CN111748529A

CN111748529A - 猪伪狂犬病病毒毒株及其应用

Info

Publication number: CN111748529A
Application number: CN202010562896.8A
Authority: CN
Inventors: 郑良益; 漆世华; 石宝兰; 朱薇; 李晶梅; 舒银辉; 谢红玲; 王治江; 徐松; 李婷婷
Original assignee: National Pharmaceutical Group Animal Health Co ltd
Current assignee: National Pharmaceutical Group Animal Health Co ltd
Priority date: 2020-06-19
Filing date: 2020-06-19
Publication date: 2020-10-09
Anticipated expiration: 2040-06-19
Also published as: CN111748529B

Abstract

本发明公开了一种猪伪狂犬病病毒毒株及其应用。本发明提供的猪伪狂犬病病毒WH‑13株于2013年在湖北武汉某发病猪场分离，经鉴定，该毒株是一株毒力较强的流行毒株。将猪伪狂犬病病毒WH‑13株制备成灭活疫苗，仔猪免疫1次(2ml)，血清中和抗体水平不低于1:128，保护期长达6个月。采用基因工程方法将该毒株缺失TK、gE、gI基因，制成猪伪狂犬病活疫苗仔猪最小免疫剂量为10^3.0TCID₅₀，仔猪免疫1次血清中和抗体水平不低于1:145，对经典毒株和流行毒株的免疫保护率均为100％，保护期长达6个月。猪伪狂犬病病毒WH‑13株的保藏编号为：CCTCC NO:V202032。

Description

猪伪狂犬病病毒毒株及其应用

技术领域

本发明属于兽用生物制品领域，具体涉及一种猪伪狂犬病病毒毒株及其应用。猪伪狂犬病灭活疫苗和猪伪狂犬病减毒活疫苗的制备方法。

背景技术

伪狂犬病病毒(Pseudorabies Virus，PRV)属疱诊病毒科疱疹病毒甲亚科，水痘病毒属。猪伪狂犬病(PR)是由伪狂犬病病毒(PRV)引起的高度接触性传染病，猪的主要症状有发热、脑脊髓炎和繁殖障碍等症状。1813年该病最早发现于美国，随后在很多养猪国家均有发生，主要出现于南美洲、亚洲和欧洲等猪群密集地区，目前已呈世界性分布，流行呈现日益上升趋势，被世界动物卫生组织(OIE)列入需申报的疾病名录(OIE listed diseases)，是我国法定二类动物疫病。

猪伪狂犬病是当今危害全球养猪业最严重的传染病之一，一旦发生很难进行根除，该病在我国广泛存在，给我国养猪业造成巨大的经济损失。目前，对该病的防控，国内外均以疫苗免疫预防为主，结合伪狂犬病毒gE抗原和gE抗体检测淘汰、净化野毒感染猪。

2011年以前，为了预防猪伪狂犬病，一般广泛使用含标记基因gE缺失的Barthr-K61株活疫苗，应用效果较好，大体控制住了伪狂犬病。2011年，伪狂犬病再次爆发，据相关学者报道，这次爆发是由伪狂犬病病毒变异引起的；据学者研究表明，新出现的PRV变异毒株与经典毒株有着不同的抗原性，会引起35日龄以上的猪产生神经症状，并出现死亡，而目前市面上的Barthr-K61株疫苗并不能完全保护2011年以后分离的这些PRV野毒株。因此，需要采用国内2011年以后分离的流行毒株制备的灭活疫苗或基因缺失减毒活疫苗来预防猪伪狂犬病经典毒株和流行毒株。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的就是提供一种猪伪狂犬病病毒毒株及其应用，充分利用该毒株制备疫苗后的安全、有效、质量可控等优势，为我国伪狂犬病的防控做出一定的贡献。

本发明提供的猪伪狂犬病病毒，分类命名：疱疹病毒科猪疱疹病毒I型猪伪狂犬病病毒WH-13株；保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；保藏时间：2020年6月2日；保藏编号：CCTCC NO:V202032；保藏单位地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学。

上述的猪伪狂犬病病毒WH-13株于2013年在湖北武汉某发病猪场分离，经鉴定，该毒株在鸡胚成纤维细胞(CEF)、Vero细胞、猪睾丸细胞(ST)、PK-15细胞、BHK-21细胞上均能出现典型细胞病变；能被伪狂犬病特异性阳性血清中和；在电镜下能看到伪狂犬病病毒粒子。确定该病毒为猪伪狂犬病病毒，命名为WH-13株。

猪伪狂犬病病毒WH-13株能致死小鼠和家兔，能使8～9周龄仔猪5/5发病，并出现死亡。

猪伪狂犬病病毒WH-13株进化分析，各毒力基因进化树上与早期分离毒株亲缘关系较远，而与2011年后中国各分离流行毒株亲缘关系较近。

本发明的猪伪狂犬病病毒用于制备疫苗。

相较于现有技术，本发明的优点及有益效果如下：

本发明的猪伪狂犬病病毒WH-13株采用基因工程方法缺失gE基因后(PRV WH-13株(gE－))，接种BHK-21细胞、扩繁，收获病毒液，采用二乙烯亚胺灭活后，与适宜佐剂混合，制备成gE基因缺失灭活疫苗，其安全性好、有效性均良好，对经典毒株和流行毒株的免疫保护率均为100％，可以针对gE蛋白的抗体进行检测，区分疫苗免疫和野毒感染，有利于伪狂犬病的净化。

本发明的猪伪狂犬病病毒WH-13株采用基因工程方法缺失TK、gE、gI基因后(PRVWH-13株(TK－/gE－/gI－))，接种BHK-21细胞、扩繁，收获病毒液，加入适宜冻干保护剂，制成猪伪狂犬病活疫苗，安全性、有效性均良好，对经典毒株和流行毒株的免疫保护率均为100％，其对流行毒株的保护效果明显优于Bartha-K61株活疫苗；针对gE蛋白的抗体检测可以区分疫苗毒和野毒的感染，有利于伪狂犬病的净化。

附图说明

图1为PRV WH-13株gE基因的PCR扩增电泳图；WH-13株扩增出约360bp的特异性条带，阳性对照为闽A株，阴性对照为灭菌超纯水。

图2为PRV WH-13株gB基因的PCR扩增电泳图；WH-13株扩增出约550bp的特异性条带，阳性对照为闽A株，阴性对照为灭菌超纯水。

图3为WH-13株病毒电镜图片(40000倍)；箭头所指处为伪狂犬病病毒粒子，形状呈圆形，病毒颗粒大小为150nm左右。

图4为依据PRV gC基因全长ORF绘制的遗传进化树；即PRV WH-13株与2011年以前及2011年以后，国内外分离毒株的gC全长ORF基因绘制的遗传进化树。

图5为依据PRV gD基因全长ORF绘制的遗传进化树；即PRV WH-13株与2011年以前及2011年以后，国内外分离毒株的gD全长ORF基因绘制的遗传进化树。

具体实施方式：

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细的描述

实施例1：猪伪狂犬病病毒的分离、鉴定

1分离

1.1病料处理自2011年以来，我国华北、华东、华中、华南等地区出现猪伪狂犬病流行，造成母猪流产、产死胎、木乃伊胎，仔猪、保育猪群出现大量死亡。2013年9月，武汉某免疫过伪狂犬病Bartha-K61株活疫苗的猪场发生了猪伪狂犬病，母猪出现流产；乳猪、保育猪出现大批量死亡。我们采集了该猪场发病死亡保育猪的脑和肺组织，混合剪碎后加入5倍体积的DMEM培养基，在灭菌的研钵内研磨制备成组织悬液，将该组织悬液于-20℃反复冻融3次后，3000r/min离心30分钟，取上清液用0.22μm微孔滤膜过滤，加入适量青、链霉素，-70℃保存作为接种材料。

1.2病毒分离将经过除菌处理的脑和肺脏组织悬液样品，接种BHK-21细胞，传至第5代，稳定在12～24小时可见细胞肿胀、出现颗粒、失去光泽，继而圆缩，脱落，并可见到许多巨细胞，与PRV闽A株所致细胞病变类似。将第5代细胞培养物接种ST细胞、Vero细胞、PK-15细胞和鸡胚成纤维细胞，均产生典型细胞病变，证实分离病毒能在不同细胞上增殖，符合伪狂犬病病毒对多种细胞易感的普遍特性。

2鉴定

2.1PCR鉴定根据PRV gB和gE基因分别设计2对引物。gB基因鉴定片段的预期扩增长度为549bp，gE基因鉴定片段的预期扩增长度为366bp。结果表明，gE-F-1/gE-R-1引物和gB-F/gB-R引物均扩增出特异性条带，阳性对照为闽A株，阴性对照为灭菌超纯水。见图1和图2。

2.2电镜观察病毒上清液经超高速离心，取沉淀物经磷钨酸钠负染后在电镜下见到典型的PRV颗粒。病毒粒子形状呈圆形，病毒颗粒大小为150nm左右。见图3。

2.3中和试验采用中和试验法，对病毒特异性进行鉴定。将分离病毒液用灭菌生理盐水稀释成每0.1ml含200TCID₅₀的病毒悬液，取50μl病毒悬液与等量的猪伪狂犬病特异性阳性血清充分混合，37℃作用1小时后，接种已形成良好细胞单层的BHK-21细胞瓶(25cm²)，每瓶0.1ml，接种2瓶，同时设病毒对照和正常细胞对照各2瓶。置37℃、含5％CO₂培养箱中培养5日。病毒对照细胞均出现CPE；正常细胞对照与病毒中和细胞均未出现CPE，均能被猪伪狂犬病特异性阳性血清中和。

2.4理化特性猪伪狂犬病病毒WH-13株对乙醚、氯仿以及胰蛋白酶均敏感；在56℃加热30分钟被完全灭活。

试验结果表明，该分离病毒为猪伪狂犬病病毒，命名为WH-13株。

实施例2：猪伪狂犬病病毒的基因分析

PRV WH-13株的变异及进化分析：利用设计的gC、gD的全基因扩增引物，分别扩增获得PRV WH-13株gC和gD基因的全长，经测序后，与其它GenBanK中毒株序列进行比对并绘制相应的遗传进化树。

结果显示，WH-13株gC基因ORF的核苷酸长度为1464bp，编码487个氨基酸，测序编号为NO.1。依据PRV gC ORF全长基因序列绘制遗传进化树，如图4。结果显示，WH-13株与国内2011年后分离的流行毒株(HeN1.seq、HNX.seq、ZJ01.seq)的亲缘关系较近，但与Bartha株和国内早些年分离毒株(Ea.seq、Fa.seq)的亲缘关系较远。

WH-13株gD基因ORF核苷酸全长为1209bp，编码402个氨基酸残基，测序编号为NO.2。依据PRV gD ORF全长基因序列绘制遗传进化树，如图5。结果显示，WH-13株与国内2011年后分离的流行毒株(HeN1.seq、HNX.seq、ZJ01.seq)的亲缘关系较近，但与Bartha株和国内早些年分离毒株(Ea.seq、Fa.seq)的亲缘关系较远。

实施例3：猪伪狂犬病病毒的毒力

1、对小鼠的毒力试验：

将分离培养的WH-13株F5代病毒悬液接种昆明小鼠5只，每只在腹腔注射0.1ml，并设5只健康小鼠作为空白对照。小鼠于接种后24小时表现为狂躁不安，尖叫，于接种后36小时出现被毛杂乱，自行啃咬注射部位，5只小鼠于攻毒72～96小时死亡，空白对照小鼠均健活。

2、对兔的毒力试验

将分离培养的WH-13株F5代病毒悬液接种健康兔5只，每只在腿部肌肉注射1ml，并设健康兔5只作为空白对照。接种24小时后，兔表现为奇痒，用嘴啃咬注射部位，使注射部位被毛脱落，皮肤受损，暴露出红色肌肉，头、颈、背部等多处擦伤，36～48小时四肢出现麻痹而死亡，空白对照兔均健活。

3、对仔猪的毒力试验

用生理盐水将WH-13株F5代病毒悬液稀释成10^6.0TCID₅₀/ml，接种5头仔猪，攻毒方法为每头滴鼻2ml，另设5头仔猪为空白对照。仔猪接种后100％(5/5)出现有精神沉郁、食欲减退、呼吸困难、流涕、拉稀或明显神经症状等临床表现，体温≥41.0℃持续3～7日，并在接种后第6日、第8日和第13日各死亡1头试验猪。攻毒猪肺部表现出血、水肿、坏死；脾脏有坏死灶；脑部表现充血、出血。空白对照猪无任何临床症状，体温在38.6～39.6℃，解剖后观察，肺、脾、脑部均无病理变化；闽A株攻毒组仔猪5/5发病，但未出现死亡。说明分离的猪伪狂犬病病毒WH-13株是一株毒力较强的流行毒株。

实施例4：猪伪狂犬病病毒gE基因缺失灭活疫苗制备及检验

1疫苗制备

1.1将猪伪狂犬病病毒WH-13株采用基因工程方法缺失gE基因(PRV WH-13株(gE－))。

1.2将已成长单层的BHK-21细胞弃去生长液，按1％(V/V)接种PRV WH-13株(gE－)毒种，加入含2％新生牛血清的DMEM细胞培养液，置37℃培养并观察2～3日，当75％以上细胞出现病变时收获，置-40℃以下冻融1次，离心后分装，取样鉴定。

1.3加入浓度为1mol/L的BEI至终浓度为0.01mol/L，边加边搅拌，混合均匀后，保持35～38℃，灭活24小时。

1.4取水溶性佐剂与灭活后病毒液按1:5的比例混匀，制备成灭活疫苗。

2疫苗检验

2.1性状久置后有少量沉淀，振摇后呈均匀混悬液。

2.2无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，无菌生长。

2.3安全性疫苗接种3～4周龄仔猪20头，每头颈部肌肉注射4ml。同时设立对照猪5头(不免疫)。免疫后观察仔猪均未出现因注射疫苗引起的不良反应，逐日观察14日，每日测量体温1次，体温均正常(38.9～39.8℃)。每日观察试验猪均未出现异常临床反应状况。临床观察结果见表1；体温结果见表2。

表1试验猪接种疫苗后临床观察结果

试验组别	过敏反应数(头)	出现异常临床症状数(头)	出现注射部位肿胀数(头)
				试验组	0/20	0/20	0/20
对照组	0/5	0/5	0/5

备注：“过敏反应”——精神沉郁、口吐白沫、呕吐、倒地、呼吸困难、全身发紫、死亡等。

“异常临床症状”——精神沉郁、食欲减退、呼吸困难、腹泻、共济失调、麻痹、四肢乱划、角弓反张、死亡等。“/”表示没有进行接种。

表2试验猪接种疫苗后体温测量结果

2.4有效性通过对仔猪免疫猪伪狂犬病病毒WH-13株灭活疫苗(灭活前病毒含量为10^5.0TCID₅₀/ml)，免后28日，分别进行流行毒株和经典毒株强毒攻击，攻毒前采血检测血清中和抗体效价。结果表明，免后28日，免疫组血清中和抗体为1:128～1:256；攻毒对照组血清中和抗体为＜1:2～1:8；免疫组对流行毒株和经典毒株的攻毒保护率均为100％(10/10)；流行毒株和经典毒株攻毒对照组均10/10发病，流行毒株攻毒组在攻毒后共死亡6头。空白对照组无任何不良反应。通过对免疫组的中和抗体水平进行监测，中和抗体在猪体内可持续6个月。对流行毒株攻毒结果见表3；对经典毒株攻毒结果见表4。

PRV WH-13株(gE－)灭活疫苗安全性好；对猪伪狂犬病病毒流行毒株和经典毒株保护率均为100％。该毒株具有开发成灭活疫苗或相关类联苗的商业潜质。

表3仔猪免疫攻毒试验结果——流行毒株攻毒组

*注：A—精神沉郁、食欲减退；B—呼吸困难(含咳嗽、喘气、张嘴呼吸、腹式呼吸)；C—流涕、拉稀；D—神经症状(共济失调、麻痹、四肢乱划、角弓反张等)；E—死亡；“无”—无临床症状。“+”表示发病，“-”表示未发病。

表4仔猪免疫攻毒试验结果——经典毒株攻毒组

实施例5：猪伪狂犬病病毒基因缺失减毒活疫苗制备及检验

1疫苗制备

1.1将猪伪狂犬病病毒WH-13株采用基因工程方法缺失gE、gI、TK基因(PRV WH-13株(TK－/gE－/gI－))。

1.2将已成长单层的BHK-21细胞弃去生长液，按3％(V/V)接种PRV WH-13株(TK－/gE－/gI－)毒种，加入含2％新生牛血清的DMEM细胞培养液，置37℃培养并观察2～3日，当75％以上细胞出现病变时收获，置-40℃以下冻融1次，离心后分装，取样鉴定。

1.3取脱脂牛奶、蔗糖保护剂与病毒液按1:1的比例混匀、分装成2ml/瓶，再进行冷冻干燥，制备成冻干疫苗。

2疫苗检验

2.1性状海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。

2.3支原体检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，无支原体生长。

2.4外源病毒检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，无外源病毒污染。

2.5安全性疫苗接种3～4周龄仔猪20头，每头颈部肌肉注射10头份(每头份不低于10^6.0TCID₅₀)。同时设立对照猪5头(不免疫)。免疫后观察仔猪均未出现因注射疫苗引起的不良反应，逐日观察14日，每日测量体温1次，体温均正常(39.0～39.8℃)。每日观察试验猪均未出现异常临床反应状况。随机取2头仔猪脑、肺、淋巴结组织分离病毒，再次接种2头仔猪，盲传5代，未见毒力返强。临床观察结果见表5；体温结果见表6；毒力返强结果见表7。

表5试验猪接种疫苗后临床观察结果

表6试验猪接种疫苗后体温测量结果

表7毒力返强试验结果

2.6有效性通过对仔猪免疫猪伪狂犬病病毒WH-13株基因缺失减毒活疫苗(每头份不低于10^3.0TCID₅₀)，免后21日，分别进行流行毒株和经典毒株强毒攻击，攻毒前采血检测血清中和抗体效价。结果表明，免后21日，免疫组血清中和抗体为1:145～1:256；攻毒对照组血清中和抗体为＜1:2～1:4；免疫组对流行毒株和经典毒株的攻毒保护率均为100％(10/10)；流行毒株和经典毒株攻毒对照组均10/10发病，流行毒株攻毒组在攻毒后死亡7头。伪狂犬病活疫苗(Bartha-K61株)对经典毒株的保护率为100％，对流行毒株的保护率为60％。空白对照组无任何不良反应。通过对免疫组的中和抗体水平进行监测，中和抗体在猪体内可持续6个月。对流行毒株攻毒结果见表8；对经典毒株攻毒结果见表9。

PRV WH-13株(TK－/gE－/gI－)活疫苗安全性好，毒力不返强；对猪伪狂犬病病毒流行毒株和经典毒株保护率均为100％。该毒株具有开发成减毒活疫苗或相关类联苗的商业潜质。

表8仔猪免疫攻毒试验结果——流行毒株攻毒组

表9仔猪免疫攻毒试验结果——经典毒株攻毒组

序列表

<110> 国药集团动物保健股份有限公司

<120> 猪伪狂犬病病毒毒株及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1464

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 1

atggcctcgc tcgcgcgtgc gatgctcgcg ctgctggcgc tctacacggc ggccatcgcc 60

gcggcgccgt cgtccacgac ggcgctcggc acgacgccca acgggggcgg gggcggcaac 120

agcagcgcgg gcgagctctc gccctcgccg ccctcgacgc ccgagcccgt ctcggggacg 180

acgggggccg cggcctccac gcccgccgcc gtctcgacgc cccgggtccc gccgccctcg 240

gtctcgcgcc ggaagcccca gcggaacggc aacaggacgc gcgtccacgg cgacaaggcc 300

acctcgcacg ggcgcaagcg catcgtgtgc cgcgagcggc tgttctcggc gagggtgggg 360

gacgcggtca gcttcgggtg cgccgtcgtc ccgcgcgccg gggagacctt cgaggtccgc 420

ttctgccgcc gcgggcgctt ccgctcgccc gacgccgacc ccgagtactt tgacgagccc 480

ccgcgcccgg agctcccgcg ggagcggctc ctcttcagct ccgccaacgc ctccctcgcc 540

cacgcggacg cgctcgcctc cgccgtcgtc gtcgagggcg agcgcgcgac cgtcgccaac 600

gtctcgggcg aggtgtccgt gcgcgtggcc gcggcggacg ccgagaccga gggcgtctac 660

acgtggcgcg tgctgtccgc caacggcacc gaggtccgca gcgccaacgt ctcgctcgtc 720

ctgtaccacc agcccgagtt cggcctgagc gcgccgcccg tcctcttcgg cgagcccttc 780

cgggcggtgt gcgtcgtccg cgactactac ccgcggcgca gcgtgcgcct gcgctggttc 840

gcggacgagc acccggtgga cgccgccttc gtgaccaaca gcaccgtggc cgacgagctc 900

gggcgccgca cgcgcgtctc cgtggtgaac gtgacgcgcg cggacgtccc gggcctcgcg 960

gccgcggacg acgcggacgc gctcgcgccg agcctgcgct gcgaggccgt gtggtaccgc 1020

gacagcgtgg cctcgcagcg cttctccgag gccctgcgcc cccacgtcta ccacccggcg 1080

gcggtctcgg tgcgcttcgt cgagggcttc gccgtctgcg acggcctctg cgtgcccccg 1140

gaggcgcgcc tcgcctggtc cgaccacgcc gccgacaccg tctaccacct cggcgcctgc 1200

gccgagcacc ccggcctgct caacgtgcgg agcgcccgcc cgctgtcgga cctcgacggg 1260

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accgtcatcg ccggcatcgc catcctagcc atcgtgctgg tcatcatggc gacgtgcgtc 1440

tactaccgcc ggtccgcgct gtga 1464

<210> 2

<211> 1206

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 2

atgctgctcg cagcgctatt ggcggcgctg gtcgcccgga cgacgctcgg cgcggacgtg 60

gacgccgtgc ccgcgccgac cttccccccg cccgcgtacc cgtacaccga gtcgtggcag 120

ctgacgctga cgacggtccc ctcgcccttc gtcggccccg cggacgtcta ccacacgcgc 180

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tacatgttcc ccacggagga cgagctgggg ctgctcatgg tggccccggg gcggttcaac 480

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cgcgatgggt gcgctcctgg tgggcgtgtg cgtctacatc ttcttccgcc tgaggggggc 1140

gaaggggcat cgcctcctgg gcggtcccgc ggacgccgac gagctaaaag cgcagcccgg 1200

tcctag 1206

Claims

1.一种猪伪狂犬病病毒毒株，其特征在于：即疱疹病毒科猪疱疹病毒I型猪伪狂犬病病毒WH-13株；保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC NO:V202032。

2.一种如权利要求1所述的猪伪狂犬病病毒毒株在制备猪伪狂犬病灭活疫苗中的应用。

3.一种如权利要求1所述的猪伪狂犬病病毒毒株在制备猪伪狂犬病减毒活疫苗中的应用。