CN112831476B - 新城疫病毒vii-nj株及其应用 - Google Patents
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Abstract
新城疫病毒VII‑NJ株及其应用，属于微生物技术领域。本发明的目的是提供一株具有优良生物学特性的新城疫病毒VII‑NJ株，用其制备新城疫病毒抗原，用于制备新城疫疫苗，具有与流行株抗原性相匹配的优势，同时所制备的新城疫卵黄抗体，具有高效价、高中和活性的特点。本发明的新城疫病毒VII‑NJ株，于2019年7月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCCNO：V201945。本发明的新城疫病毒VII‑NJ株在制备新城疫病毒灭活抗原中的应用。本发明的新城疫病毒VII‑NJ株在制备新城疫灭活疫苗中的应用。本发明的新城疫病毒VII‑NJ株在制备新城疫卵黄抗体中的应用。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体公开了一种新城疫病毒VII-NJ株及其应用。
背景技术
新城疫(ND)是由新城疫病毒(NDV)强毒株感染引起的一种急性、高度接触性禽类烈性传染病，是《国家中长期动物疫病防治规划(2012-2020年)》中优先防制的一类动物疫病之一。
目前，在生产实践中典型性的新城疫已得到较好控制，但局部地区病毒污染比较严重，疫情呈持续性地方流行。近年来，虽然ND疫苗的广泛使用，使疫病的爆发流行明显减少；但该病呈现出新的流行特点，如出现了非典型性症状、免疫带毒、免疫失败、区域流行以及混合感染等流行新特点，使新城疫防控复杂化，直接及间接造成的经济损失巨大，防控面临着新挑战，寻求防控ND已成为亟待解决的重大科学与生产实际问题。
NDV为副黏病毒科副黏病毒属的禽副黏病毒I型，基因组为不分节段的单股负链RNA，基因组结构模式为3’-NP-P-M-F-HN-L-5’，依次编码六种结构蛋白：核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein，NP)、磷蛋白(Phosphor protein，P)、基质蛋白(Matrix protein，M)、融合蛋白(Fusion protein，F)、血凝素-神经氨酸酶蛋白(Heamagglutinin-Neuraminidase protein，HN)和大分子蛋白(Large protein，L)。NDV仍只一个血清型，但根据F基因高变区的遗传进化分析可将所有毒株分为ClassⅠ和ClassⅡ大类，其中ClassⅠ又可分为3个基因型，ClassⅡ分为至少20个基因型。分子流行病学研究结果表明，我国目前流行的NDV以ClassⅡ中的基因VII型(鸡、鸭、鹅群)为主(潘群兴，等。新城疫不同宿主源分离株的生物学特性[J].江苏农业学报,2011,27(6):1325-1329.)。不同地区、不同时间分离的NDV在抗原性、致病性和毒力存在着差异。
目前，我国仍采用疫苗接种为主的防控策略。商品化活疫苗在禽群中频繁使用，导致局部地区病毒污染严重，不利于疫病的净化。与此同时，在现实情况下，禽群一旦发生新城疫，再补接种疫苗为时已晚，造成的损失巨大。临床上，通常采用以新城疫卵黄抗体为主的治疗性药物对发病禽群进行紧急干预治疗，将经济损失控制在最小程度。因此，研制安全、高效、与流行株抗原性相匹配的灭活疫苗以及高效价卵黄抗体已成为当务之急，这对保障养禽业的持续健康发展具有重要现实意义。
发明内容
本发明的目的是提供一株具有优良生物学特性的新城疫病毒VII-NJ株，用其制备新城疫病毒抗原，用于制备新城疫疫苗，具有与流行株抗原性相匹配的优势，同时所制备的新城疫卵黄抗体，具有高效价、高中和活性的特点。
本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：
本发明的新城疫病毒VII-NJ株，于2019年7月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO：V201945。
本发明的新城疫病毒VII-NJ株在制备新城疫病毒灭活抗原中的应用。
本发明的新城疫病毒VII-NJ株在制备新城疫灭活疫苗中的应用。
本发明的新城疫病毒VII-NJ株在制备新城疫卵黄抗体中的应用。
本发明的有益效果是：
本发明从近年来新城疫发病禽群中分离新城疫病毒，对获得的病毒分离株进行生物学特性分析，从中筛选到一株具有优良生物学特性的新城疫病毒VII-NJ株，于2019年7月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO：V201945。该新城疫病毒VII-NJ株为当前流行的基因VII型新城疫病毒强毒株，在鸡胚上连续传代仍具有良好的稳定性和优良的复制能力，病毒滴度高达108.9EID50/0.1mL。将其灭活处理后与矿物油佐剂乳化，制备的新城疫灭活疫苗免疫禽群能够快速产生特异性抗体，并使禽群获得免疫保护，可用于预防禽群新城疫病毒强毒株的感染；用新城疫灭活疫苗免疫蛋鸡后，制备的新城疫卵黄抗体的血凝抑制效价高达14log2，具有良好的应用前景。
具体实施方式
本发明的新城疫病毒VII-NJ株，已于2019年7月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内(武汉大学保藏中心)，保藏编号为：CCTCC NO：V201945。
利用本发明的新城疫病毒VII-NJ株制备新城疫病毒灭活抗原；利用该新城疫病毒灭活抗原制备新城疫灭活疫苗和新城疫卵黄抗体，该新城疫灭活疫苗可用于预防禽新城疫病毒感染，该新城疫卵黄抗体可用于治疗禽新城疫病毒感染。
本发明的新城疫病毒VII-NJ株基于长期的新城疫流行病学监测与病毒分离，从若干分离病毒株中筛选获得，为当前引起新城疫免疫预防失败的流行病毒株。
本发明的新城疫病毒VII-NJ株具有生产新特异性新城疫病毒灭活抗原、抗体及其高效新城疫灭活疫苗与卵黄抗体的巨大应用价值。
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1新城疫病毒流行株的分离鉴定
1、病料处理与接种SPF鸡胚
13份新城疫疑似病料J3(2012)、J4(2013)、Z8(2013)、A9(2014)、S11(2014)、A14(2015)、Z19(2015)、A21(2016)、J29(2017)、J40(2017)、Z42(2018)、Z45(2018)和J57(2020)，来源系近八年来(2012-2020年)在江苏(J)、浙江(Z)、安徽(A)和山东(S)等境内的养禽场，出现非典型性新城疫，包括气管出血、神经症状、腹泻拉稀、产蛋下降等。
将上述病料分别磨碎制成匀浆，加入4倍量灭菌PBS(含青霉素和链霉素各1000μg/ml)制成悬液，3000r/min离心20min，取上清液接种9日龄SPF鸡胚(购自南京天邦生物科技有限公司)的绒毛尿囊膜上，弃去24小时内的死胚，每日检查多次，及时取出死亡胚，置于4℃保存，至72小时后全部取出接毒胚，8000r/min离心30min，取上清作为P1代病毒液，测定其血凝HA效价。
2、病毒的分离与鉴定
将阳性(HA效价大于4log2)P1代病毒液在SPF鸡胚上连续传5代，将收集的第5代上清液进行3轮空斑纯化，将纯化的病毒继续在SPF鸡胚上连续传代，直至接毒胚出现比较整齐的规律死亡，连续传20代，按Reed-Muench法计算各病毒EID50值。采用PCR法和核酸测序技术对病毒序列进行扩增与鉴定。13株NDV表现出不同的分离毒株在不同的细胞中具有不同的细胞培养特性，在SPF鸡胚中连续传20代后，13株病毒的HA效价在6-12log2，病毒滴度在106.6-108.9EID50/0.1mL，其中编号为J4(2013)具有超高的HA效价(12log2)和超强的复制能力(108.9EID50/0.1mL)(表1)，经序列测序该毒株属于基因VII型，将该病毒命名为新城疫病毒VII-NJ株，已于2019年7月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内(武汉大学保藏中心)，保藏编号为：CCTCC NO：V201945。
表1 各NDV分离株的培养特性统计
| 编号 | HA效价(log<sub>2</sub>) | EID<sub>50</sub>/0.1mL | 基因型 |
| J3(2012) | 8 | 10<sup>7.0</sup> | II |
| J4(2013) | 12 | 10<sup>8.9</sup> | VII |
| Z8(2013) | 6 | 10<sup>6.6</sup> | VII |
| A9(2014) | 12 | 10<sup>8.6</sup> | VII |
| S11(2014) | 8 | 10<sup>8.0</sup> | II |
| A14(2015) | 7 | 10<sup>7.3</sup> | VI |
| Z19(2015) | 10 | 10<sup>7.6</sup> | VII |
| A21(2016) | 11 | 10<sup>8.3</sup> | VII |
| J29(2017) | 7 | 10<sup>7.3</sup> | VII |
| J40(2017) | 9 | 10<sup>7.6</sup> | II |
| Z42(2018) | 10 | 10<sup>8.3</sup> | VI |
| Z45(2018) | 8 | 10<sup>7.0</sup> | VI |
| J57(2020) | 10 | 10<sup>7.6</sup> | II |
实施例2新城疫病毒(VII-NJ株)灭活抗原的制备
将新城疫病毒VII-NJ株接种9日龄SPF鸡胚(购自南京天邦生物科技有限公司)，48h后收集尿囊液，8000r/min离心30min，取上清，采用PEG沉淀和不连续蔗糖密度梯度方法进行纯化，采用BCA蛋白定量检测试剂盒(赛默飞世尔科技公司产品)确定病毒浓度，-70℃保存备用。加入灭活剂BEI(BEI购自Sigma公司，全名为二乙烯亚胺，其原理是破坏病毒核酸而不破坏蛋白质，并保持病毒抗原性，相比于传统甲醛灭活方式更有优势)，使其终浓度为0.5％，作用24小时后，取液进行灭活检验(将液接种细胞观察96小时后细胞是否出现病变，重复三次，均无出现细胞病变后确定灭活成功)，-70℃保存备用。
实施例3新城疫灭活疫苗(VII-NJ株)的制备与应用
1、新城疫灭活疫苗的制备
将实施例2所制备的新城疫病毒(VII-NJ株)灭活抗原与矿物油佐剂等比例乳化。油相制备：按照注射用矿物油(也叫白油)(见《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》附录343页)、司本-80、硬脂酸铝的体积比为94:4:2的比例配制油相。注射用矿物油、司本-80和硬脂酸铝均购自南京天邦生物科技有限公司)。取硬脂酸铝，用少量注射用矿物油混合，加热融化至半透明状，再与全量司本-80及剩余注射用矿物油混合均匀，经121℃灭菌15分钟，冷却至室温备用。水相制备：用生理盐水将制备的新城疫病毒(VII-NJ株)灭活抗原进行稀释，使抗原稀释液的血凝效价达到10log2，取制备的抗原稀释液加入吐温-80中进行乳化(抗原稀释液与吐温-80的体积比为9:1)。将水相和油相按照1:1(体积比v/v)比例进行乳化，1000r/min乳化10分钟，将最终获得的新城疫灭活疫苗(VII-NJ株)进行下一步成品检测。
2、新城疫灭活疫苗(VII-NJ株)的效力试验
用3日龄SPF鸡10只(购自济南赛斯家禽科技有限公司)，皮下、肌肉注射实施例3制备的新城疫灭活疫苗(VII-NJ株)1羽份(0.2mL)，同时设立同类商品疫苗(重组新城疫病毒灭活疫苗(A-VII株)，购自青岛易邦生物工程有限公司)和空白对照各10只。分别在3天、7天、14天、28天采集各组血清并测定血清(HI)抗体效价。结果见表2：新城疫灭活疫苗(VII-NJ株)的HI抗体效价在免疫后第3天即可产生，早于商品疫苗组，且后续维持期与商品疫苗组相当。
表2新城疫病毒血凝抑制(HI)抗体检测(单位：log2)
| 分组 | 3天 | 7天 | 14天 | 28天 |
| 空白对照组 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 商品疫苗组 | 1 | 4 | 9 | 8 |
| 新城疫灭活疫苗(VII-NJ株)组 | 4 | 8 | 9 | 9 |
3、新城疫灭活疫苗(VII-NJ株)的攻毒保护试验
用3日龄SPF鸡20只(购自济南赛斯家禽科技有限公司)，皮下注射新城疫灭活疫苗(VII-NJ株)1羽份(0.2mL)，同时设立同类商品疫苗组(重组新城疫病毒灭活疫苗(A-VII株)，购自青岛易邦生物工程有限公司)和空白对照各20只；免疫后14天后加强免疫一次。
末次免疫后21天，各组分别取10只鸡进行新城疫强毒株(毒株为F48E9，购自中国兽医药品监察所)攻毒，滴鼻途径感染0.1mL(含1×106EID50病毒)。攻毒后7天内观察鸡存活情况，在第7天采集鸡喉头和泄殖腔棉拭子，并将两者上清混合液接种9日龄SPF鸡胚(购自济南赛斯家禽科技有限公司)5枚，72小时后收集鸡胚尿囊液，测定其血凝HA效价。每份混合棉拭子样品接种的5枚鸡胚中只要有1枚鸡胚的尿囊液HA效价高于或等于4log2，即可判定为病毒分离阳性；若所有5枚鸡胚的尿囊液HA效价均低于4log2，则判定为病毒分离阴性。
结果表明，除空白对照组攻毒后鸡全部死亡，本发明的新城疫灭活疫苗(VII-NJ株)和商品疫苗组鸡全部存活。本发明的新城疫灭活疫苗(VII-NJ株)10只鸡病毒分离均为阴性；商品疫苗组7只鸡病毒分离为阴性，3只鸡病毒分离为阳性。由此可见，本发明的新城疫灭活疫苗(VII-NJ株)在预防新城疫病毒强毒株感染中具有较好的免疫保护效力。
实施例4新城疫卵黄抗体的制备与应用
1、动物免疫
将新城疫灭活疫苗(VII-NJ株)(由本发明实施例2制备)皮下注射90日龄海澜白蛋鸡(购自济南赛斯家禽科技有限公司)1羽份(0.2mL)，于免疫后第14天加强免疫一次，待蛋鸡开产后，收集鸡蛋。
2、新城疫卵黄抗体的制备
采用聚乙二醇(PEG)法纯化新城疫卵黄抗体，按照1∶2的体积比在1份体积的卵黄液中加入2份体积的PBS缓冲液(pH 7.5)，剧烈振荡30s，再加入3.5％(W/V)的聚乙二醇(PEG-6000)充分搅拌溶解，室温下作用20min。4℃下12000r/min离心30min，2层滤纸过滤，在滤液中加入8.5％(W/V)的聚乙二醇(PEG-6000)，充分搅拌溶解，室温下作用20min。4℃下12000r/min离心30min，弃去上清液，在沉淀物中加PBS(pH 7.4)溶液溶解，加12％(W/V)的聚乙二醇(PEG-6000)，室温下作用10min。4℃下12000r/min离心30min，去上清，沉淀称重，在沉淀物中加入PBS(pH 7.4)溶液溶解(每10mL卵黄原液用1mLPBS溶液溶解)，-20℃保存。
采用血凝抑制试验(参照中华人民共和国国家标准《GB/T16550-2008新城疫诊断技术》，发布日：2008-12-31，实施日：2009-05-01，发布机构：中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局、中国国家标准化管理委员会)对新城疫卵黄抗体的血凝抑制效价测定。结果显示，新城疫卵黄抗体的血凝抑制效价高达14log2。
3、新城疫卵黄抗体的临床治疗试验
用50日龄SPF鸡20只(购自济南赛斯家禽科技有限公司)，各组分别取10只鸡进行新城疫病毒分离株(毒株为VII-NJ株，由本发明实施例1分离制备)攻毒，滴鼻途径感染0.1mL(含1×105EID50病毒)。治疗组于第一天口服新城疫卵黄抗体0.5ml/只，连续灌服3天；对照组不作处理。14天后观察结果显示，治疗组有2只鸡死亡，8只存活；对照组鸡全部死亡。这表明，新城疫卵黄抗体在治疗禽新城疫病毒感染中发挥了重要作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (4)
1.新城疫病毒VII-NJ株，其特征在于，该VII-NJ株于2019年7月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO：V201945。
2.如权利要求1所述的新城疫病毒VII-NJ株在制备新城疫病毒灭活抗原中的应用。
3.如权利要求1所述的新城疫病毒VII-NJ株在制备新城疫灭活疫苗中的应用。
4.如权利要求1所述的新城疫病毒VII-NJ株在制备新城疫卵黄抗体中的应用。
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