CN110590946B - 一种鸭呼肠孤病毒卵黄抗体的制备方法 - Google Patents

一种鸭呼肠孤病毒卵黄抗体的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鸭呼肠孤病毒卵黄抗体的制备方法，其包括以下步骤：(1)利用鸭呼肠孤病毒灭活疫苗免疫育龄母鸡，获得高免鸡蛋；(2)收集高免鸡蛋蛋黄，去除卵黄膜和系带后利用胶体磨进行破碎，得蛋黄液；(3)将步骤(2)得到的蛋黄液与纯化水以1:1～3的体积比混合，搅拌均匀后加入终浓度重量体积比为1～3％的柠檬酸及1～4％的聚阴离子纤维素，充分搅拌后，低温放置3～6h，1～5℃离心，收集上清液；(4)将步骤(3)收集的上清液过滤除菌后即得卵黄抗体液。本发明所公开的鸭呼肠孤病毒卵黄抗体的制备方法，步骤简单，效率及得率高，添加少，经济适用。

Description

一种鸭呼肠孤病毒卵黄抗体的制备方法
技术领域
本发明涉及一种鸭呼肠孤病毒卵黄抗体的制备方法。
背景技术
鸭呼肠孤病毒目前是世界上的研究热点，对鸭具有致病性，主要病变表现为脾脏坏死和肝脏出血，该病可直接引发养鸭场15日龄以内的雏鸭出现30％以上的死亡率，此外其临床上也常常与鸭疫李默是杆菌，大肠杆菌和鸭星状病毒等并发感染，导致种蛋鸭出现明显呼吸道病，关节炎，及严重的产蛋下降及畸形蛋等问题。因此目前该病已经成为严重影响养鸭场生产性能的重大疫病之一。
卵黄抗体(IgY)是母禽被外来抗原刺激后，母禽血液中免疫球蛋白转移至其卵黄中对子代产生保护性作用的免疫球蛋白，是在卵黄内所产生的特异性抗体，其浓度远高于血清，并具有高度稳定性和生物学活性，这使应用卵黄抗体防病治病成为可能。
如CN108912227A公开了一种抗鸭呼肠孤病毒的卵黄抗体及其制备方法和应用，制备方式为由高免蛋收集卵黄，经一次灭活、酸化萃取、二次灭活、粗滤、除菌过滤、浓缩和三次灭活后制备成防治新型鸭呼肠孤病毒的卵黄抗体。操作流程复杂，耗时长。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种纯度、收率高，活性强、易于制备与应用且经济的鸭呼肠孤病毒卵黄抗体的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明公开一种鸭呼肠孤病毒卵黄抗体的制备方法，其包括以下步骤：
(1)利用鸭呼肠孤病毒灭活疫苗免疫育龄母鸡，获得高免鸡蛋；
(2)收集高免鸡蛋蛋黄，去除卵黄膜和系带后利用胶体磨进行破碎，得蛋黄液；
(3)将步骤(2)得到的蛋黄液与纯化水以1:1～3的体积比混合，搅拌均匀后加入终浓度重量体积比为1～3％的柠檬酸及1～4％的聚阴离子纤维素，充分搅拌后，1～5℃放置3～6h，1～5℃离心，收集上清液；
(4)将步骤(3)收集的上清液过滤除菌后即得卵黄抗体液。
所述步骤(3)蛋黄液与纯化水以1:2的体积比混合；搅拌均匀后加入终浓度重量体积比为1.5％的柠檬酸及2％的聚阴离子纤维素；低温放置温度为3℃，放置时间为5小时；低温离心条件为3℃11000r/min离心25分钟。
所述步骤(1)中的鸭呼肠孤病毒灭活疫苗，其为用传代细胞系LMH细胞生产的鸭呼肠孤病毒灭活疫苗。
所述步骤(2)蛋黄液的获得优选为：将高免鸡蛋用75％酒精进行表面消毒，分离出蛋黄，过60目尼龙筛去除卵黄膜和系带，然后置于胶体磨中研磨5min，即得蛋黄液。
本发明所公开的鸭呼肠孤病毒卵黄抗体的制备方法，步骤简单，效率及得率高。聚阴离子纤维素(Polyanionic cellulose，PAC)是由天然纤维素经化学改性而制得的水溶性纤维素醚类衍生物，是一种重要的水溶性纤维素醚，主要原料是精制棉，本身无药理作用，于生理无害。本发明技术人员意外发现，其与柠檬酸组合可在高浓度液体中有效去除蛋黄中的其它成分，蛋黄液不需要加入过多的纯化水稀释，制得的卵黄抗体液无需浓缩即有较高的浓度，极大的简化了操作流程，灭活、萃取、除杂质、无需浓缩一步到位。此制备方法耗时短，操作全程都维持在较低的温度，良好的保留了所制备卵黄抗体的活力，且极低浓度柠檬酸、PAC于生理无害，可应用于注射剂，无需额外除去残留即可使用。所得的卵黄抗体纯度高，活力好，并可在胃肠道中保持较好的活性，免疫方式除注射给药，也可与饲料混合口服给药，均可提供较好的免疫保护，经济适用。
具体实施方式
以下通过具体实施例再对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅局限于以下的实施例。在不脱离本发明上述技术思想的情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的各种替换或变更，均应包括在本发明的范围内。
用于免疫的鸭呼肠孤病毒灭活疫苗可采用市售或自行制备，自行制备可应用现有的常规方法，不影响发明效果的实现。以下实施例所用的免疫鸭呼肠孤病毒灭活疫苗采用如下方式制备：
(1)传代细胞系LMH细胞的制备：将LMH细胞用0.025％EDTA-胰酶消化分散传代，用含5～10％新生牛血清和适量双抗的DMEM培养液在37℃、5％CO2培养箱中培养；
(2)种毒繁殖：用鸭呼肠孤病毒毒种按终体积1:200接种到步骤1制备的LMH细胞中，并在37℃吸附30分钟后吸弃病毒液，在用含1～2％新生牛血清、适量双抗和2mM谷氨酰胺的DMEM培养液于37℃、5％CO2培养至58±2小时；
(3)病毒收集、浓缩和纯化：LMH细胞出现80％细胞病变时，收获细胞毒液于-20℃反复冻融两次，5000rpm，4℃离心10min后收集上清液，即病毒原液，对上清病毒液进行效价测定，其效价可高达107.0/0.1mL；将病毒原液通过50K的中空纤维柱超滤浓缩10倍，即为制苗病毒液；
(4)病毒含量测定：将制苗病毒液用DMEM培养液做10倍系列稀释，取10-5、10-6、10-7、10-8、10-95个稀释度接种48孔铺满单层LMH细胞培养板，每个稀释度重复5孔，同时设立阴性对照细胞孔；每孔0.1mL，37℃吸附30min后，补加含1～2％新生牛血清、适量双抗和2mM谷氨酰胺的DMEM培养液0.3mL于37℃、5％CO2培养120小时，，观察细胞病变(CPE)，计算TCID50，每0.1mL病毒含量108.0TCID50以上，方可用于制备疫苗；
(5)病毒灭活：采用0.1％福尔马林灭活制苗病毒液，即为疫苗抗原；
(6)疫苗成品的配制：
①油相制备：取优质注射用白油94份，硬脂酸铝2份，司班-80 4份，先将白油缓慢加温，加入4％的司班-80和2％的硬脂酸铝，边搅边加温，直到硬脂酸铝充分溶解至透明为止，高压灭菌备用；
②水相制备：取疫苗抗原96份加入灭菌后的吐温-80 4份，开始搅拌，使吐温-80完全溶解为止，制成水相；
③乳化：利用IKA乳化剂进行乳化，16000rpm，乳化5分钟即可；
④分装：将制备的疫苗按照每瓶250mL进行分装。
实施例1
制备方法：
(1)利用鸭呼肠孤病毒灭活疫苗免疫100日龄的海兰褐鸡，获得高免鸡蛋，具体为：给100日龄的海兰褐鸡皮下注射1mL鸭呼肠孤病毒灭活疫苗免疫，共免疫3次，每相邻两次免疫的时间间隔为21d，在最后一次免疫后5d收集鸡蛋，即得高免鸡蛋；
(2)将高免鸡蛋用75％酒精进行表面消毒，水清洗干净，分离出蛋黄，过60目尼龙筛去除卵黄膜和系带蛋黄，破碎得蛋黄液；
(3)将步骤(2)得到的蛋黄液与纯化水以1:1的体积比混合，搅拌均匀后加入重量体积比为1％的柠檬酸及4％的聚阴离子纤维素，充分搅拌后，5℃放置6h，1℃10000r/min离心20min，收集上清液；
(4)将步骤(3)收集的上清液过滤除菌后即得卵黄抗体液。
实施例2
制备方法：
(1)利用鸭呼肠孤病毒灭活疫苗免疫100日龄的海兰褐鸡，获得高免鸡蛋，具体为：给100日龄的海兰褐鸡皮下注射1mL鸭呼肠孤病毒灭活疫苗免疫，共免疫3次，每相邻两次免疫的时间间隔为21d，在最后一次免疫后5d收集鸡蛋，即得高免鸡蛋；
(2)高免鸡蛋用75％酒精进行表面消毒，分离出蛋黄，过60目尼龙筛去除卵黄膜和系带，然后置于胶体磨中研磨5min，即得蛋黄液；
(3)将步骤(2)得到的蛋黄液与纯化水以1:3的体积比混合，搅拌均匀后加入重量体积比为3％的柠檬酸及1％的聚阴离子纤维素，充分搅拌后，1℃放置6h，5℃11000r/min离心30min，收集上清液；
(4)将步骤(3)收集的上清液过滤除菌后即得卵黄抗体液。
实施例3
制备方法：
(1)利用鸭呼肠孤病毒灭活疫苗免疫100日龄的海兰褐鸡，获得高免鸡蛋，具体为：给100日龄的海兰褐鸡皮下注射1mL鸭呼肠孤病毒灭活疫苗免疫，共免疫3次，每相邻两次免疫的时间间隔为21d，在最后一次免疫后5d收集鸡蛋，即得高免鸡蛋；
(2)高免鸡蛋用75％酒精进行表面消毒，分离出蛋黄，过60目尼龙筛去除卵黄膜和系带，然后置于胶体磨中研磨5min，即得蛋黄液；；
(3)将步骤(2)得到的蛋黄液与纯化水以1:2的体积比混合，搅拌均匀后加入终浓度重量体积比为1.5％的柠檬酸及2％的聚阴离子纤维素，充分搅拌后，3℃，放置3小时；3℃11000r/min离心25分钟，收集上清液；
(4)将步骤(3)收集的上清液过滤除菌后即得卵黄抗体液。
实施例4
制备方法：
(1)利用鸭呼肠孤病毒灭活疫苗免疫100日龄的海兰褐鸡，获得高免鸡蛋，具体为：给100日龄的海兰褐鸡皮下注射1mL鸭呼肠孤病毒灭活疫苗免疫，共免疫3次，每相邻两次免疫的时间间隔为21d，在最后一次免疫后5d收集鸡蛋，即得高免鸡蛋；
(2)高免鸡蛋用75％酒精进行表面消毒，分离出蛋黄，过60目尼龙筛去除卵黄膜和系带，然后置于胶体磨中研磨5min，即得蛋黄液；；
(3)将步骤(2)得到的蛋黄液与纯化水以1:2的体积比混合，搅拌均匀后加入终浓度重量体积比为1.5％的柠檬酸及2％的聚阴离子纤维素，充分搅拌后，3℃，放置5小时；3℃11000r/min离心25分钟，收集上清液；
(4)将步骤(3)收集的上清液用0.22μm滤膜过滤除菌后即得卵黄抗体液。
对比例1样品通过除步骤(3)不加聚阴离子纤维素，其它操作同实施例4步骤所制备。
对比例2样品通过除步骤(3)中不加柠檬酸，其它操作同实施例4步骤所制备。
对比例3样品通过如下步骤制备：
(1)蛋壳消毒：收集高免鸡蛋浸泡于1％新洁尔灭溶液中15min。取出后自然晾干或吹干后，喷洒75％的酒精对蛋壳表面消毒备用。
(2)卵黄分离：采取机械打蛋方式，打蛋时应充分除去蛋清、胚盘和系带，收集卵黄。
(3)灭活Ⅰ:将收集的蛋黄充分搅拌，使蛋黄呈均匀膏状，启动蠕动泵，将蛋黄液泵入夹层反应罐中，加入与蛋黄等体积的注射用水,搅拌混匀后，60～65℃保温(灭活)30min。
(4)酸化萃提：先在隔离反应罐中加入相当于原蛋黄3倍体积的pH值5.0的醋酸缓冲液，然后加入卵黄液，开启搅拌机，充分拌搅30分钟。
(5)灭活Ⅱ：卵黄液液中加入终浓度(V/V)为4％的辛酸作灭活剂和萃提剂，剧烈搅拌90min，2～8℃放置4～8小时。
(6)粗滤：用丙纶750B滤布过滤后，再用柱芯滤器过滤至澄清。
(7)除菌过滤：用0.22μm滤膜过滤除菌。
(8)浓缩：用30～50KD的浓缩膜包进行适当倍数的超滤浓缩，浓缩至实施例四等体积。
(9)灭活Ⅲ：将浓缩后的溶液导入灭活罐中，计量加入10％的甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，甲醛溶液的最终浓度(V/V)为0.1％，37℃灭活16小时。
本发明以上实施例所制备的鸭呼肠孤病毒卵黄抗体的试验测试结果如下：
1)以上实施例所制备的鸭呼肠孤病毒卵黄抗体的质量控制：根据《中华人民共和国兽用生物制品规程》其进行无菌检验、支原体检验、外源性病毒检测，结果显示实施例样品均未检出。
2)以上实施例所制备的鸭呼肠孤病毒卵黄抗体的纯度检测：采用SDS-PAGE分别检测实施例1-4、对比例1-3制得的卵黄抗体纯度，结果显示，实施例的纯度高于对比例。
3)以上实施例所制备的鸭呼肠孤病毒卵黄抗体的安全性试验：选用健康3日龄雏鸭将其分为8组，每组10只，分别肌肉注射和饲料拌食口服给药实施例1-4(肌肉注射1.5ml/只；口服给药6ml/只)，剩余一组作为空白对照组。结果显示，各组试验雏鸭的精神、食欲和饮欲均正常，注射部位皮肤和肌肉均无异常情况出现，在第10天进行解剖观察，内脏组织无明显的病变。表明本发明实施例1-4制备的卵黄抗体安全。
4)以上实施例所制备的鸭呼肠孤病毒卵黄抗体的抗体效价检测：在细胞培养上进行病毒中和试验，先将鸭呼肠孤病毒稀释成适当浓度，使每0.2ml含80个～100个PFU(空斑形成单位)，与不同稀释度的各实施例及对照例卵黄抗体等量混合，置37℃作用1.5h，分别测定PFU，使空斑减少50％卵黄抗体稀释度即为该卵黄抗体的中和效价。结果显示实施例样品中和效价高于对比例，具体见表1：
表1
组别 实施例1 实施例2 实施例3 实施例4 对照例1 对照例2 对照例3
中和效价 1:622 1:598 1:644 1:646 1:412 1:488 1:512
5)以上实施例所制备的鸭呼肠孤病毒卵黄抗体的免疫保护试验：取3日龄雏鸭140只，分为14组，每组10只。各组同步进行强毒攻击，0日起分别肌肉注射鸭呼肠孤病毒病毒株0.5ml/只(107TCID50/mL)，持续3天，第2日分别肌肉注射和饲料拌食口服给药实施例1-4及对照例1-3，对照组1注射生理盐水，对照组2空白。连续观察20天，统计各组卵黄抗体的保护率，结果显示实施例样品免疫保护效果优于对比例，具体见表2：
表2
Figure BDA0002184084660000061

Claims (7)

1.一种鸭呼肠孤病毒卵黄抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)利用鸭呼肠孤病毒灭活疫苗免疫育龄母鸡，获得高免鸡蛋；
(2)收集高免鸡蛋蛋黄，去除卵黄膜和系带后利用胶体磨进行破碎，得蛋黄液；
(3)将步骤(2)得到的蛋黄液与纯化水以1:1～3的体积比混合，搅拌均匀后加入终浓度重量体积比为1～3％的柠檬酸及1～4％的聚阴离子纤维素，充分搅拌后，1～5℃放置3～6h，1～5℃离心，收集上清液；
(4)将步骤(3)收集的上清液过滤除菌后即得卵黄抗体液。
2.如权利要求1所述的鸭呼肠孤病毒卵黄抗体的制备方法，特征在于，所述步骤(3)中蛋黄液与纯化水以1:2的体积比混合。
3.如权利要求1所述的鸭呼肠孤病毒卵黄抗体的制备方法，特征在于：所述步骤(3)中搅拌均匀后加入终浓度重量体积比为1.5％的柠檬酸及2％的聚阴离子纤维素。
4.如权利要求1所述的鸭呼肠孤病毒卵黄抗体的制备方法，特征在于：所述步骤(3)中低温放置温度为3℃，放置时间为5小时。
5.如权利要求1所述的鸭呼肠孤病毒卵黄抗体的制备方法，特征在于：所述步骤(3)低温离心条件为3℃11000r/min离心25分钟。
6.如权利要求1所述的鸭呼肠孤病毒卵黄抗体的制备方法，特征在于：所述步骤(1)中的鸭呼肠孤病毒灭活疫苗，其为用传代细胞系LMH细胞生产的鸭呼肠孤病毒灭活疫苗。
7.如权利要求1所述的鸭呼肠孤病毒卵黄抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)蛋黄液的获得为：将高免鸡蛋用75％酒精进行表面消毒，分离出蛋黄，过60目尼龙筛去除卵黄膜和系带，然后置于胶体磨中研磨5min，即得蛋黄液。
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