CN107739406A - 一种小鹅瘟病毒、番鸭细小病毒二联卵黄抗体的制备方法 - Google Patents

一种小鹅瘟病毒、番鸭细小病毒二联卵黄抗体的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种小鹅瘟病毒、番鸭细小病毒二联卵黄抗体的制备方法，该技术方案首先利用由小鹅瘟病毒GPV‑HB株所制备的灭活疫苗和市售的小鹅瘟病毒活疫苗共同作为小鹅瘟病毒抗原，利用番鸭细小病毒MDPV‑FJ株所制备的灭活疫苗单独作为番鸭细小病毒抗原，免疫共分三次，小鹅瘟活疫苗和自制小鹅瘟灭活苗基础免疫一次，强化免疫两次，每次间隔三周，每次每种疫苗免疫1ml/只；番鸭细小病毒病免疫次数及间隔同上，但较小鹅瘟免疫时间推迟一周，免疫剂量为1ml/只。通过以上抗原及免疫手段，能使高免蛋中两种抗体的效价均达到较高水平。利用本发明所制备的卵黄抗体可对小鹅瘟和番鸭细小病毒病实现同时防治，而且具有极高的保护率。

Description

一种小鹅瘟病毒、番鸭细小病毒二联卵黄抗体的制备方法
技术领域
本发明涉及禽用生物制品技术领域，进一步涉及卵黄抗体制备技术，具体涉及一种小鹅瘟病毒、番鸭细小病毒二联卵黄抗体的制备方法。
背景技术
小鹅瘟(Gosling plague)是由小鹅瘟病毒(Gosling plague virus,GPV)，也称为鹅细小病毒引起的雏鹅急性或亚急性的败血性传染病。本病主要侵害4～20日龄的易感雏鹅，具有传播快、发病率高和致死率高的特点。随着雏鹅日龄增长，其发病率和致死率下降。
比较研究发现，国内不同地区分离株、国内与国外分离株间同源性均较高，无论是结构蛋白还是非结构蛋白，VP3基因核苷酸一致性95％以上；编码基因核苷酸序列一致性均达到92％以上。
雏番鸭细小病毒病是由雏番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus，MDPV)引起的雏番鸭以喘气、腹泻、脚发软及进行性消瘦为主要症状的一种急性、败血性传染病，其特点是传染性强和死亡率高。该病主要发生于3周龄以内的雏番鸭，因此又称雏番鸭“三周病”；发病率和死亡率可达40％以上，是目前番鸭饲养业中危害最严重的传染病之一，严重影响养鸭业的发展。雏番鸭是惟一自然感染发病的动物，发病率和死亡率与日龄关系密切，日龄愈小发病率和死亡率愈高，3周龄以内的雏番鸭发病率为20％～60％，病死率为20％～40％不等。30日龄以上的番鸭也可发病，但发病率和死亡率较低，病鸭往往成为僵鸭。
MDPV在病毒大小、理化特性、形态结构、核酸类型及免疫学特性等方面与鹅细小病毒(即小鹅瘟病毒，GPV)很接近，通过基因比对发现，两种病毒的同源性较高，但两者在致病性上存在较大差异。MDPV只能感染番鸭及番鸭源细胞，而GPV既能感染鹅，又可以感染番鸭及其体外培养细胞。
卵黄抗体是指从免疫禽蛋中提取的针对特定抗原的抗体，由于卵黄中仅有IgG类抗体，因此称其为卵黄免疫球蛋白IgG(yolk antibody)，简称为IgY。
当机体受到外来抗原刺激后，法氏囊内的B细胞分化成为浆细胞，分泌特异性抗体进入血液循环，当血液流经卵巢时，特异性抗体(主要是IgG)在卵细胞中逐渐蓄积，形成卵黄抗体，IgG移行进入卵细胞是受体作用的结果，因而IgG可在卵细胞中大量蓄积，浓度高于血液中的IgG，单个卵黄(约15ml)中卵黄抗体含量可达200mg左右。再加之从卵黄中提取抗体较从动物血清中提取抗体简便，因此卵黄抗体具有明显的技术优势。
此外，卵黄抗体在多种环境中有较好的稳定性。在低于75℃条件下，卵黄抗体具有良好的热稳定性，90℃处理15min后，大部分卵黄抗体丧失结合活性，在PH<4时，仅有少量卵黄抗体失去活性。在pH4～12范围内，卵黄抗体的活性几乎不受影响，在pH>12时，卵黄抗体迅速失去结合活性。实验表明，卵黄抗体具有耐受反复冻融的特性，即使经过5次冻融，其抗原结合活性几乎不受影响。在室温下可保存6个月，4℃保存可达5年以上，活性仅下降5％左右。
由于具备上述优越的生物学、理化特性，因此卵黄抗体的制备与应用受到了越来越多的关注。然而现有技术的卵黄抗体普遍为单一抗体类别，仅用于一种疾病的防治，若要获得多联卵黄抗体则需要在免疫环节中对多种抗原同时实现免疫应答，然而这一过程往往难以保证所产多种抗体的效价均处于较高水平。此外，现有技术中卵黄抗体的纯化工艺仍有待完善，常规粗制方法不仅所得产品的抗体效价难以保证，而且可能会污染禽呼肠孤病毒、禽淋巴白血病病毒、网状内皮增生因子、大肠杆菌、沙门氏菌、支原体等外源性致病微生物，从而在使用中造成其他病原的感染和传播。另外，常规的卵黄抗体制备方法难以去除卵黄中的脂蛋白及卵磷脂等大分子物质，因此注射后易发生过敏性反应，同时存在局部组织出血、肿胀、坏死等情况。
发明内容
本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种小鹅瘟病毒、番鸭细小病毒二联卵黄抗体的制备方法，以解决现有技术的卵黄抗体难以同时防治番鸭小鹅瘟和番鸭细小病毒病的技术问题。
本发明要解决的另一技术问题是现有技术的卵黄抗体产品对小鹅瘟或番鸭细小病毒病的临床保护效果不佳。
为实现以上技术目的本发明采用以下技术方案：
一种小鹅瘟病毒、番鸭细小病毒二联卵黄抗体的制备方法，包括以下步骤：
1)取小鹅瘟病毒GPV-HB株，制备得到小鹅瘟灭活疫苗；取番鸭细小病毒MDPV-FJ株，制备得到番鸭细小病毒灭活疫苗；购买市售小鹅瘟活疫苗待用；
2)取蛋鸡，分别注射所述小鹅瘟灭活疫苗和小鹅瘟活疫苗进行小鹅瘟疫苗的基础免疫，一周后注射所述番鸭细小病毒灭活疫苗进行番鸭细小病毒疫苗的基础免疫，两周后分别注射所述小鹅瘟灭活疫苗和小鹅瘟活疫苗进行小鹅瘟疫苗的首次强化免疫，一周后注射所述番鸭细小病毒灭活疫苗进行番鸭细小病毒疫苗的首次强化免疫，两周后分别注射所述小鹅瘟灭活疫苗和小鹅瘟活疫苗进行小鹅瘟疫苗的二次强化免疫，一周后注射所述番鸭细小病毒灭活疫苗进行番鸭细小病毒疫苗的二次强化免疫；上述注射行为的剂量均为1mL/只；
3)当小鹅瘟病毒和番鸭细小病毒抗体琼扩效价均≥1:64时，收集高免蛋，浸入1％(v/v)的新洁尔灭溶液中浸泡10～15min，晾干，分离并收集卵黄，破碎得到卵黄匀浆，向其中加入4倍于卵黄匀浆体积的醋酸盐缓冲液，搅拌60min，过滤，向滤液中加入终浓度为2～4％(v/v)的辛酸，继续搅拌60min，过滤至滤液澄清，收集滤液，过滤除菌，即得到所述小鹅瘟病毒、番鸭细小病毒二联卵黄抗体。
作为优选，步骤3)中小鹅瘟病毒抗体琼扩效价＜1:64或番鸭细小病毒抗体琼扩效价＜1:64，此时先执行以下步骤再收集高免蛋：再次注射小鹅瘟灭活疫苗、小鹅瘟活疫苗或番鸭细小病毒灭活疫苗，直至小鹅瘟病毒和番鸭细小病毒抗体琼扩效价均≥1:64。
作为优选，步骤3)中所述分离并收集卵黄，是采取机械打蛋的方式实现的，在收集卵黄的过程中去除卵黄外部包括系带在内的附着物。
作为优选，步骤3)中所述破碎是利用胶体磨研磨。
作为优选，步骤3)中所述醋酸盐缓冲液的pH为5.2。
作为优选，步骤3)中第一次过滤以及所述过滤至滤液澄清，均是利用板框过滤器实现的。
作为优选，步骤3)中所述过滤除菌，是利用孔径为0.22μm的微孔滤膜实现的。
作为优选，包括以下步骤：以2mL/只的用量对≤21日龄的禽类个体胸肌注射所述卵黄抗体；以3mL/只的用量对＞21日龄的禽类个体胸肌注射所述卵黄抗体。
作为优选，包括以下步骤：以1mL/只的用量对≤21日龄的禽类个体胸肌注射所述卵黄抗体；以2mL/只的用量对＞21日龄的禽类个体胸肌注射所述卵黄抗体。
在以上技术方案中，所述小鹅瘟病毒GPV-HB株以及番鸭细小病毒MDPV-FJ株均为本领域的常规菌株，可自市面购得。
本发明提供了一种小鹅瘟病毒、番鸭细小病毒二联卵黄抗体的制备方法，该技术方案结合小鹅瘟病毒、番鸭细小病毒的生物学特性及其在鸡体内的免疫应答特点，从毒株类别、免疫方法等角度进行了创新性设计。具体来看，本发明首先利用由小鹅瘟病毒GPV-HB株所制备的灭活疫苗和市售的小鹅瘟病毒活疫苗共同作为小鹅瘟病毒抗原，利用番鸭细小病毒MDPV-FJ株所制备的灭活疫苗单独作为番鸭细小病毒抗原，免疫共分三次，小鹅瘟活疫苗和自制小鹅瘟灭活苗基础免疫一次，强化免疫两次，每次间隔三周，每次每种疫苗免疫1ml/只；番鸭细小病毒病免疫次数及间隔同上，但较小鹅瘟免疫时间推迟一周，免疫剂量为1ml/只；当其中一种抗体效价降低一个滴度时，进行第四次免疫。
通过以上抗原及免疫手段，能使高免蛋中两种抗体的效价均达到较高水平，为卵黄抗体产品的保护效果奠定了基础。在此基础上，本发明匹配了适宜的纯化工艺，在保证抗体纯度的基础上降低了杂质含量。利用本发明所制备的卵黄抗体可对小鹅瘟和番鸭细小病毒病实现同时防治，而且具有极高的保护率。
具体实施方式
以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。
以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。因此，用“大约”、“左右”等语言所修正的数值不限于该准确数值本身。在一些实施例中，“大约”表示允许其修正的数值在正负百分之十(10％)的范围内变化，比如，“大约100”表示的可以是90到110之间的任何数值。此外，在“大约第一数值到第二数值”的表述中，大约同时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近似性语言可能与测量仪器的精度有关。
除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
实施例1一种小鹅瘟病毒、番鸭细小病毒二联卵黄抗体的制备方法
一种小鹅瘟病毒、番鸭细小病毒二联卵黄抗体的制备方法，包括以下步骤：
1)取小鹅瘟病毒GPV-HB株，制备得到小鹅瘟灭活疫苗；取番鸭细小病毒MDPV-FJ株，制备得到番鸭细小病毒灭活疫苗；购买市售小鹅瘟活疫苗待用；
2)取蛋鸡，分别注射所述小鹅瘟灭活疫苗和小鹅瘟活疫苗进行小鹅瘟疫苗的基础免疫，一周后注射所述番鸭细小病毒灭活疫苗进行番鸭细小病毒疫苗的基础免疫，两周后分别注射所述小鹅瘟灭活疫苗和小鹅瘟活疫苗进行小鹅瘟疫苗的首次强化免疫，一周后注射所述番鸭细小病毒灭活疫苗进行番鸭细小病毒疫苗的首次强化免疫，两周后分别注射所述小鹅瘟灭活疫苗和小鹅瘟活疫苗进行小鹅瘟疫苗的二次强化免疫，一周后注射所述番鸭细小病毒灭活疫苗进行番鸭细小病毒疫苗的二次强化免疫；上述注射行为的剂量均为1mL/只；
3)当小鹅瘟病毒和番鸭细小病毒抗体琼扩效价均≥1:64时，收集高免蛋，浸入1％(v/v)的新洁尔灭溶液中浸泡10min，晾干，分离并收集卵黄，破碎得到卵黄匀浆，向其中加入4倍于卵黄匀浆体积的醋酸盐缓冲液，搅拌60min，过滤，向滤液中加入终浓度为2％(v/v)的辛酸，继续搅拌60min，过滤至滤液澄清，收集滤液，过滤除菌，即得到所述小鹅瘟病毒、番鸭细小病毒二联卵黄抗体。
在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
步骤3)中小鹅瘟病毒抗体琼扩效价＜1:64或番鸭细小病毒抗体琼扩效价＜1:64，此时先执行以下步骤再收集高免蛋：再次注射小鹅瘟灭活疫苗、小鹅瘟活疫苗或番鸭细小病毒灭活疫苗，直至小鹅瘟病毒和番鸭细小病毒抗体琼扩效价均≥1:64。
步骤3)中所述分离并收集卵黄，是采取机械打蛋的方式实现的，在收集卵黄的过程中去除卵黄外部包括系带在内的附着物。
步骤3)中所述破碎是利用胶体磨研磨。
步骤3)中所述醋酸盐缓冲液的pH为5.2。
步骤3)中第一次过滤以及所述过滤至滤液澄清，均是利用板框过滤器实现的。
步骤3)中所述过滤除菌，是利用孔径为0.22μm的微孔滤膜实现的。
实施例2利用实施例1所制备卵黄抗体进行小鹅瘟、番鸭细小病毒病治疗的效果
2000只7日龄番鸭发生小鹅瘟疫情(伴有番鸭细小病毒病)，使用实施例1所制备的卵黄抗体治疗，治疗方法为：以2mL/只的用量对≤21日龄的禽类个体胸肌注射所述卵黄抗体；以3mL/只的用量对＞21日龄的禽类个体胸肌注射所述卵黄抗体。结果发现，疫情得到有效控制，治愈率达到94％。
实施例3利用实施例1所制备卵黄抗体进行小鹅瘟、番鸭细小病毒病预防的效果
在小鹅瘟发生的番鸭场选取2群暂未发病的番鸭群(共4000只，7日龄)进行紧急预防，预防方法为：以1mL/只的用量对≤21日龄的禽类个体胸肌注射所述卵黄抗体；以2mL/只的用量对＞21日龄的禽类个体胸肌注射所述卵黄抗体。结果发现，番鸭场疫情得到控制后，此4000只番鸭并未发生小鹅瘟及番鸭细小病毒的单独感染或是混合感染，预防保护率达到了100％。
实施例4常规的单成分卵黄抗体对小鹅瘟、番鸭细小病毒病防治效果
(1)小鹅瘟高免蛋的获得：选取市售小鹅瘟活疫苗、自制小鹅瘟灭活苗，对开产前母鸡进行三次免疫，每次间隔两周，每次免疫1ml/只。当小鹅瘟抗体琼扩效价≥1:64时，开始收集高免蛋。
(2)番鸭细小高免蛋的获得：选取自制番鸭细小灭活苗，对开产母鸡进行三次免疫，每次间隔两周，每次免疫剂量1ml/只。当番鸭细小抗体琼扩效价≥1:64时，开始收集高免蛋。
(2)小鹅瘟卵黄抗体的制备：将高免蛋浸入1％的新洁尔灭溶液中浸泡消毒15min，晾干备用；采取机械打蛋，分离并收集卵黄；用胶体磨乳化后，1:4加入醋酸盐缓冲液(pH5.2)，搅拌60min，用板框过滤器过滤；过滤清液加入2％的辛酸，剧烈搅拌60min，板框过滤；过滤清液用0.22μm微孔过滤除菌即得。
(3)番鸭细小卵黄抗体的制备：将高免蛋浸入1％的新洁尔灭溶液中浸泡消毒15min，晾干备用；采取机械打蛋，分离并收集卵黄；用胶体磨乳化后，1:4加入醋酸盐缓冲液(pH5.2)，搅拌60min，用板框过滤器过滤；过滤清液加入2％的辛酸，剧烈搅拌60min，板框过滤；过滤清液用0.22μm微孔过滤除菌即得。
(4)应用方法：2000只7日龄番鸭发生小鹅瘟疫情，使用上述方法制备的抗小鹅瘟卵黄抗体，胸肌注射，2ml/只。疫情得到控制，治愈率为80％。本番鸭群14周龄时又发生番鸭细小病毒病，使用番鸭细小卵黄抗体等常规药物进行治疗，病情得到缓解，治愈率为90％，出栏时体重较其他鸭群平均低0.3kg左右。
将本实施例的结果与实施例2、3的实验结果比较表明，实施例1所制备的卵黄抗体不仅可同时防治两种疾病，同时较单成分卵黄抗体具有更好的治愈率。
实施例5
一种小鹅瘟病毒、番鸭细小病毒二联卵黄抗体的制备方法，包括以下步骤：
1)取小鹅瘟病毒GPV-HB株，制备得到小鹅瘟灭活疫苗；取番鸭细小病毒MDPV-FJ株，制备得到番鸭细小病毒灭活疫苗；购买市售小鹅瘟活疫苗待用；
2)取蛋鸡，分别注射所述小鹅瘟灭活疫苗和小鹅瘟活疫苗进行小鹅瘟疫苗的基础免疫，一周后注射所述番鸭细小病毒灭活疫苗进行番鸭细小病毒疫苗的基础免疫，两周后分别注射所述小鹅瘟灭活疫苗和小鹅瘟活疫苗进行小鹅瘟疫苗的首次强化免疫，一周后注射所述番鸭细小病毒灭活疫苗进行番鸭细小病毒疫苗的首次强化免疫，两周后分别注射所述小鹅瘟灭活疫苗和小鹅瘟活疫苗进行小鹅瘟疫苗的二次强化免疫，一周后注射所述番鸭细小病毒灭活疫苗进行番鸭细小病毒疫苗的二次强化免疫；上述注射行为的剂量均为1mL/只；
3)当小鹅瘟病毒和番鸭细小病毒抗体琼扩效价均≥1:64时，收集高免蛋，浸入1％(v/v)的新洁尔灭溶液中浸泡15min，晾干，分离并收集卵黄，破碎得到卵黄匀浆，向其中加入4倍于卵黄匀浆体积的醋酸盐缓冲液，搅拌60min，过滤，向滤液中加入终浓度为4％(v/v)的辛酸，继续搅拌60min，过滤至滤液澄清，收集滤液，过滤除菌，即得到所述小鹅瘟病毒、番鸭细小病毒二联卵黄抗体。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种小鹅瘟病毒、番鸭细小病毒二联卵黄抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)取小鹅瘟病毒GPV-HB株，制备得到小鹅瘟灭活疫苗；取番鸭细小病毒MDPV-FJ株，制备得到番鸭细小病毒灭活疫苗；购买市售小鹅瘟活疫苗待用；
2)取蛋鸡，分别注射所述小鹅瘟灭活疫苗和小鹅瘟活疫苗进行小鹅瘟疫苗的基础免疫，一周后注射所述番鸭细小病毒灭活疫苗进行番鸭细小病毒疫苗的基础免疫，两周后分别注射所述小鹅瘟灭活疫苗和小鹅瘟活疫苗进行小鹅瘟疫苗的首次强化免疫，一周后注射所述番鸭细小病毒灭活疫苗进行番鸭细小病毒疫苗的首次强化免疫，两周后分别注射所述小鹅瘟灭活疫苗和小鹅瘟活疫苗进行小鹅瘟疫苗的二次强化免疫，一周后注射所述番鸭细小病毒灭活疫苗进行番鸭细小病毒疫苗的二次强化免疫；上述注射行为的剂量均为1mL/只；
3)当小鹅瘟病毒和番鸭细小病毒抗体琼扩效价均≥1:64时，收集高免蛋，浸入1％(v/v)的新洁尔灭溶液中浸泡10～15min，晾干，分离并收集卵黄，破碎得到卵黄匀浆，向其中加入4倍于卵黄匀浆体积的醋酸盐缓冲液，搅拌60min，过滤，向滤液中加入终浓度为2～4％(v/v)的辛酸，继续搅拌60min，过滤至滤液澄清，收集滤液，过滤除菌，即得到所述小鹅瘟病毒、番鸭细小病毒二联卵黄抗体。
2.根据权利要求1所述的一种小鹅瘟病毒、番鸭细小病毒二联卵黄抗体的制备方法，其特征在于步骤3)中小鹅瘟病毒抗体琼扩效价＜1:64或番鸭细小病毒抗体琼扩效价＜1:64，此时先执行以下步骤再收集高免蛋：再次注射小鹅瘟灭活疫苗、小鹅瘟活疫苗或番鸭细小病毒灭活疫苗，直至小鹅瘟病毒和番鸭细小病毒抗体琼扩效价均≥1:64。
3.根据权利要求1所述的一种小鹅瘟病毒、番鸭细小病毒二联卵黄抗体的制备方法，其特征在于步骤3)中所述分离并收集卵黄，是采取机械打蛋的方式实现的，在收集卵黄的过程中去除卵黄外部包括系带在内的附着物。
4.根据权利要求1所述的一种小鹅瘟病毒、番鸭细小病毒二联卵黄抗体的制备方法，其特征在于步骤3)中所述破碎是利用胶体磨研磨。
5.根据权利要求1所述的一种小鹅瘟病毒、番鸭细小病毒二联卵黄抗体的制备方法，其特征在于步骤3)中所述醋酸盐缓冲液的pH为5.2。
6.根据权利要求1所述的一种小鹅瘟病毒、番鸭细小病毒二联卵黄抗体的制备方法，其特征在于步骤3)中第一次过滤以及所述过滤至滤液澄清，均是利用板框过滤器实现的。
7.根据权利要求1所述的一种小鹅瘟病毒、番鸭细小病毒二联卵黄抗体的制备方法，其特征在于步骤3)中所述过滤除菌，是利用孔径为0.22μm的微孔滤膜实现的。
8.一种利用权利要求1所制备卵黄抗体治疗小鹅瘟或番鸭细小病毒病的方法，其特征在于包括以下步骤：以2mL/只的用量对≤21日龄的禽类个体胸肌注射所述卵黄抗体；以3mL/只的用量对＞21日龄的禽类个体胸肌注射所述卵黄抗体。
9.一种利用权利要求1所制备卵黄抗体预防小鹅瘟或番鸭细小病毒病的方法，其特征在于包括以下步骤：以1mL/只的用量对≤21日龄的禽类个体胸肌注射所述卵黄抗体；以2mL/只的用量对＞21日龄的禽类个体胸肌注射所述卵黄抗体。
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