CN103525772B

CN103525772B - 一株鸭病毒性肝炎病毒及其应用

Info

Publication number: CN103525772B
Application number: CN201310489742.0A
Authority: CN
Inventors: 邓碧华; 卢宇; 吕芳; 张金秋; 侯继波; 赵晓娟; 赵艳红
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2013-10-18
Filing date: 2013-10-18
Publication date: 2015-05-20
Anticipated expiration: 2033-10-18
Also published as: CN103525772A

Abstract

本发明提供一株鸭病毒性肝炎病毒及其应用，属于生物技术领域。所述鸭病毒性肝炎病毒1型DHV-JS株，其微生物保藏号是：CGMCC NO.8159。本发明还提供鸭病毒性肝炎病毒1型DHV-JS株的应用、鸭病毒性肝炎病毒疫苗及抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体。本发明鸭病毒性肝炎病毒1型DHV-JS株，对目前流行的鸭病毒性肝炎病毒有很好的免疫原性，能够抵抗鸭病毒性肝炎病毒1型R85952株、鸭病毒性肝炎病毒1型A66株及自身毒株攻毒。本发明提供鸭病毒性肝炎病毒疫苗，该疫苗免疫种鸭后，雏鸭可从母源获得保护，能够抵抗鸭病毒性肝炎病毒感染。本发明的再一目的是提供抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体，能够预防和治疗鸭病毒性肝炎。

Description

一株鸭病毒性肝炎病毒及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株鸭病毒性肝炎病毒及其应用。

背景技术

鸭病毒性肝炎病毒1型属于小RNA病毒科，呈球形或类球形，直径在20-40nm，无囊膜，无血凝性，可在鸭、鸡、鹅胚尿囊腔增殖。鸭病毒性肝炎病毒1型可引起雏鸭的肝脏呈出血性炎症。鸭病毒性肝炎是急性烈性传染病。1945年，在美国首次发现本病，并命名为1型鸭病毒性肝炎，1965年在英国发现了鸭病毒性肝炎2型，1969年在美国发现了鸭病毒性肝炎3型。目前，1型呈世界性分布，并曾报道在印度、埃及和美国发现1型鸭肝炎病毒的变异株。2型和3型鸭病毒性肝炎分别局限于英国和美国，未发现变异毒株。20世纪80年代初期起，该病在我国再次流行。

中国由黄均健(1963)首次报道了鸭病毒性肝炎的发生。随后，研究人员分离到了鸭病毒性肝炎病毒1型R85952株，该毒株被列为参考毒株。2000年，张小飞等筛选分离到了可在鸡胚繁殖的鸭病毒性肝炎病毒1型A66株，并于2013年获得国家二类新兽药证书。何冉娅等(2010)对2007 - 2009年华南地区鸭病毒性肝炎病毒1型进行流行病学调查及变异分析，结果表明华南地区毒株已发生变异。由于鸭病毒性肝炎病毒1型自身的变异，旧的毒株对新流行毒株不能提供足够的交叉保护能力。

发明内容

本发明的目的是提供鸭病毒性肝炎病毒1型DHV-JS株，对目前流行的鸭病毒性肝炎病毒有很好的免疫原性，能够抵抗鸭病毒性肝炎病毒1型R85952株、鸭病毒性肝炎病毒1型A66株及自身毒株攻毒。

本发明的另一目的是提供鸭病毒性肝炎病毒疫苗，该疫苗免疫种鸭后，雏鸭可从母源获得保护，能够抵抗鸭病毒性肝炎病毒感染。

本发明的再一目的是提供抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体，能够预防和治疗鸭病毒性肝炎。

本发明的目的采用如下技术方案实现。

鸭病毒性肝炎病毒1型DHV-JS株，其微生物保藏号是：CGMCC NO.8159。

所述鸭病毒性肝炎病毒1型DHV-JS株CGMCC NO.8159在制备预防和治疗鸭病毒性肝炎疾病的药物中的应用。

所述预防鸭病毒性肝炎疾病的药物为鸭病毒性肝炎病毒疫苗或抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体，所述治疗鸭病毒性肝炎疾病的药物为抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体。

鸭病毒性肝炎病毒疫苗，其特征在于含有灭活的鸭病毒性肝炎病毒1型DHV-JS株CGMCC NO.8159病毒液。

所述鸭病毒性肝炎病毒1型DHV-JS株CGMCC NO.8159病毒液的制备方法为：将鸭病毒性肝炎病毒1型DHV-JS株CGMCC NO.8159接种鸭胚，收集24-100小时内死亡的鸭胚，取所述死亡鸭胚的尿囊液和去除胆囊的胚体；将所述去除胆囊的胚体均质后与所述尿囊液混合，离心取上清液，即得所述鸭病毒性肝炎病毒1型DHV-JS株CGMCC NO.8159病毒液。

所述鸭病毒性肝炎病毒疫苗为油乳剂。

所述鸭病毒性肝炎病毒疫苗采用如下方法制备：将吐温-80与灭活的鸭病毒性肝炎病毒1型DHV-JS株CGMCC NO.8159病毒液按照体积比4：90-4：100混合均匀，得到水相；将司本-80与白油按照体积比为6：90-6:100混合均匀，得到油相；将所述油相和水相按照体积比为2:1-4:1混合、乳化后得到鸭病毒性肝炎病毒疫苗。

抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体，采用如下方法制备：将权利要求4所述鸭病毒性肝炎病毒疫苗接种健康开产蛋鸡，收集高免鸡蛋；取高免鸡蛋的蛋黄，加入酸性水溶液，搅拌均匀，静置后离心取上清液，过滤取滤液，得到所述抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体。

当蛋黄的中和效价大于等于2¹¹时，收集高免鸡蛋。

有益效果

本发明提供的鸭病毒性肝炎病毒1型DHV-JS株，对目前流行的鸭病毒性肝炎病毒有很好的免疫原性，能够抵抗鸭病毒性肝炎病毒1型R85952株、鸭病毒性肝炎病毒1型A66株及自身毒株攻毒。

本发明提供的鸭病毒性肝炎病毒疫苗，该疫苗免疫种鸭后，雏鸭可从母源获得保护，能够抵抗鸭病毒性肝炎病毒感染。由于鸭病毒性肝炎病毒1型DHV-JS株，对目前流行的鸭病毒性肝炎病毒有很好的免疫原性，所以本发明鸭病毒性肝炎病毒疫苗免疫后也能够保护接种动物，避免感染鸭病毒性肝炎病毒1型R85952株、鸭病毒性肝炎病毒1型A66株及自身毒株。

本发明提供的抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体，能够预防和治疗鸭病毒性肝炎。

附图说明

图1 PCR扩增产物的电泳图。其中泳道1为DL2000 maker,泳道2和3为鸭病毒性肝炎病毒1型W株（阳性株），泳道4为本发明待鉴定毒株，泳道5为阴性对照。

图2是VP1基因同源性分析结果，与NCBI网站GENEBANK中公布的鸭病毒性肝炎病毒序列同源性比较。

图3是VP1基因进化分析结果，与NCBI网站GENEBANK中公布的鸭病毒性肝炎病毒序列进化分析。

鸭病毒性肝炎病毒1型DHV-JS株的微生物保藏号是：CGMCC NO.8159。

鸭病毒性肝炎病毒DHV-JS株的保藏信息如下：

分类命名：鸭病毒性肝炎病毒1型

拉丁文学名：duck hepatitis A virus type 1

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所

保藏日期：2013年 09月05 日

保藏编号：CGMCC NO.8159。

具体实施方式

实施例1 鸭病毒性肝炎病毒的获得和特性测定

1.病毒分离

将疑似感染鸭病毒性肝炎雏鸭的肝组织，研磨匀浆得到病料样品。加入1/5倍病料样品体积的生理盐水、终浓度均为200单位的青霉素和链霉素，反复冻融3次，7000 r/min离心20 min吸取上清液。将上清液用微孔滤膜过滤，取过滤液经尿囊腔接种10-12日龄鸭胚10枚，弃24小时内死亡胚；收集24~96小时死亡胚，采集其肝组织研磨成匀浆后与尿囊液混匀成悬液，反复冻融3次，取上清液，经无菌检查确定无菌后，作为病毒样本以备进一步鉴定。

2. 病毒鉴定

提取本实施例标题1中所获病毒样本中的RNA，具体步骤如下：取病毒样本200μL，加入600μL的TRIzol试剂；依次加入200μL氯仿，剧烈振荡15s，室温放置5min；4℃，12000r/min离心10min；取上清加入800μL的异丙醇，-20℃放置30min；4℃，12000r/min离心10min；取上清加入2倍体积的无水乙醇，弃上清，加入75%的乙醇1000μL洗涤；4℃，7500r/min离心5min；弃上清，干燥10min；加入15μL的DEPC水溶解沉淀，得到病毒RNA。以病毒RNA为模板进行反转录，获得cDNA。

以cDNA为模板，设计上游引物、下游引物和中间引物，PCR扩增病毒的VP1基因，对病毒进行鉴定。

上游引物DHV-F（SEQ ID NO:1）为：5-ATCAGGGTGATTCCAACCAG-3；

下游引物DHV-R（SEQ ID NO:2）为：5- TTGGTCTGATTCAATTTCCA -3 ；

中间引物DHV-M（SEQ ID NO:3）为：5-TTCCTGGCACATCAGAGGCAA-3。

PCR扩增的反应体系（50ul）：模板5μL，10×Buffer 5μL，Mg²⁺ 3μL，dNTPs 2μL，DHV-F 1μL，DHV-R 1μL，DHV-M 1μL，Taq DNA聚合酶 0.5μL，以DEPC水补足体积至50μL。

PCR反应程序：94℃预变性5min；进入循环：94℃变性60s，65℃退火45s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸10min。

将PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果显示片段大小约为700bp（图1）。将PCR扩增片段进行测序，具体序列如SEQ ID NO:4所示。

将基因序列进行分析，见图2和图3。其中代号J__(0706-31)yinwu1_A60554_B12_130700625是本发明待鉴定毒株，代号W__(0706-31)yinwu1_A60554_A12_130700625是阳性株鸭病毒性肝炎病毒1型W株（购自南京天邦生物技术有限公司），其它均为NCBI上的公布的鸭病毒性肝炎病毒序列。可以看出，本发明待鉴定毒株与鸭病毒性肝炎病毒1型经典标准毒株R85952株等的同源性为69.3%~70.9%，与鸭病毒性肝炎病毒1型AP-03337、AP-04009、AP-04203株同源性为92.6%~93.3%，有较高的同源性，证明本发明待鉴定毒株为鸭病毒性肝炎病毒1型。将该病毒命名为鸭病毒性肝炎病毒1型DHV-JS株（缩写为DHV-JS株），并送中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）保藏, 其微生物保藏号是：CGMCC NO.8159。

3. 病毒培养

将本实施例标题2中鉴定为鸭病毒性肝炎病毒1型的病毒样本，用生理盐水作100倍稀释，接种11~13日龄鸭胚，每胚0.2mL，37℃培养，弃去24小时死亡的鸭胚。培养96小时后，收取尿囊液和胚体。将胚体去除胆囊，均质后加入尿囊液中，经5000r/min离心10min，收集上清液作为毒种，-20℃保存。

4. 病毒特性

检测本实施例标题3中毒种的特性。

4.1 病毒含量

将毒种以生理盐水作10倍倍比稀释，分别接种11~13日龄鸭胚绒毛尿囊腔，每只鸭胚接种0.2mL，并作空白对照。每个稀释度接种5只鸭胚，以石腊封口，置于37℃温箱进行恒温培养。培养24小时照胚一次，弃去24小时内死亡的胚，以Reed-Mueeh法计算DHV-JS株对鸭胚的半数致死量（ELD₅₀），ELD₅₀不低于10^-6.0/0.2mL。

4.2 毒力

毒种以生理盐水作10倍倍比稀释，每只颈部皮下注射0.2mL接种3日龄左右雏鸭，观察10日，观察雏鸭的死亡情况。以Reed-Mueeh法计算DHV-JS株对雏鸭的半数致死量（LD₅₀），LD₅₀不低于10^-6.0/0.2mL。

实施例2鸭病毒性肝炎病毒疫苗及其应用

1病毒培养

将毒种（实施例1）以生理盐水作100倍稀释，接种11~13日龄鸭胚，每胚0.2mL，37℃培养，弃去24小时内死亡的鸭胚。培养时间为96小时，收取死亡鸭胚的尿囊液和胚体。将胚体去除胆囊、均质后与尿囊液混合，5000r/min离心10min，收集上清液作为DHV-JS株病毒液，-20℃保存。

2 病毒含量

将DHV-JS株病毒液以生理盐水作10倍倍比稀释，分别接种11~13日龄鸭胚绒毛尿囊腔，每只鸭胚接种0.2mL，并作空白对照。每个稀释度接种5只鸭胚，以石腊封口，置于37℃温箱进行恒温培养。每隔24小时照胚一次，弃去24小时内死亡的胚。以Reed-Mueeh法计算DHV-JS株病毒液对鸭胚的半数致死量（ELD₅₀），ELD₅₀应不低于10^-6.0/0.2mL。

3 病毒液的灭活

在DHV-JS株病毒液中加入甲醛，使甲醛的终浓度达到0.1%（体积浓度），于37℃作用24小时，其间每隔1小时搅拌或振摇一次，获得灭活病毒液。灭活结束后置2-8℃，可保存1个月。

4灭活检验

将灭活病毒液用生理盐水按照稀释度为1：10稀释后，接种12日龄易感鸭胚5枚，接种量为每孔0.2ml。37℃下培养，观察120小时。盲传3代，如果鸭胚无死亡则表明灭活完全。

5 制备鸭病毒性肝炎病毒疫苗

制备水相：将吐温-80与灭活病毒液按体积比4：96混合均匀，即得到水相。

油相：将司本-80与注射用白油按照体积比为6：94混合均匀，即得到油相。

乳化：按照体积比为3：1将油相和水相进行混合并乳化，得到鸭病毒性肝炎病毒疫苗。

6 鸭病毒性肝炎病毒疫苗安全检验

每批鸭病毒性肝炎病毒疫苗用3日龄雏鸭和开产种鸭各5只，每头颈部皮下注射4羽份（2ml）鸭病毒性肝炎疫苗，另设置不接种疫苗的同类鸭作对照组。

接种后观察14天，所有试验鸭无临床征状，健康情况良好。因此该鸭病毒性肝炎病毒疫苗是安全的。

鸭病毒性肝炎病毒疫苗用于接种种鸭，通过母源抗体预防雏鸭发生由鸭病毒性肝炎病毒引起的鸭病毒性肝炎。

7.鸭病毒性肝炎病毒疫苗免疫剂量确定及其保护性测定

将开产种鸭分为4组，每组10只。1组颈部皮下注射0.3ml鸭病毒性肝炎病毒疫苗；2组颈部皮下注射0.5ml鸭病毒性肝炎病毒疫苗；3组颈部皮下注射1.0ml鸭病毒性肝炎病毒疫苗；4组颈部皮下注射1.0ml生理盐水。试验采用单次免疫，免疫后21天至28天，收集所产鸭蛋，每组随机挑选20枚进行孵化雏鸭。雏鸭出雏后7天，每组选取10只雏鸭，采血并颈部皮下注射DHV-JS株，攻毒剂量为100LD₅₀，攻毒后连续观察10天，记录死亡情况。采集的血液分离血清，等量混合后鸭胚中和法测定抗体效价（参照《2000版中国兽药典》，下同）。

表1 鸭病毒性肝炎病毒疫苗免疫原性试验

分组	免疫种鸭剂量	7日龄雏鸭抗体水平	攻毒保护数	攻毒保护率
					1组	0.3ml	2^3.17	4/10	40%
2组	0.5ml	2^5.0	10/10	100%
					3组	1.0ml	2^5.63	10/10	100%
4组	1.0 ml生理盐水	-	0/10	0%

从表1可以看出，每只种鸭免疫0.3ml鸭病毒性肝炎病毒疫苗，雏鸭攻毒保护率为40%；每只种鸭免疫0.5ml鸭病毒性肝炎病毒疫苗，雏鸭攻毒保护率为100%；每只种鸭免疫1.0ml鸭病毒性肝炎病毒疫苗，雏鸭攻毒保护率为100%。孵化的雏鸭攻毒结果显示，每只种鸭接种鸭病毒性肝炎病毒疫苗0.5ml以上，可以保护雏鸭。该试验表明鸭病毒性肝炎病毒疫苗具有很好的免疫原性。

8. 鸭病毒性肝炎病毒疫苗免疫后种鸭抗体水平及抗体持续期测定

取开产种鸭20只，每只颈部皮下注射1.0ml鸭病毒性肝炎病毒疫苗。试验采用单次免疫，免疫后分别于7、14、21、28、60、90天采血，分离血清，将同一时间采血分离的血清等体积混合，采用鸭胚中和试验（检测方法参照《2000版中国兽药典》，下同）测定种鸭血液中的鸭病毒性肝炎抗体水平及抗体持续时间。

表2鸭病毒性肝炎病毒疫苗免疫后种鸭抗体水平及抗体持续期结果

免疫后时间

7天

14天

21天

28天

60天

90天

中和效价

2^2.33

2^6.17

2^8.5

2^8.63

2^8.0

2^4.5

从表2可以看出，每只种鸭免疫1.0ml鸭病毒性肝炎病毒疫苗后，7天开始产生抗体，21~28天为抗体产生高峰，28~60天，抗体效价仍有较高，60~90天抗体效价开始下降。

9. 交叉被动保护力的测定

同法按照本实施例的疫苗制备方法，制备含有R85952株（购自美国标准生物品收藏中心ATCC）和A66株（南京天邦生物技术有限公司惠赠，张小飞，黄显明，尹秀凤，等．鸭肝炎病毒 A66 弱毒株的水平传播感染［J］．江苏农业学报，2011，27( 4) : 813-817．）的疫苗。含有R85952株的疫苗记作对照疫苗1，制备过程中使用的R85952株病毒液的ELD₅₀含量为10^-6.0/0.2mL。含有A66株的疫苗自作对照疫苗2，制备过程中使用的A66株病毒液的ELD₅₀含量为10^-6.0/0.2mL。取开产7日龄雏鸭30只，随机分成3组。将对照疫苗1、2和实施例2中制备的鸭病毒性肝炎病毒疫苗（DHV-JS株）分别接种一组雏鸭（首免），每只颈部皮下注射0.5ml；14天后每只雏鸭再次接种1.0ml相应的疫苗。首免后21天，对各组雏鸭采血，收集针对各毒株的血清，采用鸭胚中和试验测定血清抗体效价，用生理盐水将针对各毒株的血清稀释至鸭胚中和效价为1:256，分别得到R85952株、A66株和DHV-JS株的高免血清。

将3日龄雏鸭45只分成3个组，每组15只。其中，第一组雏鸭，颈部皮下注射R85952株高免血清，0.5ml/只；第二组雏鸭，颈部皮下注射A66株高免血清，0.5ml/只；第三组雏鸭，颈部皮下注射DHV-JS株高免血清，0.5ml/只。高免血清接种后24h，对每组雏鸭：随机取5只雏鸭，颈部皮下注射R85952株病毒液；另取5只雏鸭，颈部皮下注射A66株病毒液；余下的5只雏鸭，颈部皮下注射DHV-JS株病毒液。各毒株的攻毒剂量均为100LD₅₀。观察10天，记录各组的死亡数。

试验结果如表3 所示。R85952株高免血清对自身毒株的保护率为100%，对A66株和DHV-JS株的保护率分别为80%和20%；A66株高免血清对R85952株、A66株和DHV-JS株的保护率分别为80%、100%和0；DHV-JS株高免血清对R85952株、A66株和DHV-JS株的保护率分别为100%、80%和100%。上述结果说明，本发明筛选到的DHV-JS株不仅可以保护自身毒株的攻毒，而且对其它毒株也有很好的交叉保护。R85952株和A66株的高免血清对DHV-JS株攻毒的保护数仅为1/5和0/5，基本没有交叉保护力。

表3交叉被动保护试验结果（百分率）

实施例3抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体的制备及其应用

采用实施例2制备的鸭病毒性肝炎病毒疫苗（DHV-JS株）制备抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体。

1.蛋鸡免疫

采用健康开产蛋鸡，先后胸部肌肉多点注射鸭病毒性肝炎病毒疫苗，0.5ml/只，此为首免。首免后10天，每只蛋鸡免疫1.0ml鸭病毒性肝炎病毒疫苗。首免后20天，每只蛋鸡注射鸭病毒性肝炎病毒疫苗2.0ml。三次免疫后，定期检查蛋黄对鸭胚中和试验效价（检测方法参照《2000版中国兽药典》），当中和效价达到2¹¹，开始收集高免鸡蛋。

2.制备抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体

消毒收集的高免鸡蛋，采取手工或机械方式分离蛋清和蛋黄。在2℃~30℃环境中，在蛋黄中加入其体积7倍的酸性水溶液（用盐酸调节水至pH为 4~5），搅拌均匀，4℃静置8小时，8000rpm离心30分钟后取上清液。上清液经过0.22μm孔径的滤芯过滤，取滤液，调整其鸭胚中和效价为1:256，得到抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体。

抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体，用于预防和紧急治疗鸭病毒性肝炎。抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体的接种途径是颈部皮下注射。3.预防雏鸭病毒性肝炎感染能力测定

3.取3日龄左右非免疫健康雏鸭50只，随机分为5组，每组10只。第1组为空白对照组，每只颈部皮下注射1.0ml抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体，不攻毒，单独隔离饲养。第2组（试验组）每只颈部皮下注射抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体0.3ml、第3组（试验组）每只颈部皮下注射抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体0.5ml，第4组（试验组）每只颈部皮下注射抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体1.0ml。第5组（攻毒对照组）每只颈部皮下注射生理盐水0.5ml。接种24小时后，第2~5组颈部皮下注射DHV-JS株病毒液，攻毒剂量为每只100LD₅₀，连续观察10日。

表4 抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体预防试验结果

分组	免疫剂量	攻毒剂量	雏鸭数量	攻毒保护率
					1组	1.0ml	0	10只	100%（10/10）
2组	0.3ml	100LD₅₀	10只	60%（6/10）
					3组	0.5ml	100LD₅₀	10只	100%（10/10）
4组	1.0ml	100LD₅₀	10只	100%（10/10）
					5组	0	100LD₅₀	10只	0%（0/10）

从表4可以看出，每只雏鸭接种0.3ml抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体，24小时后攻毒,雏鸭保护率仅有60%；每只雏鸭接种0.5ml抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体，24小时后攻毒,雏鸭保护率达到100%；雏鸭接种1.0ml抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体，24小时后攻毒,雏鸭保护率达到100%。预防试验结果显示，雏鸭注射0.5ml及以上蛋黄抗体，可以完全保护雏鸭。

4. 治疗雏鸭病毒性肝炎感染能力测定

取3日龄左右非免疫健康雏鸭50只，随机分为5组，每组10只。第1组为空白对照组，每只注射抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体1.0ml，不攻毒，单独隔离饲养。第2～5组颈部皮下注射鸭病毒性肝炎病毒DHV-JS株病毒液，每只100LD₅₀。12小时后，第2组（试验组）每只颈部皮下注射抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体0.3ml，第3组（试验组）每只颈部皮下注射抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体0.5ml，第4组（试验组）每只颈部皮下注射抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体1.0ml。第5组（攻毒对照组）每只颈部皮下注射生理盐水0.5ml。注射抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体后，连续观察10日。

表5抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体紧急治疗试验结果

分组	攻毒剂量	抗体给药剂量	雏鸭数量	攻毒保护率
					1组	0	1.0ml	10只	100%
2组	100LD₅₀	0.3ml	10只	30%
					3组	100LD₅₀	0.5ml	10只	80%
4组	100LD₅₀	1.0ml	10只	100%
					5组	100LD₅₀	0	10只	0%

从表5可以看出，采用DHV-JS株对雏鸭攻毒后12小时，每只注射0.3ml抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体，雏鸭保护率仅有30%；雏鸭接种DHV-JS株攻毒后12小时,每只注射0.5ml抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体，雏鸭保护率达到80%；雏鸭接种DHV-JS株攻毒后12小时,注射1.0ml抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体，雏鸭保护率达到100%。紧急治疗试验结果显示，雏鸭注射1.0ml及以上蛋黄抗体，可以完全保护雏鸭。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏省农业科学院

<120> 一株鸭病毒性肝炎病毒及其应用

<130> 201310172

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 上游引物

<400> 1

atcagggtga ttccaaccag 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 下游引物

<400> 2

ttggtctgat tcaatttcca 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 中间引物

<400> 3

ttcctggcac atcagaggca a 21

<210> 4

<211> 700

<212> DNA

<213> 鸭病毒性肝炎病毒1型DHV-JS株

<400> 4

cgggtgaata acagtgtgtt ttctcatttt gagactgcaa atgtgccaat acaaggggag 60

tcgcacacct tggtgaaaca tctctttggc cgtcaatggc tggttcgtac tgttcaacat 120

actggtgagg tacaagagtt ggatttgcca gtgcctgatc agggtcatgc atctctgttg 180

cgcttctttg cctatttctc tggagaagtg attctgacca ttgtcaacaa tggaacaaca 240

ccctgtatgg ttgcacactc ttatacaatg gacaatctca cttctgaata tgctgtcact 300

gccatggggg gtattcttat cccagcaaac tctgccaaga atattaatat tccattttat 360

tctgtcacac ctttacgccc cacacgaccc atgccagcat ctcagggggg tggcttgact 420

tttggcaggt tgtatatctg gacacaatca ggaagcgttt ctgtttttat gggcctccac 480

aagccagctt tgtttttccc actgcctgca ccaacttaca caacacacac gctgttgaat 540

aagattgaaa ccatgaatct gcatgatcaa tcagatcagc cagactgcca tctgtgtgag 600

atttgcagga aaatgaagaa atggtttcgc aaccatcgcc catttcgctt ctgtttgaga 660

cttaaaacac ttgcctttga gctccatttg gaaattgtcc 700

Claims

1.鸭病毒性肝炎病毒1型DHV-JS株，其微生物保藏号是：CGMCC NO.8159。

2.权利要求1 所述鸭病毒性肝炎病毒1型DHV-JS株CGMCC NO.8159在制备预防或治疗鸭病毒性肝炎疾病的药物中的应用。

3.根据权利要求2所述应用，其特征在于所述预防鸭病毒性肝炎疾病的药物为鸭病毒性肝炎病毒疫苗或抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体，所述治疗鸭病毒性肝炎疾病的药物为抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体。

4.鸭病毒性肝炎病毒疫苗，其特征在于含有灭活的鸭病毒性肝炎病毒1型DHV-JS株CGMCC NO.8159病毒液。

5.根据权利要求4所述鸭病毒性肝炎病毒疫苗，其特征在于所述鸭病毒性肝炎病毒1型DHV-JS株CGMCC NO.8159病毒液的制备方法为：将鸭病毒性肝炎病毒1型DHV-JS株CGMCC NO.8159接种鸭胚，收集24-100小时内死亡的鸭胚，取所述死亡鸭胚的尿囊液和去除胆囊的胚体；将所述去除胆囊的胚体均质后与所述尿囊液混合，离心取上清液，即得所述鸭病毒性肝炎病毒1型DHV-JS株CGMCC NO.8159病毒液。

6.根据权利要求5所述鸭病毒性肝炎病毒疫苗，其特征在于所述鸭病毒性肝炎病毒疫苗为油乳剂。

7.根据权利要求6所述鸭病毒性肝炎病毒疫苗，其特征在于所述鸭病毒性肝炎病毒疫苗采用如下方法制备：将吐温-80与灭活的鸭病毒性肝炎病毒1型DHV-JS株CGMCC NO.8159病毒液按照体积比4：90-4：100混合均匀，得到水相；将司本-80与白油按照体积比为6：90-6:100混合均匀，得到油相；将所述油相和水相按照体积比为2:1-4:1混合、乳化后得到鸭病毒性肝炎病毒疫苗。

8.抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体，其特征在于采用如下方法制备：将权利要求4所述鸭病毒性肝炎病毒疫苗接种健康开产蛋鸡，收集高免鸡蛋；取高免鸡蛋的蛋黄，加入酸性水溶液，搅拌均匀，静置后离心取上清液，过滤取滤液，得到所述抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体。

9.根据权利要求8所述抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体，其特征在于当蛋黄的中和效价大于等于2¹¹时，收集高免鸡蛋。