CN103966191A - 一种重组牛源性胰蛋白酶的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了重组牛源性胰蛋白酶（TRY）的制备方法以及所用的重组牛源性胰蛋白酶原类似物。本发明是在大肠杆菌系统中表达TRY酶原类似物的方法，表达量高，更进一步提供无需经过变性和复性的可溶性表达方法，在直接酶切去除前肽后即可得到有活性的TRY，并且后续的纯化步骤也简单方便。制备的重组牛源性胰蛋白酶可用于生产重组人胰岛素及人胰岛素类似物。

Description

一种重组牛源性胰蛋白酶的制备方法

技术领域

本发明涉及牛源性胰蛋白酶原类似物，具体地说，涉及重组牛源性胰蛋白酶原类似物，还涉及应用该类似物制备胰蛋白酶的方法。

背景技术

胰蛋白酶 (胰蛋白酶，简称TRY，EC 3.4.21.4）是一种由胰腺分泌的肽链内肽酶。胰腺最初分泌没有活性的胰蛋白酶原，然后在小肠内经过胰蛋白酶或肠激酶的活化成为有活性的胰蛋白酶，有活性的胰蛋白酶又能自动催化活化更多胰蛋白酶原。牛源性胰蛋白酶含223个氨基酸残基，分子量为23.3kDa。

胰蛋白酶能选择地水解蛋白质中所有的由赖氨酸Lys或精氨酸Arg的羧基所构成的肽链，其不仅起消化酶的作用，而且还能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体而起到活化酶原的作用。胰蛋白酶是特异性最强的蛋白酶，在决定蛋白质的氨基酸排列的步骤中，它成为不可缺少的工具。

胰蛋白酶在临床上用于脓胸、血胸、外科炎症、溃疡、创伤性损伤、瘘管等所产生的局部水肿、血肿及脓肿等，其还常用于动物细胞培养前对组织的处理。在基因工程领域，胰蛋白酶也获得了越来越广泛的应用，特别在重组人胰岛素及人胰岛素类似物的生产过程中，胰蛋白酶是不可或缺的工具酶，其比活性的高低及稳定性是影响胰岛素原活化收率的一个至关重要的参数。这其中尤以牛源性胰蛋白酶（Trypsin Bovine）作为目前被研究最多的胰蛋白酶之一，被广泛应用。

目前制备活性胰蛋白酶的方法主要包括两种：一种是从动物如猪、牛的胰脏中提取，该方法相对简单，但是该方法目前并不能完全去除其他蛋白质，并且还可能使所制备的胰蛋白酶中含有感染物质，如病毒、朊病毒等，因此应用存在一定的局限性；另一种是采用基因重组的方法制备，例如在大肠杆菌中通过基因重组的方法制备人源或猪源胰蛋白酶，该方法先经表达得到不具活性的胰蛋白酶原包涵体，然后使胰蛋白酶原包涵体经过变性、复性过程，再经过酶切切去酶原的前肽部分，才能得到有活性的酶。而在所述变性、复性过程中，复性率不可能达到100%，因此该方法费时费力，产率不高。中国专利200910055493.8公开了一种可溶性表达重组胰蛋白酶的方法，但是该方法只涉及人源性胰蛋白酶，而且需要连接40-200个氨基酸的前肽才能掩盖胰蛋白酶的天然活性。由此可知，目前采用基因重组制备的主要是人源性和猪源性胰蛋白酶，但是在将胰蛋白酶作为工具酶实际应用于蛋白质酶切时，人源性和猪源性的胰蛋白酶不如牛源性的应用效果好，即用人源和猪源胰蛋白酶酶切某些重组融合蛋白时效果不佳，收率很低，这可能是因为不同物种胰蛋白酶氨基酸序列的差异性会导致酶切行为的不同。

而目前，还没有关于在大肠杆菌中制备重组牛源性胰蛋白酶的报导，也没有可溶性表达牛源胰蛋白酶的报导。这可能是由于牛源性胰蛋白酶具有六对二硫键，一定程度上造成其在大肠杆菌中表达时难以形成正确构象且易于自溶。因此，现在仍需要表达量高，活性好且适用于生产的重组胰蛋白酶，以及新的制备活性胰蛋白酶的方法，既能够高水平地重组表达胰蛋白酶，又能够很简单方便地进行表达后的处理工艺。

发明内容

为了解决现有的上述问题，本发明的目的是提供一种重组牛源性胰蛋白酶原类似物以及应用该酶原类似物制备牛源胰蛋白酶的方法，该方法实现了在大肠杆菌中高产量的制备牛源性胰蛋白酶。

本发明的另一个目的是提供一种在大肠杆菌中可溶性表达牛源性胰蛋白酶原类似物的方法，将该方法制备得到的牛源性胰蛋白酶原类似物直接酶切去除前肽后即可得到有活性的胰蛋白酶，并且后续的纯化步骤也简单方便。

因此，为了实现本发明的目的，本发明采用如下的技术方案：

首先，本发明提供一种重组牛源性胰蛋白酶原类似物，其序列结构从N端到C端依次包括A1-A2-A3，其中A1序列由1-4个氨基酸组成，所述氨基酸选自A、F、P、V、D、S或K，A2序列为TRY酶切位点序列，A3序列为具有牛源性胰蛋白酶活性的蛋白质序列。

上述胰蛋白酶原类似物被酶切后具有胰蛋白酶活性。本发明前肽序列A1的引入，只在N端加了1-4个氨基酸，不仅能够在和胰蛋白酶共同表达时掩盖胰蛋白酶的活性，副作用小，使胰蛋白酶高表达，还可以帮助该胰蛋白酶原类似物折叠成正确的蛋白质三维结构，从而实现在大肠杆菌中表达牛源胰蛋白酶。此外，通过各方面的调节，例如N端加入特定的氨基酸、采用可溶性表达载体等，还能进一步实现可溶性表达，对后续操作影响较小，纯化后经酶切激活，不需要变性复性，可获得有活性的重组牛源性胰蛋白酶。在本发明优选的实施方式中，所述A1序列选自AFPV、V、S或AFPS。

其中A2序列所述的TRY酶切位点序列，为本领域技术人员公知的技术，任何现有技术中的TRY酶切位点序列都可应用于本发明，例如但不限于由1-7个氨基酸组成，所述氨基酸选自R、S、D、N或K。在本发明优选的实施方式中，所述TRY酶切位点序列为DDDDK。

其中A3序列所述的具有胰蛋白酶活性的蛋白质是指牛源性胰蛋白酶。

在本发明优选的实施方式中，所述的重组牛源性胰蛋白酶原类似物，其结构包含选自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的氨基酸序列。

在本发明更优选的实施方式中，所述的重组牛源性胰蛋白酶原类似物，其结构的N端包括组氨酸标签，即所述胰蛋白酶原的结构从N端到C端依次为组氨酸标签-A1-A2-A3。需要说明的是，所带的组氨酸标签并不是必需的，若所选的载体中自带组氨酸标签，则表达产物的N端带有该标签，以便于进一步纯化。

本发明还提供编码所述的重组牛源性胰蛋白酶原类似物的核苷酸序列。

其中编码所述具有胰蛋白酶活性的蛋白质的核苷酸序列可根据所用宿主的密码子偏好性来确定，以增加宿主的表达效率。该确定方法为本领域技术人员所公知的技术，具体的核苷酸序列的确定方法可参见例如内蒙古大学学报：大肠杆菌和酵母密码子使用对比, 2006, Vol.37, No.1:34-39。在本发明优选的实施方式中，是采用大肠杆菌为宿主，所用的模版是编码天然牛源性胰蛋白酶原的核苷酸序列，具体是SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。

在本发明优选的实施方式中，编码所述的重组牛源性胰蛋白酶原类似物的核苷酸序列包含SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列。

本发明进一步提供一种表达载体，包含编码所述重组牛源性胰蛋白酶原类似物的核苷酸序列。所述的载体还可包含与所述核苷酸序列操作性相连的表达调控序列，以便于所述重组牛源性胰蛋白酶原的表达。

另外，本发明提供一种重组牛源性胰蛋白酶的制备方法，该方法是以大肠杆菌作为表达宿主的包涵体表达方法，包括以下步骤：

1）通过引物对编码胰蛋白酶酶原的SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列进行PCR扩增；

2）将扩增后的产物与质粒整合得到重组胰蛋白酶酶原表达载体，其中所述重组胰蛋白酶酶原表达载体载有编码本发明所述重组胰蛋白酶原类似物的核苷酸序列；

3）将上述载体转化至大肠杆菌宿主；

4）诱导上述大肠杆菌宿主表达胰蛋白酶酶原包涵体；

5）将上述包涵体变性复性得到胰蛋白酶酶原；

6）纯化上述胰蛋白酶酶原；

7）酶切上述纯化后的胰蛋白酶酶原，生成胰蛋白酶；

8）纯化上述胰蛋白酶。

通过上述方法能够获得较高活性的牛源性胰蛋白酶。

为了进一步提高活性蛋白的产量，本发明还提供一种重组牛源性胰蛋白酶的制备方法，该方法是以大肠杆菌作为表达宿主的可溶性表达方法，包括以下步骤：

1）通过引物对编码胰蛋白酶酶原的SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列进行PCR扩增；

2）将扩增后的产物与质粒整合得到重组胰蛋白酶酶原表达载体，其中所述重组胰蛋白酶酶原表达载体载有编码本发明所述重组胰蛋白酶原类似物的核苷酸序列；

3）将上述载体转化至大肠杆菌宿主；

4）诱导上述大肠杆菌宿主表达胰蛋白酶酶原；

5）纯化上述胰蛋白酶酶原；

6）酶切上述纯化后的胰蛋白酶酶原，生成胰蛋白酶；

7）纯化上述胰蛋白酶。

其中步骤2）所述质粒可以为任意一种能够有助于蛋白形成可溶性表达的质粒。在本发明优选的实施方式中，所述质粒选自pET28a、pBV220、pQE30、pET32a、pNJUTRX-1、pET21a其中之一。

其中步骤3）所述大肠杆菌宿主作为目的蛋白的表达系统，为本领域的公知技术，因此本发明的方法对大肠杆菌宿主的种类没有任何限制。优选那些能够直接表达构象正确的目的蛋白的宿主，无需后续的变性和复性过程。在本发明优选的实施方式中，所述大肠杆菌菌株可选自DH5α、HB101、JM109、TOP10、BL21、M110、SCS110其中之一。

其中步骤4）所述诱导宿主表达蛋白的方法可采用本领域技术人员所公知的技术，例如参见Qiagen: Protein expression and purification Protocol。在本发明优选的实施方式中，是在诱导表达过程中，使用浓度为0.1mM至10mM的IPTG（ 异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷）在15℃至37℃温度下进行诱导，使得目的蛋白可以获得更高效的表达。

其中步骤5）所述纯化胰蛋白酶酶原的方法可采用本领域技术人员所公知的技术，具体方法可参见例如Qiagen: Protein expression and purification Protocol。例如采用离子交换和苯基疏水层析方法。

在本发明优选的实施方式中，是在所述胰蛋白酶原的结构中包含组氨酸标签，带有该组氨酸标签的表达产物易于纯化收集，回收率更高。这时纯化步骤是采用Ni²⁺-NTA基质进行，并通过梯度为20mM至250mM的咪唑溶液洗脱或pH梯度洗脱N端带有组氨酸标签的胰蛋白酶酶原，可以有效的将带有组氨酸标签的目的蛋白跟杂蛋白分开，得到纯度极高活性蛋白。

其中步骤6）所述酶切方法可采用本领域技术人员所公知的肠激酶或胰蛋白酶酶切方法，具体方法可参见例如上海索莱宝生物科技有限公司的产品说明书。

其中步骤7）所述纯化胰蛋白酶的步骤无需洗脱而用PBS缓冲液收集透过即可获得胰蛋白酶产品。活性测定表明利用大肠杆菌可溶性表达制备得到的重组牛源性胰蛋白酶与经变性复性制备得到的重组牛源性胰蛋白酶的活性相似。

与现有技术相比，本发明所提供的重组牛源性胰蛋白酶原类似物，以及制备重组牛源性胰蛋白酶的方法具有以下优点：

1、通过在重组牛源性胰蛋白酶原中引入A1序列，实现了在大肠杆菌系统中表达牛源性胰蛋白酶原类似物，从而相应的制备牛源性胰蛋白酶。

2、采用的大肠杆菌表达系统具有可控性高、方便操作的优点，相比于其他表达系统表达量通常较高。

3、在可溶性表达系统中进行重组表达，表达产物胰蛋白酶酶原结构与胰蛋白酶相似，无需经过变性和复性，且产量较高，其存在于菌体中，在直接酶切去除前肽后即可得到结构正确且有活性的胰蛋白酶。

4、胰蛋白酶对菌体有降解作用，同时还有一定的自溶现象，本方法所获得的是没有活性的酶原，因此基本上消除或抑制了上述现象。

5、表达生成N端带有组氨酸标签（His tag）的胰蛋白酶酶原有利于纯化收集，使得酶原在后续的亲和纯化过程中，能够使纯化产物保留在洗脱液中，纯化产物体积小，不需后续浓缩步骤。

6、使用本方法获得的胰蛋白酶即可用于本方法中的酶切反应，无需再使用其他工具酶，既不引入杂蛋白又节约成本，可实现连续生产。

7、酶切后，胰蛋白酶失去组氨酸标签，酶切产物纯化时无需经过洗脱即可达到纯化目的，获得胰蛋白酶。

附图说明

图1为采用本发明的方法制备得到的实施例1、3、5、7重组胰蛋白酶原类似物的SDS-PAGE电泳检测图。

图2为采用本发明的方法制备得到的实施例1、3、5、7重组胰蛋白酶原类似物的western-blot检测图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。如本文所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”。

材料：

菌株和质粒：克隆菌种Escherichia coli (DH5α、TOP10)是基因工程常用工具菌种；表达菌株JM109、BL21、SCS110，质粒pET28a、pBV220、pQE30、pET32a、pNJUTRX-1购自鼎国昌盛生物技术有限责任公司。

酶和试剂：

实施例中涉及分子生物学操作所用的酶均购于北京经科宏达公司，相应的操作步骤完全按照相关的产品说明书进行。

琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒、PCR产物纯化试剂盒均购于北京天根公司(TianGen)，相应的操作步骤完全按照相关的产品说明书进行。

实施例中所涉及的编码胰蛋白酶酶原的核苷酸序列的合成、引物的合成和DNA的测序工作由北京诺赛基因公司完成。

TAME购于sigma公司。

培养基：

以下培养基为固体及液体培养基：LB培养基、AMP抗性LB培养基、Kan抗性培养基。以上培养基是基因工程领域常用培养基，各培养基的配方可参见分子克隆第三版下册附录2。

其他未标明来源的原、辅料均为市售产品。

方法：

实施例不包括对传统方法的详细描述，如那些聚合酶链式反应，PCR产物纯化，基因和质粒的酶切、回收、连接和转化，以及大肠杆菌转化子的筛选，鉴定，这些基因工程常规操作方法，对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，可参见Sambrook J，Fristsh EF, Maniatis T．Molecular Cloning; A Laboiatory Manual 2nd ed. NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, pp.16-340。

实施例1 包涵体表达制备重组牛源性胰蛋白酶原类似物1

一、重组牛源性胰蛋白酶酶原表达载体的构建

1、构建胰蛋白酶酶原基因：按照大肠杆菌密码子偏好性化学合成编码阴性胰蛋白酶酶原的核苷酸序列，最终核苷酸序列为SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列。

2、以上述合成的核苷酸序列作为模板，以设计的两条引物为上下游引物，进行PCR扩增，其中，

反应引物序列为：

上游引物Pet28-cation-bSF：

AGTCATATGGCATTCCCATCGGACGACGATGACAAGATC (SEQ ID NO: 11)

下游引物Pet28-cation-bR：

CTACTCGAGTTAATTGGAAGCGATGGTCTGCTT (SEQ ID NO:12)

反应PCR体系为：

扩增条件为：

95℃ 2 min；

95℃ 20 sec、55℃ 20 sec、72℃ 40s 35个循环；

72℃ 10 min。

3、将上述PCR产物用PCR纯化试剂盒进行纯化。

4、使用限制性内切酶Nde I和Xho I对上述PCR纯化产物进行双酶切，并用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行切胶回收。

5、使用限制性内切酶NdeI和Xho I对质粒pET28a进行双酶切，并用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行切胶回收。

6、使用T4连接酶连接步骤（4）和步骤（5）中回收的片段，其中胰蛋白酶酶原基因酶切产物与质粒酶切产物的浓度比为1:2-8。

7、将上述连接产物通过CaCl₂转化的方法导入到Escherichia coli(DH5α)中，并涂布于LB培养基，在摇床中200rpm，37℃培养1小时，然后取菌液铺于Kan抗性LB培养基，37℃培养过夜。

8、挑选8至20个转化子，分别接入Kan抗性LB培养基中，培养过夜。第二天再从这些过夜培养物中用质粒抽提试剂盒提取质粒。把提取的质粒送到北京诺赛基因公司进行序列测定，以鉴定阳性克隆，选出载有含有SEQ ID NO: 7的正确基因的胰蛋白酶酶原质粒。

二、重组牛源性胰蛋白酶酶原大肠杆菌工程菌的构建

将上述载有正确基因的连接产物即重组胰蛋白酶原表达载体通过CaCl₂转化的方法导入到Escherichia coli (BL21)中，并涂布于LB培养基，在摇床中200rpm，37℃培养1小时，然后取菌液铺于Kan抗性LB培养基，37℃培养过夜。

三、重组牛源性胰蛋白酶酶原表达工程菌的诱导表达破碎

将上述工程菌按照2%接种量接种于5ml LB液体培养基中，37℃，200rpm培养，待其生长起来后，将其按照0.1%接种量接种于1LLB液体培养基中，37℃，200rpm培养，待OD_600nm为约1时，加入终浓度为1mM的IPTG，28℃诱导16小时，10mim、4000rpm离心收集菌体。

将菌体用1:10体积PBS溶液pH7.4重悬菌体，同时加入1:100PMSF（苯甲基磺酰氟），使用超声波细胞粉碎机（成都生科仪器）破碎细胞后，40min、9500rpm离心收集沉淀。

四、重组牛源性胰蛋白酶原包涵体变性复性

将收集的沉淀使用纯化水重悬40min、9500rpm离心收集沉淀，重复1次。将沉淀使用8M的尿素溶液溶解，并加入终浓度为10mM的β-巯基乙醇，使用NaOH和HCl调节pH至9.0±0.05，室温搅拌0.5h，缓慢滴加纯化水，将尿素浓度稀释至1M以下后调节pH为9.0±0.05，4℃放置16h。

使用HCl将pH调节至7.5±0.1，离心除去沉淀。

得到纯品重组牛源性胰蛋白酶原类似物1，经氨基酸序列分析，其氨基酸序列从N端依次为SEQ ID NO: 19和SEQ ID NO: 1所连接的序列，其中SEQ ID NO: 19为质粒pET28a表达出来的一段包含His标签的序列。通过280nm紫外吸收测量蛋白含量，通过SDS-PAGE检测仅可见一条带，如图1所示，其western blot检测见图2，HPLC检测重组牛源性胰蛋白酶原类似物1的纯度约为65%。

实施例2 制备重组牛源性胰蛋白酶1

一、酶切重组牛源性胰蛋白酶酶原

将上述实施例1制备的经复性的10mg/ml的重组牛源性胰蛋白酶原类似物1加入比例为2U/ml的重组肠激酶（上海启发，此肠激酶自带His标签），10℃酶切10h后用HCl调节pH为4.0终止反应。

二、重组牛源性胰蛋白酶纯化

将上述酶切产物用SP预装柱（韦氏公司定制）进行纯化，首先使用10mM pH4.0柠檬酸缓冲液含0.1MNaCl进行洗脱以除去杂蛋白，然后用含250mM NaCl的柠檬酸缓冲液pH4.0洗脱目的蛋白（胰蛋白酶），收集组分峰，得到胰蛋白酶溶液。

将上述胰蛋白酶溶液用脱盐柱（北京中原公司）去除NaCl，洗脱液为10mM 柠檬酸，pH为3.5±0.02的溶液，收集组分峰，得到纯品重组牛源性胰蛋白酶溶液。将所得重组牛源性胰蛋白酶经氨基酸序列分析，所得结构与预期一致。每升发酵液可获得0.1mg的重组牛源性胰蛋白酶1。

实施例3 包涵体表达制备重组牛源性胰蛋白酶原类似物2

制备方法同实施例1，即以合成的SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列作为模板，设计的两条引物为上下游引物，进行PCR扩增，其中，

反应引物序列为：

上游引物Pet28-cation-bSF：

AGTCATATGTCGGACGACGATGACAAGATC (SEQ ID NO:13)

下游引物Pet28-cation-bR：

CTACTCGAGTTAATTGGAAGCGATGGTCTGCTT (SEQ ID NO:14)

所用的表达菌株为JM109。

把提取的质粒送到北京诺赛基因公司进行序列测定，以鉴定阳性克隆，选出载有含有SEQ ID NO: 8所示的正确基因的胰蛋白酶酶原质粒。

按照同实施例1的方法，构建重组牛源性胰蛋白酶酶原大肠杆菌工程菌，将重组牛源性胰蛋白酶酶原表达工程菌诱导表达破碎，并将重组牛源性胰蛋白酶原包涵体变性复性，得到纯品重组牛源性胰蛋白酶原类似物2。

经氨基酸序列分析，上述重组牛源性胰蛋白酶原类似物2的氨基酸序列从N段依次为SEQ ID NO: 19和SEQ ID NO: 2所连接的序列，其中SEQ ID NO: 19为质粒pET28a表达出来的一段包含His标签的序列。通过280nm紫外吸收测量蛋白含量，通过SDS-PAGE检测仅可见一条带，如图1所示，其western blot检测见图2，HPLC检测重组牛源性胰蛋白酶原类似物2的纯度约为60%。

实施例4制备重组牛源性胰蛋白酶2

按照实施例2的方法，将实施例3制备得到的重组牛源性胰蛋白酶原类似物2的浓度约为10mg/ml的溶液加入比例为2U/ml的重组肠激酶进行酶切，以及纯化得到纯品重组牛源性胰蛋白酶2溶液。将所得重组牛源性胰蛋白酶经氨基酸序列分析，所得结构与预期一致。每升发酵液可获得0.1mg的重组牛源性胰蛋白酶2。

实施例5可溶性表达制备重组牛源性胰蛋白酶原类似物3

一、重组牛源性胰蛋白酶酶原表达载体的构建

1、构建胰蛋白酶酶原基因：按照大肠杆菌密码子偏好性化学合成编码阳性胰蛋白酶酶原的核苷酸序列，最终核苷酸序列为SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。

2、上述合成的核苷酸序列作为模板，以设计的两条引物为上下游引物，进行PCR扩增，其中，

反应引物序列为：

上游引物Pet32-cation-bSF：

AATGGTACCGTGGATGATGATGATAAGATC (SEQ ID NO:15)

下游引物Pet28-cation-bR：

CTACTCGAGTTAATTGGAAGCGATGGTCTGCTT (SEQ ID NO:16)

反应PCR体系为：

扩增条件为：

95℃ 2 min；

95℃ 20 sec、55℃ 20 sec、72℃ 40s 35个循环；

72℃ 10 min。

3将上述PCR产物用PCR纯化试剂盒进行纯化。

4使用限制性内切酶Nco I和Xho I对上述PCR纯化产物进行双酶切，并用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行切胶回收。

5使用限制性内切酶NcoI和Xho I对质粒pET32a进行双酶切，并用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行切胶回收。

6使用T4连接酶连接步骤（4）和步骤（5）中回收的片段，其中胰蛋白酶酶原基因酶切产物与质粒酶切产物的浓度比为1:2-3。

7将上述连接产物通过CaCl₂转化的方法导入到Escherichia coli (DH5α)中，并涂布于LB培养基，在摇床中200rpm，37℃培养1小时，然后取菌液铺于AMP抗性LB培养基，37℃培养过夜。

8挑选8至20个转化子，分别接入Amp抗性LB培养基中，培养过夜。第二天再从这些过夜培养物中用质粒抽提试剂盒提取质粒。把提取的质粒送到北京诺赛基因公司进行序列测定，以鉴定阳性克隆，选出载有含有序列SEQ ID NO: 9的正确基因的胰蛋白酶酶原质粒。

二、重组牛源性胰蛋白酶酶原大肠杆菌工程菌的构建

将上述载有正确基因的连接产物即重组胰蛋白酶原表达载体通过CaCl₂转化的方法导入到Escherichia coli (BL21)中，并涂布于LB培养基，在摇床中200rpm，37℃培养1小时，然后取菌液铺于AMP抗性LB培养基，37℃培养过夜。

三、重组牛源性胰蛋白酶酶原表达工程菌的诱导表达破碎

将上述工程菌按照2%接种量接种于5ml LB液体培养基中，37℃，200rpm培养，待其生长起来后，将其按照0.1%接种量接种于1LLB液体培养基中，37℃，200rpm培养，待OD_600nm为约1时，加入终浓度为1mM的IPTG，28℃诱导16小时，10mim、4000rpm离心收集菌体。

将菌体用1:10体积PBS溶液pH7.4重悬菌体，同时加入1:100PMSF，使用超声波细胞粉碎机（成都生科仪器）破碎细胞后，40min、9500rpm离心收集上清。

四、重组牛源性胰蛋白酶酶原纯化

将破碎上清用NTA-Ni预装柱（北京中原公司）进行纯化，首先使用20mM咪唑进行洗脱以除去杂蛋白，然后250mM咪唑洗脱目的蛋白（胰蛋白酶酶原），收集组分峰，得到含有咪唑的胰蛋白酶酶原溶液。

将上述含有咪唑的胰蛋白酶酶原溶液用脱盐柱（北京中原公司）去除咪唑，洗脱液为包含24.75mM Tris和100mM NaCl，pH为7.65的溶液，收集组分峰，得到纯品重组牛源性胰蛋白酶原类似物3。

经氨基酸序列分析，上述重组牛源性胰蛋白酶原类似物3的氨基酸序列由N端依次为105个氨基酸的Trx标签、SEQ ID NO: 20和SEQ IDNO: 3所连接的序列，其中SEQ ID NO: 20为质粒pET32a表达出来的一段包含His标签的序列。通过280nm紫外吸收测量蛋白含量，通过SDS-PAGE检测样品仅可见一条带，如图1所示，其western blot检测见图2，HPLC检测重组牛源性胰蛋白酶原类似物3的纯度约为76%。

实施例6 制备重组牛源性胰蛋白酶3

一、酶切重组牛源性胰蛋白酶酶原

将上述实施例5制备的经脱盐的重组牛源性胰蛋白酶原类似物3的浓度约为10mg/ml的溶液加入比例为2U/ml的重组肠激酶（上海启发，此肠激酶自带His标签），37℃酶切16h。

二、重组牛源性胰蛋白酶纯化

将酶切产物用NTA-Ni预装柱（北京中原公司）进行纯化，可将酶切后的溶液无需额外处理直接进行纯化，因目的蛋白His标签已经被切除，上样收集穿透液即为纯品重组牛源性胰蛋白酶3溶液。将所得重组牛源性胰蛋白酶经氨基酸序列分析，所得结构与预期一致。吸附的其他杂质可用含高浓度咪唑（如500mM）的PBS缓冲液洗脱，实现循环生产。每升发酵液可获得3mg的重组牛源性胰蛋白酶3。

实施例7 可溶性表达制备重组牛源性胰蛋白酶原类似物4

制备步骤同实施例5，即以合成的SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列作为模板，不同的是所设计的两条上下游引物，进行PCR扩增，其中，

反应引物序列为：

上游引物Pet32-cation-bSF：

AATGGTACCGCATTCCCAGTGGATGATGATGATAAGATC (SEQ ID NO:17)

下游引物Pet28-cation-bR：

CTACTCGAGTTAATTGGAAGCGATGGTCTGCTT (SEQ ID NO:18)

所用的菌株为SCS110。

把提取的质粒送到北京诺赛基因公司进行序列测定，以鉴定阳性克隆，选出载有包含SEQ ID NO: 10的正确基因的胰蛋白酶酶原质粒。

按照同实施例5的方法，构建重组牛源性胰蛋白酶酶原大肠杆菌工程菌，将重组牛源性胰蛋白酶酶原表达工程菌的诱导表达破碎，并将重组牛源性胰蛋白酶酶原纯化，得到纯品重组牛源性胰蛋白酶原类似物4。

经氨基酸序列分析，上述重组牛源性胰蛋白酶原类似物4的氨基酸序列由N端依次为105个氨基酸的Trx标签、SEQ ID NO: 20和SEQ IDNO: 4所连接的序列，其中SEQ ID NO: 20为质粒pET32a表达出来的一段包含His标签的序列。通过280nm紫外吸收测量蛋白含量，通过SDS-PAGE检测仅可见一条带，如图1所示，其western blot检测见图2，HPLC检测重组牛源性胰蛋白酶原类似物4的纯度约为75%。

实施例8 制备重组牛源性胰蛋白酶4

按照实施例6的方法，将实施例7制备的经脱盐的重组牛源性胰蛋白酶原类似物4的浓度约为10mg/ml的溶液加入比例为2U/ml的重组肠激酶进行酶切，以及纯化得到纯品重组牛源性胰蛋白酶4溶液。将所得重组牛源性胰蛋白酶经氨基酸序列分析，所得结构与预期一致。每升发酵液可获得1mg的重组牛源性胰蛋白酶4。

实验例：重组牛源性胰蛋白酶1-4的酶活性测定

1、酶的稀释：分别取上述实施例2、4、6、8制备得到的重组牛源性胰蛋白酶1-4溶液100ul，加0.001N HCl 900ul，此为10倍稀释液A，取10倍稀释液A 100ul，加0.001N的HCl 900ul，此为100倍稀释液B，再取100倍稀释液B 100ul。

2、将分光光度计的波长调为247nm，用移液管吸取已配好的pH值8.1左右的0.046M Tris-HCl 缓冲液2.6ml，放入3ml的比色皿中，再加入0.01M TAME 0.3ml，用此液作空白。

3、样品的操作：重复以上作空白的过程，再加入已稀释100倍的酶0.1ml混匀，立即放入754型紫外可见分光光度计中，每隔30秒记数，至5分钟为止，其线性增长区间必须在3分钟以上。

4、活力单位的计算：选择图谱中的线性部分，计算公式如下：

根据试验将公式形式改变如下：

平行测三个，计算出Trypsin的活性平均值。

其中Trypsin蛋白质浓度的计算方法为：

在比色皿中加入0.001N HCl 2.85ml，分别加重组牛源性胰蛋白酶1-4溶液0.15ml，即将样品稀释20倍，在280nm处测其OD值，平行测3个样，然后根据以下公式计算出Trypsin 酶的浓度：

蛋白质浓度（mg/ml）=A₂₈₀×0.7×稀释倍数×蛋白纯度(HPLC检测出的百分含量)

5、由公式1.TAME UNIT=19.2.CP UNIT，可计算出CP方法的Trypsin效价。

三、检测结果：

上述实施例和活性测定表明，通过本发明方法实现了在大肠杆菌系统中表达牛源性胰蛋白酶原类似物及相应制备牛源性胰蛋白酶，并且所制备得到的牛源性胰蛋白酶都具有较高活性。此外，通过可溶性表达的重组牛源性胰蛋白酶产量（每升发酵液1-3mg）要远高于包涵体表达的重组牛源性胰蛋白酶产量（每升发酵液0.1mg）。

Claims (10)

1.一种重组牛源性胰蛋白酶原类似物，其序列结构从N端到C端依次包括A1-A2-A3，其中A1序列由1-4个氨基酸组成，所述氨基酸选自A、F、P、V、D、S或K，A2序列为TRY酶切位点序列，A3序列为具有牛源性胰蛋白酶活性的蛋白质序列。

2.根据权利要求1所述的重组牛源性胰蛋白酶原类似物，其中所述A1序列选自AFPV、V、S或AFPS。

3.根据权利要求1所述的重组牛源性胰蛋白酶原类似物，其中所述A2序列为DDDDK。

4.根据权利要求1-3任一项所述的重组牛源性胰蛋白酶原类似物，其结构包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的氨基酸序列。

5.编码权利要求1-4任一项所述的重组牛源性胰蛋白酶原类似物的核苷酸序列。

6.根据权利要求5所述的核苷酸序列，包含SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列。

7.一种表达载体，包含权利要求5或6所述的核苷酸序列。

8.一种重组牛源性胰蛋白酶的制备方法，该方法是以大肠杆菌作为表达宿主的包涵体表达方法，包括以下步骤：

1）通过引物对编码胰蛋白酶酶原的SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列进行PCR扩增；

2）将扩增后的产物与质粒整合得到重组胰蛋白酶酶原表达载体，其中所述重组胰蛋白酶酶原表达载体载有的核苷酸序列为权利要求5-7任一项所述的核苷酸序列；

3）将上述载体转化至大肠杆菌宿主；

4）诱导上述大肠杆菌宿主表达胰蛋白酶酶原包涵体；

5）将上述包涵体变性复性得到胰蛋白酶酶原；

6）纯化上述胰蛋白酶酶原；

7）酶切上述纯化后的胰蛋白酶酶原，生成胰蛋白酶；

8）纯化上述胰蛋白酶。

9.一种重组牛源性胰蛋白酶的制备方法，该方法是以大肠杆菌作为表达宿主的可溶性表达方法，包括以下步骤：

1）通过引物对编码胰蛋白酶酶原的SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列进行PCR扩增；

2）将扩增后的产物与质粒整合得到重组胰蛋白酶酶原表达载体，其中所述重组胰蛋白酶酶原表达载体载有的核苷酸序列为权利要求5-7任一项所述的核苷酸序列；

3）将上述载体转化至大肠杆菌宿主；

4）诱导上述大肠杆菌宿主表达胰蛋白酶酶原；

5）纯化上述胰蛋白酶酶原；

6）酶切上述纯化后的胰蛋白酶酶原，生成胰蛋白酶；

7）纯化上述胰蛋白酶。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其中，步骤2）所述质粒选自pET28a、pBV220、pQE30、pET32a、pNJUTRX-1、pET21其中之一；或

步骤3）所述大肠杆菌宿主选自DH5α、HB101、JM109、TOP10、BL21、M110、SCS110其中之一；或

步骤4）所述诱导表达是使用浓度为0.1mM至10mM的IPTG( 异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)在15℃至37℃温度下进行的；或

步骤5）所述的纯化是采用Ni²⁺-NTA基质进行，采用梯度为20mM至250mM的咪唑溶液或pH梯度进行洗脱。