CN117384863A - 猪伪狂犬病病毒自然传代弱毒变异株js18-150及其应用 - Google Patents

猪伪狂犬病病毒自然传代弱毒变异株js18-150及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及猪伪狂犬病病毒自然传代弱毒变异株JS18‑150及其应用。申请人从猪伪狂犬病阳性病料中筛选出最新流行毒株作为亲本毒株，之后反复传代，筛选，最终获得了一株自然随机的突变弱毒株JS18‑150，所述毒株的保藏编号为：CCTCC NO：V202390。该毒株是天然的缺失株，是一种自然随机的突变，相较于基因缺失株更稳定，不返毒，同时免疫原性好，生物安全性高，可更有效的预防当前流行的PRV变异毒株。

Description

猪伪狂犬病病毒自然传代弱毒变异株JS18-150及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及猪伪狂犬病病毒自然传代弱毒变异株JS18-150及其应用。
背景技术
猪伪狂犬病(pseudorabies,PR)是一种以体温升高、打喷嚏、呼吸困难和神经系统障碍为主要特征的急性传染病。猪是其主要的天然宿主、贮存者和传播者。不同日龄的猪均可感染，主要引起妊娠母猪流产、死胎、木乃伊胎，哺乳仔猪高死亡率。PR是由伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)引起，PRV为线状双链DNA，基因组大小约为145kb。在PRV中共发现16种膜蛋白，包括gB、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gK、gM、gL和gN。其中gE基因是伪狂犬病病毒的主要毒力基因之一，能够诱导细胞融合，加快病毒在细胞之间的传递过程。还能够促进病毒在宿主中枢神经中传播，与gI蛋白形成gE/gI复合体，从而作为一个功能单位发挥功能。gE/gI蛋白复合体能与gC蛋白共同介导病毒在细胞中的释放。
目前针对该病的防控，国内外均以疫苗免疫预防为主，结合配套的gE-ELISA抗体检测方法淘汰、净化野毒感染猪，从而实现伪狂犬病的净化。目前，临床应用的猪伪狂犬病疫苗可分为三类：一是经灭活加入佐剂制备的灭活疫苗；二是利用基因工程技术，使PRV的相关毒力基因无法表达，毒力致弱同时又保持较高免疫原性而制备的基因缺失疫苗；三是将分离得到的野毒株经非猪源细胞或鸡胚连续传代得到的自然传代弱毒疫苗。弱毒疫苗具有良好的免疫原性，价格低廉，在伪狂犬病防控中起着重要作用。但其免疫之后可引起免疫猪长期排毒，同时疫苗株也可能出现毒力返强问题。鉴于其潜在的安全性问题，相关法规要求所有弱毒疫苗上市之前都需要通过5代回传试验验证疫苗毒株无毒力返强风险来确保确实致弱完全且对敏感猪无致病风险。
20世纪90年代我国从匈牙利引进的伪狂犬病活疫苗Bartha-K61株是用猪源伪狂犬病强毒通过猪肾、鸡胚反复传代得到的疫苗株。随着Bartha-K61疫苗大量应用于控制PR的流行与传播，颇见成效，猪伪狂犬病的爆发也开始变得鲜有报道。但自2011年以来，接种过Bartha-K61的猪场再次爆发猪伪狂犬病，新出现的伪狂犬病变异株与经典PRV不同，对所有年龄段的猪都有很高的致病性，并表现出不同程度临床症状，这意味着现有疫苗可能无法应对当前流行株，并提供完全的免疫保护。因此针对变异株的疫苗是否能够对动物产生足够免疫保护力，是迫切需要解决的问题。
本研究以临床分离的猪伪狂犬病病毒变异株JS18株为亲本株，采用鸡胚成纤维细胞传代培养的方法进行传代致弱，获得JS18-150株，并对其体外生长特性、安全性和免疫原性进行进一步研究，验证了该毒株安全性和免疫原性良好。鉴于现有商品化弱毒疫苗在田间使用时有些疫苗仍有大量毒力返强案例出现，本研究还将通过回归猪体5代试验进一步评估弱毒疫苗种子毒的无毒力返强风险，为变异株疫苗临床应用打下基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一株猪伪狂犬病病毒的自然突变弱毒株JS18-150，所述毒株的保藏编号为：CCTCC NO：V202390。
本发明的另一个目的在于提供猪伪狂犬病病毒弱毒株JS18-150在制备猪伪狂犬病疫苗中的应用。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
申请人从猪伪狂犬病阳性病料中筛选出最新流行毒株作为亲本毒株，之后反复传代，筛选，最终获得了一株自然随机的突变弱毒株，该弱毒株与亲本毒株的生长曲线类似，生理生化特性类似，该病毒已于2023年09月27日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：猪伪狂犬病病毒(Porcine pseudorabies virus)PRV JS18-150株，保藏编号为：CCTCC NO：V202390，地址：中国武汉武汉大学。
本发明的保护范围还包括：
狂犬病病毒弱毒株JS18-150在制备猪伪狂犬病疫苗中的应用；
以上所述的疫苗中，优选的，所述的疫苗为活疫苗；
以上所述的应用中，优选的，所述疫苗为滴鼻剂；
以上所述的应用中，优选的，所述的滴鼻剂的剂型为溶液型，混悬型或乳浊型。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明使用的亲本毒株为最新流行毒株通过传代筛选出的JS18-150株，该毒株是天然的缺失株，是一种自然随机的突变，相较于基因缺失株更稳定，不返毒，同时免疫原性好，生物安全性高，可更有效的预防当前流行的PRV变异毒株。
附图说明
图1为来自于两株猪伪狂犬病病毒的gD基因遗传进化树。
图2为猪伪狂犬病病毒JS18株和JS18-150株的病变结果示意图；
其中A为JS18株，B为JS18-150株。
图3为猪伪狂犬病病毒JS18株和JS18-150株生长曲线测定示意图。
图4为JS18-150株对仔猪的免疫保护结果；
其中A：gB-ELISA抗体检测；B：中和抗体水平检测。
图5为JS18毒株和XD18毒株攻毒后脑组织形态及高倍显微镜细胞形态比较；
A：JS18-150免疫组-JS18毒株(400×)，B：DMEM免疫组-JS18毒株(400×)，C：JS18-150免疫组-XD18毒株(400×)，D：DMEM免疫组-XD18毒株(400×)。
图6为JS18毒株和XD18株攻毒后扁桃体组织及高倍显微镜细胞形态比较；
A：JS18-150免疫组-JS18毒株(400×)，B：DMEM免疫组-JS18毒株(400×)，C：JS18-150免疫组-XD18毒株(400×)，D：DMEM-XD18毒株(400×)。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
实施例1：
鸡胚成纤维细胞的制备
a)选取9～10日龄发育良好的SPF鸡胚，先用碘酒消毒蛋壳气室部位，再用酒精棉脱点，同时在平皿中加入适量Hank’s液，以18cm大镊子在气室中间破壳，去气室蛋壳、气室膜，从胎儿眼睛位置下镊子，轻夹颈部挑出胎儿，快速放入平皿中。
b)将鸡胚去头、四肢和内脏，把配体转入烧杯中，用沙宣剪剪碎胚体，以挑剪方式把胚体剪至小米粒大小后，转移至适宜大小的锥形瓶中，加入Hank’s液清洗3次。
c)将0.25％胰酶按4ml/胚的量消化，同时开始计时。快速加盖后转入37.5℃水浴锅中，消化约10min。同时超净台中准备包有8～10层纱布的漏斗，放入锥形瓶中，在吹打细胞前润湿纱布。
d)将消化好的组织中胰酶轻轻倒出，加入Hank’s液清洗组织3次，加入血清，用破头习惯吹打组织块，静置，将上层细胞悬液倾入漏斗过滤；继续加入乳汉液，进行二轮吹打，共计吹打约7轮。吹打力度逐次加大，吹打力度逐次加大，调整每次加液量直至组织吹至仅剩骨头渣。操作过程中需不时摇动悬液瓶，避免细胞成团。制成每1ml含活细胞约250万以上的悬液。
e)悬液加入细胞瓶中，贴壁后换液，即得到鸡胚成纤维细胞CEF。
实施例2：
猪伪狂犬病病毒JS18-150株的获得:
1)利用病毒核酸DNA/RNA提取试剂盒提取猪伪狂犬病阳性病料的核酸，使用引物gD对PRV gD基因进行扩增。将扩增样品的gD基因序列(来自于申请人分离的两株猪伪狂犬病病毒野毒株，分别为XD18和JS18)与具有代表性的PRV毒株的gD序列进行遗传进化分析，绘制gD基因遗传进化树(图1)。检测的阳性样品与我国近年新分离的PRV-gD-OP8795221、PRV-TJ-KJ789182.1和PRV-JS-2012-KP257591.1等属于同一分支；与经典毒株PRV-Bartha-K61属于不同分支，该阳性病料为新毒株。
取发病猪扁桃体、脑组织，分别用剪刀剪碎，加入10.0ml的PBS，用组织研磨器研磨后转移到15ml离心管中，-70℃以下反复冻融3次，取4个1.5ml的离心管，每个离心管中加1.0ml组织液，以12000r/min离心5分钟，用0.22μm滤芯过滤除菌后，接种到ST细胞上，37℃吸附1小时，弃去。加入2％DMEM维持液，置37℃含5％CO2的细胞培养箱中培养3～5天。每天观察细胞病变，待细胞病变达80％收取细胞上清。将所得病毒株命名为猪伪狂犬病病毒JS18株。
2)取猪伪狂犬病病毒JS18株接种CEF细胞中，置37℃含5％CO2的细胞培养箱中继续培养，当细胞病变达到90％以上时，收获上清液和细胞混合物得到JS18-2株。按上述方法将猪伪狂犬病病毒JS18株在CEF细胞上连续传代至100代。从第100代连续5代挑取单个蚀斑，继续传代至第150代最终得到JS18-150株。病毒噬斑结果显示JS18-150株在体外传代适应性明显提升，表现为细胞形成病变时间缩短，细胞病变面积增大(图2)。
3)JS18-150株PCR扩增和序列测定
以GenBank中PRV全基因序列(KP257591.1)为参考，设计gD/US2基因鉴定引物gD/US2-F和gD/US2-R。引物由上海生工合成。分别提取猪伪狂犬病病毒JS18株第1代、50代、100代、130代和150代病毒基因组，利用特异性引物扩增目的基因，鉴定不同代次毒种序列的稳定性。对特异性条带进行胶回收，连接至pEASY-T1载体，构建成功后送至上海生工测序。
测序结果显示第50代与第1代同源性为100％，ORF大小均为5837bp。第100代、130代和150代该毒株均缺失从gI基因第269位核苷酸至US9基因的共3194bp碱基，包括gI部分基因、gE全部基因和US9全部基因；同时gD基因第906位碱基发生点突变。结果表明gI/US2基因缺失部位稳定，未发生恢复。
gD/US2-F：GTCGAGACCGAGACCACCAACACCACCACCACCCAGACGGGCCTGT
gD/US2-R：TCACGATCTGGGCATGCAGGGCCTCCGTCCACTCGCCGGCGTGGCGCCA。4)猪伪狂犬病病毒JS18-150株的生物学特性
将猪伪狂犬病病毒JS18株和JS18-150株分别以0.01MOI接种于CEF细胞，分别在接毒后12小时、24小时、36小时、48小时、60小时和72小时取样测定各时间点的TCID50。以上试验重复3次，并以接毒后的时间为横坐标以相对病毒滴度lgTCID50/ml为纵坐标绘制病毒的一步生长曲线，对猪伪狂犬病病毒JS18-150株增殖情况进行分析。
结果显示：猪伪狂犬病病毒JS18株和JS18-150株在CEF细胞上生长趋势基本相同，感染36小时后，病毒滴度均达到顶峰，随后缓慢下降(图3)。在整个增殖过程中，相同接种时间JS18株病毒滴度略低于JS18-150株。
申请人将该病毒已于2023年09月27日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：猪伪狂犬病病毒(Porcine pseudorabies virus)PRV JS18-150株，保藏编号为：CCTCCNO：V202390，地址：中国武汉武汉大学。
实施例3：
猪伪狂犬病病毒JS18-150的动物实验
1.仔猪的安全性试验
选取21日龄伪狂犬阴性仔猪(gB、gE抗体均为阴性)25头，随机分为五组。将JS18株和JS18-150株分别经颈部肌肉接种各5头，1.0ml/头，病毒含量为1.0×107.0TCID50/ml，同时将另一实施例2筛选得到的野毒株XD18株和按照实施例2方式传代致弱的疫苗候选株XD18-150株分别颈部肌肉接种各5头，1.0ml/头，病毒含量为1.0×107.0TCID50/ml，另设1组空白对照组。连续观察14日，观察疫苗接种猪精神、食欲以及临床表现；与接种前相比，体温是否有升高现象。接种后21日采血，检测gB-ELISA、gE-ELISA抗体。
结果显示将JS18株和XD18株接种仔猪后，均5/5仔猪出现精神不振、呼吸困难和食欲减退等临床症状，同时仔猪全部死亡。XD18-150株、JS18-150株和空白对照组所有仔猪均未观察到任何临床症状，且体温正常，均未超过40.5℃。接种后14日，PRV JS18株和XD18株免疫组试验猪gB和gE抗体均为阳性；PRV XD18-150株、PRV JS18-150株免疫组试验猪gB抗体均为阳性，而gE抗体均为阴性。空白对照组gB和gE抗体均为阴性(表1)。结果表明XD18-150株和JS18-150株毒力均显著下降，对仔猪有良好的安全性。
表1XD18-150株和JS18-150株对仔猪的安全性试验结果
“临床症状+：”精神不振、呼吸困难和食欲减退等。
2.毒力返强实验
选取21日龄伪狂犬病阴性仔猪4头(gB抗体和gE抗体均为阴性)，随机分为2组。第一组颈部接种1.0×107.0TCID50/ml的JS18-150株，第二组颈部接种1.0×107.0TCID50/ml的XD18-150株。接种后观察临床症状，第5日剖杀取脑和扁桃体组织(第一代组织毒)进行匀浆。
再次选取21日龄伪狂犬病阴性仔猪4头，随机分为两组。取第一代组织毒接种试验仔猪，并按照上述方法进行临床观察。如此传代至第5代，观察JS18-150株和XD18-150株疫苗候选株在仔猪上传5代毒力稳定性。试验结果发现，猪伪狂犬病病毒JS18-150株在猪体内连续传5代期间对仔猪无致病力，而XD18-150株在仔猪传代3代出现毒力返强，仔猪出现典型的伪狂犬病症状。以上结果说明JS18-150株具有良好的稳定性。
3.免疫保护效力试验
选取21日龄伪狂犬病阴性仔猪20头(gB抗体和gE抗体均为阴性)，随机分4组，隔离饲养。A、C组肌注1头份JS18-150株(106TCID50/头份)，B、D组肌注1ml DMEM。免疫后每7日进行1次前腔静脉采血(至攻毒后14日)，检测gB-ELISA抗体水平。免疫后28日，连同对照组仔猪采血分离血清，检测血清中的中和抗体。同时A、B组使用PRV野毒JS18毒株滴鼻攻毒，C、D组使用PRV XD18毒株滴鼻攻毒，攻毒剂量为107.0TCID50/头份。攻毒后观察21日，测量体温，记录症状，统计发病率和死亡率。
结果显示A、C组免疫接种后试验猪精神、食欲正常，接种部位无异常；免疫后28日免疫组仔猪产生较高的gB抗体水平，PRV中和抗体效价分别为63.8±5.08和54.6±6.65(图4中A、图4中B)。B、D组攻毒后对照组出现体温升高、精神沉郁、食欲废绝等典型症状，并在14日内全部死亡；A、C组使用两种野生型PRV毒株攻毒均未死亡，获得100％保护(表2)。
表2JS18-150株对仔猪免疫保护的试验结果
“临床症状+：”精神不振、呼吸困难和食欲减退等。
解剖结果发现，B、D组仔猪攻毒后，猪只脑出血，扁桃体化脓、出血，而A、C组猪只则无典型病变出现(图5、图6)。取各组的脑和扁桃体组织制备病理切片，可观察到B、D组脑组织脑膜、脉络膜、脑实质等血管周围淋巴细胞浸润，形成血管“袖套；”扁桃体淋巴细胞坏死，均质红染，吞噬细胞吞噬坏死细胞碎片，而A、C组猪只则未观察到典型病理变化(图5、图6)。以上结果说明JS18-150株作为疫苗接种仔猪能够产生良好的交叉保护。

Claims (6)

1. 一株分离的猪伪狂犬病病毒（Porcine pseudorabies virus）PRV JS18-150株，所述毒株的保藏编号为：CCTCC NO：V202390。
2.权利要求1所述的狂犬病病毒在制备猪伪狂犬病疫苗中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，所述的疫苗为活疫苗。
4.根据权利要求2所述的应用，是以权利要求1所述的病毒为唯一有效成分或有效成分之一制备猪伪狂犬病疫苗。
5.根据权利要求2所述的应用，所述疫苗为滴鼻剂。
6.根据权利要求5所述的应用，所述的滴鼻剂的剂型为溶液型，混悬型或乳浊型。
CN202311350237.8A 2023-10-18 2023-10-18 猪伪狂犬病病毒自然传代弱毒变异株js18-150及其应用 Active CN117384863B (zh)

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Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104250640A (zh) * 2014-08-22 2014-12-31 普莱柯生物工程股份有限公司 猪伪狂犬病病毒基因缺失株、疫苗组合物及其制备方法和应用
CN105087506A (zh) * 2015-03-20 2015-11-25 普莱柯生物工程股份有限公司 一种猪伪狂犬病病毒致弱方法、及其致弱的病毒株、疫苗组合物和应用
CN105903011A (zh) * 2016-06-01 2016-08-31 齐鲁动物保健品有限公司 一种猪伪狂犬病活疫苗及其制备方法
CN106282128A (zh) * 2016-08-03 2017-01-04 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 一株通过细胞低温传代和药物筛选致弱的猪伪狂犬病病毒基因缺失弱毒疫苗株及其应用
CN106282132A (zh) * 2015-05-11 2017-01-04 中国农业科学院上海兽医研究所 伪狂犬病毒变异株的弱毒株及其应用
CN106497890A (zh) * 2016-11-08 2017-03-15 武汉科前生物股份有限公司 一种猪伪狂犬病病毒变异株xf‑1株及制备方法和应用
CN110387354A (zh) * 2019-08-16 2019-10-29 江苏省农业科学院 伪狂犬病病毒传代致弱毒株及其应用
CN111748529A (zh) * 2020-06-19 2020-10-09 国药集团动物保健股份有限公司 猪伪狂犬病病毒毒株及其应用
CN113862230A (zh) * 2021-09-30 2021-12-31 中牧实业股份有限公司 一种猪伪狂犬病病毒基因缺失株、疫苗组合物及其制备方法和应用

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104250640A (zh) * 2014-08-22 2014-12-31 普莱柯生物工程股份有限公司 猪伪狂犬病病毒基因缺失株、疫苗组合物及其制备方法和应用
CN105087506A (zh) * 2015-03-20 2015-11-25 普莱柯生物工程股份有限公司 一种猪伪狂犬病病毒致弱方法、及其致弱的病毒株、疫苗组合物和应用
US20160279231A1 (en) * 2015-03-20 2016-09-29 Pulike Biological Engineering, Inc. A Method of Attenuating Porcine Pseudorabies Virus, Attenuated Strains of Porcine Pseudorabies Virus, Vaccine Composition and Use Thereof
CN106282132A (zh) * 2015-05-11 2017-01-04 中国农业科学院上海兽医研究所 伪狂犬病毒变异株的弱毒株及其应用
CN105903011A (zh) * 2016-06-01 2016-08-31 齐鲁动物保健品有限公司 一种猪伪狂犬病活疫苗及其制备方法
CN106282128A (zh) * 2016-08-03 2017-01-04 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 一株通过细胞低温传代和药物筛选致弱的猪伪狂犬病病毒基因缺失弱毒疫苗株及其应用
CN106497890A (zh) * 2016-11-08 2017-03-15 武汉科前生物股份有限公司 一种猪伪狂犬病病毒变异株xf‑1株及制备方法和应用
CN110387354A (zh) * 2019-08-16 2019-10-29 江苏省农业科学院 伪狂犬病病毒传代致弱毒株及其应用
CN111748529A (zh) * 2020-06-19 2020-10-09 国药集团动物保健股份有限公司 猪伪狂犬病病毒毒株及其应用
CN113862230A (zh) * 2021-09-30 2021-12-31 中牧实业股份有限公司 一种猪伪狂犬病病毒基因缺失株、疫苗组合物及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LI ET AL.: "Comprehensive evaluation of the safety and immunogenicity of a gene-deleted variant pseudorabies virus attenuated vaccine", 《VETERINARY RESEARCH》, vol. 53, 22 September 2022 (2022-09-22), pages 1 - 13 *
ZHENYU NIE ET AL.: "Progress on innate immune evasion and live attenuated vaccine of pseudorabies virus", 《FRONTIERS IN MICROBIOLOGY》, vol. 14, 3 March 2023 (2023-03-03), pages 1 - 12 *

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