CN115109791B - 一种基于IncQ型质粒泛宿主的功能基因递送载体、构建方法和应用 - Google Patents

一种基于IncQ型质粒泛宿主的功能基因递送载体、构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种基于IncQ型质粒泛宿主的功能基因递送载体、构建方法和应用。本发明以pLHM‑10‑1质粒为模板，在mob区和rep区处设计引物进行PCR扩增，以pUC19质粒为模板，在Amp区设计引物进行PCR扩增，将扩增产物进行电泳纯化回收，两片段进行重组，转化至大肠杆菌E.Coli Dh5α感受态细胞复苏，再将其涂布于含有氨苄西林(ampicillin，AMP)的培养基上，挑取单菌落，进行菌落PCR，测序验证得到所述递送载体。本发明的载体质粒具有体积小，宿主范围广，可搭载的功能基因种类丰富、抗性标记替换较为简便等优势，适用于不同功能基因的泛宿主递送。

Description

一种基于IncQ型质粒泛宿主的功能基因递送载体、构建方法 和应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种基于IncQ型质粒泛宿主的功能基因递送载体、构建方法和应用。
背景技术
细菌耐药性是一种古老而自然发生的现象，指细菌因含有对应的耐药基因而产生的对临床中某些抗生素表现不敏感的现象，其起源可以追溯至距今约数亿甚至数十亿年前。随着畜禽养殖过程中抗生素的大量使用，细菌耐药性在全世界蔓延、传播速度不断加快、耐药谱不断扩大、耐药强度也不断增强。细菌耐药性的传播可能导致感染性疾病治疗失败、感染加剧、病程延长以及死亡率增加等。最近的一项全球性调查分析了与耐药性病原体相关的(或可归因的)感染性疾病综合症致全球死亡人数分布情况，研究显示，在多种感染性疾病中，耐药病原体已成为导致高致死率的因素之一，在这些病原体中，耐药的大肠杆菌等革兰氏阴性菌和部分革兰氏阳性菌又起着主导的作用。耐药基因全球流行，携带这些耐药基因的宿主即耐药细菌在其中扮演了重要角色。针对耐药菌株的耐药性风险防控手段十分多样，最著名的当属抗生素疗法，但也正是这一伟大的发明充当了细菌耐药性进化过程的催化剂，给人类的生命健康带来福祉的同时又带来严峻的考验。
CRISPR系统是细菌体内用来对付入侵的外源性DNA的免疫系统之一。当外源性的DNA(通常指噬菌体或者质粒)入侵细菌时，细菌会从外源性DNA中切取一小段DNA序列插入自身基因组中，形成原间隔序列proto-spacer，作为菌体对外源性DNA的记忆，一旦相同序列的外源性DNA再次入侵该细菌，其本身携带的proto-spacer会立即启动转录，产生pre-crRNA，在CRISPR相关蛋白的辅助下，产生成熟的crRNA，由此，crRNA在有(某些CRISPR系统中无)tra-crRNA的共同作用下，与Cas(一种核酸内切酶)蛋白形成复合体，对外源入侵DNA进行搜索，一旦发现外源性DNA中的PAM位点，crRNA会随之与其后的spacer序列进行碱基互补配对，完成对CRISPR蛋白的引导，从而CRISPR蛋白可以执行切割功能，实现对外源性入侵DNA的免疫过程。2013年，张锋团队率先利用CRISPR系统实现了哺乳动物中的基因编辑。目前CRISPR编辑系统仍然面临两大问题，即脱靶效应和有效递送的问题。
目前，在原核生物中，常用的功能基因递送载体主要包括物理的方法(比如电转化的方式)、化学的方法(比如氯化钙甘油法)和生物的方法(比如噬菌体、质粒、噬菌粒等)，相比于物理和化学的方法，生物转化对于细胞的损伤相对较小，相比于生物递送方法中的其他方法，质粒递送载体的宿主范围更加广泛，但是目前与功能基因递送相关的质粒载体其递送范围也常常局限于某一类细菌，宿主范围仍有待拓展。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有质粒递送载体的缺点与不足，提供一种基于IncQ型质粒泛宿主的功能基因递送载体(pQ-mini)。
本发明还提供了上述基于IncQ型质粒泛宿主的功能基因递送载体pQ-mini构建方法。
为实现上述目的，本发明通过以下技术方案进行实现：
一种基于IncQ型质粒泛宿主的功能基因递送载体(pQ-mini)的构建方法，包括如下步骤：
S1获取IncQ质粒骨架：以pLHM-10-1质粒为模板，在mob区和rep区处设计引物进行PCR扩增，得到扩增产物；
S2获取Amp抗性基因：以pUC19质粒为模板，在Amp区设计引物进行PCR扩增，得到扩增产物；
S3将步骤S1和步骤S2得到的扩增产物进行电泳纯化回收，然后进行片段重组，转化至大肠杆菌E.Coli Dh5α感受态细胞复苏，再将其涂布于含有氨苄西林的培养基上；
S4从步骤S3制备的培养基上挑取单菌落，进行菌落PCR，测序验证，得到所述递送载体pQ-mini，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
作为本发明优选的一种技术方案，步骤S1所述引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3所示，所述的扩增产物的大小为5367bp。
优选地，步骤S2所述获取引物序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，所述的扩增产物的大小为2102bp。
优选地，步骤S3所述电泳为琼脂糖凝胶电泳。
优选地，步骤S3所述片段重组采用同源重组试剂盒的方法进行。
优选地，步骤S3所述氨苄西林终浓度为100μg/mL。
本发明还提供了上述基于IncQ型质粒泛宿主的功能基因递送载体pQ-mini在跨宿主递送不同功能基因方面的应用。
基于该递送载体，将外源性的功能基因通过酶切-连接的方式载入，之后通过接合转移的方式实现功能基因跨种属菌株的递送。
优选地，所述功能基因包括绿色荧光蛋白基因sfGFP、化学发光基因luxCDABE、CRISPR相关基因。
该载体质粒具有功能基因插入位点，可以通过双酶切的方法，一步法实现功能基因的高效搭载。该载体质粒上具有一段氨苄西林耐药基因标记Amp，在该基因片段的两端，同样具有酶切位点，可以根据待递送的目标宿主的天然抗性随时替换不同的耐药标记，方便后续的递送。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)与现有的物理、化学和病毒、类病毒递送方式相比，生物递送的优势是生物相容性较好，对细胞的损害有限，递送的手段相对温和；可递送的范围更为广泛，自然界中绝大部分细菌的感受态状态是较难出现的；质粒递送载体宿主范围较广，比较适合原核生物中功能基因的递送；基于IncQ型质粒的功能基因递送载体可以实现更为广泛的宿主菌的递送，比如从革兰氏阴性菌到革兰氏阳性菌该载体质粒具有广泛的宿主范围，不仅包括不同种类的革兰氏阴性菌，还包括诸如放线菌门、厚壁菌门等部分革兰氏阳性菌，该载体质粒上的rep区相关基因可以在上述菌株中执行复制功能，因此，该载体具有泛宿主递送的能力。
(2)本发明构建了一种基于IncQ型质粒泛宿主的功能基因递送载体(即pQ-mini：大小为7500bp左右，由mob区、rep区、氨苄西林耐药基因amp及功能基因插入位点等组成)，宿主菌为二氨基庚二酸(diaminopimelic acid，DAP)营养缺陷型的大肠杆菌菌株E.ColiWM3064，由于IncQ型质粒不具有质粒转移相关元件(Tra蛋白等)，属于不可自我转移型质粒，需要在相关元件的辅助下实现转移。而WM3064菌株染色体上具有IncP型质粒RP4的转移元件，可有效辅助IncQ型质粒转移进入不同的宿主菌，从而达到功能基因递送的目的，待其进入受体菌后，由于受体菌缺乏相关转移元件，该载体质粒无法重新移动至其他菌体，这种方式可实现功能基因递送后在宿主菌中的稳定存在。
附图说明
图1为本发明递送载体pQ-mini的构建示意图。
图2为本发明递送载体pQ-mini的构建验证琼脂糖凝胶电泳图。
图3为本发明功能基因递送载体pQ-mini可转移的宿主范围热图。
图4为pQ-sfGFP质粒构建示意图(a)及琼脂糖凝胶电泳图(b)。
图5为pQ-luxCDABE质粒构建示意图(a)及琼脂糖凝胶电泳图(b)。
图6为pQ-sfGFP质粒转移至不同宿主菌后接合子的荧光成像图。
图7为pQ-luxCDABE质粒转移至不同宿主菌后接合子的荧光成像图。
图8为pQ-Ascas12f1-Tmcr-1质粒构建、验证及靶向目的基因mcr-1的sgRNA设计示意图。
图9为质粒pQ-AsCas12f1对大肠杆菌E.coli CSZ4中mcr-1及其所在质粒的消除效果图，图a表示接合子原代菌株进行菌落PCR后产物琼脂糖凝胶电泳结果；图b表示mcr-1基因型检测结果；图c表示IncX4复制子基因PCR结果；图d表示受体菌CSZ4在获得pQ-CRISPR-Tmcr-1和pQ-CRISPR-NT之后消除效率柱状图；图e表示mcr-1消除前后菌株在2μg/mL多粘菌素E的LB琼脂板上的生长表型。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1
一种基于IncQ型质粒泛宿主的功能基因递送载体pQ-mini的构建方法，包括如下步骤：
(1)以pLHM-10-1质粒为模板，在mob区和rep区处设计引物pQ-SpeI/pQ-NotI，进行高保真PCR扩增，扩增的体系和条件如表1、2所示，得到扩增产物，所述的扩增产物的大小为5367bp；
(2)以pUC19质粒为模板，在Amp区设计引物pUC19-H11/pUC19-H21，进行高保真PCR扩增，扩增的体系和条件如表1、2所示，得到扩增产物，所述的扩增产物的大小为2102bp；
(3)对上述两种扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，纯化回收，然后采用同源重组试剂盒进行片段重组，试剂盒优选南京诺唯赞生物科技有限公司的同源重组试剂盒One StepCloning Kit，然后转化进入大肠杆菌E.coli Dh5α感受态细胞，待复苏一定的时间，将其涂布于含有终浓度为100μg/mL氨苄西林的LB琼脂板上；
所述琼脂糖凝胶电泳的方法包括制备0.8％～1.2％TAE琼脂糖凝胶，然后采用10Xloading对与PCR扩增产物进行混合，将全部产物点样进行电泳，电泳条件为100V，88mA，电泳40min；所述纯化回收采用胶回收纯化试剂盒(Takara)进行；所述同源重组的体系配置如表3所示，同源重组的反应条件优选为：在冰上配置后轻弹混匀，短暂离心，50℃反应30min；同源重组产物转化时所用到的目标菌株为：大肠杆菌E.coli Dh5α；
(4)从琼脂板上挑取单菌落，进行菌落PCR，验证其连接的情况，此处所用到的引物序列为MLF/pQ-TR、AMF/AMR。
至此，基于IncQ的功能基因递送载体质粒pQ-mini构建成功；验证的结果如图2中的胶图所示，其中所述引物pQ-SpeI、pQ-NotI、pUC19-H11、pUC19-H21、MLF/pQ-TR、AMF/AMR，序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.36、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9所示。
表1高保真PCR反应体系
表2高保真酶PCR的反应条件
表3同源重组体系
实施例2pQ-mini质粒的电转及接合转移实验
(1)对实施例1中大肠杆菌E.coli Dh5α/pQ-mini进行质粒抽提，然后将质粒电转进入大肠杆菌E.coli WM3064电转感受态细胞中，待复苏一定的时间，将其涂布于含有终浓度为100μg/mL氨苄西林和57μg/mL的DAP的LB琼脂板上；
(2)对板上长出来的单菌落进行菌落PCR以确认质粒pQ-mini确实转入，然后对转入成功的单菌落进行传代培养，菌落PCR所用引物为IncQ3-F/R，序列如SEQ ID NO.42、SEQID NO.43所示。
(3)以大肠杆菌E.coli WM3064/pQ-mini为供体，以不同类型的标准菌株(鲍曼不动杆菌临床株A.baumanii ADP-1除外)为受体，将供体和受体菌株分别培养至对数生长期后，进行膜法的接合转移实验。
步骤(1)中提及的Dh5α感受态细胞转化包括：将待转化产物吸取一定量加入Dh5α化学转化感受态细胞中，冰上静置30min，然后42℃热激45s，冰上静置3min，然后添加950μLLB肉汤，37℃，180rpm孵育1h，涂布合适抗性的筛选平板，37℃静置培养12-16h。
步骤(1)中所述的电转化优选为通过如下步骤实现：
(i)在无菌条件下，将质粒pQ-mini取适量体积(500ng)加入大肠杆菌E.coliWM3064电转感受态中(插冰解冻2～3min)，手指轻弹混匀，用移液器将混匀的液体转移至清洗干净的电转杯中(尽量不要产生气泡)，用纸巾擦干电转杯的金属侧壁部分，置于电转杯放置槽中，推入电转仪，在Bacteria模式下，点击pulse键，然后再次点击Bacteria键，观察电转时的电压和持续时间，1.8kv和5.0ms及以上为较优。后取下电转杯，在无菌环境下，用移液器转移950μL LB肉汤(预先添加适量浓度的DAP)至电转杯，吹打混匀后，转移至新的1.5毫升EP管，封口膜封口，置于37℃，180rpm，振摇1～2h。
(ii)将步骤(i)中得到的菌液涂布在含有DAP和AMP的LB固体培养基中进行培养，得到转化成功的WM3064/pQ-mini。
步骤(i)中所述的质粒(pQ-mini质粒)与大肠杆菌WM3064感受态细胞的体积比优选为1:10；所述的培养的条件优选为：37℃培养1h；所述的培养基中的二氨基庚二酸的浓度为57μg/mL；所述的培养基优选为SOB培养基或LB肉汤培养基。
步骤(ii)中所述的培养的条件优选为：37℃培养16～24h；所述培养基中的DAP的浓度为57μg/mL；培养基优选为LB琼脂培养基。
步骤(1)中所述的大肠杆菌E.coli WM3064感受态细胞通过10％甘油洗涤法制得；优选方法的具体操作步骤如下：
(i)将E.coli WM3064接种到含有DAP的LB肉汤培养基进行活化培养，然后转接到含有DAP的LB肉汤培养基进行扩大培养，再在冰上预冷后于4℃条件下进行离心(5500rpm，10min)，弃上清，得到大肠杆菌菌体沉淀；
(ii)将预冷的10％甘油加入到步骤(I)中得到的大肠杆菌菌体沉淀中，混匀后于4℃条件下进行离心，弃上清，再加入预冷的10％(v/v)甘油溶液重悬细菌，4℃条件下进行离心，弃上清，此步骤共重复4次，冰上放置，得到大肠杆菌E.coli WM3064电转化感受态细胞；
步骤(i)中所述的LB肉汤培养基中的DAP的浓度为57μg/mL；所述的活化培养的条件优选为：37℃过夜培养；所述的扩大培养的条件优选为：37℃培养2～3h；所述的冰上预冷的时间优选为10min；所述的离心的条件优选为：5500rpm离心10min；
步骤(ii)中所述的10％甘油溶液体积为10毫升；所述的离心条件优选为：5500rpm离心10min；所述的冰上放置的时间优选为10min；所述的大肠杆菌WM3064电转感受态细胞的保存温度优选为-80℃。
步骤(3)中提及的受体菌株主要包括：
大肠杆菌E.coli ATCC 25922、沙门菌S.typhimurium ATCC 14028、阴沟肠杆菌E.cloacae ATCC 13047、鲍曼不动杆菌A.baumannii ADP1、粪肠球菌E.faecalis ATCC29212、金黄色葡萄球菌S.aureus ATCC 29213、无乳链球菌S.agalactiae ATCC 12386、奇异变形杆菌P.mirabilis ATCC 35659、弗氏柠檬酸杆菌F.Citrobacter ATCC 43864、肺炎克雷伯菌K.pneumoniae ATCC 700603、小韦荣氏球菌V.parvula ATCC 10790、产气荚膜梭菌C.perfringens ATCC 13124、脆弱拟杆菌B.fragilis NCTC 9343；
步骤(3)中供受体菌的接种条件：
供体菌接种：取形态良好的单菌落接种于含有终浓度为57μg/mL的DAP和50μg/mL的AMP的4毫升的LB肉汤中，37℃，180rpm振摇3～4h，待其OD600达到0.25左右(即对数生长期)，取出备用；
受体菌在接种时无需添加任何种类的抗生素，对于革兰氏染色阳性的受体菌，则采用BHI液体培养基，对于厌氧菌，在BHI液体培养基的基础上，再添加2cm高经过灭菌的液体石蜡进行密封并静置过夜；
步骤(3)中提及的膜法接合转移实验还包括如下具体步骤：
(i)转接
吸取上述菌液各40μL重新接种于4mL BHI肉汤中，37℃，180rpm振荡培养4h，待OD600达到0.25(对数生长期)，取出，5500rpm离心2min，用pH7.3～7.4的灭菌PBS洗涤一遍，备用；厌氧菌不转接，待OD600达到0.25左右，不洗涤，备用；
(ii)准备
在实验前制备好含有DAP终浓度为57μg/mL的LB或BHI琼脂板，用灭菌后的镊子夹取高温灭菌后的接合转移的膜贴在表面备用；
(iii)接合
供体和受体菌各取100μL，1：1混合，涡旋混匀，5500rpm离心2min，弃上清180μL，余20μL与菌体混合均匀，取20μL菌液，滴膜，室温正置20min，然后倒置于培养箱，37℃培养6h；对于厌氧菌的接合，供受体菌各取100μL混合均匀后，迅速滴于膜中央，然后将BHI琼脂板置于厌氧袋封闭，待液体晾干后，倒置于37℃培养箱培养18h；
(iv)稀释滴板
接合完毕，将菌苔刮至450μL的提前准备好的灭菌PBS中，10倍比稀释7个梯度，将0～3梯度滴25μL于氨苄西林100μg/mL的LB琼脂板以筛选接合子，将5～7梯度滴25μL于LB空白板以筛选受体菌，将滴完的LB琼脂板正置20min，待液体被吸收之后将其置于37℃恒温培养箱，倒置培养18～22h；对于厌氧的接合体系，用预先添加了4mM的L-半胱氨酸的PBS进行稀释滴板，以消耗在稀释过程中引入的氧气；
(v)统计
培养结束，对长出来的单菌落使用计数器进行计数，原则是单菌落数目大约在30～300之间的范围，通过计算接合子和受体菌的数目，以接合子与受体的数目的比值作为接合转移频率，上述实验每次做三个技术重复，实验经过两次重复；
(vi)接合子的鉴定
从含有AMP的LB或BHI琼脂板上长出的菌落中挑取单菌落进行PCR验证，PCR反应体系和程序见表4和表5，鉴定引物名称为：repB-F/R-ZSY；AMP-ZSY-F/R；
其中，引物序列如SEQ ID NO.13～16所示。
表4 PCR反应体系(2×)
表5 PCR的反应条件
实施例3
一种基于IncQ型质粒泛宿主的功能基因递送载体pQ-mini构建绿色荧光蛋白基因菌株(pQ-sfGFP)的方法，包括如下步骤：
(A)对pQ-mini进行酶切，酶切方法优选为：37℃水浴静置2h，然后在65℃条件下静置20min使内切酶失活，酶切体系如表6所示；
(B)通过高保真PCR方式获取绿色荧光蛋白报告基因sfGFP，引物名称为sfGFP-1A/1B，引物序列分别如SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.30所示；基因片段sfGFP来源于质粒pLZ002，PCR反应体系为KOD高保真酶，程序如表1和表2所示；
(C)酶切后连接，连接体系的配制如表7所示；
(D)对筛选到的单菌落进行基因型验证；引物名称为AGF/AGR、MLF/MGR，序列分别如SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.12所示；
(E)抽提质粒；
(F)将质粒电转进入大肠杆菌WM3064，具体操作同实施例2；
(G)以WM3064/pQ-sfGFP为供体，以目标菌株为受体菌，进行膜法的接合转移实验，具体操作同实施例2；
(H)对筛选到的接合子进行荧光倒置显微镜成像，然后进行PCR验证，PCR验证的引物为repB-F/R；Amp-F/R，序列分别如SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ IDNO.16所示，PCR体系、条件如表4、表5所示；荧光表型验证步骤优选为：通过荧光倒置显微镜在绿色荧光检测模式下进行检测，阳性对照为大肠杆菌E.coli WM3064/pQ-sfGFP。
表6酶切体系
表7连接体系
实施例4
为了进一步探究该载体质粒携带大片段荧光报告基因进行泛宿主递送的能力，本发明利用化学发光报告基因luxCDABE构建了pQ-luxCDABE，具体步骤如下：
(A)对pQ-mini进行酶切，具体方法同实施例3；
(B)通过高保真PCR方式获取化学发光基因luxCDABE，引物名称为lux-1A/B，序列如SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.32所示；
(C)酶切后连接，连接体系如表7所示；
(D)对筛选到的单菌落进行基因型验证；引物名称为MLF/MLR；LAF/LAR，序列分别如：SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.7所示；
(E)抽提质粒；
(F)将质粒电转进入大肠杆菌WM3064；
(G)以WM3064/pQ-luxCDABE为供体，以目标菌株为受体菌，进行膜法的接合转移实验，及接合子的鉴定，操作同实施例2；
(H)对筛选到的接合子在小动物活体成像仪中进行观察，然后进行PCR验证，PCR验证的引物为repB-F/R、Amp-F/R，序列分别如：SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16。
步骤(B)中的化学发光报告基因片段luxCDABE来源于质粒PBBR1MCS4，PCR反应体系为KOD高保真酶，反应体系和程序同上表1、表2：
步骤(F)中所述的大肠杆菌E.coli WM3064感受态细胞通过10％甘油洗涤法制得；步骤与上述实施例2保持一致；
步骤(F)中所用到的筛选琼脂板为含有终浓度为57μg/mL的DAP和100μg/mL的AMP的LB琼脂板；
步骤(G)中的目标菌株与上述实施例2中用到的菌株一致。
步骤(H)中的荧光表型验证步骤优选为：通过小动物活体成像仪在luminescence模式下进行检测，阳性对照为大肠杆菌E.coli WM3064/pQ-luxCDABE。
实施例5
为了探究该载体质粒携带CRISPR-Cas系统进行递送的能力，本发明构建了基于IncQ的pQ-Ascas12f1-Tmcr-1和pQ-Ascas12f1-NT两种质粒，由于采取一步法酶切连接的方法未能成功构建，我们采用分步骤加载功能基因的方法，具体步骤如下：
(A)对pQ-mini和进行高保真PCR扩增Q质粒骨架，PCR程序和体系如表1、2所示，扩增所需引物为pQ-mini-linear-1A/pQ-mini-linear-1B，序列如SEQ ID NO.38、SEQ IDNO.39所示；
(B)通过高保真PCR方式获取核酸内切酶基因Ascas12f1，引物名称分别为pQ-CRISPR-CF/CR2，引物序列如SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.34所示，PCR程序和体系如表1、2所示；
(C)通过Infusion的方法进行两片段同源重组，获得质粒pQ-AsCas12f1；
(D)对筛选到的单菌落进行基因型验证；引物名称为pQ-TF/AsCas12f1-F，序列分别如：SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.37所示；
(E)以pSGkp-arr3-Tlacz为模板，arr3-1A/1B为引物，采用高保真的方法扩增arr3；
(F)以质粒psgRNAv1-empty为模板，以psgRNAv1-HF/HR为引物，采用高保真PCR的方法对质粒进行反向扩增；
(G)采用Infusion的方法对上述步骤(E)、(F)中获得的两片段进行同源重组，获得质粒psgRNAv1-arr3；
(H)采用高保真PCR的方法扩增sgRNA-Tmcr-1/NT序列，引物名称分别为：pQ-CRISPR-GF3/GR3，序列分别如：SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.41所示；
(I)对质粒pQ-AsCas12f1进行XhoI单酶切，并进行纯化回收；
(J)采用Infusion的方法对质粒pQ-AsCas12f1的XhoI单酶切产物和sgRNA-Tmcr-1/NT进行双片段同源重组；
(K)对筛选到的单菌落进行基因型验证；引物名称为pQ-Tmcr-1-1A/1B(pQ-TF/SacB-R)、pQ-Tmcr-1-2A/2B(pSGKP-F1/Xba-gRNA-R)，序列分别如：SEQ ID NO.19、SEQ IDNO.20、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22所示；
(L)抽提质粒；
(M)将质粒转入大肠杆菌E.coli WM3064电转感受态细胞，电转感受态的制备同实施例2中描述；
(N)以大肠杆菌E.coli WM3064/pQ-Ascas12f1-Tmcr-1/NT)为供体，以目标菌株为受体菌，进行膜法的接合转移实验；
(O)对筛选的琼脂板上长出的单菌落进行基因型和表型的验证，同时对接合子进行传代，PCR验证的引物为mcr-1-ZSY-F/R，序列分别如SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24所示，表型验证采用平板划线的方法，即将疑似接合子挑取单菌落划线于含有终浓度为2μg/mL多粘菌素E的LB琼脂板上，对照组为受体菌株。
步骤(B)中Ascas12f1核酸内切酶序列来自于质粒p15a-AsCas12f1及gRNA-NT序列来自于psgRNA-v1-Tmcr-1及psgRNA-v1-NT；
步骤(N)中的目标菌株，此处选择大肠杆菌临床株CSZ4，其携带一个IncX4的质粒pCSZ4，该质粒上携带有粘菌素耐药基因mcr-1，可介导菌株对粘菌素的耐药。
步骤(H)的gRNA序列的获取还包括如下步骤：
从NCBI搜寻多粘菌素耐药基因mcr-1及进行Blast序列比对，寻找mcr-1的保守序列；
通过CRISPR gRNA设计软件，寻找上述保守序列中的潜在的gRNA(可有效引导Ascas12f1核酸酶复合体)；
取得分最高的gRNA序列，在psgRNAv1-arr3的scaffold与HDV之间设计引物，并添加设计的靶向mcr-1及非靶向的sgRNA序列，送擎科公司合成，引物命名为N20-mcr-HR/HF，N20-HF/HR，序列分别如：SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.28所示。
以质粒psgRNAv1-arr3为模板，N20-mcr-HR/N20-mcr-HF，N20-HF/N20-HR为引物，通过高保真DNA聚合酶扩增的方法，进行反向扩增，得到成功替换sgRNA开环的DNA双链分子；
将上述PCR扩增产物，进行琼脂糖凝胶电泳，纯化，回收，将回收产物转化进入大肠杆菌Dh5α中；
从筛选琼脂板上挑取单菌落，进行PCR验证，验证引物为(Xba-gRNA-R/pSGKP-F1)：序列分别如SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.21所示。
将转化成功的Dh5α菌株接菌，提质粒，然后设计引物进行高保真PCR，获取两段sgRNA序列(gRNA-Tmcr-1、gRNA-NT)，此处的引物名称为：sgRNA1-F/Xba-gRNA-R，序列如SEQID NO.35、SEQ ID NO.22所示。
结果分析：
由图3可知，通过硝酸纤维素薄膜(接合转移膜)法的接合转移实验，pQ-mini在大肠杆菌E.Coli WM3064染色体上Tra相关元件的辅助下，可以广泛地接合转移至不同种属的受体菌，其中包括变形菌门下肠杆菌科不同的种属及厚壁菌门下某些种属的菌株。
由图6可知，将供体菌WM3064/pQ-sfGFP与不同种类的受体菌进行接合转移，经过含有100μg/mL的AMP LB琼脂板的筛选，挑取生长出的疑似接合子在荧光倒置显微镜下进行荧光观察，可以看到，不同种类的受体菌(阴沟肠杆菌E.cloacae ATCC 13047、沙门菌S.typhimurium ATCC 14028、大肠杆菌E.coli ATCC 25922、鲍曼不动杆菌A.baumannii ADP-1、粪肠球菌E.faecalis ATCC 29212、金黄色葡萄球菌S.aureus ATCC 29213、产气荚膜梭菌C.perfringens ATCC 13124、无乳链球菌S.agalactiae ATCC 12386)在获得质粒pQ-sfGFP后均可以表现出荧光。
由图7可知，将供体菌WM3064/pQ-luxCDABE与不同种类的受体菌进行接合转移，经过含有100μg/mL的AMP LB琼脂板的筛选，挑取生长出的疑似接合子在小动物活体成像仪下进行化学发光成像，可以看到，不同种类的受体菌(大肠杆菌E.coli ATCC 25922、阴沟肠杆菌E.cloacae ATCC 13047、沙门菌S.typ himurium ATCC 14028、鲍曼不动杆菌A.baumannii ADP-1)在获得质粒pQ-luxCDABE后均可以表现出荧光，另外，粪肠球菌E.faecalis ATCC 29212、金黄色葡萄球菌S.aureus ATCC 29213、无乳链球菌S.agalactiae ATCC 12386、产气荚膜梭菌C.perfringens ATCC 13124的疑似接合子在luminescence模式下并不表现发光表型，后续经过基因型验证，确认其获得了质粒pQ-luxCDABE。
由图9可知，以接合子原代菌株进行菌落PCR验证，条带有明显减弱现象，即mcr-1被明显敲降，进行一次传代后，18个样品中有15个单菌落mcr-1被成功消除，3个单菌落仍然含有mcr-1，消除效率为83.3％(图9a、b、d)。mcr-1消除株和E.coli CSZ4临床株ERIC PCR的图谱一致，表明消除mcr-1之后的菌株和野生菌为同种类型。E.coli CSZ4携带的mcr-1为IncX4型质粒，本研究通过扩增IncX4复制子区的保守序列观察mcr-1相关质粒的丢失情况。结果表明IncX4质粒被完全消除。相反，非靶向对照组中IncX4质粒未被消除(图9c)。mcr-1消除株在含有2μg/mL多粘菌素E的LB琼脂板上，生长明显受到抑制(图9e)。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为了清楚地说明本发明技术方案的所作的举例，而并非是对本发明的具体实施方式的限定。凡在本发明权利要求书的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一种基于IncQ型质粒泛宿主的功能基因递送载体、构建方法和应用
<130> ZM221223WM
<160> 43
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 7507
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
ctagtgcgta gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt 60
attgggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg 120
cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac 180
gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg 240
ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca 300
agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc 360
tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc 420
ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag 480
gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc 540
ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca 600
gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg 660
aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga agaacagtat ttggtatctg cgctctgctg 720
aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct 780
ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa 840
gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa 900
gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa 960
tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc 1020
ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat agttgcctga 1080
ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg gagggcttac catctggccc cagtgctgca 1140
atgataccgc gagacccacg ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc 1200
ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca actttatccg cctccatcca gtctattaat 1260
tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc 1320
attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt 1380
tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc 1440
ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact catggttatg 1500
gcagcactgc ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt 1560
gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg 1620
gcgtcaatac gggataatac cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct catcattgga 1680
aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg 1740
taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg 1800
tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt 1860
tgaatactca tactcttcct ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc 1920
atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca 1980
tttccccgaa aagtgccacc tgacgtctaa gaaaccatta ttatcatgac attaacctat 2040
aaaaataggc gtatcacgag gccctttcgt ctcgcgcgtt tcggtgatga cggtgaaaac 2100
ctctgacaca tgtccactag gcgcggttat cagcgccctt gtggggcgct gctgcccttg 2160
cccaatatgc ccggccagag gccggatagc tggtctattc gctgcgctag gctacacacc 2220
gccccaccgc tgcgcggcag ggggaaaggc gggcaaagcc cgctaaaccc cacaccaaac 2280
cccgcagaaa tacgctggag cgcttttagc cgctttagcg gcctttcccc ctacccgaag 2340
ggtgggggcg cgtgtgcagc cccgcagggc ctgtctcggt cgatcattca gcatcggcat 2400
catctgctaa tttcccgcaa tgttcgcagg taatcatagg tttggattgg tttctctatc 2460
tggatcacac gaattgcagc gactcaatga accatcatcg taataatgaa gctcctctcc 2520
gcattcacag cgcagttcat cactgagcag ttcatcaata aaatcagcgt ctgtgtaatc 2580
gtctagtttt aaatcagtca ttattgcttt cctttattag tttaaattca ggccggctca 2640
tccttctggc gtggcggcag accgaacaag gcccggtcgt ggtcgcgttc aaggtacgca 2700
tccattgccg ccatgagccg atcttctggc cactcgctgc tgttcacctt ggccagaatc 2760
atggcgccca ccagcacctt gcgccgcgtt tcgttcttgc gctcttgctg ctgctccctt 2820
gccctcaccc gctgaatctc ggcattgatc cgtgctcgct gttcttcgag cttggccagc 2880
ctatccgccg ccttgttgct ccccttagcc atcttgacac ctcattgtta atgtgctgtc 2940
tcttaggcta tcatggaggc acgacggcgg caaaccccga ccgtactttg tacgggaggg 3000
cgcacttacc ggtttctctt cgagaaactg gcctaacggc cacccttcgg gcggtgcgct 3060
ctccgagggc cattgcatgg agccgaaaag caaaagcaac agcgaggcag catggcgatt 3120
tatcacctta cggcgaaaac cggcagcagg tcgggcggcc aatcggccaa ggccaaggcc 3180
gactacatcc agcgcgaagg caagtatgcc cgcgacatgg atgaagtgct gcacgccgaa 3240
tccgggcaca tgccggagtt cgtcgagcgg cccgccgact actgggatgc tgccgacctg 3300
catgaacgcg ccaatgggcg gctgttcaag gaggtcgaat ttgccctgcc ggtcgagctg 3360
accctcgacc agcagaaggc gctggcgtcc gagttcgccc agcacctgac cggtgccgaa 3420
cgtttgccgt atacgctggc catccatgcc ggtggcggcg agaacccgca ctgccacctg 3480
atgatctccg agcggatcaa tgacggcatc gagcggcccg ccgctcagtg gttcaagcgg 3540
tacaacggca aggccccgga gaagggcgga gcgcagaaga ccgaagcact caagcccaag 3600
gcatggcttg agcagacccg cgaggcatgg gccgaccatg ccaaccgggc attagagcgg 3660
gctggccacg acgcccgcat tgaccaccga acgcttgagg cgcagggcat cgagcgcctg 3720
cccggtgttc acctggggcc gaacgtggtg gagatggaag gccggggcat tcgcaccgac 3780
cgggcagacg tggccctgaa catcgacacc gccaacgccc agatcatcga cttgcaggaa 3840
taccgggagg ctatagacca tgagcgcaat cgacagagtg aagaaatcca gaggaatcaa 3900
cgagttagcg gagcagatcg agccgctggc ccagagcatg gcgacactgg ccgacgaggc 3960
ccggcaggtc atgagccaga cccagcaggc cagcgaggcg caggcagcgg agtggctgaa 4020
agcccagcgc gagacacagg cagcatgggc caagctggcc aaggaattgc gggaagtggc 4080
cagcgaggtg agcgacgccg cgcagagcgc ccggagcgcg gccagagggt ggcactggaa 4140
gctgtggcta accgtgatgg cggcttccat gatgcctacg ctggtgctgc tgatcgcatc 4200
gttgctcttg ctcgacctga cgccactgac aacagaggac ggctcgatct ggctgcgctt 4260
ggtggcccga tgaaaaacga cagaaccttg caggccatag gccgacagct caaggccatg 4320
ggctgtgagc gcttcgatat cggcgtcagg gatgccacca ccggccagat gatgaaccgg 4380
gaatggtcag cctccgaagt gctccagaac acgccatggc tcaagcggat gaatgcccag 4440
ggcaatgacg tgtatatcag gcccgccgag caggaacgcc atggtctggt gctggtggac 4500
gacctcagcg agctcgacct ggaggacatg aaagccgagg gccgggaacc ggcgctgatc 4560
gtggagacca gcccgaagaa ctatcaggca tgggtcaagg tggccgacgc cgcaggcggt 4620
gaactccggg ggcagattgc ccggacgctg gccagcgagt acgacgccga cccggccagc 4680
gccgacagcc gccactatgg ccgcttggcg ggtttcacca accgcaagga caagcacacc 4740
acccgcaccg gctatcagcc gtgggtgctg ctgcgtgagt ccaagggcaa gaccgccacc 4800
gctggcccgg cgctggtgca gcaggctggc cagcagatcg agcaggccca gcggcagcag 4860
gagaaggccc gcaggctggc cagcctcgaa ctgcccgagc ggcagcttag ccgccaccgg 4920
cgcacggcgc tggacgagta ccgcagcgag atggccggac tggtcaagcg ctacggtgac 4980
gacctcagca agtgcgactt tatcgccgcg cagaaactgg ccagccgggg ccgcagtgcc 5040
gaggaaatcg gcaaggccat ggccgaggcc agcccggcgc tggcagagcg caagcccggc 5100
cacgaagcgg attacatcga gcgcaccgtc agcaaggtta tgggtctgcc cagcgtccag 5160
cttgcgcggg ccgagctggc acaggcaccg gcaccccgcc agcgaggcat ggacaggggc 5220
gggccagatt tcagcatgta acgcttgcat tagcgctaac gggtagtata ctgttagctc 5280
taatggagga tttgagatga aagaccatcg ggacacgcag accggcaacc tgttggccac 5340
gcccaacgcg atcaggcagg ctaggtttgc cgacgctcag cgaaaactgg gccgcaaggc 5400
ccgtaagata tgggccacag acgacgaggc cgaggcgctg cgtctgtacc tggaagaact 5460
cagagcggcg cagggcgggg gtagtgaccc cgccagcgcc taaccaccaa ctgcctgaac 5520
aggaggcaat catggctacc cataagccta tcaatattct ggaggcgttc acagcagcgc 5580
cgccaccgct ggactacgtt ttgcccaaca tggtggccgg tacggtcggg gcgctggtgt 5640
cgcccggtgg tgccggtaaa tccatgctgg ccctgcaact ggccgcacag attgcaggcg 5700
ggccggatct gctggaggtg ggcgaactgc ccaccggccc ggtgctctac ctgcccgccg 5760
aagatccacc caccgccatc catcaccggc ttcacgccct gggcgcatac ctcaacgacg 5820
agcagcggca agccgtggcc gctggcctgc tgatccagcc gctgatcggc agcctgccca 5880
acatcatggc cccggagtgg ttcgacggcc tcaagcgcgc cgccgagggc cgccgcctga 5940
tggtgctgga cacgctgcgc cggttccaca tcgaggaaga aaacgccagc ggccccatgg 6000
cccaggtcat cggtcgcatg gaggccatcg ccgccgatac cgggtgctct atcgtgttcc 6060
tgcaccatgc cagcaagggc gcggccatga tgggcgcagg cgaccagcag caggccagcc 6120
ggggcagctc ggtactggtc gataacatcc gctggcagtc ctacctgtcg agcatgacca 6180
gcgccgaggc cgaggaatgg ggtgtggacg acgaccagcg ccggttcttc gtccgcttcg 6240
gtgtgagcaa ggccaactat ggcgcaccgt tcgctgatcg gtggttcagg cggcatgacg 6300
gcggggtgct caagcccgcc gtgctggaga ggcagcgcaa gagcaagggg gtgccccgtg 6360
gtgaagccta agaacaagca cagcctcagc cacgtccggc acgacccggc gcactgtctg 6420
gcccccggcc tgttccgtgc cctcaagcgg ggcgagcgca agcgcagcaa gctggacgtg 6480
acgtatgact acggcgacgg caagcggatc gagttcagcg gcccggagcc gctgggcgct 6540
gatgatctgc gcatcctgca agggctggtg gccatggctg ggcctaatgg cctagtgctt 6600
ggcccggaac ccaagaccga aggcggacgg cagctccggc tgttcctgga acccaagtgg 6660
gaggccgtca ccgctgatgc catggtggtc aaaggtagct atcgggcgct ggcaaaggaa 6720
atcggggcag aggtcgatag tggtggggcg ctcaagcaca tacaggactg catcgagcgc 6780
ctttggaagg tatccatcat cgcccagaat ggccgcaagc ggcaggggtt tcggctgctg 6840
tcggagtacg ccagcgacga ggcggacggg cgcctgtacg tggccctgaa ccccttgatc 6900
gcgcaggccg tcatgggtgg cggccagcat gtgcgcatca gcatggacga ggtgcgggcg 6960
ctggacagcg aaaccgcccg cctgctgcac cagcggctgt gtggctggat cgaccccggc 7020
aaaaccggca aggcttccat agataccttg tgcggctatg tctggccgtc agaggccagt 7080
ggttcgacca tgcgcaagcg ccgccagcgg gtgcgcgagg cgttgccgga gctggtcgcg 7140
ctgggctgga cggtaaccga gttcgcggcg ggcaagtacg acatcacccg gcccaaggcg 7200
gcaggctgac cccccccact ctattgtaaa caagacattt ttatctttta tattcaatgg 7260
cttattttcc tgctaattgg taataccatg aaaaatacca tgctcagaaa aggcttaaca 7320
atattttgaa aaattgccta ctgagcgctg ccgcacagct ccataggccg ctttcctggc 7380
ttatgctatt ctgctcctgc agctaatgga tcaccgcaaa caggttactc gcctggggat 7440
tccctttcga cccgagcatc cgtatgagac tcatgctcgg tcgacggtat cgataagctt 7500
gatatcg 7507
<210> 2
<211> 31
<212> DNA
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tacgcactag ttccactagg cgcggttatc a 31
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tacgcgcggc cgccgagcat gagtctcata cgg 33
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catgtgtcag aggttttcac cg 22
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gccagctgca ttaatgaatc g 21
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gcctttggaa ggtatccatc a 21
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cagcgaatag accagctatc c 21
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gttaccaatg cttaatcagt gagg 24
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gcttgagtgc ttcggtcttc 20
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caggcaacta tggatgaacg 20
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tcggtgatgg tcctgttctg 20
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ccagaaatca tccttagcga aag 23
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cgtggtgaag cctaagaaca ag 22
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catggtatta ccaattagca gg 22
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gtatgagtat tcaacatttc cgtgtc 26
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gttaccaatg cttaatcagt gagg 24
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cgtatagtta gatggccttt catgag 26
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ggtgtgcttt aagcttaacc ga 22
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gcctttggaa ggtatccatc a 21
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caatcaacgt ttgcgcctag 20
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tctcgtttgg attgcaactg 20
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gccgctctag aagtagtgga 20
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gcgtgatgcc agtttgctta 20
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gcacatcgac ggcgtattc 19
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aacgtgcagc atgatcagca tatggccggc atggtcccag 40
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ggccatatgc tgatcatgct gcacgttcac actccacaag ctag 44
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cggccgttca cactccacaa gctagctcgc aaaccc 36
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ctagcttgtg gagtgtgaac ggccggcatg gtcccag 37
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gaattccttg acaattaatc atccggctcg 30
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actagtccag aaatcatcct tagcgaaagc 30
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gaattcccat taaatggatg gcaaatatga c 31
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actagtgcaa gcattccact tacaattagg 30
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gaattcagca tccgtatgag actcatgctc gcgttacata tcaaagggaa aactg 55
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gattgtactg agagtgcacc ataatctcga gcgcatcctc acgataataa gc 52
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atagtttctg ttgcatgggc 20
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caggcaacta tggatgaacg 20
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ctatgtgtga ctgttgagct g 21
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ggtgcactct cagtacaatc gcgtagccag ctgcattaat g 41
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atgagtctca tacggatgct gaattccatc ggcgcaag 38
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actgagagtg caccataatc tcgaggccgc tctagaacta gtgga 45
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ttattatcgt gaggatgcgc tcgagtgagt aaacttggtc tgacag 46
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cacgaattgc agcgactca 19
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tcgtctgtgg cccatatctt 20

Claims (6)

1.一种基于IncQ型质粒泛宿主的功能基因递送载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1 获取IncQ质粒骨架：以pLHM-10-1质粒为模板，在mob区和rep区处设计引物进行PCR扩增，得到扩增产物；
S2 获取Amp抗性基因：以pUC19质粒为模板，在Amp区设计引物进行PCR扩增，得到扩增产物；
S3 将步骤S1和步骤S2得到的扩增产物进行电泳，纯化回收，然后进行片段重组，转化至大肠杆菌E.coli Dh5α感受态细胞复苏，再将其涂布于含有氨苄西林的培养基上；
S4 从步骤S3制备的培养基上挑取单菌落，进行菌落PCR，测序验证，得到所述递送载体pQ-mini，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
步骤S1所述引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示，所述扩增产物的大小为5367bp；
步骤S2所述引物序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，所述扩增产物的大小为2102bp。
2.根据权利要求1所述的一种基于IncQ型质粒泛宿主的功能基因递送载体的构建方法，其特征在于，步骤S3所述电泳为琼脂糖凝胶电泳。
3.根据权利要求1所述的一种基于IncQ型质粒泛宿主的功能基因递送载体的构建方法，其特征在于，步骤S3所述片段重组采用同源重组试剂盒的方法进行。
4.根据权利要求1所述的一种基于IncQ型质粒泛宿主的功能基因递送载体的构建方法，其特征在于，步骤S3所述氨苄西林终浓度为100μg/mL。
5.权利要求1-4任一项所述方法构建得到的一种基于IncQ型质粒泛宿主的功能基因递送载体。
6.权利要求5所述的一种基于IncQ型质粒泛宿主的功能基因递送载体在跨宿主递送不同功能基因方面的应用，其特征在于，将所述功能基因通过酶切-连接的方式载入递送载体，之后通过膜法接合转移的方式实现功能基因跨宿主递送，所述功能基因包括绿色荧光蛋白基因、化学发光基因、CRISPR相关基因；
所述CRISPR相关基因是指Cas12f1编码基因及sgRNA编码基因；
膜法接合转移中将所述递送载体pQ-mini转入大肠杆菌E.coli WM3064中，以转入成功的大肠杆菌E. coli WM3064/pQ-mini为供体，以大肠杆菌E. coli ATCC 25922、沙门菌S. typhimurium ATCC 14028、阴沟肠杆菌E. cloacae ATCC 13047、鲍曼不动杆菌A. baumannii ADP1、粪肠球菌E. faecalis ATCC 29212、金黄色葡萄球菌S. aureus ATCC29213、无乳链球菌S. agalactiae ATCC 12386、奇异变形杆菌P. mirabilis ATCC 35659、弗氏柠檬酸杆菌C. freundii ATCC 43864、肺炎克雷伯菌K. pneumoniae ATCC 700603、小韦荣氏球菌V. parvula ATCC 10790、产气荚膜梭菌C. perfringens ATCC 13124中的其中一种为受体。
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