CN112961835B - 一种3型鸭甲型肝炎病毒的强毒株及其应用和灭活疫苗 - Google Patents

一种3型鸭甲型肝炎病毒的强毒株及其应用和灭活疫苗 Download PDF

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Abstract

本发明适用于生物制品技术领域，提供了一种3型鸭甲型肝炎病毒的强毒株及其应用和灭活疫苗，该3型鸭甲型肝炎病毒的强毒株命名为DHAV‑3 G株，保藏号为CCTCC NO：V202109，其VP1基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。该强毒株对10日龄以下雏鸭致死率为100%。将该3型鸭甲型肝炎病毒的强毒株制备成灭活疫苗免疫雏鸭，免疫后21日血清中和抗体不低于1:32；将该灭活疫苗免疫种鸭，二免后抗体效价可维持6个月，所产的子代雏鸭可100%抵抗强毒攻击。

Description

一种3型鸭甲型肝炎病毒的强毒株及其应用和灭活疫苗
技术领域
本发明属于生物制品技术领域，尤其涉及一种3型鸭甲型肝炎病毒的强毒株及其应用和灭活疫苗。
背景技术
鸭病毒性肝炎是由鸭甲型肝炎病毒(Duck hepatitis A virus，DHAV)感染引起的，主要危害雏鸭的一种严重的疾病。临床上可以导致感染鸭出现肝脏肿大、出血、坏死等症状，具有发病急、传播速度快、病程短及死亡率高等特点，主要感染5周龄以内的雏鸭。已报道有3个不同血清型的DHAV，分别为血清1型(DHAV-1)、血清2型(DHAV-2)和血清3型(DHAV-3)，不同型的DHAV之间的血清交叉反应目前尚不完全清楚，但DHAV-1与DHAV-3之间无交叉中和作用。DHAV-2仅报道于台湾地区，与DHAV-1与DHAV-3之间的交叉反应目前未见有报道。
研究表明，DHAV-3是我国近年来主要流行的基因型，给我国的养鸭业带来了严重的经济损失。然而，目前尚无安全有效的DHAV-3疫苗，因此必须加快疫苗的研究日程。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种3型鸭甲型肝炎病毒的强毒株，旨在解决背景技术中提出的问题。
本发明实施例是这样实现的，一种3型鸭甲型肝炎病毒的强毒株，其命名为DHAV-3G株，保藏号为CCTCC NO：V202109，其于2021年1月16日进行保藏，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国，武汉，中国典型培养物保藏中心。
作为本发明实施例的一种优选方案，其VP1基因的核苷酸序列如序列表SEQ IDNO:1所示。
作为本发明实施例的另一种优选方案，上述强毒株对10日龄以下雏鸭致死率为100％。
本发明实施例的另一目的在于提供一种上述3型鸭甲型肝炎病毒的强毒株在作为疫苗的检验用强毒中的应用。
本发明实施例的另一目的在于提供一种上述3型鸭甲型肝炎病毒的强毒株在制备3型鸭甲型肝炎病毒的疫苗中的应用。
本发明实施例的另一目的在于提供一种3型鸭甲型肝炎病毒的灭活疫苗，包括抗原和佐剂，其中，所述抗原由上述3型鸭甲型肝炎病毒的强毒株经灭活制得。
作为本发明实施例的另一种优选方案，所述抗原灭活前的病毒含量不低于107.0DELD50/mL。
作为本发明实施例的另一种优选方案，所述佐剂包括白油、司本-80和硬脂酸铝，其中，白油和司本-80的体积比为(92～96):(4～8)，硬脂酸铝的质量与白油和司本-80的总体积比以g/mL计为(1～2):100。
作为本发明实施例的另一种优选方案，所述灭活疫苗用于免疫雏鸭，免疫后21日血清中和抗体不低于1:32。
作为本发明实施例的另一种优选方案，所述灭活疫苗用于免疫种鸭，二免后对种鸭所产的子代雏鸭有100％免疫保护率，二免后抗体效价可维持6个月。
本发明实施例提供的一种3型鸭甲型肝炎病毒的强毒株，毒力较强，其对10日龄以下雏鸭致死率为100％。将该3型鸭甲型肝炎病毒的强毒株制备成灭活疫苗免疫雏鸭，免疫后21日血清中和抗体不低于1:32；将该灭活疫苗免疫种鸭，二免后抗体效价可维持6个月；二免后对种鸭所产的子代雏鸭有100％保护率。
附图说明
图1为DHAV-3 G株的RT-PCR鉴定电泳结果图；其中，M：DNA maker；1：DHAV-3 G株扩增结果；2：阴性对照。
图2为DHAV-3 G株与DHAV代表毒株序列比对图。
图3为DHAV-3 G株的遗传进化分析图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
该实施例提供了一种3型鸭甲型肝炎病毒的强毒株的分离与鉴定方法，其包括：
1、病毒分离：在广西某鸭场3～20日龄北京鸭发生一种临床表现疑似鸭病毒性肝炎的疾病，死亡鸭肝脏肿大出血，有树枝状出血点或出血斑。无菌取病死鸭肝脏，加生理盐水研磨制成匀浆，冻融后离心10分钟，取上清液，过滤除菌。将滤液经尿囊腔接种10日龄鸭胚5枚，0.1mL/枚，37℃孵育。收获死亡鸭胚的尿囊液，按同样方法接种鸭胚传代2次。3代鸭胚全部死亡，且死亡时间一致，剖检死亡鸭胚可见胚体水肿、出血，肝出血或有白色坏死点。
2、中和试验鉴定：取死亡鸭胚尿囊液稀释100倍，分别与等量DHAV-1抗血清和等量DHAV-3抗血清混合，作为血清中和组；另设病毒对照组，与等量无菌生理盐水混合，均置37℃作用1小时，每组经尿囊腔接种鸭胚10枚，0.2mL/枚；同时设空白对照组10枚。置37℃孵育，鸭胚存活情况见表1。结果表明，分离病毒为DHAV-3病毒，命名为DHAV-3 G株，并将该DHAV-3 G株于2021年1月16日进行保藏，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国，武汉，保藏号为CCTCC NO：V202109。
表1血清中和试验鉴定结果
Figure GDA0003008540940000041
实施例2
该实施例提供了上述DHAV-3 G株VP1基因扩增及序列比对实验，其包括：
1、RT-PCR：取DHAV-3 G株病毒液，按照RNA提取试剂盒操作说明书进行病毒RNA提取，并按反转录试剂盒操作说明书进行反转录，然后取反转录产物进行PCR。所需引物序列如下，理论扩增长度为720bp。
DHAV-3F：5’-GGTGATTCCAATCAGCTTGGCG-3’(如序列表SEQ ID NO:2所示)；
DHAV-3R：5’-TTCAATTTCTAGATGGAGCTC-3’(如序列表SEQ ID NO:3所示)。
用1％琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行鉴定，结果见图1，在约720bp处出现了特异性的DNA条带。
2、序列测定：将上述电泳出特异性条带的扩增产物进行核苷酸序列测定。将获得的序列与Gen-Bank收录的其他DHAV毒株的VP1基因序列进行比对(如图2所示)，并分析遗传进化关系，如图3所示。其中，该DHAV-3 G株的VP1基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，具体为：
GGTGATTCCAATCAGCTTGGTGATGATGAACCAGTGTGTTTTCTCAATTTTGAGACTGCAAATGTGCCAATACAAGGGGAGTCGCACACCTTGGTGAAACATCTCTTTGGTCGTCAATGGCTGGTTCGTACTGTTCAACATACTGGTGAGGTACAAGAGTTGGATTTGCCAGTGCCTGACCAGGGTCATGCATCTCTGTTGCGCTTCTTTGCCTATTTCTCTGGAGAAGTGATTCTGACCATTGTCAATAATGGAACAACACCCTGCATGGTTGCACACTCTTATACAATGGACAATCTCACTTCTGAATATGCTGTCACTGCCATGGGGGGTATTCTTATCCCAGCAAACTCTGCCAAGAATATTAATATTCCATTTTATTCTGTCACACCTTTACGCCCCACACGACCCATGCCAGCATCTCAGGGGGGTGGTTTGACTTTTGGCAGGTTGTATATCTGGACACAATCAGGAAGCGTTTCTGTTTTTATGGGCCTCCACAAGCCAGCTTTGTTTTTCCCACTGCCTGCACCAACTTACACAACACACACGCTGTTGAATAAGATTAAAACCATGAATCTGCATGATCAATCAGATCAGCCAGACTGCCATCTGTGTGAGATTTGCAGGAAAATGAAGAAATGGTCTCGCAACCATCGCCCATTTCGCTTCTGTTTGAGACTTAAAACACTTGCCTTTGAGCTCCATTTGGAAATTGAA。
从中可以看出，该DHAV-3 G株VP1基因与DHAV-3代表毒株在同一分支上，遗传关系较近。分离株DHAV-3 G株的VP1基因与DHAV-3代表毒株(AP-03337等)的同源性为91.9％～96.2％，与DHAV-2代表株(04G)同源性为7 1.6％，与DHAV-1(HS等)代表毒株的同源率为67.5～68.3％。通过MEGA 6.0构建的系统进化树表明DHAV-3 G株与DHAV-3病毒株关系比较密切，与DHA V-2和DHAV-1病毒株关系较远(具体如图3所示)。
实施例3
该实施例提供了DHAV-3 G株对雏鸭的毒力实验，其包括：
将DHAV-3 G株对10日龄雏鸭进行攻毒，结果见表2。攻毒组雏鸭在攻毒后3日内全部死亡；空白对照组雏鸭在观察期内全部健活，无临床症状。对死亡雏鸭进行剖检，可见肝脏肿胀、充血，有出血斑和条状出血，空白对照组鸭剖检无病变。试验结果说明，G株对10日龄雏鸭的致死率为100％，毒力较强。
表2毒力试验结果
分组 试验数(只) 攻毒剂量(DELD<sub>50</sub>) 总死亡数/试验数
攻毒组1 10 100 10/10
攻毒组2 10 1000 10/10
空白对照组 10 1000 0/10
实施例4
该实施例提供了一种DHAV-3 G株灭活疫苗的制备方法，其包括：
S1、将DHAV-3 G株用无菌生理盐水稀释100倍，经尿囊腔接种10～11日龄易感鸭胚，每胚0.1mL，37℃孵育120小时，无菌收获死亡鸭胚的尿囊液及胎儿，高速匀浆，然后用120目筒纱网过滤，得到DHAV-3 G株病毒液。每mL病毒液的病毒含量不低于107.0DELD50。
S2、将质量浓度为0.1％的二乙烯亚胺(BEI)添加至DHAV-3 G株病毒液中，37℃作用24小时，以进行灭活，灭活检验合格后，得到DHAV-3 G株抗原。
S3、在94mL白油中加入2g硬脂酸铝，加热使其完全溶解，然后加入6mL司本-80，116℃高压灭菌30分钟，得到佐剂。
S4、将上述DHAV-3 G株抗原和佐剂按照1:1的质量比进行混合，缓慢乳化30分钟，即可得到DHAV-3 G株灭活疫苗。
实施例5
该实施例提供了一种DHAV-3 G株灭活疫苗的制备方法，其包括：
S1、将DHAV-3 G株用无菌生理盐水稀释100倍，经尿囊腔接种10～11日龄易感鸭胚，每胚0.1mL，37℃孵育120小时，无菌收获死亡鸭胚的尿囊液及胎儿，高速匀浆，然后用120目筒纱网过滤，得到DHAV-3 G株病毒液。每mL病毒液的病毒含量不低于107.0DELD50。
S2、将质量浓度为0.1％的二乙烯亚胺(BEI)添加至DHAV-3 G株病毒液中，37℃作用24小时，以进行灭活，灭活检验合格后，得到DHAV-3 G株抗原。
S3、在92mL白油中加入1g硬脂酸铝，加热使其完全溶解，然后加入8mL司本-80，116℃高压灭菌30分钟，得到佐剂。
S4、将上述DHAV-3 G株抗原和佐剂按照1:1的质量比进行混合，缓慢乳化30分钟，即可得到DHAV-3 G株灭活疫苗。
实施例6
该实施例提供了一种DHAV-3 G株灭活疫苗的制备方法，其包括：
S1、将DHAV-3 G株用无菌生理盐水稀释100倍，经尿囊腔接种10～11日龄易感鸭胚，每胚0.1mL，37℃孵育120小时，无菌收获死亡鸭胚的尿囊液及胎儿，高速匀浆，然后用120目筒纱网过滤，得到DHAV-3 G株病毒液。每mL病毒液的病毒含量不低于107.0DELD50。
S2、将质量浓度为0.1％的二乙烯亚胺(BEI)添加至DHAV-3 G株病毒液中，37℃作用24小时，以进行灭活，灭活检验合格后，得到DHAV-3 G株抗原。
S3、在96mL白油中加入1.5g硬脂酸铝，加热使其完全溶解，然后加入4mL司本-80，116℃高压灭菌30分钟，得到佐剂。
S4、将上述DHAV-3 G株抗原和佐剂按照1:1的质量比进行混合，缓慢乳化30分钟，即可得到DHAV-3 G株灭活疫苗。
实施例7
该实施例提供了上述DHAV-3 G株灭活疫苗在免疫雏鸭上的应用，其包括：
将实施例4制备的灭活疫苗对5只1～3日龄雏鸭进行免疫，免疫方式为颈部皮下，0.5mL/只；同时设置对照组。于免疫后21日翅静脉采血分离血清。将血清用0.22μm滤膜进行过滤，置56℃水浴灭活30分钟，用无菌生理盐水作4倍倍比稀释，取4-1、4-2、4-3、4-4稀释度分别与病毒含量为100DELD50/0.1mL的DHAV-3 G株等量混合，置37℃作用1小时，期间摇动1～2次。将各稀释度的中和液分别经尿囊腔接种10～11日龄鸭胚5枚，0.2mL/枚；同时病毒对照组5枚，将病毒含量为100DELD50/0.1mL的DHAV-3 G株与等量无菌生理盐水混合，置37℃作用1小时，期间摇动1～2次，经尿囊腔接种10～11日龄鸭胚5枚，0.2mL/枚；设空白对照组鸭胚5枚。将各组鸭胚置37℃孵育，连续观察168小时，记录鸭胚死亡情况。按Reed-Muench法计算血清中和效价，结果见表4。
表4中和效价检测结果
Figure GDA0003008540940000081
Figure GDA0003008540940000091
实施例8
该实施例提供了上述DHAV-3 G株灭活疫苗在免疫种鸭上的应用，其包括：
取DHAV-3 G株病毒液，用0.2％甲醛溶液进行灭活，与矿物油佐剂混合乳化，经颈部皮下免疫180日龄的种鸭50只，1mL/只；3周后使用同剂量加强免疫一次。另取同群种鸭50只作为非免疫对照组，隔离饲养。分别于种鸭二免后30日、90日和180日收集种蛋，每个时间点前后3日收集并统一进行孵化。同时采集同期非免疫种鸭所产种蛋进行孵化。
种鸭二免后30日、90日和180日，分别从翅下静脉采血1.5mL，分离血清，将血清置于56℃水浴中灭活30分钟，用无菌生理盐水进行4倍倍比稀释，选择适宜稀释度与病毒含量为100DELD50/0.1mL的DHAV-3 G株等体积混合，进行中和效价测定，结果见表5。结果显示，种鸭二免后180日抗体效价没有明显的下降。
表5免疫种鸭和非免疫种鸭的子代雏鸭3日龄血清中和效价测定结果
Figure GDA0003008540940000092
取种鸭二免后30日和180日所产种蛋孵化的子代雏鸭和同群非免疫种鸭同期所产种蛋孵化的子代雏鸭各10只，于10日龄时，用1000DELD50/0.5mL的DHAV-3 G株进行攻毒，每只鸭腿部肌肉注射0.5mL，连续观察7日，记录雏鸭死亡情况。种鸭免疫后所产种蛋孵化的子代雏鸭存活率达到10/10；同群非免疫种鸭同期所产种蛋孵化的子代雏鸭攻毒后存活率为0/10。结果如表6所示，母源抗体可以保护小鸭渡过易感期。
表6种鸭二免后不同时间所产种蛋孵化的子代雏鸭攻毒试验结果
组别 攻毒剂量 试验数(只) 存活数(只)
种鸭二免后30日孵化的雏鸭 1000DELD<sub>50</sub> 10 10
同群非免疫种鸭的子代雏鸭 1000DELD<sub>50</sub> 10 0
种鸭二免后180日孵化的雏鸭 1000DELD<sub>50</sub> 10 10
同群非免疫种鸭的子代雏鸭 1000DELD<sub>50</sub> 10 0
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Figure GDA0003008540940000111
Figure GDA0003008540940000121
序列表
<110> 上海创宏生物科技有限公司
国药集团动物保健股份有限公司
<120> 一种3型鸭甲型肝炎病毒的强毒株及其应用和灭活疫苗
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 720
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggtgattcca atcagcttgg tgatgatgaa ccagtgtgtt ttctcaattt tgagactgca 60
aatgtgccaa tacaagggga gtcgcacacc ttggtgaaac atctctttgg tcgtcaatgg 120
ctggttcgta ctgttcaaca tactggtgag gtacaagagt tggatttgcc agtgcctgac 180
cagggtcatg catctctgtt gcgcttcttt gcctatttct ctggagaagt gattctgacc 240
attgtcaata atggaacaac accctgcatg gttgcacact cttatacaat ggacaatctc 300
acttctgaat atgctgtcac tgccatgggg ggtattctta tcccagcaaa ctctgccaag 360
aatattaata ttccatttta ttctgtcaca cctttacgcc ccacacgacc catgccagca 420
tctcaggggg gtggtttgac ttttggcagg ttgtatatct ggacacaatc aggaagcgtt 480
tctgttttta tgggcctcca caagccagct ttgtttttcc cactgcctgc accaacttac 540
acaacacaca cgctgttgaa taagattaaa accatgaatc tgcatgatca atcagatcag 600
ccagactgcc atctgtgtga gatttgcagg aaaatgaaga aatggtctcg caaccatcgc 660
ccatttcgct tctgtttgag acttaaaaca cttgcctttg agctccattt ggaaattgaa 720
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggtgattcca atcagcttgg cg 22
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttcaatttct agatggagct c 21

Claims (8)

1.一种3型鸭甲型肝炎病毒的强毒株，其特征在于，其命名为DHAV-3 G株，保藏号为CCTCC NO：V202109。
2.一种如权利要求1所述3型鸭甲型肝炎病毒的强毒株在作为疫苗的检验用强毒中的应用。
3.一种如权利要求1所述3型鸭甲型肝炎病毒的强毒株在制备3型鸭甲型肝炎病毒的疫苗中的应用。
4.一种3型鸭甲型肝炎病毒的灭活疫苗，包括抗原和佐剂，其特征在于，所述抗原由如权利要求1所述3型鸭甲型肝炎病毒的强毒株经灭活制得。
5.根据权利要求4所述的一种3型鸭甲型肝炎病毒的灭活疫苗，其特征在于，所述抗原灭活前的病毒含量不低于107.0DELD50/mL。
6.根据权利要求4所述的一种3型鸭甲型肝炎病毒的灭活疫苗，其特征在于，所述佐剂包括白油、司本-80和硬脂酸铝，其中，白油和司本-80的体积比为(92~96):(4~8)，硬脂酸铝的质量与白油和司本-80的总体积比以g/mL计为(1~2):100。
7.根据权利要求4所述的一种3型鸭甲型肝炎病毒的灭活疫苗，其特征在于，所述灭活疫苗用于免疫雏鸭，免疫后21日血清中和抗体不低于1:32。
8.根据权利要求4所述的一种3型鸭甲型肝炎病毒的灭活疫苗，其特征在于，所述灭活疫苗用于免疫种鸭，二免后对种鸭所产的子代雏鸭有100%免疫保护率。
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