atactgagtg agagggaccg tcttggcatc aagaccgtat ggccaacaag ggagtacact 1260

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gtgaggtcaa gcacactccc tggtggcgtt tatgcactaa atggcaccat aaacgccgtg 1800

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cttggcatca agaccgtatg gccaacaagg gagtacactg actttcgcga gtacttcatg 2700

gaggtggccg acctcaactc tcccctgaag attgcaggag catttggctt caaagacata 2760

atccgggccc taaggtga 2778

Claims

1.一种新城疫与传染性法氏囊病二联亚单位疫苗，其特征在于：

所述的疫苗包含有抗原和免疫佐剂，其中抗原为新城疫病毒样颗粒和传染性法氏囊病病毒样颗粒，免疫佐剂为矿物油；

所述的新城疫病毒样颗粒和传染性法氏囊病病毒样颗粒是通过两种重组杆状病毒分别感染昆虫细胞后，经提纯灭活处理制备而成,所述的两种重组杆状病毒分别携带有用于编码新城疫病毒HN、F、M蛋白的串联核苷酸片段SEQ ID NO：1和编码传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的重复串联核苷酸片段SEQ ID NO：2。

2.权利要求1所述的一种新城疫与传染性法氏囊病二联亚单位疫苗在制备药物方面的应用。

3.权利要求1所述的一种新城疫与传染性法氏囊病二联亚单位疫苗在制备预防鸡新城疫病毒和传染性法氏囊病病毒感染的药物方面的应用。