CN107586333B - 一种用于水禽的多联卵黄抗体制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于水禽的多联卵黄抗体制备方法，该技术方案针对在水禽中常见、且发病日龄较小的几种疾病筛选了六种病毒性抗原，覆盖了禽类呼肠孤病毒、细小病毒、小鹅瘟病毒、鸭肝炎病毒等多种病原。在此基础上，从疫苗制备、免疫方法等角度进行了针对性设计，有效保证了高免蛋中各抗体的效价水平，为卵黄抗体的临床保护效果奠定了基础。与此同时，本发明对后续纯化工艺进行了改进，利用特定截留分子量的中空纤维柱进行过滤浓缩，能在提升抗体纯度的基础上去除绝大部分大分子杂质，降低了产品的不良反应发生率。

Description

一种用于水禽的多联卵黄抗体制备方法

技术领域

本发明涉及禽用生物制品技术领域，进一步涉及卵黄抗体制备技术，具体涉及一种用于水禽的多联卵黄抗体制备方法。

背景技术

由于人类餐饮业的快速发展，并且人们消费水平的不断提升，水禽养殖量在逐日扩大，但是水禽养殖方式相对分散，养殖模式比较开放，导致许多禽类疾病在水禽上发生几率越来越大。

呼肠孤病毒是鸡病毒性关节炎和腱鞘炎的主要病原之一，属于呼肠孤病毒科，呼肠孤病毒属的一种。该毒株自1954年首次从患慢性呼吸道病的鸡呼吸道分离得到以来，多种禽呼肠孤病毒分离株相继被报道。呼肠孤病毒感染的宿主范围逐渐扩大，现在已成为危害养鸭业的重要传染病之一。随着宿主范围的不断扩大，发病日龄越来越小，7日龄内的樱桃谷肉鸭、番鸭、麻鸭等各品种鸭的发病几率越来越大。发病日龄的降低导致该疾病的预防面临重大挑战。

2015年以来，福建、山东、安徽、江苏等地半番鸭、樱桃谷鸭流行一种以短嘴、软脚、易骨折、生长障碍为临床特征的新疫病，给养鸭业带来很大的经济损失，该病主要病原是新型鹅细小病毒或番鸭细小病毒，该疾病主要侵害3周内的番鸭、半番鸭、肉鸭等各品种的鸭，发病日龄小、病理损伤大、发病范围广是其主要特点，这就要求养殖户找到适宜的防御办法，提前做好预防，降低疾病的发生。

鸭肝炎病毒是养鸭业长期存在的疾病，是雏鸭易感的一种急性接触性传染病，以3周龄以内的雏鸭急性发病、肝脏病变和高死亡率为主要特征。并且目前疾病类型发生了新的变化，由原来Ⅰ型鸭肝炎转变为新型的Ⅲ型鸭肝炎病毒，导致传统的Ⅰ型鸭肝炎抗体或是疫苗不能起到很好的保护作用。

卵黄抗体是指从免疫禽蛋中提取的针对特定抗原的抗体，由于卵黄中仅有IgG类抗体，因此称其为卵黄免疫球蛋白IgG(yolk antibody)，简称为IgY。

当机体受到外来抗原刺激后，法氏囊内的B细胞分化成为浆细胞，分泌特异性抗体进入血液循环，当血液流经卵巢时，特异性抗体(主要是IgG)在卵细胞中逐渐蓄积，形成卵黄抗体，IgG移行进入卵细胞是受体作用的结果，因而IgG可在卵细胞中大量蓄积，浓度高于血液中的IgG，单个卵黄(约15ml)中卵黄抗体含量可达200mg左右。再加之从卵黄中提取抗体较从动物血清中提取抗体简便，因此卵黄抗体具有明显的技术优势。

此外，卵黄抗体在多种环境中有较好的稳定性。在低于75℃条件下，卵黄抗体具有良好的热稳定性，90℃处理15min后，大部分卵黄抗体丧失结合活性，在PH<4时，仅有少量卵黄抗体失去活性。在pH4～12范围内，卵黄抗体的活性几乎不受影响，在pH>12时，卵黄抗体迅速失去结合活性。实验表明，卵黄抗体具有耐受反复冻融的特性，即使经过5次冻融，其抗原结合活性几乎不受影响。在室温下可保存6个月，4℃保存可达5年以上，活性仅下降5％左右。

由于具备上述优越的生物学、理化特性，因此卵黄抗体的制备与应用受到了越来越多的关注。然而现有技术的卵黄抗体普遍为单一抗体类别，仅用于一种疾病的防治，若要获得多联卵黄抗体则需要在免疫环节中对多种抗原同时实现免疫应答，然而这一过程往往难以保证所产多种抗体的效价均处于较高水平。此外，现有技术中卵黄抗体的纯化工艺仍有待完善，常规粗制方法不仅所得产品的抗体效价难以保证，而且可能会污染禽呼肠孤病毒、禽淋巴白血病病毒、网状内皮增生因子、大肠杆菌、沙门氏菌、支原体等外源性致病微生物，从而在使用中造成其他病原的感染和传播。另外，常规的卵黄抗体制备方法难以去除卵黄中的脂蛋白及卵磷脂等大分子物质，因此注射后易发生过敏性反应，同时存在局部组织出血、肿胀、坏死等情况。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种用于水禽的多联卵黄抗体制备方法，以解决现有技术的卵黄抗体难以同时防治呼肠孤病毒、细小病毒、小鹅瘟病毒、鸭肝炎病毒等多种疾病的技术问题。

本发明要解决的另一技术问题是当采用上述多种抗原共刺激卵黄以产生卵黄抗体时，如何使所产多种抗体的效价均达到较高水平。

本发明要解决的再一技术问题是如何降低多联卵黄抗体产品中的杂质。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种用于水禽的多联卵黄抗体制备方法，包括以下步骤：

1)分别制备灭活的新型番鸭源鸭呼肠孤病毒、新型肉鸭源鸭呼肠孤病毒、番鸭源细小病毒、小鹅瘟病毒、Ⅰ型鸭肝炎病毒病、Ⅲ型鸭肝炎病毒毒液，六者等体积混合，得到混合抗原溶液；

2)取由美国埃索公司(Esso)出品的、型号为MARCOL52的白油，熬制，在熬制的过程中向其中加入所述白油质量4份的司班和所述白油质量2份的硬脂酸铝，得到疫苗佐剂；

3)将步骤1)所得的混合抗原溶液与步骤2)所得的疫苗佐剂以(1～1.5):(1～2)(v/v)的比例混合均匀，即得到多联疫苗；

4)利用步骤3)所得的多联疫苗免疫蛋鸡，产蛋前1个月免疫1次，两周后二免，二免两周后三免疫，收集三免后蛋鸡的鸡蛋，即为高免蛋；

5)取步骤4)所得高免蛋，分离得到卵黄，搅拌得到卵黄匀浆；

6)向步骤5)所得卵黄匀浆中加入其2倍体积的醋酸缓冲液，调pH至4.6～4.8；在15～20℃、搅拌条件下逐滴加入辛酸，至其中正辛酸终浓度为1％(v/v)，4～8℃条件下静置6～8h，然后以4000～6000r/min的转速离心30min，弃沉淀；上清液经中空纤维柱过滤浓缩后，加入浓缩产物1/10体积的、浓度为0.01mol/l无菌PBS缓冲液，调pH至7.2；向其中加入浓度为1％(v/v)的柳硫汞溶液，至其中柳硫汞终浓度为0.01％(v/v)，搅拌均匀；

7)以30mg/mL的用量向步骤6)所得产物中加入β-葡聚糖干粉，加入冻干保护剂，分装冻干，即得到所述用于水禽的多联卵黄抗体。

作为优选，步骤1)中灭活的新型番鸭源鸭呼肠孤病毒毒液、灭活的新型肉鸭源鸭呼肠孤病毒毒液是通过以下方法制备的：用冷冻保存的新型番鸭源鸭呼肠孤病毒和新型肉鸭源鸭呼肠孤病毒，解冻稀释后接种9～10日龄SPF肉鸭胚制备的DEF细胞，培养36～72小时，收获病变的DEF细胞，反复冻融、离心、浓缩、灭活，然后置低温下冰箱保存备用。

作为优选，步骤1)中灭活的番鸭源细小病毒毒液、灭活的小鹅瘟病毒毒液是通过以下方法制备的：用冷冻保存的番鸭源细小病毒和小鹅瘟病毒，解冻稀释后接种9～10日龄SPF番鸭胚制备的DEF细胞，培养36～72小时，收获病变的DEF细胞，反复冻融、离心、中空纤维超滤浓缩、灭活，然后置低温下冰箱保存备用。

作为优选，步骤1)中灭活的Ⅰ型鸭肝炎病毒毒液、灭活的Ⅲ型鸭肝炎病毒毒液是通过以下方法制备的：用冷冻保存的Ⅰ型鸭肝炎病毒病和Ⅲ型鸭肝炎病毒，解冻稀释后接种9～10日龄SPF鸭胚制备的DEF细胞，培养36～72小时，收获病变DEF细胞，反复冻融、离心、中空纤维超滤浓缩、灭活，然后置低温下冰箱保存备用。

作为优选，所述醋酸缓冲液是pH为5.0～5.2的、醋酸浓度为0.06mol/L的水溶液。

作为优选，步骤6)中第二次对pH的调整是利用饱和碳酸氢钠溶液实现的。

作为优选，步骤5)具体包括以下操作：取步骤4)所得高免蛋，用清水洗净外表，再擦净、晾干，送入蛋清蛋黄分离机分离得到卵黄，搅拌得到卵黄匀浆。

作为优选，步骤6)所述中空纤维柱的截留分子量为20KD。

本发明提供了一种用于水禽的多联卵黄抗体制备方法，该技术方案针对在水禽中常见、且发病日龄较小的几种疾病筛选了六种病毒性抗原，覆盖了禽类呼肠孤病毒、细小病毒、小鹅瘟病毒、鸭肝炎病毒等多种病原。在此基础上，从疫苗制备、免疫方法等角度进行了针对性设计，有效保证了高免蛋中各抗体的效价水平，为卵黄抗体的临床保护效果奠定了基础。与此同时，本发明对后续纯化工艺进行了改进，利用特定截留分子量的中空纤维柱进行过滤浓缩，能在提升抗体纯度的基础上去除绝大部分大分子杂质，降低了产品的不良反应发生率。

本发明所提供的多联的抗体具有较高的抗体水平和良好的临床保护效果，在使用时对1日龄幼禽注射，5～7天加强注射一次，可以对水禽提供足够的抗体保护，降低低日龄疾病的发生，降低养殖成本，减少免疫次数，提供有效预防措施，增加经济效益。同时，本发明方法工艺稳定且成本较低，可适用于规模化生产的需求。

附图说明

图1是本发明实施例2中番鸭不治疗不攻毒组肝脏形态图；

图2是本发明实施例2中番鸭不治疗攻毒组肝脏形态图；

图3是本发明实施例2中番鸭普通治疗攻毒组肝脏形态图；

图4是本发明实施例2中番鸭治疗攻毒组肝脏形态图；

图5是本发明实施例2中肉鸭不治疗不攻毒组肝脏形态图；

图6是本发明实施例2中肉鸭不治疗攻毒组脾脏形态图；

图7是本发明实施例2中肉鸭普通治疗攻毒组肝脏形态图；

图8是本发明实施例2中肉鸭治疗攻毒组肝脏形态图。

具体实施方式

以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。

以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。因此，用“大约”、“左右”等语言所修正的数值不限于该准确数值本身。在一些实施例中，“大约”表示允许其修正的数值在正负百分之十(10％)的范围内变化，比如，“大约100”表示的可以是90到110之间的任何数值。此外，在“大约第一数值到第二数值”的表述中，大约同时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近似性语言可能与测量仪器的精度有关。

除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。

实施例1：多联精致卵黄抗体的制备

(1)油佐剂灭活疫苗的制备

a.灭活呼肠孤病毒悬液的制备

用冷冻保存的新型番鸭源鸭呼肠孤病毒和新型肉鸭源鸭呼肠孤病毒解冻稀释后接种9～10日龄SPF肉鸭胚制备的DEF细胞，36～72小时，收获病变DEF细胞，反复冻融、离心、100KD中空纤维超滤浓缩、灭活，然后置低温下冰箱保存备用；

b.灭活细小病毒悬液的制备

用冷冻保存的番鸭源细小病毒病和小鹅瘟病毒病解冻稀释后接种9～10日龄SPF番鸭胚制备的DEF细胞，36～72小时，收获病变DEF细胞，反复冻融、离心、浓缩、灭活，然后置低温下冰箱保存备用；

c.灭活鸭肝炎病毒悬液的制备

用冷冻保存的Ⅰ型鸭肝炎病毒病和Ⅲ型鸭肝炎病毒解冻稀释后接种9～10日龄SPF鸭胚制备的DEF细胞，36～72小时，收获病变DEF细胞，反复冻融、离心、100KD中空纤维超滤浓缩、灭活，然后置低温下冰箱保存备用；

d.进口油佐剂灭活苗的制备

美国埃索进口白油MARCOL52，在熬制过程中添加司班4份和2份硬脂酸铝。

e灭活苗的制备

将步骤a、b、c制备的灭活病毒悬液与步骤d制备的油佐剂按1:1.5～1：2(v/v)混合，搅拌均匀即可；

(2)制备高免鸡蛋

选择健康高产蛋鸡，将步骤(1)制备的剂灭活苗免疫健康高产蛋鸡，开产前1个月免疫一次，免疫后两周2免，二免两周后进行第三次免疫，收集免疫后高产蛋鸡的鸡蛋，即为多联精致卵黄抗体的高免蛋；

(3)制备精制蛋黄抗体复合物

a.分离蛋清蛋黄

将上述步骤(2)制备的高免鸡蛋用清水洗净，再用擦洗，晾干，送入蛋清蛋黄分离机进行蛋黄分离；

b.制备精制蛋黄抗体

取1份步骤(3)-a所分离的蛋黄匀浆加2份醋酸缓冲液，调pH至4.6；在15℃的室温下搅拌逐滴加入辛酸，正辛酸的终浓度为1％，4℃低温下静置6～8h，然后以6000r/min的转速离心30min，弃沉淀；上清液经中空纤维柱(截留分子量为2万)过滤浓缩后，加入1/10体积的0.01mol/l的无菌PBS，用饱和碳酸氢钠调pH至7.2；将1％柳硫汞溶液与该上清液混合，使柳硫汞的终浓度达到0.01％(v/v)，充分搅拌均匀；

c.制备精制蛋黄抗体复合物

在步骤b所制备的精制蛋黄抗体中加β-葡聚糖干粉30mg/mL，加入保护剂，分装冻干，检验合格，包装入库即可。

实施例2：多联精致蛋黄抗体治疗效果

2.1试验方法

1日龄番鸭和樱桃谷肉鸭各40只，随机分成4组，第1组为治疗组，第2组为普通抗体治疗组，第3组不治疗攻毒组，第4组为不治疗不攻毒组。具体的分组情况见表1。1日龄试验动物进行肌肉注射多联精致蛋黄抗体，每只0.5ml，接种后6-8小时，肌肉注射新分离的新型番鸭源鸭呼肠孤病毒和新型肉鸭源鸭呼肠孤病毒(含10^2.0～2.5EID₅₀)，观察14天，记录发病情况。死亡鸭子进行剖检，观察肝脏和脾脏的病变，器官形态如图1～8所示。

表1试验分组情况

动物种类	治疗组	普通治疗组	不治疗组	不治疗不攻毒组
					1日龄番鸭	10只	10只	10只	10只
1日龄樱桃谷肉鸭	10只	10只	10只	10只

2.2试验结果

观察期内，不治疗组和普通治疗组番鸭均出现了死亡，治疗组番鸭、肉鸭全部键活。观察期结束对死亡和不死亡的鸭子全部进行剖检，治疗组和不治疗不攻毒组鸭子肝脏、脾脏正常，体重正常。不治疗组和普通治疗组鸭子出现死亡、肝脏出血坏死、体重减轻等明显的变化。具体试验结果见表2和表3。

表2攻毒保护率情况

动物种类	治疗组	普通治疗组	不治疗组	不治疗不攻毒组
					1日龄番鸭	10/10	5/10	0/10	10/10
1日龄樱桃谷肉鸭	10/10	6/10	0/10	10/10

表3攻毒后平均体重统计情况

动物种类	治疗组	普通治疗组	不治疗组	不治疗不攻毒组
					1日龄番鸭	390g	260g	255g	386g
1日龄樱桃谷肉鸭	632g	507g	459g	640g

实施例3

一种用于水禽的多联卵黄抗体制备方法，包括以下步骤：

1)分别制备灭活的新型番鸭源鸭呼肠孤病毒、新型肉鸭源鸭呼肠孤病毒、番鸭源细小病毒、小鹅瘟病毒、Ⅰ型鸭肝炎病毒病、Ⅲ型鸭肝炎病毒毒液，六者等体积混合，得到混合抗原溶液；

2)取由美国埃索公司出品的、型号为MARCOL52的白油，熬制，在熬制的过程中向其中加入所述白油质量4份的司班和所述白油质量2份的硬脂酸铝，得到疫苗佐剂；

3)将步骤1)所得的混合抗原溶液与步骤2)所得的疫苗佐剂以1:2(v/v)的比例混合均匀，即得到多联疫苗；

4)利用步骤3)所得的多联疫苗免疫蛋鸡，产蛋前1个月免疫1次，两周后二免，二免两周后三免疫，收集三免后蛋鸡的鸡蛋，即为高免蛋；

5)取步骤4)所得高免蛋，分离得到卵黄，搅拌得到卵黄匀浆；

6)向步骤5)所得卵黄匀浆中加入其2倍体积的醋酸缓冲液，调pH至4.6；在15℃、搅拌条件下逐滴加入辛酸，至其中正辛酸终浓度为1％(v/v)，4℃条件下静置6h，然后以4000r/min的转速离心30min，弃沉淀；上清液经中空纤维柱过滤浓缩后，加入浓缩产物1/10体积的、浓度为0.01mol/l无菌PBS缓冲液，调pH至7.2；向其中加入浓度为1％(v/v)的柳硫汞溶液，至其中柳硫汞终浓度为0.01％(v/v)，搅拌均匀；

7)以30mg/mL的用量向步骤6)所得产物中加入β-葡聚糖干粉，加入冻干保护剂，分装冻干，即得到所述用于水禽的多联卵黄抗体。

在以上技术方案的基础上，满足以下条件：

步骤1)中灭活的新型番鸭源鸭呼肠孤病毒毒液、灭活的新型肉鸭源鸭呼肠孤病毒毒液是通过以下方法制备的：用冷冻保存的新型番鸭源鸭呼肠孤病毒和新型肉鸭源鸭呼肠孤病毒，解冻稀释后接种9日龄SPF肉鸭胚制备的DEF细胞，培养36小时，收获病变的DEF细胞，反复冻融、离心、100KD中空纤维超滤浓缩、灭活，然后置低温下冰箱保存备用。

步骤1)中灭活的番鸭源细小病毒毒液、灭活的小鹅瘟病毒毒液是通过以下方法制备的：用冷冻保存的番鸭源细小病毒和小鹅瘟病毒，解冻稀释后接种9日龄SPF番鸭胚制备的DEF细胞，培养36小时，收获病变的DEF细胞，反复冻融、离心、浓缩、灭活，然后置低温下冰箱保存备用。

步骤1)中灭活的Ⅰ型鸭肝炎病毒毒液、灭活的Ⅲ型鸭肝炎病毒毒液是通过以下方法制备的：用冷冻保存的Ⅰ型鸭肝炎病毒病和Ⅲ型鸭肝炎病毒，解冻稀释后接种9日龄SPF鸭胚制备的DEF细胞，培养36小时，收获病变DEF细胞，反复冻融、离心、100KD中空纤维超滤浓缩、灭活，然后置低温下冰箱保存备用。

所述醋酸缓冲液是pH为5.0的、醋酸浓度为0.06mol/L的水溶液。

步骤6)中第二次对pH的调整是利用饱和碳酸氢钠溶液实现的。

步骤6)所述中空纤维柱的截留分子量为20KD。

实施例4

一种用于水禽的多联卵黄抗体制备方法，包括以下步骤：

1)分别制备灭活的新型番鸭源鸭呼肠孤病毒、新型肉鸭源鸭呼肠孤病毒、番鸭源细小病毒、小鹅瘟病毒、Ⅰ型鸭肝炎病毒病、Ⅲ型鸭肝炎病毒毒液，六者等体积混合，得到混合抗原溶液；

2)取由美国埃索公司出品的、型号为MARCOL52的白油，熬制，在熬制的过程中向其中加入所述白油质量4份的司班和所述白油质量2份的硬脂酸铝，得到疫苗佐剂；

3)将步骤1)所得的混合抗原溶液与步骤2)所得的疫苗佐剂以1.5:1(v/v)的比例混合均匀，即得到多联疫苗；

4)利用步骤3)所得的多联疫苗免疫蛋鸡，产蛋前1个月免疫1次，两周后二免，二免两周后三免疫，收集三免后蛋鸡的鸡蛋，即为高免蛋；

5)取步骤4)所得高免蛋，分离得到卵黄，搅拌得到卵黄匀浆；

6)向步骤5)所得卵黄匀浆中加入其2倍体积的醋酸缓冲液，调pH至4.8；在20℃、搅拌条件下逐滴加入辛酸，至其中正辛酸终浓度为1％(v/v)，8℃条件下静置8h，然后以6000r/min的转速离心30min，弃沉淀；上清液经中空纤维柱过滤浓缩后，加入浓缩产物1/10体积的、浓度为0.01mol/l无菌PBS缓冲液，调pH至7.2；向其中加入浓度为1％(v/v)的柳硫汞溶液，至其中柳硫汞终浓度为0.01％(v/v)，搅拌均匀；

7)以30mg/mL的用量向步骤6)所得产物中加入β-葡聚糖干粉，加入冻干保护剂，分装冻干，即得到所述用于水禽的多联卵黄抗体。

在以上技术方案的基础上，满足以下条件：

步骤1)中灭活的新型番鸭源鸭呼肠孤病毒毒液、灭活的新型肉鸭源鸭呼肠孤病毒毒液是通过以下方法制备的：用冷冻保存的新型番鸭源鸭呼肠孤病毒和新型肉鸭源鸭呼肠孤病毒，解冻稀释后接种10日龄SPF肉鸭胚制备的DEF细胞，培养72小时，收获病变的DEF细胞，反复冻融、离心、浓缩、灭活，然后置低温下冰箱保存备用。

步骤1)中灭活的番鸭源细小病毒毒液、灭活的小鹅瘟病毒毒液是通过以下方法制备的：用冷冻保存的番鸭源细小病毒和小鹅瘟病毒，解冻稀释后接种10日龄SPF番鸭胚制备的DEF细胞，培养72小时，收获病变的DEF细胞，反复冻融、离心、浓缩、灭活，然后置低温下冰箱保存备用。

步骤1)中灭活的Ⅰ型鸭肝炎病毒毒液、灭活的Ⅲ型鸭肝炎病毒毒液是通过以下方法制备的：用冷冻保存的Ⅰ型鸭肝炎病毒病和Ⅲ型鸭肝炎病毒，解冻稀释后接种10日龄SPF鸭胚制备的DEF细胞，培养72小时，收获病变DEF细胞，反复冻融、离心、浓缩、灭活，然后置低温下冰箱保存备用。

所述醋酸缓冲液是pH为5.2的、醋酸浓度为0.06mol/L的水溶液。

实施例5

一种用于水禽的多联卵黄抗体制备方法，包括以下步骤：

1)分别制备灭活的新型番鸭源鸭呼肠孤病毒、新型肉鸭源鸭呼肠孤病毒、番鸭源细小病毒、小鹅瘟病毒、Ⅰ型鸭肝炎病毒病、Ⅲ型鸭肝炎病毒毒液，六者等体积混合，得到混合抗原溶液；

2)取由美国埃索公司出品的、型号为MARCOL52的白油，熬制，在熬制的过程中向其中加入所述白油质量4份的司班和所述白油质量2份的硬脂酸铝，得到疫苗佐剂；

3)将步骤1)所得的混合抗原溶液与步骤2)所得的疫苗佐剂以1:1(v/v)的比例混合均匀，即得到多联疫苗；

4)利用步骤3)所得的多联疫苗免疫蛋鸡，产蛋前1个月免疫1次，两周后二免，二免两周后三免疫，收集三免后蛋鸡的鸡蛋，即为高免蛋；

5)取步骤4)所得高免蛋，分离得到卵黄，搅拌得到卵黄匀浆；

6)向步骤5)所得卵黄匀浆中加入其2倍体积的醋酸缓冲液，调pH至4.7；在17℃、搅拌条件下逐滴加入辛酸，至其中正辛酸终浓度为1％(v/v)，6℃条件下静置7h，然后以5000r/min的转速离心30min，弃沉淀；上清液经中空纤维柱过滤浓缩后，加入浓缩产物1/10体积的、浓度为0.01mol/l无菌PBS缓冲液，调pH至7.2；向其中加入浓度为1％(v/v)的柳硫汞溶液，至其中柳硫汞终浓度为0.01％(v/v)，搅拌均匀；

7)以30mg/mL的用量向步骤6)所得产物中加入β-葡聚糖干粉，加入冻干保护剂，分装冻干，即得到所述用于水禽的多联卵黄抗体。

以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种用于水禽的多联卵黄抗体制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)分别制备灭活的新型番鸭源鸭呼肠孤病毒、新型肉鸭源鸭呼肠孤病毒、番鸭源细小病毒、小鹅瘟病毒、Ⅰ型鸭肝炎病毒病、Ⅲ型鸭肝炎病毒毒液，六者等体积混合，得到混合抗原溶液；

2)取由美国埃索公司出品的、型号为MARCOL52的白油，熬制，在熬制的过程中向其中加入所述白油质量4份的司班和所述白油质量2份的硬脂酸铝，得到疫苗佐剂；

3)将步骤1)所得的混合抗原溶液与步骤2)所得的疫苗佐剂以(1～1.5):(1～2)(v/v)的比例混合均匀，即得到多联疫苗；

4)利用步骤3)所得的多联疫苗免疫蛋鸡，产蛋前1个月免疫1次，两周后二免，二免两周后三免疫，收集三免后蛋鸡的鸡蛋，即为高免蛋；

5)取步骤4)所得高免蛋，分离得到卵黄，搅拌得到卵黄匀浆；

6)向步骤5)所得卵黄匀浆中加入其2倍体积的醋酸缓冲液，调pH至4.6～4.8；在15～20℃、搅拌条件下逐滴加入辛酸，至其中正辛酸终浓度为1％(v/v)，4～8℃条件下静置6～8h，然后以4000～6000r/min的转速离心30min，弃沉淀；上清液经中空纤维柱过滤浓缩后，加入浓缩产物1/10体积的、浓度为0.01mol/l无菌PBS缓冲液，调pH至7.2；向其中加入浓度为1％(v/v)的柳硫汞溶液，至其中柳硫汞终浓度为0.01％(v/v)，搅拌均匀；

7)以30mg/mL的用量向步骤6)所得产物中加入β-葡聚糖干粉，加入冻干保护剂，分装冻干，即得到所述用于水禽的多联卵黄抗体。

2.根据权利要求1所述的一种用于水禽的多联卵黄抗体制备方法，其特征在于步骤1)中灭活的新型番鸭源鸭呼肠孤病毒毒液、灭活的新型肉鸭源鸭呼肠孤病毒毒液是通过以下方法制备的：用冷冻保存的新型番鸭源鸭呼肠孤病毒和新型肉鸭源鸭呼肠孤病毒，解冻稀释后接种9～10日龄SPF肉鸭胚制备的DEF细胞，培养36～72小时，收获病变的DEF细胞，反复冻融、离心、中空纤维超滤浓缩、灭活，然后置低温下冰箱保存备用。

3.根据权利要求1所述的一种用于水禽的多联卵黄抗体制备方法，其特征在于步骤1)中灭活的番鸭源细小病毒毒液、灭活的小鹅瘟病毒毒液是通过以下方法制备的：用冷冻保存的番鸭源细小病毒和小鹅瘟病毒，解冻稀释后接种9～10日龄SPF番鸭胚制备的DEF细胞，培养36～72小时，收获病变的DEF细胞，反复冻融、离心、中空纤维超滤浓缩、灭活，然后置低温下冰箱保存备用。

4.根据权利要求1所述的一种用于水禽的多联卵黄抗体制备方法，其特征在于步骤1)中灭活的Ⅰ型鸭肝炎病毒毒液、灭活的Ⅲ型鸭肝炎病毒毒液是通过以下方法制备的：用冷冻保存的Ⅰ型鸭肝炎病毒病和Ⅲ型鸭肝炎病毒，解冻稀释后接种9～10日龄SPF鸭胚制备的DEF细胞，培养36～72小时，收获病变DEF细胞，反复冻融、离心、中空纤维超滤浓缩、灭活，然后置低温下冰箱保存备用。

5.根据权利要求1所述的一种用于水禽的多联卵黄抗体制备方法，其特征在于所述醋酸缓冲液是pH为5.0～5.2的、醋酸浓度为0.06mol/L的水溶液。

6.根据权利要求1所述的一种用于水禽的多联卵黄抗体制备方法，其特征在于步骤6)中第二次对pH的调整是利用饱和碳酸氢钠溶液实现的。

7.根据权利要求1所述的一种用于水禽的多联卵黄抗体制备方法，其特征在于步骤5)具体包括以下操作：取步骤4)所得高免蛋，用清水洗净外表，再擦净、晾干，送入蛋清蛋黄分离机分离得到卵黄，搅拌得到卵黄匀浆。

8.根据权利要求1所述的一种用于水禽的多联卵黄抗体制备方法，其特征在于步骤6)所述中空纤维柱的截留分子量为20KD。