CN102241763A

CN102241763A - 一种鱼类持续激活生长激素受体基因及制备方法和用途

Info

Publication number: CN102241763A
Application number: CN2011101410847A
Authority: CN
Inventors: 孙永华; 朱作言; 熊凤; 伊斯提亚克; 迈克沃特斯
Original assignee: Institute of Hydrobiology of CAS
Current assignee: Institute of Hydrobiology of CAS
Priority date: 2011-05-27
Filing date: 2011-05-27
Publication date: 2011-11-16
Anticipated expiration: 2031-05-27
Also published as: CN102241763B

Abstract

本发明公开了一种鱼类持续激活生长激素受体基因及制备方法和用途。通过对鲤鱼GHR信号肽、c-Jun亮氨酸拉链区以及GHR跨膜区和胞内区分别采取PCR扩增，结合又一轮的搭桥PCR扩增，获得持续激活的GHR重组基因片段；将获得的重组基因克隆入表达载体pCA-AT，获得用于基因转移的重组基因载体pCA-SJG-AT。一种编码的蛋白质，其序列为SEQIDNO:1所示的氨基酸序列，一种分离的重组基因，其序列为SEQIDNO:2所示的核苷酸序列。该重组基因在快速生长转基因鱼中的应用，具有如下优点：（1）重组GHR蛋白的促进信号通路活性高，持续激活的GHR作用比GH作用的效率高3倍以上；（2）持续激活的GHR基因的转基因促生长效应显著，转基因鱼比对照鱼生长速度快50%以上。

Description

一种鱼类持续激活生长激素受体基因及制备方法和用途

技术领域

本发明属于水产经济动物基因工程育种技术领域，本发明涉及一种持续激活鱼类生长激素信号通路和促进鱼类生长的重组基因，还涉及该重组基因的制备方法，同时还涉及一种重组基因在鱼类基因工程育种中的用途。

背景技术

生长速度是水产养殖动物最重要的经济性状之一。在自然捕捞资源有限并日渐匮乏的情况下，如何提高提高养殖鱼类的生长速度和产量，已成为当前的一个紧迫课题。同时，提高养殖鱼类的生长速度可以加快商品鱼上市周期和提供更高质量的养殖鱼类新品种，提高经济效益。因此，通过基因工程的技术研制具有快速生长效应的养殖鱼类新品种具有重要的实际应用价值(Chen，T.T.，N.H.Vrolijk，et al.(1996).″Transgenic fish andits application in basic and applied research.″Biotechnol Annu Rev 2：205-236；Fu，C.，W.Hu，et al.(2005).″Developments in transgenic fish in the People′s Republic of China.″Rev Sci Tech 24(1)：299-307.)。

自本实验室在1985年率先开展快速生长转基因鱼研究以来(Zhu，Z.，G.Li，et al.(1985).″Novel gene transfer into the fertilized eggs of gold fish(Carassius auratus L.1758).″Journal of Applied Ichthyology 1(1)：31-34.)，全球范围内有数十家实验室开展了转基因鱼相关的研究工作。在一些主养经济鱼类物种，如鲤鱼、罗非鱼、鲶鱼、鲑鱼等30多种鱼中，都进行了转基因的研究(Zhu，Z.Y.and Y.H.Sun(2000).″Embryonic and geneticmanipulation in fish.″Cell Res 10(1)：17-27.Wu，G.，Y.Sun，et al.(2003).″Growth hormonegene transfer in common carp.″Aquat.Living Resour 16：416-420.Devlin，R.H.，L.F.Sundstrom，et al.(2006).″Interface of biotechnology and ecology for environmental riskassessments of transgenic fish.″Trends Biotechnol 24(2)：89-97.)。在所有提高受试鱼生长速度为目的的研究中，均无一例外地使用了生长激素(GH)基因作为目标基因。然而，由于GH信号通路的负反馈效应，和受试鱼多样的遗传背景，外源GH基因转移导致的促生长效应在不同鱼中的效应不尽一致(Devlin，R.H.，C.A.Biagi，et al.(2001).″Growthofdomesticated transgenic fish.″Nature 409(6822)：781-782 Devlin，R.H.，D.Sakhrani，etal.(2009).″Domestication and growth hormone transgenesis cause similar changes in geneexpression in coho salmon(Oncorhynchus kisutch).″Proc Natl Acad Sci U S A 106(9)：3047-3052.)。

广为所知的是，GH需要与体内生长激素受体(GHR)结合，通过GHR介导的信号通路的活化来促进机体生长(Lichanska，A.M.and M.J.Waters(2008).″How growthhormone controls growth，obesity and sexual dimorphism.″Trends Genet 24(1)：41-47.)。GHR是一种I型细胞因子受体，它由膜外区、跨膜区和胞内区组成。GH通过与GHR的膜外区相结合使两个GHR蛋白形成二聚体结构，从而导致GHR胞内区JAK2激酶活性的激活(Herrington，J.and C.Carter-Su(2001).″Signaling pathways activated by thegrowth hormone receptor.″Trends Endocrinol Metab 12(6)：252-257.Waters，M.J.，H.N.Hoang，et al.(2006).″New insights into growth hormone action.″J Mol Endocrinol 36(1)：1-7.)。通过Stat5因子的磷酸化等一系列胞内的信号传导途径，最终激活igfl等靶基因的转录(Cesena，T.I.，T.X.Cui，et al.(2007).″Multiple mechanisms of growthhormone-regulated gene transcription.″Mol Genet Metab 90(2)：126-133.)。因此我们提出，通过将GHR的膜外区用一个特殊的亮氨酸拉链替代，可以使GHR分子持续形成二聚体结构，从而导致GHR信号通路的持续激活；通过对GHR蛋白进行分子设计，可以获得更高活性的GHR分子；以这一激活型的GHR分子进行基因转移，则可以获得新型和高效的快速生长转基因鱼。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种鱼类持续激活生长激素受体(GHR)基因，该持续激活的GHR分子由“全鱼”GHR信号肽、“全鱼”亮氨酸拉链、“全鱼”GHR跨膜区和胞内区依序组成，能够在体内持续形成GHR的二聚体结构，从而持续激活GHR信号通路。

本发明的另一个目的是在于提供了一种鱼类持续激活生长激素受体基因的制备方法。该方法易行，操作简便。该持续激活的GHR重组基因由编码“全鱼”GHR信号肽、“全鱼”亮氨酸拉链、“全鱼”GHR跨膜区和胞内区的基因片段依序组成，通过连接型聚合酶链式(PCR)反应，将这些基因片段无缝连接，形成持续激活的GHR重组基因。

本发明还有一个目的是在于提供了一种鱼类持续激活生长激素受体基因在制备快速生长转基因斑马鱼(鲤鱼、团头鲂、黄颡鱼)中的应用。该重组基因由于以cJun基因的亮氨酸拉链结构替换GHR的胞外区，可以持续形成二聚体结构，因此其过表达促进GH信号通路的活性高，比普通GH转基因促进信号通路的活性高3倍以上。该重组基因被显微注射入斑马鱼(鲤鱼、团头鲂、黄颡鱼)受精卵中，通过进一步筛选获得快速生长的转基因鱼。转基因促生长效应显著，转基因斑马鱼(鲤鱼、团头鲂、黄颡鱼)平均生长速度比对照鱼快50％以上。

为了实现上述的目的，本发明采用了以下技术措施：

通过生物信息学方法，设计了持续激活的重组生长激素受体的蛋白分子。

该重组蛋白分子包含编码鲤鱼GHR信号肽，鲤鱼c-Jun亮氨酸拉链区，鲤鱼GHR跨膜区和胞内区的基因序列，其氨基酸序列包含如下序列：

1)鲤鱼GHR信号肽：

MAYSLSLGLLYLGLLCGNGLVSARSE

2)鲤鱼c-Jun亮氨酸拉链区：

RIKAERKRLRNRLAATKCRKRKLERISRLEEKVKVLKNDNAGLSNTASVLRDQVAQLKQKV

3)鲤鱼GHR跨膜区和胞内区：

LRVAQIPSKESTFPTTLVLIFGVIGVVILLVLLIFSQQQRLMVIFLPPIPAPKIKGIDPELLKNGKLDQLNSLLSSQDMYKPDFYHEDPWVEFIQLDLDDPAEKNESSDTQHLLGLSRSGSSHFLNFKSDNDSGRASCYDPEIPNPKDLASFLPGHSGRGDNHPLVSRSSSSIPDLGFQQTSEVEETPIQTQPAVPSWVNMDFYAQVSDFTPAGGVVLSPGQLNSSPVKKKGEGNEKKIQFQLLSDGAYTSENTARLLSADVPPSPGPEQGYQAFPTQAVEGNLWNGEYLVSANDSQTPCLVPEAPPAPILPPVSDYTVVQEVDAQHSLLLNPPSSQPAICPHSPNKHLPVIPTMPMGYLTPDLLGNLNP

其中GHR信号肽可以将重组蛋白分子运输到细胞膜上，c-Jun基因的亮氨酸拉链区可以使GHR分子持续形成二聚体结构，GHR的跨膜区和胞内区可以传导GHR信号，从而激活下游信号通路。

一种鱼类持续激活生长激素受体基因的制备方法，其步骤是：

1)引物设计。

为扩增鲤鱼GHR信号肽的引物：

JSP_F：AGATCGATCACCCGGGAGCCACCATGGCTTACTCTCTCTCGCTC

JSP_R：TTTCCGCCTTGATGCGCTCGGATCTTGCAGACACCAG

扩增c-Jun拉链区的引物：

J_F：CAAGATCCGAGCGCATCAAGGCGGAAAGGAAGAG

J_R：CTTGGTATCTGTGCCACTCTCAGGACTTTCTGTTTGAGTTG

为扩增GHR跨膜区和信号传导区的引物：

JG_F：CCTGAGAGTGGCACAGATACCAAGCAAAG

JG_R：GTTCTCGAGATTCATGGGTTCAGGTTTCCCAGAAG

2)对GHR信号肽，c-Jun亮氨酸拉链区，GHR跨膜区和胞内区，分别采取PCR扩增。

以JSP_F和JSP_R引物对GHR信号肽进行扩增，PCR条件为：95℃预变性4分钟；95℃变性30秒，66℃复性30秒，68℃延升30秒，13个循环；68℃延升10分钟；4℃保存。

以J_F和J_R引物对c-Jun亮氨酸拉链区进行扩增，PCR条件为：95℃预变性4分钟；95℃变性30秒，59℃复性30秒，68℃延升30秒，18个循环；68℃延升10分钟；4℃保存。

以JG_F和JG_R引物对GHR跨膜区和胞内区进行扩增，PCR条件为：95℃预变性4分钟；95℃变性30秒，63℃复性30秒，68℃延升90秒，20个循环；68℃延升10分钟；4℃保存。

3)对扩增的三个基因片段，采取又一轮PCR扩增，获得持续激活的GHR重组基因片段。

用JSP_F和JG_R引物进行连接PCR，将GHR信号肽，亮氨酸拉链区，GHR跨膜区和胞内区连接成一个新的分子片段，PCR扩增条件为：95℃预变性4分钟；95℃变性30秒，66-62℃(每个循环降0.5℃)复性30秒，68℃延升90秒，10个循环；95℃变性30秒，63℃复性30秒，68℃延升90秒，10个循环；68℃延升10分钟；4℃保存。

4)将获得的重组基因片段及人工合成的表达载体pCA-AT连接成重组基因载体pCA-SJG-AT。

将重组基因片段及人工合成的表达载体pCA-AT用限制性内切酶SmaI和XhoI双酶切，利用T4连接酶连接(常规方法，分子克隆实验指南，第二版，J.萨姆布鲁克等著，科学出版社，1993)。转化大肠杆菌TOP10菌株(购自Invitrogen公司)，利用引物F：CCGCAAAGCGTCTCAAACCAT，R：GTTTCCACACAGCAAGCCCAG进行PCR筛选阳性克隆，见图2。经序列测定，获得用于基因转移的重组基因载体pCA-SJG-AT。该重组基因编码一种蛋白质，其序列为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；一种分离的重组基因，其序列为SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

该序列在SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列导入到斑马鱼胚胎中，可以翻译为SEQID NO：1所示氨基酸序列的蛋白质。其中GHR信号肽可以将重组蛋白分子运输到细胞膜上，c-Jun基因的亮氨酸拉链区可以使GHR分子持续形成二聚体结构，GHR的跨膜区和胞内区可以传导GHR信号，从而激活下游信号通路。该SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列组成的重组基因可以显著促进GH信号通路，利用GH信号通路的靶基因IGF1的表达水平进行检测，发现重组基因促进GH信号通路的活性比普通GH促进信号通路的活性高3倍以上，见图3。

一种鱼类持续激活生长激素受体基因在制备快速生长转基因斑马鱼(鲤鱼、团头鲂、黄颡鱼)中的应用，其步骤是：

1)转基因斑马鱼(鲤鱼、团头鲂、黄颡鱼)的制备。通过显微注射仪和显微注射法(Zhu Z，Li G，He L，et al.Novel gene transfer into the fertilized eggs of goldfish(Carassius auratus L.1758).Z angew Ichthyol，1985，1：31-34)将含重组基因的表达载体pCA-SJG-AT导入斑马鱼(鲤鱼、团头鲂、黄颡鱼)受精卵中。

2)筛选具有快速生长效应的转基因鱼。通过重组基因在受试鱼体内的PCR检测，筛选获得含有该重组基因且生长快速的转基因鱼。

检测pCA-SJG-AT转基因鱼的引物为：

F：CCGCAAAGCGTCTCAAACCAT，R：GTTTCCACACAGCAAGCCCAG

PCR条件为：

95℃预变性4分钟；95℃变性30秒，58℃复性30秒，72℃延升30秒，35个循环；72℃延升5分钟。检测电泳图见图4。

3)转基因阳性鱼和对照鱼饲养于同样条件下，每月测定体重，转基因鱼的平均体重比对照鱼重50％以上。结果见图5。

本发明专利具有如下优点和效果：(1)重组GHR蛋白的促进信号通路活性高，靶基因的转录分析表明，持续激活的GHR作用比GH作用的效率高3倍以上；(2)持续激活的GHR基因的转基因促生长效应显著，转基因鱼比对照鱼生长速度快50％以上。

附图说明

图1为一种表达载体pCA-SJG-AT示意图。

注：鲤鱼肌动蛋白基因的启动子，长2513bp；鲤鱼c-Jun基因的亮氨酸拉链区，长177bp；鲤鱼生长激素受体基因跨膜区和信号传导区，长1107bp；鲤鱼肌动蛋白基因的终止子区，长696bp。

图2为一种表达载体pCA-SJG-AT的PCR阳性克隆鉴定电泳图。

注：M：DNAMarker DL2000；1：阴性克隆；2-9：阳性克隆。

图3为一种表达载体pCA-SJG-AT促进GH信号通路的活性分析结果。

注：WT：为野生型胚胎；GH：为注射了GH表达载体的胚胎；CA-GHR：为注射了重组基因载体pCA-SJG-AT的胚胎；Y轴示IGF1表达水平高低。卡方检验比较两者的IGF1表达水平，**表示两组之间具有统计学上的极显著性差异(P＜0.01)。

图4为一种表达载体pCA-SJG-AT在转基因鱼中的PCR鉴定电泳图。

注：M：DNAMarker DL2000；1-17：不同的转基因鱼个体。

图5为一种pCA-SJG-AT转基因斑马鱼的生长示意图。

注：WT：为野生型鱼；Jun-GHR：为pCA-SJG-AT转基因鱼。卡方检验比较两者的体重，**表示两组之间具有统计学上的极显著性差异(P＜0.01)。

具体实施方式

实施例1：

持续激活的重组生长激素受体的重组蛋白的分子设计

通过蛋白质结构预测(http://swissmodel.expasy.org//SWISS-MODEL.html)SWISS-MODEL程序和蛋白质结构分析(http://swissmodel.expasy.org/spdbv/)Swiss-PdbViewer程序，基于我们前期对GHR信号通路的深刻认识，分子设计了持续激活型的重组生长激素受体分子：

1)鲤鱼GHR信号肽：

MAYSLSLGLLYLGLLCGNGLVSARSE

2)鲤鱼c-Jun亮氨酸拉链区：

RIKAERKRLRNRLAATKCRKRKLERISRLEEKVKVLKNDNAGLSNTASVLRDQVAQLKQKV

4)鲤鱼GHR跨膜区和胞内区：

实施例2：

持续激活的GHR重组基因的制备

1)引物设计。

扩增GHR信号肽的引物：

F：CAGATCGATCACCCGGGAGCCACCATGGCTTACTCTCTCTCGCTC

R：TTTCCGCCTTGATGCGCTCGGATCTTGCAGACACCAG

扩增c-Jun拉链区的引物：

F：CAAGATCCGAGCGCATCAAGGCGGAAAGGAAGAG

R：CTTGGTATCTGTGCCACTCTCAGGACTTTCTGTTTGAGTTG

扩增GHR信号传递区的引物：

F：CCTGAGAGTGGCACAGATACCAAGCAAAG

R：GTTCTCGAGATTCATGGGTTCAGGTTTCCCAGAAG

GHR信号肽扩增条件为：95℃预变性4分钟；95℃变性30秒，66℃复性30秒，68℃延升30秒，13个循环；68℃延升10分钟；4℃保存。

c-Jun亮氨酸拉链区扩增条件为：95℃预变性4分钟；95℃变性30秒，59℃复性30秒，68℃延升30秒，18个循环；68℃延升10分钟；4℃保存。

GHR跨膜区和胞内区扩增条件为：95℃预变性4分钟；95℃变性30秒，63℃复性30秒，68℃延升90秒，20个循环；68℃延升10分钟；4℃保存。

3)对扩增的3个基因片段，采取又一轮PCR扩增，获得持续激活的GHR重组基因片段。

用连接PCR的方法将GHR信号肽，亮氨酸拉链区，GHR跨膜区和胞内区连接成一个新的分子片段，扩增条件为：95℃预变性4分钟；95℃变性30秒，66-62℃(每个循环降0.5℃)复性30秒，68℃延升90秒，10个循环；95℃变性30秒，63℃复性30秒，68℃延升90秒，10个循环；68℃延升10分钟；4℃保存。

4)将获得的重组基因克隆入改造后的表达载体pCA-AT，获得用于基因转移的重组基因。

将重组基因片段及人工合成的表达载体pCA-AT用限制性内切酶SmaI和XhoI双酶切，利用T4连接酶连接(常规方法，分子克隆实验指南，第二版，J.萨姆布鲁克等著，科学出版社，1993)。转化大肠杆菌菌株，利用引物F：CCGCAAAGCGTCTCAAACCAT，R：GTTTCCACACAGCAAGCCCAG进行PCR筛选阳性克隆，见图2。经序列测定，获得用于基因转移的重组基因载体pCA-SJG-AT。该重组基因编码一种蛋白质，其序列为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；一种分离的重组基因，其序列为SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。在SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列导入到斑马鱼胚胎中，可以翻译为SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的蛋白质，其中GHR信号肽可以将重组蛋白分子运输到细胞膜上，c-Jun基因的亮氨酸拉链区可以使GHR分子持续形成二聚体结构，GHR的跨膜区和胞内区可以传导GHR信号，从而激活下游信号通路。SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的重组基因表达促进GH信号通路的活性比普通GH促进信号通路的活性高3倍以上，见图3。该持续激活的GHR重组基因载体pCA-SJG-AT如图1所示。

实施例3：

一种持续激活的生长激素受体基因在斑马鱼中的应用。

1)转基因斑马鱼的制备：

以斑马鱼为对象，制备转持续激活GHR基因斑马鱼。将表达载体pCA-SJG-AT经质粒小量制备试剂盒(Axygen公司)提取质粒DNA后，溶于ST溶液(88mmol/l NaCl，10mmol/l Tris-HCl，pH 7.5)中，调节其终浓度为85ng/μl，采用显微注射的方法(Zhu Z，Li G，He L，et al.Novel gene transfer into the fertilized eggs of goldfish(Carassius auratusL.1758).Z angew Ichthyol，1985，1：31-34)，在第一次卵裂前将DNA溶液导入斑马鱼受精卵动物极，DNA注射剂量1-2nl/卵，完成显微操作后的受精卵置于28.5℃水温孵化和养殖。

2)快速生长转持续激活GHR基因鱼的筛选：

在鱼缸中养殖3个月后，取约0.1-0.2cm²上述转基因鱼尾鳍组织，参考常规酚/氯仿法提取DNA，进行转基因检测。常规酚/氯仿法：在1.5ml管中加入0.4ml DNA抽提掖(10mmol/L EDTA，10mmol/L Tris·HCl，300mmol/L NaCl，2％(重量体积比g/L)SDS)，55℃水浴1-2h后，于37℃水浴消化过夜；消化的组织液分别用酚、酚/氯仿、氯仿个抽提一次；加入2.5倍体积酒精，将沉淀立即放入另一离心管中；然后加入70％(体积比)乙醇洗涤一次，高速离心1min；倒尽乙醇，37℃恒温培养箱放置15min，加入适当体积含RNase的TE(含RNase，20mg/ml)溶解DNA。

采用PCR技术检测pCA-SJG-AT在转基因鱼中的整合情况。正向检测引物为(CCGCAAAGCGTCTCAAACCAT)，反向检测引物为(GTTTCCACACAGCAAGCCCAG)。

PCR反应条件如下：95℃预变性4分钟；95℃变性30秒，58℃复性30秒，72℃延升30秒，35个循环；72℃延升5分钟。目的片段长度为311bp，证实pCA-SJG-AT整合到转基因鱼基因组中。

将经PCR检测获得的P₀代转基因鱼及其对照鱼分别在同等条件下养殖，约20％的转基因鱼比对照鱼最大个体大，平均体重是对照鱼的1.5倍以上。

将上述快速生长的转pCA-SJG-AT基因鱼在养殖至性成熟后，与对照鱼杂交，筛选转基因阳性的F₁代转基因鱼并继续养殖，从而获得具有快速生长特性的转基因鱼家系。

实施例4：

一种持续激活的生长激素受体基因在快速生长转基因鲤鱼、团头鲂或黄颡鱼中的应用。

1)转基因鲤鱼、团头鲂或黄颡鱼的制备

以中国重要的经济性养殖鱼类鲤鱼、团头鲂和黄颡鱼为对象，制备转持续激活GHR基因鲤鱼、团头鲂和黄颡鱼。将表达载体pCA-SJG-AT经质粒小量制备试剂盒(Axygen公司)提取质粒DNA后，溶于ST溶液(88mmol/l NaCl，10mmol/l Tris-HCl，pH 7.5)中，调节其终浓度为85ng/μl，采用显微注射的方法(Zhu Z，Li G，He L，et al.Novel genetransfer into the fertilized eggs of goldfish(Carassius auratus L.1758).Z angew Ichthyol，1985，1：31-34)，在第一次卵裂前将DNA溶液导入鲤鱼(团头鲂、黄颡鱼)受精卵动物极，DNA注射剂量1-2nl/卵，完成显微操作后的受精卵按常规方法进行孵化和养殖(申玉春，2008，鱼类增养殖学，中国农业出版社)。

2)快速生长转持续激活GHR基因鱼的筛选：

将pCA-SJG-AT载体通过显微操作转入鲤鱼、团头鲂或黄颡鱼受精卵后，室温(20-25℃，以下相同)孵化，后置于鱼塘中养殖。在鱼塘中养殖3个月后，取约0.1-0.2cm²上述转基因鱼尾鳍组织，参考常规酚/氯仿法提取DNA，进行转基因检测。常规酚/氯仿法：在1.5ml管中加入0.4ml DNA抽提掖(10mmol/L EDTA，10mmol/L Tris·HCl，300mmol/LNaCl，2％(重量体积比g/L)SDS)，55℃水浴1-2h后，于37℃水浴消化过夜；消化的组织液分别用酚、酚/氯仿、氯仿个抽提一次；加入2.5倍体积酒精，将沉淀立即放入另一离心管中；然后加入70％(体积比)乙醇洗涤一次，高速离心1min；倒尽乙醇，37℃恒温培养箱放置15min，加入适当体积含RNase的TE (含RNase，20mg/ml)溶解DNA。

将经PCR检测获得的P₀代转基因鱼及其对照鱼分别在相同池塘中按同等养殖方法常规养殖(申玉春，2008，鱼类增养殖学，中国农业出版社)。在池塘中经1年期的养殖观察，约20％的转基因鱼比对照鱼最大个体大，平均体重是对照鱼的1.5倍以上。

将上述快速生长的转pCA-SJG-AT基因鱼在池塘养殖至性成熟后，与对照鱼杂交，筛选转基因阳性的F₁代转基因鱼并继续养殖，从而获得具有快速生长特性的转基因鱼家系。鲤鱼、团头鲂和黄颡鱼的养殖及繁殖等均按常规操作进行(申玉春，2008，鱼类增养殖学，中国农业出版社)。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院水生生物研究所

<120> 一种鱼类持续激活生长激素受体基因及制备方法和用途

<130> 一种鱼类持续激活生长激素受体基因及制备方法和用途

<160> 2

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 457

<212> PRT

<213> 鲤鱼

<220>

<221> signal peptide of common carp GHR

<222> (1)..(26)

<223>

<220>

<221> Leucine zipper domain of common carp c-Jun

<222> (27)..(87)

<223>

<220>

<221> common carp GHR transmembrane and intracellular domain

<222> (88)..(457)

<223>

<400> 1

Met Ala Tyr Ser Leu Ser Leu Gly Leu Leu Tyr Leu Gly Leu Leu Cys

1 5 10 15

Gly Asn Gly Leu Val Ser Ala Arg Ser Glu Arg Ile Lys Ala Glu Arg

20 25 30

Lys Arg Leu Arg Asn Arg Leu Ala Ala Thr Lys Cys Arg Lys Arg Lys

35 40 45

Leu Glu Arg Ile Ser Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Val Leu Lys Asn

50 55 60

Asp Asn Ala Gly Leu Ser Asn Thr Ala Ser Val Leu Arg Asp Gln Val

65 70 75 80

Ala Gln Leu Lys Gln Lys Val Leu Arg Val Ala Gln Ile Pro Ser Lys

85 90 95

Glu Ser Thr Phe Pro Thr Thr Leu Val Leu Ile Phe Gly Val Ile Gly

100 105 110

Val Val Ile Leu Leu Val Leu Leu Ile Phe Ser Gln Gln Gln Arg Leu

115 120 125

Met Val Ile Phe Leu Pro Pro Ile Pro Ala Pro Lys Ile Lys Gly Ile

130 135 140

Asp Pro Glu Leu Leu Lys Asn Gly Lys Leu Asp Gln Leu Asn Ser Leu

145 150 155 160

Leu Ser Ser Gln Asp Met Tyr Lys Pro Asp Phe Tyr His Glu Asp Pro

165 170 175

Trp Val Glu Phe Ile Gln Leu Asp Leu Asp Asp Pro Ala Glu Lys Asn

180 185 190

Glu Ser Ser Asp Thr Gln His Leu Leu Gly Leu Ser Arg Ser Gly Ser

195 200 205

Ser His Phe Leu Asn Phe Lys Ser Asp Asn Asp Ser Gly Arg Ala Ser

210 215 220

Cys Tyr Asp Pro Glu Ile Pro Asn Pro Lys Asp Leu Ala Ser Phe Leu

225 230 235 240

Pro Gly His Ser Gly Arg Gly Asp Asn His Pro Leu Val Ser Arg Ser

245 250 255

Ser Ser Ser Ile Pro Asp Leu Gly Phe Gln Gln Thr Ser Glu Val Glu

260 265 270

Glu Thr Pro Ile Gln Thr Gln Pro Ala Val Pro Ser Trp Val Asn Met

275 280 285

Asp Phe Tyr Ala Gln Val Ser Asp Phe Thr Pro Ala Gly Gly Val Val

290 295 300

Leu Ser Pro Gly Gln Leu Asn Ser Ser Pro Val Lys Lys Lys Gly Glu

305 310 315 320

Gly Asn Glu Lys Lys Ile Gln Phe Gln Leu Leu Ser Asp Gly Ala Tyr

325 330 335

Thr Ser Glu Asn Thr Ala Arg Leu Leu Ser Ala Asp Val Pro Pro Ser

340 345 350

Pro Gly Pro Glu Gln Gly Tyr Gln Ala Phe Pro Thr Gln Ala Val Glu

355 360 365

Gly Asn Leu Trp Asn Gly Glu Tyr Leu Val Ser Ala Asn Asp Ser Gln

370 375 380

Thr Pro Cys Leu Val Pro Glu Ala Pro Pro Ala Pro Ile Leu Pro Pro

385 390 395 400

Val Ser Asp Tyr Thr Val Val Gln Glu Val Asp Ala Gln His Ser Leu

405 410 415

Leu Leu Asn Pro Pro Ser Ser Gln Pro Ala Ile Cys Pro His Ser Pro

420 425 430

Asn Lys His Leu Pro Val Ile Pro Thr Met Pro Met Gly Tyr Leu Thr

435 440 445

Pro Asp Leu Leu Gly Asn Leu Asn Pro

450 455

<210> 2

<211> 8246

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<221> leucine zipper domain of common carp c-Jun

<222> (2876)..(3052)

<223>

<220>

<221> transmembrane and intra-cellular domain of common carp GHR

<222> (3059)..(4165)

<223>

<220>

<221> signal peptide of common carp GHR

<222> (2792)..(2869)

<223>

<400> 2

aagctttggt caagaaccag aggtgtaaag tacttgagta attttacttg attactgtac 60

ttaagtatta tttttgggga tttttacttt acttgagtac aattaaaaat caatactttt 120

acttttactt aattacattt ttttagaaaa aaaagtactt tttactcctt acaattttat 180

ttacagtcaa aaagtactta ttttttggag atcacttcat tctattttcc cttgctatta 240

ccaagctttt agaccttctt acttttgggg attatataag tattttctca ataaatatct 300

catatcttac tgtggtttaa ctgctgaatc taaaatttta atacaaaagt agttatattt 360

gttgtacatt gtaaactata acttaacttc agtttcagag aaactcatgt gctcaaaatg 420

taaaaaaagt ttcctgttaa atattttgta aatgtattga agacaaaata agaaaaaaaa 480

aatataagcc actaaatcac actgtccttg gtatcagcaa gagattctga cataatcagc 540

tgtttttgtt tattactgcc attgaaggcc atgtgcatta gtcccaagtt acacattaaa 600

aagtcacatg tagcttacca acatcagtgc tgttcaagca cagcctcatc tactattcaa 660

actgtggcac catctaaaat atgccagaat ttttttattt aatgaatttg accctgaaat 720

atgtattaat atcactcctg tgattttttt gtaatcagct tacaattaca ggaatgcaag 780

cctgattcat tacaagtttc actacacttt ctctgacaac atcacctact gaactcagac 840

cagctagttg ctccttaagt atacaatcat gtcactaatc ctcatttcaa tgaaaaatac 900

ccctattgta cttggtactt ggtagataac cacagagcag tattatgcca ttattgtgaa 960

tacaataaga ggtaaatgac ctacagagct gctgctgctg ttgtgttaga ttgtaaacac 1020

agcacaggat caaggaggtg tccatcacta tgaccaatac tagcactttg cacaggctct 1080

ttgaaaggct gaaaagagcc ttattggcgt tatcacaaca aaatacgcaa atacggaaaa 1140

caacgtattg aacttcgcaa acaaaaaaca gcgattttga tgaaaatcgc ttagggatcc 1200

ccccttgctc ttcaaacaat ccagcttctc cttctttcac tctcaagttg caagaagcaa 1260

gtgtagcaat gtgcacgcga cagccgggtg tgtgacgctg gaccaatcag agcgcagagc 1320

tccgaaagtt taccttttat ggctagagcc gggcatctgc cgtcatataa aagagcgcgc 1380

ccagcgtctc agcctcactt tgagctcctc cacacgcagc tagtgcggaa tatcatctgc 1440

ctgtaaccca ttctctaaag tcgacaaacc cccccaaacc taaggtgagt tgatctttaa 1500

gctagctttt tacattttca gctcgcatat atcaattcga acgtttaatt agaatgttta 1560

aataaagcca gattaaatga ttaggctcag ttaccggtct tttttttctc atttacgtgc 1620

gaactctgct taaactctag ttattcttta ttaatatgtg gttattttta tatatgtatg 1680

tgttatcata actgtactgg ctatgtcagg tggtaatgac tgtaacgtta cgttactcgt 1740

tgtaggcacg acattgaatg ggccggtgtt gaaataagtc ttcaacccct tttaacctca 1800

aaatgtgctc tggttaacaa ggattttaac agctatcagt atgactgtgc ggttttaaag 1860

ccgttagtga ggcacgttgc acacttgatg gatggccgga atgggaagtt ctttatgcag 1920

gcagtgctgc agcagggtgt gacctacttt agctaacgtt agccggctaa ccagcattca 1980

tctgccggta acttgagtct aatattctct catgtgatat cgaagtgatc aaagacacgt 2040

ctgttagctc actttaacca actgtagtga aaaatagcgc agtgtgcagc ccttcagtct 2100

ttcatttagg ctgattattc aatcatttta ttaactatta acgcgttact aaacgtaagg 2160

taacgtagtc agtttttaat aactggtgaa aagtactggt tgggtttaaa tggtgactta 2220

taattgtgtt ggagggggaa acctttttga taaaggctat ataatctcaa atgaatgggc 2280

tgaggatggt gttcacaggt gctttagtga agtccgctcg tgaagagtcg ctgaagtgac 2340

tgcagatctg tgacgcagtc gttttgggca gacggccgtt gaaattcggt tgagtaattg 2400

ataccaggtg aggctagagg atgtagaaat tcatttgtgt agaatttagg gagtggccct 2460

ggcgtgatga atgtcgaaat ccgttccttt ttactgaacc ctatgtctct ggctgagtgc 2520

cacaccgccg gcagccgcaa agcgtctcaa accattgcct tttatggtaa taatgagaat 2580

gcagagggac ttcctttgtc tggcacatct gaggcgcgca ttgtcacact agcacccact 2640

agcggtcaga ctgcagattg cagcacgaaa caggaagctg actccacatg gtcacatgct 2700

cactgaagtg ttgacttccc tgacagctgt gcactttcta aaccggtttt ctcattcatt 2760

tacagttcag atcgatcacc cgggagccac catggcttac tctctctcgc tcggtctgct 2820

ctacctgggc ttgctgtgtg gaaacggact ggtgtctgca agatccgagc gcatcaaggc 2880

ggaaaggaag aggctccgga accgactggc ggccaccaaa tgccgcaagc gcaaactgga 2940

acgcatctcc cggctggagg agaaagtgaa ggtgctcaag aacgacaacg ccggcctgtc 3000

caacaccgcc tccgtcctgc gggaccaggt ggcccaactc aaacagaaag tcctgagagt 3060

ggcacagata ccaagcaaag aatcaacgtt cccgacgacg ttggtgttga tttttggagt 3120

gattggagtg gtgattcttc ttgtcctcct catcttctct caacaacaga ggttgatggt 3180

aatattttta ccacctattc ctgcacctaa aataaaaggc atcgacccag agctgctgaa 3240

gaatggaaag cttgaccagc tcaattcttt gctgagcagt caggatatgt acaagccgga 3300

cttctaccat gaggatccat gggtggagtt catccagctg gaccttgatg accctgcaga 3360

gaagaatgag agttctgata cacaacatct gctgggcttg tctcgctcag gctcttctca 3420

cttccttaat ttcaaaagtg acaacgattc gggtcgtgct agctgctacg acccagaaat 3480

cccaaatccc aaggacttgg cttcttttct gcctggccat tcaggacgag gagataacca 3540

ccctctggtt tccagaagca gctcatccat ccctgatctt ggtttccagc agacatcaga 3600

agtggaggag actcccattc aaacgcaacc agctgtgccc agctgggtta acatggactt 3660

ttatgcccaa gtaagtgatt tcacaccagc aggaggtgtc gtgctttcac ctggacaact 3720

gaacagctct ccagtgaaaa agaagggaga agggaatgag aagaagatac aattccagtt 3780

gctttccgat ggagcctaca cctcagagaa cacagccagg ctgctttctg ccgatgtgcc 3840

acccagccct ggtcctgagc aggggtacca agcattccca acccaagccg ttgaggggaa 3900

cctctggaat ggtgagtacc tggtgtccgc caatgattcc cagacgccgt gcctggttcc 3960

tgaagctcct ccagccccca tactgccacc agtatcagac tatactgtag tgcaggaagt 4020

ggatgcccag cacagcctcc tcctgaatcc tccttcctca cagcctgcga tatgccctca 4080

cagcccaaac aaacatctcc ctgtaatccc aaccatgccc atggggtacc tcaccccaga 4140

ccttctggga aacctgaacc catgaatctc gagaaagcgg ccgcacggac tgttaccact 4200

tcacgccgac tcaactgcgc agagaaaaac ttcaaacgac aacattggca tggcttttgt 4260

tatttttggc gcttgactca ggatctaaaa actggaacgg cgaaggtgac ggcaatgttt 4320

tggcaaataa gcatccccga agttctacaa tgcatctgag gactcaatgt tttttttttt 4380

tttttttctt tagtcattcc aaatgtttgt taaatgcatt gttccgaaac ttatttgcct 4440

ctatgaaggc tgcccagtaa ttgggagcat acttaacatt gtagtattgt atgtaaatta 4500

tgtaacaaaa caatgactgg gtttttgtac tttcagcctt aatcttgggt tttttttttt 4560

ttttggttcc aaaaaactaa gctttaccat tcaagatgta aaggtttcat tccccctggc 4620

atattgaaaa agctgtgtgg aacgtggcgg tgcagacatt tggtggggcc aacctgtaca 4680

ctgactaatt caaataaaag tgcacatgta agacatccta ctctgtgtga tttttctgtt 4740

tgtgctgagt gaacttgcta tgaagtcttt tagtgcactc tttaataaaa gtagtcttcc 4800

cttaaagtgt cccttccctt atggccttca catttctcaa ctagcgcttc aactagaaag 4860

cactttaggg actgggatgc tctagacagg ataaaacctt gtatgcattt catttaatgt 4920

tttttgagat taaaagctta aacaagaatc tctagttttc tttcttgctt ttacttttac 4980

ttccttaata ctcaagtaca attttaatgg agtacttttt tacttttact caagtaagat 5040

tctagccaga tacttttact tttaattgag taaaattttc cctaagtact tgtactttca 5100

cttgagtaaa atttttgagt actttttaca cctctgtcaa gaactcctgg acaaagaatt 5160

cgtaatcatg tcatagctgt ttcctgtgtg aaattgttat ccgctcacaa ttccacacaa 5220

catacgagcc ggaagcataa agtgtaaagc ctggggtgcc taatgagtga gctaactcac 5280

attaattgcg ttgcgctcac tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt gccagctgca 5340

ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt attgggcgct cttccgcttc 5400

ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc 5460

aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc 5520

aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag 5580

gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc 5640

gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt 5700

tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct 5760

ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg 5820

ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct 5880

tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat 5940

tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg 6000

ctacactaga agaacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa 6060

aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt 6120

ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc 6180

tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt 6240

atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta 6300

aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat 6360

ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac 6420

tacgatacgg gagggcttac catctggccc cagtgctgca atgataccgc gagacccacg 6480

ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag 6540

tggtcctgca actttatccg cctccatcca gtctattaat tgttgccggg aagctagagt 6600

aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt 6660

gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt 6720

tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt 6780

cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact catggttatg gcagcactgc ataattctct 6840

tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt 6900

ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac gggataatac 6960

cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa 7020

actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa 7080

ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca 7140

aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt tgaatactca tactcttcct 7200

ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga 7260

atgtatttag aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc 7320

tgacgtctaa gaaaccatta ttatcatgac attaacctat aaaaataggc gtatcacgag 7380

gccctttcgt ctcgcgcgtt tcggtgatga cggtgaaaac ctctgacaca tgcagctccc 7440

ggagacggtc acagcttgtc tgtaagcgga tgccgggagc agacaagccc gtcagggcgc 7500

gtcagcgggt gttggcgggt gtcggggctg gcttaactat gcggcatcag agcagattgt 7560

actgagagtg caccataaaa ttgtaaacgt taatattttg ttaaaattcg cgttaaattt 7620

ttgttaaatc agctcatttt ttaaccaata ggccgaaatc ggcaaaatcc cttataaatc 7680

aaaagaatag cccgagatag ggttgagtgt tgttccagtt tggaacaaga gtccactatt 7740

aaagaacgtg gactccaacg tcaaagggcg aaaaaccgtc tatcagggcg atggcccact 7800

acgtgaacca tcacccaaat caagtttttt ggggtcgagg tgccgtaaag cactaaatcg 7860

gaaccctaaa gggagccccc gatttagagc ttgacgggga aagccggcga acgtggcgag 7920

aaaggaaggg aagaaagcga aaggagcggg cgctagggcg ctggcaagtg tagcggtcac 7980

gctgcgcgta accaccacac ccgccgcgct taatgcgccg ctacagggcg cgtactatgg 8040

ttgctttgac gtatgcggtg tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa ataccgcatc 8100

aggcgccatt cgccattcag gctgcgcaac tgttgggaag ggcgatcggt gcgggcctct 8160

tcgctattac gccagctggc gaaaggggga tgtgctgcaa ggcgattaag ttgggtaacg 8220

ccagggtttt cccagtcacg acgttg 8246

Claims

1.一种编码的蛋白质，其序列为SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

2.一种分离的重组基因，其序列为SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

3.权利要求2所述的一种鱼类持续激活生长激素受体基因的制备方法，其步骤是：

A. 设计引物：扩增GHR信号肽的引物：

F: CAGATCGATCACCCGGGAGCCACCATGGCTTACTCTCTCTCGCTC

R: TTTCCGCCTTGATGCGCTCGGATCTTGCAGACACCAG；

扩增c-Jun拉链区的引物：

F: CAAGATCCGAGCGCATCAAGGCGGAAAGGAAGAG

R: CTTGGTATCTGTGCCACTCTCAGGACTTTCTGTTTGAGTTG；

扩增GHR信号传递区的引物：

F: CCTGAGAGTGGCACAGATACCAAGCAAAG

R: GTTCTCGAGATTCATGGGTTCAGGTTTCCCAGAAG；

B. 对GHR信号肽，c-Jun亮氨酸拉链区，GHR跨膜区和胞内区，分别采取PCR扩增；

GHR信号肽扩增条件为：95°C预变性4 分钟；95°C变性30秒，66°C复性30秒，68°C延升30秒，13个循环; 68°C延升10分钟; 4°C保存；

c-Jun亮氨酸拉链区扩增条件为：95°C预变性4 分钟；95°C变性30秒，59°C复性30秒，68°C延升30秒，18个循环，68°C延升10分钟，4°C保存；

GHR跨膜区和胞内区扩增条件为：95°C预变性4 分钟；95°C变性30秒，63°C复性30秒，68°C延升90秒，20个循环，68°C延升10分钟，4°C保存；

C. 对扩增的三个基因片段，采取又一轮PCR扩增，获得持续激活的GHR重组基因片段；

用连接PCR的方法将GHR信号肽，亮氨酸拉链区，GHR跨膜区和胞内区连接成一个新的分子片段，扩增条件为：95°C预变性4 分钟；95°C变性30秒，66-62°C，每个循环降0.5°C，复性30秒，68°C延升90秒，10个循环; 95°C变性30秒，63°C复性30秒，68°C延升90秒，10个循环； 68°C延升10分钟；4°C保存；

D. 将获得的重组基因克隆入表达载体pCA-AT，获得用于基因转移的重组基因载体pCA-SJG-A。

4.权利要求2所述的一种重组基因在斑马鱼中的应用。

5.权利要求2所述的一种重组基因在快速生长转基因鲤鱼中的应用。

6.权利要求2所述的一种重组基因在快速生长转基因团头鲂中的应用。

7.权利要求2所述的一种重组基因在快速生长转基因黄颡鱼中的应用。