CN114652828B - 一种含新型鹅细小病毒和鸭圆环病毒抗原抗体复合物的生物制品 - Google Patents

一种含新型鹅细小病毒和鸭圆环病毒抗原抗体复合物的生物制品 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种含新型鹅细小病毒和鸭圆环病毒抗原抗体复合物的生物制品。该生物制品首先将新型鹅细小病毒卵黄抗体与其活苗制备抗原抗体复合物；将鸭圆环病毒卵黄抗体与鸭圆环病毒Cap蛋白制备抗原抗体复合物；然后再将两种抗原抗体复合物混合，并添加保护剂最终形成一种生物制品。该生物制品可以同时抵抗新型鹅细小病毒和鸭圆环病毒对机体的入侵，对于由这两种病毒引起的鸭短喙侏儒综合征和鸭脱羽综合征起到良好的预防和保护作用。

Description

一种含新型鹅细小病毒和鸭圆环病毒抗原抗体复合物的生物 制品
技术领域
本发明属于兽用生物制品领域，具体是涉及一种含新型鹅细小病毒和鸭圆环病毒抗原抗体复合物的生物制品。
背景技术
“脱羽综合征”(Feathers Shedding Syndrome,FSS)的主要症状为全身羽毛部分或全部脱落，屠宰后羽根难以拔除(毛刺鸭)，精神萎靡不振，症状较轻一点的病鸭羽毛脱落不明显但是躯体较小，体重较轻，解剖后主要症状为胸腺肿大出血，部分脑部出血，心肝脾肿大有出血点，肠道水肿等，该病没有明显的发病日龄，病程较长，并且有的伴随着生长迟缓，上下喙萎缩变短，舌头外露等为症状的“短喙-侏儒综合征”(Short beak and dwarfismsyndrome,SBDS)的疾病。研究证实，这两种疾病的发生与鸭圆环病毒(Duck circovirus,DuCV)和新型鹅细小病毒(Novel gooseparvovirus-related virus,NGPV)的混合感染有关。鸭圆环病毒和新型鹅细小病毒都能够对免疫系统造成损害，而且由于这两种病毒都能通过鸭胚垂直传播，对于鸭群的危害也在逐步上升，即使康复后的病鸭也会成为残次鸭，极大的影响了肉鸭的生产性能及肉胚品质，给养殖户造成巨大的经济损失。
鸭圆环病毒(DuCV)属于圆环病毒科圆环病毒属，大小与其他圆环病毒相似，是一种无囊膜、二十面体对称、直径大小为15-16nm的单股环形DNA结构，也是目前所知的最小的鸭源性病毒。DuCV基因组较小，几乎无法在体外培养，而且在鸭子体内的复制率也很低，传统的传代培养方式，并不能很好的进行增殖，这给鸭圆环病毒的商品化疫苗的生产带来了不小的挑战，对于众多研究鸭圆环病毒的学者来说都是一个亟待解决的问题。
新型鹅细小病毒(NGPV)又名小鹅瘟病毒，研究发现NGPV的分离纯化只能在樱桃谷鸭胚中，不能在鸡胚及番鸭胚中增殖病毒，该病毒经过测试，可以在原代鸭胚成纤维细胞上生长增殖，但是增殖效率并不高，接种后也没有发现明显的细胞病变情况。而在其他细胞系上进行验证发现，鸡胚成纤维细胞、猫肾细胞、非洲绿猴肾细胞(vero)以及Hela细胞上均不能增殖培养，极大的限制了小鹅瘟病毒的抗体和疫苗的生产。
目前治疗和预防新型鹅细小病毒和鸭圆环病毒共感染的生物制品还不多见，鸭圆环病毒或新型鹅细小病毒感染的药品主要包括中药制剂、弱毒活疫苗及卵黄抗体等抗病毒感染生物制剂。其中，中药制剂药效慢、用量大、质量不易稳定，使用起来不方便；卵黄抗体对于混合感染和继发感染的治疗作用较弱，且随着发病鸭日龄增大，卵黄抗体在小日龄注射后很难保护肉鸭生长全程，反复注射会增加饲养成本；单纯的活疫苗存在着毒力返强的可能，有潜在的传染性和致病性，且疫苗存在与母源抗体相互作用的问题，接种时间及方式等都可能影响最终的免疫效果。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种含新型鹅细小病毒和鸭圆环病毒抗原抗体复合物的生物制品。
本发明的目的还在于提供了一种作用于新型鹅细小病毒和鸭圆环病毒共感染的生物制品。
为实现以上技术目的，本发明采用如下技术方案：
一种含新型鹅细小病毒和鸭圆环病毒抗原抗体复合物的生物制品，所述生物制品包含鸭圆环病毒抗原抗体复合物和新型鹅细小病毒抗原抗体复合物，所述鸭圆环病毒抗原抗体复合物包括鸭圆环病毒Cap蛋白和鸭圆环病毒高免卵黄抗体，所述新型鹅细小病毒抗原抗体复合物包括新型鹅细小病毒高免卵黄抗体和新型鹅细小病毒活疫苗。
所述新型鹅细小病毒高免卵黄抗体和新型鹅细小病毒活疫苗均采用新型鹅细小病毒毒株RPVA2203株制备而成，该毒株的保藏编号为CCTCC NO：V202209。
所述新型鹅细小病毒毒株需要在75-85℃条件下预处理25-35分钟。
所述新型鹅细小病毒毒株采用鸭胚、鹅胚交替传代的方式进行弱化。
所述鸭圆环病毒Cap蛋白抗原浓度为180μg/ml。
所述鸭圆环病毒高免卵黄抗体EILSA效价范围为1：128。
所述新型鹅细小病毒高免卵黄抗体效价范围为1：64。
所述新型鹅细小病毒活疫苗的鸭胚半数致死量为104.5ELD50。
一种含新型鹅细小病毒和鸭圆环病毒抗原抗体复合物的生物制品在脱羽综合征和短喙- 侏儒综合征中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下优势：
本发明提供的生物制品具有安全性好，免疫效果佳，免疫作用产生快，保护率高等优势。与传统卵黄抗体相比，可以持续保护肉鸭整个生长周期，免去为预防进行多次注射，节省大量防治成本。与单纯使用鸭圆环病毒Cap蛋白作为抗原相比，可以减少鸭圆环病毒本身对鸭免疫系统的抑制作用。由于新型鹅细小病毒和鸭圆环病毒混合感染，会导致脱羽综合征和短喙-侏儒综合征，情况更为严重，两种抗原抗体复合物的复配方式，可以更有效的保护肉鸭，显著提高保护效力。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为新型鹅细小病毒血清琼扩抗体水平比较图；
图2为鸭圆环病毒血清ELISA抗体水平比较图；
具体实施方式
以下具体说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。本领域的技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围的前提下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围。
以下实施例中使用的试剂，生物原料均来自商业化产品。
实施例1：新型鹅细小病毒活疫苗及灭活疫苗的制备
1.本发明的病料采自安徽省樱桃谷鸭场内发生鸭短喙侏儒综合征及鸭脱羽综合征病的樱桃谷肉鸭内脏，及鸭羽毛毛囊。利用GenBank中经典小鹅瘟病毒(SYG61v株)基因序列 (GenBank序列号：KC996729)，使用Primer5.0软件设计上下游引物(F： 5‘-GTAAGGGGTCTGTTAGTATTG-3’；R：5‘-GCTGTTGGTCGTAGTAGGC-3’)。病料经研磨，提取上清等处理后，采用上述引物进行PCR扩增、测序后，证实为新型鹅细小病毒。
2.对病毒进行多种水禽病毒PCR鉴定(包括鸭圆环病毒、鸭瘟、禽腺病毒、禽流感病毒、鸭坦布苏病毒、鸭呼肠孤病毒)，共有5株毒纯净，除鹅细小病毒外，其余病毒PCR检测均为阴性。
3.对5株病毒进行鸭胚鹅胚交替传代，每次接种时将相关毒株经75-85℃处理25-35分钟后在进行尿囊腔接种。先在鸭胚上传2代后，于鹅胚上传2代，如此交替传代8次(即共传32代)后进行毒株对比，PCR确定纯净性后进行毒力返强试验和免疫原性试验进行进一步筛选，最终筛选出最优的毒株RPVA2203株(已于2022年2月24日，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉，毒种保藏号为CCTCC NO：V202209，该保藏中心于2022年3月3日检测完毕，结果为存活)。具体如下：
(1)毒力返强试验：将5株病毒进行雏鸭攻毒实验。取1日龄易感雏鸭70只，随机分成7组，10只/组。第1～5组雏鸭分别肌肉注射毒株1～毒株5(毒株4为RPVA2203株)；第6组为健康对照组，肌肉注射生理盐水；第7组为攻毒对照组，肌肉注射鸭大舌病强毒。攻毒前称重，观察35天。在1、7、14、21、28、35天分别采集各组肛拭子；并在试验结束时称重并剖检，主要观察是否出现大舌症状。如表1、表2所示，毒株3和毒株4未出现排毒及大舌症状，体增重与健康对照无统计学差异。筛选出毒株3和毒株4继续进行免疫原性试验。
表1排毒情况
组号 组别 1天 7天 14天 21 28 35
第1组 毒株1 - - - + + -
第2组 毒株2 - - - + + -
第3组 毒株3 - - - - - -
第4组 毒株4# - - - - - -
第5组 毒株5 - - - + + -
第6组 健康对照 - - - - - -
第7组 攻毒对照 - + + + + +
注：“#”为RPVA2203株。“-”为PCR检测肛拭子阴性，表示未排毒，“+”为PCR检测肛拭子阳性，表示排毒。
表2体重及剖检情况
组号 组别 体增重 剖检情况
第1组 毒株1 1628.33±58.30* 3/10出现大舌症状
第2组 毒株2 1589.17±52.81* 4/10出现大舌症状
第3组 毒株3 1982.17±55.71* 均无大舌症状
第4组 毒株4# 1999.50±24.98 均无大舌症状
第5组 毒株5 1743.17±62.46* 3/10出现大舌症状
第6组 健康对照 2037.67±28.37 均无大舌症状
第7组 攻毒对照 1468.67±50.82* 8/10出现大舌症状
注：“#”为RPVA2203株。“*”为与健康对照进行统计学分析，P≤0.05，特异。
(2)免疫原性试验：对毒株3和毒株4进行免疫原性试验。将毒株3和毒株4加入佐剂冻干后制备成活疫苗。接种1日龄易感雏鸭，14日后抽取血清进行琼扩实验。结果显示：注射毒株3，14天后雏鸭血清抗体琼扩效价为1：4；注射毒株4(即RPVA2203株)，14天后雏鸭血清抗体琼扩效价为1:16。因此选择RPVA2203株作为最优毒株，并进行保藏。
4.将活毒加入佐剂，进行冻干，制备成活疫苗。
5.将RPVA2203株未进行弱化的强毒在鸭胚上尿囊腔接种传代5代后进行常规灭活苗制备：收取接毒后死亡鸭胚尿囊液加入甲醛灭活，加入佐剂后制备成灭活疫苗。
实施例2：制备新型鹅细小病毒卵黄抗体IgY
(1)高免蛋的制备：用新型鹅细小病毒活苗、灭活疫苗先后对蛋鸡进行免疫，在蛋鸡小日龄(25-35日龄)进行活疫苗免疫，80-90天后进行第一次灭活疫苗免疫，间隔21天，使用灭活疫苗进行第二次免疫，再间隔21天后，使用灭活疫苗进行第三次免疫；灭活疫苗三免后14天收集高免鸡蛋，并进行琼扩双向扩散试验检测，琼扩效价≥1：64的高免蛋进行鸡蛋收集。
(2)卵黄抗体IgY的提取制备：将高免蛋浸入1％的新洁尔灭溶液中浸泡消毒15min，晾干备用；采取机械打蛋，分离并收集卵黄；用胶体磨乳化后，1:4加入醋酸盐缓冲液(pH5.2)，搅拌60min，用板框过滤器过滤；过滤清液加入2％的辛酸，剧烈搅拌60min，板框过滤；过滤清液用0.22μm微孔过滤除菌即得。
实施例3：鸭圆环病毒Cap蛋白抗原制备
利用GenBank中鸭圆环病毒经典毒株(GeneBank序列号：GU014543.1)的Cap蛋白基因共保守片段，使用软件Premier 5.0设计Cap蛋白基因上下游引物并合成；取病料组织，研磨匀浆后利用常规RNA提取技术提取总RNA并反转录为cDNA；以cDNA为模板，利用Cap 蛋白基因上下游引物对Cap蛋白基因进行扩增及回收；回收产物及所使用的表达载体使用同种限制性内切酶进行酶切后连接，并将连接产物转化至表达载体；筛选阳性克隆进行培养、诱导后回收表达菌体；将菌体进行超声破碎，进行亲和层析后获得。利用基因克隆技术，将鸭圆环病毒Cap蛋白基因克隆到原核表达载体上，转染到原核表达宿主体内，诱导表达。后用亲和层析技术纯化从而获得Cap蛋白。
实施例4：鸭圆环病毒Cap蛋白卵黄抗体IgY制备
1.高免蛋的制备：用鸭圆环病毒Cap蛋白制备的疫苗先后对蛋鸡进行免疫，三免后14 天收集高免鸡蛋，并进行琼扩双向扩散试验检测，琼扩效价≥1：64的高免蛋进行鸡蛋收集。
2.卵黄抗体IgY的提取制备：将高免蛋浸入1％的新洁尔灭溶液中浸泡消毒15min，晾干备用；采取机械打蛋，分离并收集卵黄；用胶体磨乳化后，1:4加入醋酸盐缓冲液(pH5.2)，搅拌60min，用板框过滤器过滤；过滤清液加入2％的辛酸，剧烈搅拌60min，板框过滤；过滤清液用0.22μm微孔过滤除菌即得。
实施例5：制备新型鹅细小病毒抗原抗体复合物。
1.配制活苗的鸭胚半数致死量为104.5ELD50。
2.配制新型鹅细小病毒卵黄抗体效价为1:64。
3.将上述1和2中制备的活苗和卵黄抗体按体积比100:15、100:25、100:35混合。
4.混合产物做无菌处理后可得复合物1、复合物2、复合物3。
5.对复合物1、2、3进行鸭胚ELD50测定，最终发现复合物3可以完全不致死鸭胚。
6.选取复合物3进行后续试验。
实施例6：制备鸭圆环病毒Cap蛋白抗原抗体复合物。
1.配制鸭圆环Cap蛋白抗原浓度为180μg/ml。
2.配制鸭圆环卵黄抗体EILSA效价1：128。
将上述1和2的抗原和抗体按体积比100:50、100:100、100:150分别混合。
3.混合产物做无菌处理后可得复合物a、复合物b、复合物c。
4.使用雏鸭进行复合物保护力对比试验，根据雏鸭攻毒后排毒情况来进行保护力效果对比评价(如表3所示)。最终选取复合物b(100:100)的抗原抗体混合比例。
表3鸭圆环病毒抗原抗体复合物攻毒保护排毒情况
攻毒后天数 攻毒对照 复合物a 复合物b 复合物c
1 - - - -
7 + - - -
14 + - - -
21 + - - +
28 + + - +
35 + + - +
实施例7：制备新型鹅细小病毒和鸭圆环病毒Cap蛋白混合抗原抗体复合物
将两种处方量的抗原抗体复合物(实施例5中复合物2和实施例6中复合物c)，等比例混合后，加入铝胶中进行混合，即可得到所需成品抗原抗体复合物。
实施例8：免疫试验
取1日龄易感雏鸭40羽，随机分为4组，适应饲养一天后进行如下操作：
第一组：设为空白对照组，每羽肌注0.2ml生理盐水；
第二组：设为复合物组，每羽肌注0.2ml复合物；
第三组：设为常规新型鹅细小病毒疫苗组，每羽肌注处方剂量的常规新型鹅细小病毒灭活疫苗；
第四组：设为常规鸭圆环病毒疫苗组，每羽肌注处方剂量的常规鸭圆环病毒灭活疫苗；
上述免疫之后14天进行一次加强免疫，每隔一周进行采血，检测血清中抗体水平(见图1、图2)，其中，鹅细小病毒抗体水平采用琼脂扩散试验进行评价；鸭圆环病毒抗体水平采用ELISA方法进行评价。经检测，抗原抗体复合物组各雏鸭，两种病毒产生免疫应答的时间都要短于常规疫苗，第二组中血清抗体效价上升最快，能够产生抗体的水平最高。
具体实施例9：攻毒试验
取4和21日龄雏肉鸭各180羽，分别随机分为9组，适应饲养一日后，分别进行如下操作：
第一组：设为攻毒对照组；
第二组：设为鹅细小疫苗组，每羽肌注处方量的常规新型鹅细小病毒灭活疫苗；
第三组：设为鸭圆环疫苗组，每羽肌注处方量的鸭圆环病毒灭活疫苗；
第四组：设为鹅细小抗体组，每羽肌注处方量的常规新型鹅细小病毒卵黄抗体；
第五组：设为鸭圆环抗体组，每羽肌注处方量的鸭圆环病毒卵黄抗体；
第六组：设为鹅细小抗原抗体复合物组，每羽肌注1ml所制备的鹅细小抗原抗体复合物；
第七组：设为鸭圆环抗原抗体复合物组，每羽肌注1ml所制备的鸭圆环抗原抗体复合物；
第八组：设为两种抗原抗体复合物混合组，每羽肌注1ml所制备的抗原抗体复合物；
第九组：设为健康对照组。
各组免疫21天后，利用新型鹅细小病毒(103.38EID50)、鸭圆环病毒(103.63EID50)进行肌肉注射攻毒，统计各组中鸭脱羽综合征和鸭短喙侏儒综合征发病率及保护率(见表4)。结果表明：攻毒对照组的鸭发病率为80％-90％，抗原抗体复合物组保护率可达到95％-100％。
表4发病率、保护率
Figure RE-GDA0003583845990000071

Claims (8)

1.一种含新型鹅细小病毒和鸭圆环病毒抗原抗体复合物的生物制品，其特征在于，所述生物制品包含鸭圆环病毒抗原抗体复合物和新型鹅细小病毒抗原抗体复合物，所述鸭圆环病毒抗原抗体复合物包括鸭圆环病毒Cap蛋白和鸭圆环病毒高免卵黄抗体，所述新型鹅细小病毒抗原抗体复合物包括新型鹅细小病毒高免卵黄抗体和新型鹅细小病毒活疫苗，所述新型鹅细小病毒高免卵黄抗体和新型鹅细小病毒活疫苗均采用新型鹅细小病毒毒株RPVA2203株制备而成，该毒株的保藏编号为CCTCC NO：V202209。
2.根据权利要求1所述的一种含新型鹅细小病毒和鸭圆环病毒抗原抗体复合物的生物制品，其特征在于，所述新型鹅细小病毒毒株需要在75-85℃条件下预处理25-35分钟。
3.根据权利要求1所述的一种含新型鹅细小病毒和鸭圆环病毒抗原抗体复合物的生物制品，其特征在于，所述新型鹅细小病毒毒株采用鸭胚、鹅胚交替传代的方式进行弱化。
4.根据权利要求1所述的一种含新型鹅细小病毒和鸭圆环病毒抗原抗体复合物的生物制品，其特征在于所述鸭圆环病毒Cap蛋白抗原浓度为180μg/ml。
5.根据权利要求1所述的一种含新型鹅细小病毒和鸭圆环病毒抗原抗体复合物的生物制品，其特征在于所述鸭圆环病毒高免卵黄抗体EILSA效价范围为1：128。
6.根据权利要求1所述的一种含新型鹅细小病毒和鸭圆环病毒抗原抗体复合物的生物制品，其特征在于所述新型鹅细小病毒高免卵黄抗体效价范围为1：64。
7.根据权利要求1所述的一种含新型鹅细小病毒和鸭圆环病毒抗原抗体复合物的生物制品，其特征在于所述新型鹅细小病毒活疫苗的鸭胚半数致死量为104.5ELD50。
8.权利要求1所述一种含新型鹅细小病毒和鸭圆环病毒抗原抗体复合物的生物制品在制备治疗脱羽综合征和短喙-侏儒综合征的药物中的应用。
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