CN103014007A - 双峰驼α-乳白蛋白基因、重组蛋白及其克隆方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，是一种双峰驼α-乳白蛋白基因、重组蛋白及其克隆方法；该基因是一种乳品中除具有易消化吸收的特点外、还具有杀菌和诱导肿瘤细胞凋亡的功能密切相关的基因，具有SEQIDNO.1中从核苷酸第4-432位的核苷酸序列。本发明双峰驼α-乳白蛋白是乳清蛋白的主要成分之一，具有调节产乳的功能，还有细胞溶解活性，诱导细胞生长抑制和细胞凋亡等多种功能，是驼乳中非常重要的一种蛋白质，本发明构建的双峰驼的α-乳白蛋白序列及进化树可以直观的表现出双峰驼α-乳白蛋白与其他物种此蛋白序列的差异，为以后驼乳在食品中的添加和进一步的生化研究提供实验数据，所以本发明具有很高的应用价值。

Description

双峰驼α-乳白蛋白基因、重组蛋白及其克隆方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，是一种双峰驼α-乳白蛋白基因、重组蛋白及其克隆方法。

背景技术

α-乳白蛋白（alpha-lactalbumin）是主要的乳清蛋白成分之一，具有调节产乳的功能，还有细胞溶解活性，诱导细胞生长抑制和细胞凋亡等多种功能。最近的研究发现，它可能具有抗癌功能，此外，乳白蛋白在氨基酸比例结构方面，以及在功能特性上与人乳都非常相似的。临床研究显示，富含α-乳白蛋白的婴儿配方奶粉是安全的。α-乳白蛋白含有丰富的色氨酸，色氨酸有助于促进宝宝的神经发育，是调节睡眠、食欲情绪的重要因子。而且，α-乳白蛋白是必需氨基酸和支链氨基酸的极好来源，也是唯一能与金属元素和钙元素结合的乳清蛋白成分。

α-乳白蛋白在牛乳中研究的较多，α-乳白蛋白(α-lactalbumin)是牛乳的特异蛋白之一，也是乳清蛋白主要成分之一，占总乳清蛋白10%，牛乳中含量为 0.5 mg/mL至2 mg/mL，分子量为14175u，由 123个氨基酸组成。α-乳白蛋白是必需氨基酸和支链氨基酸的极好来源，是惟一能结合钙的乳清蛋白，它所特有的4个天冬氨酸残基的肽循环位置均能结合钙离子。α-乳白蛋白所含的2个脯氨酸可以中断其一级结构，导致易受蛋白酶水解。

Merin等 (2001)对内蒙古阿拉善双峰驼分娩后第1次所挤的初乳成分进行了研究，结果表明，乳清蛋白氮主要由血清白蛋白和免疫球蛋白组成。随泌乳时间的延长，阿拉善双峰驼驼乳氮分布中酪蛋白比例逐渐升高，乳清蛋白氮比例逐渐降低。24小时后到90天泌乳期内，非蛋白氮占总氮比例变化不大，为5.26％至7.89％。尽管总氮含量随泌乳进行逐渐下降，但在7天至90天泌乳期内，酪蛋白氮及乳清蛋白氮占总氮百分比较为恒定，分别在77.59％至80.36％和12.50％至15.52％，乳清蛋白氮：酪蛋白氮比例在15：85左右。

在食品蛋白中，α-乳白蛋白所含有的色氨酸的比例最高。大量实验表明：食用较高色氨酸含量的蛋白，有助于提高血液中复合胺的释放，在动物实验中发现其有抗焦虑的作用，因此牛奶中的α-乳白蛋白日益引起人们的关注。因此婴幼儿配方乳制品中α-乳白蛋白的含量是衡量其营养成分和品质的标准之一。α-乳白蛋白在蛋白结构、 氨基酸序列及DNA 序列上与溶菌酶有极大的相似性，在氨基酸水平上牛乳中α-乳白蛋白与牛溶菌酶有62. 6%的相似性及35.8%的一致性。

内蒙、新疆地区是双峰驼的主要产地，骆驼资源丰富，是当地重要的经济动物。驼乳在成分、含量等方面与牛乳有一定的区别，因此，研究驼乳中的α-乳白蛋白就显得尤为重要。我们参考了其他九种动物的α-乳白蛋白基因序列，克隆并测序得到了双峰驼驼乳中α-乳白蛋白基因的cDNA序列，并对十种物种基因的CDS序列进行同源性比较并作进化树，为今后研究双峰驼驼乳中α-乳白蛋白提供基础资料。目前，国内外对酪蛋白、α-乳球蛋白等的研究较多，但是国内几乎没有对双峰驼α-乳白蛋白基因方面的研究的相关研究。

发明内容

本发明提供了一种双峰驼α-乳白蛋白基因，该基因是一种乳品中除具有易消化吸收的特点外、还具有杀菌和诱导肿瘤细胞凋亡的功能密切相关的基因，其氨基酸序列与人、鼠、牛等物种α-乳白蛋白氨基酸序列具有很高的相似性。

本发明的技术方案之一是通过以下措施来实现的：一种双峰驼α-乳白蛋白基因、该基因是一种乳品中除具有易消化吸收的特点外、还具有杀菌和诱导肿瘤细胞凋亡的功能密切相关的基因，具有SEQ ID NO.1中从核苷酸第4-432位的核苷酸序列。

本发明的技术方案之二是通过以下措施来实现的：一种双峰驼α-乳白蛋白基因的重组蛋白。

下面是对上述发明技术方案之二的进一步优化或/和改进：

上述重组蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。 

上述重组蛋白为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。

上述重组蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

上述重组蛋白通过设计一对引物从双峰驼α-乳白蛋白中得到双峰驼α-乳白蛋白基因，该引物对的核苷酸序列正向引物为SEQ ID NO.3和反向引物为SEQ ID NO.4，其序列信息如下：

SEQ ID NO.3：5’- ATGAAGCTCTTCTTCCCCGCC -3’，

SEQ ID NO.4：5’- TATTCTGTGCTGTCATTGTTTTG -3’。

本发明的技术方案之三是通过以下措施来实现的：一种双峰驼α-乳白蛋白基因的克隆方法，按下述步骤进行：第一步，组织分离(Isolation)；第二步，总RNA的分离(Total RNA isolation)，总RNA的分离(Total RNA isolation)包括提取RNA的准备工作、组织总RNA提取、组织总RNA的鉴定；第三步，全长cDNA的克隆(Cloning of Full-length cDNA)，全长cDNA的克隆(Cloning of Full-length cDNA)包括引物设计及合成、RT-PCR扩增、克隆和测序，该引物对的核苷酸序列正向引物为SEQ ID NO.3和反向引物为SEQ ID NO.4，其序列信息如下：

SEQ ID NO.3：5’- ATGAAGCTCTTCTTCCCCGCC -3’，

SEQ ID NO.4：5’- TATTCTGTGCTGTCATTGTTTTG -3’。

本发明双峰驼α-乳白蛋白是乳清蛋白的主要成分之一，具有调节产乳的功能，还有细胞溶解活性，诱导细胞生长抑制和细胞凋亡等多种功能，是驼乳中非常重要的一种蛋白质，本发明构建的双峰驼的α-乳白蛋白序列及进化树可以直观的表现出双峰驼α-乳白蛋白与其他物种此蛋白序列的差异，为以后驼乳在食品中的添加和进一步的生化研究提供实验数据，所以本发明具有很高的应用价值。

附图说明

附图1为双峰驼α-乳白蛋白基因RT-PCR产物电泳图。

附图2为双峰驼和和人、鼠、牛等动物用Clustal X 中对齐的α-乳白蛋白氨基酸序列同源性比较结果图。

附图3为本发明双峰驼α-乳白蛋白氨基酸序列和人、鼠、牛等动物α-乳白蛋白氨基酸序列构建的系统进化树图。

具体实施方式

本发明不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体的实施方式。

实施例1：一种双峰驼α-乳白蛋白基因，该基因是一种乳品中除具有易消化吸收的特点外、还具有杀菌和诱导肿瘤细胞凋亡的功能密切相关的基因，具有SEQ ID NO.1中从核苷酸第4-432位的核苷酸序列。

实施例2：一种双峰驼α-乳白蛋白基因的重组蛋白。

实施例3：重组蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。 

实施例4：重组蛋白为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。

实施例5：重组蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

实施例6：重组蛋白通过设计一对引物从双峰驼α-乳白蛋白中得到双峰驼α-乳白蛋白基因，该引物对的核苷酸序列正向引物为SEQ ID NO.3和反向引物为SEQ ID NO.4，其序列信息如下：

SEQ ID NO.3：5’- ATGAAGCTCTTCTTCCCCGCC -3’，

SEQ ID NO.4：5’- TATTCTGTGCTGTCATTGTTTTG -3’。

实施例7：一种双峰驼α-乳白蛋白基因的克隆方法，按下述步骤进行：第一步，组织分离(Isolation)；第二步，总RNA的分离(Total RNA isolation)，总RNA的分离(Total RNA isolation)包括提取RNA的准备工作、组织总RNA提取、组织总RNA的鉴定；第三步，全长cDNA的克隆(Cloning of Full-length cDNA)，全长cDNA的克隆(Cloning of Full-length cDNA)包括引物设计及合成、RT-PCR扩增、克隆和测序，该引物对的核苷酸序列正向引物为SEQ ID NO.3和反向引物为SEQ ID NO.4，其序列信息如下：

SEQ ID NO.3：5’- ATGAAGCTCTTCTTCCCCGCC -3’，

SEQ ID NO.4：5’- TATTCTGTGCTGTCATTGTTTTG -3’。

双峰驼α-乳白蛋白基因cDNA序列的克隆

1.     组织分离(Isolation)

从内蒙古阿拉善盟采得双峰驼，快速屠宰并取肝脏样，将组织样迅速放入液氮中冷冻后于－70℃保存，拿回实验室准备提取组织总RNA。

2. 总RNA的分离(Total RNA isolation)

(1) 提取RNA的准备工作

玻璃制品用0.1M的NaOH浸泡过夜，用自来水反复冲洗，再用蒸馏水冲洗2遍，180℃烘烤4小时。

匀浆器、电泳槽用3%的双氧水浸泡20分钟至30分钟，再用0.1%的DEPC水冲洗，由于未灭活的DEPC对PCR反应有影响，可用0.5%的SDS处理。

 Tip头、EP管用0.1%的DEPC水浸泡过夜,高压灭菌使DEPC失活。

双蒸水和溶液用DEPC处理，即每100ml水或溶液加0.1mlDEPC液，室温放置过夜，高压灭菌30分钟DEPC失活。

（2）组织总RNA提取

取100mg在液氮中冻存的组织样放入有1ml Trizol（trizal reagent, invitrogen BRL, USA）的匀浆器管中匀浆；4℃、12000g离心10分钟，吸取上清液，15℃至30℃温育5分钟，加0.2ml氯仿，盖上盖子，用手剧烈震荡15秒，15℃至30℃温育2分钟至3分钟，4℃ 12000g离心15分钟，吸取上清液，加0.8ml异丙醇，混合均匀。15℃至30℃温育10分钟，4℃、12000g离心10分钟，离心管底部白色沉淀即为RNA；倒掉上清，加1ml 75%乙醇洗涤RNA，4℃、7500g离心10分钟，自然干燥或真空干燥RNA；溶于水（RNase free）中分装，-70℃保存。

（3）组织总RNA的鉴定

通过分光光度计上测定RNA含量并且用琼脂糖电泳分析RNA的质量，具体方法如下：电泳槽用RNA清洗液（100mM NaOH,1mM EDTA）浸泡4小时至5小时，再用DEPC处理过的水反复冲洗数次后倒入1×TBE待用，琼脂糖凝胶用1×TBE配制；在10ul上样缓冲液（2×TBE，13%菲可，0.1%溴酚兰，7M 尿素）中加入1ul以上组织总RNA，65℃变性10分钟后立即放入冰水中2分钟至3分钟，点样于琼脂糖凝胶中电泳。

3.全长cDNA的克隆(Cloning of Full-length cDNA)

（1）引物设计及合成 

根据GenBanK发表的人（Accession No: BAC06860.1）、鼠（Accession No: AAH69916.1）、牛（Accession No: CAA29664.1）等物种的溶菌酶基因mRNA序列ORF侧翼同源序列，设计如下引物用于以双峰驼溶菌酶cDNA为模版的PCR扩增，以获得双峰驼溶菌酶基因cDNA序列。引物用Primer Premier 5.0自行设计，由上海桑尼生物科技有限公司合成，该引物对的核苷酸序列分别为SEQ ID NO:3（正向）和SEQ ID NO.4（反向），序列信息如下：

SEQ ID NO:3（正向）： 5’- TATTTAGTGGTATTGGTGGTTGG -3’

SEQ ID NO.4（反向）： 5’- TATTCTGTGCTGTCATTGTTTTG -3’

（2）RT-PCR扩增

按大连宝生物反转录试剂盒(BcaBEST RNA PCR Kit Ver.1.1)要求进行反转录，反转录反应液组成：10ul 2×Bca 1st Buffer，4ul 25Mm MgSO4，1ul dNTP Mixtur，0.5ul Rnase Inhibitor (40U/ul)，1ul BcaBEST Polymerase(22U/ul)，1ul Oligo dT Primer，1ul RNA Sample，1.5ul Rnase Free dH2O，总体系为20 ul；反转录反应条件：65℃1分钟，30℃5分钟（15分钟至30分钟内匀速升温），65℃25分钟，98℃5分钟，5℃5分钟；PCR扩增条件：97℃ 变性5分钟；95℃30秒→55℃30秒→72℃ 1分钟，如此进行30次循环；72℃延伸10分钟，4℃保存。

（3）克隆和测序 

PCR扩增片段的回收：片段回收按上海华舜小量胶回收试剂盒说明进行，操作过程如下：尽可能小的割下含DNA的琼脂糖块，放入1.5mlEP管中，按每100mg琼脂糖加入300ulS1液的比例加S1液，50℃水浴10分钟；将溶化的琼脂糖液移入吸附柱，10000g离心1分钟，倒掉管中液体。在吸附柱中加入500ul W1液，10000g离心15秒；倒掉管中液体，在吸附柱中加入500ul W1液，静置1分钟后，10000g离心15秒，倒掉管中液体，离心1分钟，将吸附柱放入一个干净的1.5mlEP管中，在吸附膜中央加入30ulT1液，静置1分钟后，10000g离心1分钟， EP管中液体即为回收的DNA。

回收片段同T载体的连接：连接用TaKaRa pMD18-T Vector试剂盒，操作过程如下：在EP管中制备下列连接反应液：pMD 18-T Vector(50ng/ul) 0.5ul，DNA 20-40ng，Solution 1 5ul，加dH2O至10ul；将上述反应液在16℃反应30分钟(过夜也可以)，产物用于转化感受态细胞。

质粒的转化：从－70℃冰箱中取出保存的感受态细胞，冰浴助溶；100ul感受态细胞加入10ul连接产物，冰浴30分钟；42℃水浴热应激90秒钟，立即置入冰浴中2分钟；加400ul液体LB培养基，37℃复活50分钟；取100ul铺于LB平板上，平板含0.1%(V/V)的氨苄青霉Amp (100mg/ml)，37℃恒温培养10小时至15小时。

转化菌落的PCR鉴定与培养：用记号笔标记转化培养的单菌落，用灭菌的牙签蘸取单菌落；将牙签头放入在加有PCR反应液（不含模板）的EP管中晃动，使单菌落充当模板；用获得该片段的PCR条件进行扩增，PCR产物同Marker一起进行琼脂糖凝胶电泳，鉴别T载体上是否含有目的片段，若得到目的片段，可用灭菌枪头挑取在平板上的与之对应的单菌落，放入40 ml LB液体培养基中，先在液体中加入0.1%(V/V)的青霉素钠(100mg/ml)，37℃过夜摇菌培养，用于质粒回收。

质粒的回收：质粒回收用上海华舜小量质粒抽提纯化试剂盒，操作步骤如下：将转化培养的菌液加入1.5mlEP管中，4000转/分钟离心，倒掉液体获细菌沉淀；细菌沉淀不够时可再加一次菌液离心；在细菌沉淀中加入250ulP1液，振荡悬浮；加入250ulP2液，温和摇匀，室温静置4分钟；加入350ulP3液，温和摇匀，离心10分钟，将上清液小心移入吸附柱，离心15秒，倒掉液体；在吸附柱中加入500ulW1，离心15秒，倒掉液体；在吸附柱中加入500ulW1，静置1分钟，离心15秒，倒掉液体；离心1分钟，将吸附柱放入一个干净的1.5mlEP管中，在吸附膜中央加入25-30ulT1液，静置1分钟后，离心1分钟，EP管中液体即为回收的质粒。

质粒的酶切鉴定：为了证明回收质粒确为插入目的片段的重组质粒,采用双酶切法鉴定，本研究具体操作如下：根据TaKaRa pMD18-T Vector图，选择内切酶Bam HⅠ和Hin d Ⅲ，保证目的片段中无这两种酶的切点；组成如下酶切反应体系：Bam HⅠ1ul，Hin d Ⅲ 1ul，10×K Buffer 2ul，DNA ≤1ul，加dH2O至 20ul，30℃反应3小时，琼脂糖凝胶电泳检测。

重组质粒的测序： 取20ul重组质粒于EP管中，封口膜密封，交生物技术公司测序。

双峰驼α-乳白蛋白基因编码序列同源性比较和系统发生树构建

1、双峰驼α-乳白蛋白的序列信息与生物信息学分析

本发明新的双峰驼α-乳白蛋白CDS的长度为2128 bp，详细序列见SEQ ID NO:1。根据全长CDS推导出双峰驼α-乳白蛋白的氨基酸序列，共693个氨基酸残基，详见SEQ ID NO.2，在线预测（http://www.expasy. ch/tools/pi_

tool.html）结果显示，其分子量为16458.94道尔顿，等电点（pI）为5.00。

2、α-乳白蛋白基因编码序列系统发生树构建

在GenBank上搜索并获得人、鼠等九种物种的九条α-乳白蛋白基因的编码蛋白序列，加上本发明获得的SEQ ID NO.2序列，利用分子生物学软件MEGA4构建了系统发生树见附图3。结果显示，双峰驼α-乳白蛋白基因同狗、大熊猫的亲缘关系最近。

在编码序列基础上将人、鼠、羊、鲸等不同物种α-乳白蛋白基因的CDS序列和氨基酸序列进行同源性比较；对包括双峰驼在内的10个物种的10个α-乳白蛋白基因的CDS序列构建了系统发生树。

本发明中的双峰驼α-乳白蛋白基因的cDNA序列是通过以双峰驼肝脏组织中总RNA为模板，参考人、鼠等物种的α-乳白蛋白基因的同源序列设计引物，进行反转录PCR而获得的新基因序列。获得的双峰驼α-乳白蛋白基因cDNA序列见SEQ ID NO.1。将双峰驼α-乳白蛋白基因cDNA序列中的编码序列（CDS）按通用密码子翻译成的蛋白质编码序列见SEQ ID NO.2。

在SEQ ID NO.1中，RT-PCR产物长度为437bp，电泳结果见附图1， 其中4-6位为起始密码子ATG，430-432位为终止密码子TGA，4-432位为编码蛋白质区域（CDS）。在SEQ ID NO.1，双峰驼α-乳白蛋白基因编码142个氨基酸。双峰驼与九种动物α-乳白蛋白的蛋白相似性见表一。双峰驼和人、鼠、牛等动物用Clustal X 中对齐的α-乳白蛋白基因编码氨基酸序列同源性比较结果见附图2。其中十种动物α-乳白蛋白氨基酸个数及分子量见表二。其中十种动物乳铁蛋白氨基酸比例（%）见表三。

对包括SEQ ID NO.1在内的十个物种的十条α-乳白蛋白基因的CDS序列构建了系统发生树，结果发现，双峰驼与人、鼠、牛等物种的α-乳白蛋白的氨基酸序列有很高的相似性。 

本发明双峰驼α-乳白蛋白是乳清蛋白的主要成分之一，具有调节产乳的功能，还有细胞溶解活性，诱导细胞生长抑制和细胞凋亡等多种功能，是驼乳中非常重要的一种蛋白质，同时α-乳白蛋白含有丰富的色氨酸，色氨酸有助于促进宝宝的神经发育，是调节睡眠、食欲情绪的重要因子。而且，α-乳白蛋白是必需氨基酸和支链氨基酸的极好来源，也是唯一能与金属元素和钙元素结合的乳清蛋白成分。该发明构建的双峰驼的α-乳白蛋白序列及进化树可以直观的表现出双峰驼α-乳白蛋白与其他物种此蛋白序列的差异，为以后驼乳在食品中的添加和进一步的生化研究提供实验数据，所以本发明具有很高的应用价值。

以上技术特征构成了本发明的实施例，其具有较强的适应性和实施效果，可根据实际需要增减非必要的技术特征，来满足不同情况的需求。

序   列   表

<110> 新疆旺源驼奶实业有限公司

<120>  双峰驼α-乳白蛋白的蛋白编码序列

<160>  4     

<210>  1

<211>  437

<212>  DNA

<213>  阿拉善盟双峰驼

<400>  1

aaaatgatgt ccttggtctc tctgctcctg gtgggcatcc tgttccctac catccaggcc        60

aaacaattta caaaatgtaa gctgtccgac gagctgaaag acatgaatgg ccacggaggc       120

atcactctgg ctgaatggat ctgtatcata tttcacatga gcggttatga cacagaaact       180

gtagtttcta acaatggcaa cagagaatat ggactcttcc agatcaacaa taaaatttgg       240

tgcagagaca atgagaacct tcagtcaagg aacatctgcg acatctcctg tgacaagttc       300

ctggatgatg acctcactga cgacaaaatg tgtgccaaga agatcctgga taaggaagga       360

attgactact ggttggccca taaaccactc tgttctgaga agctggagca gtggcaatgt       420

gagaagtggt gatcttg                                                      437

<210>  2

<211>  142

<212>  PRT

<213>  阿拉善盟双峰驼

<400>  2

Met Met Ser Leu Val Ser Leu Leu Leu Val Gly Ile Leu Phe Pro Thr 

1                5                  10                  15

Ile Gln Ala Lys Gln Phe Thr Lys Cys Lys Leu Ser Asp Glu Leu Lys 

            20                  25                  30

Asp Met Asn Gly His Gly Gly Ile Thr Leu Ala Glu Trp Ile Cys Ile 

        35                  40                  45

Ile Phe His Met Ser Gly Tyr Asp Thr Glu Thr Val Val Ser Asn Asn 

    50                  55                  60

Gly Asn Arg Glu Tyr Gly Leu Phe Gln Ile Asn Asn Lys Ile Trp Cys 

65                  70                  75                  80

Arg Asp Asn Glu Asn Leu Gln Ser Arg Asn Ile Cys Asp Ile Ser Cys 

                85                  90                  95

Asp Lys Phe Leu Asp Asp Asp Leu Thr Asp Asp Lys Met Cys Ala Lys 

            100                 105                 110

Lys Ile Leu Asp Lys Glu Gly Ile Asp Tyr Trp Leu Ala His Lys Pro 

        115                 120                 125

Leu Cys Ser Glu Lys Leu Glu Gln Trp Gln Cys Glu Lys Trp

    130                 135                 140

<210>  3

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工

<400>  3

tatttagtgg tattggtggt tgg                                        23

<210>  4

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工

<400>  4

tattctgtgc tgtcattgttttg                                          23

Claims (10)

1.一种双峰驼α-乳白蛋白基因，其特征在于该基因是一种乳品中除具有易消化吸收的特点外、还具有杀菌和诱导肿瘤细胞凋亡的功能密切相关的基因，具有SEQ ID NO.1中从核苷酸第4-432位的核苷酸序列。

2.一种根据权利要求1所述的双峰驼α-乳白蛋白基因的重组蛋白。

3.根据权利要求2所述的重组蛋白，其特征在于该重组蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

4. 根据权利要求2或3所述的重组蛋白，其特征在于该重组蛋白为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。

5.根据权利要求2或3所述的重组蛋白，其特征在于该重组蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

6.根据权利要求4所述的重组蛋白，其特征在于该重组蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

7.根据权利要求2或3所述的重组蛋白，其特征在于通过设计一对引物从双峰驼α-乳白蛋白中得到双峰驼α-乳白蛋白基因，该引物对的核苷酸序列正向引物为SEQ ID NO.3和反向引物为SEQ ID NO.4，其序列信息如下：

SEQ ID NO.3：5’- ATGAAGCTCTTCTTCCCCGCC -3’，

SEQ ID NO.4：5’- TATTCTGTGCTGTCATTGTTTTG -3’。

8.根据权利要求4所述的重组蛋白，其特征在于通过设计一对引物从双峰驼α-乳白蛋白中得到双峰驼α-乳白蛋白基因，该引物对的核苷酸序列正向引物为SEQ ID NO.3和反向引物为SEQ ID NO.4，其序列信息如下：

SEQ ID NO.3：5’- ATGAAGCTCTTCTTCCCCGCC -3’，

SEQ ID NO.4：5’- TATTCTGTGCTGTCATTGTTTTG -3’。

9.根据权利要求5或6所述的重组蛋白，其特征在于通过设计一对引物从双峰驼α-乳白蛋白中得到双峰驼α-乳白蛋白基因，该引物对的核苷酸序列正向引物为SEQ ID NO.3和反向引物为SEQ ID NO.4，其序列信息如下：

SEQ ID NO.3：5’- ATGAAGCTCTTCTTCCCCGCC -3’，

SEQ ID NO.4：5’- TATTCTGTGCTGTCATTGTTTTG -3’。

10.一种根据权利要求1所述的双峰驼α-乳白蛋白基因的克隆方法，按下述步骤进行：第一步，组织分离(Isolation)；第二步，总RNA的分离(Total RNA isolation)，总RNA的分离(Total RNA isolation)包括提取RNA的准备工作、组织总RNA提取、组织总RNA的鉴定；第三步，全长cDNA的克隆(Cloning of Full-length cDNA)，全长cDNA的克隆(Cloning of Full-length cDNA)包括引物设计及合成、RT-PCR扩增、克隆和测序，该引物对的核苷酸序列正向引物为SEQ ID NO.3和反向引物为SEQ ID NO.4，其序列信息如下：

SEQ ID NO.3：5’- ATGAAGCTCTTCTTCCCCGCC -3’，

SEQ ID NO.4：5’- TATTCTGTGCTGTCATTGTTTTG -3’。

Images