CN1800374A - 一种重组伪狂犬病－猪繁殖与呼吸综合征基因工程毒株及应用 - Google Patents

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CN1800374A CN 200510012147 CN200510012147A CN1800374A CN 1800374 A CN1800374 A CN 1800374A CN 200510012147 CN200510012147 CN 200510012147 CN 200510012147 A CN200510012147 A CN 200510012147A CN 1800374 A CN1800374 A CN 1800374A
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Abstract

本发明属于动物病毒基因工程技术领域，具体涉及重组伪狂犬病－猪繁殖与呼吸综合征基因工程毒株的构建、疫苗制备及应用。本发明得到一株重组伪狂犬病－猪繁殖与呼吸综合征基因工程毒株Pseudorabies virus HzauAVL－PRprrsvV－GP5mM，保藏在CCTCC，保藏编号：CCTCC－V200509。该毒株缺失了伪狂犬病毒主要毒力基因TK，不产生功能性的糖蛋白gE/gI；能同时表达猪繁殖与呼吸综合征病毒的GP5m和M蛋白抗原。该毒株可以刺激猪产生抵抗猪繁殖与呼吸综合征病毒和伪狂犬病毒的保护性免疫反应，有效防止猪繁殖与呼吸综合征病毒和伪狂犬病毒的感染。本发明的基因工程毒株可用于制备伪狂犬病－猪繁殖与呼吸综合征基因工程疫苗。

Description

一种重组伪狂犬病-猪繁殖与呼吸综合征基因工程毒株及应用
                          技术领域
本发明属于动物病毒基因工程技术领域。具体涉及一种重组伪狂犬病-猪繁殖与呼吸综合征基因工程毒株，用该基因工程毒株制备的基因工程疫苗及应用。
                          背景技术
伪狂犬病是由伪狂犬病毒(pseudorabies virus，简称PrV)感染猪、牛、羊、犬、猫、家兔、小白鼠、水貂、狐等多种家畜和野生动物引起的急性传染病，猪是该病毒的贮存者和传播者(Mettenleiter等，Comp Immunol Microbiol Infect Dis.1991，14：151-163)。除猪以外的其它动物呈散发形式，发病后通常具有发热、奇痒及脑脊髓炎等热型症状，均为致死性感染。该病对猪呈爆发流行，危害主要导致母猪繁殖障碍综合征和新生仔猪大量死亡。PrV一般经鼻咽部感染动物，并在感染局部的粘膜内增殖，然后经淋巴循环或神经纤维移行，一般认为病毒经神经通路到达脑而引起中枢神经功能紊乱，或在嗅球，三叉神经中建立潜伏感染(Nauwynck等，In proceeding of PRRVS and Aujeszky’s Disease.1999，321-322)。
伪狂犬病毒的基因组为线状双链DNA，长约150kbp，G+C含量高达74％，整个基因组至少编码70-100个蛋白，其中胸苷激酶(Thymidine Kinase，TK)基因位于UL区，全长963bp，编码320个氨基酸，催化脱氧胸苷磷酸化。TK基因与PrV的毒力有关，是伪狂犬病毒的一个主要毒力基因，与病毒的潜伏感染有关(Kit S等，Am J Vet Res.1985，46：1359-1367；Nunberg等，J Virol.1989，63：3240-3249)。除了TK基因外，与伪狂犬病毒毒力有关的基因还有gG、gE等。TK、gE和gI基因都是病毒增殖所非必需的，缺失病毒株与野毒一样能正常增殖，而且不存在毒力返强的危险(Yokyama等，Virol.1991，185：55-65)。突变病毒株具有很好的免疫原性，接种动物后可产生保护性免疫反应，但是不产生抗gE的抗体，因此可以作为区分免疫动物和野毒感染动物的一个标志，有利于建立无伪狂犬病感染的猪群，并最终为根除该病提供了有用的工具。华中农业大学在自主分离鉴定的伪狂犬病病毒强毒Ea株(陈焕春等，畜牧兽医学报，1998，29(2)，151-156)的基础上，通过DNA重组技术将主要毒力TK基因、非必需糖蛋白gG或gE、gI基因缺失，构建了一系列的重组突变毒株用于伪狂犬病的根除(刘正飞等，微生物学报，2002，42(3)，370-374；刘正飞等，畜牧兽医学报，2004，35(1)，70-73；徐晓鹃等，生物工程学报，2004，20(4)，532-535)。
猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive andrespiratory syndrome virus，简称PRRSV)引起的一种新的传染病，主要以母猪发热、厌食、早产、流产、死胎、弱仔等繁殖障碍及各种年龄猪的呼吸系统疾病和高死亡率为特征。由于该病目前危害严重和没有较好的防制措施而引起全球养猪业和研究者越来越多的注意。已有商品化减毒猪繁殖与呼吸综合征疫苗问世，但存在安全性问题，。而灭活疫苗的免疫效力
不尽人意，同时由于猪繁殖与呼吸综合征病毒具有抗体依赖增强(ADE)效应(仇华吉等，中国兽医科技，1999，29(7)，19-20)，使得常规疫苗难以奏效(仇华吉等，中国兽医学报，2000，20(1)，100-103)，因此有必要开发新型疫苗。猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因编码的糖蛋白GP5是PRRSV中最主要的保护性抗原，可诱导体液免疫和细胞免疫，因此是设计PRRS新型疫苗的首选目标基因(Dea S等，Arch Virol，2000a，145，659-688)。但单独基于天然ORF5基因构建的疫苗难以诱发较高的免疫应答(Pirzadeh B等，J Gen Virol，1998a，79，989-999；Ostrowski M等，J Virol，2002，76，4241～4250)，基于这一考虑，本申请人对所述的ORF5基因进行了修饰，即将人工合成的编码辅助性T淋巴细胞表位的核苷酸插入GP5的中和表位和覆盖表位间，构建的修饰型ORF5M基因具有更好的免疫原性(江云波等，中国兽医学报，2005(1)，1-3)。Balasuriya R等(Balasuriya R等，J Virol，2000，74，10623-10630)在研究与PRRSV同属的马动脉炎病毒(EAV)活病毒载体疫苗时发现，EAV的E蛋白在体外表达时其短肽-MHC复合体从内质网向高尔基体转运的效率很低，因此难以激发很高的抗体，而当ORF5与ORF6基因共表达时，二者编码的蛋白形成异源二聚体这种异源二聚体的存在极大地促进E蛋白短肽-MHC复合体从内质网向高尔基体转运，有利于诱发机体产生很强的免疫反应。但目前PRRSV相关方面的研究尚未见报道。
与本发明相关的一些专利申请，例如伪狂犬病的专利申请，有华中农业大学提出的申请号为03156706.1(一种伪狂犬病TK-/gE-/gI-基因缺失标志活疫苗及制备方法)，该申请专利所述的一种基因缺失突变株是在人工构建的伪狂犬病TK-/gE-/LacZ+突变株中缺失LacZ基因，构建的一株没有外源基因的伪狂犬病TK-/gE-/gI-三基因缺失的突变株，同时该申请只涉及用该毒株制备伪狂犬病基因标记疫苗在防制伪狂犬病单一疾病上的应用。
与本发明相关的另一些专利申请，例如猪繁殖与呼吸综合征的专利申请见于下列文献：华中农业大学提出的申请号为200410000238.0(一种猪繁殖与呼吸综合征的“自杀性”DNA疫苗)和申请号为200410009838.3(一种修饰的猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因及应用)的专利申请，上述两项专利申请只涉及对猪繁殖与呼吸综合征的单一疾病的防制。
与本发明密切相关的一篇专利文献是中国国家知识产权局2004年7月21日公开的一份申请号为03132417.7(表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5的重组伪狂犬病病毒及应用)的专利申请，该申请采用一株gE基因缺失疫苗Bartha-K61株为亲本株，利用同源重组技术构建了一株伪狂犬病病毒突变株。该毒株是一株弱毒株，不产生功能性的gE/gI蛋白，同时造成TK基因的部分缺失，导入猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因和大肠杆菌半乳糖苷酶(即常用的LacZ报告基因-作标记用)。其发明的目的是利用该毒株制备二价或多价基因工程活载体疫苗，但是从公开的说明书和权利要求书来看，该申请没有提出任何说明该发明效果的有关生物学实验数据，不能让人明了其实施的效果，也没有实施例对如何利用该发明并再现发明效果的详细资料，难以推广应用。
                                  发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，获得一种免疫原性更好和安全性更强的伪狂犬病-猪繁殖与呼吸综合征的基因工程毒株；
本发明的第二个目的是利用该基因工程毒株制备伪狂犬病-猪繁殖与呼吸综合征基因工程疫苗；
本发明的第三个目的是伪狂犬病-猪繁殖与呼吸综合征基因工程毒株在制备伪狂犬病病-猪繁殖与呼吸综合征基因工程疫苗上的应用。
本发明通过以下技术方案实现：
一种重组伪狂犬病-猪繁殖与呼吸综合征基因工程毒株Pseudorabies virusHzauAVL-PRprrsvV-GP5mM，保藏在CCTCC，保藏编号：CCTCC-V200509。
一种重组伪狂犬病-猪繁殖与呼吸综合征基因工程毒株，所述的基因工程毒株涉及的TK-/gE-/LacZ+亲本株是一株人工致弱的基因工程突变株，它衍生于猪伪狂犬病毒Ea株，所述的Ea毒株由华中农业大学动物病毒研究室分离、鉴定，是一株在细胞培养物上增殖滴度高，免疫原性强的强毒株(参见陈焕春等，猪伪狂犬病病毒鄂A株的分离鉴定，畜牧兽医学报，1998，29(2)，151-156)。所述的重组伪狂犬病-猪繁殖与呼吸综合征基因工程毒株其主要毒力基因TK缺失了205bp，导致毒力大大降低；gE/gI基因发生1247bp的缺失，导致不产生结构糖蛋白gE/gI，能在分化细胞中复制，但在未分化的神经细胞中的复制被阻止或限制，接种后即使发生潜伏感染，也不易被激活，因而具有很高的安全性。
本发明的基本构建方法是：将猪繁殖与呼吸综合征病毒的修饰型主要免疫原性基因ORF5M和ORF6基因，以完整的独立表达盒(包括人巨细胞病毒CMV强启动子和polyA信号)即CMV-ORF5M-polyA和CMV-ORF6-polyA插入到伪狂犬病毒TK-/gE-/LacZ+疫苗株的基因组gE和gI基因之间(而申请号为03132417.7的专利申请外源基因是插入TK基因中)，使其能够独立表达近似天然的猪繁殖与呼吸综合征病毒的GP5m和M蛋白，所以表达的GP5m和M蛋白的生物学特性和免疫原性没有改变，同时gE蛋白依然得不到表达。通过大量的生物学实验数据证明本发明的重组毒株可用于制备防制伪狂犬病-猪繁殖与呼吸综合征基因工程疫苗上的应用。
本发明的主要优点是：
1、本发明所用的载体材料为伪狂犬病病毒Ea TK-/gE-/LacZ+基因工程弱毒疫苗株，该疫苗株不但对育肥猪、仔猪十分安全有效，即使对初生仔猪也十分安全，可产生坚强的保护力，而且可用于仔猪的超前免疫，具有很好的预防和治疗效果，这就为将其开发成一种良好的病毒活疫苗载体提供了广阔的前景。
2、本发明表达的外源基因之一ORF5M基因是天然的ORF5基因的修饰型，申请人的研究资料表明，该基因具有更好的免疫原性，进而展示了其广阔的开发应用前景。
3、本发明利用DNA同源重组技术成功地替换了LacZ基因，而03132417.7申请仅仅是一种推测，究竟如何实施，03132417.7专利申请没有明确的解决方案，而本发明则为进一步制备伪狂犬病和猪繁殖与呼吸综合征疫苗提出了具体的技术方案。
4、本发明以两个独立的完整的表达元件(包括人巨细胞病毒CMV强启动子和polyA信号)
表达了猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5M和ORF6基因，这就保证了导入的外源基因高水平的互不干扰的表达。
5、本发明为深入评价该重组猪繁殖与呼吸综合征-伪狂犬病病毒基因工程毒株在制备防制伪狂犬病和猪繁殖与呼吸综合征疫苗上的应用，将该毒株制备成基因工程疫苗进行了小鼠和猪的免疫效果和免疫保护研究，与03132417.7专利申请相比具有明显的实用性。
本发明与申请号为03132417.7的主要技术特征和实施效果的比较分析如表1所示：
                    表1本发明与现有技术的主要技术差别
  比较项目   本发明的主要技术特征   03132417.7专利申请的技术特征   本发明相对于03132417.7专利申请的突出效果
亲本毒株   缺失主要毒力基因TK，非必需复制基因gE/gI的伪狂犬病病毒EaTK-/gE-/LacZ+基因工程突变弱毒株   缺失非必需复制基因gE/gI的伪狂犬病毒Bartha-K61基因工程突变弱毒株   在安全性方面，两者相近；但在免疫原性方面，由于本发明的衍生毒株来自我国地方分离株，相对于对比申请中的来自国外的衍生毒株具有较好的地方特异性，所提供的保护也会更高。
外源抗原基因 包括ORF5M(天然ORF5的修饰型基因)和ORF6基因 单一的ORF5基因   本发明中涉及的ORF5M基因相对于对比申请天然ORF5基因具有更好的免疫原性，刺激机体产生更高的免疫应答；而ORF6基因所编码的M蛋白同样是猪繁殖与呼吸综合征病毒的主要免疫原性抗原，将ORF6保护性抗原基因插入载体病毒中能够产生针对猪繁殖与呼吸综合征病毒更好的保护。
外来垃圾基因 本发明中获得的基因工程毒株不含任何垃圾基因(即LacZ基因) 含有外来的垃圾基因LacZ   由资料表明，外来垃圾基因的存在对生物体本身可能具有负面影响；再者，用于生物体的生物制剂是不允许随便插入垃圾基因(金升藻等，中国农业科学，2002，35(1)，89-93)。而对比申请中含有的外来LacZ垃圾基因，只能用来研究病毒感染和增殖的动力学的一种手段，是不能作为商品进入市场的。
实用性   本发明中获得的基因工程毒株进行了生物学特性的研究鉴定，并利用该毒株制备的基因工程疫苗进行了小鼠和猪的免疫效果和免疫保护实验 没有提供任何的生物学实验资料和数据   本发明经生物学特性实验证实所构建的基因工程毒株具有与亲本株相似的生物学特性。用该毒株制备的基因工程疫苗免疫实验动物，能够产生良好的免疫效果和提供对猪繁殖与呼吸综合征及伪狂犬病两种疾病良好的免疫保护。
创造性   本发明用翔实的数据和具体实施例充分证明了本发明的有益效果   没有提供任何证明该发明的有益效果的生物实验数据   在新颖性方面本发明是导入两个抗原基因，而对比申请为一个；从技术的复杂性和发明的有益性比较本发明具有更好的技术公开。
图1：是本发明的pIECMV-5m6转移质粒图谱。图中CMV i.e.为人巨细胞病毒立即早期启动子，polyA为牛生长激素转录终止信号，gD、gI、gE、11K和28K为来自伪狂犬病病毒基因组的同源臂序列。
图2：是本发明pIECMV-5m6转移质粒鉴定结果。
图中M：DNA marker(DL 15000)  1：pIECMV-5m6/BamH I  2：pIECMV-5m6/Kpn I  3：pIECMV-5m6/Xba I  4：pIECMV-5m6中ORF5M基因的PCR扩增  5：pIECMV-5m6中ORF5M基因的PCR扩增。
图3：是本发明的pIECMV-5m6转移质粒构建的流程图。
图4：是本发明的重组PrV病毒TK-/gE-/GP5m+/M+构建流程。
图5：是本发明的重组病毒PrV TK-/gE-/GP5m+/M+PCR扩增ORF5M基因鉴定的电泳图谱。图中1：PK-15细胞对照  2：H2O对照  3：质粒pIECMV-5m6对照  4：亲本株PrVTK-/gE-/LacZ+对照  5-10：重组病毒PrV TK-/gE-/GP5m+/M+  M：DL2000DNA分子量对照
图6：是本发明的重组病毒PrV TK-/gE-/GP5m+/M+PCR扩增ORF6基因鉴定的电泳图谱。图中1：H2O对照  2：PK-15细胞对照  3：亲本株PrV TK-/gE-/LacZ+对照  4：质粒pIECMV-5m6对照  5-8：重组病毒PrV TK-/gE-/GP5m+/M+  M：DL2000DNA分子量对照
图7：是本发明的重组伪狂犬病毒PrV TK-/gE-/GP5m+/M+的Southern-blotting分析结果。图中A：在0.8％琼脂糖凝胶上的电泳；B：以ORF5M为探针杂交的结果；C：以ORF6为探针杂交的结果；1、Sal I酶切PrV TK-/gE-/GP5m+/M+株的基因组；2、Sal I酶切TK-/gE-/LacZ+亲本株的基因组；3、Bgl II酶切PrV TK-/gE-/GP5m+/M+株的基因组；4、Bgl II酶切TK-/gE-/LacZ+亲本株的基因组；M：DL15000DNA分子量对照
图8：是本发明的重组伪狂犬病毒PrV TK-/gE-/GP5m+/M+株表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5m和M蛋白的Western-blotting分析结果。
图中1：感染TK-/gE-/LacZ+株的PK-15细胞；1：TK-/gE-/GP5m+/M+株的；2：感染TK-/gE-/GP5m-/M-株的PK-15细胞；M：蛋白质Marker。
图9：是本发明的重组伪狂犬病毒PrV TK-/gE-/GP5m+/M+免疫猪后以及攻毒后产生特异性针对PRRSV的中和抗体。
图10：是本发明的重组伪狂犬病毒PrV TK-/gE-/GP5m+/M+免疫猪后PBMC中产生特异性针对PRRSV的淋巴细胞增殖。
图11：是本发明的重组伪狂犬病毒PrV TK-/gE-/GP5m+/M+免疫猪后PBMC中产生特异性杀伤感染PRRSV的猪肺泡巨噬细胞的效率。
图12：是本发明的重组伪狂犬病毒PrV TK-/gE-/GP5m+/M+免疫猪PRRSV强毒攻击后猪体温变化。
图13：是本发明的重组伪狂犬病毒PrV TK-/gE-/GP5m+/M+免疫猪PRRSV强毒攻击后猪肺组织中的病理切片微观变化(HE染色，放大倍数40倍)。
图中A：TK-/gE-/LacZ+亲本株对照免疫组；B：阴性对照组；C：灭活苗对照组(KV control)：D：重组伪狂犬病毒PrV TK-/gE-/GP5m+/M+免疫组。
                              具体实施方式
以下结合说明书附图对本发明作进一步的说明
1、引物设计(用于基因克隆和分子检测)
根据已发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒的ORF5M和ORF6基因序列(江云波等，中国兽医学报，2005(1)，1-3)设计引物，扩增片段大小分别约为650bp和540bp，并且其两端分别设计BamH I、Xba I和EcoR I、SmaI酶切位点。同时设计ORF7基因序列引物，扩增片段大小约为430bp。Pcmv和PpolyA引物扩增pCI-neo(Promega公司产品)载体中人巨细胞病毒CMV启动子、MCS多克隆位点和polyA信号片段，大小约为1450bp。上述引物均由上海生工生物工程公司合成。引物序列如下：
Porf5m1：5′--GAAGGATCCAGTATGTTGGGGAAATGCTTGACC--3′
Porf5m2：5′--TTTTCTAGAGAGACCCCATTGTTGTTCCGC--3′
Porf61：5′--TTTGAATTCACAATGGGGTCGTCTCTAG--3′
Porf62：5′--TTTGATATCTTATTTGGCATATTTG--3′
Porf71：5′--TAGGTGACTTAGAGGCACAGT--3′
Porf72：5′--TAAATAAGCCAAATAACAAC--3′
Pcmv：5′--GATAAGCTTGATCAGATCTTCAATATTGGCCATTA--3′
PpolyA：5′--CGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACGGA--3′
2、pIECMV-5m6转移质粒的构建(见附图1、2、3所示)
以含PRRSV YA株(方六荣等，猪繁殖与呼吸综合征病毒YA株ORF5基因的克隆与序列分析，华中农业大学学报，2002年，21(6)，501-505)完整ORF5M基因的质粒pMD-ORF5M和含完整ORF6基因的pMD-ORF6为模板，Porf5m1/Porf5m2，Porf61/Porf62为引物进行PCR扩增，ORF5M和ORF6基因两部分序列的扩增条件均为：95.0℃5min变性后进入循环，循环参数为：95.0℃1min，57.0℃1min，72.0℃1min，35个循环后72.0℃延伸10min。反应结束后获得大小约为650bp的ORF5M基因片段和大小约为550bp的ORF6基因片段。
BamH I和Xba I酶切ORF5M基因PCR扩增产物，直接插到转移载体pIECMV(方六荣，华中农业大学，博士论文(一种在华中农业大学图书馆可以开放查询的研究生论文)，2003)中的BamH I和Xba I酶切位点，得到pIECMV-ORF5M转移载体。
利用引物Pcmv/PpolyA扩增来自pCI-neo(Promega公司产品)载体中CMV启动子、MCS多克隆位点和polyA信号片段，获得大小约为1450bp的PCR产物。将该PCR产物进行Hind III和BamH I酶切，插到用Hind III和BamH I酶切的pBluescript SK+(Stratagene公司产品)载体中，获得一种人工构建的真核表达载体pCMVPA。
将EcoR I和SmaI酶切的ORF6基因PCR扩增产物插入到人工构建的真核表达载体pCMVPA的EcoR I和SmaI位点，获得中间载体pCMVPA-ORF6。进一步将pCMVPA-ORF6进行Bal II和
BamH I酶切，获得大小约为2.5kb的CMV-ORF6-PolyA表达盒，将CMV-ORF6-PolyA表达盒进行Klenow I大片段酶补平后定位插到已经利用CIAP去磷酸化酶进行去磷酸化的转移载体pIECMV-ORF5M的Stu I位点，在T4DNA连接酶作用下连接，然后将连接产物转化DH5。大肠杆菌，小量制备质粒、酶切鉴定，从而获得转移质粒pIECMV-5m6。其结构模拟图见图1。鉴定结果证实构建正确(见图2)，其构建流程图如图3所示。
3、重组伪狂犬病毒TK-/gE-/GP5m+/M+的构建
在PK-15细胞上增殖PrV TK-/gE-/LacZ+亲本株，提取其基因组DNA(提取方法参照王柳等，生物技术，1994，4(4)，33-35)。由于PrV TK-/gE-/LacZ+的基因组DNA中只存在一个EcoR I酶切位点，而且位于LacZ基因中。用EcoR I将PrV TK-/gE-/LacZ+的基因组DNA酶切成两段，应用脂质体介导转染技术(方法参照周复春等，畜牧兽医学报，2001，32(2)，129-133)将其与pIECMV-5m6转移载体共转染PK-15细胞，通过发生同源重组交换将CMV-ORF5M-polyA和CMV-ORF6-polyA两个独立的完整表达盒导入到PrV基因组gE和gI基因位点之间(图4)，同时置换出LacZ基因，待产生细胞病变后收毒。将病毒液接种于PK-15细胞，用含1％低熔点琼脂糖的DMEM(例如美国GIBCO公司产品)维持液覆盖，于37℃5％CO2的条件下培养，当刚出现细胞病变时，用0.01％的中性红染色1h，由于病变细胞不能着色，而正常细胞被染成红色，从而出现圆点状空斑，挑取单个空斑接种PK-15细胞扩大培养，利用ORF5M和ORF6基因的PCR扩增检测方法鉴定阳性重组病毒(PCR结果见图5和图6)，如此进行三次纯化，最后利用LacZ基因的PCR检测方法不能检测到PrV TK-/gE-/LacZ+株的存在，从而确定病毒液中只含有重组伪狂犬病毒TK-/gE-/GP5m+/M+。其构建流程如图2。
4、重组伪狂犬病毒(TK-/gE-/GP5m+/M+)株的生物学特性及其鉴定
重组伪狂犬病毒(TK-/gE-/GP5m+/M+)株Southern-blotting和Western-blotting的鉴定参照(萨姆布鲁I，弗里奇E和曼尼阿蒂斯T.著，《分子克隆实验指南》第二版.金冬雁等译校，科学出版社，1998)中的方法进行。
Southern-blotting鉴定：提取重组伪狂犬病毒TK-/gE-/GP5m+/M+突变株的基因组DNA(参考文献：王柳等，生物技术，1994，4(4)，33-35)用Bgl II和Sal I酶切后，在0.8％的琼脂糖凝胶上30伏电泳6小时后，按常规方法(萨姆布鲁I，弗里奇E和曼尼阿蒂斯T.著，《分子克隆实验指南》第二版.金冬雁等译校，科学出版社，1998)进行Southern-blotting鉴定。将酶切后进行电泳的突变株的基因组DNA转移到硝酸纤维素膜上，80℃烤膜后备用。PCR扩增完整的ORF5M和ORF6基因的DNA片段，按DNA回收试剂盒(上海生工生物工程公司)操作说明回收目的DNA后，用地高辛标记与检测试剂盒(Roch公司产品)标记(具体方法按Roch公司的试剂盒说明书操作)，作为ORF5M和ORF6基因的DNA探针，置于-20℃保存备用。最后将ORF5M和ORF6基因的DNA探针与备用的硝酸纤维素膜杂交，结果如图7所示。试验结果表明，Bgl II和Sal I酶切的TK-/gE-/GP5m+/M+株基因组DNA泳道有明显的特异性杂交带，与预期相符合，而TK-/gE-/LacZ+株基因组DNA泳道则没有，证实ORF5M和ORF6基因表达盒已正确插入到了亲本株基因组gE/gI中。
Western-blotting鉴定：将重组伪狂犬病毒TK-/gE-/GP5m+/M+株接种于刚长成单层的
PK-15细胞，16小时后收集病变细胞。按常规方法(萨姆布鲁I，弗里奇E和曼尼阿蒂斯T.著，《分子克隆实验指南》，第二版.金冬雁等译校，科学出版社，1998)制备样品，进行SDS-PAGE和Western-blotting鉴定，结果如图8所示。经过Western-blotting分析，感染TK-/gE-/GP5m+/M+株的PK-15细胞泳道，发现其可以与猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性血清反应，在约26kD和19kD处发现两条特异性杂交带，而两个对照泳道中则没有，表明猪繁殖与呼吸综合征病毒的GP5m和M蛋白得到了表达。
重组伪狂犬病毒株TK-/gE-/GP5m+/M+是本发明所构建的以伪狂犬病毒双基因缺失株TK-/gE-/LacZ+为病毒载体，将猪繁殖与呼吸综合征病毒的修饰型主要免疫原性基因ORF5M和ORF6基因插入到伪狂犬病毒双基因缺失株TK-/gE-/LacZ的基因组中，人工构建得到的二价弱毒疫苗株。其遗传稳定性和生物学特性与亲本毒株TK-/gE-/LacZ+没有差异。重组病毒有囊膜、核酸为双链DNA，病毒颗粒直径为120-180nm，对乙醚、氯仿及胰蛋白酶敏感，于56℃30min可以完全灭活。在PK-15细胞上的TCID50仍可以达到10-8.4/mL。将重组病毒连续在PK-15细胞上传30代，其增殖滴度没有明显的变化，可以稳定的表达猪繁殖与呼吸综合征病毒的GP5m和M蛋白。
该重组病毒需要在猪肾继代细胞(PK-15)上增殖和检测存活情况，PK-15细胞的培养基为含10％犊牛血清的Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)(美国GIBCO公司产品)，pH范围为6.8-7.2，于37℃培养。可采用超低温冻结和/或真空冷冻干燥保藏。
5、伪狂犬病毒-猪繁殖与呼吸综合征病毒基因工程疫苗的制备
将获得的重组伪狂犬病毒TK-/gE-/GP5m+/M+进行鉴定，30次传代后发现其遗传性稳定，外源蛋白可以稳定表达，并具有良好的生物学活性的伪狂犬病毒-猪繁殖与呼吸综合征病毒基因工程毒株作为基因工程疫苗的候选毒株。该疫苗株在猪肾传代细胞上的增殖滴度达到108.4TCID50，经过筛选，采用制备简便的鸡胚成纤维细胞增殖疫苗病毒，其增殖滴度达到107.0TCID50。将疫苗种毒按1/10的体积比例接种鸡胚成纤维细胞，细胞病变后收集合格的病毒液，加入按病毒液∶明胶为7∶1的体积比例加入明胶保护剂(每100ml去离子水中加蔗糖40g，明胶8g，充分融化后，置121℃下灭菌)，于灭菌冻干瓶中按2.5mL/瓶分装，置冷冻干燥机中冻干，冻干36-40h后压盖，置-20℃保存备用。
6、伪狂犬病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒基因工程二价疫苗的安全性评价
将30只伪狂犬病血清学阴性的健康Balb/C小白鼠随机分为三组，其中两组分别接种106TCID50病毒量的TK-/gE-/GP5m+/M+疫苗株和PrV Ea株，另一组作为空白对照组，观察14天。接种疫苗的和对照组的小白鼠精神食欲均正常，无异常表现；而接种强毒(PrV Ea株)的小白鼠，从接种后72小时开始死亡，到144小时全部死亡，表明该基因重组疫苗对小白鼠是安全的(表2)。
表2本发明的伪狂犬病毒-猪繁殖与呼吸综合征病毒基因工程疫苗对Balb/C小白鼠的安全性
  试验组别   动物数(只)   死亡数(只)   平均死亡时间(小时)
  空白对照组TK-/gE-/GP5m+/M+组接种PrV鄂A株组   101010   0010   00111.3±32.7
将TK-/gE-/GP5m+/M+疫苗按107TCID50的病毒量接种25日龄的仔猪，部分出现轻度的一过性的发热反应，两天后恢复正常，在此期间仔猪的精神食欲正常，未见异常变化，可以检测到伪狂犬病毒中和抗体。PrV鄂A株(强毒株)接种的仔猪，第二天全部呈现发热反应，持续一周，并有一头死亡，剖解发现具有典型的伪狂犬病病理变化，而对照组既没有体温升高，也没有异常临床表现。按107TCID50的病毒量接种TK-/gE-/GP5m+/M+疫苗和未接种的妊娠母猪，窝产仔数基本相当，均没有出现死胎、木乃伊胎等，证实该疫苗对妊娠母猪是安全的。
7、伪狂犬病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒基因工程二价疫苗的免疫效力和保护力检测
1)猪的免疫及攻毒程序
将突变株(TK-/gE-/GP5m+/M+)制成的冻干活疫苗分别经颈部肌肉注射25日龄的断奶阴性仔猪，每组5头，每头猪免疫106TCID50，共免疫2次，间隔4周；同时设亲本株TK-/gE-/LacZ-、PRRSV灭活苗(KV control)(成都中牧生物制品股份公司产品)和阴性未免疫(neg control)对照。并于二免后5周进行PRRSV强毒YA株进行攻击。实验猪经前腔静脉采血，分离血清后分别进行特异性针对PRV的ELISA抗体和中和抗体，以及针对PRRSV的中和抗体水平检测(方法参照方六荣等，病毒学报，2004，20(3)，249-254)。同时采集抗凝血，分离外周血单个核细胞(PBMC)检测特异性针对PRRSV的淋巴细胞增殖和特异性杀伤感染PRRSV的猪肺泡巨噬细胞效率(方法参照Pirzadeh B等，J Gen Virol，1998a，79，989-999)，以评估其诱导机体产生的细胞免疫应答水平。实验猪攻毒后每天观察其临床症状，并测量体温变化，维持三周。于攻毒后0，7，10，14，17，21天利用PRRSV的ORF7特异性引物Porf71、Porf72进行RT-PCR检测血清、鼻拭子和扁桃体拭子中PRRSV的含量(方法参照Pirzadeh B等，J Gen Virol，1998a，79，989-999)，RT-PCR反应条件为：50℃反转录30min；94℃预变性5min；进入PCR循环，94℃1min，55℃1min，72℃1min，35个循环后，72℃延伸10min。反应结束后，用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。于攻毒后12天和21天进行猪只的称重，观察攻毒后对体重的影响。于攻毒后21天将所有实验猪放血处死，分别观察扁桃体、肺、肺门淋巴结、肠系膜淋巴结、肾的大体病理变化，同时进行这六个组织的病理切片观察。
2)伪狂犬病免疫效果检测
首免后3周突变株(TK-/gE-/GP5m+/M+)可以特异性的检测到针对PrV的ELISA和中和抗体，并于二免后2周达到最高，血清在1∶40的稀释倍数下ELISA抗体水平达到最高，其抗体滴度达到1∶20480，而中和抗体达到33.6±17.6，和亲本株TK-/gE-/LacZ+免疫组所表现出的趋势和实际值均无显著性差异(表3)，表明突变株(TK-/gE-/GP5m+/M+)可以较好的产生特异性针对PrV的免疫应答。
             表3重组病毒免疫小鼠诱发特异性针对PRV的抗体水平检测
  3W   6W   8W   10W
Tk-/gE-/LacZ+TK-/gE-/GP5m+/M+KV controlNeg control   SNaELISAbSNELISASNELISASNELISA   1/6c1602/6160----   31.3±18.42048038.4±24.320480----   35.6±17.52048033.6±17.620480----   34.6±19.72048035.2±16.520480----
说明：a：SN是指中和抗体；
      b：PrV的ELISA抗体效价是指针对PrV全病毒粒子的ELISA抗体滴度；
      c：是指可以检测到针对PrV中和抗体的小鼠数量。
3)猪繁殖与呼吸综合征中和抗体检测
采用文献(Pirzadeh B等，J Gen Virol，1998a，79，989-999)报道的中和抗体检测方法，检测血清中特异性针对PRRSV的中和抗体水平。结果表明，突变株(TK-/gE-/Gp5m+/M+)免疫组在首免后7周可以检测到特异性针对PRRSV的中和抗体(＞＝1∶4)，并趋于上升。攻毒后其中和抗体水平快速上升，于攻毒后17天达到最高，其中有3头猪的中和抗体都达到了1∶256，而灭活苗对照免疫组在攻毒前基本检测不到中和抗体，攻毒后的中和抗体水平也不高，与突变株(TK-/gE-/Gp5m+/M+)免疫组相比差异极显著(P＜0.01，t-test)，空白对照组在整个实验过程中都未检测到特异性针对PRRSV的中和抗体，亲本株对照免疫组在攻毒后21天有1头猪表现出可检测中和抗体(1∶4)。试验结果如图9。
4)外周血单个核细胞(PBMC)淋巴细胞增殖和特异性杀伤
分别采集免疫猪首免后42、63天和攻毒后14天的抗凝血，分离PBMC(方法参照PirzadehB等，J Gen Virol，1998a，79，989-999)，检测特异性针对PRRSV的淋巴细胞增殖，结果表明，以紫外照射灭活的PRRSV为特异性刺激原，突变株(TK-/gE-/GP5m+/M+)免疫组相比灭活
苗对照组表现出显著的增殖效应，特别是攻毒后这种差异更明显，表现出记忆T细胞免疫反应。试验结果如图10。
以PRRSV感染的猪肺泡巨噬细胞为靶细胞，检测免疫猪首免后63天的特异性杀伤淋巴T细胞的特异性细胞毒活性(方法参照Pirzadeh B等，J Gen Virol，1998a，79，989-999)。结果表明，突变株(TK-/gE-/GP5m+/M+)免疫组相比灭活苗对照组表现出显著的特异性杀伤感染PRRSV的猪肺泡巨噬细胞效应，表明突变株(TK-/gE-/GP5m+/M+)免疫组具有更高的特异性杀伤细胞毒活性(CTL)，能够更好的抑制病毒在体内的复制。试验结果如图11。
5)攻毒后猪的临床症状及体温和体重变化
在整个攻毒实验过程中未观察到攻毒猪的明显临床症状。在攻毒前2天和攻毒后21天内，每天进行所有免疫猪的体温测量，其结果见图10，突变株(TK-/gE-/GP5m+/M+)和灭活免疫组分别于攻毒后第3和第4天出现一过性的发热(＞40.0℃)，维持一天后恢复正常，而亲本株和阴性对照组表现持续发热，并且波动较大，结果见图12。
于攻毒后12天和21天时进行所有猪只的体重测量，计算日平均增重。结果表明，突变株(TK-/gE-/GP5m+/M+)免疫组相比亲本株和阴性对照组日平均增重更高，具有显著的差异，特别在攻毒前期12天内，这种差异更大，但与灭活苗无显著差异性。结果见表4。
                         表4攻毒后猪的体重变化
组别                   平均增重(攻毒后)
  Days 0-12   Days 13-21   The total
  TK-/gE-/LacZ+KV controlTK-/gE-/GP5m+/M+Neg control   5.46.296.345.38   4.765.15.294.77   10.1611.3911.6310.15
单位：千克
6)病毒血症和排毒情况
利用PRRSV的ORF7特异性引物Porf71、Porf72进行RT-PCR检测攻毒后，7，10，14，17，21天血清，攻毒后7，14，21天鼻拭子和攻毒后10，17，21天扁桃体拭子中PRRSV的含量，具体按RT-PCR试剂盒(TAKARA公司产品)说明书进行，以确定病毒血症和排毒情况。RT-PCR反应条件为：50℃反转录30min；94℃预变性5min；进入PCR循环，94℃1min，
55℃1min，72℃1min，35个循环后，72℃延伸10min。反应结束后，用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。结果表明，突变株(TK-/gE-/GP5m+/M+)免疫组相比灭活苗可以更有效地抑制病毒血症的发生，并可以快速的清除病毒在血清中的存在。同时，通过检测鼻拭子和扁桃体拭子中病毒的含量，突变株(TK-/gE-/GP5m+/M+)免疫组向外排毒情况(包括排出病毒的含量和时间)也显著优于灭活苗免疫组。结果见表5。
表5攻毒后猪血清、鼻拭子、扁桃体拭子中ORF7基因RT-PCR结果
组别                          攻毒后天数
  7   10   14   17   21
  血清   TK-/gE-/LacZ+   +++++   +++++   +++++   +++++   ++++
  KV control   ++++   +++++   +++++   +++++   +++
TK-/gE-/GP5m+/M+ +++ +++++ +++++ ++++ -
  Neg control   +++++   +++++   +++++   +++++   ++++
  鼻拭子   TK-/gE-/LacZ+   +++   ++++   +
  KV control   ++   +++   -
  TK-/gE-/GP5m+/M+   ++   ++   -
  Neg control   +++   +++   ++
  扁桃体拭子   TK-/gE-/LacZ+   +++++   ++++   +++
  KV control   +++++   +++   ++
  TK-/gE-/GP5m+/M+   +++++   ++   -
  Neg control   +++++   ++++   ++++
说明：-：RT-PCR扩增结果为阴性；+：5头猪中有1头RT-PCR扩增结果为阳性；++：5头猪中有2头RT-PCR扩增结果为阳性；+++：5头猪中有3头RT-PCR扩增结果为阳性；++++：5头猪中有4头RT-PCR扩增结果为阳性；+++++：5头猪中有5头RT-PCR扩增结果为阳性。
7)免疫猪攻毒后的组织病理变化
于攻毒后21天将所有实验猪放血处死，分别观察其扁桃体、肺、肺门淋巴结、肠系膜淋巴结、肾的大体病理变化，同时进行这六个组织的病理切片观察(参照赵德明编，兽医病理学，中国农业大学出版社，1998)。结果发现，亲本株和阴性对照组肺部有散在的淤血和出血点，同时肺门淋巴结和肠系膜淋巴结水肿，严重出血，而其它组织大体病理变化不明显。灭活苗和突变株(TK-/gE-/GP5m+/M+)免疫组肺部无明显肉眼可观的病理变化，但肺门淋巴结也
表现出较重的出血。组织显微病理变化观察发现，亲本株和阴性对照组肺部具有典型严重的间质性肺炎变化，肺泡壁增厚，支气管和细支气管壁增厚并管内有淋巴细胞和巨噬细胞浸润，肺门淋巴结大量脂肪细胞沉积，出血水肿，并由于巨噬细胞吞噬红细胞造成的铁血黄素沉积，肠系膜淋巴结水肿，严重出血，肾表现出肾小管的水肿和上皮细胞的损伤脱落形成管型，扁桃体和脾未见有典型病理变化。灭活苗免疫组猪的肺表现中度温和的间质性肺炎，其他组织的显微病理变化与对照组基本一致。相比亲本株、阴性对照和灭活苗免疫组，突变株(TK-/gE-/GP5m+/M+)免疫组所表现出明显差异的是较轻的间质性肺炎，肺泡和支气管壁基本无明显的增厚。脾小体扩大，生发中心明显，这可能是诱发的免疫应答反应所致。但其他组织的显微病理变化也无明显的差异。其中肺组织的显微病理变化差异见图13。

Claims (4)

1、一种重组伪狂犬病-猪繁殖与呼吸综合征基因工程毒株Pseudorabies virusHzauAVL-PRprrsvV-GP5mM，保藏在CCTCC，保藏编号：CCTCC-V200509。
2、根据权利要求1所述的一种重组伪狂犬病-猪繁殖与呼吸综合征基因工程毒株，其特征在于所述的重组伪狂犬病-猪繁殖与呼吸综合征基因工程毒株：
1)缺失伪狂犬病病毒主要毒力基因TK，不产生功能性的糖蛋白gE/gI；
2)猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5M和ORF6基因是以两个独立完整的表达盒的形式插入；
3)同时表达猪繁殖与呼吸综合征病毒的GP5m和M蛋白抗原。
3、包含权利要求1或2所述的重组伪狂犬病-猪繁殖与呼吸综合征病毒基因工程毒株制备的疫苗，该疫苗包含权利要求1所述的基因工程毒株Pseudorabies virusHzauAVL-PRprrsvV-GP5mM，保藏在CCTCC，保藏编号：CCTCC-V200509。
4、权利要求1或2所述的一种重组伪狂犬病-猪繁殖与呼吸综合征基因工程毒株在制备伪狂犬病-猪繁殖与呼吸综合征基因工程疫苗上的应用。
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