CN111304257B - 基于psen1基因的非治疗目的的将病毒注入动物特定脑区进行基因编辑的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于PSEN1基因的非治疗目的的将病毒注入动物特定脑区进行基因编辑的方法，利用脑立体定位注射泵将病毒直接注射入非人灵长类动物的特定脑区域中；注射量为每1m3注射病毒1uL，注射病毒的滴度为10*1013vg/mL。该方法直接将病毒注入非人灵长类动物的特定脑区域进行基因编辑，可以短时间内获得具有疾病表型的转基因猴模型，解决现阶段迫切的阿兹海默病(AD)的研究需求。
Description
技术领域
本发明属于非人灵长类动物的转基因技术及建模领域，具体涉及一种基于 PSEN1(PS1)基因的非治疗目的的将病毒注入非人灵长类动物特定脑区进行基因编辑的方法，从而构建非人灵长类动物AD疾病模型。
背景技术
阿兹海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一组病因未明的原发性退行性脑变性疾病。病理改变主要为皮质弥漫性萎缩，沟回增宽，脑室扩大，神经元大量减少，并可见老年斑(senile plaque)，神经纤维缠结等病变，同时伴随有胆碱乙酰化酶及乙酰胆碱含量显著减少。多起病于老年期，起病隐匿，病程缓慢且不可逆，以记忆损害为早期表现，随着病程发展，其最终将演变为包含认知功能障碍、人格和行为能力障碍，记忆缺失的复杂性痴呆综合症。其临床症状包括谵妄、易怒、具攻击性、情绪起伏不定、丧失长期记忆等。随着痴呆的不断加重，患者将从家庭和社会关系中退出，机体功能逐渐丧失，最终导致病患死亡。
2006年全球约有AD病患两千六百万名，而到2050年预估每85人就有一人罹患本病。发达国家中AD患者占痴呆患者的比例约为50％到70％。由于AD 是迄今为止无法治愈的退化性疾病，病患终生需依赖其他人照顾，长期照护将对照护者、精神、体能、社交和经济带来巨大影响。近年来AD俨然已成为花费最高的疾病之一，造成了严重的家庭负担及社会问题。已引起广泛关注。
但是AD发病原因众多,致病机制迄今仍不十分清楚，尚无有效诊断和治疗方法。而对于AD疾病机理的探讨，发展能反应AD病程的动物模型是进行有效研究的关键。以往较为普遍运用的AD模型有损伤模型、铝模型、D2半乳糖模型、Aβ模型、叠氮钠模型等。这些模型尽管可以存在部分特征性病理改变,但均不能模拟人类AD疾病渐进性的退行性改变，从而逐步被转基因技术所构建的动物模型淘汰。目前，仅有少数针对于猕猴的胚胎的转基因猕猴模型，但是 (1)猕猴的个体间遗传背景差异大，加之胚胎转基因技术嵌合体问题无法解决，因此这些基于胚胎转基因的猕猴目前还很难帮助我们去观察和研究AD的病因及发病机制。(2)而猕猴自然性成熟时间是5-6年，妊娠期需要6个月，属单胎生殖动物，因此利用转基因猕猴交配得到纯合子的基因操作猴现阶段还很难实现。(3)基于胚胎转基因技术的转基因猴死亡率高、成功率低、转入基因保留的稳定性差、发病时间极长，目前很难建立稳定的转基因猴模型。即使建立成功，此种猴的模型很难大量繁殖且维护成本极高而难于满足现阶段迫切的研究需求。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种基于PSEN1(PS1)基因的非治疗目的的将病毒注入非人灵长类动物特定脑区进行基因编辑的方法。
本发明所采用的技术方案：一种基于PSEN1(PS1)基因的非治疗目的的将病毒注入非人灵长类动物特定脑区进行基因编辑的方法，用微量注射器将病毒直接注射入非人灵长类动物的特定脑区域中；注射量为每1m3注射病毒1uL，注射病毒的滴度为10*1013vg/mL。
进一步地，上述非人灵长类动物为猕猴或食蟹猴；所述非人灵长类动物的特定脑区域为海马及前额叶脑区。所述可表达靶向猕猴PSEN1(PS1)基因的 sgRNA如序列表中所示。
进一步地，上述病毒以600～800nL/min的速度进行注射，注射后留针 10～15min。所述病毒为腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)。
进一步地，上述微量注射器放置在立体定位仪的注射泵上，在MRI的定位指导下利用多点阵列注射法进行注射。
本发明具有以下显著特点：有效避免猕猴个体间的遗传差异和胚胎转基因技术嵌合体问题，以及传统胚胎转基因技术的死亡率高、成功率低、转入基因保留的稳定性差，成模时间长等不足。直接将外源基因注入非人灵长类动物的特定脑区域，可以短时间内获得转基因猴模型，解决现阶段迫切的AD(阿兹海默病)疾病研究需求。
附图说明
图1是本发明实施例所述基于PSEN1(PS1)基因的非治疗目的的将病毒注入非人灵长类动物特定脑区的注射原理示意图。
图2是本发明实施例中PSEN1(PS1)基因编辑方法的原理示意图之一。
图3是本发明实施例中PSEN1(PS1)基因编辑方法的原理示意图之二。
具体实施方式
猕猴与人有良好的亲缘性、十分相似的脑结构、其基因与人类基因相似度高达97.5％。介于此，观察人类老年痴呆基因在猕猴体内产生的病理学效应，将具有更深远的意义，其也将在更大尺度上为我们揭示出更为客观地AD的致病过程。另外，猕猴具有推理、分析、决策、记忆等高级脑功能，能完成除人外最复杂的行为学任务，相比其他动物也更容易进行复杂和精确的行为学检测。因此，用猕猴建立的AD转基因疾病模型将成为更为完善和最接近人类AD的动物模型。
因此，本发明的实施例提出一种直接将外源基因注入非人灵长类动物脑区的方法，以下以猕猴为例进行说明。
如图1至图3所示，本实施例采用直接向猕猴的特定脑区域注射腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除注射脑区猕猴的PSEN1(PS1)基因，构建出能模拟AD核心症状的转基因猕猴。具体操作步骤：
(1)在病毒注射前，利用CANTAB(Cambridge Neuropsychological TestAutomated Batter)学习记忆功能检测等范式，进一步的对猕猴各项行为学指标及脑功能进行采集。
(2)利用MRI(核磁共振成像)深部脑结构精确定位技术，定位注射的特定脑区域，本实施例中为海马及前额叶脑区。在MRI的定位指导下，利用多点阵列注射法将AAV病毒精确地注射入猕猴的特定脑区域中。
具体地，在本实施例所述转基因时的方法：首先麻醉猕猴，逐层打开头皮及头皮表组织，在定位处颅骨钻孔；然后采用微量注射器抽取病毒，放置在立体定位仪的注射泵上，以600～800nL/min的速度进行注射(优选800nL/min的注射速度)，注射后留针10～15min(分钟)，注射量为每1m3注射病毒1uL，注射病毒的滴度在10*1013vg/mL。所述转基因用的病毒载体为AAV(腺相关病毒)。
(3)注射病毒后，对猕猴重新进行行为学采集及分析，通过与之前采集的基础行为对比，同时与空载病毒注射对照组猕猴进行比较，观察猕猴在转基因前后出现了哪些行为学上的改变，是否有AD疾病的症状出现。在取得行为学数据之后，处死部分猕猴进行海马及周边脑区组织学及基因突变的检测，并利用组化和电镜关注猕猴AD病理特征的改变。
另外，本发明的实施例中，所述非人灵长类动物也可以选择食蟹猴，所述方法为CRSPER/Cas 9技术敲除PSEN1(PS1)基因，所述动物模型为人类阿兹海默病(AD)的转基因非人灵长类模型。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和修饰，这些改进和修饰也应视为本发明的保护范围。
110> 中国科学院昆明动物研究所
<120> 基于PSEN1基因的非治疗目的的将病毒注入动物特定脑区进行基因编辑的方法
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<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 可表达靶向猕猴PSEN1(PS1)基因的sgRNA sgRNA-PSEN1-a的DNA序列，带有载体构建用碱基
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caccgtcagt cagcttttat acccgg 26
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<211> 26
<212> DNA
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<223> 表达靶向猕猴PSEN1(PS1)基因的sgRNA sgRNA-PSEN1-a的DNA互补序列，带有载体构建用碱基
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aaacccgggt ataaaagctg actgac 26
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<212> DNA
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<223> 表达靶向猕猴PSEN1(PS1)基因的sgRNA sgRNA-PSEN1-b的DNA互补序列，带有载体构建用碱基
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aaacgggtcg tccattagat aatggc 26
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<212> DNA
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<223> 可表达靶向猕猴PSEN1(PS1)基因的sgRNA sgRNA-PSEN1-a的载体p-sgRNA-PSEN1-a序列
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acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt 60
ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt 120
ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc 180
gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa 240
gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct 300
ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta 360
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gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc 480
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ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg 600
gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt 660
tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg 720
tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta 780
aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg 840
aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg 900
tgtagataac tacgatacgg gagggcttac catctggccc cagtgctgca atgataccgc 960
ggcttccacg ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg 1020
agcgcagaag tggtcctgca actttatccg cctccatcca gtctattaat tgttgccggg 1080
aagctagagt aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag 1140
gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat 1200
caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc 1260
cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact catggttatg gcagcactgc 1320
ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa 1380
ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac 1440
gggataatac cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct catcattgga aaacgttctt 1500
cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccactc 1560
gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa 1620
caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt tgaatactca 1680
tactcttcct ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat 1740
acatatttga atgtatttag aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa 1800
aagtgccacc tgacgtctaa gaaaccatta ttatcatgac attaacctat aaaaataggc 1860
gtatcacgag gccctttcgt ctcgcgcgtt tcggtgatga cggtgaaaac ctctgacaca 1920
tgcagctccc ggagacggtc acagcttgtc tgtaagcgga tgccgggagc agacaagccc 1980
gtcagggcgc gtcagcgggt gttggcgggt gtcggggctg gcttaactat gcggcatcag 2040
agcagattgt actgagagtg caccataaaa ttgtaaacgt taatattttg ttaaaattcg 2100
cgttaaattt ttgttaaatc agctcatttt ttaaccaata ggccgaaatc ggcaaaatcc 2160
cttataaatc aaaagaatag cccgagatag ggttgagtgt tgttccagtt tggaacaaga 2220
gtccactatt aaagaacgtg gactccaacg tcaaagggcg aaaaaccgtc tatcagggcg 2280
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cactaaatcg gaaccctaaa gggagccccc gatttagagc ttgacgggga aagccggcga 2400
acgtggcgag aaaggaaggg aagaaagcga aaggagcggg cgctagggcg ctggcaagtg 2460
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cgtactatgg ttgctttgac gtatgcggtg tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa 2580
ataccgcatc aggcgcccct gcaggcagct gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg 2640
ggcaaagccc gggcgtcggg cgacctttgg tcgcccggcc tcagtgagcg agcgagcgcg 2700
cagagaggga gtggccaact ccatcactag gggttcctgc ggccgcgagg gcctatttcc 2760
catgattcct tcatatttgc atatacgata caaggctgtt agagagataa ttggaattaa 2820
tttgactgta aacacaaaga tattagtaca aaatacgtga cgtagaaagt aataatttct 2880
tgggtagttt gcagttttaa aattatgttt taaaatggac tatcatatgc ttaccgtaac 2940
ttgaaagtat ttcgatttct tggctttata tatcttgtgg aaaggacgaa acaccgtcag 3000
tcagctttta tacccgggtt ttagtactct ggaaacagaa tctactaaaa caaggcaaaa 3060
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tagaaggcac agtcgaggct gatcagcgag ctctaggaat tcttactttc ccatcaacct 3360
gggtccaagc tcgttggcga agccgctagc gtaatctgga acatcgtatg ggtaggatcc 3420
ctttttcttt tttgcctggc cggccttttt cgtggccgcc ggccttttgc cctttttgat 3480
gatctgaggg tgcttcttag atttcacttc atacaggttg cccagaatgt ctgtgctgta 3540
cttcttaatg ctctgggtct tggaggcgat tgtcttaatg atcctggggg gcctcttgtc 3600
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cagcaggtcg ttgttcacgc cgatcactct atacagctcg ccgttgatct tgatcagatc 3720
gttgttgtag aaggaggcga taaactcggc ctggttgctg atcttcttca gcttcttagc 3780
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cttcacggtc acgaacttgt acacgccatt gtccaggtac acgtcgaatc tgtagggctt 3900
cagggacagc ttcacgacct tgtttctgct gttggggtag tcgtcggtga tgtccagatg 3960
ggcgttcagt ttgttgccgt aatacttaat cttcttgatc acggggccgt tgtccttttt 4020
ggagtacttg gtcaggtagt tcccggtttc ctcgtagtac ttgtacaggg gattcttctc 4080
gtcgccgtac tgttccataa tcagcttcag tttctggtag gtctgggggt cgtggtggta 4140
catcagcagc ttttcggggc tcttgttgat cagctttttc agcttgtcat tgtccttgtc 4200
gtacaggccg ttcagattgt tcacgatcag ggtgttgccc ttgtcgtcct tccgggtgga 4260
gtacagggtg tcgttaatca gctctctatt aggcttcttg tccacccggt ggctgtactt 4320
gtagtccttg aagtccttaa tgtgcttgat ctggtggggg gtgatgaaga tctctttgta 4380
ctcctgctcg gtttcgatct cgggcatgct ctcggcctgc ttttcctcga acatctggtt 4440
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ggcaatgatc agggcgtcct cggcgtggtg cttgtacccc ttgttccgct ctttcttaaa 4560
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gaagctgttg tcgaaggaca cgcttctggg gatgatgtgg tccacctcat agttgaaggg 4980
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gacggggctc aggatgaagt cgtccaccag ggtggtgggg atctctttct gctgggacag 5340
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ggtcagttct tcctggatgt cctcgctgct ctggtagatg gtcaggatct tggcaatctg 5580
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cttctttggg gccatggtgg caccggtacc cggggatccg gtaccttctc gactgcgctc 6720
tcaggcacga cacgactcct ccgctgccca ccgcagactg aggcagcgct gagtcgccgg 6780
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agg 7323
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gaagctgttg tcgaaggaca cgcttctggg gatgatgtgg tccacctcat agttgaaggg 4980
gttgttcagc agatcttcca gagggatggc ttccaggctg tacaggcact tgccttcctg 5040
catgtcgtgc agcttgatct tctcgatcag gtacttggcg ttctctttgc cggtggtccg 5100
gatgatttcc tcgatccgct cgttggtctg ccggttccgc ttctgcatct cgttgatcat 5160
tttctgggcg tccttggagt tcttctcgcg ggccagctcg ataatgatgt cgttgggcag 5220
gccgtacttc ttgatgatgg cgttgatcac tttgatgctc tggatgaagc ttctcttcac 5280
gacggggctc aggatgaagt cgtccaccag ggtggtgggg atctctttct gctgggacag 5340
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gtgccacagc tcgtccagga tcaggttgat ggccttcagg ctcaggttgt gggtgccggt 5460
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atccagcagc tcggcgttct caataatctc tttccgggcg gtaatgtcct tgatgtcgtg 5640
gtacaccttc aggttggtga actcgggctt gccggtgctg gtcactctgt agcccttaat 5700
atcctcttcg ttcacgagga tttctttggc gatctgcttc agggtgggct tcttcttctg 5760
cttgaacacg ttctcgatga tctggaactt ctcgtaatat tccagcttct cgttctcgtc 5820
cctggtgatc acgagattgt tcaggtcgtt cagggcgttg tacaggtcgg cgttgtaggc 5880
gtacttcacg ctccgcagtt cctcggggaa gtaggtgcag tggcccatca gcatctcgta 5940
ccattctttg atgtccttcc agccgaaggg gctgccctcg ccaggtccct catagtaggt 6000
ccgccgggtt tccagcaggt cgatgtaggt gtcgatgaag ctctggtcca gctggtggta 6060
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gccggtgtcc tcttccacct cgttcacgtt gtgcacgcct cttctcttgg ccaggtgcag 6300
cagggcggca gagaactctt cctcgctcag cttctggctc aggcccttca ctctggcctc 6360
gtaggggttg atgccgctca gctcgctgtg gtcggtcagc aggttgtagt cgaacagcag 6420
cttcttcact ctctggattc tatgccgcct ccgccgcttc agccttctgg cgcctctctt 6480
gctccgcctg ccctcgttgt tttccacgtt ggcctctttg aacagccgca cgccggcatc 6540
gatcacgtcc cgtgtctcgt agtcgatgat gccgtagccc acgctggtga tgccgatgtc 6600
caggcccagg atgtagttcc gcttggctgc tgggactccg tggataccga ccttccgctt 6660
cttctttggg gccatggtgg caccggtacc cggggatccg gtaccttctc gactgcgctc 6720
tcaggcacga cacgactcct ccgctgccca ccgcagactg aggcagcgct gagtcgccgg 6780
cgccgcagcg cagatggtcg cgcccgtgcc cccctatctc gcgcctcgcg tggtgcggtc 6840
cggctgggcc ggcggcggcg cggacgcgac caaggtggcc gggaagggga gtttgcgggg 6900
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tcctgtttcc cctccccctc tctgataggg gatgcgcaat ttggggaatg ggggttgggt 7080
gcttgtccag tgggtcgggg tcggtcgtca ggtaggcacc cccaccccgc ctcatcctgg 7140
tcctaaaacc cacttgcact catacgcagg gccctctgca gtctagaggc cgcaggaacc 7200
cctagtgatg gagttggcca ctccctctct gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg 7260
accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggcct cagtgagcga gcgagcgcgc agctgcctgc 7320
agg 7323
Claims (3)
1.一种基于PSEN1基因的非治疗目的的将病毒注入非人灵长类动物特定脑区进行基因编辑的方法，其特征在于：采用直接向猕猴的特定脑区域注射腺相关病毒，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除注射脑区猕猴的PSEN1基因，构建出能模拟AD核心症状的转基因猕猴；所述方法是在MRI的定位指导下，利用多点阵列注射法用微量注射器将腺相关病毒直接注射入非人灵长类动物的特定脑区域中；所述病毒以600～800nL/min的速度进行注射，注射后留针10～15min，注射量为每1m3注射病毒1uL，注射病毒的滴度为10*1013vg/mL；可表达靶向PSEN1(PS1)基因的sgRNA如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3所示，并且其中，所述非人灵长类动物的特定脑区域为海马及前额叶脑区。
2.根据权利要求1所述基于PSEN1基因的非治疗目的的将病毒注入非人灵长类动物特定脑区进行基因编辑的方法，其中，所述病毒以800nL/min的速度进行注射，注射后留针10～15min。
3.根据权利要求1所述基于PSEN1基因的非治疗目的的将病毒注入非人灵长类动物特定脑区进行基因编辑的方法，其中，所述微量注射器放置在立体定位仪的注射泵上，在MRI的定位指导下利用多点阵列注射法进行注射。
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