CN113355296A - 一种表达人ccl19的重组溶瘤新城疫病毒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物病毒构建领域，具体公开了一种表达人CCL19的重组溶瘤新城疫病毒，通过在新城疫病毒Italien株全长基因组质粒中插入人CCL19编码基因，经过病毒体外复活获得，所述的人CCL19基因如SEQ ID NO.1所示。本发明利用CCL19分子趋化效应T淋巴细胞、自然杀伤细胞和成熟树突状细胞的功能，结合溶瘤新城疫病毒肿瘤选择性复制的特性，在直接杀伤肿瘤细胞、引起的炎症反应的同时，趋化更多效应淋巴细胞浸润肿瘤组织，增强肿瘤局部的抗肿瘤免疫应答反应和肿瘤抗原提呈，提高单独或者联合应用溶瘤病毒治疗肿瘤的治疗效果，为肿瘤免疫治疗带来新的治疗思路。

Description

一种表达人CCL19的重组溶瘤新城疫病毒及其应用

技术领域

本发明属于生物病毒构建领域，具体涉及一种表达人CCL19的重组溶瘤新城疫病毒及其应用。

背景技术

溶瘤病毒(oncolytic virus)是指一类能够特异性杀伤肿瘤细胞的病毒，利用溶瘤病毒对肿瘤进行治疗是肿瘤生物治疗的研究热点之一。溶瘤病毒主要通过2种机制实现对肿瘤的杀伤，一是病毒感染后引起宿主细胞的功能紊乱或者病毒大量复制导致的宿主细胞直接死亡。二是溶瘤病毒感染肿瘤细胞后，通过增强肿瘤抗原呈递、引起肿瘤细胞免疫源性死亡、释放多种细胞因子及趋化因子等多种机制增强局部乃至全身的抗肿瘤免疫反应，产生更加持久和广泛的抗肿瘤效果。随着近年来肿瘤免疫治疗的兴起，后一种机制被认为更加重要，特别是联合其它的抗肿瘤免疫治疗策略如CART细胞治疗，可以大大增强对实体肿瘤的治疗效果。

另一方面，溶瘤病毒通过改造，自身可以作为复制性病毒载体，携带外源效应基因在肿瘤局部特异性的高表达，也可以进一步增强溶瘤病毒的治疗效果。目前溶瘤病毒携带的外源分子主要包括以下几类：诱导细胞死亡相关分子，抗血管生成分子，免疫调节因子等。免疫调节因子是目前最主要的外源效应分子，如GM-CSF，CCL5等。如已经被FDA批准上市的T-VEC即是利用重组HSV溶瘤病毒表达免疫调节细胞因子GM-CSF，增强溶瘤病毒的效果。

新城疫病毒(NDV)是一种天然的溶瘤病毒，为单股负链RNA病毒，其天然宿主为禽类，对人体无致病性。NDV用于肿瘤治疗的研究历史超过50年，研究结果表明NDV应用于人体具有良好的安全性，在体内体外均可以选择性的杀伤多种人肿瘤细胞，实现一定的治疗效果，但是单纯依靠天然NDV的溶瘤作用还不足以产生足够的治疗效果，因此还需要对其进行改造，通过携带表达不同的效应基因以及开展与其它治疗方法的联合应用提高疗效。

发明内容

本发明的目的是提供一种表达人CCL19的重组溶瘤新城疫病毒及其应用，解决了解决目前肿瘤治疗，特别是实体肿瘤免疫治疗中，肿瘤免疫抑制性微环境导致免疫治疗效果不佳的问题。

本发明提供了一种表达人CCL19的重组溶瘤新城疫病毒，通过将人CCL19基因插入新城疫病毒Italien株基因组质粒中，经体外病毒复活获得，所述的人CCL19基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了上述表达人CCL19的重组溶瘤新城疫病毒的构建方法，具体包括如下步骤：

S1，构建重组病毒基因组质粒pcDNA-hCCL19，然后转入DH5α菌中；

S2，将病毒基因组质粒pBR-rNDV和pcDNA-hCCL19质粒分别用AgeI酶切，产物用T4连接酶进行连接获得连接产物，然后转入DH5α感受态大肠杆菌中，选择阳性克隆进行测序，最终获得重组病毒基因组质粒，命名为pBR-rNDV-hCCL19；

S3，BSR-T7/5经消化后转移至新的容器中，加入DMEM培养基培养，采用PEI转染试剂进行转染，转染完成后观察细胞生长状态，待出现细胞融合现象后表明病毒复活成功，重组病毒命名为rNDV-hCCL19。

进一步地，S3中，所述DMEM培养基含体积分数10％胎牛血清和100μg/mL青链霉素。

进一步地，S3中，PEI转染试剂的浓度为1mg/mL。

进一步地，S3中，转染过程中，按照质粒的质量比pBR-rNDV-hCCL19：pCI-NP：pCI-P：pCI-L＝2:1:1:1混合。

本发明还提供了所述的表达人CCL19的重组溶瘤新城疫病毒在制备肿瘤治疗药物中的应用。

进一步地，所述的表达人CCL19的重组溶瘤新城疫病毒能够单独用于制备肿瘤治疗药物。

进一步地，所述的表达人CCL19的重组溶瘤新城疫病毒能够联合其它治疗药物用于制备肿瘤治疗药物。

进一步地，其它治疗药物包括但不限于肿瘤的外科手术治疗药物、放射线治疗药物、化学治疗药物、抗体治疗药物、免疫细胞治疗药物、介入治疗药物、干细胞治疗药物。

与现有技术相比，本发明提供的一种表达人CCL19的重组溶瘤新城疫病毒及其应用，具有以下有益效果：

1、本发明基于新城疫病毒Italien株，该毒株是新城疫病毒的强毒株和溶瘤毒株。

2、本发明构建的重组溶瘤新城疫病毒表达人CCL19分子，该分子是人体重要的淋巴细胞趋化因子，可以招募外周的T淋巴细胞、NK细胞和成熟树突状细胞进入炎症反应部位，增强肿瘤病灶局部的淋巴细胞数量，增强肿瘤抗原呈递。

3、本发明以溶瘤新城疫病毒Italien株为基础构建携带外源基因的溶瘤病毒载体，具有以下的特点：

a.新城疫病毒Italien株为强毒株和溶瘤毒株。新城疫病毒的成熟(即病毒具有感染活性)需要水解病毒F蛋白，相较于目前常用的中弱毒株，Italien株F蛋白可以被更多种蛋白酶水解，因此新城疫病毒Italien具有更加广泛的体内分布潜力和感染更多肿瘤类型的潜力。

b.相较于复制缺陷型病毒载体，溶瘤病毒载体可以在肿瘤细胞中特异性复制。一方面病毒直接杀伤肿瘤细胞，激活局部的炎症反应，提高抗肿瘤免疫反应水平；另一方面在局部表达外源基因产物，提高局部产物浓度的同时避免全身应用出现的不良反应，具有更好的安全性。

c.新城疫病毒为RNA病毒，复制和转录过程不进入细胞核，不具有基因整合的风险；其天然宿主为禽类，应用于人体具有较好的安全性。

附图说明

图1是重组溶瘤新城疫病毒基因组结构示意图；

图2是pcDNA-hCCL19和pBR-rNDV质粒AgeI酶切产物图；

其中，图2a是pcDNA-hCCL19质粒的AgeI酶切产物；

图2b是pBR-rNDV质粒的AgeI酶切产物；

图3是重组溶瘤病毒基因组质粒转化大肠杆菌菌落PCR鉴定结果(▲表示测序鉴定克隆)；

图4是重组溶瘤新城疫病毒增殖检测；

其中，图4a表示重组溶瘤新城疫病毒对肺癌细胞系A549的体外杀伤能力；

图4b表示重组溶瘤新城疫病毒对人肺正常细胞系BEAs2B细胞的体外杀伤能力；

图5是重组溶瘤新城疫病毒感染上清CCL19检测；

图6是重组溶瘤病毒表达人CCL19趋化功能检测；

其中，图6a表示重组溶瘤病毒表达人CCL19对上室细胞密度的影响；

图6b表示重组溶瘤病毒表达人CCL19对下室细胞密度的影响；

图7是重组溶瘤病毒表达人CCL19趋化细胞亚群分析；

其中，图7a表示重组溶瘤病毒表达人CCL19后下室细胞亚群分析结果，横轴为CD4染色阳性细胞分布，纵轴为CD8染色阳性细胞分布；

图7b表示重组溶瘤病毒表达人CCL19后下室CD4阳性细胞亚群统计结果；

图7c表示重组溶瘤病毒表达人CCL19后下室CD8阳性细胞亚群统计结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件操作，由于不涉及发明点，故不对其步骤进行详细描述。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

下述实施例中CCL19基因片段的合成由南京金斯瑞完成并转化至DH5α工程菌株。BSR-T7/5细胞由德国慕尼黑大学Conzelmann教授惠赠。RPMI-1640培养基、DMEM高糖培养基、谷氨酰胺、胰酶细胞消化液购自Sigma公司，胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司。质粒提取试剂盒和凝胶回收试剂盒购自OMEGA Bio-Tek公司，核酸内切酶、T4 DNA连接酶购自NEB公司；CCK8细胞活率检测试剂盒碧云天生物技术公司；Human CCL19/MIP-3beta ELISA试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；Matrigel购自Corning公司；SPF级种蛋购自北京梅里亚公司。

本发明中pBR-rNDV质粒的具体构建方法、辅助质粒pCI-NP、pCI-P和pCI-L的构建方法详见授权专利《肿瘤靶向性重组新城疫病毒及其构建方法》，专利号ZL200710018423.6。

本发明提供了一种可以表达人CCL19趋化因子的重组溶瘤新城疫病毒，通过将人CCL19基因插入新城疫病毒Italien株基因组质粒中，经体外病毒复活获得，所属的人CCL19基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一、重组病毒基因组质粒的构建

1、插入基因片段的合成及载体构建

表达人CCL19基因来源于Genbank数据库NM_006274.3序列，在CDS区上下游分别添加NDV转录调控序列GS(序列如SEQ ID NO.5所示)和GE(序列如SEQ ID NO.6所示)，在片段两端添加AgeI酶切位点。该片段由南京金斯瑞合成并酶切连接至pcDNA3.1(+)EcoRV位点，得到质粒pcDNA-hCCL19。该质粒由南京金斯瑞转化入DH5α菌中。

SEQ ID NO.5：ACGGGTAGAA；SEQ ID NO.6：TTAGAAAAAAA；

2、重组病毒基因组质粒的构建

提取病毒基因组质粒pBR-rNDV和上述包含人CCL19基因序列的pcDNA-hCCL19质粒。利用AgeI将质粒进行酶切，反应体系如表1所示，37℃酶切1小时。酶切完成后反应产物利用凝胶回收试剂盒回收酶切产物，其中，pBR-rNDV酶切产物为单一条带，条带大小约为20kb(如图2b所示)；pcDNA-hCCL19酶切产物为2条带，其中目标条带为350bp左右(如图2a所示)。目标条带回收纯化后，采用T4连接酶进行连接，反应体系如表2所示。连接完成后连接产物转化DH5α感受态大肠杆菌，利用菌落PCR对转化产物进行鉴定，鉴定引物包括上游引物primer-F(序列如SEQ ID NO.3所示)和下游引物primer-R(序列如SEQ ID NO.4所示)，其反应体系如表3所示，完成后分装每管10μL，枪头挑入微量克隆菌后进行PCR反应。鉴定结果如图3所示；挑选阳性克隆进行测序，最终获得重组病毒基因组质粒，命名为pBR-rNDV-hCCL19，质粒全长基因序列如SEQ ID NO.2所示，质粒结构如图1所示。

SEQ ID NO.3：ACCTGATGTACAAGCAAAAGGCA；

SEQ ID NO.4：CGGGACCCATCTTGCGTAG；

表1 AgeI酶切体系

表2 T4连接酶体系

表3菌落PCR鉴定反应体系及反应条件

二、重组病毒的复活及制备

1、重组病毒的体外复活

BSR-T7/5经消化后转移至10cm培养皿，加入DMEM培养基(含体积分数10％胎牛血清和100μg/mL青链霉素)培养至铺满培养皿底面80％。采用PEI(1mg/mL)转染试剂进行转染，步骤如下：①按照质粒质量比pBR-rNDV-hCCL19：pCI-NP：pCI-P：pCI-L＝2:1:1:1，将10μg、5μg、5μg、5μg的上述质粒混合，无血清培养基调整终体积为1500μl。②取1mg/mL PEI无菌溶液30μl溶于1500μl无血清培养基；③二者混合后室温孵育20min，加入细胞培养皿后37℃孵育4小时；④孵育完成后，吸尽上清加入DMEM完全培养基继续在37℃，5％CO₂条件下培养。

转染完成后观察细胞生长状态，待出现细胞融合现象后表明病毒复活成功，重组病毒命名为rNDV-hCCL19。收集培养上清加入新的细胞中进行病毒的扩增。待出现大面积融合细胞后收集培养上清，经过4000g，4℃离心30min去除大颗粒杂质，随后测定病毒滴度(TCID₅₀/mL)。

2、鸡胚尿囊腔制备重组病毒

培养至第9天的SPF受精蛋，接种前利用照蛋灯检查去除死胚和未受精蛋；将病毒滴度稀释至10⁴TCID₅₀/mL；用1mL无菌注射器吸取稀释好的病毒悬液，从气室上方打孔处垂直进针约1cm，注射100μl病毒稀释液。注射完成后，用无菌医用胶布封闭注射孔，种蛋放回孵化箱继续孵育，不再翻蛋。收集24-48h之内死亡的鸡胚，置4℃冰箱保存；接种病毒72h后将剩余鸡胚置于4℃冰箱过夜处死鸡胚，随后收集鸡胚尿囊液并置于4℃冰箱保存。利用蔗糖密度梯度离心收集和纯化尿囊液中的病毒，具体步骤如下：①尿囊液粗离，4000g，4℃离心30min，除去蛋壳碎片等杂质，收集上清。②用70μm的细胞滤网过滤，除去不能沉淀的脂质等杂质。③将20％的无菌蔗糖溶液加入Beckman 34.5mlmL超速离心专用离心管底部，完成后用10mL移液管缓慢加入粗离后的尿囊液上清。④25000RPM(SW32Ti水平转头，下同)，4℃离心4h。⑤离心结束后弃上清，10mL TNE缓冲液重悬沉淀。⑥在离心管中依次加入浓度为50％和20％无菌蔗糖溶液各10mL，最后缓慢加入病毒重悬液，确保个液层之间界限清晰。⑦31900RPM，4℃离心4h。⑧小心吸走上层液体，收集浓度为50％与20％蔗糖界面的絮状物，并用TNE缓冲液稀释至35mL。⑨31900RPM 4℃离心4h，结束后用2mL TNE缓冲液重悬病毒。⑩测定病毒悬液滴度后分装保存于-80℃备用。

三、重组病毒的功能鉴定

1、重组病毒对肿瘤细胞杀伤能力

以肺癌细胞系A549和人肺正常细胞系BEAs2B细胞为靶细胞，检测重组病毒rNDV-hCCL19对肿瘤细胞和正常细胞的体外杀伤能力，具体步骤如下：

①H1299和H460细胞消化后调整计数，接种于96孔细胞培养板至细胞汇合度达80％～90％。②对病毒悬液进行倍比稀释，其中感染A549细胞稀释起始浓度按照MOI＝10设定，稀释倍数为2；BEAs2B起始浓度按照MOI＝100设定进行无血清稀释，稀释倍数为10。③其中感染前更换新鲜完全培养基，随后按照对应的感染强度加入相应体积的rNDV-hCCL19病毒稀释液，每种病毒不同时间点样本均设置5个复孔，同时在空白孔和阴性对照孔中加入等体积的TNE缓冲液，随后细胞继续在5％CO₂、37℃培养箱继续培养。④利用CCK8检测试剂盒，分别在感染后72h对细胞活率进行检测，细胞杀伤率＝[(Ac-As)/(Ac-Ab)]×100％，其中As：实验组吸光度值；Ac：对照组吸光度平均值；Ab：空白组吸光度平均值。⑤利用软件，对病毒感染不同细胞的半数抑制浓度(IC₅₀)进行计算。

结果如图4所示：重组病毒rNDV-hCCL19对肺癌细胞系A549的半数抑制浓度为0.2623(即以MOI＝0.2623感染细胞后可以在感染后72h杀伤半数肿瘤细胞)，而对正常细胞系BEAs2B的半数抑制浓度为37.36，远大于肿瘤细胞，表明rNDV-hCCL19可以有效感染肿瘤细胞的同时，仍然具有明显的肿瘤选择性杀伤能力。

2、重组病毒表达CCL19的鉴定

rNDV-hCCL19以MOI＝0.1感染BSR-T7/5细胞，感染48小时后收集细胞上清，并用样品稀释液稀释50倍待测。利用ELISA试剂盒进行检测，具体步骤如下：①将人CCL19标准品配置成1000pg/mL稀释液，随后2倍比稀释为500-15.6pg/mL溶液用于绘制标准曲线。②取待测样品稀释液与标品稀释液加入酶标板孔，每孔100μL，加封板膜，37℃，孵育90min。③甩干液体后将100μL生物素标记的抗人CCL19抗体工作液，加封板膜，37℃，孵育60min。④孵育结束后用洗涤缓冲液洗涤洗板3次，每次1min，随后甩干液体。⑤每孔加入100μLABC工作液，加封板膜，37℃，孵育30min。⑥洗涤缓冲液洗涤5次，每次2min后甩干液体。⑦每孔加入90μL TMB显色液，加封板膜，37℃，孵育15min后每孔加入100μL TMB终止液。⑧酶标仪检测A450并根据标准曲线计算各组浓度。

结果如图5所示：rNDV-hCCL19感染细胞48h后上清中检测到人CCL19，浓度为(2.72±0.15)×10⁴pg/mL，表明重组病毒rNDV-hCCL19感染细胞后具有分泌表达人CCL19的功能。

3、重组病毒表的CCL19功能鉴定

rNDV-hCCL19以MOI＝0.1感染BSR-T7/5细胞，收集感染后48小时后的细胞培养上清，并且利用紫外线灭活上清中的病毒。利用该上清检测其中CCL19对人PBMC中细胞的趋化效果以验证表达产物的生物学功能，具体步骤如下：

①BSR-T7/5接种于六孔板，生长至80％后用rNDV-hCCL19感染(MOI＝0.01)，同时设置NDV Italien株感染和未感染组作为阴性和空白对照。②感染48小时后收集上清，紫外灭活后以4000g，4℃离心30min以除去细胞碎片。③分离PBMC，调整细胞浓度至5×10⁶cells/mL。④Matrigel经4℃冰箱过夜解冻后，与4℃保存无血清培养基与Matrigel按4：1混匀，取150μL加入Transwell迁移小室(8μm孔径)。⑤Transwell小室37℃培养箱孵育2h后加入100μL PBMC。⑥将Transwell迁移小室放入24孔板中，并在孔中(下室)加入400μLrNDV-hCCL19感染上清。⑦37℃培养箱孵育4h，分别取Transwell迁移小室内和24孔板中的细胞计数，同时利用流式细胞仪对下室中细胞亚群进行检测。结果表明，如图6所示，rNDV-hCCL19感染细胞上清组的下室细胞数量显著多余阴性对照组和空白对照组，该结果证明病毒表达的CCL19确实能够发挥其趋化以CD8+T为主的淋巴细胞功能。下室细胞的流式细胞分析结果如图7所示，rNDV-hCCL19感染细胞上清作用下迁移至下室的细胞以CD8+细胞为主。

需要说明的是，申请人采用NDV强毒株和溶瘤毒株Italien株，构建的重组NDV技术平台，可以基于此方法获得携带表达外源基因的重组NDV(已授权专利，专利号为ZL200710018423.6)。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

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agctggatgc agccgggtcg attgaagaga tcaggaaaat caagcgcctt gcgctgaatg 3480<>

gctgatcact atcacaacct acaacaggtt cccgcctttt cagtgtcaca aggactctgc 3540<>

cctgagcttt cccccataaa cccaagcttc aacactttag gtgataaccc cttctcacct 3600<>

cccctacccc attgagtgat cgcgcaactg caattaatct agcagcatta aagattaaga 3660<>

aaaaaaacgg gtagaatcgg agtgccccga ctgcgtcaaa atggactcat ccaggacaat 3720<>

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ctcgtggaca gacagtaaag aagattcggt atttatcacc acctatggat tcatcttcca 3900<>

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ttcctctgcg atgctctgcc taggaagtgt cccgaatgat ggagatcttg ttgagctggc 4020<>

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aaccctagag tacaaggtga actttgtctc tctgactgtg gtgccgagga aggatgtcta 4260<>

caggatccca accgcggcat tgaaagtgtc tggctcgagc ctgtacaatc ttgcgctcaa 4320<>

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cgacagtgga tactacgcta atctcttctt gcatatcgga cttatgtcca ctgtagataa 4440<>

gaaggggaag aaagtgacat ttgacaagct ggagaggaag ataaggagac tcgatctatc 4500<>

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tactaagata gagaagaggc ataccattgc taaatacaat cctttcaaga aataggctgc 4800<>

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cccggtacct ctaatgctga tcatccgaat tgcgctgaca ctgagctgta tccgtctgac 5040<>

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tactttgctc accccccttg gcaattctat ccgcaggata caagagtctg tgactacttc 5280<>

cggaggaagg agacagagac gctttatagg tgccattatc ggcagtgtag ctcttggggt 5340<>

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tgacggatta tcacaactag cagtggcagt agggaagatg cagcagtttg ttaatgacca 5520<>

gtttaataat acagcgcaag aattggactg tataaaaatt acacagcagg tcggtgtaga 5580<>

actcaacttg tacctaactg aattgactac agtattcggg ccacaaatca cttcccctgc 5640<>

cttaactccg ctgactatcc aggcgcttta caatttagct ggtggtaata tggattactt 5700<>

gctgactaag ttaggtgtag ggaacaacca actcagctca ttaattggta gcggcttgat 5760<>

caccggcaac cctattctgt acgactcaca gactcagatc ttgggtatac agataacttt 5820<>

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gatagaagaa cttgacacct catactgtat ggagaccgac ttggatctat actgtacaag 6000<>

aatagtgaca ttccctatgt ctcctggtat ttattcctgt ctgagcggta atacatcggc 6060<>

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gcaaaattat ggagaagctg tgtccttaat agataggcac tcatgcaatg tcttatcctt 6240<>

agacgggata actctgaggc tcagtgggga atttgatgca acctatcaaa agaatatctc 6300<>

aatactagat tctcaagtta tagtgacagg caatctcgat atatcaactg agcttgggaa 6360<>

tgtcaacaac tcaataagta atgccctgaa taagttagag gaaagcaaca gcaaactaga 6420<>

caaagtcaat gtcaaactga ccagcacatc tgctctcatt acctacatcg ttttaactgt 6480<>

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aaattctggc aacctgttaa ttagaagaat taagaaaaag ctactggatg taagtgacaa 6720<>

aaaagcaata cacgggtaga accggtaggt gtgaatctcg agtgcgaggc cgaagctcaa 6780<>

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cgggtagaac ggtcggagaa gccacccctc aatcgggaat caggcctcac aacgtccttt 7200<>

ctaccgcatc accaatagca gacttcggtc atggaccgtg cagttggcag agttgcgcta 7260<>

gagaatgaag aaagagaagc gaagaataca tggcgctttg tattccggat cgcaatcttt 7320<>

cttttaatag taataacctt agccatctct gcagccgccc tggtatatag catggaggct 7380<>

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tcttatcaaa tcaatggagc tgcaaataat agcgggtgtg gggcacctgt tcatgaccca 7620<>

gattatatcg gggggatagg caaagaactt attgtagatg acgctagtga tgtcacatca 7680<>

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ggttgcactc ggataccctc attcgacata agtgctaccc actactgtta cactcacaat 7800<>

gtgatattat ctggttgcag agatcactca cactcacatc agtacttagc acttggtgtg 7860<>

cttcggacat ctgcaacagg gagggtattc ttttctactc tgcgttccat caatttggat 7920<>

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ccgcctaata cagtcacact catgggggcc gaaggcagag ttctcacagt agggacatct 8460<>

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tgttttaaag ttgtcaagac caataaaaca tattgcctca gcattgcaga aatatccaat 8880<>

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agtcacttgg ttaagaaaaa atatgagtgg tagtgagata cacggctaaa caactcacgg 9180<>

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cctaccagag tcacacctat cctcaccatt ggtcaagcac aaactgctct attactggaa 9300<>

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gaagaagatc caaattcaca acacaaggta tggagaactg tttacaaggc tgtgcacgca 9600<>

tgtagaaaag aaattgttgg ggtcgtcctg gtctagcaat gtcccacgat cagaggaatt 9660<>

caacagcatc cgtacagatc cggcattctg gtttcactca aaatggtcca gagctaagtt 9720<>

tgcatggctc catataaaac aggtccaaag gcacctgatt gtagcagcaa gaacaaggtc 9780<>

cgcagtcaac aaattagtga cgctgaccca taagataggc caagtctttg ttactcctga 9840<>

gcttgtcatt gtgacacata cagatgagaa caagttcaca tgcctcaccc aggaacttgt 9900<>

gttgatgtat gcggatatga tggagggcag agatatggtc aacataatat catccacggc 9960<>

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tgtcaagatg ggtacgatat acgggaaggt cattgggcag ctacacgcag attcagcaga 10500<>

gatttcacat gatgtcatgt tgagagagta caagagttta tctgcacttg aattcgagcc 10560<>

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Claims (9)

1.一种表达人CCL19的重组溶瘤新城疫病毒，其特征在于，所述表达CCL19的重组溶瘤新城疫病毒为向新城疫病毒溶瘤毒株Italien株的基因组中插入人淋巴细胞趋化因子CCL19的全长基因后获得，所述CCL19基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种权利要求1所述的表达人CCL19的重组溶瘤新城疫病毒的构建方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

S1，构建重组病毒基因组质粒pcDNA-hCCL19，转入工程菌中；

S2，将病毒基因组质粒pBR-rNDV和pcDNA-hCCL19质粒分别用AgeI酶切，产物用T4连接酶连接获得连接产物，然后转入DH5α感受态大肠杆菌中，选择阳性克隆进行测序，最终获得重组病毒基因组质粒，命名为pBR-rNDV-hCCL19；

S3，BSR-T7/5经消化后转移至新的容器中，加入DMEM培养基培养，采用PEI转染试剂进行转染，转染完成后观察细胞生长状态，待出现细胞融合现象后表明病毒复活成功，重组病毒命名为rNDV-hCCL19。

3.如权利要求2所述的表达人CCL19的重组溶瘤新城疫病毒的构建方法，其特征在于，S3中，所述DMEM培养基含体积分数10％胎牛血清和100μg/mL青链霉素。

4.如权利要求2所述的表达人CCL19的重组溶瘤新城疫病毒的构建方法，其特征在于，S3中，PEI转染试剂的浓度为1mg/mL。

5.如权利要求2所述的表达人CCL19的重组溶瘤新城疫病毒的构建方法，其特征在于，S3中，转染过程中，按照质粒的质量比pBR-rNDV-hCCL19：pCI-NP：pCI-P：pCI-L＝2:1:1:1混合。

6.一种权利要求1所述的表达人CCL19的重组溶瘤新城疫病毒在制备肿瘤治疗药物中的应用。

7.如权利要求6所述的表达人CCL19的重组溶瘤新城疫病毒在制备肿瘤治疗药物中的应用，其特征在于，所述的表达人CCL19的重组溶瘤新城疫病毒能够单独用于制备肿瘤治疗药物。

8.如权利要求6所述的表达人CCL19的重组溶瘤新城疫病毒在制备肿瘤治疗药物中的应用，其特征在于，所述的表达人CCL19的重组溶瘤新城疫病毒能够联合其它治疗药物制备肿瘤治疗药物。

9.如权利要求8所述的表达人CCL19的重组溶瘤新城疫病毒在制备肿瘤治疗药物中的应用，其特征在于，其它治疗药物包括但不限于肿瘤的外科手术治疗药物、放射线治疗药物、化学治疗药物、抗体治疗药物、免疫细胞治疗药物、介入治疗药物、干细胞治疗药物。

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