CN114644709A - 一种可降低辛酸蛋渣残留的大规模生产蛋黄抗体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物制品技术领域，公开了一种可降低辛酸蛋渣残留的大规模生产蛋黄抗体的方法，具体公开了一种蛋黄抗体的制备方法，包括以下步骤：蛋黄液与醋酸‑醋酸盐缓冲溶液混合，固液分离，得到蛋黄抗体液；蛋黄抗体液与辛酸混合萃取，收集下层澄清液；下层澄清液与甲醛混合，得到蛋黄抗体。本发明提供的蛋黄抗体的制备方法将蛋黄抗体提取操作划分为酸化水沉淀提取和辛酸沉淀提取两个步骤，首先以醋酸‑醋酸盐为主要离子介质，增大了蛋黄抗体的产出量，并获得可利用的蛋渣；将辛酸提取步骤作为进一步去除蛋黄中脂蛋白的操作手段，辛酸蛋渣废出量可减少约65％～70％，很大程度上降低了辛酸蛋渣的产出量。
Description
技术领域
本发明属于生物制品技术领域，具体涉及一种可降低辛酸蛋渣残留的大规模生产蛋黄抗体的方法。
背景技术
畜禽和水产的细菌、病毒疾病，病毒疾病发展后期引发的细菌疾病均阻碍养殖业健康发展。抗生素的使用虽然极大控制了畜禽和水产细菌疾病、病毒疾病后期引发的细菌继发感染，但是抗生素滥用却造成环境污染并严重危害了人体健康，全面禁抗刻不容缓。自2020年7月饲料中禁止添加促生长类抗生素药物这一措施实施以来，全面禁抗正式拉开序幕。蛋黄抗体因其产量大、效价稳定、预防和治疗效果明显成为抗生素的有效替代品之一。
目前，可用于预防、治疗鸭病毒性肝炎、小鹅瘟和传染性法氏囊的蛋黄抗体注射液已正式上市，部分企业采用辛酸纯化方法提取蛋黄抗体，其中辛酸纯化方法获得的蛋黄抗体效价合理，注射液中无有害化学物质残留，但辛酸纯化方法的使用导致生产过程中产生大量辛酸蛋渣无法有效回收利用，造成严重的环境污染和资源浪费，同时此种方法制备的蛋黄抗体产量较低。
按照现有的蛋黄抗体生产工艺，产1000吨蛋黄抗体大约需要使用400吨蛋黄，同时产生约160吨辛酸蛋渣。蛋渣废出若未进行有效回收利用会造成严重的环境污染和巨大的资源浪费。因废出中含有大量蛋黄残渣，营养丰富，因此常选择将其添加至饲料中饲喂动物以便再次利用。但是，由于辛酸味道强烈并且对胃肠道有强刺激性，添加至饲料投喂给动物后，常出现动物不饮食或突发胃肠道疾病等现象，因此很难将辛酸蛋渣以饲料投喂方式再次利用。也就是说，在辛酸蛋渣无法回收再利用的情况下，急需改进现有蛋黄抗体生产工艺，大幅度减少辛酸蛋渣产出量。
因此急需建立一种方法，在保证有效效价的情况下，增大蛋黄抗体产量，减少辛酸蛋渣废出量，降低环境污染，确保资源有效回收利用。
发明内容
本发明第一方面的目的，在于提供一种蛋黄抗体的制备方法。
本发明第二方面的目的，在于提供本发明第一方面的制备方法在制备药物或饲料添加剂中的应用。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供一种蛋黄抗体的制备方法，包括以下步骤：蛋黄液与醋酸-醋酸盐缓冲溶液混合，固液分离，得到蛋黄抗体液；蛋黄抗体液与辛酸混合萃取，收集下层澄清液；下层澄清液与甲醛混合，得到蛋黄抗体。
优选地，所述醋酸-醋酸盐缓冲液的pH值为4.2～5.4。
进一步优选地，所述醋酸-醋酸盐缓冲液的pH值为4.4～5.4。
更进一步优选地，所述醋酸-醋酸盐缓冲液的pH值为4.6～5.4。
优选地，所述醋酸-醋酸缓盐冲液与所述蛋黄液体积的比(4～7):1。
进一步优选地，所述醋酸-醋酸盐缓冲液与所述蛋黄液体积的比(4.4～6):1。
更进一步优选地，所述醋酸-醋酸盐缓冲液与所述蛋黄液体积的比(5.2～5.8):1。
优选地，所述蛋黄液与醋酸-醋酸盐缓冲溶液混合的条件为100～200rpm搅拌20～35min。
进一步优选地，所述蛋黄液与醋酸-醋酸盐缓冲溶液混合的条件为100～160rpm搅拌20～35min。
优选地，所述醋酸-醋酸盐缓冲液为醋酸-醋酸钠缓冲溶液。
优选地，所述辛酸的添加量为所述蛋黄抗体液体积的1v/v‰～4v/v‰。
进一步优选的，所述辛酸的添加量为所述蛋黄抗体液体积的1v/v‰～3v/v‰。
优选地，所述辛酸添加的方式为：逐滴加入，边加边搅拌。
优选地，所述蛋黄抗体液与辛酸混合的条件为100～200rpm搅拌1～3h。
进一步优选地，所述蛋黄抗体液与辛酸混合的条件为100～160rpm搅拌1～2h。
优选地，所述甲醛在下层澄清液与甲醛的混合液中的终浓度为0.03v/v％～0.1v/v％。
进一步优选地，所述甲醛在下层澄清液与甲醛的混合液中的终浓度为0.03v/v％～0.05v/v％。
优选地，所述下层澄清液与甲醛混合前调节pH值为6.0～7.0。
进一步优选地，所述下层澄清液与甲醛混合前调节pH值为6.0～6.5。
优选地，所述蛋黄液为高免蛋的蛋黄液。
优选地，所述高免蛋为小鹅瘟的高免蛋、鸭病毒性肝炎的高免蛋和传染性法氏囊病的高免蛋中的至少一种。
进一步优选地，所述高免蛋为小鹅瘟的高免蛋。
本发明第二个方面，在于提供本发明第一方面的制备方法在制备药物或饲料添加剂中的应用。
优选地，所述药物为预防和治疗小鹅瘟或亚病毒性肝炎的药物。
本发明的有益效果是：
本发明提供的蛋黄抗体的制备方法将蛋黄抗体提取操作划分为酸化水沉淀提取和辛酸沉淀提取两个步骤，首先以醋酸-醋酸钠为主要离子介质，增大了蛋黄抗体的产出量，并获得可利用的蛋渣；将辛酸提取步骤作为进一步去除蛋黄中脂蛋白的操作手段，辛酸蛋渣废出量可减少约65％～70％，很大程度上降低了辛酸蛋渣的产出量，减轻了资源浪费和环境污染的压力。
本发明以高免蛋作为蛋黄抗体生产的主要原料，是生产中最大的成本支出之一，按照现有的蛋黄抗体生产工艺，生产1000吨蛋黄抗体，需消耗约150万枚高免蛋。本发明增大了酸化水用量，减少了辛酸使用量，增大了抗体在酸化水中的溶解量，避免了辛酸对抗体的破坏，既保证了蛋黄抗体有效效价又提高了蛋黄抗体的单位产值。也就是说，与现有蛋黄抗体生产工艺相比，同样生产1000吨蛋黄抗体，本发明提供的制备方法在高免蛋的使用量上减少约50％，很大程度上降低了蛋黄抗体的生产成本。
酸化水提取方法沉淀脂蛋白，得到粗提水溶性蛋黄抗体的过程中，因脂蛋白沉淀对溶液离子浓度和pH要求严格，因此过酸和过碱的缓冲体系或非缓冲酸碱体系均无法提取抗体。在实际工业生产过程中，由于蛋黄自身粘稠的特性，将酸化水处理后的蛋黄经管道式离心机离心，蛋黄易沾壁堵塞管道，所以需边离心边清理管道，拖缓生产效率，同时清理过程中极易导致产品污染。因此本发明中利用醋酸-醋酸盐缓冲体系作为酸化水提取抗体，根据过夜沉淀后上清澄清度、沉淀分离程度、上清体积摸索了适宜此体系的pH范围，同时用静止过夜沉淀的方法分离水溶性蛋黄抗体和脂蛋白沉淀，得到分离度较好的黄抗体液。
本发明提供的蛋黄抗体制备方法操作简单、具有普适性，易于大规模、高效的生产蛋黄抗体。
具体实施方式
现结合具体实施例对本发明进行详细说明，但不限制本发明的范围。
本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的材料和试剂。
实施例1
一种可用于大规模生产小鹅瘟蛋黄抗体的方法，包括如下步骤：
(1)将1000枚小鹅瘟的高免蛋(购买自山东恩诺基生物工程有限公司)用0.1％新洁尔灭浸泡消毒15min；
(2)将清洗消毒后的高免蛋进行机械打蛋操作，获得蛋黄；
(3)将步骤(2)中获得的蛋黄注入搅蛋罐中，将蛋黄搅拌混匀，搅拌速度200rpm，得到蛋黄液；
(4)25℃条件下，于酸化罐中配制蛋黄液4.4倍体积的冰醋酸-醋酸钠缓冲液，并用氢氧化钠调节pH至5.4；
(5)将已配制好的酸化水注入步骤(3)准备的蛋黄液中，搅拌时间30min，搅拌速度130rpm，搅拌均匀后，室温静置沉淀过夜，观察上清澄清度和溶液分层情况(上层为含少量脂质的蛋黄抗体液，下层为无辛酸残留的可利用的蛋黄沉淀)，记录上清体积；
(6)吸取全部上清并转入配液罐中，滴加上清的4v/v‰的正辛酸进一步沉淀脂质，边加边搅拌(130rpm搅拌2h)，直至分层，即上层为含辛酸的蛋渣废出，下层为澄清蛋黄抗体；
(7)将下层的澄清蛋黄抗体静置过滤过夜，得到少量辛酸蛋黄废出沉淀，并得到澄清抗体；
(8)将澄清抗体经板框过滤器过滤后注入另一配液罐中，加入氢氧化钠调节pH至6.5，加入甲醛(终浓度为0.05v/v％)，搅拌均匀；
(9)调配后的蛋黄抗体经板框过滤器再次过滤后注入另一的配液罐，经除菌过滤器过滤除菌，得蛋黄抗体半成品；对半成品进行检验，检验合格后标记转入成品库，即得到小鹅瘟蛋黄抗体成品。
实施例2
一种可用于大规模生产小鹅瘟蛋黄抗体的方法，包括如下步骤：
(1)将1000枚小鹅瘟的高免蛋(购买自山东恩诺基生物工程有限公司)用0.1％新洁尔灭浸泡消毒15min；
(2)将清洗消毒后的高免蛋进行机械打蛋操作，获得蛋黄；
(3)将步骤(2)中获得的蛋黄注入搅蛋罐中，将蛋黄搅拌混匀，搅拌速度200rpm，得到蛋黄液；
(4)25℃条件下，于酸化罐中配制蛋黄液5.2倍体积的冰醋酸-醋酸钠缓冲液，并用氢氧化钠调节pH至5.0；
(5)将已配制好的酸化水注入步骤(3)准备的蛋黄液中，搅拌时间30min，搅拌速度160rpm，搅拌均匀后，室温静置沉淀过夜，观察上清澄清度和溶液分层情况(上层为含少量脂质的蛋黄抗体液，下层为无辛酸残留的可利用的蛋黄沉淀)，记录上清体积；
(6)吸取全部上清并转入配液罐中，滴上加清的3v/v‰的正辛酸进一步沉淀脂质，边加边搅拌(160rpm搅拌2h)，直至分层，即上层为含辛酸的蛋渣废出，下层为澄清蛋黄抗体；
(7)将下层的澄清蛋黄抗体静置过滤过夜，得到少量辛酸蛋黄废出沉淀，并得到澄清抗体；
(8)将澄清抗体经板框过滤器过滤后注入另一配液罐中，加入氢氧化钠调节pH至6.5，加入甲醛(终浓度为0.05v/v％)，搅拌均匀；
(9)调配后的蛋黄抗体经板框过滤器再次过滤后注入另一的配液罐，经除菌过滤器过滤除菌，得蛋黄抗体半成品；对半成品进行检验，检验合格后标记转入成品库，即得到小鹅瘟蛋黄抗体成品。
实施例3
一种可用于大规模生产小鹅瘟蛋黄抗体的方法，包括如下步骤：
(1)将1000枚小鹅瘟的高免蛋(购买自山东恩诺基生物工程有限公司)用0.1％新洁尔灭浸泡消毒15min；
(2)将清洗消毒后的高免蛋进行机械打蛋操作，获得蛋黄；
(3)将步骤(2)中获得的蛋黄注入搅蛋罐中，将蛋黄搅拌混匀，搅拌速度300rpm，得到蛋黄液；
(4)25℃条件下，于酸化罐中配制蛋黄液5.8倍体积的冰醋酸-醋酸钠缓冲液，并用氢氧化钠调节pH至4.6；
(5)将已配制好的酸化水注入步骤(3)准备的蛋黄液中，搅拌时间25min，搅拌速度100rpm，搅拌均匀后，室温静置沉淀过夜，观察上清澄清度和溶液分层情况(上层为含少量脂质的蛋黄抗体液，下层为无辛酸残留的可利用的蛋黄沉淀)，记录上清体积；
(6)吸取全部上清并转入配液罐中，滴加上清的1v/v‰的正辛酸进一步沉淀脂质，边加边搅拌(100rpm搅拌1h)，直至分层，即上层为含辛酸的蛋渣废出，下层为澄清蛋黄抗体；
(7)将下层的澄清蛋黄抗体静置过滤过夜，得到少量辛酸蛋黄废出沉淀，并得到澄清抗体；
(8)将澄清抗体经板框过滤器过滤后注入另一配液罐中，加入氢氧化钠调节pH至6.5，加入甲醛(终浓度为0.05v/v％)，搅拌均匀；
(9)调配后的蛋黄抗体经板框过滤器再次过滤后注入另一的配液罐，经除菌过滤器过滤除菌，得蛋黄抗体半成品；对半成品进行检验，检验合格后标记转入成品库，即得到小鹅瘟蛋黄抗体成品。
实施例4
一种可用于大规模生产小鹅瘟蛋黄抗体的方法，包括如下步骤：
(1)将1000枚小鹅瘟的高免蛋(购买自山东恩诺基生物工程有限公司)用0.1％新洁尔灭浸泡消毒15min；
(2)将清洗消毒后的高免蛋进行机械打蛋操作，获得蛋黄；
(3)将步骤(2)中获得的蛋黄注入搅蛋罐中，将蛋黄搅拌混匀，搅拌速度300rpm，得到蛋黄液；
(4)在25℃条件下，于酸化罐中配制蛋黄液5.8倍体积的冰醋酸-醋酸钠缓冲液，并用氢氧化钠调节pH至4.2；
(5)将已配制好的酸化水注入步骤(3)准备的蛋黄液中，搅拌时间25min，搅拌速度100rpm，搅拌均匀后，室温静置沉淀过夜，观察上清澄清度和溶液分层情况(上层为含少量脂质的蛋黄抗体液，下层为无辛酸残留的可利用的蛋黄沉淀)，记录上清体积；
(6)吸取全部上清并转入配液罐中，滴加上清的1v/v‰的正辛酸进一步沉淀脂质，边加边搅拌(100rpm搅拌1h)，直至分层，即上层为含辛酸的蛋渣废出，下层为澄清蛋黄抗体；
(7)将下层的澄清蛋黄抗体静置过滤过夜，得到少量辛酸蛋黄废出沉淀，并得到澄清抗体；
(8)将澄清抗体经板框过滤器过滤后注入另一配液罐中，加入氢氧化钠调节pH至6.5，加入甲醛(终浓度为0.05v/v％)，搅拌均匀；
(9)调配后的蛋黄抗体经板框过滤器再次过滤后注入另一的配液罐，经除菌过滤器过滤除菌，得蛋黄抗体半成品；对半成品进行检验，检验合格后标记转入成品库，即得到小鹅瘟蛋黄抗体成品。
实施例5
一种可用于大规模生产小鹅瘟蛋黄抗体的方法，包括如下步骤：
(1)将1000枚小鹅瘟的高免蛋(购买自山东恩诺基生物工程有限公司)用0.1％新洁尔灭浸泡消毒15min；
(2)将清洗消毒后的高免蛋进行机械打蛋操作，获得蛋黄；
(3)将步骤(2)中获得的蛋黄注入搅蛋罐中，将蛋黄搅拌混匀，搅拌速度300rpm，得到蛋黄液；
(4)在25℃条件下，于酸化罐中配制蛋黄液5.8倍体积的冰醋酸-醋酸钠缓冲液，并用氢氧化钠调节pH至4.4)；
(5)将已配制好的酸化水注入步骤(3)准备的蛋黄液中，搅拌时间25min，搅拌速度100rpm，搅拌均匀后，室温静置沉淀过夜，观察上清澄清度和溶液分层情况(上层为含少量脂质的蛋黄抗体液，下层为无辛酸残留的可利用的蛋黄沉淀)，记录上清体积；
(6)吸取全部上清并转入配液罐中，滴加上清的1v/v‰的正辛酸进一步沉淀脂质，边加边搅拌(100rpm搅拌1h)，直至分层，即上层为含辛酸的蛋渣废出，下层为澄清蛋黄抗体；
(7)将下层的澄清蛋黄抗体静置过滤过夜，得到少量辛酸蛋黄废出沉淀，并得到澄清抗体；
(8)将澄清抗体经板框过滤器过滤后注入另一配液罐中，加入氢氧化钠调节pH至6.5，加入甲醛(终浓度为0.05v/v％)，搅拌均匀；
(9)调配后的蛋黄抗体经板框过滤器再次过滤后注入另一的配液罐，经除菌过滤器过滤除菌，得蛋黄抗体半成品；对半成品进行检验，检验合格后标记转入成品库，即得到小鹅瘟蛋黄抗体成品。
对比例1
采用目前工厂常用辛酸提取法获得小鹅瘟蛋黄抗体，具体包括如下步骤：
(1)将1000枚小鹅瘟的高免蛋(购买自山东恩诺基生物工程有限公司)用0.1％新洁尔灭浸泡消毒15min；
(2)将清洗消毒后的高免蛋进行机械打蛋操作，获得蛋黄；
(3)将步骤(2)中获得的蛋黄注入搅蛋罐中，将蛋黄搅拌混匀，搅拌速度100rpm，得到蛋黄液；
(4)在25℃条件下，于酸化罐中配制蛋黄液2.5倍体积的冰醋酸-醋酸钠缓冲液，并用氢氧化钠调节pH至4.8，并将其升温至48℃；
(5)将已配制好的酸化水注入步骤(3)准备的蛋黄液中，搅拌时间25min，搅拌速度200rpm，搅拌均匀后，滴加1v/v％的正辛酸沉淀脂质，边加边搅拌(200rpm搅拌1h)，过滤得到澄清抗体；
(6)将澄清抗体经板框过滤器过滤后注入另一配液罐中，加入氢氧化钠调节pH至6.5，加入甲醛(终浓度为0.05v/v％)，搅拌均匀；
(8)调配后的蛋黄抗体经板框过滤器再次过滤后注入另一的配液罐，经除菌过滤器过滤除菌，得蛋黄抗体半成品；对半成品进行检验，检验合格后标记转入成品库，即得到小鹅瘟蛋黄抗体成品。
对比例2
一种可用于大规模生产小鹅瘟蛋黄抗体的方法，包括如下步骤：
(1)将1000枚小鹅瘟的高免蛋(购买自山东恩诺基生物工程有限公司)用0.1％新洁尔灭浸泡消毒15min；
(2)将清洗消毒后的高免蛋进行机械打蛋操作，获得蛋黄；
(3)将步骤(2)中获得的蛋黄注入搅蛋罐中，将蛋黄搅拌混匀，搅拌速度300rpm，得到蛋黄液；
(4)在25℃条件下，于酸化罐中配制蛋黄液5.8倍体积的冰醋酸-醋酸钠缓冲液，并用氢氧化钠调节pH至4.0)；
(5)将已配制好的酸化水注入步骤(3)准备的蛋黄液中，搅拌时间25min，搅拌速度100rpm，搅拌均匀后，室温静置沉淀过夜，观察上清澄清度和溶液分层情况，记录上清体积。
对比例3
一种可用于大规模生产小鹅瘟蛋黄抗体的方法，包括如下步骤：
(1)将1000枚小鹅瘟的高免蛋(购买自山东恩诺基生物工程有限公司)用0.1％新洁尔灭浸泡消毒15min；
(2)将清洗消毒后的高免蛋进行机械打蛋操作，获得蛋黄；
(3)将步骤(2)中获得的蛋黄注入搅蛋罐中，将蛋黄搅拌混匀，搅拌速度300rpm，得到蛋黄液；
(4)在25℃条件下，于酸化罐中配制蛋黄液5.8倍体积的冰醋酸-醋酸钠缓冲液，并用氢氧化钠调节pH至6.0；
(5)将已配制好的酸化水注入步骤(3)准备的蛋黄液中，搅拌时间25min，搅拌速度100rpm，搅拌均匀后，室温静置沉淀过夜，观察上清澄清度和溶液分层情况，记录上清体积。
对比例4
一种可用于大规模生产小鹅瘟蛋黄抗体的方法，包括如下步骤：
(1)将1000枚小鹅瘟的高免蛋(购买自山东恩诺基生物工程有限公司)用0.1％新洁尔灭浸泡消毒15min；
(2)将清洗消毒后的高免蛋进行机械打蛋操作，获得蛋黄；
(3)将步骤(2)中获得的蛋黄注入搅蛋罐中，将蛋黄搅拌混匀，搅拌速度300rpm，得到蛋黄液；
(4)在25℃条件下，于酸化罐中配制蛋黄液5.8倍体积的1mol/L盐酸，并用氢氧化钠调节pH至4.6；
(5)将已配制好的酸化水注入步骤(3)准备的蛋黄液中，搅拌时间25min，搅拌速度100rpm，搅拌均匀后，室温静置沉淀过夜，观察上清澄清度和溶液分层情况，记录上清体积。
效果实施例
1.按实施例1～3和对比例1的方法提取小鹅瘟蛋黄抗体，记录获得小鹅瘟蛋黄抗体的体积，并对提取过程中得到的辛酸蛋渣进行称重，同时利用琼脂扩散法测定小鹅瘟蛋黄抗体的效价。
结果如表1所示，与目前工厂中常用的辛酸提取法(对比例1)相比，实施例1～3提取方法产生的辛酸蛋渣重量均有不同程度的减少，而获得的小鹅瘟蛋黄抗体体积均有不同程度的增加，其中，实施例1产生的辛酸蛋渣重量占对比例1产生的辛酸蛋渣重量的28.7％，减少了71.3％，其获得的小鹅瘟蛋黄抗体体积较对比例1增加了1.62倍；实施例2产生的辛酸蛋渣重量占对比例1产生的辛酸蛋渣重量的30.1％，减少了69.9％，获得的小鹅瘟蛋黄抗体体积较对比例增加了1.85倍；实施例3产生的辛酸蛋渣重量占对比例1产生的辛酸蛋渣重量的32.8％，减少了67.2％，获得的小鹅瘟蛋黄抗体体积较对比例1增加了2.4倍。另外，随着因酸化水用量加大，实施例1～3获得的小鹅瘟蛋黄抗体效价较对比例1获得的小鹅瘟蛋黄抗体效价有所降低，但效价均高于1:8，符合国家标准(农业部公告第608号小鹅瘟精制蛋黄抗体制造与检验试行规程)。
表1实施例1～3与对比例1获得的辛酸蛋渣重量、上清液体积以及蛋黄抗体的效价
2.通过利用实施例3～5和对比例2～4的方法提取小鹅瘟蛋黄抗体，观察提取过程中步骤(5)上清液的澄清度和溶液分层情况，并记录所获得的上清液的体积。
结果如表2所示，在醋酸-醋酸盐缓冲液使用量均为5.8倍蛋黄体积的情况下，当醋酸-醋酸钠缓冲溶液pH4.6(实施例3)时，可得到澄清上清，证明醋酸-醋酸钠缓冲溶液pH4.6是可以使得脂蛋白沉淀的较适合酸碱度；当降低醋酸-醋酸盐缓冲溶液pH至4.2～4.4(实施例4和实施例5)，尽管体系中脂蛋白分层，但是上清仍旧较为浑浊，脂蛋白沉淀不完全，导致后续蛋黄抗体产出较低；对比实施例3和对比例2～3，降低醋酸-醋酸盐缓冲溶液pH至4.0并过夜沉淀后(对比例2)，此时反应体系中脂蛋白不分层，无法沉淀；当醋酸-醋酸盐缓冲溶液pH为6.0并过夜沉淀后(对比例3)，此时反应体系浑浊，脂蛋白不分层，无法沉淀。可见，当醋酸-醋酸盐缓冲溶液pH小于等于4.0或大于等于6.0时，脂蛋白无法沉淀或沉淀不完全，会导致小鹅瘟蛋黄抗体纯化效果差。若为了获得高纯度小鹅瘟蛋黄抗体，则后续需增加辛酸使用量进行进一步的沉淀脂蛋白，但是增大辛酸使用量会导致辛酸蛋渣废出量增大，违背了本发明减少辛酸蛋渣废出产量目的。
对比实施例3和对比例4，在相同沉淀时间、相同酸化水用量和pH的条件下，醋酸-醋酸盐缓冲溶液体系可有效沉淀脂蛋白并获得水溶性小鹅瘟蛋黄抗体，而盐酸溶液体系中脂蛋白不能沉淀，无法获得水溶性小鹅瘟蛋黄抗体。分析原因如下：酸化水提取方法粗提水溶性小鹅瘟蛋黄抗体过程是需要持续提供氢离子以便快速沉淀蛋黄脂蛋白的过程，当使用醋酸-醋酸盐缓冲溶液调节体系，体系可持续提供氢离子以推进蛋黄脂蛋白的快速沉淀，但是如果酸化水体系中加入盐酸，则无法为体系持续提供氢离子，导致相同沉淀时间下，盐酸溶液体系的蛋黄脂蛋白沉淀速度要远低于醋酸-醋酸盐缓冲溶液体系，甚至不发生沉淀。可见，在小鹅瘟蛋黄抗体的提取过程中不能使用盐酸溶液体系进行小鹅瘟蛋黄抗体提取。
表2实施例3～5和对比例2～4提取小鹅瘟蛋黄抗体过程中上清液的澄清度和溶液分层情况以及上清液体积
注：上清液澄清度用“+”表示，“+”越多，表明上清液越澄清，上清液越澄清表明脂蛋白沉淀越完全；“/”表示无法分层而获得上清液。
上面对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
Claims (10)
1.一种蛋黄抗体的制备方法，包括以下步骤：蛋黄液与醋酸-醋酸盐缓冲溶液混合，固液分离，得到蛋黄抗体液；蛋黄抗体液与辛酸混合萃取，收集下层澄清液；下层澄清液与甲醛混合，得到蛋黄抗体。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述醋酸-醋酸盐缓冲液的pH值为4.2～5.4。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述醋酸-醋酸盐缓冲液与所述蛋黄液体积的比(4～7):1。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述辛酸的添加量为所述蛋黄抗体液体积的1v/v‰～4v/v‰。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述蛋黄液与醋酸-醋酸盐缓冲溶液混合的条件为100～200rpm搅拌20～35min。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述蛋黄抗体液与辛酸混合的条件为100～200rpm搅拌1～3h。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述甲醛在下层澄清液与甲醛的混合液中的终浓度为0.03v/v％～0.1v/v％。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述下层澄清液与甲醛混合前调节pH值至6.0～7.0。
9.根据权利要求1～6中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述蛋黄液为高免蛋的蛋黄液；所述高免蛋优选为小鹅瘟的高免蛋、鸭病毒性肝炎的高免蛋和传染性法氏囊病的高免蛋中的至少一种。
10.权利要求1～9中任一项所述的制备方法在制备药物或饲料添加剂中的应用。
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