KR101814048B1 - 대량 생산이 가능하도록 개선된 경구투여용 트롬보포이에틴 및 이의 대량 생산공정 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 경구투여용 약제 개발시 필수적으로 요구되는 대량 생산이 가능하도록 개량된 경구투여용 트롬보포이에틴 및 이의 대량 생산공정에 관한 것으로, 대장균 내에서 발현이 잘 되지 않는 서열번호 1에 기재된 '단백질 분해효소 저항성 개량 트롬보포이에틴'에 유비퀴틴 및 히스택을 융합시켜 불용성 내포체 형태로 성공적으로 발현시켰고, 수용화 공정, 융합 파트너 제거공정, 리간드 친화성 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피를 이용한 정제 공정을 통해 고순도의 활성형 형태로 대량 수득하는데 성공하였다.
Description
본 발명은 경구투여용 약제 개발시 필수적으로 요구되는 대량 생산이 가능하도록, 2개의 융합 파트너 (유비퀴틴, His-tag)가 결합되어 형성된 트롬보포이에틴 융합 단백질, 이의 대량 생산공정 및 트롬보포이에틴의 정제방법에 관한 것이다.
혈소판감소증(thrombocytopenia)은 혈소판 수가 정상범위인 150,000~450,000/mm3 이하인 상태로, 간질환에 의한 트롬보포이에틴(Thrombopoietin, TPO) 생산의 감소, 자가면역세포나 각종 약물치료 부작용에 의한 혈소판 파괴에 의해 유발된다. 중증 혈소판감소증의 치료에는 혈소판 수혈만이 유일한 방법이나, 발열(febrile reaction), 병원균의 전달, 박테리아 감염, 동종면역(alloimmunization) 반응 등의 문제를 야기하는 문제점이 있다.
1994년 트롬보포이에틴 (TPO) 유전자가 발견된 후, 혈소판감소증 치료를 위하여 TPO 단백질의 크기를 달리하거나, TPO 발현 숙주를 달리함으로써 다양한 형태의 TPO 개발이 시도되었다. 하지만, 내인성 TPO에 대한 중화항체 형성으로 개발이 중단되었다. 이후, 저분자 약물 (Promacta) 또는 펩타이드 (peptide)를 이용한 TPO 수용체 아고니스트 (TPO receptor agonist, Nplate)를 개발하여 2008년 FDA 승인을 받기도 하였다. 하지만, 이 역시도 TPO에 비해 부작용이 높거나 약효가 떨어지는 문제점이 보고되었다.
따라서, TPO 수용체 아고니스트 대신 TPO 단백질 자체를 이용하고자 하는 노력이 다시 주목을 받았는데, 중화항체 형성을 방지하기 위한 경구형 제제가 대안으로 떠오르고 있다. 하지만, 경구형 TPO 개발은 장내, 세포간질 및 혈액에 존재하는 단백질분해효소에 대해 저항성을 가지는 것이 요구된다. 또한, 경구 투여를 하기 위하여는 많은 양의 TPO 단백질을 필요하기 때문에, 고효율의 대량생산 시스템 구축이 필수적으로 요구되기도 한다.
이에 본 발명에서는 대량 생산이 가능하도록 개선된 경구투여용 트롬보포이에틴 및 이의 대량생산 공정을 개발하여 제공하고자 한다.
본 발명에서는 상기 대한민국 등록특허 제10-1040396호 (2011년 06월 02일)에 기재된 것으로, 단백질 분해효소에 대한 저항성이 우수한 개량 TPO (서열번호 1)의 대량생산을 위한 호스트로 대장균을 설정하였는데, 예비 실험에 의할 경우, 상기 '단백질 분해효소 저항성 개량 TPO'가 거의 발현되지 않았다.
따라서, 본 발명은 대장균 내 상기 '단백질 분해효소 저항성 개량 TPO'의 효과적인 발현을 유도하기 위해 예의 노력하였고, 그 결과, 유비퀴틴 (ubiquitin)을 융합시킬 경우, 효과적으로 발현됨을 확인하였다. 또한, 본 발명에서는 대장균 내에서의 효과적인 정제를 위해 히스티딘이 6개 결합하여 구성된 히스티틴 태그 (상용명 '히스택(His-tag)')을 사용하였다. 즉, 유비퀴틴과 히스택을 개량 TPO의 융합 파트너로 사용한 것이다.
본 발명에서는 상기 두 가지 융합 파트너를 사용하여, 기존의 저발현 '단백질 분해효소 저항성 개량 TPO'의 과발현을 불용성 내포체 형태로 유도할 수 있었고, 간단한 수용화 공정, 융합 단백질 제거 공정 및 정제 공정을 통해 '단백질 분해효소 저항성 개량 TPO'를 활성형으로 대량 수득할 수 있었다.
본 발명은 제1형태로, 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 트롬보포이에틴(thrombopoietin)의 N-말단에, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 유비퀴틴(Ubiquitin)이 융합되어 있고; 이 유비퀴틴의 N-말단에 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 갖는 히스택(His-tag)이 융합된; 것을 특징으로 하는 트롬보포이에틴 융합 단백질을 제공한다. 본 발명의 제1형태에 있어서, 상기 트롬보포이에틴 융합 단백질은, 바람직하게 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 히스택-유비퀴틴 융합 단백질이 서열번호 1의 트롬보포이에틴의 N-말단에 융합되어 형성된 것일 수 있다.
서열번호 1에 기재된 트롬보포이에틴(thrombopoietin, TPO)은 332개의 아미노산으로 이루어진 원래의 TPO를 활성부위의 153개 아미노산으로 크기를 줄이고, 단백질 분해효소에 취약한 부위의 아미노산을 변경(V67T, 67번째 아미노산이 'V(발린)' 'T(트레오닌)'로 변경)하여, 활성을 유지하면서도 단백질 분해효소에 대한 저항성을 향상시킨 돌연변이체이다. 다만, 이를 대장균 내에서 발현시킬 경우, 거의 발현되지 않은데, 본 발명에서 히스택 및 유비퀴틴을 N-말단에 융합시켜 발현시킬 경우, 대장균 내에서 발현됨을 확인할 수 있었다.
한편, 본 발명은 제2형태로, 상기 서열번호 4에 기재된 히스택-유비퀴틴 융합 단백질이 서열번호 1의 트롬보포이에틴의 N-말단에 융합하여 형성된 트롬보포이에틴 융합 단백질을 암호화하는 유전자를 제공한다.
한편, 본 발명은 제3형태로, 플라스미드 벡터에 상기 본 발명 제2형태의 유전자가 삽입된 것을 특징으로 하는 재조합 벡터를 제공한다. 본 발명의 제3형태에 있어서, 상기 벡터는 일 예로, IPTG에 의해 본 발명 제2형태의 유전자의 발현이 유도될 수 있다. 재조합 벡터의 제조에 사용되는 기술은 공지의 유전공학 기술을 이용할 수 있으므로, 구체적인 기재는 생략하기로 한다.
한편, 본 발명은 제4형태로, 대장균에 상기 본 발명 제3형태의 벡터를 도입시켜 형질전환시킨 것을 특징으로 하는 재조합 대장균을 제공한다. 형질전환은 공지의 유전공학 기술을 이용할 수 있으므로, 구체적인 기재는 생략하기로 한다.
한편, 본 발명은 제5형태로, 상기 본 발명 제4형태의 재조합 대장균을 배양하는 것을 특징으로 하는 트롬보포이에틴 융합 단백질의 생산방법을 제공한다. 대장균을 배양하는 것은 대장균 배양 기술에 관한 공지기술을 사용할 수 있으므로, 구체적인 기재는 생략하기로 한다.
본 발명의 제5형태를 이용할 경우, 트롬보포이에틴의 N-말단에 히스택 및 유비퀴틴이 융합된 트롬보포이에틴 융합 단백질(H6UbTPO)을 균체 내 불용성 내포체 형태로 생산할 수 있다.
본 발명의 제5형태에 있어서, 상기 배양시, 배양액의 pH는 바람직하게 6.9인 것이 좋다. 배양액의 pH가 6.9일 때, 불용성 내포체 형태인 H6UbTPO가 원심분리를 통해 배지로부터 용이하게 분리될 수 있음이 실험을 통해 확인되었기 때문이다.
한편, 본 발명은 제6형태로, 대장균에서 불용성 내포체 형태로 생산된 본 발명 제1형태의 트롬보포이에틴 융합 단백질에, 재접힘(refolding) 버퍼를 첨가하여 희석시킴으로써, 상기 불용성 내포체를 활성형 형태로 재접힘함에 있어서, 상기 버퍼로는 NaCl이 첨가되지 않은 pH 9의 20mM 트리스(Tris) 용액을 사용하고, 희석은 20배 시키는 것을 특징으로 하는 재접힘 방법을 제공한다.
재접힘 공정은 불용성 내포체를 활성형으로 전환시킬 때 많이 사용되고 있는 기술이다. 불용성 내포체에 우레아(Urea)를 첨가할 경우 불용성 내포체는 강한 응집이 풀리면서 수용화가 된다. 이후, 버퍼를 첨가하여 우레아를 희석시키면, 열역학적으로 안정한 천연의 형태로 서서히 그 형태가 변하게 되면서, 활성형 형태로 변하게 된다.
본 발명의 제6형태에 있어, 상기 재접힘은 바람직하게 20℃ 온도에서 5일간 수행하는 것이 좋다. 또한, 상기 버퍼는, 바람직하게 시스테인(cysteine)과 시스틴(cystine)이 1.0mM 대 0.1mM의 비율로 첨가된 것을 사용하는 것이 좋다. 이와 같은 조건에서 재조합 수율이 상대적으로 높게 나오기 때문이다.
본 발명은 제7형태로, 본 발명 제1형태의 트롬보포이에틴 융합 단백질을 포함하는 대장균 균체 파쇄액을 히스택이 결합할 수 있는 리간드 친화성 크로마토그램에 통과시켜 용출물을 수득하는 단계 (a); 상기 단계 (a)에서 수득된 용출물에 유비퀴티나아제(ubiquitinase)를 첨가하여 반응시킨 후, 반응물을 수득하는 단계 (b); 상기 단계 (b)에서 수득된 반응물을 음이온 교환 크로마토그램에 통과시켜 용출물을 수득하는 단계 (c); 상기 단계 (c)에서 수득된 용출물을 히스택이 결합할 수 있는 리간드 친화성 크로마토그램에 통과시켜 용출물을 수득하는 단계 (d); 상기 단계 (d)에서 수득된 용출물을 음이온 교환 크로마토그램에 통과시켜 용출물을 수득하는 단계 (e); 를 포함하는 것을 특징으로 하는 트롬보포이에틴 단백질의 수득방법을 제공한다. 이와 같은 방법을 통해 트롬보포이에틴 단백질이 고순도로 수될 수 있다.
본 발명의 제7형태에 있어서, 상기 트롬보포이에틴 단백질의 수득방법은, 바람직하게 상기 단계 (e) 이후, 한외 여과하는 단계 (f);를 추가로 포함하는 것이 좋다. 한외 여과를 통해, 트롬보포이에틴 단백질은 더욱 농축될 수 있다.
본 발명은 서열번호 1에 기재된 '단백질 분해효소에 대해 저항성을 보이는 개량 TPO'를 대량 생산할 수 있는 방법을 제공하는데, 대장균 내에서 발현이 잘 되지 않는 '단백질 분해효소 저항성 개량 TPO'에 유비퀴틴 및 히스택을 융합시킴으로써, 불용성 내포체 형태로 성공적으로 발현됨이 확인되었다.
또한, 수용화공정, 융합 파트너 제거공정 및 리간드 친화성 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피를 이용한 정제 공정을 통해 고순도의 활성형 형태로 대량 수득하는데에도 성공하였다.
도 1은 본 발명에서 구축한 발현벡터의 맵이다.
도 2는 pH 및 염 첨가 여부에 따라 다양하게 제조된 버퍼를 이용하여 재접힘한 샘플들의 SDS-PAGE 분석 결과이다.
도 3의 TPO 정제를 위한 각 단계의 SDS-PAGE 결과인데, A는 1차 리간드 친화성 컬럼 크로마토그램을 수행한 후, 용출한 샘플의 SDS-PAGE 결과이고, B는 2차 이온교환 컬럼 크로마토그램을 수행한 후, 용출한 샘플의 SDS-PAGE 결과이며, C는 3차 리간드 친화성 컬럼 크로마토그램을 수행한 후, 용출한 샘플의 SDS-PAGE 결과이고, D는 4차 이온교환 컬럼 크로마토그램을 수행한 후, 용출한 샘플의 SDS-PAGE 결과이다.
도 2는 pH 및 염 첨가 여부에 따라 다양하게 제조된 버퍼를 이용하여 재접힘한 샘플들의 SDS-PAGE 분석 결과이다.
도 3의 TPO 정제를 위한 각 단계의 SDS-PAGE 결과인데, A는 1차 리간드 친화성 컬럼 크로마토그램을 수행한 후, 용출한 샘플의 SDS-PAGE 결과이고, B는 2차 이온교환 컬럼 크로마토그램을 수행한 후, 용출한 샘플의 SDS-PAGE 결과이며, C는 3차 리간드 친화성 컬럼 크로마토그램을 수행한 후, 용출한 샘플의 SDS-PAGE 결과이고, D는 4차 이온교환 컬럼 크로마토그램을 수행한 후, 용출한 샘플의 SDS-PAGE 결과이다.
본 발명은 종래에 개발된 '단백질분해효소 저항성 개량 TPO 단백질'의 N-말단에, 유비퀴틴프로테아제 특이 절단부위를 지니는 유비퀴틴이 융합되어 있고, 이 유비퀴틴의 N-말단에 His-tag (히스티딘 6개가 연속적으로 연결되어 구성됨)이 연결된 것을 특징으로 하는 단백질분해효소 저항성 개량 TPO 융합 단백질 및 이의 정제 공정에 관한 것이다.
본 발명에서 사용한 '단백질분해효소 저항성 개량 TPO 단백질'은 332개의 아미노산으로 이루어진 원래의 TPO를 활성부위의 153개 아미노산으로 크기를 줄이고, 단백질 분해효소에 취약한 부위의 아미노산을 변경하여, 활성을 유지하면서도 단백질 분해효소에 대한 저항성을 향상시킨 돌연변이체(V67T 변이체)인데, 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는다. 이하에서 지칭하는 'TPO'는 특별한 설명이 없으면, 서열번호 1로 표시되는 '단백질분해효소 저항성 개량 TPO'를 지칭하기로 한다.
본 발명에 의할 경우, 종래에 대장균 내에서 발현이 거의 불가능하였던 TPO를 불용성 내포체 (inclusion body) 형태로 발현할 수 있었고, 본 발명의 정제 공정을 통해 고순도로 생산할 수 있었다.
본 발명에서는, 본 발명에서 구축한 TPO 융합 단백질 (H6UbTPO)을 암호화하는 유전자를 Lac-프로모터를 전사개시로 가지는 벡터에 삽입하여 발현벡터를 구축하였고, 이것으로 대장균을 형질전환하여 재조합 대장균을 구축하였다.
또한, 재조합 대장균을 배양하면서 IPTG를 사용하여 융합 단백질의 발현을 유도하면, H6UbTPO가 불용성 내포체 형태로 발현됨이 확인되었다. 회분식 배양의 경우, 전체 단백질 중 약 20%의 양으로 발현되었으며, 유가식 배양의 경우, 전체 단백질 중 약 15%의 양으로 발현되었다.
한편, 대장균 내부에 불용성 내포체 형태로 존재하는 H6UbTPO 융합단백질은 재접힘 과정을 거쳐 활성형 형태로 전환되고, 유비퀴티나아제 효소의 처리에 의해 H6Ub가 떨어져 나가 최종적으로 TPO 형태로 수득되었다. 이때, 1차 리간드 친화성 크로마트그래피, 2차 이온교환 크로마토그래피, 3차 리간드 친화성 크로마토그래피, 4차 이온교환 크로마토그래피를 거치면, 최종적으로 고순도의 TPO를 수득할 수 있었다.
이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
[
실시예
1: 단백질 분해효소 저항성 개량
TPO
의 발현벡터 및 재조합 대장균 제조]
본 실시예에서는 개량형 TPO의 발현을 위한 벡터 및 이로 형질전환된 재조합 대장균을 제조하고자 하였다.
먼저, 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 '단백질 분해효소 저항성 개량 TPO 단백질 (대한민국 등록특허 제10-1040396호에 기재된 V67T mutant)'의 N-말단에, 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 'His-tag 유비퀴틴'을 융합시켰다. 이때, 'His-tag 유비퀴틴'은 유비퀴틴 단백질의 N-말단에 히스택(His-tag)이 연결된 것이다. 유비퀴틴(하기에서 'Ub'로도 표시함)은 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지며, 히스택(히스티딘이 6개 결합하여 구성됨, 하기에서 'H6'로도 표시함)은 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는다.
상기 과정을 통해 5' 쪽으로부터 His-tag, 유비퀴틴, TPO 유전자가 순차적으로 위치하도록 융합된 H6UbTPO 유전자를 최종 합성하였고, 이를 pAPT (모벡터로 pUC19 유래) 벡터의 MCS(multiful cloning site)에 삽입하여 발현벡터를 최종 제조하였다. 도 1은 본 발명에서 구축한 발현벡터의 맵이다.
상기에서 제작한 발현벡터를 대장균 (E. coli) BL21(DE3)에 도입하여, 재조합 대장균을 제작하였는데, 2014년 1월 22일자로 한국생명공학연구원에 기탁하여, 수탁번호 KCTC 18273P를 받았다.
[
실시예
2; 융합 단백질
H6UbTPO
의 대장균 내 발현 여부 확인]
(1)
회분식
배양
본 실험에서는 상기에서 제작한 재조합 대장균에서 H6UbTPO가 발현되는지 여부를 확인하고자 하였다.
실험을 위해, 우선 상기 발현벡터로 형질전환되어 셀 스탁 (cell stock)으로 보관되어 있던 재조합 대장균 1ml을 100~200ml LB 배지 (Luria-Bertani broth, 10g tryptone, 5g yeast extract, 10g NaCl per liter D.W., 50mg/L kanamycin 포함)에 접종하여 25℃, 200rpm의 조건으로 배양하였다.
접종 후, 약 10시간 내외에 배양액이 OD660 1.0에 도달하면, 본 배양액에 주입하여 본 배양을 실시하였다. 본 배양에 사용된 회분식 배양을 위한 배지의 조성은 하기의 표 1과 같았다.
| 조성 | 1 L 배지 기준 g |
| Glucose | 20 |
| Yeast Extract | 20 |
| KH2PO4 | 5 |
| K2HPO4 | 3 |
| MgSO4.7H2O | 1.2 |
| Kanamycin (50g/L stock) | 0.1 |
상기 배지를 이용하여 5L 발효조 (working volume : 3L, CNS, Daejeon, Korea)에서 37℃, 800 rpm의 조건으로 회분식 배양을 수행하였다.
H6UbTPO의 발현을 위해, 배양액의 흡광도 (OD660)가 10에 도달했을 때, IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)를 1 mM이 농도로 첨가하여 발현유도를 수행하였다. 이후, 3시간 동안 추가 배양을 마치고, 원심분리하여 균체를 회수하였다.
회분식 배양을 통해 발현율을 비교 분석한 결과, H6UbTPO 형태로 성공적으로 발현됨을 확인하였다. 다만, 성공적으로 발현된 H6UbTPO는 불용성 형태이었고, 전체 단백질 중 약 20%의 양으로 발현됨을 확인할 수 있었다.
(2)
유가식
배양
세포를 고농도로 배양하여 H6UbTPO의 생산량을 늘리고자 상기의 재조합 대장균 균주에 대해 유가식 배양을 수행하였다. 기본 조건은 상기의 회분식 배양과 동일하게 하였고, 유가식 배양을 위한 고농도 주입배지는 하기 표 2와 같았다.
| 주입배지 (g) | |
| Comp. | 1L |
| Glucose | 274 |
| Yeast Extract | 211 |
| (NH4)2SO4 | 1.5 |
| MgSO4 7H2O | 1 |
| Kanamycin (50g/L stock) | 0.1 |
| 상기 성분 중 분리해서 살균할 묶음 | |
| P1 : N,YE | 0.6 |
| P2 : Glc, Mg | 0.4 |
| P3 : kanamycin | 0.001 |
유가식 배양 중, O.D 130에서 1mM의 IPTG를 첨가하여 융합 단백질 H6UbTPO를 발현시키고, 발현유도 4시간 경과 후 원심분리하여 균체를 회수하여, 그 결과를 분석하였다. 배양종료 시, OD660 145의 균체 축적이 달성되었고, 원심분리로 245g/L의 함습 균체(wet cell)를 회수하였다.
SDS-PAGE를 통해 단백질을 분석하였는데, H6UbTPO 융합 단백질은 불용성으로 발현되었으며, 총 단백질 중 15% 내외로 발현되었음을 확인하였다.
(3)
pH
변화에 의한
H6UbTPO
의 회수율 비교
불용성 내포체(inclusion body, IB)로 발현되는 재조합 단백질의 회수율을 높이기 위해 배양액 pH를 6.9와 6.4로 설정하고, pH에 의한 영향을 비교하였다. 이때, 용존산소(DO)는 30% 이상을 유지하였고, 배양은 유가식 배양으로 수행하였다.
배양 결과, pH 6.4에서 배양한 경우, 단백질 발현이 높았으나, IB 회수 시 원심분리에 의한 회수가 불가능한 문제가 지속적으로 발생하였다.
그런데, pH 6.9에서 배양하는 경우, 원심분리에 의해 융합 단백질이 회수 가능함을 확인할 수 있었다.
[
실시예
3: 융합 단백질
H6UbTPO
의
재접힘
]
(1) 실험 목적
상기에서 불용성 내포체(IB)로 발현된 융합 단백질을 실질적으로 사용하기 위해서는 재접힘(refolding) 공정을 거쳐 활성형 형태로 바꾸어 주어야 한다. 이를 위해, 하기와 같은 재접힘 공정을 수행하였다.
(2)
pH
및 염의 첨가에 따른
재접힘
수율 비교
20mM Tris, 8mM 메르캅토에탄올(mercaptoethanol), 8M 우레아(Urea) 용액으로, 1g/50ml 농도의 상기 IB 형태 H6UbTPO를 수용화시켰다. 이후, pH를 7, 8, 9, 10.4로 조정한 20mM Tris 용액을 상기 수용화시킨 IB 용액에 첨가하여 20배 희석시켜 3일간 실온(20℃)에서 유지하면서 재접힘을 유도하였다. 이때, '20mM Tris, pH 8 용액'과 '20mM Tris, pH 9 용액'의 경우, 추가적으로 0.2M의 NaCl을 첨가하여 재접힘시, 염(salt)의 영향을 알아보고자 하였다.
재접힘 수행 후, 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)를 수행하고, 결과(재접힘 수율)를 확인하였다.
SDS-PAGE 분석 결과, 'NaCl을 첨가하지 않은 20mM Tris, pH 9 용액'으로 재접힘을 진행하는 것이 재접힘 융합 단백질의 밴드가 가장 굵게 나타났다 (도 2). 도 2는 pH 및 염 첨가 여부에 따라 다양하게 제조된 버퍼를 이용하여 재접힘한 샘플들의 SDS-PAGE 분석 결과이다.
(3) 온도 및 시간에 따른
재접힘
수율 비교
본 실험에서는 온도 및 시간이 재접힘 수율에 미치는 영향을 알아보고자 하였다.
20mM Tris, pH 9.0 용액으로 20배 희석시킨 후, 8℃에서 2일, 4일간 재접힘 공정을 진행한 것과 실온(20℃)에서 3일, 5일, 7일간 재접힘 공정을 시킨 것에 대해 정제를 진행하여 재접힘 수율을 비교하여 보았다.
실험 결과, 하기 표 4에서 보는 바와 같이 저온보다는 실온에서 재접힘 효능이 좋았고, 실온에서는 5일간 재접힘시킨 것이 가장 좋은 재접힘 수율을 보여주었다. '재접힘 수율'은 '재접힘 전 wet IB 의 g' 대비 '재접힘 후 재접힘된 융합 단백질의 g' 비율로 나타냈다.
| 재접힘 조건 | 재접힘 수율 (mg/ wet IB 1g) | 비고 |
| 8℃ 2일 | 1.79 | |
| 8℃ 4일 | 6.54 | |
| 실온(20℃) 3일 | 9.73 | |
| 실온(20℃) 5일 | 13.81 | |
| 실온(20℃) 7일 | 9.95 |
(4) 아미노산 첨가에 의한
재접힘
수율 비교
본 실험에서는 특정 아미노산의 첨가가 재접힘 수율에 미치는 영향을 알아 보고자 하였다. 실험을 위해, 특정 아미노산으로 시스테인(Cysteine), 시스틴(cystine)을 선정하고, 이를 첨가하여 그렇지 않은 경우와 재접힘 수율을 비교하였다. 기타 조건은 상기 (3)과 동일하게 하였으며, 온도는 실온(20℃)에서 기간은 5일 동안 재접힘 공정을 수행하였다.
상기 아미노산 2종을 하기 표 5의 첨가 농도로 재접힘 버퍼에 첨가하여 pH 10에서 재접힘을 진행한 결과, cysteine : cystine = 1.0mM : 0.1mM 샘플에서 재접힘 수율이 가장 높게 나타났다.
| 재접힘 버퍼 조건 | 재접힘 수율 (mg/ wet IB 1g) | 비고 | |
| 20mM Tris, cysteine, cystine, pH 9.0 |
cysteine : cystine =0.5mM : 0.05mM |
26.2 | |
| cysteine : cystine =1.0mM : 0.1mM |
29.8 | ||
| cysteine : cystine =2.0mM : 0.2mM |
15.3 | ||
(5) 최종 확립
재접힘
조건
상기의 실험 결과를 종합할 때, 최적 재접힘 조건은, 수용화된 IB를 '20mM Tris, 1mM 시스테인, 0.1mM 시스틴, pH 9.0 용액'으로 20배 희석하여, 24시간 이상 상온에 정치시키는 것이었다.
[
실시예
4: 융합 단백질
H6UbTPO
의 정제 및 농축]
(1) 실험 개요
융합 단백질 (H6UbTPO)은 총 4단계에 걸친 컬럼 크로마토그래피 공정을 통해 정제되었으며, 컬럼 크로마토그래피 정제 후, 최종적으로 한외 여과를 통해 농축하였다.
(2) 1차
리간드
친화성
크로마토그램
본 단계는 재접힘 후, 재접힘이 효과적으로 수행된 H6UbTPO를 회수하는 단계이다. 본 단계를 통해 재접힘이 되지 않은 H6UbTPO 및 대장균 내 여타의 단백질은 걸러지게 된다. 컬럼 및 세부 조건은 하기와 같았다.
- 컬럼 : Ni Sepharose FF Column 3L (200mm x 95mm)
- 정제 시스템 : AKTA Pilot system
- A 버퍼 : 20mM Tris, pH 7.5
- B 버퍼 : 20mM Tris, 0.5M Imidazole, pH 7.5
- 샘플 : 상기에서 준비한 재접힘 샘플 300L에 0.5M Tris, pH 7.5 용액를 첨가하여 최종 pH 8.4로 맞춘것
- 로딩 : 준비한 샘플의 1/2에 해당하는 160L 씩 컬럼에 주입
- 세척 : 95% A 버퍼, 5% B 버퍼 비율로 컬럼을 세척
- 용출(elution) : 70% A 버퍼, 30% B 버퍼 비율로 단백질 용출
- 회수량 (AP2S0061-1Ni1 / AP2S0061-1Ni2) : 6.8 L / 6.7 L
- 회수량 (AP2S0062-1Ni1 / AP2S0062-1Ni2) : 5.6 L / 5.4 L
- SDS-PAGE 분석 : 약 28 kDa 크기의 밴드(H6UbTPO)를 확인함
실험 결과는 도 3의 A와 같이 나타났다. 도 3의 A는 1차 리간드 친화성 컬럼 크로마토그램을 수행한 후, 용출한 샘플의 SDS-PAGE 결과이다. 도 3의 A에서 보는 바와 같이 H6UbTPO가 정제됨을 확인할 수 있었다. 다만, 우리가 목적으로 하는 H6UbTPO 외에 다른 불순물 단백질도 많이 함유되어 있음을 알 수 있었다.
(3) 2차 음이온 교환
크로마토그램
(
anion
exchange
chromatography
)
H6UbTPO으로부터 H6Ub을 제거하기 위해 상기 1차 리간드 친화성 크로마토그래피에서 회수한 용출액에 UBP 효소(유비퀴티나아제) 75mg을 첨가한 후 상온에서 1시간 반응시켰다.
UBP 효소 처리 후, 잘려 나간 H6Ub 및 기타 불순물 단백질을 제거하기 위해 2차 이온교환 크로마토그래피(anion chromatography)를 수행하였다. 컬럼 및 세부 조건은 하기와 같았다.
- 컬럼 : Q Sepharose FF Column 1.5L (140mm x 98mm)
- 정제 시스템 : AKTA Pilot 시스템
- A 버퍼 : 20mM Tris, pH 7.5
- B 버퍼 : 20mM Tris, 1M NaCl, pH 7.5
- 로딩 샘플 : 1차 크로마토그래피 용출액에 UBP 효소 75mg을 첨가한 후 상온에서 1시간 반응시킨 것
- 세척 : 83% A 버퍼, 17% B 버퍼 비율로 컬럼을 세척
- 용출 : 70% A 버퍼, 30% B 버퍼 비율로 단백질 용출
- 회수량 (AP2S0061-2Q1 / AQ2S0061-2Q2) : 2L / 2L
- 회수량 (AP2S0062-2Q1 / AQ2S0062-2Q2) : 2.2L / 2.2L
실험 결과는 도 3의 B와 같이 나타났다. 도 3의 B는 2차 이온교환 컬럼 크로마토그램을 수행한 후, 용출한 샘플의 SDS-PAGE 결과이다. 도 3의 B에서 보듯이 H6Ub 및 기타 불순물 단백질이 효과적으로 제거됨을 확인할 수 있었다. 다만, 용출액 중 미절단 H6UbTPO가 TPO와 함께 존재함을 확인할 수 있었다.
TPO를 고순도로 정제하기 위해서는 H6UbTPO를 걸러낼 필요가 있다. 따라서, 하기의 3차 리간드 친화성 크로마토그래피를 수행하였다.
(4) 3차
리간드
친화성
크로마토그램
H6UbTPO와 TPO가 혼합되어 있는 정제액으로부터 TPO만을 고순도로 정제하기 위해 3차 리간드 친화성 크로마토그래피를 수행하였다.
- 컬럼 : Ni Sepharose FF Column 3L (200mm x 95mm)
- 정제 시스템 : AKTA Pilot 시스템
- A 버퍼 : 20mM Tris, pH 7.5
- B 버퍼 : 20mM Tris, 0.5M Imidazole, pH 7.5
- 로딩 샘플 : 2차 이온교환 크로마토그래피 용출액
- 세척 : A 버퍼로 컬럼을 세척
- 용출 : 96% A 버퍼, 4% B 버퍼 비율로 단백질 용출
- 회수량 (AP2S0061-3Ni) : 7L
- 회수량 (AP2S0062-3Ni) : 5.8L
실험 결과는 도 3의 C와 같이 나타났다. 도 3의 C는 3차 리간드 친화성 컬럼 크로마토그램을 수행한 후, 용출한 샘플의 SDS-PAGE 결과이다. 실험 결과, H6UbTPO가 효과적으로 제거됨을 확인할 수 있었다.
(5) 4차 음이온 교환
크로마토그램
(
anion
exchange
chromatography
)
3차 정제액 중 존재하는 미량의 불순물을 제거하고자 4차 이온교환 크로마토그래피를 수행하였다. 컬럼 및 세부 조건은 하기와 같았다.
- 컬럼 : Q Sepharose FF Column 1.5L (140mm x 98mm)
- 정제 시스템 : AKTA Pilot 시스템
- A 버퍼 : 20mM Tris, pH 7.5
- B 버퍼 : 20mM Tris, 1M NaCl, pH 7.5
- 로딩 샘플 : 3차 이온교환 크로마토그래피 용출액
- 세척 : 83% A 버퍼, 17% B 버퍼 비율로 컬럼을 세척
- 용출 : 70% A 버퍼, 30% B 버퍼비율로 단백질 용출
- 회수량 (AP2S0061-4Q) : 2.7L
- 회수량 (AP2S0062-4Q) : 2.5L
실험 결과는 도 3의 D와 같이 나타났다. 도 3의 D는 4차 이온교환 컬럼 크로마토그램을 수행한 후, 용출한 샘플의 SDS-PAGE 결과이다. 도 3의 D에서 보듯이 미량의 잔여 불순물 단백질까지 모두 제거되어 TPO가 고순도로 정제됨을 확인할 수 있었다.
(6) 한외여과
상기 4차 이온교환 크로마토그래피를 통해 정제된 용출액을 농축하고자 한외여과를 수행하였다. 한외 여과의 조건은 하기와 같았다.
- 멤브레인 : 10K, 0.1m2
- TMP : 1.0bar 이하
- 농축액 농도 및 부피 (AP2S0061) : 11.4 g/L, 0.55 L
- 농축액 농도 및 부피 (AP2S0062) : 11.16 g/L, 0.45 L
이상의 과정을 통해 TPO를 고순도(97.5%)로 수득할 수 있었고, 생산량은 Wet IB g 당 15~19 mg의 수율로 생산이 가능하였다.
<110> AP TECHNOLOGY CO., LTD.
<120> Thrombopoietin developed with mass production for oral dosage and
mass production process therof
<130> AP-2014-0030
<160> 4
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 153
<212> PRT
<213> Homo sapiens sapiens
<400> 1
Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu
1 5 10 15
Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val
20 25 30
His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu
35 40 45
Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp Ile Leu
50 55 60
Gly Ala Thr Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln
65 70 75 80
Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln
85 90 95
Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln Leu
100 105 110
Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe
115 120 125
Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu
130 135 140
Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg
145 150
<210> 2
<211> 75
<212> PRT
<213> Homo sapiens sapiens
<400> 2
Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val
1 5 10 15
Glu Ser Ser Asp Thr Ile Asp Asn Val Lys Ser Lys Ile Gln Asp Lys
20 25 30
Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln
35 40 45
Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser
50 55 60
Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly
65 70 75
<210> 3
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> His-tag
<400> 3
His His His His His His
1 5
<210> 4
<211> 81
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fusion protein with His-tag and Ubiquitin
<400> 4
His His His His His His Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys
1 5 10 15
Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Ser Ser Asp Thr Ile Asp Asn Val Lys
20 25 30
Ser Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu
35 40 45
Ile Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr
50 55 60
Asn Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly
65 70 75 80
Gly
Claims (13)
- 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 트롬보포이에틴(thrombopoietin)을 대장균 내에서 생산하는 방법에 있어서,
상기 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 트롬보포이에틴(thrombopoietin)은, N-말단에, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 유비퀴틴(Ubiquitin)이 융합되어 있고, 이 유비퀴틴의 N-말단에 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 갖는 히스택(His-tag)이 융합되어 있으며;
상기 융합에 의해, 상기 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 트롬보포이에틴(thrombopoietin)은, 대장균 내에서 불용성 내포체 형태로 발현되는 것을 특징으로 하는 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 트롬보포이에틴 단백질의 대장균 내 생산 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 트롬보포이에틴 단백질은,
서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 '히스택-유비퀴틴 융합 단백질'이, 서열번호 1의 트롬보포이에틴의 N-말단에 융합되어 형성된 것을 특징으로 하는 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 트롬보포이에틴 단백질의 대장균 내 생산 방법.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항의 방법에 의해 생산된 것으로서, '서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 트롬보포이에틴(thrombopoietin)의 N-말단에 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 유비퀴틴(Ubiquitin)이 융합되어 있고, 이 유비퀴틴의 N-말단에 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 갖는 히스택(His-tag)을 융합되어 있는 융합단백질'을 불용성 내포체 형태로 포함하는 대장균 균체 파쇄액을 히스택이 결합할 수 있는 리간드 친화성 크로마토그램에 통과시켜 용출물을 수득하는 단계 (a);
상기 단계 (a)에서 수득된 용출물에 유비퀴티나아제(ubiquitinase)를 첨가하여 반응시킨 후, 반응물을 수득하는 단계 (b);
상기 단계 (b)에서 수득된 반응물을 음이온 교환 크로마토그램에 통과시켜 용출물을 수득하는 단계 (c);
상기 단계 (c)에서 수득된 용출물을 히스택이 결합할 수 있는 리간드 친화성 크로마토그램에 통과시켜 용출물을 수득하는 단계 (d);
상기 단계 (d)에서 수득된 용출물을 음이온 교환 크로마토그램에 통과시켜 용출물을 수득하는 단계 (e); 를 포함하는 것을 특징으로 하는 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 트롬보포이에틴 단백질의 수득방법.
- 제12항에 있어서,
상기 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 트롬보포이에틴 단백질의 수득방법은,
상기 단계 (e) 이후,
한외 여과하는 단계 (f);를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 트롬보포이에틴 단백질의 수득방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020140010183A KR101814048B1 (ko) | 2014-01-28 | 2014-01-28 | 대량 생산이 가능하도록 개선된 경구투여용 트롬보포이에틴 및 이의 대량 생산공정 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020140010183A KR101814048B1 (ko) | 2014-01-28 | 2014-01-28 | 대량 생산이 가능하도록 개선된 경구투여용 트롬보포이에틴 및 이의 대량 생산공정 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20150089499A KR20150089499A (ko) | 2015-08-05 |
| KR101814048B1 true KR101814048B1 (ko) | 2018-01-02 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020140010183A KR101814048B1 (ko) | 2014-01-28 | 2014-01-28 | 대량 생산이 가능하도록 개선된 경구투여용 트롬보포이에틴 및 이의 대량 생산공정 |
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| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101814048B1 (ko) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20060276625A1 (en) | 2005-04-20 | 2006-12-07 | Viromed Co., Ltd. | Compositions and methods for fusion protein separation |
-
2014
- 2014-01-28 KR KR1020140010183A patent/KR101814048B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20060276625A1 (en) | 2005-04-20 | 2006-12-07 | Viromed Co., Ltd. | Compositions and methods for fusion protein separation |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20150089499A (ko) | 2015-08-05 |
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