CN111320689A - 一种鸭呼肠孤病毒、鸭细小病毒和鸭星状病毒三价卵黄抗体的制备方法 - Google Patents

一种鸭呼肠孤病毒、鸭细小病毒和鸭星状病毒三价卵黄抗体的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种鸭呼肠孤病毒、鸭细小病毒和鸭星状病毒三价卵黄抗体的制备方法。本发明提供的三价卵黄抗体是利用鸭呼肠孤病毒、鸭细小病毒和鸭星状病毒三联灭活疫苗免疫鸡，制得高免鸡蛋，经过研磨破碎，混合搅拌，并对收集到的上清液进行纯化、浓缩、无菌处理制得。按照本发明方法制得的三价卵黄抗体，性质稳定、效价活性强，适合呼肠孤病毒、细小病毒和星状病毒三价精制卵黄抗体的大规模制备。

Description

一种鸭呼肠孤病毒、鸭细小病毒和鸭星状病毒三价卵黄抗体 的制备方法
技术领域
本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种鸭呼肠孤病毒、鸭细小病毒和鸭星状病毒三价卵黄抗体的制备方法。
背景技术
鸭呼肠孤病毒(DRV)、鸭细小病毒和鸭星状病毒(DAstv)目前是世界上的研究热点，对鸭、鹅均具有致病性，主要病变表现为脾脏坏死和肝脏出血，该病可直接引发养15日龄以内的雏鸭和雏鹅出现30％以上的死亡率，此外其临床上也常常与鸭疫李默是杆菌，大肠杆菌和星状病毒等并发感染，导致鸭和鹅出现明显呼吸道病，关节炎，及严重的产蛋下降及畸形蛋等问题。因此目前该病已经成为严重影响养鸭和养鹅产业的重大疫病之一。
卵黄抗体是指从免疫禽蛋中提取的针对特定抗原的抗体，由于卵黄中仅有 IgG类抗体，因此称其为卵黄免疫球蛋白IgG(yolk antibody)，简称为IgY。当机体受到外来抗原刺激后，法氏囊内的B细胞分化成为浆细胞，分泌特异性抗体进入血液循环，当血液流经卵巢时，特异性抗体(主要是IgG)在卵细胞中逐渐蓄积，形成卵黄抗体，IgG移行进入卵细胞是受体作用的结果，因而IgG可在卵细胞中大量蓄积，浓度高于血液中的IgG，单个卵黄(约15ml)中卵黄抗体含量可达200mg左右。再加之从卵黄中提取抗体较从动物血清中提取抗体简便，因此卵黄抗体具有明显的技术优势。
此外，卵黄抗体在多种环境中有较好的稳定性。在低于75℃条件下，卵黄抗体具有良好的热稳定性，90℃处理15min后，大部分卵黄抗体丧失结合活性，在pH<4时，仅有少量卵黄抗体失去活性。在pH4～12范围内，卵黄抗体的活性几乎不受影响，在pH>12时，卵黄抗体迅速失去结合活性。实验表明，卵黄抗体具有耐受反复冻融的特性，即使经过5次冻融，其抗原结合活性几乎不受影响。在室温下可保存6个月，4℃保存可达5年以上，活性仅下降5％左右。
由于具备上述优越的生物学、理化特性，因此卵黄抗体的制备与应用受到了越来越多的关注。然而由于现有技术的卵黄抗体生产工艺存在缺陷，因此极大的影响了产品品质，例如一些粗制抗体产品不仅抗体效价难以保证，而且通常会污染禽淋巴白血病病毒、网状内皮增生因子、大肠杆菌、沙门氏菌、支原体等外源性致病原。在注射抗体预防或者治疗疾病时，极有可能造成垂直传播病原或其他一些细菌、病毒的扩散甚至疾病的爆发，带来严重的经济损失。此外，由于这些粗制抗体的制造者往往试图通过添加大剂量的甲醛、青、链霉素等措施来延长其产品的保质期，增加所谓的使用“安全性”，但结果往往是造成更大的应激和严重的药物残留。而且粗制抗体中含有大量的脂蛋白及卵磷脂等大分子物质，这些物质没有任何治疗作用且体积大，粘稠度高，注射困难且难以吸收，注射后对机体的应激大，易造成过敏反应，是外源性致热原。注射后易造成注射部位局部组织出血、肿胀、坏死，坏死的组织会导致机体发热，而发热会造成机体神经调节、体液调节等功能的紊乱，从而导致发病群体采食量减少，抵抗力下降，继发其他疾病。另外一方面，卵黄抗体中存在的不饱和脂肪酸和磷脂类十分容易氧化变质，从而使卵黄抗体的保存期大大缩短，因此，建立一种可大量生产、产品纯度和活性高的提纯方法对卵黄抗体的广泛应用将具有重要意义。
目前对卵黄抗体的分离提纯主要是利用抗体蛋白的亲水性和疏水性进行分离。主要方法有盐析法、超滤浓缩法、层析法、离子交换层析法、正辛酸沉淀等。
发明内容
为了解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种鸭呼肠孤病毒、鸭细小病毒和鸭星状病毒三价卵黄抗体的制备方法。本发明提供的三价卵黄抗体是由鸭呼肠孤病毒、鸭细小病毒和鸭星状病毒免疫鸡，制得高免鸡蛋，并对鸡蛋进行多次处理所得。按照本发明方法制得的三价卵黄抗体，性质稳定、效价活性强，适合鸭呼肠孤病毒、鸭细小病毒和鸭星状病毒三价精制卵黄抗体的大规模制备，并对鸭呼肠孤病毒、鸭细小病毒和鸭星状病毒的防控和治疗提供有力的保障。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种三价卵黄抗体的制备方法，包括如下步骤：
S1、利用鸭呼肠孤病毒、鸭细小病毒和鸭星状病毒三联灭活疫苗免疫100 日龄的海兰褐鸡，获得高免鸡蛋，用75％酒精进行表面消毒，去蛋清，得高免鸡蛋蛋黄；
S2、收集步骤S1获得的高免鸡蛋蛋黄，去除卵黄膜和系带后利用胶体磨进行破碎，得蛋黄液；
S3、将步骤S2得到的蛋黄液与0.1mol/L的pH为7.2～7.4的醋酸盐缓冲溶液以1：6～8的体积比混合，然后向其中加入总体积0.05％～0.1％的聚乙二醇15-羟基硬脂酸酯，搅拌混合均匀，然后加入总体积0.3～0.5％的β-环糊精，充分搅拌， 4℃静置1～2h，充分平衡后在4℃，4000r/min离心15～20min，收集上清液；
S4、将步骤S3收集的上清液进行纯化、浓缩，无菌处理，即得。
优选地，步骤S1中所述的鸭呼肠孤病毒、鸭细小病毒和鸭星状病毒三联灭活疫苗用传代细胞系LMH细胞生产。
优选地，步骤S1中所述高免鸡蛋蛋黄的具体制备方法为：给100日龄的海兰褐鸡皮下注射1mL鸭呼肠孤病毒灭活疫苗免疫，共免疫3次，每相邻两次免疫的时间间隔为21d，在最后一次免疫后5d收集鸡蛋，即得。
优选地，步骤S2中所述蛋黄液的具体制备方法为：将高免鸡蛋用75％酒精进行表面消毒，分离出蛋黄，过60目尼龙筛，去除卵黄膜和系带，然后置于胶体磨中研磨4～6min，即得。
优选地，步骤S3中所述醋酸盐缓冲液的制备过程为：每1000mL纯化水中溶解0.886g乙酸钠和2.82ml冰乙酸，然后利用1mol/L的NaOH溶液调节pH 至4.8。
优选地，步骤S3中所述聚乙二醇15-羟基硬脂酸酯的终浓度为0.6～1.2％；所述β-环糊精的终浓度为1.0～2.0％。
优选地，步骤S3中所述聚乙二醇15-羟基硬脂酸酯的终浓度为0.8％；所述β-环糊精的终浓度为1.2％。
优选地，步骤S4中所述无菌处理具体操作为：将经纯化、浓缩后得到的浓缩液使用过滤精度为0.45μm的筒式滤芯精滤，再用过滤精度为0.20μm的筒式滤芯过滤除菌，无菌操作分装，即得。
本发明中，经匀浆后的蛋黄液在接近中性的醋酸盐缓冲溶液中可以较大程度地溶解水溶性蛋白质，并通过添加一定量的β-环糊精，通过离心，利用密度差，除去水不溶性成分，从而充分地从鸡蛋黄中分离出水溶性蛋白液(WSF)，提高卵黄抗体的回收率。本发明人在试验过程中发现，当β-环糊精的用量较大时，会引起卵黄抗体损失，仅在一定的浓度范围内，充分除去水不溶性成分的同时可保持较高的卵黄抗体的回收率，优选地，所述的β-环糊精在水中的终浓度为1.0～2.0％ (m/v)，进一步优选地，所述β-环糊精在水中的终浓度为1.2％。
上述的聚乙二醇15-羟基硬脂酸酯是由环氧乙烷和羟基硬脂酸反应制得，是一种无毒、无害的医药辅料，本发明人通过大量的试验发现，在醋酸盐缓冲液环境中添加一定量的聚乙二醇15-羟基硬脂酸酯，可较大程度地除去水溶性蛋白液中的不饱和脂肪酸和脂蛋白等成分，提高卵黄抗体的纯度和稳定性，优选地，所述聚乙二醇15-羟基硬脂酸酯在体系中的终浓度为0.6～1.2％(m/v)，进一步优选地，所述聚乙二醇15-羟基硬脂酸酯在体系中的终浓度为0.8％。
与现有技术，本发明提供的三价卵黄抗体具有如下优点：
(1)本发明提供的鸭呼肠孤病毒、鸭细小病毒和鸭星状病毒三价卵黄抗体制备方法具有简便、快捷、高效的优点，制得的鸭呼肠孤病毒、鸭细小病毒和鸭星状病毒三价卵黄抗体性质稳定、效价活性强，适合鸭呼肠孤病毒、鸭细小病毒和鸭星状病毒三价卵黄抗体的大规模制备。
(2)采用本发明提供的制备方法制得的鸭呼肠孤病毒、鸭细小病毒和鸭星状病毒三价卵黄抗体纯度高，可有效除去不饱和脂肪酸和脂蛋白等成分，同时制得的抗体液无细菌、无支原体、无外源性病毒存在，安全性高、保护率高。
(3)采用本发明提供的制备方法制得的鸭呼肠孤病毒、鸭细小病毒和鸭星状病毒三价卵黄抗体注射鸭后，其抗体维持时间长，治疗效果显著。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解释，但是应当注意的是，以下实施例仅用以解释本发明，而不能用来限制本发明，所有与本发明相同或相近的技术方案均在本发明的保护范围之内。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料为市售商品。
实施例1鸭呼肠孤病毒、鸭细小病毒和鸭星状病毒三联疫苗的制备
所述鸭呼肠孤病毒、鸭细小病毒和鸭星状病毒三联疫苗，包括如下过程：
(1)传代细胞系LMH细胞的制备：将LMH细胞用0.025％EDTA-胰酶消化分散传代，用含7％新生牛血清和适量双抗的DMEM培养液在37℃、5％CO2培养箱中培养；
(2)种毒繁殖：用呼肠孤病毒、细小病毒和星状病毒分别按其终体积1:200 接种到步骤1制备的LMH细胞中，并在37℃吸附30分钟后吸弃病毒液，在用含1.5％新生牛血清、适量双抗和2mM谷氨酰胺的DMEM培养液于37℃、5％CO2培养，呼肠孤病毒至58±2小时、细小病毒至68±2小时、星状病毒至88±2 小时；
(3)病毒收集、浓缩和纯化：LMH细胞出现80％细胞病变时，收获细胞毒液于-20℃反复冻融两次，5000rpm，4℃离心10min后收集上清液，即病毒原液，对上述三种病毒上清液进行效价测定，其效价均可达到107/0.1mL；将病毒原液通过50K的中空纤维柱超滤浓缩10倍，即为制苗病毒液；
(4)病毒含量测定：将制苗病毒液用DMEM培养液做10倍系列稀释，取 10-5、10-6、10-7、10-8、10-95个稀释度接种48孔铺满单层LMH细胞培养板，每个稀释度重复5孔，同时设立阴性对照细胞孔；每孔0.1mL，37℃吸附30min后，补加含1.5％新生牛血清、适量双抗和2mM谷氨酰胺的DMEM培养液0.3mL于 37℃、5％CO2培养120小时，，观察细胞病变(CPE)，计算TCID50，每0.1mL 病毒含量108TCID50以上，方可用于制备疫苗；
(5)病毒灭活：采用0.1％福尔马林灭活制苗病毒液，即为疫苗抗原；
(6)疫苗成品的配制：
①油相制备：取优质注射用白油94份，硬脂酸铝2份，司班-80 4份，先将白油缓慢加温，加入4％的司班-80和2％的硬脂酸铝，边搅边加温，直到硬脂酸铝充分溶解至透明为止，高压灭菌备用；
②水相制备：取疫苗抗原96份加入灭菌后的吐温-80 4份，开始搅拌，使吐温-80完全溶解为止，制成水相；
③乳化：利用IKA乳化剂进行乳化，16000rpm，乳化5分钟即可；
④分装：将制备的疫苗按照每瓶250mL进行分装。
实施例2鸭呼肠孤病毒、鸭细小病毒和鸭星状病毒三价卵黄抗体制备
所述三价卵黄抗体的制备过程如下：
S1、利用鸭呼肠孤病毒、鸭细小病毒和鸭星状病毒三联灭活疫苗免疫100 日龄的海兰褐鸡，获得高免鸡蛋，具体为：给100日龄的海兰褐鸡皮下注射1mL 鸭呼肠孤病毒、鸭细小病毒和鸭星状病毒三联灭活疫苗免疫，共免疫3次，每相邻两次免疫的时间间隔为21d，在最后一次免疫后5d收集鸡蛋，即得高免鸡蛋，用75％酒精进行表面消毒，去蛋清，得高免鸡蛋蛋黄；
S2、将步骤S1制得的高免鸡蛋蛋黄，过60目尼龙筛去除卵黄膜和系带，然后置于胶体磨中研磨5min，得蛋黄液；
S3、将步骤S2得到的蛋黄液与0.1mol/L的pH为7.3的醋酸盐缓冲溶液以 1:8的体积比混合，然后向其中加入终浓度为0.8％(m/v)的聚乙二醇15-羟基硬脂酸酯，加入量为总体积的0.0.8％，搅拌混合均匀，搅拌均匀后加入终浓度为 1.2％(m/v)的β-环糊精，加入量为总体积的0.4％，充分搅拌，4℃静置1.5h，充分平衡后在4℃，4000r/min离心20min，收集上清液；所述醋酸盐缓冲液的制备过程为：每1000mL纯化水中溶解0.886g乙酸钠和2.82ml冰乙酸，然后利用 1mol/L的NaOH溶液调节pH至4.8；
S4、将步骤S3收集到的上清液经纯化、浓缩的浓缩液进行无菌处理，具体为：将经纯化、浓缩后得到的浓缩液使用过滤精度为0.45μm的筒式滤芯精滤，再用过滤精度为0.20μm的筒式滤芯过滤除菌，无菌操作分装，即得。
实施例3呼肠孤病毒、细小病毒和星状病毒三价卵黄抗体制备
所述三价卵黄抗体的制备方法为：S1、利用呼肠孤病毒、细小病毒和星状病毒三联灭活疫苗免疫100日龄的海兰褐鸡，获得高免鸡蛋，具体为：给100日龄的海兰褐鸡皮下注射1mL呼肠孤病毒、细小病毒和星状病毒三联灭活疫苗免疫，共免疫3次，每相邻两次免疫的时间间隔为21d，在最后一次免疫后5d收集鸡蛋，即得高免鸡蛋，用75％酒精进行表面消毒，去蛋清，得高免鸡蛋蛋黄；
S2、将步骤S1制得的高免鸡蛋蛋黄，过60目尼龙筛去除卵黄膜和系带，然后置于胶体磨中研磨6min，得蛋黄液；
S3、将步骤S2得到的蛋黄液与0.1mol/L的pH为7.2的醋酸盐缓冲溶液以1:8的体积比混合，然后向其中加入终浓度为0.8％(m/v)的聚乙二醇15-羟基硬脂酸酯，加入量为总体积的0.05％，搅拌混合均匀，搅拌均匀后加入终浓度为2％ (m/v)的β-环糊精，加入量为总体积的0.3％，充分搅拌，4℃静置1h，充分平衡后在4℃，4000r/min离心15min，收集上清液；所述醋酸盐缓冲液的制备过程为：每1000mL纯化水中溶解0.886g乙酸钠和2.82ml冰乙酸，然后利用1mol/L 的NaOH溶液调节pH至4.8；
S4、将步骤S3收集到的上清液经纯化、浓缩的浓缩液进行无菌处理，具体为：将经纯化、浓缩后得到的浓缩液使用过滤精度为0.45μm的筒式滤芯精滤，再用过滤精度为0.20μm的筒式滤芯过滤除菌，无菌操作分装，即得。
实施例4呼肠孤病毒、细小病毒和星状病毒三价卵黄抗体制备
所述三价卵黄抗体的制备方法为：
S1、利用呼肠孤病毒、细小病毒和星状病毒三联灭活疫苗免疫100日龄的海兰褐鸡，获得高免鸡蛋，具体为：给100日龄的海兰褐鸡皮下注射1mL呼肠孤病毒、细小病毒和星状病毒三联灭活疫苗免疫，共免疫3次，每相邻两次免疫的时间间隔为21d，在最后一次免疫后5d收集鸡蛋，即得高免鸡蛋，用75％酒精进行表面消毒，去蛋清，得高免鸡蛋蛋黄；
S2、将步骤S1制得的高免鸡蛋蛋黄，过60目尼龙筛去除卵黄膜和系带，然后置于胶体磨中研磨6min，得蛋黄液；
S3、将步骤S2得到的蛋黄液与0.1mol/L的pH为7.4的醋酸盐缓冲溶液以 1:6的体积比混合，然后向其中加入终浓度为0.6％(m/v)的聚乙二醇15-羟基硬脂酸酯，加入量为总体积的0.1％，搅拌混合均匀，搅拌均匀后加入终浓度为0.5％ (m/v)的β-环糊精，加入量为总体积的0.5％，充分搅拌，4℃静置2h，充分平衡后在4℃，4000r/min离心15min，收集上清液；所述醋酸盐缓冲液的制备过程为：每1000mL纯化水中溶解0.886g乙酸钠和2.82ml冰乙酸，然后利用1mol/L 的NaOH溶液调节pH至4.8；
S4、将步骤S3收集到的上清液经纯化、浓缩的浓缩液进行无菌处理，具体为：将经纯化、浓缩后得到的浓缩液使用过滤精度为0.45μm的筒式滤芯精滤，再用过滤精度为0.20μm的筒式滤芯过滤除菌，无菌操作分装，即得。
实施例5鸭呼肠孤病毒、鸭细小病毒和鸭星状病毒三价卵黄抗体制备
所述三价卵黄抗体的制备方法为：
S1、利用鸭呼肠孤病毒、鸭细小病毒和鸭星状病毒三联灭活疫苗免疫100 日龄的海兰褐鸡，获得高免鸡蛋，具体为：给100日龄的海兰褐鸡皮下注射1mL 鸭呼肠孤病毒、鸭细小病毒和鸭星状病毒三联灭活疫苗免疫，共免疫3次，每相邻两次免疫的时间间隔为21d，在最后一次免疫后5d收集鸡蛋，即得高免鸡蛋，用75％酒精进行表面消毒，去蛋清，得高免鸡蛋蛋黄；
S2、将步骤S1制得的高免鸡蛋蛋黄，过60目尼龙筛去除卵黄膜和系带，然后置于胶体磨中研磨6min，得蛋黄液；
S3、将步骤S2得到的蛋黄液与0.1mol/L的pH为7.3的醋酸盐缓冲溶液以 1:6的体积比混合，然后向其中加入终浓度为1.2％(m/v)的聚乙二醇15-羟基硬脂酸酯，加入量为总体积的0.09％，搅拌混合均匀，搅拌均匀后加入终浓度为2.5％ (m/v)的β-环糊精，加入量为总体积的0.4％，充分搅拌，4℃静置1.5h，充分平衡后在4℃，4000r/min离心15min，收集上清液；所述醋酸盐缓冲液的制备过程为：每1000mL纯化水中溶解0.886g乙酸钠和2.82ml冰乙酸，然后利用1mol/L 的NaOH溶液调节pH至4.8；
S4、将步骤S3收集到的上清液经纯化、浓缩的浓缩液进行无菌处理，具体为：将经纯化、浓缩后得到的浓缩液使用过滤精度为0.45μm的筒式滤芯精滤，再用过滤精度为0.20μm的筒式滤芯过滤除菌，无菌操作分装，即得。
实施例6鸭呼肠孤病毒、鸭细小病毒和鸭星状病毒三价卵黄抗体制备
所述三价卵黄抗体的制备方法为：
S1、利用鸭呼肠孤病毒、鸭细小病毒和鸭星状病毒三联灭活疫苗免疫100 日龄的海兰褐鸡，获得高免鸡蛋，具体为：给100日龄的海兰褐鸡皮下注射1mL 鸭呼肠孤病毒、鸭细小病毒和鸭星状病毒三联灭活疫苗免疫，共免疫3次，每相邻两次免疫的时间间隔为21d，在最后一次免疫后5d收集鸡蛋，即得高免鸡蛋，用75％酒精进行表面消毒，去蛋清，得高免鸡蛋蛋黄；
S2、将步骤S1制得的高免鸡蛋蛋黄，过60目尼龙筛去除卵黄膜和系带，然后置于胶体磨中研磨6min，得蛋黄液；
S3、将步骤S2得到的蛋黄液与0.1mol/L的pH为7.2的醋酸盐缓冲溶液以 1:7的体积比混合，然后向其中加入终浓度为1.0％(m/v)的聚乙二醇15-羟基硬脂酸酯，加入量为总体积的0.06％，搅拌混合均匀，搅拌均匀后加入终浓度为3.0％ (m/v)的β-环糊精，加入量为总体积的0.45％，充分搅拌，4℃静置1.7h，充分平衡后在4℃，4000r/min离心15min，收集上清液；所述醋酸盐缓冲液的制备过程为：每1000mL纯化水中溶解0.886g乙酸钠和2.82ml冰乙酸，然后利用1mol/L 的NaOH溶液调节pH至4.8；
S4、将步骤S3收集到的上清液经纯化、浓缩的浓缩液进行无菌处理，具体为：将经纯化、浓缩后得到的浓缩液使用过滤精度为0.45μm的筒式滤芯精滤，再用过滤精度为0.20μm的筒式滤芯过滤除菌，无菌操作分装，即得。
对比例1鸭呼肠孤病毒、鸭细小病毒和鸭星状病毒三价卵黄抗体制备
所述三价卵黄抗体的制备方法与实施例2类似；与实施例2的区别在于，对比例在步骤S3时不加入β-环糊精。
对比例2鸭呼肠孤病毒、鸭细小病毒和鸭星状病毒三价卵黄抗体制备
所述三价卵黄抗体的制备方法与实施例2类似；与实施例2的区别在于，对比例在步骤S3时不加入聚乙二醇15-羟基硬脂酸酯。
对比例3鸭呼肠孤病毒、鸭细小病毒和鸭星状病毒三价卵黄抗体制备
所述三价卵黄抗体的制备方法与实施例2类似；与实施例2的区别在于，对比例在步骤S3中将pH为4.8的醋酸盐缓冲液替换为纯化水。
试验例一、鸭呼肠孤病毒、鸭细小病毒和鸭星状病毒三价卵黄抗体质量控制
根据《中华人民共和国兽用生物制品规程》对本发明实施例2-6和对比例1-3 制得的鸭呼肠孤病毒、鸭细小病毒和鸭星状病毒三价卵黄抗体进行无菌检验、支原体检验、外源性病毒检测，结果均未检出。
试验例二、鸭呼肠孤病毒、鸭细小病毒和鸭星状病毒三价卵黄抗体安全性试验1.试验样品：实施例2-6及对比例1-3制得的三价卵黄抗体
2.试验方法：选取由SPF鸭胚孵化，并在隔离房饲养至10天龄的健康鸡做安全试验。将其分为9组，每组5只，分别用实施例2-6和对比例1-3制得的卵黄抗体溶液分点肌肉注射小鸡，注射量分别为5mL，其中有一组不注射作为对照组。试验鸡均在隔离房饲养。注射前探温，注射后探温2d，早晚各1次，并观察注射部位有无异常情况出现。
3.试验结果：与对照组比较，本发明实施例2-6和对比例1-3制得的卵黄抗体注射前和注射后的体温差异均为±0.1℃，且各组试验小鸡的精神、食欲和饮欲均正常，注射部位皮肤和肌肉均无异常情况出现，表明本发明提供的卵黄抗体安全性高。
试验例三、β-环糊精对蛋白回收率的影响
采用BCA法分别测定实施例2-6中步骤(2)得到的蛋黄液和步骤(3)得到的上清液中蛋白质的浓度，计算蛋白回收率，以评价加入不同浓度β-环糊精对卵黄抗体回收率的影响，结果见下表1。
表1不同浓度的β-环糊精对蛋白回收率的影响
组别 β-环糊精终浓度(m/v) 蛋白回收率(％)
实施例2 1.2％ 96.4
实施例3 2.0％ 95.8
实施例4 0.5％ 90.5
实施例5 2.5％ 84.2
实施例6 3.0％ 80.4
在制备卵黄抗体的过程中，经匀浆后的蛋黄液在接近中性的Tris-HCL缓冲溶液可以较大程度地溶解水溶性蛋白质，添加一定量的β-环糊精能有效除去通过离心，利用密度差，除去水不溶性成分，从而充分地从鸡蛋黄中分离出水溶性蛋白液(WSF)。由上表可知，当β-环糊精的用量较小，蛋白回收率较低；当其用量较大，会引起卵黄抗体损失，明显降低蛋白回收率，当其在体系中的终浓度为 1.2％和2.0％时，能充分除去水不溶性成分的同时可保持较高的卵黄抗体的回收率。
试验例四、SDS-PAGE检测呼肠孤病毒、细小病毒和星状病毒三价卵黄抗体纯度
采用SDS-PAGE分别检测实施例2、对比例1-3制得的卵黄抗体溶液纯度，结果显示，实施例2在相对分子量为67～70kD(重链)和22～30kD(轻链)处可见一条明显且单一的蛋白条带，且在其他相对分子量处几乎没有杂蛋白，说明其提取的鸭呼肠孤病毒卵黄抗体纯度高，而对比例1-3均存在较为明显的多个条带，说明其提取的鸭呼肠孤病毒卵黄抗体杂质多、纯度低。
试验例五、鸭呼肠孤病毒、鸭细小病毒和鸭星状病毒三价卵黄抗体中和试验法
按现行《中华人民共和国兽药典》的中和试验法分别检测实施例2制得的卵黄抗体的效价，结果见下表3-表8所示。
表3雏鸭注射三联高免卵黄抗体后呼肠孤病毒中和抗体的变化情况
Figure RE-GDA0002442591320000111
表4雏鹅注射三联高免卵黄抗体后呼肠孤病毒中和抗体的变化情况
Figure RE-GDA0002442591320000112
Figure RE-GDA0002442591320000121
表5雏鸭注射三联高免卵黄抗体后细小病毒中和抗体的变化情况
Figure RE-GDA0002442591320000122
Figure RE-GDA0002442591320000131
表6雏鹅注射三联高免卵黄抗体后细小病毒中和抗体的变化情况
Figure RE-GDA0002442591320000132
表7雏鸭注射三联高免卵黄抗体后星状病毒中和抗体的变化情况
Figure RE-GDA0002442591320000133
Figure RE-GDA0002442591320000141
表8雏鹅注射三联高免卵黄抗体后星状病毒中和抗体的变化情况
Figure RE-GDA0002442591320000142
结果显示，本发明制得的呼肠孤病毒、细小病毒和星状病毒三价卵黄抗体免疫后产生的中和抗体效价高且持续时间长。
试验例六、呼肠孤病毒、细小病毒和星状病毒三价卵黄抗体攻毒动物保护试验
取1日龄雏鸭50只，分为5组，每组10只，分别为实施例2、对比例1-3 和对照组，各组分别肌肉注射呼肠孤病毒液1mL(107TCID50/mL)，在攻毒48小时，分别肌肉注射实施例2、对比例1-3制得的卵黄抗体0.5mL/只，对照组注射生理盐水。连续观察15天，统计各组卵黄抗体的保护率，并观察雏鸭的状态，结果见下表9所示。
表9卵黄抗体液攻毒动物保护试验结果
Figure RE-GDA0002442591320000151
取1日龄雏鹅50只，分为5组，每组10只，分别为实施例2、对比例1-3 和对照组，各组分别肌肉注射呼肠孤病毒液1mL(107TCID50/mL)，在攻毒48小时，分别肌肉注射实施例2、对比例1-3制得的卵黄抗体1mL/只，对照组注射生理盐水。连续观察15天，统计各组卵黄抗体的保护率，并观察雏鹅的状态，结果见下表10所示。
表10卵黄抗体液攻毒动物保护试验结果
Figure RE-GDA0002442591320000152
取1日龄雏鸭50只，分为5组，每组10只，分别为实施例2、对比例1-3 和对照组，各组分别肌肉注射细小病毒液1mL(107TCID50/mL)，在攻毒48小时，分别肌肉注射实施例2、对比例1-3制得的卵黄抗体0.5mL/只，对照组注射生理盐水。连续观察15天，统计各组卵黄抗体的保护率，并观察雏鸭的状态，结果见下表11所示。
表11卵黄抗体液攻毒动物保护试验结果
Figure RE-GDA0002442591320000161
取1日龄雏鹅50只，分为5组，每组10只，分别为实施例2、对比例1-3 和对照组，各组分别肌肉注射细小病毒液1mL(107TCID50/mL)，在攻毒48小时，分别肌肉注射实施例2、对比例1-3制得的卵黄抗体0.5mL/只，对照组注射生理盐水。连续观察15天，统计各组卵黄抗体的保护率，并观察雏鹅的状态，结果见下表12所示。
表12卵黄抗体液攻毒动物保护试验结果
Figure RE-GDA0002442591320000162
Figure RE-GDA0002442591320000171
取1日龄雏鸭50只，分为5组，每组10只，分别为实施例2、对比例1-3 和对照组，各组分别肌肉注射星状病毒液1mL(107TCID50/mL)，在攻毒48小时，分别肌肉注射实施例2、对比例1-3制得的卵黄抗体0.5mL/只，对照组注射生理盐水。连续观察15天，统计各组卵黄抗体的保护率，并观察雏鸭的状态，结果见下表13所示。
表13卵黄抗体液攻毒动物保护试验结果
Figure RE-GDA0002442591320000172
取1日龄雏鹅50只，分为5组，每组10只，分别为实施例2、对比例1-3 和对照组，各组分别肌肉注射星状病毒液1mL(107TCID50/mL)，在攻毒48小时，分别肌肉注射实施例2、对比例1-3制得的卵黄抗体0.5mL/只，对照组注射生理盐水。连续观察15天，统计各组卵黄抗体的保护率，并观察雏鹅的状态，结果见下表14所示。
表14卵黄抗体液攻毒动物保护试验结果
Figure RE-GDA0002442591320000173
Figure RE-GDA0002442591320000181
结果显示，本发明实施例2制得的卵黄抗体对呼肠孤病毒、细小病毒和星状病毒攻毒的雏鸭和雏鹅具有较好的保护作用，保护率达100％，而对比例1和2 的保护率仅为40％和30％，表明β-环糊精和聚乙二醇15-羟基硬脂酸酯均可有效提高卵黄抗体回收率、纯度，提高效价活性。由对比例3可知，以纯化水替换 pH为4.8的醋酸盐缓冲液，会导致制得的卵黄抗体保护率降低，仅为70％，表明醋酸盐缓冲液对提高卵黄抗体的纯度具有一定的作用，同时表明，仅且当在 pH为4.8的醋酸盐缓冲液环境下，聚乙二醇15-羟基硬脂酸酯才能充分发挥作用。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明做了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (8)

1.一种三价卵黄抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、利用鸭呼肠孤病毒、鸭细小病毒和鸭星状病毒三联灭活疫苗免疫100日龄的海兰褐鸡，获得高免鸡蛋，去蛋清，用75％酒精进行表面消毒，得高免鸡蛋蛋黄；
S2、收集步骤S1获得的高免鸡蛋蛋黄，去除卵黄膜和系带后利用胶体磨进行破碎，得蛋黄液；
S3、将步骤S2得到的蛋黄液与0.1mol/L的pH为7.2～7.4的醋酸盐缓冲溶液以1：6～8的体积比混合，然后向其中加入总体积0.05～0.1％的聚乙二醇15-羟基硬脂酸酯，搅拌混合均匀，然后加入总体积0.3～0.5％的β-环糊精，充分搅拌，4℃静置1～2h，充分平衡后在4℃，4000r/min离心15～20min，收集上清液；
S4、将步骤S3收集的上清液进行纯化、浓缩，无菌处理，即得。
2.如权利要求1所述的三价卵黄抗体的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述的鸭呼肠孤病毒、鸭细小病毒和鸭星状病毒三联灭活疫苗用传代细胞系LMH细胞生产。
3.如权利要求1所述的三价卵黄抗体的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述高免鸡蛋蛋黄的具体制备方法为：给100日龄的海兰褐鸡皮下注射1mL鸭呼肠孤病毒、鸭细小病毒和鸭星状病毒三联灭活疫苗免疫，共免疫3次，每相邻两次免疫的时间间隔为21d，在最后一次免疫后5d收集鸡蛋，即得。
4.如权利要求1所述的三价卵黄抗体的制备方法，其特征在于，步骤S2中所述蛋黄液的具体制备方法为：将高免鸡蛋用75％酒精进行表面消毒，分离出蛋黄，过60目尼龙筛，去除卵黄膜和系带，然后置于胶体磨中研磨4～6min，即得。
5.如权利要求1所述的三价卵黄抗体的制备方法，其特征在于，步骤S3中所述醋酸盐缓冲液的制备过程为：每1000mL纯化水中溶解0.886g乙酸钠和2.82ml冰乙酸，然后利用1mol/L的NaOH溶液调节pH至4.8。
6.如权利要求1所述的三价卵黄抗体的制备方法，其特征在于，步骤S3中所述聚乙二醇15-羟基硬脂酸酯的终浓度为0.6～1.2％；所述β-环糊精的终浓度为1.0～2.0％。
7.如权利要求6所述的三价卵黄抗体的制备方法，其特征在于，步骤S3中所述聚乙二醇15-羟基硬脂酸酯的终浓度为0.8％；所述β-环糊精的终浓度为1.2％。
8.如权利要求1所述的三价卵黄抗体的制备方法，其特征在于，步骤S4中所述无菌处理具体操作为：将经纯化、浓缩后得到的浓缩液使用过滤精度为0.45μm的筒式滤芯精滤，再用过滤精度为0.20μm的筒式滤芯过滤除菌，无菌操作分装，即得。
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