CN104531625B - 一种鸭病毒性肝炎的灭活疫苗及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鸭病毒性肝炎的灭活疫苗及其制备方法与应用。本发明提供的鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗，由抗原和油佐剂组成；所述抗原由鸭肝炎病毒的组合物与吐温‑80混合得到；所述鸭肝炎病毒的组合物由鸭甲型肝炎病毒1型病毒和鸭甲型肝炎病毒3型病毒组成；所述鸭甲型肝炎病毒1型病毒为灭活的鸭甲型肝炎病毒1型DHAV‑SH株病毒液；所述鸭甲型肝炎病毒3型病毒为灭活的鸭甲型肝炎病毒3型DHAV‑FS株病毒液；所述油佐剂由Montanide ISA206、硬脂酸铝和司本‑80组成。本发明提供的鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗具有如下优点：(1)同时对1型鸭肝炎病毒和3型鸭肝炎病毒具有预防作用；(2)使用灭活病毒制成，安全性好；(3)保存、运输和使用方便；(4)免疫效果稳定。

Description

一种鸭病毒性肝炎的灭活疫苗及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种鸭病毒性肝炎的灭活疫苗及其制备方法与应用。

背景技术

鸭病毒性肝炎简称鸭肝炎，是由鸭病毒性肝炎病毒引起的一种以肝脏呈现出血性炎症为特征的急性烈性传染病。病鸭和带毒鸭是主要传染源，主要通过消化道和呼吸道感染。饲养管理不良，缺乏维生素和矿物质，鸭舍潮湿、拥挤，均可促使鸭病毒性肝炎发生。鸭病毒性肝炎一旦发生，在鸭群中传播很快，发病率可达100％。鸭病毒性肝炎主要感染20日龄以内的雏鸭，潜伏期为1-4天，突然发病，病程短促。病初精神萎靡，不食，行动呆滞，缩颈，翅下垂，眼半闭呈昏迷状态，有的出现腹泻。不久，病鸭出现神经症状，不安，运动失调，身体倒向一侧，两脚发生痉挛，数小时后死亡。死前头向后弯，呈角弓反张姿势。剖析可见特征性病变在肝脏。肝肿大，呈黄红色或花斑状，表面有出血点和出血斑，胆囊肿大，充满胆汁。脾脏有时肿大，外观也类似肝脏的花斑。多数肾脏充血、肿胀。心肌如煮熟状。有些病例有心包炎、气囊中有微黄色渗出液和纤维素絮片。

目前，在我国同时流行由1型鸭肝炎病毒和3型鸭肝炎病毒引起的雏鸭病毒性肝炎。现有的鸭病毒性肝炎疫苗为1型鸭病毒性肝炎弱毒活疫苗，主要通过如下方法制备：将鸭肝炎病毒弱毒株接种鸡胚，收集胚液，加入保护剂后冻干。使用时，用生理盐水稀释，采用肌肉注射成鸭或雏鸭。弱毒活疫苗存在如下问题：(1)保存和运输需-20℃低温条件，不方便；(2)免疫鸭后，疫苗病毒在体内存活时间长、易排毒，且病毒对环境抵抗力强、易毒力返强；(3)疫苗的免疫效果不稳定，易受母源抗体干扰，造成免疫失败。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种鸭甲型肝炎病毒1型DHAV-SH株，其保藏编号为CGMCC No.10098。

上述的鸭甲型肝炎病毒1型DHAV-SH株在制备鸭病毒性肝炎二价疫苗中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供一种鸭肝炎病毒的组合物。

本发明提供的鸭肝炎病毒的组合物的活性成分由鸭甲型肝炎病毒1型病毒和鸭甲型肝炎病毒3型病毒组成。

上述组合物中，所述鸭甲型肝炎病毒1型病毒和所述鸭甲型肝炎病毒3型病毒的病毒量比为1:1。

上述组合物中，所述鸭甲型肝炎病毒1型病毒具体为鸭甲型肝炎病毒1型病毒液；所述鸭甲型肝炎病毒3型病毒具体为鸭甲型肝炎病毒3型病毒液。

上述组合物中，所述鸭甲型肝炎病毒1型病毒液的病毒量具体为10^6.25ELD₅₀/100ml；所述鸭甲型肝炎病毒3型病毒液的病毒量具体为10^6.25ELD₅₀/100ml；所述鸭甲型肝炎病毒1型病毒液和鸭甲型肝炎病毒3型病毒液的体积比具体为1:1。

上述组合物中，所述鸭甲型肝炎病毒1型病毒液进一步具体为灭活的鸭甲型肝炎病毒1型病毒液；所述鸭甲型肝炎病毒3型病毒液进一步具体为灭活的鸭甲型肝炎病毒3型病毒液。

上述组合物中，所述鸭甲型肝炎病毒1型的病毒株进一步具体为鸭甲型肝炎病毒1型DHAV-SH株CGMCC No.10098；所述鸭甲型肝炎病毒3型的病毒株进一步具体为鸭甲型肝炎病毒3型DHAV-FS株CGMCC No.4457。

上述组合物中，所述灭活的鸭甲型肝炎病毒1型DHAV-SH株病毒液的制备方法如下：在鸭甲型肝炎病毒1型DHAV-SH株病毒液中加入甲醛溶液，孵育后得到所述灭活的鸭甲型肝炎病毒1型DHAV-SH株病毒液；

所述灭活的鸭甲型肝炎病毒3型DHAV-FS株病毒液的制备方法如下：在鸭甲型肝炎病毒3型DHAV-FS株病毒液中加入甲醛溶液，孵育后得到所述灭活的鸭甲型肝炎病毒3型DHAV-FS株。

上述组合物中，所述灭活的鸭甲型肝炎病毒1型DHAV-SH株病毒液的制备方法中，所述孵育温度为37℃；所述孵育时间为24小时；

所述灭活的鸭甲型肝炎病毒3型DHAV-FS株病毒液的制备方法中，所述孵育温度为37℃；所述孵育时间为24小时。

上述的组合物在制备鸭病毒性肝炎二价疫苗中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明还有一个目的是提供一种鸭病毒性肝炎二价疫苗。

本发明提供的鸭病毒性肝炎二价疫苗其活性成分为上述的组合物。

上述疫苗中，包括抗原和油佐剂；

上述疫苗中，所述抗原为将上述的组合物与吐温-80混合得到的混合物。

上述疫苗中，所述组合物中的所述鸭甲型肝炎病毒1型病毒、所述组合物中的所述鸭甲型肝炎病毒3型病毒和所述油佐剂的配比为9.6×10^5.25ELD₅₀:9.6×10^5.25ELD₅₀:4ml。

上述疫苗中，所述油佐剂为将Montanide ISA 206、硬脂酸铝和司本-80混合得到。

上述疫苗中，所述Montanide ISA 206、硬脂酸铝和司本-80的配比具体为94ml:2g:6ml。

上述疫苗中，所述抗原与所述油佐剂的体积比具体为1:1.5。

本发明还有一个目的是提供一种制备鸭病毒性肝炎二价疫苗的方法。

本发明提供的制备鸭病毒性肝炎二价疫苗的方法包括如下步骤：

1)分别制备抗原和油佐剂；

所述抗原的制备方法包括如下步骤：将上述的组合物和吐温-80混合，得到所述抗原；

所述组合物中的所述鸭甲型肝炎病毒1型病毒、所述组合物中的所述鸭甲型肝炎病毒3型病毒和所述吐温-80的配比具体为9.6×10^5.25ELD₅₀:9.6×10^5.25ELD₅₀:4ml；

所述油佐剂的制备方法包括如下步骤：将Montanide ISA 206、硬脂酸铝和司本-80混合，得到所述油佐剂；

所述Montanide ISA 206、硬脂酸铝和司本-80的配比具体为94ml:2g:6ml；

2)将所述抗原和所述油佐剂混匀，乳化，得到所述鸭病毒性肝炎二价疫苗；

所述抗原和所述油佐剂体积比具体为1:1.5。

本发明的最后一个目的是提供一种油佐剂。

本发明提供的油佐剂是由Montanide ISA 206、硬脂酸铝和司本-80组成。

上述油佐剂，所述Montanide ISA 206、硬脂酸铝和司本-80的配比具体为94ml:2g:6ml。

上述的油佐剂在制备鸭病毒性肝炎疫苗中的应用也属于本发明的保护范围。

上述的DHAV-SH株CGMCC No.10988和/或DHAV-FS株CGMCC No.4457在制备鸭病毒性肝炎疫苗中的应用也属于本发明的保护范围。

上述的DHAV-SH株的分类命名为鸭甲型肝炎病毒1型，该菌株已于2014年12月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.10098。

本发明提供的鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗具有如下优点：(1)使用毒株为流行优势株；(2)同时对1型鸭肝炎病毒和3型鸭肝炎病毒具有预防作用；(3)使用灭活病毒制成，安全性好；(4)使用新型佐剂免疫效果稳定，免疫持续时间长；(5)保存、运输(2-8℃条件)和使用方便(不需稀释)。

保藏说明

菌种名称：鸭甲型肝炎病毒1型

拉丁名：Duck hepatitis A virus type 1

菌株编号：DHAV-SH株

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2014年12月03日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.10098

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

如无特殊说明，所用鸭品种均为北京白羽鸭，购自北京金星鸭业有限公司。

下述实施例中的DHAV-SH株均为鸭甲型肝炎病毒1型(Duck hepatitis A virustype 1)，保藏号为CGMCC No.10098，公众可从中国科学院微生物研究所和北京信得威特科技有限公司获得。

下述实施例中的DHAV-FS株均为鸭甲型肝炎病毒1型(Duck hepatitis A virustype 3)，保藏号为CGMCC No.4457，在公开号为CN 102174476B中公开过。

实施例1、DHAV-SH株的获得

一、DHAV-SH株的发现

2013年12月在上海市的鸭场，刘文军和李晶从发病鸭体内分离获得了一株鸭病毒性肝炎Ⅰ型病毒，将其命名为DHAV-SH株。

二、DHAV-SH株的鉴定

1、病毒形态

DHAV-SH株的病毒粒子呈二十面体对称，直径约40nm。

2、分子生物学鉴定

提取DHAV-SH株的RNA，反转录后获得DNA，根据GENBANK发表的DHAV全基因序列设计的一对特异性引物(P1和P2)，用P1和P2对获得的DNA进行RT-PCR扩增，得到扩增产物。将扩增产物进行测序表明：扩增获得了大小为229bp的目的片段,其序列如序列表的序列1所示，与GENBANK发表的DHAV全基因序列具有很高的同源性。引物序列如下：

P1：5’-GTTCCAAATGATGATTATTATG-3’；

P2：5’-GGATCTGATTAGTACCAGATAAG-3’。

3、血凝性

DHAV-SH株对鸡、兔、猪、豚鼠红细胞均不凝集。

4、对细胞的半数感染量(TCID₅₀)

DHAV-SH株第16代的细胞毒为10^7.5TCID₅₀/ml、27代的细胞毒为10^7.05TCID₅₀/ml。

5、对鸡胚的半数感染量(EID₅₀)

DHAV-SH株第13代的滴度为10^6.5EID₅₀/0.1ml。

6、对雏鸭的致病力测定

DHAV-SH株3代对雏鸭的致病力测定，滴度为10^4.45ID₅₀/ml，10^3.9LD₅₀/ml。ID₅₀为半数感染量，LD₅₀为半数致死量。

7、稳定性

将DHAV-SH株在细胞传32代，每0.1ml病毒含量均为10^6.5TCID₅₀以上，DHAV-SH毒株在32代以内是稳定的，可以作为疫苗生产用种毒。

8、免疫原性

DHAV-SH株F₁-F₃₂均具有良好的免疫原性,利于疫苗的研究。

9、特异性

将DHAV-SH株稀释至10⁴TCID₅₀/ml，与等量抗鸭肝炎病毒特异性血清混合，室温放置1小时后，接种SPF鸡胚10个，观察120小时。在24～120小时内不引起特异性死亡，且至少存活8个。

综合以上鉴定和分析，DHAV-SH株的分类命名为鸭甲型肝炎病毒1型，该菌株已于2014年12月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.10098。

实施例2、鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗的制备

一、抗原的制备

1、制备病毒液

将DHAV-SH株经尿囊腔接种11日龄易感鸭胚，每胚0.1mL，37℃孵育120小时，然后无菌收集胚液和胚体，高速匀浆(14000r/min)，然后用8层无菌纱布网过滤，收集滤液，-20℃冻融一次，得到DHAV-SH株病毒液。每0.1mL的DHAV-SH株病毒液的病毒含量＝10^6.25ELD₅₀(鸭胚半数致死剂量)。实际应用中每0.2mL的DHAV-SH株病毒液的病毒含量≥10^6.25ELD₅₀均可。

将DHAV-FS株经尿囊腔接种11日龄易感鸭胚，每胚0.1mL，37℃孵育120小时，然后无菌收集胚液和胎儿，高速匀浆(14000r/min)，然后用8层无菌纱布网过滤，收集滤液，-20℃冻融一次，得到DHAV-FS株病毒液。每0.1mL的DHAV-FS株病毒液的病毒含量＝10^6.30ELD₅₀(鸭胚半数致死剂量)。实际应用中每0.2mL的DHAV-FS株病毒液的病毒含量≥10^6.30ELD₅₀均可。

2、灭活

向100ml步骤1得到的DHAV-SH株病毒液中加入0.2ml的甲醛溶液(甲醛溶液中甲醛的体积分数为37-40％)，37℃孵育24小时，得到灭活后的DHAV-SH株病毒液(病毒量为10^6.25ELD₅₀/100ml)。

向100ml步骤1得到的DHAV-FS株病毒液中加入0.2ml的甲醛溶液(甲醛溶液中甲醛的体积分数为37-40％)，37℃孵育24小时，得到灭活后的DHAV-FS株病毒液(病毒量为10^6.25ELD₅₀/100ml)。

3、抗原的制备

将步骤2得到的灭活后的DHAV-SH株病毒液和灭活后的DHAV-FS株病毒液等体积混合，得到混合病毒液(体积比为1:1)。在96mL的混合病毒液中加入4ml的灭菌后的吐温-80，充分溶解，得到抗原。

二、油佐剂的制备

在94ml的Montanide ISA206(法国赛比克公司，ISA206)中加入2g硬脂酸铝(上海裕明实业有限公司，637-12-7)，加热使之完全溶解，然后加入6ml司本-80(上海申宇医药化工有限公司，9005-65-6)，121℃高压灭菌30分钟，得到油佐剂。

三、鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗的制备

用乳化剪切机将1体积份步骤一得到的抗原和1.5体积份步骤二得到的油佐剂混合，开启乳化剪切机90s后停60s，循环3次，得到鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗。外观形状为均匀乳白色乳剂、粘稠度为7.6s/0.4ml、离心后无水相析出。

按照上述方法重复制备鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗，每次制备的鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗即为一个批次。得到批次1的鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗、批次2的鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗、批次3的鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗。

实施例3、鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗的稳定性

取3个批次的鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗保存于4℃，保存3、6、9、12、15个月后取样进行物理性状检测，并将检验结果同生产后检测结果相比。

结果表明：3批试验室制品于2～8℃保存3、6、9、12、15个月后，其物理性状均保持稳定，外观、剂型、稳定性和黏度均符合《试行规程》(草案)中质量标准的规定。详细结果见表1。

表1、3批实验室制品不同保存时间的物理性状检测结果

实施例4、鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗的安全性

取实施例1制备的3个批次的鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗，分别对1日龄的番鸭、半番鸭、北京白羽鸭进行单次使用剂量注射(每只注射0.4ml，每只0.1kg)。

取实施例1制备的3个批次的鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗，分别对1日龄的番鸭、半番鸭、北京白羽鸭进行单次超剂量注射(每只注射0.8ml，每只0.1kg)。

取实施例1制备的3个批次的鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗，分别对1日龄的番鸭、半番鸭、北京白羽鸭进行单剂量重复注射(第一次注射14天后进行第二次注射每次每只注射0.4ml，每只0.1kg)。

结果均安全，无明显的局部和全身反应。

实施例5、鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗的效力

一、抗体效价

将1日龄北京白羽雏鸭分为5组，每组20只，分别进行如下处理：

第一组：取鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗原液(批次1)，对20只1日龄北京白羽鸭进行单次免疫(每只注射0.4ml)，注射方法为皮下注射，14天、28天后检测血清中和抗体效价。

血清中和抗体效价检测方法如下：

1、于第一组随机抽选10只雏鸭，用1ml注射器，于鸭颈部静脉采血0.8ml。采集血液放入37℃放置半小时后，5000rpm离心收集血清。

2、将步骤1中收集到血清置于56℃水浴锅中，灭活30min。

3、将步骤2中灭活后的血清，用无菌生理盐水2倍倍比稀释，于每个稀释度中加入等量体积的DHAV-SH株病毒液(病毒滴度为200ELD₅₀/0.2ml)，混合后于37℃放置1h。

4、将步骤2中灭活后的血清，用无菌生理盐水2倍倍比稀释，于每个稀释度中加入等量体积的DHAV-FS株病毒液(病毒滴度为200ELD₅₀/0.2ml)，混合后于37℃放置1h。

5、将步骤3所得病毒血清混合液体接种11日龄鸭胚，每个稀释度接种3枚鸭胚。24h后每隔12h照胚一次(弃去24h内死亡鸭胚)，记录死亡鸭胚个数。按照Reed-Muench法计算中和效价。

6、将步骤4所得病毒血清混合液体接种11日龄鸭胚，每个稀释度接种3枚鸭胚。24h后每隔12h照胚一次(弃去24h内死亡鸭胚)，记录死亡鸭胚个数。按照Reed-Muench法计算中和效价。

结果如表2所示：用实施例1制备的疫苗原液，经颈部皮下注射接种14天后，雏鸭对DHAV-SH株(病毒滴度为200ELD₅₀/0.2ml)的中和抗体效价均＞1:24，对DHAV-FS株(病毒滴度为200ELD₅₀/0.2ml)的中和抗体效价均＞1:24；28天后雏鸭对DHAV-SH株(病毒滴度为200ELD₅₀/0.2ml)的中和抗体效价均＞1:32，对DHAV-FS株(病毒滴度为200ELD₅₀/0.2ml)的中和抗体效价均＞1:32。

表2、第1组免疫后攻毒抗体效价结果

第二组：取鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗原液(批次1)，对20只1日龄北京白羽鸭进行单次免疫(每只注射0.4ml)，注射方法为肌肉注射，14天、28天后检测血清中和抗体效价。血清中和抗体效价检测方法参照第一组。

结果如表3所示：用实施例1制备的疫苗原液，经腿部肌肉注射免疫14天后，雏鸭对DHAV-SH株(病毒滴度为200ELD₅₀/0.2ml)的中和抗体效价均＞1:24，对DHAV-FS株(病毒滴度为200ELD₅₀/0.2ml)的中和抗体效价均＞1:24；28天后雏鸭对DHAV-SH株(病毒滴度为200ELD₅₀/0.2ml)的中和抗体效价均＞1:32，对DHAV-FS株(病毒滴度为200ELD₅₀/0.2ml)的中和抗体效价均＞1:32。

表3、第2组免疫后攻毒抗体效价结果

第三组：取含1/2鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗原液的稀释液(批次1)，对20只1日龄北京白羽鸭进行单次免疫(每只注射0.4ml)，14天、28天后检测血清中和抗体效价，血清中和抗体效价检测方法参照第一组。

结果如表4所示：用实施例1制备的疫苗的1/2疫苗疫原液免疫后14天，雏鸭对DHAV-SH株(病毒滴度为200ELD₅₀/0.2ml)的中和抗体效价均＞1:16，对DHAV-FS株(病毒滴度为200ELD₅₀/0.2ml)的中和抗体效价均＞1:16；28天后雏鸭对DHAV-SH株(病毒滴度为200ELD₅₀/0.2ml)的中和抗体效价均＞1:32，对DHAV-FS株(病毒滴度为200ELD50/0.2ml)的中和抗体效价均＞1:32。

表4、第3组免疫后攻毒抗体效价结果

第四组：取鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗原液(批次1)，对20只1日龄北京白羽鸭进行单次免疫(每只注射0.4ml)，14天、28天后检测血清中和抗体效价，血清中和抗体效价检测方法参照第一组。

结果如表5所示：用实施例1制备的疫苗原液免疫后14天雏鸭对DHAV-SH株(病毒滴度为200ELD₅₀/0.2ml)的中和抗体效价均＞1:24，对DHAV-FS株(病毒滴度为200ELD₅₀/0.2ml)的中和抗体效价均＞1:24；28天后雏鸭对DHAV-SH株(病毒滴度为200ELD₅₀/0.2ml)的中和抗体效价均＞1:32，对DHAV-FS株(病毒滴度为200ELD₅₀/0.2ml)的中和抗体效价均＞1:32。

表5、第4组免疫后攻毒抗体效价结果

第五组：取生理盐水，对20只1日龄北京白羽鸭进行单次免疫(每只注射0.4ml)，14天后检测血清中和抗体效价，血清中和抗体效价检测方法参照第一组。

结果如表6所示：雏鸭对DHAV-SH株(病毒滴度为200ELD₅₀/0.2ml)的中和抗体效价均＜1:2，对DHAV-FS株(病毒滴度为200ELD₅₀/0.2ml)的中和抗体效价均＜1:2。

表6、第5组(生理盐水对照组)攻毒抗体效价检测结果

二、攻毒试验

将1日龄北京白羽雏鸭分为2组，每组40只，分别进行如下处理：

第一组：皮下注射实施例1制备的鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗(批次1)，每次每只注射0.4ml。免疫14天后，其中10只肌肉注射DHAV-SH株、另10只注射DHAV-FS株，每只攻毒剂量均为100LD₅₀。每天观察，攻毒后第14天统计攻毒保护率(即未死亡的只数占总只数的百分率)。

第二组(对照组)：皮下注射生理盐水，每次每只注射0.4ml。免疫14天后，其中10只肌肉注射DHAV-SH株、另10只注射DHAV-FS株，每只攻毒剂量均为100LD₅₀。每天观察，攻毒后第14天统计攻毒保护率(即未死亡的只数占总只数的百分率)。

结果如表7所示：雏鸭的被动保护期为14天，用生理盐水免疫种鸭后，雏鸭在各个时期的攻毒保护率均为0％，但用实施例1制备的疫苗免疫后，雏鸭第1-14天的攻毒保护率均为80％以上。

表7、攻毒保护结果

三、雏鸭免疫持续期试验

将1日龄北京白羽鸭分为2组，每组60只，分别进行如下处理：

第一组(免疫组)：皮下注射实施例1制备的鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗(批次1)，免疫14天，每次每只注射0.4ml；

第二组(对照组)：皮下注射生理盐水，免疫14天，每次每只注射0.4ml。分别于免疫后7天、14天、21天、28天、42天和63天，随机取第一组的20只鸭、第二组的20只鸭，采血、分离血清并分别按照步骤一中的方法测定血清中的鸭甲型肝炎病毒1型DHAV-SH株和鸭甲型肝炎病毒3型DHAV-FS株的中和抗体效价。

结果如表8所示：用实施例1制备的疫苗免疫雏鸭后7-63天，第一组14天、21天所有待检鸭血清对DHAV-SH株的中和抗体效价均＞1:16，对DHAV-FS株的中和抗体效价均＞1:16，28天所有待检鸭血清对DHAV-SH株的中和抗体效价均＞1:32，对DHAV-FS株的中和抗体效价均＞1:32，42天、63天所有待检鸭血清对DHAV-SH株的中和抗体效价均＞1:16，对DHAV-FS株的中和抗体效价均＞1:16，疫苗对种鸭的免疫持续期为60天以上；第二组所有待检鸭血清对DHAV-SH株(病毒滴度为200ELD₅₀/0.2ml)的中和抗体效价均＜1:2，对DHAV-FS株(病毒滴度为200ELD₅₀/0.2ml)的中和抗体效价均＜1:2。

表8、免疫雏鸭免疫后7-63日免疫组和对照组发病情况

Claims (8)

1.鸭甲型肝炎病毒1型DHAV-SH株，其保藏编号为CGMCC No.10098。

2.权利要求1所述的鸭甲型肝炎病毒1型DHAV-SH株在制备鸭病毒性肝炎二价疫苗中的应用。

3.一种鸭肝炎病毒的组合物，它的活性成分由鸭甲型肝炎病毒1型病毒和鸭甲型肝炎病毒3型病毒组成；

所述鸭甲型肝炎病毒1型病毒和所述鸭甲型肝炎病毒3型病毒的病毒量比为1:1；

所述鸭甲型肝炎病毒1型病毒为灭活的鸭甲型肝炎病毒1型病毒；

所述鸭甲型肝炎病毒3型病毒为灭活的鸭甲型肝炎病毒3型病毒；

所述鸭甲型肝炎病毒1型的病毒株具体为鸭甲型肝炎病毒1型DHAV-SH株CGMCCNo.10098；

所述鸭甲型肝炎病毒3型的病毒株具体为鸭甲型肝炎病毒3型DHAV-FS株CGMCCNo.4457。

4.权利要求3所述的组合物在制备鸭病毒性肝炎二价疫苗中的应用。

5.一种鸭病毒性肝炎二价疫苗，其活性成分为权利要求3所述的组合物。

6.根据权利要求5所述的疫苗，其特征在于：所述疫苗包括抗原和油佐剂；

所述抗原为将权利要求3所述的组合物与吐温-80混合得到的混合物；所述组合物中的所述鸭甲型肝炎病毒1型病毒、所述组合物中的所述鸭甲型肝炎病毒3型病毒和所述吐温-80的配比为9.6×10^5.25ELD₅₀:9.6×10^5.25ELD₅₀:4ml；

所述油佐剂由Montanide ISA 206、硬脂酸铝和司本-80混合而成；

所述油佐剂中，所述Montanide ISA 206、硬脂酸铝和司本-80的配比具体为94ml:2g:6ml；

所述抗原与所述油佐剂的体积比具体为1:1.5。

7.一种制备鸭病毒性肝炎二价疫苗的方法，包括如下步骤：

1)分别制备抗原和油佐剂；

所述抗原的制备方法包括如下步骤：将权利要求3或4所述的组合物和吐温-80混合，得到所述抗原；

所述组合物中的所述鸭甲型肝炎病毒1型病毒、所述组合物中的所述鸭甲型肝炎病毒3型病毒和所述吐温-80的配比具体为9.6×10^5.25ELD₅₀:9.6×10^5.25ELD₅₀:4ml；

所述油佐剂的制备方法包括如下步骤：将Montanide ISA 206、硬脂酸铝和司本-80混合，得到所述油佐剂；

所述Montanide ISA 206、硬脂酸铝和司本-80的配比具体为94ml:2g:6ml；

2)将所述抗原和所述油佐剂混匀，乳化，得到所述鸭病毒性肝炎二价疫苗；

所述抗原和所述油佐剂体积比具体为1:1.5。

8.DHAV-SH株CGMCC No.10098和DHAV-FS株CGMCC No.4457在制备鸭病毒性肝炎疫苗中的应用。