CN113151191B - 鸽源基因VI型新城疫病毒rVI-HZ株及其应用 - Google Patents

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Abstract

鸽源基因VI型新城疫病毒rVI‑HZ株及其应用，属于微生物技术领域。本发明的目的是提供一株具有优良生物学特性的鸽源基因VI型新城疫病毒rVI‑HZ株，用其制备鸽新城疫病毒灭活抗原，用于制备鸽新城疫灭活疫苗，具有与流行株抗原性相匹配的优势。本发明的鸽源基因VI型新城疫病毒rVI‑HZ株，于2020年12月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO：V202083。本发明的鸽源基因VI型新城疫病毒rVI‑HZ株在制备鸽新城疫病毒灭活抗原中的应用。本发明的鸽源基因VI型新城疫病毒rVI‑HZ株在制备鸽新城疫灭活疫苗中的应用。

Description

鸽源基因VI型新城疫病毒rVI-HZ株及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体公开了一种鸽源基因VI型新城疫病毒rVI-HZ株及其应用。
背景技术
新城疫(ND)是由新城疫病毒(NDV)强毒株感染引起的一种急性、高度接触性禽类烈性传染病，是《国家中长期动物疫病防治规划(2012-2020年)》中优先防制的一类动物疫病之一。
NDV为副黏病毒科副黏病毒属的禽副黏病毒I型，基因组为不分节段的单股负链RNA，基因组结构模式为3’-NP-P-M-F-HN-L-5’，依次编码六种结构蛋白：核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein，NP)、磷蛋白(Phosphor protein，P)、基质蛋白(Matrix protein，M)、融合蛋白(Fusionprotein，F)、血凝素-神经氨酸酶蛋白(Heamagglutinin-Neuraminidase protein，HN)和大分子蛋白(Large protein，L)。NDV仍只一个血清型，但根据F基因高变区的遗传进化分析可将所有毒株分为ClassⅠ和ClassⅡ大类，其中ClassⅠ又可分为3个基因型，ClassⅡ分为至少20个基因型。分子流行病学研究结果表明，目前在我国鸡、鸭、鹅群中流行的NDV以ClassⅡ中的基因VII型为主，鸽群中流行的NDV以ClassⅡ中的基因VI型为主(潘群兴，等。新城疫不同宿主源分离株的生物学特性[J].江苏农业学报,2011,27(6):1325-1329.)。不同地区、不同时间分离的NDV在抗原性、致病性和毒力存在着差异。
20世纪70年代末在中东地区首先发现鸽新城疫。该病于1981年在非洲流行后传至欧洲大陆及美国，随后在日本大流行。大约在1985年底，随进口鸽传入中国，1986年间，中国的福州、上海、北京各地多有此病发生。
目前，治疗鸽新城疫没有特效药，疫苗的免疫接种是防制本病最有效的手段。尽管鸽新城疫和鸡新城疫存在着很高的交叉反应，但在实际应用中用鸡新城疫疫苗免疫鸽子来防治鸽新城疫的效果常常不够确实有效。更多的研究表明，用与鸽新城疫同源病毒制备的灭活疫苗能够提供坚固而持久的免疫效果。
在没有鸽新城疫专用疫苗时，采用鸡新城疫疫苗预防鸽新城疫也有一定的保护效果。然而，研制安全、高效、与流行株抗原性相匹配的鸽新城疫灭活疫苗已成为当务之急，这对保障养鸽业的持续健康发展具有重要现实意义。
发明内容
本发明的目的是提供一株具有优良生物学特性的鸽源基因VI型新城疫病毒rVI-HZ株，用其制备鸽新城疫病毒抗原，用于制备鸽新城疫灭活疫苗，具有与流行株抗原性相匹配的优势。
本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：
本发明的鸽源基因VI型新城疫病毒rVI-HZ株，于2020年12月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO：V202083。
本发明的鸽源基因VI型新城疫病毒rVI-HZ株的全基因组核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。
本发明的鸽源基因VI型新城疫病毒rVI-HZ株在制备鸽新城疫病毒灭活抗原中的应用。
本发明的鸽源基因VI型新城疫病毒rVI-HZ株在制备鸽新城疫灭活疫苗中的应用。
本发明的有益效果是：
本发明从近年来新城疫发病鸽群中分离鸽源新城疫病毒，对获得的病毒分离株进行生物学特性分析，从中筛选到一株具有优良生物学特性的鸽源基因VI型新城疫病毒rVI-HZ株，于2020年12月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO：V202083。该鸽源基因VI型新城疫病毒rVI-HZ株为当前流行的基因VI型鸽新城疫病毒强毒株，在鸡胚上连续传代仍具有良好的稳定性和优良的复制能力，病毒滴度高达108.3EID50/0.1mL。将其灭活处理后与矿物油佐剂乳化，制备的鸽新城疫灭活疫苗免疫鸽群能够快速产生特异性抗体，并使鸽群获得完全的免疫保护，可用于预防鸽群新城疫病毒强毒株的感染，具有良好的应用前景。
具体实施方式
本发明的鸽源基因VI型新城疫病毒rVI-HZ株，已于2020年12月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内(武汉大学保藏中心)，保藏编号为：CCTCC NO：V202083。
本发明的鸽源基因VI型新城疫病毒rVI-HZ株的全基因组核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。
利用本发明的鸽源基因VI型新城疫病毒rVI-HZ株制备鸽新城疫病毒灭活抗原；利用该鸽新城疫病毒灭活抗原制备鸽新城疫灭活疫苗，该鸽新城疫灭活疫苗可用于预防鸽新城疫病毒感染。
本发明的鸽源基因VI型新城疫病毒rVI-HZ株基于长期的新城疫流行病学监测与病毒分离，从若干分离病毒株中筛选获得，为当前引起鸽群新城疫免疫预防失败的流行病毒株。
本发明的鸽源基因VI型新城疫病毒rVI-HZ株具有生产新特异性鸽新城疫病毒灭活抗原及其高效鸽新城疫灭活疫苗的巨大应用价值。
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1新城疫病毒流行株的分离鉴定
1、病料处理与接种SPF鸡胚
13份新城疫疑似病料J3(2012)、J4(2013)、Z8(2013)、A9(2014)、S11(2014)、A14(2015)、Z19(2015)、A21(2016)、J29(2017)、J40(2017)、Z42(2018)、Z45(2018)和J57(2020)，来源系近八年来(2012-2020年)在江苏(J)、浙江(Z)、安徽(A)和山东(S)等境内的养禽场，出现非典型性新城疫，包括气管出血、神经症状、腹泻拉稀、产蛋下降等。
将上述病料分别磨碎制成匀浆，加入4倍量灭菌PBS(含青霉素和链霉素各1000μg/ml)制成悬液，3000r/min离心20min，取上清液接种9日龄SPF鸡胚(购自南京天邦生物科技有限公司)的绒毛尿囊膜上，弃去24小时内的死胚，每日检查多次，及时取出死亡胚，置于4℃保存，至72小时后全部取出接毒胚，8000r/min离心30min，取上清作为P1代病毒液，测定其血凝HA效价。
2、病毒的分离与鉴定
将阳性(HA效价大于4log2)P1代病毒液在SPF鸡胚上连续传5代，将收集的第5代上清液进行3轮空斑纯化，将纯化的病毒继续在SPF鸡胚上连续传代，直至接毒胚出现比较整齐的规律死亡，连续传20代，按Reed-Muench法计算各病毒EID50值。采用PCR法和核酸测序技术对病毒序列进行扩增与鉴定。13株NDV表现出不同的分离毒株在不同的细胞中具有不同的细胞培养特性，在SPF鸡胚中连续传20代后，13株病毒的HA效价在6-12log2，病毒滴度在106.6-108.9EID50/0.1mL，其中编号为Z42(2018)具有较高的HA效价(10log2)和较强的复制能力(108.3EID50/0.1mL)(表1)，经序列测序该毒株属于鸽源基因VI型，其病毒全基因组序列见序列表中的序列1(毒株核苷酸序列，全长15192nt)，将该病毒命名为鸽源基因VI型新城疫病毒rVI-HZ株，已于2020年12月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内(武汉大学保藏中心)，保藏编号为：CCTCC NO：V202083。
表1各NDV分离株的培养特性统计
Figure GDA0003985871210000041
Figure GDA0003985871210000051
实施例2鸽源基因VI型新城疫病毒(rVI-HZ株)灭活抗原的制备
将鸽源基因VI型新城疫病毒rVI-HZ株接种9日龄SPF鸡胚(购自南京天邦生物科技有限公司)，48h后收集尿囊液，8000r/min离心30min，取上清，采用PEG沉淀和不连续蔗糖密度梯度方法进行纯化，采用BCA蛋白定量检测试剂盒(赛默飞世尔科技公司产品)确定病毒浓度，-70℃保存备用。加入灭活剂BEI(BEI购自Sigma公司，全名为二乙烯亚胺，其原理是破坏病毒核酸而不破坏蛋白质，并保持病毒抗原性，相比于传统甲醛灭活方式更有优势)，使其终浓度为0.5％，作用24小时后，取液进行灭活检验(将液接种细胞观察96小时后细胞是否出现病变，重复三次，均无出现细胞病变后确定灭活成功)，-70℃保存备用。
实施例3鸽新城疫灭活疫苗(rVI-HZ株)的制备与应用
1、鸽新城疫灭活疫苗的制备
将实施例2所制备的鸽源基因VI型新城疫病毒(rVI-HZ株)灭活抗原与矿物油佐剂等比例乳化。油相制备：按照注射用矿物油(也叫白油)(见《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》附录343页)、司本-80、硬脂酸铝的体积比为94:4:2的比例配制油相。注射用矿物油、司本-80和硬脂酸铝均购自南京天邦生物科技有限公司。取硬脂酸铝，用少量注射用矿物油混合，加热融化至半透明状，再与全量司本-80及剩余注射用矿物油混合均匀，经121℃灭菌15分钟，冷却至室温备用。水相制备：用生理盐水将制备的鸽源基因VI型新城疫病毒(rVI-HZ株)灭活抗原进行稀释，使抗原稀释液的血凝效价达到9log2，取制备的抗原稀释液，加入吐温-80进行乳化(抗原稀释液与吐温-80的体积比为9:1)。将水相和油相按照1:1(体积比v/v)比例进行乳化，1000r/min乳化10分钟，将最终获得的鸽新城疫灭活疫苗(rVI-HZ株)进行下一步成品检测。
2、鸽新城疫灭活疫苗(rVI-HZ株)的效力试验
用18日龄乳鸽30只(购自梅州市金绿现代农业发展有限公司)，皮下、肌肉注射实施例3制备的鸽新城疫灭活疫苗(rVI-HZ株)1羽份(0.2mL)，同时设立同类商品疫苗(鸡新城疫病毒活疫苗(LaSota株)，购自青岛易邦生物工程有限公司)和空白对照各30只。分别在免疫后第3天、7天、14天、28天采集各组血清并测定血清(HI)抗体效价。结果见表2：新城疫灭活疫苗(rVI-HZ株)的HI抗体效价在免疫后第3天即可产生，早于商品疫苗组，且后续维持期与商品疫苗组相当。
表2新城疫病毒血凝抑制(HI)抗体检测(单位：log2)
分组 3天 7天 14天 28天
空白对照组 0 0 0 0
商品疫苗组 0 3 9 8
鸽新城疫灭活疫苗(rVI-HZ株)组 2 7 9 8
3、新城疫灭活疫苗(rVI-HZ株)的攻毒保护试验
用18日龄SPF鸡乳鸽30只(购自梅州市金绿现代农业发展有限公司)，皮下注射新城疫灭活疫苗(rVI-HZ株)1羽份(0.2mL)，同时设立同类商品疫苗组(鸡新城疫病毒活疫苗(LaSota株)，购自青岛易邦生物工程有限公司)和空白对照各30只；免疫后14天后加强免疫一次。
末次免疫后21天，各组分别取10只鸽进行鸡新城疫强毒株(毒株为F48E9，购自中国兽医药品监察所)攻毒和鸽新城疫毒株(毒株为rVI-HZ株，由本发明实施例1分离并保存)，滴鼻途径感染0.1mL(含1×106EID50病毒)。攻毒后14天内观察鸽存活情况。
结果表明，用鸡新城疫强毒株(F48E9)攻毒时，空白对照组攻毒后鸽全部死亡，本发明的鸽新城疫灭活疫苗(rVI-HZ株)组存活率为70％(7/10)，和商品疫苗组鸽存活率为90％(9/10)。用鸽新城疫强毒株(rVI-HZ株)攻毒时，空白对照组攻毒后鸽全部死亡，本发明的鸽新城疫灭活疫苗(rVI-HZ株)组鸽存活率为100％(10/10)，和商品疫苗组鸽存活率为60％(6/10)。由此可见，本发明的鸽新城疫灭活疫苗(rVI-HZ株)在预防鸽新城疫病毒强毒株感染中具有完全的免疫保护效力。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Figure IDA0003985871250000011
Figure IDA0003985871250000021
Figure IDA0003985871250000031
Figure IDA0003985871250000041
Figure IDA0003985871250000051
Figure IDA0003985871250000061
Figure IDA0003985871250000071

Claims (4)

1.鸽源基因VI型新城疫病毒rVI-HZ株，其特征在于，该鸽源基因VI型新城疫病毒rVI-HZ株于2020年12月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO：V202083。
2.如权利要求1所述的鸽源基因VI型新城疫病毒rVI-HZ株，其特征在于，该鸽源基因VI型新城疫病毒rVI-HZ株的全基因组核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
3.如权利要求1所述的鸽源基因VI型新城疫病毒rVI-HZ株在制备鸽新城疫病毒灭活抗原中的应用。
4.如权利要求1所述的鸽源基因VI型新城疫病毒rVI-HZ株在制备鸽新城疫灭活疫苗中的应用。
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