CN103014008A - 双峰驼ghr蛋白基因、重组蛋白及其克隆方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，是一种双峰驼GHR蛋白基因、重组蛋白及其克隆方法。通过对GHR从基因、蛋白质、酶活性等多方面的研究,必然会为糖尿病、部分肝病、肾功能不全、侏儒症、巨人症等疾病的预防和治疗带来新的希望。双峰驼有比较特殊的生理特性，尤其是在抗干旱耐饥渴等方面，很适合进行物质代谢研究。本发明参考其它物种GHR基因序列，克隆测序获得双峰驼GHR基因的cDNA序列，并对不同物种GHR基因的CDS序列进行同源性比较，旨在了解和验证GHR基因的结构特点，为今后研究GHR基因与双峰驼物质代谢的关系提供基础资料。

Description

双峰驼GHR蛋白基因、重组蛋白及其克隆方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，是一种双峰驼GHR蛋白基因、重组蛋白及其克隆方法。

背景技术

生长激素受体  (growth hormone receptor，GHR)是生长激素(growth hormone，GH)的受体蛋白，由于生长激素为生物大分子，不能直接透过细胞膜，必须通过与位于靶细胞膜上的GHR结合，经过介导体将信息传递到细胞内，才能发挥其生物学功能。生长激素受体是由单一基因编码的 ,含有 620 个氨基酸的单链跨膜糖蛋白 ,其胞外区 ,跨膜区及胞内区分别是由约246 ,24 ,350个氨基酸残基组成。它属于细胞因子P 造血因子受体超家族的成员之一 ,与其他受体具有相似的结构和功能 ,尤其胞外区约 200 个氨基酸具有较显著的同源性。

1987年 ,Lueng从兔肝脏中提取并纯化出 GHR ,又根据氨基酸序列首次从兔的肝脏 cDNA 文库中克隆出 GHR cDNA。随后人们相继克隆了人、 小鼠、 大鼠、 绵羊、 牛、 鸡等 20多种动物的 GHR cDNA，大多数哺乳动物的 GHR基因由 10 个外显子和9 个内含子组成。生长激素能促进人的生长，且能调节体内的物质代谢。它主要通过抑制肌肉及脂肪组织利用葡萄糖，同时促进肝脏中的糖异生作用及对糖元进行分解，从而使血糖升高。还可促进脂肪分解，使血浆游离脂肪酸升高。饥饿时胰岛素分泌减少，生长激素分泌增高，于是血中葡萄糖利用减少及脂肪利用增高，此时血浆中葡萄糖及游离脂肪酸含量上升。由于生长激素必须通过与位于靶细胞膜上的GHR结合，经过介导体将信息传递到细胞内，才能发挥其生物学功能，所以，组织中 GHR 含量多少 ,功能正常与否都影响 GH生理效应得以发挥 ,导致动物生长发育模式的变异。 

GHR在机体的生长和体内的物质代谢中有着关键的调控作用,双峰驼有比较特殊的生理特性，尤其是在抗干旱耐饥渴等方面，很适合进行物质代谢研究。

发明内容

本发明提供了一种双峰驼GHR蛋白基因、重组蛋白及其克隆方法，GHR蛋白即生长激素受体  (growth hormone receptor，GHR)是生长激素(growth hormone，GH)的受体蛋白，克服了上述现有技术之不足，通过对GHR从基因、蛋白质、酶活性等多方面的研究, 必然会为糖尿病、部分肝病、肾功能不全、侏儒症、巨人症等疾病的预防和治疗带来新的希望。双峰驼有比较特殊的生理特性，尤其是在抗干旱耐饥渴等方面，很适合进行物质代谢研究。

本发明的技术方案之一是通过以下措施来实现的：一种双峰驼GHR蛋白基因，该基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO.1所示的序列。本发明中的双峰驼GHR蛋白基因的cDNA序列是通过以双峰驼肝脏组织中总RNA为模板，参考牛、人、鼠等物种的GHR蛋白基因的同源序列设计引物，进行反转录PCR而获得的新基因序列。获得的双峰驼GHR蛋白基因cDNA序列见SEQ ID NO.1。

下面是对上述发明技术方案之一的进一步优化或/和改进：

上述基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO.1中33-1736位的序列。在SEQ ID NO.1中，RT-PCR产物长度为1746bp，电泳结果见附图1， 其中33-35位为起始密码子ATG，1734-1736位为终止密码子TAG，33-1736位为编码蛋白质区域（CDS）。

本发明的技术方案之二是通过以下措施来实现的：一种双峰驼GHR蛋白基因的重组蛋白。

下面是对上述发明技术方案之二的进一步优化或/和改进：

上述重组蛋白的氨基酸序列具有SEQ ID NO.2所示的序列。将双峰驼GHR蛋白基因cDNA序列中的编码序列（CDS）按通用密码子翻译成的蛋白质编码序列见SEQ ID NO.2。

上述重组蛋白为具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。

上述重组蛋白通过设计一对引物从双峰驼A-FABP蛋白中得到双峰驼肌球蛋白基因，该引物对的核苷酸序列信息如下：

正引物，SEQ ID NO.3（正向）：5’- 5’- ATGGGCAATACTTTCCTC -3’，

反引物，SEQ ID NO.4（反向）：Oligo dT。

本发明的技术方案之三是通过以下措施来实现的：一种双峰驼GHR蛋白基因的克隆方法，按下述步骤进行：

第一步，总RNA提取，采取双峰驼组织样品后，对组织样品进行组织总RNA提取；

第二步，引物设计及合成，引物对的核苷酸序列信息如下：

正引物，SEQ ID NO.3（正向）：5’- ATGGGCAATACTTTCCTC -3’，

反引物，SEQ ID NO.4（反向）：Oligo dT；

第三步，RT-PCR扩增，利用反转录试剂盒对组织样品中的蛋白基因进行反转录，并对待扩增的DNA片段进行RT-PCR扩增；

第四步，蛋白基因的克隆，首先对PCR扩增的DNA片段进行回收，然后将回收的DNA片段同T载体连接形成感受态细胞，将感受态细胞进行转化培养成单菌落，取少量该单菌落进行PCR扩增，对扩增后的单菌落鉴别T载体上是否含有目的DNA片段，若有目的DNA片段，将单菌落放入培养基中进行过夜培养，最后对质粒进行回收。

本发明参考其它物种GHR基因序列，克隆测序获得双峰驼GHR基因的cDNA序列，并对不同物种GHR基因的CDS序列进行同源性比较，旨在了解和验证GHR基因的结构特点，为今后研究GHR基因与双峰驼物质代谢的关系提供基础资料。

附图说明

附图1为双峰驼GHR蛋白基因RT-PCR产物电泳图。

附图2为构建系统发生树所用GHR蛋白氨基酸同源性比较。

附图3为不同物种GHR蛋白氨基酸序列系统进化树。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步描述：

实施例1，一种双峰驼GHR蛋白基因，该基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO.1所示的序列。

可根据实际需要，对上述A作进一步优化或/和改进：

双峰驼GHR蛋白基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO.1中33-1736位的序列。

实施例2，一种双峰驼GHR蛋白基因的重组蛋白。

可根据实际需要，对上述双峰驼GHR蛋白基因的重组蛋白作进一步优化或/和改进：

重组蛋白的氨基酸序列具有SEQ ID NO.2所示的序列。

重组蛋白为具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。

重组蛋白通过设计一对引物从双峰驼A-FABP蛋白中得到双峰驼肌球蛋白基因，该引物对的核苷酸序列信息如下：

正引物，SEQ ID NO.3（正向）：5’- 5’- ATGGGCAATACTTTCCTC -3’，

反引物，SEQ ID NO.4（反向）：Oligo dT；

实施例3，一种双峰驼GHR蛋白基因的克隆方法按下述步骤进行：

第一步，总RNA提取

1.组织分离(Isolation)

从内蒙古阿拉善盟采得双峰驼，快速屠宰并取肝脏样，将组织样迅速放入液氮中冷冻后于－70℃保存，拿回实验室准备提取组织总RNA。

2. 总RNA的分离(Total RNA isolation)

(1) 提取RNA的准备工作

玻璃制品用0.1M的NaOH浸泡过夜,用自来水反复冲洗,再用蒸馏水冲洗2遍,180℃烘烤4小时。

匀浆器、电泳槽用3%的双氧水浸泡20-30分钟，再用0.1%的DEPC水冲洗.由于未灭活的DEPC对PCR反应有影响,可用0.5%的SDS处理。

 Tip头、EP管用0.1%的DEPC水浸泡过夜,高压灭菌使DEPC失活。

双蒸水和溶液用DEPC处理,即每100ml水或溶液加0.1mlDEPC液,室温放置过夜,高压灭菌30分钟DEPC失活。

（2）组织总RNA提取

取100mg在液氮中冻存的组织样放入有1ml Trizol（trizal reagent, invitrogen BRL, USA）的匀浆器管中匀浆。4℃ 12000g离心10分钟。吸取上清液，15-30℃温育5分钟。加0.2ml氯仿,盖上盖子,用手剧烈震荡15秒。15-30℃温育2-3分钟。4℃ 12000g离心15分钟。吸取上清液，加0.8ml异丙醇,混合均匀。15-30℃温育10分钟, 4℃ 12000g离心10分钟,离心管底部白色沉淀即为RNA。倒掉上清,加1ml 75%乙醇洗涤RNA, 4℃ 7500g离心10分钟。自然干燥或真空干燥RNA.溶于水（RNase free）中分装，-70℃保存。

（3）组织总RNA的鉴定

通过分光光度计上测定RNA含量并且用琼脂糖电泳分析RNA的质量，具体方法如下：电泳槽用RNA清洗液（100mM NaOH,1mM EDTA）浸泡4－5小时，再用DEPC处理过的水反复冲洗数次后倒入1×TBE待用。琼脂糖凝胶用1×TBE配制。在10ul上样缓冲液（2×TBE，13%菲可，0.1%溴酚兰，7M 尿素）中加入1ul以上组织总RNA，65℃变性10分钟后立即放入冰水中2－3分钟。点样于琼脂糖凝胶中电泳。

第二步，引物设计及合成 

根据GenBanK发表的牛（Accession No: AY748827.1）、人（Accession No: BC136496.1）、马（Accession No: XM_001498656.3）等物种的GHR蛋白基因mRNA序列ORF侧翼同源序列，设计如下引物用于以双峰驼GHR蛋白cDNA为模版的PCR扩增，以获得双峰驼GHR蛋白基因cDNA序列。引物用Primer Premier 5.0自行设计，由上海桑尼生物科技有限公司合成，该引物对的核苷酸序列分别为SEQ ID NO:3（正向）和SEQ ID NO:4（反向），序列信息如下：

SEQ ID NO.3（正向）：5’- ATGGGCAATACTTTCCTC-3’

SEQ ID NO.4（反向）：Oligo dT

第三步，RT-PCR扩增

按大连宝生物反转录试剂盒(BcaBEST RNA PCR Kit Ver.1.1)要求进行反转录。反转录反应液组成：10ul 2×Bca 1st Buffer，4ul 25Mm MgSO4，1ul dNTP Mixture，0.5ul Rnase Inhibitor (40U/ul)，1ul BcaBEST Polymerase(22U/ul)，1ul Oligo dT Primer，1ul RNA Sample，1.5ul Rnase Free dH2O，总体系为20 ul。反转录反应条件：65℃1分钟，30℃5分钟（15分钟-30分钟内匀速升温），65℃25分钟，98℃5分钟，5℃5分钟。PCR扩增条件：97℃ 变性5分钟；95℃30秒→55℃30秒→72℃ 1分钟，如此进行30次循环；72℃延伸10分钟，4℃保存。

第四步，蛋白基因的克隆

1、PCR扩增片段的回收：片段回收按上海华舜小量胶回收试剂盒说明进行，操作过程如下： 尽可能小的割下含DNA的琼脂糖块，放入1.5mlEP管中。按每100mg琼脂糖加入300ulS1液的比例加S1液, 50℃水浴10分钟。将溶化的琼脂糖液移入吸附柱, 10000g离心1分钟,倒掉管中液体。在吸附柱中加入500ul W1液, 10000g离心15秒, 倒掉管中液体。在吸附柱中加入500ul W1液,静置1分钟后, 10000g离心15秒, 倒掉管中液体。离心1分钟。将吸附柱放入一个干净的1.5mlEP管中,在吸附膜中央加入30ulT1液, 静置1分钟后, 10000g离心1分钟， EP管中液体即为回收的DNA。

2、回收片段同T载体的连接：连接用TaKaRa pMD18-T Vector试剂盒, 操作过程如下：在EP管中制备下列连接反应液:pMD 18-T Vector(50ng/ul) 0.5ul，DNA 20-40ng，Solution 1 5ul，加dH2O至10ul。将上述反应液在16℃反应30分钟(过夜也可以),产物用于转化感受态细胞。

3、质粒的转化：从—70℃冰箱中取出保存的感受态细胞，冰浴助溶。100ul感受态细胞加入10ul连接产物，冰浴30分钟。42℃水浴热应激90秒钟，立即置入冰浴中2分钟。加400ul液体LB培养基，37℃复活50分钟。取100ul铺于LB平板上,平板含0.1%(V/V)的氨苄青霉Amp (100mg/ml)。37℃恒温培养10-15小时。

4、转化菌落的PCR鉴定与培养：用记号笔标记转化培养的单菌落，用灭菌的牙签蘸取单菌落。将牙签头放入在加有PCR反应液（不含模板）的EP管中晃动，使单菌落充当模板。用获得该片段的PCR条件进行扩增。PCR产物同Marker一起进行琼脂糖凝胶电泳，鉴别T载体上是否含有目的片段。若得到目的片段，可用灭菌枪头挑取在平板上的与之对应的单菌落，放入40 ml LB液体培养基中，先在液体中加入0.1%(V/V)的青霉素钠(100mg/ml),37℃过夜摇菌培养，用于质粒回收。

5、质粒的回收：质粒回收用上海华舜小量质粒抽提纯化试剂盒，操作步骤如下：将转化培养的菌液加入1.5mlEP管中,4000转/分钟离心,倒掉液体获细菌沉淀。细菌沉淀不够时可再加一次菌液离心。在细菌沉淀中加入250ulP1液,振荡悬浮。加入250ulP2液,温和摇匀,室温静置4分钟。加入350ulP3液, 温和摇匀。离心10分钟,将上清液小心移入吸附柱,离心15秒,倒掉液体。在吸附柱中加入500ulW1,离心15秒,倒掉液体。在吸附柱中加入500ulW1, 静置1分钟,离心15秒,倒掉液体。离心1分钟。将吸附柱放入一个干净的1.5mlEP管中,在吸附膜中央加入25-30ulT1液, 静置1分钟后, 离心1分钟. EP管中液体即为回收的质粒。

6、质粒的酶切鉴定：为了证明回收质粒确为插入目的片段的重组质粒,采用双酶切法鉴定.本研究具体操作如下:根据TaKaRa pMD18-T Vector图,选择内切酶Bam HⅠ和Hin d Ⅲ.保证目的片段中无这两种酶的切点。组成如下酶切反应体系：Bam HⅠ1ul，Hin d Ⅲ 1ul，10×K Buffer 2ul，DNA ≤1ul，加dH2O至 20ul。30℃反应3小时。琼脂糖凝胶电泳检测。

实施例4，重组质粒的测序： 取20ul重组质粒于EP管中,封口膜密封,交生物技术公司测序。

实施例5，双峰驼GHR蛋白基因编码序列同源性比较和系统发生树构建

1、双峰驼GHR蛋白基因编码序列同源性比较

在GenBank上搜索并获得牛、人、鼠、猪等12种动物的GHR蛋白基因编码蛋白序列，将其同克隆测序获得的本发明获得的SEQ ID NO.1序列一起，在分子生物学软件MEGA4上进行序列同源性比较（见附图2）。比较结果显示：SEQ ID NO.2序列与GHR蛋白氨基酸序列同源性为89.00%。

2、GHR蛋白基因编码序列系统发生树构建

在GenBank上搜索并获得牛、人、鼠等12种物种的12条GHR蛋白基因的编码蛋白序列，加上本发明获得的SEQ ID NO.2序列，利用分子生物学软件MEGA4构建了系统发生树（见附图3）。结果显示：双峰驼GHR蛋白基因同马的亲缘关系最近；间接证明了所得到的序列确为双峰驼 GHR蛋白基因。

 

序列表：

<110> 新疆旺源驼奶实业有限公司

<120>  双峰驼GHR蛋白的蛋白编码序列

<160>  4     

<210>  1

<211>  1746

<212>  DNA

<213>  阿拉善盟双峰驼

<400>  1

ggagtgtctg ctggactctt ggtcctacag gtatgggcaa tactttcctc aaccctgcag        60

gcattaaagc agattcttcc gggaagccta aattcaccaa gtgccgttca cctgaactag       120

agactttttc atgccactgg acagatgggg ttcatcatgg tttacagagc ccaggatcca       180

tacagctgtt ctatattaga aggagcactc aagaatggac tcaagaatgg aaagaatgcc       240

ctgattatgt ctctgctgga gaaaacagct gttactttaa ttcgtcttac acctccattt       300

ggatacccta ctgcatcaag ctaacaagca atggtggtac tgtggatcag aagtgtttct       360

ctgttgagga aatagtgcaa ccagatccgc ccattggcct caactggact ttactgaaca       420

tcagtttaac ggggattcat gcagacatcc aagtgagatg ggaaccacca ccgaatgcag       480

atgttcagaa gggatggata gtcctggagt atgaactgca gtacaaagaa gtaaatgaga       540

cccaatggaa aatgatggac cctgtattgt caacatcagt cccagtgtac tcgttgagac       600

tggacaaaga gtatgaagtg cgtgtgagat ccagacaacg aaactctgaa aaatatggcg       660

aattcagtga cgtgctctat gtaacacttc ctcaaatgag cccatttgcg tgtgaagaag       720

taccagttcc aaagattaaa ggaattgatc cagatctcct caaggaagga aaattagaag       780

aggtgaacac aatcttagcc attcatgaca actataaaca cgaattctac aatgatgact       840

cttgggtgga atttatcgag ctagatattg acgaccctga tgaaaagact gaaggctcag       900

acacagacag acttctaagc aatgaccatg aaaaatcact taatatcctt ggggcaaagg       960

acgacgactc tggacgtacc agctgttgtg aacctgacat tctggagact gatttcaatg      1020

ccagtgacac gtgtgacggt acctcagagg ttgctcagcc acagaggtta aaaggggaag      1080

cagatctctt gtgccttgac cagaagaatc aaagtgactt gccttctaat gatgctgccc      1140

ctgctaccca gcagcccagt gttatcctag cggaggaaga caaaccaaga ccacttctca      1200

ttggtggaac tgagtcaact catcaagctg cccatacgca gctgagcaac ccaagttcac      1260

tggcaaacat cgacttttat gcccaggtaa gtgacattac accagcaggg agtgtggtcc      1320

tttccccggg ccagaagaat aaggcaggga tcgcccagtg tgacacgcat ccagaagtgg      1380

tctcaccctg ccaagcaagc ttcatcatgg acagcgccta tttctgcgaa gcagatgcca      1440

agaagtgtat cgccgtggcc cctcacaccg aggcagaatc acgtgcagag cccagcttta      1500

accaggaaga catttacatc accacagaaa gccttagcac tgctgctggg aggtctggga      1560

cagcagagcg tgccccgagt gctgagacgc ccgtcccaga ctatacctcc attcatatag      1620

tgcagtctcc ccggggcctt gtacttaatg ctaccgccct gcgcttgcct gacaaggagt      1680

ttctctcgtc gtgtggctac gtgagcacag accaactgaa caaaatcatg ccgtagatgg      1740

cacagg                                                                             1746

<210>  2

<211>  567

<212>  PRT

<213>  阿拉善盟双峰驼

<400>  2

MGNTFLNPAG  IKADSSGKPK  FTKCRSPELE  TFSCHWTDGV  HHGLQSPGSI  QLFYIRRSTQ        60

EWTQEWKECP  DYVSAGENSC  YFNSSYTSIW  IPYCIKLTSN  GGTVDQKCFS  VEEIVQPDPP        120

IGLNWTLLNI  SLTGIHADIQ  VRWEPPPNAD  VQKGWIVLEY  ELQYKEVNET  QWKMMDPVLS      180

TSVPVYSLRL  DKEYEVRVRS  RQRNSEKYGE  FSDVLYVTLP  QMSPFACEEV  PVPKIKGIDP        240

DLLKEGKLEE  VNTILAIHDN  YKHEFYNDDS  WVEFIELDID  DPDEKTEGSD  TDRLLSNDHE        300

KSLNILGAKD  DDSGRTSCCE  PDILETDFNA  SDTCDGTSEV  AQPQRLKGEA  DLLCLDQKNQ       360

SDLPSNDAAP  ATQQPSVILA  EEDKPRPLLI  GGTESTHQAA  HTQLSNPSSL  ANIDFYAQVS          420

DITPAGSVVL  SPGQKNKAGI  AQCDTHPEVV  SPCQASFIMD  SAYFCEADAK  KCIAVAPHTE        480

AESRAEPSFN  QEDIYITTES  LSTAAGRSGT  AERAPSAETP  VPDYTSIHIV  QSPRGLVLNA           540

TALRLPDKEF  LSSCGYVSTD  QLNKIMP                                                         567  

<210>  3

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工

<400>  3

ATGGGCAATACTTTCCTC                                       18

<210>  4

<211>  

<212>  DNA

<213>  人工

<400>  4

Oligo dT

Claims (8)

1.一种双峰驼GHR蛋白基因，其特征在于该基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO.1所示的序列。

2.根据权利要求1所述的双峰驼GHR蛋白基因，其特征在于该基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO.1中33-1736位的序列。

3.一种含有权利要求1或2所述的双峰驼GHR蛋白基因的重组蛋白。

4.根据权利要求3所述的重组蛋白，其特征在于该重组蛋白的氨基酸序列具有SEQ ID NO.2所示的序列。

5.根据权利要求3或4所述的重组蛋白，其特征在于该重组蛋白为具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。

6.根据权利要求3或4所述的重组蛋白，其特征在于通过设计一对引物从双峰驼GHR蛋白中得到双峰驼肌球蛋白基因，该引物对的核苷酸序列信息如下：

正引物，SEQ ID NO.3（正向）：5’- ATGGGCAATACTTTCCTC -3’，

反引物，SEQ ID NO.4（反向）：Oligo dT。

7.根据权利要求5所述的重组蛋白，其特征在于通过设计一对引物从双峰驼GHR蛋白中得到双峰驼肌球蛋白基因，该引物对的核苷酸序列信息如下：

正引物，SEQ ID NO.3（正向）：5’- ATGGGCAATACTTTCCTC -3’，

反引物，SEQ ID NO.4（反向）：Oligo dT。

8.一种根据权利要求1或2所述的双峰驼GHR蛋白基因的克隆方法，其特征在于按下述步骤进行：

第一步，总RNA提取，采取双峰驼组织样品后，对组织样品进行组织总RNA提取；

第二步，引物设计及合成，引物对的核苷酸序列信息如下：

正引物，SEQ ID NO.3（正向）：5’- ATGGGCAATACTTTCCTC -3’，

反引物，SEQ ID NO.4（反向）：Oligo dT；

第三步，RT-PCR扩增，利用反转录试剂盒对组织样品中的蛋白基因进行反转录，并对待扩增的DNA片段进行RT-PCR扩增；

第四步，蛋白基因的克隆，首先对PCR扩增的DNA片段进行回收，然后将回收的DNA片段同T载体连接形成感受态细胞，将感受态细胞进行转化培养成单菌落，取少量该单菌落进行PCR扩增，对扩增后的单菌落鉴别T载体上是否含有目的DNA片段，若有目的DNA片段，将单菌落放入培养基中进行过夜培养，最后对质粒进行回收。

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