CN109750005A - 一种猪伪狂犬病重组病毒株及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于猪伪狂犬病病毒技术领域，具体公开一种猪伪狂犬病重组病毒株及其构建方法。所述重组病毒株为rPRV‑gE‑/TK‑/GP5+/M+、rPRV‑gE‑/TK‑/GP5+/M+/IL‑18+、rPRV‑gE‑/TK‑/GP5m+、rPRV‑gE‑/TK‑/GP5m+/IL‑18+或rPRV‑gE‑/TK‑/IL‑18+，其中GP5m是指修饰型GP5。本发明重组病毒株对小白鼠安全有效，可诱导机体产生有效的抗PRV、PRRSV特异性中和抗体、抗PRRSV特异性ELISA抗体。
Description
技术领域
本发明属于猪伪狂犬病病毒技术领域，具体涉及一种猪伪狂犬病重组病毒株及其构建方法。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndromevirus,PRRSV）引起的怀孕母猪在妊娠后期出现流产、早产或死产的繁殖障碍和新生仔猪的呼吸系统症状。自1987在美国发现以来，PRRSV已有快30年的历史。在中国自从1996年郭宝清首次分离到PRRSV以来，已有20年历史，世界上已陆续有不少国家出现了PRRSV，每年都给养殖业造成巨大的经济损失。感染PRRSV猪体液免疫产生的抗体主要是针对PRRSV结构蛋白的抗体，如：N蛋白、M蛋白和GP5蛋白。研究表明，猪接种PRRSV后7天就可检出N蛋白的特异性抗体，9～35天后可检出针对M蛋白的抗体。目前证明N蛋白抗体对病毒没有中和作用。PRRSV的主要中和性表位存在于GP5蛋白上，感染后7天即可检出GP5抗体，但针对GP5的非中和性抗体的出现早于其中和性抗体。这主要是由于位于GP5蛋白中和表位B之前非中和表位A对中和表位产生覆盖效应，导致中和表位B不能充分暴露，从而不能有效诱发较高的中和抗体。目前已有研究证实通过在ORF5基因的96位和97位核苷酸之间引入PADRE表位的修饰型ORF5m基因可以诱导机体产生更为高的中和抗体水平，这主要是去除了非中和表位A对中和表位B的覆盖性效应。
2012年初以来，许多使用猪伪狂犬病（PR）基因缺失活疫苗免疫的规模化猪场均出现了PR的流行，说明传统毒株的PR基因缺失疫苗已不能有效地预防PR的发生，因此，针对目前主要流行毒株的PR新型基因工程疫苗的研究显得尤为重要。目前在生产养殖上常使用PR常规疫苗来预防本病发生，但常规疫苗在免疫时常出现毒力返强、散毒、免疫效率较低、过敏反应、用量较大等弊端。近年来，随着分子生物学技术的发展，关于PRV的分子生物学研究取得了很大进展，若将外源基因插入到PRV基因组中构建出重组病毒，不仅保持了原病毒良好的抗原性，且其毒力不返强，易与野毒区别而且利用PRV作为载体同目的基因一起在动物体内表达，既安全又可达到一针多防的效果，对多种动物疫病的防控具有重大意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种猪伪狂犬病重组病毒株及其构建方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
一种猪伪狂犬病重组病毒株，所述重组病毒株为rPRV-gE-/TK-/GP5+/M+、rPRV-gE-/TK-/GP5+/M+/IL-18+、rPRV-gE-/TK-/GP5m+、rPRV-gE-/TK-/GP5m+/IL-18+或rPRV-gE-/TK-/IL-18+，其中GP5m是指修饰型GP5。
所述的猪伪狂犬病重组病毒株的构建方法：
（1）、设计PCR扩增GP5、G-GP5m、D-GP5m、G-2A-M、D-2A-M、2A-IL-18、IL-18、表达框的引物，分别为：
G-GP5m F：如SEQ ID No.1所示；G-GP5m R：如SEQ ID No.2所示；
D-GP5m F：如SEQ ID No.3所示；D-GP5m R：如SEQ ID No.4所示；
G-2A-M F：如SEQ ID No.5所示；G-2A-M R：如SEQ ID No.6所示；
D-2A-M F：如SEQ ID No.7所示；D-2A-M R：如SEQ ID No.8所示；
2A-IL-18 F：如SEQ ID No.9所示；2A-IL-18 R：如SEQ ID No.10所示；
GP5 F：如SEQ ID No.11所示；GP5 R：如SEQ ID No.12所示；
IL-18 F：如SEQ ID No.13所示；IL-18 R：如SEQ ID No.14所示；
CMV F：如SEQ ID No.15所示；Poly R：如SEQ ID No.16所示；
其中：G-GP5m F和G-GP5m R用于构建重组质粒pZJ-GP5m-2A-IL-18的GP5m序列扩增；D-GP5m F和D-GP5m R用于构建重组质粒pZJ-GP5m的GP5m序列扩增；G-2A-M F和G-2A-M R用于构建重组质粒pZJ-GP5-2A-M-2A-IL-18的2A-M序列扩增；D-2A-M F和D-2A-M R用于构建重组质粒pZJ-GP5-2A-M的2A-M序列扩增；2A-IL-18 F和2A-IL-18 R用于构建重组质粒pZJ-GP5-2A-M-2A-IL-18和pZJ-GP5m-2A-IL-18的2A-IL-18序列扩增；GP5 F和GP5 R用于构建重组质粒pZJ-GP5-2A-M-2A-IL-18和pZJ-GP5-2A-M的GP5序列扩增；IL-18 F和IL-18 R用于构建重组质粒pZJ-IL-18的IL-18序列扩增；CMV F、PolyA R用于扩增含有CMV、外源性基因、PolyA的完整表达框；其中，G-GP5m不含GP5m基因的终止密码子，D-GP5m含GP5m基因的终止密码子，G-2A-M含有2A肽序列但不含M基因的终止密码子，D-2A-M含有2A肽序列和M基因的终止密码子，2A-IL-18含有2A肽序列和IL-18基因的终止密码子，GP5不含GP5基因的终止密码子，IL-18含IL-18基因的终止密码子；
（2）、外源性基因GP5、G-GP5m、D-GP5m、G-2A-M、D-2A-M、2A-IL-18、IL-18的RT-PCR扩增
从PRRSV ATCC-VR2332中提取RNA，采用引物Random进行RT反应；以RT反应的产物cDNA为模板，应用PCR技术通过高保真聚合酶GXL扩增外源性基因，扩增完成后，琼脂糖凝胶电泳并回收外源性基因片段，备用；
（3）、重组质粒pZJ-GP5-2A-M、pZJ-GP5-2A-M-2A-IL-18、pZJ-GP5m、pZJ-GP5m-2A-IL-18、pZJ-IL-18的构建
（3.1）pZJ-GP5-2A-M-2A-IL-18的构建：
（3.1.1）EcoR I和Xba I双酶切GP5，Xba I和Sph I双酶切G-2A-M，EcoR I和Sph I双酶pMD18-T载体，回收酶切后的GP5、2A-M和pMD18-T，T4DNA连接酶作用下进行连接反应，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pMD-GP5-2A-M；
（3.1.2）EcoR I和Sph I双酶切pMD-GP5-2A-M，Sph I和BamH I双酶切2A-IL-18，EcoR I和BamH I双酶切pZJ-1载体，回收酶切后的GP5-2A-M、2A-IL-18和pZJ-1，T4DNA连接酶作用下进行连接反应，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pZJ-GP5-2A-M-2A-IL-18；
（3.2）pZJ-GP5-2A-M的构建：
（3.2.1）EcoR I和Xba I双酶切GP5，Xba I和BamH I双酶切D-2A-M，EcoR I和Sph I双酶切pMD18-T载体，回收酶切后的GP5、2A-M和pMD18-T，T4DNA连接酶作用下进行连接反应，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pMD-GP5-2A-M；
（3.2.2）EcoR I和BamH I双酶切pMD-GP5-2A-M，EcoR I和BamH I双酶切pZJ-1载体，回收酶切后的GP5-2A-M和pZJ-1，T4DNA连接酶作用下进行连接反应，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pZJ-GP5-2A-M；
（3.3）pZJ-GP5m-2A-IL-18的构建：
（3.3.1）EcoR I和Sph I双酶切G-GP5m，Sph I和BamH I双酶切2A-IL-18，EcoR I和SphI双酶切pMD18-T载体，回收酶切后的GP5m、2A-IL-18和pMD18-T，T4DNA连接酶作用下进行连接反应，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pMD-GP5m-2A-IL-18；
（3.3.2）EcoR I和BamH I双酶切pMD-GP5m-2A-IL-18，EcoR I和BamH I双酶切pZJ-1载体，回收酶切后的GP5m-2A-IL-18和pZJ-1，T4DNA连接酶作用下进行连接反应，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pZJ-GP5m-2A-IL-18；
（3.4）pZJ-GP5m的构建：
（3.4.1）EcoR I和BamH I双酶切D-GP5m，EcoR I和Sph I双酶切pMD18-T载体，回收酶切后的GP5m和pMD18-T，T4DNA连接酶作用下进行连接反应，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pMD-GP5m；
（3.4.2）EcoR I和BamH I双酶切pMD-GP5m，EcoR I和BamH I双酶切pZJ-1载体，回收酶切后的GP5m和pZJ-1载体，T4DNA连接酶作用下进行连接反应，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pZJ-GP5m；
（3.5）pZJ-IL-18的构建：
（3.5.1）EcoR I和BamH I双酶切IL-18，EcoR I和Sph I双酶切pMD18-T载体，回收酶切后的IL-18和pMD18-T，T4DNA连接酶作用下进行连接反应，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pMD-IL-18；
（3.5.2）EcoR I和BamH I双酶切pMD-IL-18，EcoR I和BamH I双酶切pZJ-1载体，回收酶切后的IL-18和pZJ-1，T4DNA连接酶作用下进行连接反应，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pZJ-IL-18。
（4）、穿梭载体pTK-GP5m、pTK-GP5m-IL-18、pTK-GP5-M、pTK-GP5-M-IL-18、pTK-IL-18的构建
分别以重组质粒pZJ-GP5m、pZJ-GP5m-2A-IL-18、pZJ-GP5-2A-M、pZJ-GP5-2A-M-2A-IL-18或pZJ-IL-18的DNA为模板，以CMV F、PolyA R为上下游引物，应用PCR技术通过高保真聚合酶GXL扩增表达框，扩增完成后，回收PCR扩增片段；Spe I分别酶切PCR扩增片段与pTK载体，回收酶切后的基因片段和pTK，T4DNA连接酶作用下进行连接反应，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒依次命名为pTK-GP5m、pTK-GP5m-IL-18、pTK-GP5-M、pTK-GP5-M-IL-18、pTK-IL-18；
（5）、在穿梭载体上下游同源臂上重新设计引物：上游引物如SEQ ID No.17所示，下游引物如SEQ ID No.18所示；然后分别以已构建好的穿梭载体pTK-GP5m、pTK-GP5m-IL-18、pTK-GP5-M、pTK-GP5-M-IL-18或pTK-IL-18为模板，PCR扩增同源重组的基因片段，回收基因片段，分别获得TK-GP5m、TK-GP5m-IL-18、TK-GP5-M、TK-GP5-M-IL-18、TK-IL-18；
（6）、PRV缺失株rPRV-gE-/TK-/EGFP+基因组的提取
蛋白酶K法提取PRV缺失株rPRV-gE-/TK-/EGFP+的基因组DNA，溶于无菌TE，测定浓度后，保存备用；
（7）、重组病毒株的构建
将rPRV-gE-/TK-/EGFP+基因组分别与基因片段TK-GP5m、TK-GP5m-IL-18、TK-GP5-M、TK-GP5-M-IL-18、TK-IL-18共转染至293T细胞，蚀斑纯化，依次获得rPRV-gE-/TK-/GP5m+、rPRV-gE-/TK-/GP5m+/IL-18+ 、rPRV-gE-/TK-/GP5+/M+、rPRV-gE-/TK-/GP5+/M+/IL-18+、rPRV-gE-/TK-/IL-18+。
较好地，步骤（3）中，所述pZJ-1载体的序列如SEQ ID No.31所示。
较好地，步骤（4）中，所述pTK载体为申请人自行构建的质粒pTK；步骤（6）中，所述PRV缺失株rPRV-gE-/TK-/EGFP+为申请人自行构建的重组荧光病毒HN-QYY-gE-/TK-/EGFP+；质粒pTK和重组荧光病毒HN-QYY-gE-/TK-/EGFP+的构建步骤如下：
S1、缺失gE基因：
S1.1、将猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY（保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期：2017年12月22日，保藏编号：CGMCC No.15192，分类命名：猪伪狂犬病病毒）接种至长满单层的vero细胞，当细胞出现80%以上病变的时候，收获病毒液，反复冻融，离心，取上清，酚氯仿方法提取变异株HN-QYY病毒基因组DNA，保存备用；
S1.2、以变异株HN-QYY病毒基因组DNA为模板，利用引物gEL-f/gEL-r和gER-f/gER-r分别PCR扩增gE基因上下游同源臂gEL和gER，琼脂糖凝胶电泳鉴定后纯化PCR产物，测定DNA含量，保存备用；
其中，引物序列分别为：
gEL-f：如SEQ ID No.19所示；gEL-r：如SEQ ID No.20所示；
gER-f：如SEQ ID No.21所示；gER-r：如SEQ ID No.22所示；
S1.3、EcoR I和Spe I双酶切gEL，Spe I和Hind III双酶切gER，EcoR I和Hind III双酶切pMD18-T载体，回收酶切后的gEL、gER、pMD18-T；
S1.4、将回收后的gEL和gER连接到回收后的pMD18-T上，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pgE；
S1.5、Spe I单酶切质粒pgE，纯化后去磷酸化，再次纯化；
S1.6、Nhe I和Spe I双酶切pEGFP-N1载体，回收酶切后的pEGFP-N1；将回收后的pEGFP-N1连接到去磷酸化后的pgE上，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pgE-EGFP；
S1.7、构建重组荧光病毒HN-QYY-gE-/EGFP+
将步骤S1.1所得变异株HN-QYY病毒基因组DNA、pgE-EGFP共转染至293T细胞，空斑纯化，直至所有细胞病变均出现绿色荧光，获得重组荧光病毒HN-QYY-gE-/EGFP+；
S1.8、去除绿色荧光基因
将HN-QYY-gE-/EGFP+和pcGlobin2-Cre质粒共转染至293T细胞，空斑纯化，直至所有细胞病变均不带荧光，获得猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY-gE-（保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期：2018年01月02日，保藏编号：CGMCC No.15200，分类命名：猪伪狂犬病病毒gE基因缺失HN-QYY株）；
S2、缺失TK基因：
S2.1、将步骤S1.8所得变异株HN-QYY-gE-接种至长满单层的vero细胞，当细胞出现80%以上病变的时候，收获病毒液，反复冻融，离心，取上清，酚氯仿方法提取变异株HN-QYY-gE-病毒基因组DNA，保存备用；
S2.2、以变异株HN-QYY-gE-病毒基因组DNA为模板，利用引物TKL-f/TKL-r和TKR-f/TKR-r分别PCR扩增TK基因上下游同源臂TKL和TKR，琼脂糖凝胶电泳鉴定后纯化PCR产物，测定DNA含量，保存备用；
其中，引物序列分别为：
TKL-f：如SEQ ID No.23所示；TKL-r：如SEQ ID No.24所示；
TKR-f：如SEQ ID No.25所示；TKR-r：如SEQ ID No.26所示；
S2.3、EcoR I和Spe I双酶切TKL，Spe I和Hind III双酶切TKR，EcoR I和Hind III双酶切pMD18-T载体，回收酶切后的TKL、TKR、pMD18-T；
S2.4、将回收后的TKL和TKR连接到回收后的pMD18-T上，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pTK；
S2.5、Spe I单酶切质粒pTK，纯化后去磷酸化，再次纯化；
S2.6、Nhe I和Spe I双酶切pEGFP-N1载体，回收酶切后的pEGFP-N1；将回收后的pEGFP-N1连接到去磷酸化后的pTK上，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pTK-EGFP；
S2.7、构建重组荧光病毒HN-QYY-gE-/TK-/EGFP+
将步骤S2.1所得变异株HN-QYY-gE-病毒基因组DNA、pTK-EGFP共转染至293T细胞，空斑纯化，直至所有细胞病变均出现绿色荧光，获得重组荧光病毒HN-QYY-gE-/TK-/EGFP+。
本发明的有益效果：本发明重组病毒株对小白鼠安全有效，可诱导机体产生有效的抗PRV、PRRSV特异性中和抗体、抗PRRSV特异性ELISA抗体。
附图说明
图1：猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY的gE基因PCR鉴定，M：2000 DNA marker；1：HN-QYY gE基因的PCR扩增；2：vero细胞对照；
图2：pgE和pgE-EGFP质粒的PCR鉴定，M：15000bp DNA marker；1：pgE的PCR扩增；2：pgE-EGFP的PCR扩增；
图3：猪伪狂犬病病毒gE缺失株HN-QYY-gE-的PCR鉴定，M：250bp DNA marker，1：gE-f/gE-r对HN-QYY-gE- gE基因的PCR扩增，2：gEL-f/gER-r对HN-QYY-gE-的PCR扩增；3：gEL-f/gER-r对HN-QYY-gE-/EGFP+的PCR扩增；
图4：pTK质粒和HN-QYY-gE-/TK-/EGFP+重组病毒的PCR鉴定，M：15000bp DNA marker；1：pTK的PCR扩增；2：HN-QYY-gE-/TK-/EGFP+的PCR扩增；
图5：HN-QYY-gE-/TK-重组病毒的PCR鉴定，M：250bp DNA marker；1：TK-f/TK-r对HN-QYY-gE- TK基因的PCR扩增；2：TK-f/TK-r对HN-QYY-gE-/TK- TK基因的PCR扩增；
图6：RT-PCR扩增外源性基因的电泳图，M：DNA分子量标准，1-7依次为：GP5、G-GP5m、D-GP5m、IL-18、2A-IL-18、G-2A-M和D-2A-M；
图7：重组质粒的酶切鉴定，7a-7e依次为：pZJ-GP5-2A-M-2A-IL-18、pZJ-GP5-2A-M、pZJ-GP5m-2A-IL-18、pZJ-GP5m、pZJ-IL-18，2a-2e中，M：DNA分子量标准，1：EcoR I、BamH I双酶切，2：EcoR I单酶切对照；
图8：穿梭载体的酶切鉴定，M：DNA分子量标准，1、3、5、7、9依次为：SpeI单酶切pTK-GP5-M、pTK-GP5m-IL-18、pTK-GP5m、pTK-GP5-M-IL-18、pTK-IL-18；2、4、6、8、10依次为：未酶切pTK-GP5-M、pTK-GP5m-IL-18、pTK-GP5m、pTK-GP5-M-IL-18、pTK-IL-18对照；
图9：GP5蛋白的Western-blot检测，M：预染的蛋白质分子质量标准，1：rPRV-gE-/TK-/GP5+/M+蛋白表达，2：rPRV-gE-/TK-/GP5+/M+/IL-18+蛋白表达，3：rPRV-gE-/TK-/GP5m+蛋白表达，4：rPRV-gE-/TK-/GP5m+/IL-18+蛋白表达，5：rPRV-gE-/TK-/IL-18+蛋白表达，6：PRRSV对照，7：rPRV-TK-/gE-对照；
图10：M蛋白的Western-blot检测，M：预染的蛋白质分子质量标准，1：rPRV-gE-/TK-/GP5+/M+蛋白表达，2：rPRV-gE-/TK-/GP5+/M+/IL-18+蛋白表达，3：rPRV-gE-/TK-/GP5m+蛋白表达，4：rPRV-gE-/TK-/GP5m+/IL-18+蛋白表达，5：rPRV-gE-/TK-/IL-18+蛋白表达，6：PRRSV对照，7：rPRV-TK-/gE-对照；
图11：IL-18的Western-blot检测，M：预染的蛋白质分子质量标准，1：rPRV-gE-/TK-/GP5+/M+蛋白表达，2：rPRV-gE-/TK-/GP5+/M+/IL-18+蛋白表达，3：rPRV-gE-/TK-/GP5m+蛋白表达，4：rPRV-gE-/TK-/GP5m+/IL-18+蛋白表达，5：rPRV-gE-/TK-/IL-18+蛋白表达，6：rPRV-TK-/gE-对照；
图12：抗PRRSV特异性IgG抗体动态；
图13：抗PRRSV特异性IgA抗体动态。
具体实施方式
实施例1--猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY的分离鉴定
申请人在2012年从河南省洛阳市某猪场采集发病猪的脑组织，剪碎，按质量/体积比g/mL 1∶5加入灭菌PBS溶解，用组织匀浆机打碎，-70℃、室温反复冻融3次，8000rpm离心10min；取上清，用0.22μm一次性滤器过滤除菌，将所得的组织液按体积比1∶5接种到长满单层的vero细胞上，待病变达到80%时收获病毒液，-70℃、室温反复冻融3次，将病毒液8000rpm离心10min，取上清，重新接种长满单层的vero细胞，盲传5代（从出现病变的代次起），当病变稳定后，收获病毒，空斑纯化，即得猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY并-70℃保存。
用酚氯仿法抽提猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY病毒基因组DNA，具体步骤为：
（1）、将空斑纯化后的病毒液-70℃、室温反复冻融3次；
（2）、取病毒液上清350μL加到1.5mL离心管，在管中加350 μL RIPA裂解液和10μL蛋白酶K于56℃水浴2 h；
（3）、加入700μL的Tris饱和酚，混匀3min，然后4℃离心机中12000rpm离心10min；
（4）、吸取上层液体加入新的离心管，再加入700μL 的Tris饱和酚、氯仿和异戊醇的混合液（Tris饱和酚∶氯仿∶异戊醇=25∶24∶1，体积比），混匀3min， 4℃离心机中12000rpm离心10min；
（5）、吸取上清液加到新的离心管，加入等体积的氯仿和异戊醇的混合液（氯仿∶异戊醇=24∶1，体积比），混匀3min，4℃离心机中12000rpm离心10min；
（6）、吸取上清液加入新的离心管，加入等体积的氯仿，混匀3min，4℃离心机中12000rpm离心10min；
（7）、吸取上清液400μL加入新的离心管，然后加入2.5体积倍的经过-20℃冷冻的无水乙醇，-20℃沉淀2h；
（8）、将样品取出，4℃离心机中12000rpm离心20min，弃上清，留白色沉淀，加1000μL经过-20℃冷冻的75v%乙醇，上下颠倒混匀，4℃离心机中12000rpm离心10min；
（9）、将酒精弃去，静止3min，待酒精挥发完毕，加入30μL的TE溶液，4℃溶解30min，即可得到DNA，-20℃保存备用。
猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY的鉴定采用gE基因PCR方法，引物如表1所示。gE基因PCR反应体系为：2xGC Buffer 25μL，dNTP(10 mmol/μL)1μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.5μL，上下游引物（5 OD）各1μL，DNA模板（100 μg/mL）4μL，灭菌双蒸水补足至50 μL；反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，60℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环；最后72℃10min；PCR产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果见图1，表明所分离的毒株为猪伪狂犬病病毒变异株。
实施例2--猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY-gE-/TK-/EGFP+以及HN-QYY-gE-/TK-的构建方法
构建步骤如下：
S1、缺失gE基因：
S1.1、T25细胞瓶中vero细胞长满单层后，弃去营养液，用无菌PBS洗涤2次，接种30 μL保藏编号为CGMCC No.15192的变异株HN-QYY，37℃ CO2培养箱中孵育1h，弃去病毒液，加入6mL的维持液（含2%胎牛血清的DMEM），继续37℃ CO2培养箱中培养，当细胞出现80%以上病变的时候，收获病毒液，-70℃、室温反复冻融3次，8000rpm离心10min，取上清，酚氯仿方法提取变异株HN-QYY病毒基因组DNA，-20℃保存备用；
S1.2、以变异株HN-QYY病毒基因组DNA为模板，利用引物gEL-f/gEL-r和gER-f/gER-r分别PCR扩增gE基因上下游同源臂gEL和gER，琼脂糖凝胶电泳鉴定后纯化PCR产物，测定DNA含量，-20℃保存备用；
其中，引物序列如表2所示：
PCR扩增反应体系为：2xGC Buffer 25 μL，dNTP（10 mmol/μL）1 μL，Taq DNA聚合酶（5U/μL）0.5 μL，上下游引物（5 OD）各1 μL，DNA模板（100 μg/mL）4 μL，补水至50 μL；PCR反应条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，60℃退火30s，72℃延伸80s，30个循环；最后72℃延伸10 min；
S1.3、EcoR I和Spe I双酶切gEL，Spe I和Hind III双酶切gER，EcoR I和Hind III双酶切pMD18-T载体，回收酶切后的gEL、gER、pMD18-T，-20℃保存备用；；
其中，酶切体系分别为：EcoR I（15 U/μL） 1.5 μL，Spe I（15 U/μL） 1.5 μL，片段gEL3 μg，10×buffer 5 μL，补水至50 μL；Spe I（15 U/μL） 1.5μL，Hind III（15 U/μL） 1.5μL，片段gER 3 μg，10×buffer 5μL，补水至50 μL；EcoR I（15 U/μL） 1 μL，Hind III（15 U/μL） 1 μL，pMD18-T载体 2 μg，10×buffer 5 μL，补水至50 μL；酶切条件均为：37℃水浴锅中孵育4 h；
S1.4、将回收后的gEL和gER连接到回收后的pMD18-T上，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pgE，-20℃保存备用；
其中，连接体系为：T4 DNA连接酶（350 U/μL）1 μL，10×T4 Ligase buffer 1 μL，基因片段与载体片段（以摩尔比计，gEL∶gER∶pMD18-T=5∶5∶1），补水至10 μL；连接条件为：16℃连接16h；
质粒转化的具体步骤为：取出大肠杆菌感受态细胞DH5α 100μL，置于冰水混合物中，将10μL连接产物全部加入感受态细胞中，轻轻震荡混匀，静置30 min；之后将感受态细胞置于42℃，热激90s，再置于冰水混合物中静置5 min，加入1mL不含抗性的LB培养基，37℃、200rpm摇床培养1h，然后离心，留200μL上清液，混合均匀，取100μL上清的菌液均匀涂在含有氨苄青霉素（Amp+）抗性的固体LB平板（氨苄青霉素含量100 μg/mL，下同）上，37℃恒温培养16 h，挑取菌落至1mL含有Amp+抗性的LB培养基中，37℃、200rpm摇床培养12h，制备成菌液，进行菌液PCR；
菌液PCR扩增体系：2xGC Buffer 25μL，dNTP（10 mmol/μL）1μL， Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.5μL，引物gEL-f和gER-r（5 OD）各1μL，菌液4μL，补水至50 μL；PCR反应条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，60℃退火30s，72℃延伸150 s，30个循环；最后72 ℃延伸10min；之后用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定（见图2），挑取电泳条带位置在2600 bp的菌液为阳性菌液；
扩大培养步骤为：将阳性菌液按体积比1∶100接至15 mL LB培养基中，37 ℃摇床200r/min 摇菌14 h；
S1.5、Spe I单酶切质粒pgE，纯化后去磷酸化，再用PCR产物试剂盒进行纯化，-20℃保存备用；
其中，酶切体系为：Spe I（15 U/μL）2 μL，质粒pgE 4 μg，10×buffer 5μL，补水至50 μL；酶切条件为：37℃水浴锅中孵育3h；
去磷酸化体系为：去磷酸化酶（1 U/μL） 2 μL，酶切后的质粒pgE 2 μg，10×buffer 5μL，补水至50 μL；去磷酸化条件为：37℃水浴锅中孵育3h；
S1.6、Nhe I和Spe I双酶切pEGFP-N1载体（购自湖南丰晖生物科技有限公司），回收酶切后的EGFP-N1片段；将回收后的EGFP-N1片段连接到去磷酸化后的pgE上，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pgE-EGFP；
其中，酶切体系为：Nhe I（15 U/μL）1 μL，Spe I（15 U/μL）1 μL，pEGFP-N1 2 μg，10×buffer 5 μL，补水至50 μL；酶切条件为：37℃水浴锅中孵育3h；
连接体系为：T4 DNA连接酶（350 U/μL）1 μL，10×T4 Ligase buffer 1 μL，基因片段与载体片段（以摩尔比计，EGFP-N1∶pgE=5∶1），补水至10 μL；连接条件为：16℃连接16h；
质粒转化、菌液PCR和扩大培养的步骤同步骤S1.4，只是菌液PCR在用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定（见图2）后，挑取电泳条带位置在4500bp左右的菌液为阳性菌液；
S1.7、构建重组荧光病毒HN-QYY-gE-/EGFP+
采用脂质体LipofectamineTM2000将HN-QYY病毒基因组、pgE-EGFP按照1μg∶3μg的比例进行转染：首先将六孔板中生长至80%的293T细胞弃去营养液，每孔添加1mL的无血清DMEM，37℃ CO2培养箱中孵育1h；取两只离心管，每只加300μL无血清无双抗DMEM，然后第一管加步骤S1.1所得变异株HN-QYY病毒基因组DNA 1μg，脂质体3μL，第二管加质粒pgE-EGFP 3μg，脂质体9μL，第一管和第二管全部震荡混匀，静置5min，之后将两管合并为一管，吹打混匀，静止30min，加入到293T细胞中，37℃ CO2培养箱中孵育6 h，弃去培养液，换成含2%胎牛血清的DMEM，37℃ CO2培养箱中继续培养，36h后收获，-70℃、室温反复冻融后，接种长满单层的vero细胞，待细胞出现80%的病变时收毒；
空斑纯化：取病毒液，离心，取上清将上清液按10倍比稀释接种于生长至单层的vero细胞六孔板，每孔1000 μL，吸附1h后弃去病毒液，加入2%琼脂糖与2×DMEM（含2%胎牛血清）以体积比1∶1组成的混合物2 mL，待出现细胞病变时，在荧光显微镜下挑取最高稀释度中带荧光的空斑，并再次按照10倍倍比稀释接种于生长至单层的vero细胞六孔板，待细胞出现绿色荧光病变时，选择稀释度最大的孔挑取带绿色荧光的空斑继续接种vero细胞，如此纯化至所有空斑均出现绿色荧光的病变，利用引物gEL-f/gER-r对其进行PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳鉴定（扩增体系及条件同步骤S1.4菌液PCR扩增体系及条件，见图3），将此代病毒保存，命名为HN-QYY-gE-/EGFP+；
在vero细胞上扩增病毒，具体步骤为：当T25细胞瓶中vero细胞生长至单层，弃去旧的培养液，用无血清的DMEM 2mL将20μL的病毒液稀释，加入到细胞瓶中，37℃ CO2培养箱中孵育1h，换成含2%胎牛血清的DMEM，37℃ CO2培养箱中继续培养，细胞病变80%时后收获，-70℃、室温反复冻融，取适量病毒液，酚氯仿抽提DNA，测定含量，-20℃保存备用；
S1.8、去除绿色荧光基因
将HN-QYY-gE-/EGFP+和pcGlobin2-Cre质粒按照1μg∶3μg的比例按照步骤S1.7的方法转染至80%的293T细胞，36h后收获，-70℃、室温反复冻融3次后，接种长满单层的vero细胞，待细胞出现80%的病变时收获病毒液；按照步骤S1.7的方法空斑纯化病毒，直至所有的细胞病变均不带荧光，利用引物gEL-f/gER-r对其进行PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳鉴定（扩增体系及条件同步骤S1.4菌液PCR扩增体系及条件，见图3），将此代病毒保存，命名为猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY-gE-；
用酚氯仿法抽提猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY-gE-病毒基因组DNA，利用引物gE-f和gE-r对其gE基因进行PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳鉴定（扩增体系及条件同实施例1中HN-QYY的gE基因PCR扩增体系及条件，见图3），结果表明：HN-QYY-gE-成功缺失了gE基因；
S2、缺失TK基因：
S2.1、T25细胞瓶中vero细胞长满单层后，弃去营养液，用无菌PBS洗涤2次，接种30 μL步骤S1.8所得变异株HN-QYY-gE-，37℃ CO2培养箱中孵育1h，弃去病毒液，加入6mL的维持液（含2%胎牛血清的DMEM），继续37℃ CO2培养箱中培养，当细胞出现80%以上病变的时候，收获病毒液，-70℃、室温反复冻融3次，8000rpm离心10min，取上清，酚氯仿方法提取变异株HN-QYY-gE-病毒基因组DNA，-20℃保存备用；
S2.2、以变异株HN-QYY-gE-病毒基因组DNA为模板，利用引物TKL-f/TKL-r和TKR-f/TKR-r分别PCR扩增TK基因上下游同源臂TKL和TKR，琼脂糖凝胶电泳鉴定后纯化PCR产物，测定DNA含量，保存备用；
其中，引物序列如表3所示：
PCR扩增反应体系及条件同步骤S1.2；
S2.3、EcoR I和Spe I双酶切TKL，Spe I和Hind III双酶切TKR，EcoR I和Hind III双酶切pMD18-T载体，回收酶切后的TKL、TKR、pMD18-T，-20℃保存备用；；
其中，酶切体系及条件同步骤S1.3；
S2.4、将回收后的TKL和TKR连接到回收后的pMD18-T上，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pTK，-20℃保存备用；
其中，连接体系及条件、质粒转化步骤、菌液PCR扩增体系及条件、扩大培养步骤同步骤S1.4，只是菌液PCR时的引物为TKL-f 和TKR-r，琼脂糖凝胶电泳鉴定结果见图4；
S2.5、Spe I单酶切质粒pTK，纯化后去磷酸化，再用PCR产物试剂盒进行纯化，-20℃保存备用；
其中，酶切体系及条件、去磷酸化体系及条件同步骤S1.5；
S2.6、Nhe I和Spe I双酶切pEGFP-N1载体（购自湖南丰晖生物科技有限公司），回收酶切后的EGFP-N1片段；将回收后的EGFP-N1片段连接到去磷酸化后的pTK上，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pTK-EGFP；
其中，连接体系及条件、质粒转化步骤、菌液PCR扩增体系及条件、扩大培养步骤同步骤S1.4；
S2.7、构建重组荧光病毒HN-QYY-gE-/TK-/EGFP+
采用脂质体LipofectamineTM2000进行转染：首先将六孔板中生长至80%的293T细胞弃去营养液，每孔添加1mL的无血清DMEM，37℃ CO2培养箱中孵育1h；取两只离心管，每只加300μL无血清无双抗DMEM，然后第一管加步骤S2.1所得变异株HN-QYY-gE-病毒基因组DNA 1μg，脂质体3μL，第二管加质粒pTK-EGFP 3μg，脂质体9μL，第一管和第二管全部震荡混匀，静置5min，之后将两管合并为一管，吹打混匀，静止30min，加入到293T细胞中，37℃ CO2培养箱中孵育6 h，弃去培养液，换成含2%胎牛血清的DMEM，37℃ CO2培养箱中继续培养，36h后收获，-70℃、室温反复冻融后，接种长满单层的vero细胞，待细胞出现80%的病变时收毒；
空斑纯化：取病毒液，离心，取上清将上清液按10倍比稀释接种于生长至单层的vero细胞六孔板，每孔1000 μL，吸附1h后弃去病毒液，加入2%琼脂糖与2×DMEM（含2%胎牛血清）以体积比1∶1的混合物2 mL，待出现细胞病变时，在荧光显微镜下挑取最高稀释度中带荧光的空斑，并再次按照10倍倍比稀释接种于生长至单层的vero细胞六孔板，待细胞出现绿色荧光病变时，选择稀释度最大的孔挑取带绿色荧光的空斑继续接种vero细胞，如此纯化至所有空斑均出现绿色荧光的病变，利用引物TKL-f/TKR-r对其进行PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳鉴定（扩增体系及条件同步骤S1.4菌液PCR扩增体系及条件，见图4），将此代病毒保存，命名为HN-QYY-gE-/TK-/EGFP+；
在vero细胞上扩增病毒，具体步骤为：当T25细胞瓶中vero细胞生长至单层，弃去旧的培养液，用无血清的DMEM 2mL将20μL的病毒液稀释，加入到细胞瓶中，37℃ CO2培养箱中孵育1h，换成含2%胎牛血清的DMEM，37℃ CO2培养箱中继续培养，细胞病变80%时后收获，-70℃、室温反复冻融，取适量病毒液，酚氯仿抽提DNA，测定含量，-20℃保存备用；
S2.8、去除绿色荧光基因
将HN-QYY-gE-/TK-/EGFP+和pcGlobin2-Cre质粒按照1μg∶3μg的比例按照步骤S2.7的方法转染至80%的293T细胞，36h后收获，-70℃、室温反复冻融3次后，接种长满单层的vero细胞，待细胞出现80%的病变时收获病毒液；按照步骤S2.7的方法空斑纯化病毒，直至所有的细胞病变均不带荧光，利用引物TKL-f/TKR-r对其进行PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳鉴定（扩增体系及条件同步骤S1.4菌液PCR扩增体系及条件），将此代病毒保存，命名为猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY-gE-/TK-；
用酚氯仿法抽提猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY-gE-/TK-病毒基因组DNA。利用引物TK-f（如SEQ ID No.29）和TK-r（如SEQ ID No.30）分别对HN-QYY-gE-和HN-QYY-gE-/TK-中的TK基因进行PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳鉴定（扩增体系及条件同实施例1中HN-QYY的gE基因PCR扩增体系及条件，见图5），结果表明：HN-QYY-gE-/TK-成功缺失了TK基因。
实施例3--猪伪狂犬病重组病毒株rPRV-gE-/TK-/GP5+/M+、rPRV-gE-/TK-/GP5+/M+/IL-18+、rPRV-gE-/TK-/GP5m+、rPRV-gE-/TK-/GP5m+/IL-18+ 、rPRV-gE-/TK-/IL-18+的构建方法
（1）、设计PCR扩增GP5、G-GP5m、D-GP5m、G-2A-M、D-2A-M、2A-IL-18、IL-18、表达框的引物，引物信息如表4：
表4中：G-GP5m F和G-GP5m R用于构建重组质粒pZJ-GP5m-2A-IL-18的GP5m序列扩增；D-GP5m F和D-GP5m R用于构建重组质粒pZJ-GP5m的GP5m序列扩增；G-2A-M F和G-2A-M R用于构建重组质粒pZJ-GP5-2A-M-2A-IL-18的2A-M序列扩增；D-2A-M F和D-2A-M R用于构建重组质粒pZJ-GP5-2A-M的2A-M序列扩增；2A-IL-18 F和2A-IL-18 R用于构建重组质粒pZJ-GP5-2A-M-2A-IL-18和pZJ-GP5m-2A-IL-18的2A-IL-18序列扩增；GP5 F和GP5 R用于构建重组质粒pZJ-GP5-2A-M-2A-IL-18和pZJ-GP5-2A-M的GP5序列扩增；IL-18 F和IL-18 R用于构建重组质粒pZJ-IL-18的IL-18序列扩增；CMV F、PolyA R用于扩增含有CMV、外源性基因、PolyA的完整表达框；其中，G-GP5m不含GP5m基因的终止密码子，D-GP5m含GP5m基因的终止密码子，G-2A-M含有2A肽序列但不含M基因的终止密码子，D-2A-M含有2A肽序列和M基因的终止密码子，2A-IL-18含有2A肽序列和IL-18基因的终止密码子，GP5不含GP5基因的终止密码子，IL-18含IL-18基因的终止密码子；
（2）、外源性基因GP5、G-GP5m、D-GP5m、G-2A-M、D-2A-M、2A-IL-18、IL-18的RT-PCR扩增
从PRRSV ATCC-VR2332（德国勃林格殷格翰药业有限公司）中提取RNA，采用引物Random(10μmol/L)（上海生工生物工程股份有限公司）进行RT反应；以RT反应的产物cDNA为模板，应用PCR技术通过高保真聚合酶GXL扩增外源性基因，扩增完成后，琼脂糖凝胶电泳（见图6）并回收外源性基因片段，备用；
其中，RNA提取步骤：将1头份PRRSV ATCC-VR2332加入1 mL PBS稀释；取稀释液300 μL加入750 μL TRIZOL轻摇后静置5 min；加入200 μL氯仿剧烈振荡15s，室温静置5-10 min，然后4 ℃ 10000 r/min离心10-20 min；取上清500 μL加入同体积异丙醇，摇匀，4℃静置20-30 min，4 ℃ 10000 r/min离心15 min；弃上清加入75%乙醇1000 μL，轻摇后4 ℃ 8000 r/min离心5 min；弃上清瞬时离心1-2 min并干燥5 min，然后加入30-60 μL千分之一DEPC处理的水中于4 ℃溶解RNA 20min，-70 ℃保存备用；
RT反应体系（20μL）：RNA模板13 μL，5×M-MLV Buffer 4 μL，RRI(40 U/μL) 0.5 μL，M-MLV(200 U/μL) 0.5 μL，引物Random (10 μmol/L)1 μL，dNTP(10 mM) 1 μL；RT反应条件为：42 ℃ 60 min；95 ℃ 5 min；
（3）、重组质粒pZJ-GP5-2A-M、pZJ-GP5-2A-M-2A-IL-18、pZJ-GP5m、pZJ-GP5m-2A-IL-18、pZJ-IL-18的构建
（3.1）pZJ-GP5-2A-M-2A-IL-18的构建：
（3.1.1）EcoR I和Xba I双酶切GP5，Xba I和Sph I双酶切G-2A-M，EcoR I和Sph I双酶pMD18-T载体，回收酶切后的GP5、2A-M和pMD18-T，T4DNA连接酶作用下进行连接反应，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pMD-GP5-2A-M；
（3.1.2）EcoR I和Sph I双酶切pMD-GP5-2A-M，Sph I和BamH I双酶切2A-IL-18，EcoR I和BamH I双酶切pZJ-1载体（pZJ-1载体由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，pZJ-1载体序列如SEQ ID No.31所示），回收酶切后的GP5-2A-M、2A-IL-18和pZJ-1，T4DNA连接酶作用下进行连接反应，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，EcoR I和BamH I 酶切鉴定和测序，如图7a所示，鉴定正确的质粒命名为pZJ-GP5-2A-M-2A-IL-18，
（3.2）pZJ-GP5-2A-M的构建：
（3.2.1）EcoR I和Xba I双酶切GP5，Xba I和BamH I双酶切D-2A-M，EcoR I和Sph I双酶切pMD18-T载体，回收酶切后的GP5、2A-M和pMD18-T，T4DNA连接酶作用下进行连接反应，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pMD-GP5-2A-M；
（3.2.2）EcoR I和BamH I双酶切pMD-GP5-2A-M，EcoR I和BamH I双酶切pZJ-1载体，回收酶切后的GP5-2A-M和pZJ-1，T4DNA连接酶作用下进行连接反应，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，EcoR I和BamH I 酶切鉴定和测序，如图7b所示，鉴定正确的质粒命名为pZJ-GP5-2A-M；
（3.3）pZJ-GP5m-2A-IL-18的构建：
（3.3.1）EcoR I和Sph I双酶切G-GP5m，Sph I和BamH I双酶切2A-IL-18，EcoR I和SphI双酶切pMD18-T载体，回收酶切后的GP5m、2A-IL-18和pMD18-T，T4DNA连接酶作用下进行连接反应，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pMD-GP5m-2A-IL-18；
（3.3.2）EcoR I和BamH I双酶切pMD-GP5m-2A-IL-18，EcoR I和BamH I双酶切pZJ-1载体，回收酶切后的GP5m-2A-IL-18和pZJ-1，T4DNA连接酶作用下进行连接反应，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，EcoR I和BamH I 酶切鉴定和测序，如图7c所示，鉴定正确的质粒命名为pZJ-GP5m-2A-IL-18；
（3.4）pZJ-GP5m的构建：
（3.4.1）EcoR I和BamH I双酶切D-GP5m，EcoR I和Sph I双酶切pMD18-T载体，回收酶切后的GP5m和pMD18-T，T4DNA连接酶作用下进行连接反应，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pMD-GP5m；
（3.4.2）EcoR I和BamH I双酶切pMD-GP5m，EcoR I和BamH I双酶切pZJ-1载体，回收酶切后的GP5m和pZJ-1载体（序列如SEQ ID No.31所示，由上海生工生物工程有限公司合成），T4DNA连接酶作用下进行连接反应，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，EcoR I和BamH I 酶切鉴定和测序，如图7d所示，鉴定正确的质粒命名为pZJ-GP5m；
（3.5）pZJ-IL-18的构建：
（3.5.1）EcoR I和BamH I双酶切IL-18，EcoR I和Sph I双酶切pMD18-T载体，回收酶切后的IL-18和pMD18-T，T4DNA连接酶作用下进行连接反应，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pMD-IL-18；
（3.5.2）EcoR I和BamH I双酶切pMD-IL-18，EcoR I和BamH I双酶切pZJ-1载体，回收酶切后的IL-18和pZJ-1，T4DNA连接酶作用下进行连接反应，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，EcoR I和BamH I 酶切鉴定和测序，如图7e所示，鉴定正确的质粒命名为pZJ-IL-18；
（4）、穿梭载体pTK-GP5m、pTK-GP5m-IL-18、pTK-GP5-M、pTK-GP5-M-IL-18、pTK-IL-18的构建
（4.1）pTK-GP5m的构建：
以重组质粒pZJ-GP5m的DNA为模板，以CMV F、PolyA R为上下游引物，应用PCR技术通过高保真聚合酶GXL扩增表达框，扩增完成后，回收PCR扩增片段；Spe I分别酶切PCR扩增片段与pTK载体（为实施例2构建的质粒pTK，下同），回收酶切后的GP5m和pTK，T4DNA连接酶作用下进行连接反应，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，SpeI酶切鉴定和测序，如图8所示，该质粒命名为pTK-GP5m；
（4.2）pTK-GP5m-IL-18的构建：
以重组质粒pZJ-GP5m-2A-IL-18的DNA为模板，以CMV F、PolyA R为上下游引物，应用PCR技术通过高保真聚合酶GXL扩增表达框，扩增完成后，回收PCR扩增片段；Spe I分别酶切PCR扩增片段与pTK载体，回收酶切后的GP5m-2A-IL-18和pTK，T4DNA连接酶作用下进行连接反应，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，SpeI酶切鉴定和测序，如图8所示，该质粒命名为pTK-GP5m-IL-18；
（4.3）pTK-GP5-M的构建：
以重组质粒pZJ-GP5-2A-M的DNA为模板，以CMV F、PolyA R为上下游引物，应用PCR技术通过高保真聚合酶GXL扩增表达框，扩增完成后，回收PCR扩增片段；Spe I分别酶切PCR扩增片段与pTK载体，回收酶切后的GP5-2A-M和pTK，T4DNA连接酶作用下进行连接反应，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，SpeI酶切鉴定和测序，如图8所示，该质粒命名为pTK-GP5-M；
（4.4）pTK-GP5-M-IL-18的构建：
以重组质粒pZJ-GP5-2A-M-2A-IL-18的DNA为模板，以CMV F、PolyA R为上下游引物，应用PCR技术通过高保真聚合酶GXL扩增表达框，扩增完成后，回收PCR扩增片段；Spe I分别酶切PCR扩增片段与pTK载体，回收酶切后的GP5-2A-M-2A-IL-18和pTK载体，T4DNA连接酶作用下进行连接反应，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，SpeI酶切鉴定和测序，如图8所示，该质粒命名为pTK-GP5-M-IL-18；
（4.5）pTK-IL-18的构建：
以重组质粒pZJ-IL-18的DNA为模板，以CMV F、PolyA R为上下游引物，应用PCR技术通过高保真聚合酶GXL扩增表达框，扩增完成后，回收PCR扩增片段；Spe I分别酶切PCR扩增片段与pTK载体，回收酶切后的IL-18和pTK载体，T4DNA连接酶作用下进行连接反应，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，SpeI酶切鉴定和测序，如图8所示，该质粒命名为pTK-IL-18；
（5）、在穿梭载体上下游同源臂上重新设计引物：上游引物如SEQ ID No.17所示，下游引物如SEQ ID No.18所示；然后分别以已构建好的穿梭载体pTK-GP5m、pTK-GP5m-IL-18、pTK-GP5-M、pTK-GP5-M-IL-18、pTK-IL-18为模板，PCR扩增同源重组的基因片段，回收基因片段，分别获得TK-GP5m、TK-GP5m-IL-18、TK-GP5-M、TK-GP5-M-IL-18、TK-IL-18；
（6）、PRV缺失株HN-QYY-gE-/TK-/EGFP+基因组的提取
蛋白酶K法提取实施例2获得的PRV缺失株HN-QYY-gE-/TK-/EGFP+的基因组DNA，溶于无菌TE，测定浓度后，保存备用；
（7）、重组病毒株的构建
采用脂质体LipofectamineTM2000进行转染，具体步骤为：将HN-QYY-gE-/TK-/EGFP+基因组、基因片段TK-GP5m、TK-GP5m-IL-18、TK-GP5-M、TK-GP5-M-IL-18、TK-IL-18分别与脂质体按1 μg∶3 μL混匀；然后再将脂质体包覆后的基因组分别和五种脂质体包覆后的基因片段按照基因组与基因片段=2 μg∶4 μg的比例共转染至生长至80%的293T细胞，36h后收获，反复冻融三次后，接种长满单层的vero细胞，待细胞出现80%左右的病变时收毒；取病毒液，将病毒液按10倍比稀释接种于生长至单层的vero细胞六孔板，每孔50 μL，吸附1 h后弃去病毒液，加入1%的低熔点琼脂糖，待出现细胞病变时，在荧光显微镜下挑取不带荧光的空斑，并接种于生长至单层的vero细胞六孔板，待细胞出现不带荧光病变时且细胞病变80%以上收获病毒，酚氯仿法抽提病毒基因组，溶于无菌TE，测定浓度后-20℃保存备用；引物PCR扩增目的基因片段，把疑似阳性的重组病毒基因片段送公司测序，测序正确的重组病毒继续蚀斑纯化，直至如此纯化至所有空斑均出现不带绿色荧光的病变，依次获得rPRV-gE-/TK-/GP5m+、rPRV-gE-/TK-/GP5m+/IL-18+ 、rPRV-gE-/TK-/GP5+/M+、rPRV-gE-/TK-/GP5+/M+/IL-18+、或rPRV-gE-/TK-/IL-18+；
其中，步骤（3.1）-步骤（3.5）以及步骤（4.1）-步骤（4.5）中，所涉及的酶切体系及条件、连接体系及条件、质粒转化步骤、菌液PCR体系及条件、扩大培养步骤均相同，具体分别为：
酶切体系为：10×Buffer 5 μL，限制性核酸内切酶各（15 U/μL）2 μL，外源性基因或载体或质粒 1.5 μg，加水至50 μL；酶切条件为：37 ℃作用4 h，加入Loading Buffer终止反应；
连接体系：10×T4 Ligase Buffer 1μL，T4 Ligase（350U/μL）1μL，基因片段与载体片段以摩尔比为3∶1的比例添加（如果是一个以上的基因片段，则这两个每个基因片段各自与载体片段的比例均是3∶1），加水至10 μL；连接条件条件为：16 ℃过夜；
质粒转化步骤为：连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经氨苄青霉素抗性LB平板（氨苄青霉素含量100 μg/mL，下同）进行初步筛选，挑取单个克隆加入含有氨苄青霉素抗性的LB培养基37 ℃摇床200 r/min 摇菌6 h，进行菌液PCR；
菌液PCR扩增体系：菌液3 μL，2×Master mix 25 μL，上下游引物（如果目的质粒中仅有一个外源性基因，那么此处的上下游引物即是指该外源性基因的上下游引物；如果目的质粒中存在一个以上的外源性基因，那么此处的上下游引物分别为目的质粒中首个外源性基因的上游引物和最后一个外源性基因的下游引物，比如针对步骤（3.1.1）中的质粒pMD-GP5-2A-M，上游引物为GP5的上游引物GP5 F，下游引物为G-2A-M的下游引物G-2A-M R；针对步骤（3.1.2）中的质粒pZJ-GP5-2A-M-2A-IL-18，上游引物为GP5的上游引物GP5 F；下游引物为2A-IL-18的下游引物2A-IL-18 R）各1 μL，加至50 μL，PCR条件为：95 ℃ 5 min；95 ℃30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，30个循环；72 ℃10 min；
扩大培养步骤为：将与阳性克隆相对的菌液按体积比1∶100接至15 mL LB培养基中，37℃摇床200 r/min 摇菌14 h；
步骤（2）、步骤（5）、步骤（7）所涉及的PCR扩增体系及条件以及步骤（4）在PCR扩增表达框时所涉及的PCR扩增体系及条件均相同，具体为：
PCR扩增体系：10 ng 模板cDNA，高保真聚合酶GXL（25U/μL）0.5 μL，上下游引物(10μmol/L)各1 μL，加水至50 μL；PCR条件：98 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，68 ℃ 1 min，30个循环；68℃10min。
实施例4--Wetern-bloting检测重组病毒株外源性基因的表达
（1）Vero细胞铺板（六孔板），待细胞长成单层以后，弃去孔内DMEM，每孔分别加入2 mL2%犊牛血清的DMEM维持液+50 μL重组病毒（rPRV-gE-/TK-/GP5m+、rPRV-gE-/TK-/GP5m+/IL-18+ 、rPRV-gE-/TK-/GP5+/M+、rPRV-gE-/TK-/GP5+/M+/IL-18+或rPRV-gE-/TK-/IL-18+），37℃5% CO2温箱培养；并设置rPRV-TK-/gE-（为实施例2中申请人自行构建的HN-QYY-gE-/TK-）接毒Vero细胞阴性对照和PRRSV接毒Mark-145细胞阳性对照；
（2）待细胞病变完全时，用孔内的培养基将贴壁细胞轻轻吹下，3000 r离心5 min，弃去上清，得到的细胞沉淀每只离心管加入100 μL RIPA中度裂解液（加有1 mM的蛋白酶抑制剂），冰上裂解20 min左右，每5分钟涡旋一次，测定蛋白浓度，保存于-70℃；
（3）每个样品细胞蛋白取25 μg，加入5×loading buffer 后煮沸，10000 r/min离心1min后进行SDS-PAGE蛋白胶分离；
（4）电转：剪1张与聚丙烯酰胺分离胶一般大小的硝酸纤维素膜(NC膜)，并提前将滤纸、NC膜及待转的凝胶块浸泡于电转液中；将已经浸泡好的滤纸平铺于负极电极板，再将聚丙烯酰胺分离胶铺在下层滤纸上，用玻璃棒将气泡全部赶出，紧接着再将NC膜铺在聚丙烯酰胺分离胶上，对齐边缘并赶出气泡，最后在NC膜上再铺一层浸泡好的滤纸，用玻璃板赶出NC膜与滤纸之间的气泡并把各层都对齐，压上另一侧电极，连接电源，200 mAh稳流电转40min；
（5）封闭：电转结束后，将NC膜在TBST缓冲液中漂洗3次，放在含5%脱脂奶封闭液（5 g/100mL，用TBST配，下同）中封闭，室温下置于摇床中，60 r/min振摇3 h后，4℃过夜；
（6）一抗孵育：用TBST洗NC膜3次，每次5 min，然后加入体积比1∶400稀释（用5%脱脂奶封闭液稀释）的抗GP5/GP5m、M、IL-18蛋白多抗，室温下置于摇床中60 r/min振摇2 h；
（7）二抗孵育：用TBST洗膜3次，每次5min，加入体积比1∶5000稀释（用5%脱脂奶封闭液稀释）的HRP-羊抗兔二抗，室温下置于摇床中，60 r/min振摇孵育1 h；
（8）显色：TBST洗膜3次，每次5min，用干净的滤纸将膜表面多余的水分吸干净，于暗室中将化学发光显色液低于膜上进行显影，盖上底片曝光10s，将曝光好的底片分别置于显影液和定影液中浸泡30s，最后将底片置于双蒸水中终止反应，观察结果。
GP5蛋白、M蛋白、IL-18的Western-blot检测结果分别见图9-11，实验结果表明：所构建的五种重组病毒所插入的PRRSV 外源免疫原性基因均获得表达，GP5/GP5m蛋白在22KDa处出现一条特异性抗原-抗体结合带；M蛋白在19KDa处出现一条特异性抗原-抗体结合带；IL-18在17KDa处出现一条特异性抗原-抗体结合带，与猪IL-18基因大小相符。说明表达的蛋白可以被PRRSV阳性血清及抗猪IL-18基因的抗体识别，具有良好的反应原性。
实施例5--重组病毒对小白鼠免疫原性研究
1. 试验方法
将45只6周龄左右的雌性小白鼠随机分成9组，每组5只。具体分组情况是：1-5组免疫重组病毒试验组；第6组为免疫rPRV-TK-/gE-照组；第7、8组分别免疫PRRS、PR商品疫苗；第9组免疫DMEM，如表5。免疫途径均采用滴鼻+皮下注射混合免疫（滴鼻和皮下注射剂量相同），并在4周后加强免疫一次。在首次免疫当天及随后每隔1周小鼠尾静脉采血一次，检测血清中特异性ELISA抗体水平；每2周中和试验检测血清中抗PRRSV和PRV特异性中和抗体水平，以此评价重组病毒对小白鼠的体液免疫和黏膜免疫。
重组病毒免疫小白鼠后血清中和抗体效价测定：每2周从5只免疫的小白鼠中随机抽取3只进行尾静脉采血分离血清进行PRRSV和PRV中和抗体试验。PRRSV和PRV中和抗体试验的检测抗原分别是200TCID50/0.1ml PRRSV和200TCID50/0.1ml PRV。具体操作如下：将血清灭活(56℃ 30min)，96孔细胞培养板中每孔加入40 μL DMEM，再取40 μL血清加入96孔板中，DMEM倍比稀释血清为1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512，取已稀释至200TCID50的PRRSV或PRV加入96孔细胞培养板中，置于37℃温箱中孵育1h；每孔取50μL分别加入到已铺好Marc-145或Vero 96孔细胞培养板中，1h后，加入200μL含2%胎牛血清的DMEM维持液，同时设置正常细胞对照（即只在已铺好Marc-145或Vero 96孔细胞培养板中，加入200μL含2%胎牛血清的DMEM维持液），放于37℃、5%CO2的培养箱中培养；每天记录观察细胞病变（CPE）孔数，按Reed-Muench氏法计算被检血清中的中和抗体效价，中和抗体效价=50%细胞不产生细胞病变（CPE）的血清稀释度。
间接ELISA法检测抗PRRSV IgG和IgA抗体水平：每周从5只免疫的小白鼠中随机抽取3只进行尾静脉采血分离血清，间接ELISA试验检测免疫重组病毒试验组及对照组中抗PRRSV特异性ELISA IgG、IgA抗体平均值水平变化趋势。具体操作如下：
（1）从铝箔袋中取出96孔板，每孔包被0.5 μg的PRRSV病毒蛋白37 ℃温箱中孵育1 h，4℃过夜；
（2）PSST洗板3次，每次间隔3 min；每孔加入10 mL 5%脱脂奶封闭液封闭1 h；
（3）一抗为分离的小白鼠血清按体积比1∶500稀释（用PH7.2-7.8 的Tris-HCL稀释），100 μL/孔加入96孔板中37℃温箱孵育2 h；
（4）PBST洗板3次每次间隔3 min；每孔加入体积比1∶5000稀释（用PH7.2-7.8 的Tris-HCL稀释）的辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗原羊抗兔IgG或IgA二抗100μL，37 ℃温箱孵育1 h；
（5）PBST洗板3次，每次间隔3 min；每孔加入底物TMB 100µL 37 ℃温箱避光显色15min；
（6）每孔加入50 μL终止液（2 mol/L H2SO4）终止反应，450 nm处测定各孔OD值。
2．实验结果
中和试验检测血清中抗PRRSV特异性中和抗体水平结果如表6。可知：二次免疫28d，PRRSV ATCC-VR2332商品疫苗与rPRV-gE-/TK-/GP5+/M+、rPRV-gE-/TK-/GP5+/M+/IL-18+、rPRV-gE-/TK-/GP5m+/IL-18+组抗PRRSV中和抗体水平较高，达到3log2；rPRV-gE-/TK-/GP5m+、rPRV-gE-/TK-/IL-18+组未检测到抗PRRSV中和抗体。该试验结果表明，PRRSV的两种膜相关蛋白可以有效刺激机体产生抗PRRSV的中和抗体，猪IL-18基因可以有效增强机体的特异性体液免疫作用。
中和试验检测血清中抗PRV中和抗体水平结果如表7。可知：rPRV-gE-/TK-/GP5+/M+、 rPRV-gE-/TK-/GP5+/M+/IL-18+、rPRV-gE-/TK-/GP5m+/IL-18+、rPRV-gE-/TK-/GP5m+、rPRV-gE-/TK-/IL-18+、rPRV-TK-/gE-免疫组产生抗PRV特异性中和抗体水平比免疫PRV HB-98商品疫苗中和抗体水平高，中和抗体水平最高达到6log2。该试验结果表明：本发明构建的重组病毒可以产生较高的抗PRV流行毒株的中和抗体，且IL-18可以有效增强PRV特异性中和抗体的产生。
ELISA试验检测血清中抗PRRSV特异性IgG抗体水平见图12，试验结果表明：试验组rPRV-gE-/TK-/GP5+/M+、rPRV-gE-/TK-/GP5+/M+/IL-18+、rPRV-gE-/TK-/GP5m+/IL-18+、rPRV-gE-/TK-/GP5m+抗PRRSV IgG抗体平均值水平在第二次免疫后一周达到高峰并持续2-3周且ELISA抗体水平无太大差异；试验组rPRV-gE-/TK-/IL-18+和免疫PRV HB-98试验组未检测到抗PRRSV ELISA抗体；免疫PRRSV ATCC-VR2332疫苗的特异性ELISA抗体产生较慢。
ELISA试验检测血清中抗PRRSV 特异性IgA见图13，试验结果表明：试验组rPRV-gE-/TK-/GP5+/M+、rPRV-gE-/TK-/GP5+/M+/IL-18+、rPRV-gE-/TK-/GP5m+/IL-18+、rPRV-gE-/TK-/GP5m+可以诱导机体抗PRRSV IgA抗体的产生，免疫PRRSV ATCC-VR2332疫苗诱导机体产生IgA水平低。较IgG抗体相比，血清中IgG抗体水平更高。
试验结果表明：rPRV-gE-/TK-/GP5+/M+、rPRV-gE-/TK-/GP5+/M+/IL-18+、rPRV-gE-/TK-/GP5m+/IL-18+、rPRV-gE-/TK-/GP5m+有效诱导特异性ELISA IgG和IgA抗体的产生；与IL-18共表达试验组则能增强机体特异性ELISA抗体的产生。
序列表
<110> 河南农业大学
<120> 一种猪伪狂犬病重组病毒株及其构建方法
<160> 31
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cggaattcat gttggagaaa tgcttgaccg c 31
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acatgcatgc aggacgaccc cattgttc 28
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
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<211> 29
<212> DNA
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<210> 24
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
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tatataagca gagctggttt agtgaaccgt cagatccgaa ttcgagctcg gtacccgggg 1020
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cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc attctattct 1200
ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata gcaggcatgc 1260
tggggatgcg gtgggctcta tggctactag tgagcttggc gtaatcatgg tcatagctgt 1320
ttcctgtgtg aaattgttat ccgctcacaa ttccacacaa catacgagcc ggaagcataa 1380
agtgtaaagc ctggggtgcc taatgagtga gctaactcac attaattgcg ttgcgctcac 1440
tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg 1500
cggggagagg cggtttgcgt attgggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc 1560
gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat 1620
ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca 1680
ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc 1740
atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc 1800
aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg 1860
gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta 1920
ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg 1980
ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac 2040
acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag 2100
gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga agaacagtat 2160
ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat 2220
ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc 2280
gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt 2340
ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct 2400
agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt 2460
ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc 2520
gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg gagggcttac 2580
catctggccc cagtgctgca atgataccgc gagacccacg ctcaccggct ccagatttat 2640
cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca actttatccg 2700
cctccatcca gtctattaat tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg ccagttaata 2760
gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta 2820
tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt 2880
gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag 2940
tgttatcact catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa 3000
gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc 3060
gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac gggataatac cgcgccacat agcagaactt 3120
taaaagtgct catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc 3180
tgttgagatc cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta 3240
ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa 3300
taagggcgac acggaaatgt tgaatactca tactcttcct ttttcaatat tattgaagca 3360
tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac 3420
aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc tgacgtctaa gaaaccatta 3480
ttatcatgac attaacctat aaaaataggc gtatcacgag gccctttcgt c 3531
Claims (4)
1.一种猪伪狂犬病重组病毒株，其特征在于：所述重组病毒株为rPRV-gE-/TK-/GP5+/M+、rPRV-gE-/TK-/GP5+/M+/IL-18+、rPRV-gE-/TK-/GP5m+、rPRV-gE-/TK-/GP5m+/IL-18+ 或rPRV-gE-/TK-/IL-18+，其中GP5m是指修饰型GP5。
2.一种如权利要求1所述的猪伪狂犬病重组病毒株的构建方法，其特征在于：
（1）、设计PCR扩增GP5、G-GP5m、D-GP5m、G-2A-M、D-2A-M、2A-IL-18、IL-18、表达框的引物，分别为：
G-GP5m F：如SEQ ID No.1所示；G-GP5m R：如SEQ ID No.2所示；
D-GP5m F：如SEQ ID No.3所示；D-GP5m R：如SEQ ID No.4所示；
G-2A-M F：如SEQ ID No.5所示；G-2A-M R：如SEQ ID No.6所示；
D-2A-M F：如SEQ ID No.7所示；D-2A-M R：如SEQ ID No.8所示；
2A-IL-18 F：如SEQ ID No.9所示；2A-IL-18 R：如SEQ ID No.10所示；
GP5 F：如SEQ ID No.11所示；GP5 R：如SEQ ID No.12所示；
IL-18 F：如SEQ ID No.13所示；IL-18 R：如SEQ ID No.14所示；
CMV F：如SEQ ID No.15所示；Poly R：如SEQ ID No.16所示；
其中：G-GP5m F和G-GP5m R用于构建重组质粒pZJ-GP5m-2A-IL-18的GP5m序列扩增；D-GP5m F和D-GP5m R用于构建重组质粒pZJ-GP5m的GP5m序列扩增；G-2A-M F和G-2A-M R用于构建重组质粒pZJ-GP5-2A-M-2A-IL-18的2A-M序列扩增；D-2A-M F和D-2A-M R用于构建重组质粒pZJ-GP5-2A-M的2A-M序列扩增；2A-IL-18 F和2A-IL-18 R用于构建重组质粒pZJ-GP5-2A-M-2A-IL-18和pZJ-GP5m-2A-IL-18的2A-IL-18序列扩增；GP5 F和GP5 R用于构建重组质粒pZJ-GP5-2A-M-2A-IL-18和pZJ-GP5-2A-M的GP5序列扩增；IL-18 F和IL-18 R用于构建重组质粒pZJ-IL-18的IL-18序列扩增；CMV F、PolyA R用于扩增含有CMV、外源性基因、PolyA的完整表达框；其中，G-GP5m不含GP5m基因的终止密码子，D-GP5m含GP5m基因的终止密码子，G-2A-M含有2A肽序列但不含M基因的终止密码子，D-2A-M含有2A肽序列和M基因的终止密码子，2A-IL-18含有2A肽序列和IL-18基因的终止密码子，GP5不含GP5基因的终止密码子，IL-18含IL-18基因的终止密码子；
（2）、外源性基因GP5、G-GP5m、D-GP5m、G-2A-M、D-2A-M、2A-IL-18、IL-18的RT-PCR扩增
从PRRSV ATCC-VR2332中提取RNA，采用引物Random进行RT反应；以RT反应的产物cDNA为模板，应用PCR技术通过高保真聚合酶GXL扩增外源性基因，扩增完成后，琼脂糖凝胶电泳并回收外源性基因片段，备用；
（3）、重组质粒pZJ-GP5-2A-M、pZJ-GP5-2A-M-2A-IL-18、pZJ-GP5m、pZJ-GP5m-2A-IL-18、pZJ-IL-18的构建
（3.1）pZJ-GP5-2A-M-2A-IL-18的构建：
（3.1.1）EcoR I和Xba I双酶切GP5，Xba I和Sph I双酶切G-2A-M，EcoR I和Sph I双酶pMD18-T载体，回收酶切后的GP5、2A-M和pMD18-T，T4DNA连接酶作用下进行连接反应，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pMD-GP5-2A-M；
（3.1.2）EcoR I和Sph I双酶切pMD-GP5-2A-M，Sph I和BamH I双酶切2A-IL-18，EcoR I和BamH I双酶切pZJ-1载体，回收酶切后的GP5-2A-M、2A-IL-18和pZJ-1，T4DNA连接酶作用下进行连接反应，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pZJ-GP5-2A-M-2A-IL-18；
（3.2）pZJ-GP5-2A-M的构建：
（3.2.1）EcoR I和Xba I双酶切GP5，Xba I和BamH I双酶切D-2A-M，EcoR I和Sph I双酶切pMD18-T载体，回收酶切后的GP5、2A-M和pMD18-T，T4DNA连接酶作用下进行连接反应，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pMD-GP5-2A-M；
（3.2.2）EcoR I和BamH I双酶切pMD-GP5-2A-M，EcoR I和BamH I双酶切pZJ-1载体，回收酶切后的GP5-2A-M和pZJ-1，T4DNA连接酶作用下进行连接反应，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pZJ-GP5-2A-M；
（3.3）pZJ-GP5m-2A-IL-18的构建：
（3.3.1）EcoR I和Sph I双酶切G-GP5m，Sph I和BamH I双酶切2A-IL-18，EcoR I和SphI双酶切pMD18-T载体，回收酶切后的GP5m、2A-IL-18和pMD18-T，T4DNA连接酶作用下进行连接反应，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pMD-GP5m-2A-IL-18；
（3.3.2）EcoR I和BamH I双酶切pMD-GP5m-2A-IL-18，EcoR I和BamH I双酶切pZJ-1载体，回收酶切后的GP5m-2A-IL-18和pZJ-1，T4DNA连接酶作用下进行连接反应，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pZJ-GP5m-2A-IL-18；
（3.4）pZJ-GP5m的构建：
（3.4.1）EcoR I和BamH I双酶切D-GP5m，EcoR I和Sph I双酶切pMD18-T载体，回收酶切后的GP5m和pMD18-T，T4DNA连接酶作用下进行连接反应，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pMD-GP5m；
（3.4.2）EcoR I和BamH I双酶切pMD-GP5m，EcoR I和BamH I双酶切pZJ-1载体，回收酶切后的GP5m和pZJ-1载体，T4DNA连接酶作用下进行连接反应，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pZJ-GP5m；
（3.5）pZJ-IL-18的构建：
（3.5.1）EcoR I和BamH I双酶切IL-18，EcoR I和Sph I双酶切pMD18-T载体，回收酶切后的IL-18和pMD18-T，T4DNA连接酶作用下进行连接反应，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pMD-IL-18；
（3.5.2）EcoR I和BamH I双酶切pMD-IL-18，EcoR I和BamH I双酶切pZJ-1载体，回收酶切后的IL-18和pZJ-1，T4DNA连接酶作用下进行连接反应，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pZJ-IL-18。
（4）、穿梭载体pTK-GP5m、pTK-GP5m-IL-18、pTK-GP5-M、pTK-GP5-M-IL-18、pTK-IL-18的构建
分别以重组质粒pZJ-GP5m、pZJ-GP5m-2A-IL-18、pZJ-GP5-2A-M、pZJ-GP5-2A-M-2A-IL-18或pZJ-IL-18的DNA为模板，以CMV F、PolyA R为上下游引物，应用PCR技术通过高保真聚合酶GXL扩增表达框，扩增完成后，回收PCR扩增片段；Spe I分别酶切PCR扩增片段与pTK载体，回收酶切后的基因片段和pTK，T4DNA连接酶作用下进行连接反应，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒依次命名为pTK-GP5m、pTK-GP5m-IL-18、pTK-GP5-M、pTK-GP5-M-IL-18、pTK-IL-18；
（5）、在穿梭载体上下游同源臂上重新设计引物：上游引物如SEQ ID No.17所示，下游引物如SEQ ID No.18所示；然后分别以已构建好的穿梭载体pTK-GP5m、pTK-GP5m-IL-18、pTK-GP5-M、pTK-GP5-M-IL-18或pTK-IL-18为模板，PCR扩增同源重组的基因片段，回收基因片段，分别获得TK-GP5m、TK-GP5m-IL-18、TK-GP5-M、TK-GP5-M-IL-18、TK-IL-18；
（6）、PRV缺失株rPRV-gE-/TK-/EGFP+基因组的提取
蛋白酶K法提取PRV缺失株rPRV-gE-/TK-/EGFP+的基因组DNA，溶于无菌TE，测定浓度后，保存备用；
（7）、重组病毒株的构建
将rPRV-gE-/TK-/EGFP+基因组分别与基因片段TK-GP5m、TK-GP5m-IL-18、TK-GP5-M、TK-GP5-M-IL-18、TK-IL-18共转染至293T细胞，蚀斑纯化，依次获得rPRV-gE-/TK-/GP5m+、rPRV-gE-/TK-/GP5m+/IL-18+ 、rPRV-gE-/TK-/GP5+/M+、rPRV-gE-/TK-/GP5+/M+/IL-18+、rPRV-gE-/TK-/IL-18+。
3.如权利要求2所述的猪伪狂犬病重组病毒株的构建方法，其特征在于：步骤（3）中，所述pZJ-1载体的序列如SEQ ID No.31所示。
4.如权利要求2所述的猪伪狂犬病重组病毒株的构建方法，其特征在于：步骤（4）中，所述pTK载体为申请人自行构建的质粒pTK；步骤（6）中，所述PRV缺失株rPRV-gE-/TK-/EGFP+为申请人自行构建的重组荧光病毒HN-QYY-gE-/TK-/EGFP+；质粒pTK和重组荧光病毒HN-QYY-gE-/TK-/EGFP+的构建步骤如下：
S1、缺失gE基因：
S1.1、将保藏编号为CGMCC No.15192的变异株HN-QYY接种至长满单层的vero细胞，当细胞出现80%以上病变的时候，收获病毒液，反复冻融，离心，取上清，酚氯仿方法提取变异株HN-QYY病毒基因组DNA，保存备用；
S1.2、以变异株HN-QYY病毒基因组DNA为模板，利用引物gEL-f/gEL-r和gER-f/gER-r分别PCR扩增gE基因上下游同源臂gEL和gER，琼脂糖凝胶电泳鉴定后纯化PCR产物，测定DNA含量，保存备用；
其中，引物序列分别为：
gEL-f：如SEQ ID No.19所示；gEL-r：如SEQ ID No.20所示；
gER-f：如SEQ ID No.21所示；gER-r：如SEQ ID No.22所示；
S1.3、EcoR I和Spe I双酶切gEL，Spe I和Hind III双酶切gER，EcoR I和Hind III双酶切pMD18-T载体，回收酶切后的gEL、gER、pMD18-T；
S1.4、将回收后的gEL和gER连接到回收后的pMD18-T上，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pgE；
S1.5、Spe I单酶切质粒pgE，纯化后去磷酸化，再次纯化；
S1.6、Nhe I和Spe I双酶切pEGFP-N1载体，回收酶切后的pEGFP-N1；将回收后的pEGFP-N1连接到去磷酸化后的pgE上，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pgE-EGFP；
S1.7、构建重组荧光病毒HN-QYY-gE-/EGFP+
将步骤S1.1所得变异株HN-QYY病毒基因组DNA、pgE-EGFP共转染至293T细胞，空斑纯化，直至所有细胞病变均出现绿色荧光，获得重组荧光病毒HN-QYY-gE-/EGFP+；
S1.8、去除绿色荧光基因
将HN-QYY-gE-/EGFP+和pcGlobin2-Cre质粒共转染至293T细胞，空斑纯化，直至所有细胞病变均不带荧光，获得猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY-gE-；
S2、缺失TK基因：
S2.1、将步骤S1.8所得变异株HN-QYY-gE-接种至长满单层的vero细胞，当细胞出现80%以上病变的时候，收获病毒液，反复冻融，离心，取上清，酚氯仿方法提取变异株HN-QYY-gE-病毒基因组DNA，保存备用；
S2.2、以变异株HN-QYY-gE-病毒基因组DNA为模板，利用引物TKL-f/TKL-r和TKR-f/TKR-r分别PCR扩增TK基因上下游同源臂TKL和TKR，琼脂糖凝胶电泳鉴定后纯化PCR产物，测定DNA含量，保存备用；
其中，引物序列分别为：
TKL-f：如SEQ ID No.23所示；TKL-r：如SEQ ID No.24所示；
TKR-f：如SEQ ID No.25所示；TKR-r：如SEQ ID No.26所示；
S2.3、EcoR I和Spe I双酶切TKL，Spe I和Hind III双酶切TKR，EcoR I和Hind III双酶切pMD18-T载体，回收酶切后的TKL、TKR、pMD18-T；
S2.4、将回收后的TKL和TKR连接到回收后的pMD18-T上，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pTK；
S2.5、Spe I单酶切质粒pTK，纯化后去磷酸化，再次纯化；
S2.6、Nhe I和Spe I双酶切pEGFP-N1载体，回收酶切后的pEGFP-N1；将回收后的pEGFP-N1连接到去磷酸化后的pTK上，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pTK-EGFP；
S2.7、构建重组荧光病毒HN-QYY-gE-/TK-/EGFP+
将步骤S2.1所得变异株HN-QYY-gE-病毒基因组DNA、pTK-EGFP共转染至293T细胞，空斑纯化，直至所有细胞病变均出现绿色荧光，获得重组荧光病毒HN-QYY-gE-/TK-/EGFP+。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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