CN103833848A - 一种用于预防治疗番鸭细小病毒病的卵黄抗体 - Google Patents

Abstract

发明的目的是提供一种用于预防治疗番鸭细小病毒病的卵黄抗体，是用保藏编号为CGMCC No.8504的番鸭细小病毒作为抗原制备的。本发明用番鸭细小病毒YBMDP株接种番鸭胚，分别收获死亡胚胚体和胚液，经研磨、冻融后收取病毒液，经超滤浓缩、甲醛溶液灭活后，加油佐剂混合乳化制成疫苗。用此疫苗接种产蛋鸡，收获鸡蛋，分离蛋黄，灭活、萃提精制得到抗体。制备的抗体能预防番鸭细小病毒引起的雏鸭细小病毒感染，此卵黄抗体具有高效、安全性好、保护率高等优点。

Description

一种用于预防治疗番鸭细小病毒病的卵黄抗体

技术领域

本发明属于兽用生物制品领域，具体涉及一种用于预防治疗番鸭细小病毒病的卵黄抗体。

背景技术

番鸭细小病毒病是侵害雏番鸭的一种急性或亚急性传染病，它具有高度传染性，发病率和死亡率都很高，常造成严重的经济损失，主要发生于1～3周龄的雏番鸭，尤其是10日龄左右的雏番鸭，3周龄以上基本不发病。雏番鸭以喘气、腹泻及胰脏坏死和出血为主要特征的传染病。本病最早于20世纪80年代中后期出现于中国福建和法国西部Brittany地区，20世纪90年代初才认识到它是不同于小鹅瘟的独立疾病，死亡率高达80%。对死亡的番鸭如果处理不当，往往造成病毒的蔓延，产生更大的危害，目前市场上有预防该病的活疫苗，但而尚无快速有效的药物或方法来防治番鸭细小病毒病。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于预防治疗番鸭细小病毒病的卵黄抗体，提供的卵黄抗体具有效价高、保护率高、安全性好等优点。

本发明所提供的用于预防治疗番鸭细小病毒病的卵黄抗体，是用保藏编号为CGMCC No.8504的番鸭细小病毒作为抗原制备的。

该保藏编号为CGMCC No.8504的番鸭细小病毒，为YBMDV株，已于2013年11月08日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

本发明的卵黄抗体，其制备包括如下的步骤

1）用番鸭细小病毒作为抗原，制成灭活疫苗；

2)将制备的灭活疫苗注射免疫产蛋鸡，来获得用番鸭细小病毒免疫后的鸡蛋；

3）将免疫后的鸡蛋收集卵黄用酸化水-辛酸的方法萃提、灭活制成卵黄抗体。

本发明用番鸭细小病毒YBMDP株接种番鸭胚，分别收获死亡胚胚体和胚液，经研磨、冻融后收取病毒液，经超滤浓缩、甲醛溶液灭活后，加油佐剂混合乳化制成疫苗。用此疫苗接种产蛋鸡，收获鸡蛋，分离蛋黄，灭活、萃提精制得到抗体。制备的抗体能预防番鸭细小病毒引起的雏鸭细小病毒感染，此卵黄抗体具有高效、安全性好、保护率高等优点。

具体实施方式

本发明使用的抗原为番鸭细小病毒YBMDP株，其信息如下:

一、YBMDV株的筛选

2011年从浙江省某鸭场爆发了急性的番鸭细小病毒病，取病死鸭的胰脏及肠道，将胰脏及肠道组织用无生理盐水匀浆制成20%悬液，3000r/min离心15min，取上清除菌后经尿囊腔分别接种13日龄番鸭胚，孵化120小时，收集尿囊液及胚体组织，经匀浆后，反复冻融3次，取上清液冻存。收获的病毒液经纯化后进行了病毒含量、免疫原性、特异性及纯净性等方面的病毒特性的分析检测，结果表明该毒株病毒含量为10^5.7ELD₅₀/0.2ml,最小免疫剂量为10^2.0ELD₅₀/0.2ml，该病毒仅与番鸭细小病毒发生特异性反应，无细菌、支原体及外源病毒污染，适合作为制苗用毒株。将筛选的病毒株于2013年11月08日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.8504。

对于本发明筛选的毒株的性状进行检测，结果表明，该株病毒属细小病毒，圆形无囊膜，直径在20μｍ左右、对乙醚、胰蛋白酶、酸不敏感，对红细胞无凝集现象。该病毒可引起雏番鸭发生以出血性肠炎为特征的急性败血性传染病。该毒株制备的疫苗免疫成年番鸭后，能保护免疫4个月内种番鸭所产子代免受流行毒株的攻击。该毒株作100倍稀释后，与等量雏番鸭细小病毒病抗血清中和，接种13日龄番鸭胚，结果表明，中和组番鸭胚全部健活，而病毒对照组番鸭胚全部死亡。

对筛选的YBMDV株的结构基因VP进行测序,结果VP全长为2199bp，编码732个氨基酸；NCBI的blast序列分析表明，YBMDV株的结构基因VP与已公开的番鸭细小病毒的VP存在差异位点，同源性为97.7％～98.3％（即存在着9-16个氨基酸的差异）。

实施例1

1.制苗用病毒液的制备将生产用毒种YBMDV株，尿囊腔接种12～14日龄易感番鸭胚，每胚0.2ml，36～37℃孵育，每日2次照胚检查。选择接种后48～120小时内死亡，且胚体有广泛出血，毛囊出血，肝脏变性和坏死，绒毛尿膜有轻度水肿的鹅胚，取其尿囊液及鹅胚体放入组织捣碎机中粉碎，取粉碎后的组织按1:2加入生理盐水混合；置2～8℃4～12小时，收取尿囊液、羊水及胚体（去掉头和四肢）。用胚液匀浆、冻融3次，4000r/min离心30min，取上清混合于无菌容器中，置2～8℃保存。（参见表1）。

表1:病毒液的制备

毒株名称	制苗材料	接种胚数（枚）	胚日龄	收获毒液（ml）
					YBMDP株	番鸭胚	100	13	1200

2.灭活将病毒液倒入灭活瓶内，计量加入10%甲醛溶液，使其充分混合，甲醛溶液的最终浓度为0.2%。加甲醛溶液后倒入另一灭活罐中，以避免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37℃灭活16小时后取出，置2～8℃保存。

3.疫苗半成品检验

（1）无菌检验取灭活的胚液，按现行《中国兽药典》附录进行，无菌生长。

（2）病毒含量测定将病毒液用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10^-2、10^-3、10^-4、10^-54个稀释度，分别尿囊腔接种12～14日龄易感番鸭胚，每胚0.2ml，同时设接种生理盐水对照5枚，每胚0.2ml。置36～37℃继续孵育，每日照胚2次，观察168小时。以鸡胚死亡并出现尿囊膜水肿增厚，头、颈、背部等全身出血性病变判为感染，计算ELD₅₀为10^4.7ELD₅₀/0.2ml。

（3）灭活检验将病毒液尿囊腔接种12～14日龄易感番鸭胚10枚，每胚0.2ml，置36～37℃继续孵育，连续观察168小时，鸭胚均无死亡。

4.灭活疫苗的制备：经过检验合格后的半成品抗原进行疫苗制备（以下配制中各液体成分按体积比计，参见表2）。

（1）油相制备取兽用白油95份，硬脂酸铝1份，置于油相制备罐中加热至80℃后，再加司本－805份，至温度达到115℃时，维持30min，冷却后备用。

（2）水相制备将灭活检验合格的病毒液混合，检测每0.2ml水相中含YBMDP株病毒含量不低于10^4.0ELD₅₀。取灭菌后的吐温-805份，加入配液罐中，同时加混合抗原液95份，开动搅拌电机搅拌20～30min，使吐温-80完全溶解。

（3）乳化取油相2份放于高速剪切机内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份，以10000r/min，乳化5分钟。乳化后，取10ml，以3000r/min离心15分钟，管底无水相析出。

（4）分装定量分装，加盖密封。

表2：疫苗乳化和分装

5.疫苗成品检验

（1）性状

外观乳白色乳剂。

剂型油包水型，取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水，呈油滴状不扩散。

稳定性吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底无水相析出。

黏度按现行版《中国兽药典》附录进行，为58.6cp。

（2）装量检查按现行版《中国兽药典》附录进行,符合标准。

（3）无菌检验按现行版《中国兽药典》附录进行,无菌生长。

（4）安全检验用21日龄番鸭10只，每只颈部皮下注射疫苗2.0ml，同时设对照5只，在相同的条件下饲养，连续观察14日，试验番鸭全部健活,且均未出现任何因疫苗引起的局部和全身反应。

（5）效力检验用28日龄SPF鸡10只，每只颈部皮下注射疫苗，0.5ml/只，另取5只同日龄鸡不免疫作对照，免后21日，采血分离血清，测定番鸭细小病毒AGP抗体效价。免疫组10只鸡抗体效价均不低于为1:2，对照组5只鸡均为阴性。（参见表3）。

表3：疫苗效力检验结果

（6）甲醛残留量测定按现行版《中国兽药典》附录进行测定，甲醛残留量为0.07%。

实施例2：番鸭细小病毒卵黄抗体制备

1.疫苗免疫蛋的制备

将上述制备的番鸭细小病毒灭活疫苗免疫蛋鸡，首次免疫每只鸡颈部皮下注射1羽份番鸭细小病毒病活疫苗，14天后进行第二次免疫，每只鸡颈部皮下注射2.0ml灭活疫苗，二免后14天进行第三次免疫，每只鸡颈部皮下注射2.0ml灭活疫苗，三免后14天进行第三次免疫,每只鸡颈部皮下注射2.0ml灭活疫苗，第四次免疫之后14天，采集卵黄测定番鸭细小病毒AGP抗体效价为1:64。

2.卵黄抗体制造（参见表4）

（1）蛋壳消毒将20kg疫苗免疫蛋（高免蛋）浸入1%的TH4+溶液中浸泡消毒5min。取出消毒后的鸡蛋自然晾干或吹干，喷洒75%的酒精对蛋壳表面消毒后备用。

（2）卵黄分离采取机械打蛋。打蛋时应充分除去蛋清、胚盘和系带，收集卵黄。

（3）灭活Ⅰ将收集的蛋黄充分搅拌，使蛋黄呈均匀膏状，启动蠕动泵，将蛋黄液泵入夹层反应罐中，加入与蛋黄等体积的注射用水（注射用水先经80℃30min消毒，并冷却至65℃以下），搅拌混匀后，60～65℃保温（灭活）30min。

（4）酸化萃提先在隔离反应罐中加入相当于原蛋黄4倍体积冷却至4℃的注射用水,然后加入卵黄液，开启搅拌机搅拌,混匀后用1mol/L盐酸调pH值至5.4,2～8℃静置12小时。酸化完成后，

6000r/min离心15min，离心后取上清液。

（5）灭活Ⅱ在分离的上清液中加入终浓度（V/V）为0.2%的辛酸作灭活剂和萃提剂，搅拌均匀，2～8℃放置4～8小时。

（6）粗滤用无菌滤布过滤后，再用柱芯滤器过滤至澄清。

（7）除菌过滤用0.22μm微孔芯过滤除菌。置2～8℃存放，应不超过14日。同时取样检测番鸭细小病毒AGP抗体效价。

（8）浓缩如检测的番鸭细小病毒AGP抗体效价低于1:64，应将除菌过滤后的卵黄抗体在2～8℃条件下，用30～50KD的浓缩膜包进行适当倍数的超滤浓缩，浓缩后的AGP抗体效价应均不低于1:64。

（9）灭活Ⅲ将过滤后的溶液导入灭活罐中，计量加入10%的甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，甲醛溶液的最终浓度（V/V）为0.1%，37℃灭活16小时。

（10）阻断灭活结束后，立即在灭活病毒液中加入过滤除菌的50%硫代硫酸钠溶液，使硫代硫酸钠溶液终含量（W/V）为2%，充分混合，取样后迅速置4℃保存。

表4：卵黄抗体制造及分装

实施例3：卵黄抗体成品检验

（1）性状本品为淡黄色的透明液体。pH值为7.1。

（2）装量检查按现行《中国兽药典》附录进行，符合规定。

（3）无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行，无菌生长。

（4）安全检验用1～3日龄易感雏番鸭10只，各肌肉分点注射本品2.0ml。观察14日，易感雏鸭全部健活。

（5）效力检验（参见表5）

1）血清学方法番鸭细小病毒病卵黄抗体效价均为1:64。

2）免疫攻毒法5日龄易感雏番鸭30只，随机分成A、B、C组，每组10只。A组为治疗组，B组为攻毒对照组，C组为空白对照组，A、B组以番鸭细小病毒强毒攻击，攻毒24h，治疗组注射卵黄抗体1mL/只，攻毒对照组注射生理盐水1mL/只，观察14d，治疗组10/10正常；攻毒组8/10死亡；健康对照组10/10正常。（参见表5）由此可见，卵黄抗体治疗组全部保护，治疗效果很明显。

表5：卵黄抗体效力检验结果

注:攻毒保护为攻毒后健康存活鸭数/攻毒鸭总数。

上述结果表明，本发明制备的卵黄抗体能够有效的预防治疗番鸭细小病毒的侵染。而且，相比于已有的番鸭细小病毒抗体，本发明的卵黄抗体对YBMDV株的免疫效果更好，推测是由于YBMDV株与已有的番鸭细小病毒的遗传背景上的差异造成的。

Claims (4)

1.一种卵黄抗体，其特征在于，所述的卵黄抗体是用番鸭细小病毒YBMDV株作为抗原制备的。 

2.如权利要求1所述的卵黄抗体，其特征在于，所述的番鸭细小病毒YBMDV株的番鸭细小病毒YBMDV株已于2013年11月08日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.8504。 

3.权利要求1所述的卵黄抗体，其制备包括如下的步骤 

1）用番鸭细小病毒作为抗原，制成灭活疫苗； 

2)将步骤1）制备的灭活疫苗注射免疫产蛋鸡，来获得用番鸭细小病毒免疫后的鸡蛋； 

3）将免疫后的鸡蛋收集卵黄用酸化水-辛酸的方法萃提、灭活后制成卵黄抗体。 

4.权利要求1所述的卵黄抗体用于预防治疗番鸭细小病毒病。