CN101607994B - 一种鸭病毒性肝炎精制蛋黄抗体的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种鸭病毒性肝炎精制蛋黄抗体的制备方法，其制备方法步骤如下：①生产用毒种的制备；②制备抗原用毒液的制备；③油乳剂灭活苗的制备；④高免蛋制备；⑤分离蛋黄；⑥灭活I及提取；⑦灭活II及粗滤、深滤；⑧灭活III及除菌过滤；⑨配制、包装。将收集的无菌过滤液进行鸭肝中和抗体效价测定，用0.015mol/L pH7.2的灭菌PBS稀释抗体至中和抗体效价为1∶256～1∶1024，加入终浓度为0.02％(体积百分比)吐温-80作稳定剂并充分混匀，分装，无菌定量分装。该产品具有纯度高、特异性强、易保存、无残留等优点，对鸭病毒性肝炎的预防与治疗具有极好的效果。

Description

一种鸭病毒性肝炎精制蛋黄抗体的制备方法

技术领域：

本发明涉及禽类生物药制剂技术领域，具体地讲涉及一种鸭病毒性肝炎精制蛋黄抗体的制备方法。

背景技术：

鸭病毒性肝炎(DVH)是雏鸭的一种急性致死性传染病。该病发病急、传播快、发病率和致死率可高达100％。我国自1958年在上海首次分离到鸭肝炎病毒(DHV)以来，相继在全国许多省市流行发生，造成巨大的经济损失，已成为影响养鸭业健康发展的重要威胁。

鸭病毒性肝炎主要威胁20日龄以内的雏鸭，此时雏鸭的免疫系统发育尚不完善，疫苗免疫后难以达到预防效果，较高的母源抗体虽然可以使雏鸭在2周内免受病毒的袭击，但在一些母源抗体水平较低、卫生状况较差和其他的一些应激因素作用下，该病仍时有发生。目前，在缺乏有效的治疗药物的情况下，利用鸭病毒性肝炎抗体来进行治疗和预防该病的发生，仍然是十分有效的。

目前我国主要利用蛋黄液抗体预防该病的发生，其生产的蛋黄液抗体存在诸多缺点：1、蛋黄内含有一些可以垂直传播给雏鸡的病原，如霉形体、沙门氏菌、腺病毒及呼肠孤病毒等，如在蛋黄抗体生产中未进行严格消毒和灭活，即可导致人为传毒。2、蛋壳表面污染的常在菌，用粗制方法无法灭活；3、高浓度蛋黄液为污染菌的繁殖提供了最有利的条件；4、贮存不便，贮存成本较高；5、使用极不方便，因其粘度大，易堵塞注射器；6、应激反应较为强烈。因此，禁止这种粗制蛋黄抗体的生产和使用，取而代之的是另一种更为安全和有效的抗体制剂，既是生产的需要，也是众多从事生物制品的专家学者的追求目标。

发明内容：

为了克服现有技术不足，本发明公开了一种鸭病毒性肝炎精制蛋黄抗体的制备方法，该产品能更好的预防和治疗鸭病毒性肝炎，减少广大养殖户的经济损失。

为了实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

所述一种鸭病毒性肝炎精制蛋黄抗体的制备方法，其制备方法步骤如下：

①、生产用毒种的制备：将AV2111-5株毒种用灭菌生理盐水作10^-2稀释，将稀释后的毒种经绒毛尿囊腔接种发育良好的9～10日龄SPF鸡胚，置37℃孵育，收获48～96小时死亡且胚体病变典型的鸡胚的尿囊液；

②、制备抗原用毒液的制备：将生产用毒种用灭菌生理盐水作10^-2稀释，绒毛尿囊腔接种10日龄的鸡胚，每枚胚接种0.1ml，接种后于37℃孵化96小时。收获胚液、胚体及绒毛尿囊膜，研磨、过滤。

③、油乳剂灭活苗的制备：取抗原用毒液加入0.2％的福尔马林溶液37℃24h灭活，取白油96份，司本4份，硬脂酸铝2份，混合均匀后121℃103kPa灭菌后制成油相，取灭活后的抗原用病毒液98份，吐温2份，混合均匀后制成水相。取油相2份，水相1份，混合乳化制成。

④、高免蛋制备：取步骤③中制备的油乳剂灭活油苗免疫刚开产的产蛋鸡，免疫4次，每次间隔7～10日，每次免疫1.0ml，第四次免疫后7日开始收集鸡蛋；

⑤、分离蛋黄：将收获高免鸡蛋进行蛋黄分离备用；

⑥灭活I及提取：将分离的蛋黄用0.015mol/L pH7.2的灭菌PBS 1∶1稀释，60℃加热灭活15分钟；加入终浓度为14～19％的硫酸铵，8000转/分离心15分钟，收集沉淀。

⑦、灭活II及粗滤、深滤：将收集的沉淀用0.015mol/L pH7.2的灭菌PBS作1∶4稀释后，加入0.2％的辛酸室温放置2小时；之后用板框滤器进行粗滤与深滤；

⑧、灭活III及除菌过滤：将深滤后的滤液加入终浓度为0.1％甲醛溶液，充分搅拌混匀，密封60分钟；用0.22μm微孔滤芯过滤除菌，收集滤液备用；

⑨、配制、包装：将收集的无菌过滤液进行鸭肝中和抗体效价测定，用0.015mol/L pH7.2的灭菌PBS稀释抗体至中和抗体效价为1∶256～1∶1024，加入终浓度为0.02％(体积百分比)吐温-80作稳定剂并充分混匀，分装，无菌定量分装。

本发明采用免疫原性良好的鸭肝炎病毒AV2111-5株毒种，此株病毒为由购自农业部中国兽医药品监察所的鸭病毒性肝炎种毒AV2111株在10日龄SPF鸡胚传5代后而来。接种后的鸡胚基本稳定在48～96小时胚胎死亡，死亡率可达90％以上。

由于采用了如上所述技术方案，本发明具有如下优越性：

本发明采用了一种集热灭活、化学灭活及物理灭活为一体的综合灭活技术。即对蛋黄中添加的指示微生物能完全彻底灭活，而且不影响抗体效价。无化学残留、无毒副作用。

由于采用了硫酸铵沉淀法，并且在14～19％的浓度时沉淀效果最佳，抗体效价也最高。

采用本发明生产的产品具有纯度高、特异性强、易保存、无残留等优点。该产品对鸭病毒性肝炎的紧急预防与治疗具有极好的效果。

具体实施方式：

实施例1：

一种鸭病毒性肝炎精制蛋黄抗体的制备方法：其制备方法步骤是：

①、生产用毒种的制备：将购自农业部中国兽医药品监察所的鸭病毒性肝炎种毒AV2111株在10日龄SPF鸡胚传5代后而来的AV2111-5株毒种用灭菌生理盐水作10^-2稀释，将稀释后的毒种经绒毛尿囊腔接种发育良好的9～10日龄SPF鸡胚，置37℃孵育，收获48～96小时死亡且胚体病变典型的鸡胚的尿囊液；

②、制备抗原用毒液的制备：将生产用毒种用灭菌生理盐水作10^-2稀释，绒毛尿囊腔接种10日龄的鸡胚，每枚胚接种0.1ml，接种后于37℃孵化96小时。收获胚液、胚体及绒毛尿囊膜，研磨、过滤。

③、油乳剂灭活苗的制备：取抗原用毒液加入0.2％的福尔马林溶液37℃24h灭活，取白油96份，司本4份，硬脂酸铝2份，混合均匀后121℃103kPa灭菌后制成油相，取灭活后的抗原用病毒液98份，吐温2份，混合均匀后制成水相。取油相2份，水相1份，混合乳化制成。

④、高免蛋制备：取步骤③中制备的油乳剂灭活油苗免疫刚开产的产蛋鸡，免疫4次，每次间隔7～10日，每次免疫1.0ml，第四次免疫后7日开始收集鸡蛋；

⑤、分离蛋黄：将收获高免鸡蛋进行蛋黄分离备用；

⑥灭活I及提取：将分离的蛋黄用0.015mol/L pH7.2的灭菌PBS 1∶1稀释，60℃加热灭活15分钟；加入终浓度为14％的硫酸铵，8000转/分离心15分钟，收集沉淀。

⑦、灭活II及粗滤、深滤：将收集的沉淀用0.015mol/L pH7.2的灭菌PBS作1∶4稀释后，加入0.2％的辛酸室温放置2小时；之后用板框滤器进行粗滤与深滤；

⑧、灭活III及除菌过滤：将深滤后的滤液加入终浓度为0.1％甲醛溶液，充分搅拌混匀，密封60分钟；用0.22μm微孔滤芯过滤除菌，收集滤液备用；

⑨、配制、包装：将收集的无菌过滤液进行鸭肝中和抗体效价测定，用0.015mol/L pH7.2的灭菌PBS稀释抗体至中和抗体效价为1∶256，加入终浓度为0.02％(体积百分比)吐温-80作稳定剂并充分混匀，分装，无菌定量分装。

实施例2：

一种鸭病毒性肝炎精制蛋黄抗体的制备方法：其制备方法步骤是：其制备步骤①、②、③、④、⑤、⑦、⑧同实施例1制备步骤①、②、③、④、⑤、⑦、⑧；步骤⑥、⑨变为：

⑥灭活I及提取：将分离的蛋黄用0.015mol/L pH7.2的灭菌PBS 1∶1稀释，60℃加热灭活15分钟；加入终浓度为16％的硫酸铵，8000转/分离心15分钟，收集沉淀。

⑨、配制、包装：将收集的无菌过滤液进行鸭肝中和抗体效价测定，用0.015mol/L pH7.2的灭菌PBS稀释抗体至中和抗体效价为1∶512，加入终浓度为0.02％(体积百分比)吐温-80作稳定剂并充分混匀，分装，无菌定量分装。

实施例3：

一种鸭病毒性肝炎精制蛋黄抗体的制备方法：其制备方法步骤是：其制备步骤①、②、③、④、⑤、⑦、⑧同实施例1制备步骤①、②、③、④、⑤、⑦、⑧；步骤⑥、⑨变为：

⑥灭活I及提取：将分离的蛋黄用0.015mol/L pH7.2的灭菌PBS 1∶1稀释，60℃加热灭活15分钟；加入终浓度为19％的硫酸铵，8000转/分离心15分钟，收集沉淀。

⑨、配制、包装：将收集的无菌过滤液进行鸭肝中和抗体效价测定，用0.015mol/L pH7.2的灭菌PBS稀释抗体至中和抗体效价为1∶1024，加入终浓度为0.02％(体积百分比)吐温-80作稳定剂并充分混匀，分装，无菌定量分装。

Claims (1)

1.一种鸭病毒性肝炎精制蛋黄抗体的制备方法，其特征是：其制备方法步骤如下：

①、生产用毒种的制备：将AV2111-5株毒种用灭菌生理盐水作10-2稀释，将稀释后的毒种经绒毛尿囊腔接种发育良好的9～10日龄SPF鸡胚，置37℃孵育，收获48～96小时死亡且胚体病变典型的鸡胚的尿囊液；

②、制备抗原用毒液的制备：将生产用毒种用灭菌生理盐水作10-2稀释，绒毛尿囊腔接种10日龄的鸡胚，每枚胚接种0.1ml，接种后于37℃孵化96小时；收获胚液、胚体及绒毛尿囊膜，研磨、过滤；

③、油乳剂灭活苗的制备：取抗原用毒液加入0.2％的福尔马林溶液37℃24h灭活，取白油96份，司本4份，硬脂酸铝2份，混合均匀后121℃103kPa灭菌后制成油相，取灭活后的抗原用病毒液98份，吐温2份，混合均匀后制成水相。取油相2份，水相1份，混合乳化制成；

④、高免蛋制备：取步骤③中制备的油乳剂灭活苗免疫刚开产的产蛋鸡，免疫4次，每次间隔7～10日，每次免疫1.0ml，第四次免疫后7日开始收集鸡蛋；

⑤、分离蛋黄：将收获高免鸡蛋进行蛋黄分离备用；⑥灭活I及提取：将分离的蛋黄用0.015mol/L pH7.2的灭菌PBS 1∶1稀释，60℃加热灭活15分钟；加入终浓度为14～19％的硫酸铵，8000转/分离心15分钟，收集沉淀；

⑦、灭活II及粗滤、深滤：将收集的沉淀用0.015mol/L pH7.2的灭菌PBS作1∶4稀释后，加入0.2％的辛酸室温放置2小时；之后用板框滤器进行粗滤与深滤；

⑧、灭活III及除菌过滤：将深滤后的滤液加入终浓度为0.1％甲醛溶液，充分搅拌混匀，密封60分钟；用0.22μm微孔滤芯过滤除菌，收集滤液备用；

⑨、配制、包装：将收集的无菌过滤液进行鸭肝中和抗体效价测定，用0.015mol/L pH7.2的灭菌PBS稀释抗体至中和抗体效价为1∶256～1∶1024，加入终浓度为0.02％(体积百分比)吐温-80作稳定剂并充分混匀，分装，无菌定量分装。