CN102827275B

CN102827275B - 鸭病毒性肝炎二价精制卵黄抗体的制备方法

Info

Publication number: CN102827275B
Application number: CN201210336595.9A
Authority: CN
Inventors: 徐保娟; 宫晓; 郭伟伟; 王龙; 孙健; 胡潇
Original assignee: Qingdao Yebio Bioengineering Co Ltd
Current assignee: Qingdao Yebio Bioengineering Co Ltd
Priority date: 2012-09-12
Filing date: 2012-09-12
Publication date: 2014-03-05
Anticipated expiration: 2032-09-12
Also published as: CN102827275A

Abstract

本发明涉及鸭病毒性肝炎二价精制卵黄抗体的生产方法。本发明从鸭肝炎病毒优势流行毒株中筛选出免疫原性良好的鸭肝炎病毒1型YBH1株和新型YBHX株疫苗制备毒株，分别接种鸡胚和鸭胚，分别收获死亡胚胚体和胚液，经研磨、冻融后收取病毒液，经超滤浓缩、甲醛溶液灭活后，加油佐剂混合乳化制成疫苗。用此疫苗接种产蛋鸡，收获高免鸡蛋，分离蛋黄，灭活、萃提精制而成，能同时预防由1型和新型鸭肝炎病毒引起的鸭病毒性肝炎，此卵黄具有高效、安全性好、保护率高等优点。

Description

鸭病毒性肝炎二价精制卵黄抗体的制备方法

技术领域

本发明涉及一种用于预防由1型和新型鸭病毒性肝炎二价精制卵黄抗体的制备方法，属于兽用生物制品领域。

背景技术

鸭病毒性肝炎（duck viral hepatitis,DVH）是由鸭肝炎病毒（duck hepatitis virus,DHV）引起雏鸭的一种以肝脏为主要病理变化的急性、高度致死性、接触性传染病。临床表现痉挛、抽搐和角弓反张等神经症状，以肝脏肿胀和出血为特征性病变。1～3周龄的雏鸭易感，发病严重，传播迅速，雏鸭通常出现症状后的1小时内死亡，10日龄雏鸭感染后死亡率90～95%，已经成为严重危害养鸭业的主要疾病之一。

鸭肝炎病毒（DHV）血清型DHV有4个独立的血清型，1型、2型、3型和新型。范书才等（范书才，李虹，袁率珍等.新型鸭肝炎病毒的分离鉴定.中国预防兽医学报,2009,10）通过试验证明目前在我国同时存在1型和新型DHV流行。血清中和试验表明，1型和新型之间缺乏交叉保护作用。在4个型的DHV中，1型与新型DHV流行最广泛，毒力最强；对3周龄内的雏鸭致死率可在80%以上。2型DHV仅在英国，3型仅在美国有报道；二者均呈散发性流行，致死率低（约20%）。目前国内、外尚无商品化的二价卵黄抗体，由于1型和新型之间无交叉保护作用，1型卵黄抗体很难对流行的新型鸭肝炎病毒进行预防，因此研制1型和新型二价卵黄抗体是预防和控制鸭病毒性肝炎的必然要求，针对此要求我们研制了鸭病毒性肝炎1型和新型二价精制卵黄抗体。

卵黄抗体是指从免疫禽蛋中提取出的针对特定抗原的抗体，由于卵黄中仅有IgG类抗体，故称其为卵黄免疫球蛋白IgG(egg yolkimmunoglobulins)，简称为IgY。卵黄抗体的研究始于19世纪末，1893年，Klemperer发现了卵黄中富含抗体；1934年Jukes的实验证明母鸡血清中的抗体可以转移到卵黄中，从而为雏鸡提供被动免疫保护。Patters等的试验证实，相对别的血浆蛋白，IgG被选择性的转运到卵泡中。1969年，Leslie和Clem将这种抗体命名为IgY。

卵黄抗体的形成过程是：当机体受到外界特异性抗原(尤其是灭活抗原)的刺激后诱发一系列的免疫应答反应，激发B细胞分化成能分泌特异性抗体的浆细胞，分泌大量的特异性抗体进入血液中。同时在产蛋禽体内，血液中的特异性抗体IgG(所有亚群)由卵巢IgG受体的介导逐步进入到卵巢滤泡和输卵管中，并在卵黄中蓄积起来，也正是由于这种卵黄累积作用，使卵黄中的IgG明显地高于血清中的含量，而血清中的其他抗体(主要是IgM，IgA)与输卵管中的卵白白蛋白一起混入到鸡蛋白中。

卵黄抗体在多种环境中有较高的稳定性，在低于75℃条件下，卵黄抗体具有良好的热稳定性，90℃处理15min后，大部分卵黄抗体丧失结合活性，在pH＜4时，仅有少量卵黄抗体失去活性。在pH4-12范围内，卵黄抗体的活性几乎不受影响，在pH＞12时，卵黄抗体迅速失去结合活性。实验表明，卵黄抗体具有耐受反复冻融的特性，即使经过5次冻融，其抗原结合活性几乎不受影响。在室温下可保存6个月，4℃保存可达5年以上，活性仅下降5％左右。由于具有这些稳定的理化性质，所以其的开发应用备受人们所关注。

对于鸭病毒性肝炎的预防和治疗，目前除了加强消毒和疫苗免疫外，抗体免疫也在控制该病的流行中发挥着重要作用。由于卵黄抗体成本比较低且比较容易获得，所以已广泛使用于一些疾病的预防和治疗。但由于卵黄中含有大量的脂质，给使用带来许多不便，所以人们采取各种办法从卵黄中提取分离IgY。常用的方法有聚乙二醇、硫酸葡聚糖、有机溶剂、水稀释法、辛酸法等。在此基础上，我们进行了鸭病毒性肝炎二价精制卵黄抗的研制工作。研制结果表明，我们研制的卵黄抗体效价高，安全性好，保护率高，为预防鸭病毒性肝炎病奠定了坚实的基础。

发明内容

本发明的目的是制备1型和新型鸭肝炎病毒性的两种抗原，并进行合理配制成鸭病毒性肝炎1型和新型二价油乳剂灭活疫苗，用此疫苗接种产蛋鸡，收获高免鸡蛋，分离蛋黄，灭活、萃提精制而成，可同时预防由1型和新型鸭肝炎病毒引起的雏鸭病毒性肝炎，此卵黄具有抗体效价高、保护率高、安全性好等优点。

本发明所涉及的卵黄抗体含有抗鸭肝炎病毒1型YBH1株和新型YBHX株的抗体，可同时预防由1型和新型鸭肝炎病毒引起的雏鸭病毒性肝炎。

该卵黄抗体的主要相关内容和所采用的技术手段：

（1）选育的新毒株要经过血清学、分子生物学等试验进行大量的临床病料分析鉴定工作，最后选出效价高、免疫原性好制苗用毒株——鸭肝炎病毒1型YBH1株和新型YBHX株。

（2）在卵抗的生产过程中用超滤浓缩柱将卵抗经过超滤浓缩，使卵抗的效价高，保护率高。

（3）制备鸭病毒性肝炎二价精制卵黄抗体主要步骤为：

①用鸭肝炎病毒1型YBH1株和新型YBHX株作为疫苗生产毒株，制成鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗。

②将制备的二价灭活疫苗注射免疫产蛋鸡，制备高免蛋。

③将收集的高免蛋收集卵黄用酸化水-辛酸的方法萃提、灭活。

本发明详细描述

一、生产用毒株

制苗免疫原用鸭肝炎病毒（Duck hepatitis virus）1型YBH1株和新型YBHX株，均由青岛易邦生物公程有限公司分离、鉴定、保管和供应。国内分离株1型YBH1株和新型YBHX株（两型毒株均是2008年从山东省某鸭场病死鸭的肝脏中分离）,已于2012年08月15日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC No.6441、CGMCC No.6442。

二、疫苗（免疫原）的制备

1．制苗用病毒液的制备

（1）YBH1株病毒液制备将生产用毒种YBH1株作100倍稀释，尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚，每胚0.2ml，36～37℃孵育，每日2次照胚检查。接种后48～120小时内死亡的鸡胚，置2～8℃放置4～12小时后，收取尿囊液、羊水及胚体，胚体去掉头和四肢。用胚液匀浆后、冻融3次，4000r/min离心30min，取上清混合于无菌容器中，置2～8℃保存。

（2）YBHX株病毒液制备将生产用毒种YBHX株100倍稀释，尿囊腔接种12～13日龄易感鸭胚，每胚0.2ml，36～37℃孵育，每日2次照胚检查。接种后48～120小时内死亡的鸭胚，置2～8℃4～12小时，收取尿囊液、羊水及胚体（去掉头和四肢）。用胚液匀浆、冻融3次，4000r/min离心30min，取上清混合于无菌容器中，置2～8℃保存。

2．浓缩将收获的YBH1株和YBHX株病毒液在2～8℃条件下，用超滤浓缩机分别浓缩至原体积的1/3，按现行《中国兽药典》（中国兽药典委员会.中国人民共和国兽药典二○一○年版三部.中国农业出版社，2011，本发明以下简称“现行《中国兽药典》”）规定进行无菌检验，应无菌生长，并留样备测毒价。每0.2ml病毒含量均应不低于10^6.3ELD₅₀。浓缩后的胚液随即进行灭活。

3．灭活分别将浓缩后的YBH1株与YBHX株病毒液导入灭活罐内，计量加入10%甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，甲醛溶液的最终浓度为0.2%。加甲醛溶液后导入另一灭活罐中，以避免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37℃灭活16小时（以罐内温度达到37℃开始计时）后取出，置2～8℃保存，应不超过3个月。

4．鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗半成品检验

（1）无菌检验取灭活的浓缩胚液，按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验。

（2）病毒含量测定

浓缩后YBH1株病毒含量测定将浓缩后的病毒液用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10^-4、10^-5、10^-6、10^-74个稀释度，分别尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚5枚，每胚0.2ml。同时设接种生理盐水对照5枚，每胚0.2ml。置36～37℃继续孵育，每日照胚2次，观察168小时。以鸡胚死亡并出现尿囊膜水肿增厚，头、颈、背部等全身出血性病变判为感染，计算ELD50。

浓缩后YBHX株病毒含量测定将浓缩后的病毒液用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10^-4、10^-5、10^-6、10^-74个稀释度，分别尿囊腔接种12～13日龄易感鸭胚5枚，每胚0.2ml。同时设生理盐水对照，每胚0.2ml。置36～37℃继续孵育，每日照胚2次，观察168小时。以鸭胚死亡并出现尿囊膜水肿增厚，头、颈、背部等全身出血性病变判为感染，计算ELD50。

③灭活检验分别将YBH1株和YBHX株灭活后的病毒液尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚和12～13日龄易感鸭胚各10枚，每胚0.2ml，置36～37℃继续孵育，连续观察168小时。

5．灭活疫苗的制备：经过检验合格后的半成品抗原进行疫苗制备（以下配制中各液体成分按体积比计）。

油相制备取兽用白油94份，硬脂酸铝2份，置于油相制备罐中加热至80℃后，再加司本－806份，至温度达到115℃时，维持30min，冷却后备用。

水相制备将灭活检验合格的YBH1株和YBHX株病毒液适当比例混合，使每0.2ml水相中含YBH1株和YBHX株病毒含量均不低于10^6.1ELD₅₀。取灭菌后的吐温-804份，加入配液罐中，同时加混合抗原液96份，开动搅拌电机搅拌20～30min，使吐温-80完全溶解。

乳化取油相3份放于高速剪切机内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份，以10000r/min，乳化5分钟。乳化后，取10ml，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相≤0.5ml。

二、疫苗成品检验

（1）性状

外观疫苗应为乳白色乳剂，无杂质并且外包装应合格。

剂型为油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第1滴外，均应不扩散。

稳定性吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应不超过0.5ml。

黏度按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。

（2）装量检查按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。

（3）无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。

（4）安全检验用21～35日龄SPF鸡10只，每只颈部皮下注射疫苗2.0ml，同时设对照5只，在相同的条件下饲养，连续观察14日，记录试验鸡采食、饮水及临床情况。应不出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。

（5）效力检验用21～35日龄SPF鸡10只，每只颈部皮下注射疫苗，0.5ml/只，另取5只同日龄鸡不免疫作对照，免后21日，采血分离血清，分别测定1型和新型鸭肝炎病毒中和抗体效价。免疫组抗体效价，应均不低于1:64，对照组应均为阴性。

三、高免蛋的制备

1．免疫程序颈部皮下或肌肉注射

基础免疫：于开产前2～3周做基础免疫，1ml/只；

第2次免疫：基础免疫后2周，加强免疫，2ml/只；

第3次免疫：第2次免疫后2周，加强免疫2ml/只；

第4次免疫：第3次免疫后2周，加强免疫2ml/只；

第N次免疫：第4次免疫后，每隔6～8周，加强免疫，2ml/只。

2．高免蛋收集第4次免疫后第14日，测定卵黄中1型和新型鸭肝炎病毒的中和抗体效价。抗体效价均不低于1:1024为合格。收集高免鸡蛋，2～8℃贮存备用，贮存时间应不超过7日。

四、鸭病毒性肝炎卵黄抗体制造及检验

1．卵黄抗体制造

（1）将高免蛋浸入1%的TH4+溶液中浸泡消毒5min。取出消毒后的鸡蛋自然晾干或吹干，喷洒75%的酒精对蛋壳表面消毒后备用。

（2）卵黄分离采取机械打蛋。打蛋时应充分除去蛋清、胚盘和系带，收集卵黄。

（3）灭活Ⅰ将收集的蛋黄充分搅拌，使蛋黄呈均匀膏状，启动蠕动泵，将蛋黄液泵入夹层反应罐中，加入与蛋黄等体积的注射用水（注射用水先经80℃30min消毒，并冷却至65℃以下），搅拌混匀后，60～65℃保温（灭活）30min。

（4）酸化萃提先在隔离反应罐中加入相当于原蛋黄4倍体积冷却至4℃的注射用水。然后加入卵黄液，开启搅拌机搅拌。混匀后用1mol/L盐酸调pH值至5.4。2～8℃静置12小时。酸化完成后，6000r/min离心15min，离心后取上清液。

（5）灭活Ⅱ在分离的上清液中加入终浓度为0.2%（体积比）的辛酸作灭活剂和萃提剂，搅拌均匀，2～8℃放置4～8小时。

（6）粗滤用无菌滤布过滤后，再用柱芯滤器过滤至澄清。

（7）除菌过滤用0.22μm微孔芯过滤除菌。置2～8℃存放，应不超过14日。同时取样检测1型和新型鸭肝炎病毒的中和抗体效价。

（8）浓缩如检测的1型或新型鸭肝炎病毒的中和抗体效价低于1:256，应将除菌过滤后的卵黄抗体在2～8℃条件下，用30～50KD的浓缩膜包进行适当倍数的超滤浓缩，浓缩至原体积的1/3，浓缩后的1型和新型鸭肝炎病毒中和抗体效价应均不低于1:256。

（9）灭活Ⅲ将过滤后的溶液导入灭活罐中，计量加入10%的甲醛溶液，使其充分混合，甲醛溶液的最终浓度为0.1%，37℃灭活16小时。

（10）阻断灭活结束后，立即在灭活病毒液中加入过滤除菌的50%硫代硫酸钠溶液，使其终含量为2%（质量体积比W/V），充分混合，取样后迅速置4℃保存。

2.卵黄抗体成品的检验

（1）性状本品为淡黄色的透明液体。pH值应为6.8～7.2。

（3）无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行，应无菌生长。

（4）安全检验用1～3日龄易感雏鸭（1型和新型鸭肝炎母源抗体均＜1:4）10只，各肌肉分点注射本品2.0ml。观察14日，易感雏鸭应全部健活。

（5）效力检验（参见表5）

血清学方法按附注1方法测定中和抗体效价，成品中鸭病毒性肝炎YBH1株和YBHX株卵黄抗体效价均应不低于1:256。

免疫攻毒法3～7日龄易感雏鸭（Ⅰ型和新型鸭肝炎病毒母源抗体均＜1:4）40只，随机分成A、B、C、D组，每组10只。A、B为免疫组，颈部皮下或肌肉注射本品，每只0.5ml；C、D为攻毒对照组，颈部皮下或肌肉注射生理盐水，每只0.5ml，隔离饲养。16小时后A、C组雏鸭分别肌肉注射用生理盐水作10倍稀释的YBH1株鸭肝炎病毒，每只0.5ml；B、D组雏鸭分别肌肉注射用生理盐水作10倍稀释的YBHX株鸭肝炎病毒，每只0.5ml。攻毒后观察10日，记录每组雏鸭发病、死亡情况。A、B组攻毒后应至少8只健活；C、D组应于攻毒16小时后开始发病，10日内至少8只死亡。

本发明所涉及微生物：

本发明涉及鸭肝炎病毒（Duck hepatitis virus）YBH1株和YBHX株，以上2个毒株已于2012年08月15日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC No.6441、CGMCC No.6442。

本发明的积极意义

本发明涉及鸭病毒性肝炎二价精制卵黄抗体的生产方法。本发明从鸭病毒性肝炎病毒优势流行毒株中筛选出免疫原性良好的鸭病毒性肝炎病毒1型YBH1株和新型YBHX株疫苗制备毒株，分别接种鸡胚和鸭胚，分别收获死亡胚胚体和胚液，经研磨、冻融后收取病毒液，经超滤浓缩、甲醛溶液灭活后，加油佐剂混合乳化制成疫苗。用此疫苗接种产蛋鸡，收获高免鸡蛋，分离蛋黄，灭活、萃提精制而成，能同时预防由1型和新型鸭肝炎病毒引起的雏鸭病毒性肝炎，此卵黄具有高效、安全性好、保护率高等优点。

实施例

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的保护范围。

实施例1

——疫苗（免疫原）制备：

1.制苗用病毒液的制备

（1）YBH1株毒液制备将生产用毒种YBH1株作100倍稀释，尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚100枚，每胚0.2ml，36～37℃孵育，每日2次照胚检查。接种后48～120小时内死亡的鸡胚，置2～8℃放置4～12小时后，收取尿囊液、羊水及胚体，胚体去掉头和四肢。用胚液匀浆后、冻融3次，4000r/min离心30min，取上清混合于无菌容器中，置2～8℃保存。（参见表1）。

（2）YBHX株毒液制备将生产用毒种YBHX株100倍稀释，尿囊腔接种12～13日龄易感鸭胚100枚，每胚0.2ml，36～37℃孵育，每日2次照胚检查。接种后48～120小时内死亡的鸭胚，置2～8℃4～12小时，收取尿囊液、羊水及胚体（去掉头和四肢）。用胚液匀浆、冻融3次，4000r/min离心30min，取上清混合于无菌容器中，置2～8℃保存。（参见表1）。

表1毒液的制备

毒株名称	胚品种	接种胚数（枚）	胚日龄	收获胚液（ml）
					YBH1株	SPF鸡胚	100	10	1100
YBHX株	易感鸭胚	100	12	1200

2.浓缩将收获的YBH1株和YBHX株病毒液在2～8℃条件下，用超滤浓缩机分别浓缩至原体积的1/3，按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验，无菌生长，并留样备测毒价。YBH1株病毒液每0.2ml病毒含量为10^6.3ELD₅₀，YBHX株病毒液每0.2ml病毒含量为10^6.5ELD₅₀。浓缩后的胚液随即进行灭活。（参见表2）。

表2毒液浓缩

3.灭活分别将浓缩后的YBH1株与YBHX株病毒液导入灭活罐内，计量加入10%甲醛溶液，使其充分混合，甲醛溶液的最终浓度为0.2%。加甲醛溶液后导入另一灭活罐中，以避免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37℃灭活16小时（以罐内温度达到37℃开始计时）后取出，置2～8℃保存。

4.疫苗半成品检验

（1）无菌检验取灭活的浓缩胚液，按现行《中国兽药典》附录进行，无菌生长。

（2）病毒含量测定

1）浓缩后YBH1株病毒含量测定将浓缩后的病毒液用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10^-4、10^-5、10^-6、10^-74个稀释度，分别尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚5枚，每胚0.2ml。同时设接种生理盐水对照5枚，每胚0.2ml。置36～37℃继续孵育，每日照胚2次，观察168小时。以鸡胚死亡并出现尿囊膜水肿增厚，头、颈、背部等全身出血性病变判为感染，ELD₅₀，为10^6.3。

2）浓缩后YBHX株病毒含量测定将浓缩后的病毒液用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10^-4、10^-5、10^-6、10^-74个稀释度，分别尿囊腔接种12～13日龄易感鸭胚5枚，每胚0.2ml。同时设生理盐水对照，每胚0.2ml。置36～37℃继续孵育，每日照胚2次，观察168小时。以鸭胚死亡并出现尿囊膜水肿增厚，头、颈、背部等全身出血性病变判为感染，ELD₅₀，为10^6.5。

（3）灭活检验分别将YBH1株和YBHX株灭活后的病毒液尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚和12～13日龄易感鸭胚各10枚，每胚0.2ml，置36～37℃继续孵育，连续观察168小时，鸡胚和鸭胚均无死亡。

5．灭活疫苗的制备：经过检验合格后的半成品抗原进行疫苗制备（以下配制中各液体成分按体积比计，参见表3）。

（1）油相制备取兽用白油94份，硬脂酸铝2份，置于油相制备罐中加热至80℃后，再加司本－806份，至温度达到115℃时，维持30min，冷却后备用。

（2）水相制备将灭活检验合格的YBH1株和YBHX株病毒液混合，检测每0.2ml水相中含YBH1株和YBHX株病毒含量，分别为10^6.1ELD₅₀和10^6.3ELD₅₀。取灭菌后的吐温-804份，加入配液罐中，同时加混合抗原液96份，开动搅拌电机搅拌20～30min，使吐温-80完全溶解。

（3）乳化取油相3份放于高速剪切机内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份，以10000r/min，乳化5分钟。乳化后，取10ml，以3000r/min离心15分钟，管底无水相析出。

（4）分装定量分装，加盖密封。

表3疫苗乳化和分装

5.疫苗成品检验

（1）性状

外观乳白色乳剂。

剂型油包水型，取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水，呈油滴状不扩散。

稳定性吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底无水相析出。

黏度按现行版《中国兽药典》附录进行，为61.6cp。

（2）装量检查按现行版《中国兽药典》附录进行,符合标准。

（3）无菌检验按现行版《中国兽药典》附录进行,无菌生长。

（4）安全检验用21～35日龄SPF鸡10只，每只颈部皮下注射疫苗2.0ml，同时设对照5只，在相同的条件下饲养，连续观察14日，试验鸡全部健活，且均未出现任何因疫苗引起的局部和全身反应。

（5）效力检验用28日龄SPF鸡10只，每只颈部皮下注射疫苗，0.5ml/只，另取5只同日龄鸡不免疫作对照，免后21日，采血分离血清，分别测定鸭肝炎1型和新型中和抗体效价。免疫组10只鸡中1型和新型中和抗体效价均有7只鸡为1:64，3只鸡为1:128，对照组5只鸡均为阴性。（参见表4）。

表4疫苗效力检验结果

（6）甲醛残留量测定按现行版《中国兽药典》附录进行测定，甲醛残留量为0.07%。

实施例2

——鸭病毒性肝炎卵黄抗体制备

1.高免蛋的制备

将上述制备的鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗免疫蛋鸡，首次免疫每只鸡颈部皮下注射1.0ml二价灭活疫苗，14天后进行第二次免疫，每只鸡颈部皮下注射2.0ml二价灭活疫苗，二免后14天进行第三次免疫，每只鸡颈部皮下注射2.0ml二价灭活疫苗，三免后14天进行第三次免疫,每只鸡颈部皮下注射2.0ml二价灭活疫苗，第四次免疫之后14天，采集卵黄测定鸭病毒性肝炎1型和新型中和抗体效价分别为1:1024和1:2048。

2.卵黄抗体制造（参见表5）

（1）蛋壳消毒将20kg高免蛋浸入1%的TH4+溶液中浸泡消毒5min。取出消毒后的鸡蛋自然晾干或吹干，喷洒75%的酒精对蛋壳表面消毒后备用。

（4）酸化萃提先在隔离反应罐中加入相当于原蛋黄4倍体积冷却至4℃的注射用水,然后加入卵黄液，开启搅拌机搅拌,混匀后用1mol/L盐酸调pH值至5.4,2～8℃静置12小时。酸化完成后，6000r/min离心15min，离心后取上清液。

（5）灭活Ⅱ在分离的上清液中加入终浓度（V/V）为0.2%的辛酸作灭活剂和萃提剂，搅拌均匀，2～8℃放置4～8小时。

（6）粗滤用无菌滤布过滤后，再用柱芯滤器过滤至澄清。

（9）灭活Ⅲ将过滤后的溶液导入灭活罐中，计量加入10%的甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，甲醛溶液的最终浓度（V/V）为0.1%，37℃灭活16小时。

（10）阻断灭活结束后，立即在灭活病毒液中加入过滤除菌的50%硫代硫酸钠溶液，使硫代硫酸钠溶液终含量（W/V）为2%，充分混合，取样后迅速置4℃保存。

表5卵黄抗体制造及分装

实施例3

——卵黄抗体成品检验

（1）性状本品为淡黄色的透明液体。pH值为7.0。

（2）装量检查按现行《中国兽药典》附录进行，符合规定。

（3）无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行，无菌生长。

（4）安全检验用1～3日龄易感雏鸭（1型和新型鸭肝炎母源抗体均＜1:4）10只，各肌肉分点注射本品2.0ml。观察14日，易感雏鸭全部健活。

（5）效力检验（参见表6）

1）血清学方法按附注1方法测定中和抗体效价，成品中鸭病毒性肝炎YBH1株和YBHX株卵黄抗体效价均为1:256。

2）免疫攻毒法5日龄易感雏鸭（1型和新型鸭肝炎母源抗体均＜1:4）40只，随机分成A、B、C、D组，每组10只。A、B为免疫组，颈部皮下或肌肉注射本品，每只0.5ml；C、D为攻毒对照组，颈部皮下或肌肉注射生理盐水，每只0.5ml，隔离饲养。16小时后A、C组雏鸭分别肌肉注射用生理盐水作10倍稀释的YBH1株鸭肝炎病毒，每只0.5ml；B、D组雏鸭分别肌肉注射用生理盐水作10倍稀释的YBHX株鸭肝炎病毒，每只0.5ml。攻毒后观察10日，记录每组雏鸭发病、死亡情况。A、B组攻毒后10/10保护；C、D组于攻毒16小时后开始发病，10日内分别死亡9只和8只。（参见表6）

表6卵黄抗体效力检验结果

试验组	攻毒毒株	攻毒保护
			A组	1型病毒	10/10
B组	新型病毒	10/10
			C组	1型病毒	1/10
D组	新型病毒	2/10

注:攻毒保护为攻毒后健康存活鸭数/攻毒鸭总数。

Claims

1.一种鸭病毒性肝炎二价精制卵黄抗体，其特征在于该卵黄抗体含有抗鸭肝炎病毒1型CGMCCNo.6441株抗体和抗鸭肝炎病毒新型CGMCCNo.6442株抗体，可同时预防由1型和新型鸭肝炎病毒引起的鸭病毒性肝炎。

2.权利要求1所述鸭病毒性肝炎二价精制卵黄抗体的制备方法，其特征在于

（1）鸭肝炎病毒1型YBH1株和新型YBHX株已于2012年08月15日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCCNo.6441、CGMCCNo.6442；

（2）用1型CGMCCNo.6441株和新型CGMCCNo.6442株鸭肝炎病毒作为疫苗生产毒株，制成鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗；

（3）用制备的鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗注射免疫产蛋鸡，制备高免蛋；

（4）由高免蛋收集卵黄用酸化水-辛酸的方法萃提、灭活后制备成鸭病毒性肝炎二价精制卵黄抗体。