CN105294854B

CN105294854B - 提高胰岛素及其类似物制备效率的方法

Info

Publication number: CN105294854B
Application number: CN201510219297.5A
Authority: CN
Inventors: 常国栋; 周代福; 窦鑫; 刘鹏
Original assignee: Yantai Proji Pharmaceutical Technology Co ltd; Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2014-05-04
Filing date: 2015-05-04
Publication date: 2020-09-08
Anticipated expiration: 2035-05-04
Also published as: CN105294854A

Abstract

本发明提供了对重组表达的甘精胰岛素前体进行纯化的方法，其中包括采用羟基磷灰石介质对所述甘精胰岛素前体进行层析的步骤。本发明还提供了制备有活性的甘精胰岛素的方法，其中包括采用Kex‑2p酶对重组表达的甘精胰岛素前体进行酶切的步骤。在本发明一个优选实施方案中，所述方法包括：获得重组表达的甘精胰岛素前体；采用Kex‑2p酶对所述甘精胰岛素前体进行酶切；对酶切产物进行一步层析纯化，以获得有活性的甘精胰岛素。

Description

提高胰岛素及其类似物制备效率的方法

技术领域

本发明涉及生物制药领域，更具体地说，涉及长效胰岛素类似物甘精胰岛素的制备方法。

背景技术

糖尿病是威胁人类健康的重大疾病，全球发病率逐年上升。胰岛素是治疗糖尿病的关键药物，可有效控制血糖，已经被临床广泛应用和接受。为了满足不同的使用需求，人们研发出了多种胰岛素类似物，在起效时间上为患者提供了多种选择。

胰岛素及其类似物包含A、B两条肽链，通过二硫键相互连接。在重组表达过程中，胰岛素及其类似物通常以融合蛋白形式存在，即A、B两条肽链之间由连接肽(即C链)连接，纯化并得到构象正确的融合蛋白后，再用特定工具酶对融合蛋白进行水解，去除连接肽。胰岛素及其类似物可用酵母菌或大肠杆菌表达，分别具有优势和局限。酵母菌表达的胰岛素及其类似物以可溶形式分泌到发酵液中，可以直接纯化和酶切，但发酵周期长、成本高。大肠杆菌表达的胰岛素及其类似物以包涵体蛋白形式存在，需要经过复性才能够获得天然构象的前体蛋白，然后再进行酶切，但具有发酵周期短、产量高和成本低的优点。可见酶切是一个重要的工艺步骤，对于原核和真核表达体系的产物普遍适用。

甘精胰岛素(insulin glargine)是一种长效胰岛素类似物，具有血药浓度平稳、没有峰值和作用时间长的特点，很受患者欢迎。目前，全世界生产甘精胰岛素的企业只有法国的赛诺菲安万特公司和中国的甘李药业。甘精胰岛素的构建是通过在人胰岛素B链C端添加两个精氨酸，同时将A链C端的N21突变成Gly获得的。甘精胰岛素由于具有这样特殊的氨基酸序列，其制备方法，特别是酶切和酶切后纯化工艺，与野生型重组人胰岛素存在很大差别。特别是由于甘精胰岛素中的两个精氨酸紧邻，常规的胰酶和羧肽酶两步酶切法效率较低，错切率较高，而且副产物较多，为后续纯化工艺带来很大负担，显著提高了甘精胰岛素的制备难度和成本。例如，赛诺菲公司的专利申请CN101253196B中提供了一种使用重组猪胰蛋白酶及其变体切割甘精胰岛素前体的方法，酶切效率分别是58.1％和62.9％；中国专利申请CN 201210532873.8中提供了一种甘精胰岛素前体的酶切转化方法，包括采用牛胰蛋白酶水解甘精胰岛素前体的步骤，其中通过调整酶切反应条件，牛胰蛋白酶的酶切效率可达到86％。

Kex-2p酶是一个特异性水解两个连续碱性氨基酸后羧基端肽键的蛋白酶，酶切位点是后一个碱性氨基酸的羧基端。Kex-2p酶的使用可显著提高甘精胰岛素融合蛋白的酶切效率，显著降低错切率，为后续纯化工艺带来便利。Nagaraj Govindappa等发明了将Kex-2p酶和甘精胰岛素融合蛋白在酵母工程菌中共表达的技术(专利申请号PCT/IB2012/052853，此处通过援引将其全部内容并入本文)，但共表达工程菌中目的蛋白的表达率受到了很大影响，难以满足大规模生产的需求。此外，该酶是一个糖蛋白，分子量大，经原核表达时复性困难。因此，这种共表达的方法在具有多种优势的原核表达体系中难以实现，使该技术的应用进一步受到限制。

提高纯化效率是胰岛素及其类似物产业化的一项迫切需求。胰岛素及其类似物例如甘精胰岛素需要长期用药，因此对纯度有很高的要求。同时，该类药物用药量大，纯化收率对于生产成本至关重要。可以用于胰岛素及其类似物纯化介质的大多是离子交换层析介质，如Q Sepharose Fast Flow、DEAE Sepharose Fast Flow、Source 30Q、Source 15Q、SPSepharose Fast Flow、CM Sepharose Fast Flow、Nuvia HR-S、Nuvia HR-Q等。此外，胰岛素及其类似物经过酶切处理后，一般均需要两步纯化：先用离子交换介质纯化一次，再用高压液相层析进行精纯化，采用的介质主要有C8或者C18。因此，通过调整纯化条件提高纯化收率和目的蛋白纯度是本领域技术人员共同的目标。

羟基磷灰石是一种无机层析介质，由高温烧结的磷酸钙晶体制备而成。根据烧结温度不同，这类介质分为I型和II型，各有20、40和80μm三种直径的产品满足不同的层析要求。该类介质载量大，具有独特的分离性能和优越的选择性和分辨率，广泛应用于抗体及抗体片段、各种球蛋白、各种酸性蛋白以及DNA纯化。然而，该介质只能在pH大于6.8的环境下使用，限制了它的应用范围。

发明内容

发明人惊讶地发现，采用羟基磷灰石介质对重组表达的甘精胰岛素前体进行层析纯化时，取得了优越的效果，而且该方法既适用于甘精胰岛素前体包涵体蛋白的纯化，也适用于甘精胰岛素前体复性蛋白的纯化。在本发明的实施例中，目的蛋白纯度可以达到95％甚至98％，大大提高了甘精胰岛素前体的纯化效率，而且便于后续操作。

本发明一方面提供了一种对重组表达的甘精胰岛素前体进行纯化的方法，其中包括采用羟基磷灰石介质对所述甘精胰岛素前体进行层析的步骤。

在本发明一个实施方案中，所述方法包括如下步骤：对原核表达的甘精胰岛素前体包涵体采用羟基磷灰石介质进行层析；对获得的甘精胰岛素前体包涵体进行复性；以及对复性的甘精胰岛素前体采用羟基磷灰石介质进行层析。

在本发明一个实施方案中，所述对甘精胰岛素前体包涵体采用羟基磷灰石介质进行层析步骤的条件为：层析pH 6.5～11，优选pH 6.8～9.5，以及依次用含有NaCl和NaH₂PO₄的层析液进行盐浓度洗脱，其中NaCl的浓度为0.3-2M，NaH₂PO₄的浓度为5-600mM。

在本发明一个优选实施方案中，所述方法包括如下步骤：在大肠杆菌表达体系中原核表达甘精胰岛素前体，获得甘精胰岛素前体包涵体；对所述甘精胰岛素前体包涵体采用羟基磷灰石介质进行层析，层析条件为：pH 8.0，依次用含有1M NaCl、10mM NaH₂PO₄、50mMNaH₂PO₄和500mM NaH₂PO₄的层析液进行盐浓度洗脱；

对所获得的甘精胰岛素前体包涵体进行复性；并对复性的甘精胰岛素前体采用羟基磷灰石介质进行层析，层析条件为：层析pH 6.5～11，优选pH 6.8～9.5，以及依次用含有NaCl和NaH₂PO₄的层析液进行盐浓度洗脱，其中NaCl的浓度为0.3-2M，NaH₂PO₄的浓度为0-300mM。

在本发明一个优选实施方案中，所述方法包括如下步骤：对所获得的甘精胰岛素前体包涵体进行复性；并对复性的甘精胰岛素前体采用羟基磷灰石介质进行层析，层析条件为：层析pH 8.0，依次用含有500mM NaCl、5mM NaH₂PO₄、20mM NaH₂PO₄和200mM NaH₂PO₄的层析液进行盐浓度洗脱；以及获得纯化的甘精胰岛素前体。

本发明另一方面提供了一种制备有活性的甘精胰岛素的方法，其中包括采用Kex-2p酶对重组表达的甘精胰岛素前体进行酶切的步骤。

在本发明一个实施方案中，所述Kex-2p酶的酶切条件为：Kex-2p酶与甘精胰岛素前体摩尔浓度比为1:1000～10000，如：1：2000、3000、5000、8000或10000；反应温度0～37℃，如：4、10、15、20、25、37℃；反应时间0.5～60小时，可以是：0.5、2、6、12、24、48或60小时。在一个优选实施方案中，所述Kex-2p酶的酶切条件为：Kex-2p酶与甘精胰岛素前体摩尔浓度比为1：3000，4℃反应48小时，或25℃反应12小时。

本发明另一方面提供了一种制备有活性的甘精胰岛素的方法，包括如下步骤：获得重组表达的甘精胰岛素前体；采用Kex-2p酶对所述甘精胰岛素前体进行酶切；使用反相柱对酶切产物进行一步层析纯化，以获得有活性的甘精胰岛素。其中，反相柱可以是C18、C8或C4，反相柱的层析pH为2.5-4.0，如可以用pH 2.5、3.0或4.0。

在本发明一个实施方案中，所述一步层析纯化采用C8反相柱。在一个优选实施方案中，所述C8反相柱层析的条件为：Buffer A含有0.2M Na₂SO₄,50mM H₃PO₄,pH2.5-4，Buffer B含有50％ACN、0.2M Na₂SO₄,50mM H₃PO₄,pH 2.5-4.0，线性梯度洗脱。

本发明另一方面提供了一种制备有活性的甘精胰岛素的方法，包括如下步骤：在大肠杆菌表达体系中原核表达甘精胰岛素前体，获得甘精胰岛素前体包涵体；对所述甘精胰岛素前体包涵体采用羟基磷灰石介质进行层析；对所获得的甘精胰岛素前体包涵体进行复性；对复性的甘精胰岛素前体采用羟基磷灰石介质进行层析，获得纯化的甘精胰岛素前体；采用Kex-2p酶对所述甘精胰岛素前体进行酶切；对酶切产物进行一步层析纯化，以获得有活性的甘精胰岛素。

在本发明一个实施方案中，所述一步层析纯化采用C8反相柱。在一个优选实施方案中，所述C8反相柱层析的条件为：Buffer A含有0.2M Na₂SO₄,50mM H₃PO₄,pH2.5-4.0，Buffer B含有50％ACN、0.2M Na₂SO₄,50mM H₃PO₄,pH 2.5-4，线性梯度洗脱。

在一个优选实施方案中，所述对甘精胰岛素前体包涵体采用羟基磷灰石介质进行层析步骤的条件为：层析pH 6.5～11，以及依次用含有1M NaCl、10mM NaH₂PO₄、50mMNaH₂PO₄和500mM NaH₂PO₄的层析液进行盐浓度洗脱。

在一个优选实施方案中，所述Kex-2p酶的酶切条件为：Kex-2p酶与甘精胰岛素前体摩尔浓度比为1:1000～10000，0～37℃反应2～60小时。在一个特别优选的实施方案中，所述Kex-2p酶的酶切条件为：Kex-2p酶与甘精胰岛素前体摩尔浓度比为1：3000，4℃反应48小时。

本发明还提供了羟基磷灰石介质在层析纯化甘精胰岛素前体包涵体蛋白中的用途，羟基磷灰石介质在层析纯化甘精胰岛素前体复性蛋白中的用途，以及Kex-2p酶在酶切转化甘精胰岛素前体以获得有活性的甘精胰岛素中的用途。

在本发明的一个优选实施方案中，在反应器中使用Kex-2p酶进行酶切反应，该方法便于线性放大，对于原核及真核表达系统生产的甘精胰岛素融合蛋白都适用。通过调整酶切反应条件，酶切效率可达到95％以上，且没有错切产物。酶切产物经一步柱层析，即可达到或超过常规技术中酶切产物经过两步柱层析才能达到的纯化效果，具有显著的产业化应用价值。

附图说明

图1显示了甘精胰岛素融合蛋白发酵表达率分析结果。1～4道分别为IPTG诱导0、1、2、3小时样品，其中目的蛋白分子量9.7kD。5道为蛋白Marker，由上至下各条带分子量分别是116、66、45、35、25、18.4、14kD。

图2显示了甘精胰岛素融合蛋白包涵体纯化纯度分析结果。1道为包涵体溶解液，2～5道为纯化过程样品，分别是在1M NaCl、10mM NaH₂PO₄、50mM NaH₂PO₄和500mM NaH₂PO₄缓冲液条件下洗脱得到的组分，6道为蛋白Marker(分子量顺序同上)。

图3显示了RP-HPLC分析复性率的结果。横坐标是时间(单位：min)，纵坐标是吸光度单位(单位：mAU)。

图4显示了甘精胰岛素融合蛋白复性蛋白纯化纯度分析结果。1道为复性样品，2～5道为纯化过程样品，分别是在500mM NaCl、5mM NaH₂PO₄、20mM NaH₂PO₄和200mM NaH₂PO₄缓冲液条件下得到的洗脱组分，6道为蛋白Marker(分子量顺序同上)。

图5显示了甘精胰岛素融合蛋白经Kex-2p酶切后RP-HPLC分析结果，酶切效率98％，未见错切产物。横坐标是时间(单位：min)，纵坐标是吸光度单位(单位：mAU)。

图6显示了甘精胰岛素纯品RP-HPLC纯度分析结果：横坐标是时间(单位：min)，纵坐标是吸光度单位(单位：mAU)。

图7显示了本发明一个优选实施方案中的甘精胰岛素融合蛋白的氨基酸序列。

图8显示了甘精胰岛素的结构示意图。

具体实施方式

本文中所用的术语“甘精胰岛素”(insulin glargine)具有本领域公知的含义，结构为21A-Gly-30Ba-L-Arg-30Bb-L-Arg-人胰岛素，即将人胰岛素A链的21位Asn替换成Gly，在B链的30位氨基酸后加入2个Arg。成熟的有活性的甘精胰岛素由A链和B链共53个氨基酸组成，其中A链含有21个氨基酸，B链含有32个氨基酸(结构显示于图8)。

PCT国际申请PCT/IB2012/052853中对甘精胰岛素和甘精胰岛素原进行了详细描述。

本文中所用的术语“甘精胰岛素融合蛋白”、“甘精胰岛素前体”和“甘精胰岛素原”具有相同的含义，可以互换使用，指的是由甘精胰岛素A链、B链和连接肽(也称C链)共价连接所形成的甘精胰岛素前体。

出于便于纯化、表达或分泌等目的，甘精胰岛素前体中还可以包含任选的前肽链，例如MKR。

甘精胰岛素前体在经过酶切去除连接肽和前肽链后，即可得到有活性的甘精胰岛素。

例如，本发明一个优选实施方式中的甘精胰岛素前体的氨基酸序列显示于图7中。该甘精胰岛素前体由甘精胰岛素A链、B链、连接肽和前肽链按照前肽链——B链——连接肽——A链的顺序共价连接。在经过酶切去除前肽链和连接肽后即可纯化得到有活性的甘精胰岛素。

本文所用的术语“任选”(optional)表示“可有可无”、“非必需”的含义。例如，“任选的前肽链”是指可以含有该前肽链，也可以不含有该前肽链，这可以由本领域技术人员根据情况进行选择。

甘精胰岛素在大肠杆菌中以包涵体形式表达，表达产物为重组甘精胰岛素前体。前体的结构通常为在B链和A链之间加入C肽(C肽长度和序列可变，例如可由33个、更少或更多个氨基酸组成)。C肽的存在促进和保证了A链和B链的正确折叠，可通过蛋白酶，例如胰蛋白酶，酶切切除。

本文中所用的术语“Kex-2p酶”指的是蛋白内肽酶Kex-2p(EC 3.4.21.61)。PCT国际申请PCT/IB2012/052853中对Kex-2p酶的氨基酸序列和酶切特性进行了详细描述。

本领域技术人员可以理解，在不显著影响其生物学功能的情况下，可以对野生型Kex-2p酶进行一定的修饰，例如一个或几个氨基酸残基的添加、删除或替换，以及PEG化等。此类经过修饰的Kex-2p酶突变体仍然可以作为工具酶用于本发明的酶切操作步骤中。因此，本文中所用的术语“Kex-2p酶”也涵盖此类经过修饰的Kex-2p酶突变体。

本文中所用的术语“原核表达”具有本领域公知的含义，指的是在原核表达体系例如大肠杆菌中对目的蛋白进行表达。

本文中所用的术语“羟基磷灰石介质”是磷酸钙高温烧结制备的用于纯化生物分子的球形无机层析介质，以美国Bio-Rad公司CHT^TM Ceramic Hydroxyapatite为代表，具有独特的分离性能和很高的选择性和分辨率，根据烧结温度不同分为I型和II型，各有20、40和80μm三种直径的产品满足不同的层析要求。

本领域技术人员可以理解，I型和II型以及不同粒径的羟基磷灰石可以通过调整洗脱条件达到等同的纯化效果。

本文中所用的术语“包涵体”是指由原核生物如大肠杆菌表达产生的、没有活性的重组甘精胰岛素前体，经复性才能获得正确构象，从而具有生物学活性。这里所指的包涵体可以是不可溶的沉淀，也可以是溶解于缓冲液中的可溶形式。

为了更加详细地解释本发明，下面将结合附图给出本发明的实施例。这些实施例仅仅是出于解释和说明的目的，不应该被理解为是对本发明范围的限制。

实施例1：重组甘精胰岛素融合蛋白表达

参照Novagen公司《pET系统操作手册》(第10版)，按照常规分子克隆技术构建甘精胰岛素融合蛋白质粒，转入pET30a BL-21(DE3)大肠杆菌表达菌株，获得甘精胰岛素融合蛋白工程菌，发酵获得重组表达的甘精胰岛素融合蛋白，在100L发酵体积下，OD₆₀₀达到150，目的蛋白表达率可达到42％(图1)。

实施例2：甘精胰岛素融合蛋白变性蛋白纯化

将按照实施例1方法获得的甘精胰岛素融合蛋白发酵液离心(9000rpm x 20min)，将收集的菌体用高压均质机破碎三次，离心收集沉淀(9000rpm x 30min)。用含有20mMTris、2M尿素、5mM EDTA、10mM二硫苏糖醇以及1％Triton-100的重悬缓冲液将沉淀重悬，用高压均质机再次均质三次，离心收集沉淀(13000rpm x 30min)。获得的包涵体用8M尿素溶解，加入20mM二硫苏糖醇。

采用羟基磷灰石介质(如CHT^TM Ceramic Hydroxyapatite)对由上述方法获得的变性蛋白进行层析纯化。参考Bio-Rad公司《CHT^TM Ceramic Hydroxyapatite InstructionManual》第13页方法，调节层析pH为8.0，依次用含有1M NaCl、10mM NaH₂PO₄、50mM NaH₂PO₄和500mM NaH₂PO₄的层析液进行盐浓度洗脱，得到纯度大于90％的甘精胰岛素融合蛋白变性蛋白。纯化样品经电泳分析，组分3纯度95％，组分4纯度98％，总收率大于90％(图2)。

实施例3：甘精胰岛素融合蛋白复性

将按照实施例2方法获得的甘精胰岛素融合蛋白变性蛋白溶液稀释到复性缓冲液中获得甘精胰岛素融合蛋白复性蛋白，复性缓冲液含有20mM NaH₂PO₄、20mM NaAc、5mM GSH、1mM GSSG，pH值为5.0。在目的蛋白为10mg/ml的浓度下，复性率为91％。将获得的甘精胰岛素融合蛋白复性蛋白溶液浓缩并进行缓冲液置换，置换缓冲液含有20mM NaH₂PO₄、20mMTris，pH 8.0。RP-HPLC法检测复性率结果见图3。

实施例4：甘精胰岛素融合蛋白复性后纯化

将按照实施例3方法获得的复性蛋白用羟基磷灰石介质(如CHT^TM CeramicHydroxyapatite)进行层析纯化。参考Bio-Rad公司《CHT^TM Ceramic HydroxyapatiteInstruction Manual》第13页方法进行，调节层析pH为8.0，依次用含有500mM NaCl、5mMNaH₂PO₄、20mM NaH₂PO₄和200mM NaH₂PO₄的层析液进行盐浓度洗脱，得到纯度大于98％的甘精胰岛素融合蛋白复性蛋白。纯化样品纯度分析见图4。

实施例5：甘精胰岛素融合蛋白酶切处理

将按照实施例4方法纯化得到的甘精胰岛素融合蛋白用蛋白内肽酶Kex-2p(EC3.4.21.61)进行连接肽和前肽的切除。按照Kex-2p酶与甘精胰岛素融合蛋白摩尔浓度比1：3000加入Kex-2p酶，4℃反应48小时，加5mM EDTA终止酶切。经RF-HPLC检测，酶切效率达到98％，且未检测到错切产物(图5)。

实施例6：甘精胰岛素纯化

将按照实施例5方法制备的酶切产物调节pH值至2.5～4.0，使用C8反相柱进行纯化。Buffer A含有0.2M Na₂SO₄,50mM H₃PO₄,pH 2.5，Buffer B包含50％ACN、0.2M Na₂SO₄,50mM H₃PO₄,pH 2.5，通过线性梯度洗脱得到纯度大于99.5％的甘精胰岛素蛋白。得到的甘精胰岛素蛋白透析至30mM HAc溶液中去除有机溶剂，并进一步制剂得到甘精胰岛素产品。RP-HPLC法分析甘精胰岛素纯度达到99.7％，结果见图6。

Claims

1.对重组表达的甘精胰岛素前体进行纯化的方法，其中所述方法包括如下步骤：对原核表达的甘精胰岛素前体包涵体采用羟基磷灰石介质进行层析，层析条件为：层析pH 8.0，依次用含有1M NaCl、10mM NaH₂PO₄、50mM NaH₂PO₄和500mM NaH₂PO₄的层析液进行盐浓度洗脱；

对获得的甘精胰岛素前体包涵体进行复性；以及

对复性的甘精胰岛素前体采用羟基磷灰石介质进行层析，层析条件为：层析pH 8.0，依次用含有500mM NaCl、5mM NaH₂PO₄、20mM NaH₂PO₄和200mM NaH₂PO₄的层析液进行盐浓度洗脱。

2.权利要求1的方法，其中所述方法还包括如下步骤：

在大肠杆菌表达体系中原核表达甘精胰岛素前体，获得甘精胰岛素前体包涵体。

3.权利要求1-2任一项的方法，其中所述甘精胰岛素前体的氨基酸序列为前肽链—B链—连接肽链—A链，各链之间共价连接，其中前肽链为MKR，B链为FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRR，连接肽链为EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKR，和A链为GIVEQCCTSICSLYQLENYCG。

4.制备有活性的甘精胰岛素的方法，其中包括如下步骤：

在大肠杆菌表达体系中原核表达甘精胰岛素前体，获得甘精胰岛素前体包涵体；

对所述甘精胰岛素前体包涵体采用羟基磷灰石介质进行层析，层析条件为：层析pH8.0，依次用含有1M NaCl、10mM NaH₂PO₄、50mM NaH₂PO₄和500mM NaH₂PO₄的层析液进行盐浓度洗脱；

对所获得的甘精胰岛素前体包涵体进行复性；

对复性的甘精胰岛素前体采用羟基磷灰石介质进行层析，获得纯化的甘精胰岛素前体，层析条件为：层析pH 8.0，依次用含有500mM NaCl、5mM NaH₂PO₄、20mM NaH₂PO₄和200mMNaH₂PO₄的层析液进行盐浓度洗脱；

采用Kex-2p酶对所述甘精胰岛素前体进行酶切，其中所述Kex-2p酶的酶切条件为：Kex-2p酶与甘精胰岛素前体摩尔浓度比为1：3000，4℃反应48小时；和

对酶切产物进行一步层析纯化，以获得有活性的甘精胰岛素。

5.权利要求4的方法，其中所述一步层析纯化采用C8反相柱。

6.权利要求5的方法，其中所述C8反相柱层析的条件为：Buffer A含有0.2M Na₂SO₄,50mM H₃PO₄,pH 2.5-4，Buffer B含有50％ACN、0.2M Na₂SO₄,50mM H₃PO₄,pH 2.5-4.0，线性梯度洗脱。