CN102994534A - 鸭瘟病毒gE基因转移载体pUC-ΔgE-EGFP及重组株DPV-ΔgE-EGFP - Google Patents

Abstract

本发明公开了鸭瘟病毒gE基因转移载体pUC-ΔgE-EGFP，包含转移载体pUC-ΔgE-EGFP的大肠杆菌种(Escherichia coli)JM109于2012年2月24日保藏于位于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M2012033；分类命名为大肠杆菌JM109/pUC-ΔgE-EGFP(Escherichia coli JM109/pUC-ΔgE-EGFP)。该转移载体可通过与鸭瘟病毒同源重组，获得EGFP标记基因的重组鸭瘟病毒，鸭瘟病毒gE缺失重组株DPV-ΔgE-EGFP，于2012年2月23日保藏于位于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：V201210。该重组病毒将可以发展成为具有筛选标记的有效预防鸭瘟的新型疫苗。

Description

鸭瘟病毒gE基因转移载体pUC-ΔgE-EGFP及重组株DPV-ΔgE-EGFP

技术领域

本发明涉及动物医学领域中一种基因工程制品的制备方法，特别涉及鸭瘟病毒gE基因部分缺失的转移载体构建及其应用。

背景技术

鸭瘟(duck plague，DP)是由疱疹病毒科中的鸭瘟病毒(Duck plague virus，DPV)引起的常见于鸭、鹅、天鹅等雁形目水禽的一种高度致死性传染病。目前，鸭瘟仍是危害水禽养殖业持续稳定发展的重要因素，加强鸭瘟的研究对水禽养殖业的防制尤为重要。用于预防鸭瘟的疫苗主要有灭活苗和弱毒苗两大类，一般认为弱毒苗免疫效力较灭活苗好，弱毒苗虽然只使鸭体产生低水平中和抗体，当受强毒攻击时可使鸭体产生明显的血清记忆反应。

基因缺失疫苗毒株稳定，不易返祖，免疫原性好、安全性高。gE基因是非常重要的毒力基因，它的缺失使病毒的毒力大大降低，但是病毒仍可以复制，因此在疱疹病毒基因工程疫苗中gE基因缺失疫苗的研究十分关键。另一方面，重组病毒活载体疫苗兼有常规活疫苗和灭活疫苗的优点，是当前新型疫苗研制与开发的主要方向。疱疹病毒是用于活载体疫苗制备的理想病毒载体之一，作为疱疹病毒成员的鸭瘟病毒，基因组较大，约160kb左右，可容纳多个外源基因的插入。以gE基因作为一个插入位点，来表达外源基因蛋白，由于gE基因的缺失、突变，从而使该鸭瘟病毒的野毒株毒力减弱，不再引起临床疾病，但仍能感染宿主并诱发保护性免疫力，而且和外源基因蛋白的共表达，可产生多联疫苗。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种鸭瘟病毒转移载体及其构建方法，该转移载体可通过与鸭瘟病毒同源重组，获得重组鸭瘟病毒，为鸭瘟病毒gE基因缺失疫苗及其gE基因功能研究打下基础。

一种鸭瘟病毒gE基因转移载体pUC-ΔgE-EGFP，包含转移载体pUC-ΔgE-EGFP的大肠杆菌种(Escherichia coli)JM109于2012年2月24日保藏于位于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M2012033；分类命名为大肠杆菌JM 109/pUC-ΔgE-EGFP(Escherichia coli JM109/pUC-ΔgE-EGFP)。

所述的转移载体pUC-ΔgE-EGFP的制备方法，包括以下步骤：

1)以鸭瘟病毒CHv株为材料，利用PCR扩增部分gE基因及其左侧翼(L)1073bp片段和部分gE基因及其右侧翼(R)1130bp片段，克隆进载体pMD18-T，构建质粒pMD-L和pMD-R；

2)先将pMD-L用Hind III和BamH I酶切，回收1073bp片段，克隆进已用相应限制性内切酶酶切的pUC18载体，然后再将pMD-R中的部分gE基因及其右侧翼(R)1130bp片段以BamH I和EcoR I插入到已含有部分gE基因及其左侧翼(L)的pUC-L载体中，获得载体pUC-ΔgE；

3)用ApaL I和Mlu I酶切质粒pEGFP-Cl，回收包含CMV立即早期启动子、EGFP基因、转录终止信号SV40polyA以及一个多克隆位点基因共2016bp片段的EGFP表达盒，然后对其进行补平；

4)先将载体pUC-ΔgE，用BamH I酶切后，进行补平，再将其与3)中获得补平后的EGFP表达盒连接，从而获得转移载体pUC-ΔgE-EGFP；

上述扩增PCR扩增部分gE基因及其左侧翼(L)1073bp片段的上、下游引物分别是：

上游引物：5′-AAGCTTCCTGAAAGATGTTCTAAG-3′

下游引物：5′-GGATCCTTGATGATAGTCTGCTATAC-3′

上述扩增PCR扩增部分gE基因及其右侧翼(R)1130bp片段的上、下游引物分别是：

上游引物：5′-GGATCCGTTTGTAGTCGGTCTCGG-3′

下游引物：5′-GAATTCCGTATTAACCTTTTGTAGCT-3′。

鸭瘟病毒gE缺失重组株DPV-ΔgE-EGFP，于2012年2月23日保藏于位于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：V201210。

所述鸭瘟病毒gE缺失重组株DPV-ΔgE-EGFP的制备方法，由以下步骤完成：

1)鸭瘟病毒CHv株感染鸭胚成纤维细胞；

2)转移载体pUC-ΔgE-EGFP质粒转染；

3)收获出现荧光斑的细胞；

4)结合无限稀释法，通过空斑纯化获得重组鸭瘟病毒。

实验结果表明重组病毒和弱毒疫苗均能提供较好的保护，并且重组病毒表现出更优的免疫效果，可以进一步发展成为有效预防鸭瘟病的新型疫苗。

附图说明

图1鸭瘟病毒gE基因的跨膜区预测。结果表明gE蛋白有跨膜区域，是典型的I型膜蛋白。gE蛋白由396个氨基酸的胞外区、23个氨基酸的跨膜区和71个氨基酸的胞质区所组成。

图2转移载体左右臂PCR扩增。M为DL2000，L指左臂片段，大小为1073bp；R指右臂片段，大小为1130bp。

图3包含CMV立即早期启动子、EGFP基因、转录终止信号SV40polyA以及一个多克隆位点基因共2016bp片段的EGFP表达盒片段。M为DL2000，G代表EGFP表达盒。

图4转移载体pUC-ΔgE-EGFP结构示意图。

图5感染重组病毒DPV-ΔgE-EGFP的鸭胚成纤维细胞呈现均一绿色荧光。

图6常规PCR鉴定重组病毒DPV-ΔgE-EGFP的结果。M为DL15000，1为DPV-CHv亲本株扩增片段约1800bp，2为重组病毒DPV-ΔgE-EGFP的扩增片段约2700bp。

图7A、B、C分别为鸭瘟病毒CHv亲本株在可见光显微镜下、荧光显微镜下及合成图片，D、E、F分别为重组病毒DPV-ΔgE-EGFP在可见光显微镜下、荧光显微镜下及合成图片。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

包含转移载体pUC-ΔgE-EGFP的大肠杆菌种(Escherichia coli)JM109于2012年2月24日保藏于位于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCCNO：M2012033；分类命名为大肠杆菌JM109/pUC-ΔgE-EGFP(Escherichia coliJM 109/pUC-ΔgE-EGFP)。

鸭瘟病毒gE缺失重组株(DPV-ΔgE-EGFP)已于2012年2月23日保藏于位于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：V201210。

1病毒毒株和细胞

鸭瘟病毒强毒DPV CHv株由四川农业大学禽病防治研究中心分离、鉴定保存，该病毒株已与2012年2月23日保存在位于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为：CCTCC NO：V201209，分类命名为鸭瘟病毒CH virulent株(DPV CHv)；鸭瘟病毒弱毒疫苗株：购自成都天邦生物制品有限公司产品，兽药生产许可证证号：(2006)兽药生产证字07022号；批准文号：兽医生字(2006)070222023)；鸭胚成纤维细胞(DEF)用含10％小牛血清的MEM培养基于37℃培养。

2质粒和菌株

大肠杆菌JM109、质粒pUC18等购自宝生物工程(大连)有限公司；质粒pEGFP-C1购自Clontech。

3分子生物学试剂

Lipofectamine 2000、MEM和小牛血清购自Invitrogen；ApaL I、Mlu I、Hind III、BamH I、EcoR I、DL2000、DL15000、Agarose Gel DNA Purification Kit、BKL Kit、Dephospharylation(BAP)Kit、DNA Ligation Kit等购自宝生物工程(大连)有限公司；Seaplaque低熔点琼脂糖购自LONZA；小量质粒抽提试剂盒及饱和酚(pH8.0)购自天根生化科技(北京)有限公司。

4实验所用溶液及其配制

LB液体培养基：Tryptone 10g，Yeast extract 5g，NaCl 10g，800mL纯水溶解，1mol/LNaOH调pH至7.0，定容至1000mL，分装，高温高压灭菌，4℃保存备用。

LB固体培养基：按1.5g/100mL加入琼脂粉于液体培养基中，高温高压灭菌，待冷却至60℃左右，加入0.1mL氨苄青霉素(100mg/mL)或卡那霉素(50mg/mL)，平铺于灭菌平皿中，无菌检测后，4℃避光保存备用。

氨苄青霉素(Amp)溶液：取Amp粉剂1g，溶于灭菌超纯水中，使其终浓度为100mg/mL，过滤除菌后分装，-20℃保存备用。

双抗：将100万IU青霉素和100万IU链霉素加入100mL去离子水中，过滤除菌，-20℃保存。

MEM：将9.6g MEM干粉和2.2g碳酸氢钠溶于800mL去离子水，充分搅拌，调节pH值至7.4，定容至1L，过滤除菌，4℃保存。

细胞生长营养液：取10mL小牛血清加入到90mL MEM中，再加入1mL双抗，充分混匀，现配现用。

细胞维持液：取3mL小牛血清加入到97mL MEM中，再加入1mL双抗，充分混匀，现配现用。

2×MEM：称取9.6g MEM干粉、2.2g碳酸氢钠溶于400mL去离子水，充分搅拌，调节pH值至7.4，定容至500mL，过滤除菌，4℃保存。

2×细胞维持液：取6mL小牛血清加入到94mL 2×MEM中，再加入2mL双抗，充分混匀，现配现用。

2％低熔点琼脂糖：称取2g低熔点琼脂糖溶于100mL去离子水中，高温高压灭菌，室温保存。

实施例1.转移载体构建

1.1病毒培养

1)鸭成纤维细胞的制备：将鸭胚放入蛋槽，气室朝上，用碘酒、酒精消毒；用镊子将气室敲开，轻轻将鸭蛋壳去掉，将小鸭胚用镊子从脖子处轻轻挑出放入灭菌好的培养皿，并用生理盐水冲洗几次；将头、尾、四肢、内脏全部取出，用生理盐水冲洗干净；将剩余的胴体剪碎至无大的组织块，要很均匀。用生理盐水冲洗，加胰酶37℃消化1-2min并摇动，5000r/min离心5min留上清。然后用灭菌好的纱布过滤，在过滤液中加入生长液混匀(每个鸭胚30mL左右)，分装到细胞瓶中，放入CO₂培养箱培养24-48h。

2)细胞种毒液的准备：接种DPV CHv后出现75％细胞病变的DEF细胞，反复冻融三次后收集细胞悬液，4℃ 8000r/min离心10min后的上清作为接种DEF的细胞种毒液。

3)病毒的接种方法：取刚刚长成致密单层的DEF，弃生长营养液，用灭菌PBS清洗细胞表面2次后加入病毒覆盖细胞表面进行吸附，37℃吸附2h后弃病毒液，然后加含3％小牛血清和1％双抗的MEM维持营养液于37℃培养。

1.2鸭瘟病毒核酸的制备

1)接种完全适应DEF生长的DPV CHv，待细胞出现75％病变后，反复冻融三次，将细胞混悬液分装到1.5mL Eppendorf管中，0.5mL/管，-20℃保存备用；

2)向EP管中加入消化缓冲液0.5mL/管，加入10μL的蛋白酶K(10mg/mL)，56℃水浴消化2h；

3)将EP管置4℃，待SDS析出后于4℃ 8000r/min离心5min，将SDS沉淀除去；

4)加入0.5mL饱和酚，颠倒混匀5min，于4℃ 12000r/min离心5min，取上层水相；

5)加入0.5mL氯仿/异戊醇(24/1)，颠倒混匀5min，于4℃ 12000r/min离心5min，取上层水相；

6)加入1/10体积的3mol/L NaAc(pH5.2)和2倍体积的冰冷无水乙醇，-20℃静置2h以上；

7)于4℃ 12000r/min离心20min沉淀核酸；

8)弃上清，加入1mL 70％无水乙醇，轻轻混匀后于4℃ 12000r/min离心20min，倾弃上清以除去溶解于70％无水乙醇中的酚、氯仿等物质；

9)将EP管倒扣于吸水纸上，使其中的乙醇自然挥发；

10)加入40μL TE溶解核酸，-20℃保存备用。

1.3设计转移载体左右臂的引物

根据鸭瘟病毒CHv株基因组(GenBank登录号：JQ647509)gE基因序列，将其序列推导的肽链提交到丹麦技术大学生物序列分析中心(CBS)网站(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)进行跨膜区预测(图1)。设计引物时，将主要生物学功能区去掉，由部分gE基因及其前后的基因的序列设计并合成了两对引物，分别用于扩增转移载体的左右臂。

用于扩增左臂的引物如下：

L-S：5′-AAGCTTCCTGAAAGATGTTCTAAG-3′

L-A：5′-GGATCCTTGATGATAGTCTGCTATAC-3′

用于扩增右臂的引物如下：

R-S：5′-GGATCCGTTTGTAGTCGGTCTCGG-3′

R-A：5′-GAATTCCGTATTAACCTTTTGTAGCT-3′

其中引物L-S和L-A用于扩增转移载体的左臂，扩增长度约为1073bp，包括部分gE基因及其左侧的序列；其中引物R-S和R-A用于扩增转移载体的右臂，扩增长度约为1130bp，包括部分gE基因及其右侧的序列。

1.4转移载体左右臂PCR扩增

1.4.1转移载体左臂PCR扩增

以1.2中抽提的鸭瘟病毒基因组核酸为模板，经优化，PCR的反应体系和反应条件如下：

PCR反应体系：L-S(10μmol/L)1μL，L-A(10μmol/L)1μL，DPV DNA 2μL，PrimeSTAR(R)HS(Premix)12.5μL，ddH₂O 8.5μL；

PCR反应条件：95℃ 45s；94℃ 45s、58℃ 45s、72℃ 1.5min 30个循环；72℃ 10min；

操作：先将PCR仪预热启动，待温度上升到95℃时暂停运行，加样完毕后再运行PCR仪，即采用简易热启动法以减少引物二聚体的产生。扩增完毕后取5μL产物做1％琼脂糖凝胶电泳，鉴定PCR扩增产物。

1.4.2转移载体右臂PCR扩增

PCR反应体系、反应条件及操作方法同1.4.1.

1.4.3左右重组臂的克隆和鉴定

将扩增大小正确的左右臂PCR产物(图2)，克隆于pMD18-T中，分别命名为pMD-L和pMD-R；并将两个质粒送于宝生物工程(大连)有限公司序列测定。

1.4.4重组质粒pUC18-L的构建

1)常规方法增殖细菌，采用微量碱裂解法提取质粒pMD-L和pUC18，并用限制性内切酶Hind III和BamH I分别对pMD-L和pUC18酶切。酶切体系如下：

2)37℃，作用4h，电泳回收目的片段(左臂)；并使用胶回收试剂盒回收酶切的目的片断，用T4 DNA连接酶，16℃连接过夜。反应体系如下：

3)取15μL连接产物转化于E.coli JM109感受态细胞中，筛选出的阳性克隆命名为pUC18-L。

4)用Hind III和BamH I对重组pUC18-L质粒双酶切鉴定。

1.4.5重组质粒pUC-ΔgE的构建

1)常规方法增殖细菌，采用微量碱裂解法提取质粒pUC18-L和pMD-R，并用限制性内切酶BamH I和EcoR I分别对pUC18-L和pMD-R酶切。酶切体系如下：

2)37℃，作用4h，电泳回收目的片段；并使用胶回收试剂盒回收酶切的目的片断，用T4DNA连接酶，16℃连接过夜。反应体系如下：

3)取15μL连接产物转化于E.coli JM109感受态细胞中，筛选出的阳性克隆命名为pUC-ΔgE。

4)使用BamH I和EcoR I对重组pUC-ΔgE双酶切鉴定。

1.5绿荧光蛋白基因表达盒的获取

1.5.1载体pEGFP-C1质粒的制备

取pEGFP-C1重组菌的单个菌落接种于5mL LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，4000r/min离心10min，弃上清收集菌体。用微量碱裂解法抽提pEGFP-C1质粒。

1.5.2分步酶切pEGFP-C1质粒

1)ApaL I酶切，反应体系如下：

2)37℃作用4h，电泳回收目的片段。

3)Mlu I酶切，反应体系如下：

4)37℃作用4h，电泳回收目的片段(图3)。

1.5.3含EGFP基因片段的回收

利用PCR产物胶回收试剂盒对目的酶切片段进行回收，具体步骤如下：

1)将经过ApaL I和Mlu I双酶切的产物于1％琼脂糖凝胶上电泳后，在暗箱式紫外透射仪下切取含目的条带(约2.0kb的片段)的凝胶块，放入1.5mL的Eppendorf管内，加入0.4mL纯化树脂，65℃保温3-5min，使琼脂糖凝胶完全熔化；

2)将熔化液装入离心纯化柱中，13000r/min离心30s，倒掉收集管中废液；

3)加入70％乙醇500μL，13000r/min离心30s，倒掉收集管中的废液；再用乙醇处理一次，13000r/min离心2min，将乙醇除尽；

4)将纯化柱套入干净的离心管中，加20μL的TE缓冲液(pH8.0)于纯化树脂上，室温放置2min，13000r/min离心30s，收获离心液，即纯化的目的基因；

5)取离心液5μL进行凝胶电泳检查提纯效果，其余的样本于4℃保存备用。

1.5.4含EGFP基因片段(目的片段)的补平反应

1)反应体系如下：

2)37℃15min后，电泳回收目的片段。

1.6含绿色荧光蛋白(EGFP)基因转移载体的构建

1.6.1重组质粒pUC-ΔgE的线形化

1)微量碱裂解法抽提质粒pUC-ΔgE，用内切酶BamH I对质粒进行线形化。反应体系如下：

2)37℃作用4h，电泳回收目的片段

1.6.2补平反应

1)反应体系如下：

2)37℃15min后，电泳回收目的片段。

1.6.3去磷酸化处理

1)反应体系如下：

2)65℃作用30min后，电泳并胶回收目的片段。

1.6.4连接反应

1)反应体系如下：

2)16℃反应过夜。

1.6.5转化及筛选

取15μL连接产物转化于E.coli JM109感受态细胞中，涂布平板，37℃过夜培养。挑取单菌落进行PCR检测，筛选出的阳性克隆命名为pUC18-ΔgE-EGFP(图4)并进行测序鉴定，测序结果如下：

CTTCCTGAAAGATGTTCTAAGTAGTACTGCGTTGTTTGTATTGGACTCTCCATCTATACACGATTCGGGGATATATT ATATCAGAGTAAGTGTGAACGATGCTGTAGTACCGGATGTGTTTAAAACGACAGTTATAATTACCGACAAAATTAA TGCAGTAGTCCCCCCGGATGATAACGCTTATGAAAAGGTAACAGAACGGCCACCCGTCGGCGAAGATTTCGGAG TTGTAGCGGATGTAGGTTCCATATGCCATCACTATGACTTCTATTCTGGAGTTCCTCTCGACTATCATCTCATGGGC ATTTCTGGACCATTGGAGGATGACAAGCATTTGAAAGAAGAGGTATCTACAGAAGGCTTCTCGACCATGAAGCC TGTGACCGTTCCTACGACTAACAATTACACAACATTATCTGATGATATGCAGCCTACGCATAATGATACCAATAGT GGACTTAATATCTTTGACAAAATTCCAAATATCTATCTTATCCCAGCTGTAATGTTTGTGGTACTACCGCTGACCAT ATTCATCGTGTTGATGTGCTCTCCTCTTAAACGCAAATTATGTCGTTGTTGTACGAAACGACGTGTTTATACAGGT TCTACCACAAGCGTGATCAACCAATCGGCACTGGATAATCCTCCTTCTCAAGACGCTCTGGAATCAAAACATCCG GAGCTAGATGGTACCCTAATGAGAAAGCTGGAGGAAAAACTGGCAGCGTATGACAGCTCTGGGGATCATAAAAC AGAATAATTCACATCAGTATGACTAAAAGTAAATGTTTTTGTTATGATTGACTGTTTGCCTTTCATTAACATCCAAA TATATTTGTACATGAGGTAATAGGCTATGGGTGGAGCTATAGATCTGTACTAATTTAAGTGTGCAGCCTGGTTAACT GTATTATGCGCGGAGGTTGGAGTACTAAACACCAACATACTGCCGGCCAGACTACGGAACCTCAACAATTGGTA CG

GGATCTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCATGCATTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTA CGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAG TAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATC AAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTA CATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTT GGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATG GGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATG GGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCTA CCGGTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACG GCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCACCTACGGCAAGCTGACCCTG AAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCA GTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCC AGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACAC CCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAG TACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGAT CCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGC CCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCG

CTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATA GCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTAACGCGGATCC

TCATGGATGTTGAACTAATGA CTCACTAGTGAAATAGTTACCTGTATTACTAATGCACAGGTATATTAGGCCGACACCTGGTATACAGGGGTTATAC CGCATCCTACAAGGGATAGAACGTTTGATACCTGTACCTACAACTGCTCTGGAATCCATTCGGAATGCGCAGATG TACTAGCCGGCGACAGTGCCTCACTAGACCACTATCAAGCGCAGACCGGTCACGCAGATGGAATATAATGACCG ACGCAGAGAAGTACTCGCTTTGTGTTAATGCCAACTTAGGTCTTTCGGTTCCATTACGCCCAGACATATGCCTCG GCGACCGTTACATTTGTCATCCTTGTTATGTTGATGGGCTATTCGAAAACTGTCGTGTAGTCGAACGCGCGAAGA ATATAGTGCTACCTGAACACCGCACAGAGTGTATGAAACCTACTTGGTGGTCGGCCATTTGTGATATTTTCATATT TTCTGTAATTTCATGCATTTGTCTGTTATTGTTATTAGTATACTAATAAACAATAAGATTGAGACAGCGCCTCTTCAT TTATATTTACCCGACCCGCCGCGGGCTGGCCGTTTCCCCCACGCCCTCGCCCACGCCCAACCGTCCCTCCCTTCA GTAAACAAGTGCCGGCGTCGGTTTCTTAAGCGGTGTTTATTGACATCAATTGGATGGAATGGGCGGGGCAAACA GGAGCCAGCAACTGGTTACATAGCAATCGCAAAAGGTCAATACGCGCCCGTAGCATATATCGCGACAGTTTTTTT TTAACTCTTGGGCGTTTGCGGTACCCAACGAGTTGCATAGCTACAAAAGGTTAATACGGAA

其中，第一段下划线部分为左臂(gEL)序列；第二段下划线部分为CMV立即早期启动子序列；第三段下划线部分为EGFP基因序列(其中加边框部分表示多克隆位点序列)；第四段下划线部分为转录终止信号SV40polyA序列；第五段下划线部分为右臂(gER)序列；左右臂中用斜体标出部分为gE基因残余序列。

测序结果表明：转移质粒载体pUC-ΔgE-EGFP由gEL和gER组成且gE基因主要功能区1109bp片段由CMV立即早期启动子、EGFP基因、转录终止信号SV40polyA以及一个多克隆位点基因替换，pUC-ΔgE-EGFP按照预期构建成功。

实施例2.重组鸭瘟病毒DPV-ΔgE-EGFP的的构建与纯化

2.1含EGFP基因重组鸭瘟病毒DPV-ΔgE-EGFP的构建

常规方法制备原代鸭胚成纤维细胞，在六孔细胞培养板中培养至形成单层，接种DPV CHv株，37℃作用2h；约1h后，先按照每孔加入240μL无血清OPTI-MEM和10μLLipofectamine 2000的比例计算配制溶液1，再按照每孔加入240μL无血清MEM和10μL含4μg pUC-ΔgE-EGFP转移质粒DNA计算配制溶液2，然后将溶液1与溶液2混合，置室温作用20min；在此期间，将六孔板中的细胞用无血清MEM轻轻洗两遍，每孔加入1.5mL无血清OPTI-MEM，再逐滴加入0.5mL孵育后的混合液，并留一孔作为对照；37℃ 5％ CO₂培养箱中作用6h，吸弃转染液，加入含细胞维持液；37℃ 5％ CO₂培养箱中培养2-3天，每天观察荧光，直至出现重组病毒荧光斑。

2.2含EGFP基因重组鸭瘟病毒DPV-ΔgE-EGFP的纯化

1)收集出现荧光孔中的细胞，反复冻融三次后，接种六孔板中长满单层的鸭胚成纤维细胞，37℃作用2h后，吸去上清液，加入细胞培养维持液37℃ 5％ CO₂培养箱中培养24-48h。

2)待出现荧光后，吸去维持液，在六孔板中覆盖营养琼脂(2×细胞维持液与2％低熔点琼脂糖等体积混合，每孔加入2mL)，待琼脂凝固后翻转细胞培养板，37℃ 5％ CO₂培养箱中继续培养24h左右，显微镜下标记含荧光斑细胞集落，用巴氏吸管将其吸出，置于1mL细胞培养维持液中，反复冻融三次。

3)将反复冻融后的病毒液以不同的稀释倍数感染24孔细胞培养板上的鸭胚成纤维细胞，37℃作用2h后，吸去病毒液，覆盖营养琼脂，待琼脂凝固后翻转细胞培养板，37℃ 5％ CO₂培养箱中继续培养至出现较大荧光斑，再进行荧光挑斑，然后置于1mL细胞培养维持液中，反复冻融三次。

4)重复步骤3)至所有的空斑均出现荧光(图5)。

实施例3.重组鸭瘟病毒DPV-ΔgE-EGFP的鉴定

3.1病毒核酸提取

按照1.2的方法抽提重组病毒DPV-ΔgE-EGFP的核酸。

3.2鉴定引物设计

在转移载体的左和右臂分别设计用于鉴定的上游和下游引物，以跨EGFP基因进行扩增。

用于鉴定的上游引物：5’-CTGTATTATGCGCGGAGGTT-3’

用于鉴定的下游引物：5’-ACTTCTCTGCGTCGGTCATT-3’

3.3常规PCR鉴定

使用常规PCR分别检测鸭瘟病毒重组株DPV-ΔgE-EGFP和CHv亲本株，琼脂糖凝胶电泳分析扩增条带，结果显示二者相差约900bp(图6)，与预期目标一致。

3.4测序鉴定

将鉴定引物对扩增鸭瘟病毒DPV-ΔgE-EGFP重组株PCR扩增获得的片段送宝生物工程(大连)有限公司进行测序，测序结果显示：gE基因主要功能区1109bp片段由CMV立即早期启动子、EGFP基因、转录终止信号SV40polyA以及一个多克隆位点基因替换，EGFP表达盒按照预期完全正确地取代了DPV gE基因主要功能区片段。

实施例4.重组鸭瘟病毒DPV-ΔgE-EGFP特性之一：病毒感染原代鸭胚成纤维细胞后的致细胞病变观

参照实施例1中1.1的方法进行原代鸭胚成纤维细胞的制备及鸭瘟病毒DPV-ΔgE-EGFP重组株和DPV CHv亲本株的接种，待细胞出现病变后分别置显微镜和荧光显微镜下观察二者对原代鸭胚成纤维细胞的致细胞病变情况。结果(图7)显示：二者均能使鸭胚成纤维细胞皱缩、变圆并脱落形成空斑，但重组株较亲本株的空斑变小；荧光显微镜下，可以观察到重组病毒产生荧光，而亲本株则没有。这种表达荧光的重组病毒为鸭瘟病毒的生物学特性研究提供了一种新型材料和新的观察手段。

实施例5.重组鸭瘟病毒DPV-ΔgC-EGFP特性之二：病毒滴度(TCID50)的测定

分别收获出现90％以上病变的DPV-ΔgE-EGFP和DPV CHv，反复冻融三次后，-20℃保存备用。参照1.1的方法制备原代鸭胚成纤维细胞悬液，按50μL/孔加入96孔板；将DPV-ΔgE-EGFP和DPV CHv分别用细胞营养液进行10倍倍比稀释，按50μL/孔加入96孔板，每个稀释度加10个孔；置37℃含5％ CO₂培养箱，5-7天后观察并记录出现细胞病变的孔数；Reed-Muench法计算接种病毒液的滴度(TCID50/mL)。结果显示：DPV-ΔgE-EGFP和DPV CHv的滴度Log值分别为8.0和7.1，重组株的病毒滴度比亲本病毒降低了约9.5倍。

实施例6.重组鸭瘟病毒DPV-ΔgE-EGFP特性之三：重组病毒对鸭的致病性实验

将重组病毒分别以10⁶PFU、10⁵PFU、10⁴PFU接种4周龄雏鸭，每组10只，并以DPV-CHv亲本株(10⁴PFU/mL)、PBS(1mL)和DPV弱毒疫苗(1mL/羽份)作为对照，每天监测体温和临床症状，共监测2周。从临床症状来看，除DPV CHv亲本株组100％死亡外，其余各组间未见显著差异。各组检测体温数据经SAS统计分析表明：注射重组病毒各剂量组平均体温显著高于PBS对照组(P＜0.05)，10⁶PFU、10⁵PFU组略高于10⁴PFU，但差异不显著；而注射弱毒疫苗组平均体温极显著高于PBS对照组(P＜0.01)，并极显著高于重组病毒组。此结果说明接种重组病毒后会使雏鸭体温升高，但对鸭的致病性大大降低；与弱毒疫苗相比，重组病毒具有相对更高的安全性。

实施例7.重组鸭瘟病毒DPV-ΔgE-EGFP特性之四：重组病毒免疫鸭对鸭瘟强毒的免疫保护效果

实施例6中的各组雏鸭监测2周后，用10⁴MLD(最小致死量)DPV CHv强毒攻击。攻毒后继续监测体温和进行临床症状观察，对死亡鸭剖检观察各组织病变情况，2周后，对未死亡鸭剖检以观察各组织病变情况。从临床症状来看，重组病毒各剂量组及弱毒组有个别鸭出现一过性少食或不食情况，大群总体正常，未见死亡；PBS对照组攻毒后第6天出现死亡，至第10天全部死亡。从体温监测情况来看，第4-9天，PBS对照组和弱毒疫苗组体温出现显著升高，弱毒组体温升高3-5天后，降至正常值，而PBS对照组体温升高1-2天即死亡；重组病毒各剂量组在攻毒后第4-10天体温会有1-2天的升高，10⁶PFU组相对其它两组体温变化更小；弱毒疫苗组平均体温显著高于重组病毒各剂量组，10⁶PFU组又略低于其它两组平均体温。从剖检变化来看，PBS对照组呈现鸭瘟病毒的典型变化，弱毒疫苗组和重组病毒各剂量组显著减轻了由于强毒攻击造成的各组织病变。该实验结果表明重组病毒和弱毒疫苗均能提供较好的保护，并且重组病毒表现出更优的免疫效果，可以进一步发展成为有效预防鸭瘟病的新型疫苗。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (4)

1.一种鸭瘟病毒gE基因转移载体pUC-ΔgE-EGFP，包含转移载体pUC-ΔgE-EGFP的大肠杆菌种(Escherichia coli)JM109于2012年2月24日保藏于位于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M2012033；分类命名为大肠杆菌JM109/pUC-ΔgE-EGFP(Escherichia coli JM109/pUC-ΔgE-EGFP)。

2.权利要求1所述的转移载体pUC-ΔgE-EGFP的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)以鸭瘟病毒CHv株为材料，利用PCR扩增部分gE基因及其左侧翼(L)1073bp片段和部分gE基因及其右侧翼(R)1130bp片段，克隆进载体pMD18-T，构建质粒pMD-L和pMD-R；

2)先将pMD-L用Hind III和BamH I酶切，回收1073bp片段，克隆进已用相应限制性内切酶酶切的pUC18载体，然后再将pMD-R中的部分gE基因及其右侧翼(R)1130bp片段以BamH I和EcoR I插入到已含有部分gE基因及其左侧翼(L)的pUC-L载体中，获得载体pUC-ΔgE；

3)用ApaL I和Mlu I酶切质粒pEGFP-C1，回收包含CMV立即早期启动子、EGFP基因、转录终止信号SV40polyA以及一个多克隆位点基因共2016bp片段的EGFP表达盒，然后对其进行补平；

4)先将载体pUC-ΔgE，用BamH I酶切后，进行补平，再将其与3)中获得补平后的EGFP表达盒连接，从而获得转移载体pUC-ΔgE-EGFP；

上述扩增PCR扩增部分gE基因及其左侧翼(L)1073bp片段的上、下游引物分别是：

上游引物：5′-AAGCTTCCTGAAAGATGTTCTAAG-3′

下游引物：5′-GGATCCTTGATGATAGTCTGCTATAC-3′

上述扩增PCR扩增部分gE基因及其右侧翼(R)1130bp片段的上、下游引物分别是：

上游引物：5′-GGATCCGTTTGTAGTCGGTCTCGG-3′

下游引物：5′-GAATTCCGTATTAACCTTTTGTAGCT-3′。

3.鸭瘟病毒gE缺失重组株DPV-ΔgE-EGFP，于2012年2月23日保藏于位于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：V201210。

4.权利要求3所述鸭瘟病毒gE缺失重组株DPV-ΔgE-EGFP的制备方法，其特征在于，由以下步骤完成：

1)鸭瘟病毒CHv株感染鸭胚成纤维细胞；

2)转移载体pUC-ΔgE-EGFP质粒转染；

3)收获出现荧光斑的细胞；

4)结合无限稀释法，通过空斑纯化获得重组鸭瘟病毒。

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