JP2018531007A6 - インスリンの製造方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、高濃度のプロインスリンを酵素分解してインスリンに転換させる段階を含む、プロインスリンからインスリンを製造する方法、インスリンを精製する方法及びこれから製造されたインスリンに関する。
【選択図】 図１

Description

本発明の高濃度のプロインスリンを酵素分解してインスリンに転換させる段階を含む、プロインスリンからインスリンを製造する方法、インスリンを精製する方法及びこれから製造されたインスリンに関する。
組み換えインスリンの製造方法は、半合成インスリン（semi-synthetic insulin）の製造方法から、二鎖方法（two chain method）を経てプロインスリンからインスリンを製造する方法まで持続的に開発されてきた。
二鎖方法と半合成方法を除いたプロインスリンからインスリンを製造する方法の中で、トリプシン及びカルボキシぺプチダーゼＢを用いてプロインスリンをインスリンに転換させる工程は数年間用いられてきた（参考；非特許文献１及び２）。しかし、この方法を用いてインスリンを生産する場合には、一般的なカラムなどの精製方法では除去が難しい不純物、特にＢ鎖の最後のアミノ酸であるトレオニンが消失されたヒトインスリン[Ｄｅｓ‐Ｔｈｒ（Ｂ３０）インスリン]の形態が条件に応じてその含量は異なるが、ほとんどの条件でインスリン製造の際に生成されるその他の不純物に比べて多量（４〜１０％）に形成されると知られている。
半合成方法の場合は、Ｃペプチドを天然型とは異なって変形させ、トリプシン処理だけでプロインスリン類似体でＣペプチドを除去できるようにし、Ｂ鎖の最後のアミノ酸であるトレオニンが除去された形態が精製されるようにする。その後、生成されたインスリンのＢ鎖の最後のアミノ酸にトレオニンエステルを合成により結合させた後、生成されたインスリンエステルとＢ鎖の最後のアミノ酸であるトレオニンが消失されたヒトインスリン[Ｄｅｓ‐Ｔｈｒ（Ｂ３０）インスリン]形態を分離する方法を用いる。一方、ヒトプロインスリンを中間体として用いる方法の場合には、Ｄｅｓ‐Ｔｈｒ（Ｂ３０）インスリンが酵素転換工程中に多量生成されることにより、その抑制のための試みが存在した。
例えば、特許文献１では、酵素転換工程で２価金属イオンを導入することにより、Ｄｅｓ‐Ｔｈｒ（Ｂ３０）インスリンの生成量を減少させたと報告した。
また、Son YJらの非特許文献３及び特許文献２によると、「 シトラコニル化（citraconylation）」という方法を用いてＢ３０トレオニン付近のＢ２９リジンサイトをブロッキングする反応をさせた後、酵素転換工程を行い、Ｄｅｓ‐Ｔｈｒ（Ｂ３０）インスリンの生成量を減少させたと報告した。
しかし、このような方法は、酵素転換工程の後に行われる精製工程であり、添加剤による潜在的な問題を引き起こしうる。また、工程に前記Ｄｅｓ‐Ｔｈｒ（Ｂ３０）インスリンの精製を防ぐための添加剤の追加及び/または添加剤の除去工程が含まれるべきであるという点で、工程の複雑性を増加させ、後にはコストの増加につながるという問題点がある。
米国登録特許ＵＳ５４５７０６６ 米国公開特許第２０１２−０２１４９６４
Krmmler, W., Clark, j., Steiner, D.F., Fed. Proc. 30 (1971) 1210 Kemmler, W., Peterson, J.D., Steiner, D.F.,J. Biol.Chem., 246 (1971) 6788-6791 Biotechnol Prog. 2009 Jul-Aug;25(4):1064-70
このような背景下で、本発明者らはプロインスリンを中間体として用いるインスリン製造方法において、不純物の生成を最小化できる方法を開発しようと鋭意努力した結果、高濃度のプロインスリン試料に酵素転換工程を行う方法を開発した。本発明で開発された前記方法を介してＤｅｓ‐Ｔｈｒ（Ｂ３０）インスリンの生成を効果的に減少させうる。
本発明の一つの目的は、高濃度のプロインスリンを酵素分解してインスリンに転換させる段階を含む、プロインスリンからインスリンを製造する方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、高濃度のプロインスリンを酵素分解してインスリンに転換させて、インスリンを含む試料を製造する段階；及び前記製造された試料を精製工程に適用する段階を含む、インスリンの精製方法を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、前記方法で製造されたインスリンを提供することにある。
本発明の方法を通じて、不純物が効果的に制御されたインスリン試料を製造することができ、インスリン精製効率を著しく増加させうる。したがって、これを大量のインスリンの製造に適用することで、不純物除去のためのコスト減少が期待できる。
酵素処理時、プロインスリンの濃度条件に応じる不純物の減少効果を分析したグラフである。 酵素処理時、反応温度の条件に応じる不純物の減少効果を分析したグラフである。 酵素処理時、反応ｐＨ条件に応じる不純物の減少効果を分析したグラフである。 Ｄｅｓ-Ｔｈｒ（Ｂ３０）インスリンアナログを過量に含むインスリンアナログ試料の逆相クロマトグラフィー分析結果を示す。 純粋に精製されたインスリンアナログの純度を高圧クロマトグラフィーで分析した結果である。（図５ａ）Ｃ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣ 純粋に精製されたインスリンアナログの純度を高圧クロマトグラフィーで分析した結果である。（図５ｂ）Ｃ４ ＲＰ−ＨＰＬＣ 純粋に精製されたインスリンアナログの純度を高圧クロマトグラフィーで分析した結果である。（図５ｃ）ＳＥＣ−ＨＰＬＣ
本発明を具現するための一つの様態は、５０ｍｇ/ｍｌ以上の濃度のプロインスリンを酵素分解してインスリンに転換させる段階を含む、プロインスリンからインスリンを製造する方法である。
一つの具体例として、前記酵素は、トリプシン、カルボキシぺプチダーゼＢまたはこれらの組み合わせである。
他の具体例として、前記プロインスリンの濃度は、５０ｍｇ/ｍｌ〜３００ｍｇ/ｍｌである。
他の具体例として、前記プロインスリンの濃度は、１００ｍｇ/ｍｌ〜３００ｍｇ/ｍｌである。
他の具体例として、前記プロインスリンの濃度は、２００ｍｇ/ｍｌ〜３００ｍｇ/ｍｌである。
他の具体例として、前記トリプシンの比率は、プロインスリンに比べて１/７，５００〜１/４０，０００（weight/weight）である。
他の具体例として、前記トリプシンの比率は、プロインスリンに比べて１/１５，０００〜１/４０，０００（weight/weight）である。
他の具体例として、前記トリプシンの比率は、プロインスリンに比べて１/２０，０００〜１/４０，０００（weight/weight）である。
他の具体例として、前記トリプシンの比率は、プロインスリンに比べて１/３０，０００〜１/４０，０００（weight/weight）である。
他の具体例として、前記カルボキシぺプチダーゼＢの比率は、プロインスリンに比べて１/６００〜１/２０，０００（weight/weight）である。
他の具体例として、前記カルボキシぺプチダーゼＢの比率は、プロインスリンに比べて１/６００〜１/１５，０００（weight/weight）である。
他の具体例として、酵素反応におけるｐＨは、６．５〜９．０である。
他の具体例として、酵素反応におけるｐＨは、７．０〜８．５である。
他の具体例として、酵素反応における温度は、４．０℃〜２５．０℃である。
他の具体例として、酵素反応における時間は、４．０時間〜５５時間である。
他の具体例として、酵素反応の緩衝液は、１ｍＭ〜１００ｍＭのＴｒｉｓ-ＨＣｌである。
他の具体例として、酵素反応の緩衝液は、金属イオンを含まない。
他の具体例として、前記プロインスリンまたはインスリンは、アナログ形態である。
他の具体例として、前記方法は、プロインスリンから転換されたインスリンを含む試料をクロマトグラフィーに適用してインスリンを精製する段階をさらに含む。
他の具体例として、前記クロマトグラフィーは、陽イオン交換クロマトグラフィーまたは逆相クロマトグラフィーである。
他の具体例として、 前記方法は、逆相クロマトグラフィーまたは陰イオン交換クロマトグラフィーをさらに含む。
他の具体例として、前記方法は、プロインスリンから転換されたインスリンを含む試料に陽イオン交換クロマトグラフィーを適用することによってインスリンを精製した後、逆相クロマトグラフィーを行うことをさらに含む。
他の具体例として、前記プロインスリンは、陽イオン交換カラムまたは逆相カラムにより部分精製されたものである。
他の具体例として、前記方法で製造されたインスリンを含む試料は、Ｄｅｓ-Ｔｈｒ（Ｂ３０）インスリン不純物の含量が５％未満である。
本発明を具現するための他の様態は、高濃度のプロインスリンを酵素分解してインスリンに転換させて、インスリンを含む試料を製造する段階；及び前記製造された試料を精製工程に適用する段階を含む、インスリンの精製方法である。
一つの具体例として、前記クロマトグラフィーは、陽イオン交換クロマトグラフィーまたは逆相クロマトグラフィーである。
他の具体例として、前記方法は、プロインスリンから転換されたインスリンを含む試料を陽イオン交換クロマトグラフィーに適用し、続いて逆相クロマトグラフィーを行うことによってインスリンを精製することを含む。
前記目的を具現するための他の様態として、本発明は、前記方法により製造されたインスリンを提供する。
以下、添付の図面を参照して、本発明の好ましい実施様態について詳細に説明する。しかしながら、本発明は、異なる形態で実施されてもよく、本願に記載された実施様態に限定されると解釈されるべきではない。むしろ、これらの実施様態は本開示が徹底的かつ完全であり、本発明の範囲を当業者に完全に伝えるように提供される。
本発明を具現するための一つの様態は、高濃度のプロインスリンを酵素分解してインスリンに転換させる段階を含む、プロインスリンからインスリンを製造する方法を提供する。
本発明の方法において、前記プロインスリンは高濃度で用いられてもよい。
具体的に、５０ｍｇ/ｍｌ以上のプロインスリンを酵素転換に用いてもよい。より具体的に、前記方法でプロインスリンの濃度は、５０ｍｇ/ｍｌ〜３００ｍｇ/ｍｌ、具体的には１００ｍｇ/ｍｌ〜３００ｍｇ/ｍｌ、より具体的には２００ｍｇ/ｍｌ〜３００ｍｇ/ｍｌであってもよいが、これに制限されない。
前記プロインスリンを酵素分解してインスリンに転換させることは、本発明で酵素転換とも命名される。
前記「酵素転換」とは、Ａ鎖とＢ鎖の間にＣペプチドを含むプロインスリンを酵素を用いてインスリンに転換させることをいう。
本発明で前記酵素転換は、トリプシン、カルボキシぺプチダーゼＢまたはこれらの組み合わせから選択されるものを用いて酵素転換しうる。
本発明で、前記トリプシンは、プロインスリンに比べて１/７，５００〜１/４０，０００（weight/weight）の比率、具体的に１/１５，０００〜１/４０，０００（weight/weight）、より具体的に１/２０，０００〜１/４０，０００（weight/weight）、さらに具体的に１/３０，０００〜１/４０，０００（weight/weight）の比率で用いられてもよいが、これに制限されない。
本発明で、前記カルボキシぺプチダーゼＢは、プロインスリンに比べて１/６００〜１/２０，０００（weight/weight）、具体的に１/６００〜１/１５，０００（weight/weight）の比率で用いられてもよいが、これに制限されない。
特に、トリプシン及びカルボキシぺプチダーゼＢを両方用いる場合に、前述したトリプシン及びカルボキシぺプチダーゼＢの比率を互いに組み合わせて用いてもよい。
本発明の酵素転換反応でのｐＨは、プロインスリンからインスリンの効果的な転換が可能であれば、特にこれに制限されないが、ｐＨ６．５〜９．０、具体的に７．０〜８．５であってもよいが、これに制限されない。
本発明の酵素転換反応における温度は、４．０℃〜２５．０℃であってもよいが、これに制限されない。
本発明の酵素反応時間は、４．０時間〜５５時間であってもよいが、これに制限されない。
本発明の酵素反応の緩衝液は、１ｍＭ〜１００ｍＭのＴｒｉｓ-ＨＣｌであってもよいが、これに制限されない。
本発明の酵素反応の緩衝液は、金属イオンを含まなくてもよい。
下記では、プロインスリン及びインスリンに対してより詳細に説明する。
本発明で用語、「プロインスリン」は、インスリンの前駆体分子をいう。前記プロインスリンは、インスリンＡ鎖及びＢ鎖、そしてその間にＣペプチドを含んでもよい。前記プロインスリンはヒトインスリンであってもよい。
本発明で用語、「インスリン」は、体内の血糖を調節する役割を行うタンパク質をいう。
天然型インスリンは、膵臓から分泌されるホルモンであって、一般的に細胞内のグルコース吸収を促進し、脂肪の分解を抑制して体内の血糖を調節する役割をする。
インスリンは、血糖調節機能がないプロインスリン形態でプロセッシングを経て血糖調節機能を有するインスリンになる。インスリンは、２つのプリペプチド鎖、すなわちそれぞれ２１個及び３０個のアミノ酸残基を含むＡ鎖及びＢ鎖から構成されており、これらは２つのジスルフィド架橋で相互連結されている。天然型インスリンのＡ鎖及びＢ鎖は、それぞれ下記配列番号１及び２で表されるアミノ酸配列を含んでもよい。
Ａ鎖：
Ｇｌｙ‐Ｉｌｅ‐Ｖａｌ‐Ｇｌｕ‐Ｇｌｎ‐Ｃｙｓ‐Ｃｙｓ‐Ｔｈｒ‐Ｓｅｒ‐Ｉｌｅ‐Ｃｙｓ‐Ｓｅｒ‐Ｌｅｕ‐Ｔｙｒ‐Ｇｌｎ‐Ｌｅｕ‐Ｇｌｕ‐Ａｓｎ‐Ｔｙｒ‐Ｃｙｓ‐Ａｓｎ（配列番号１)
Ｂ鎖：
Ｐｈｅ‐Ｖａｌ‐Ａｓｎ‐Ｇｌｎ‐Ｈｉｓ‐Ｌｅｕ‐Ｃｙｓ‐Ｇｌｙ‐Ｓｅｒ‐Ｈｉｓ‐Ｌｅｕ‐Ｖａｌ‐Ｇｌｕ‐Ａｌａ‐Ｌｅｕ‐Ｔｙｒ‐Ｌｅｕ‐Ｖａｌ‐Ｃｙｓ‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｕ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｙ‐Ｐｈｅ‐Ｐｈｅ‐Ｔｙｒ‐Ｔｈｒ‐Ｐｒｏ‐Ｌｙｓ‐Ｔｈｒ（配列番号２)
本発明で、プロインスリン及びインスリンは、天然型インスリン及びインスリンアナログの形態をすべて含む概念である。
本発明で、プロインスリンアナログまたはインスリンアナログは、天然型と比較するとき、Ｂ鎖またはＡ鎖のアミノ酸が変異されたものを含む。前記インスリンアナログは、天然型インスリンと同一または天然型インスリンに相応する生体内の血糖調節機能を有しうる。
具体的に、前記プロインスリンアナログまたはインスリンアナログは天然型から少なくても一つ以上のアミノ酸が置換、追加、欠失、修飾及びこれらの組み合わせからなる群から選択される変形が起こったものであってもよいが、これに制限されない。
本発明の実施例で使用されたインスリンアナログは、遺伝子組み換え技術で製作したインスリンアナログであり、前記インスリンアナログは逆方向インスリン、インスリン変異体、インスリン断片などの概念を含む。
これらのインスリンアナログは、天然型インスリンと同一または相応する生体内の血糖調節機能を有するペプチドであって、このようなペプチドはインスリンアゴニスト、インスリン誘導体、インスリン断片、インスリン変異体などをすべて含む。
前記インスリン誘導体は、体内で血糖を調節する機能を有しながら、天然型インスリンのＡ鎖及びＢ鎖のアミノ酸配列のそれぞれに対して相同性を示し、アミノ酸残基の一部のグループが、化学的に置換（例えば、α‐メチル化、α‐ヒドロキシル化）、削除（例えば、脱アミン化）または修飾（例えば、Ｎ‐メチル化）された形態のペプチド形態を含む。前記インスリン断片は、インスリンに１つ以上のアミノ酸が追加または削除された形態を意味し、追加されたアミノ酸は天然に存在しないアミノ酸（例えば、Ｄ型アミノ酸）であってもよく、このようなインスリン断片は体内で血糖を調節する機能を有する。
これらのインスリン変異体は、インスリンとアミノ酸配列が一つ以上異なるペプチドであって、体内で血糖を調節する機能を有する。
本発明のインスリンアゴニスト、インスリン誘導体、インスリン断片及びインスリン変異体でそれぞれ用いられた製造方法は、独立して用いられてもよく、組み合わせも可能である。例えば、アミノ酸配列が一つ以上異なり、Ｎ末端のアミノ酸残基に脱アミノ化が導入されたもので、体内で血糖を調節する機能を有するペプチドも、本発明の範囲に含まれる。
具体的に、前記プロインスリンまたはインスリンアナログは、インスリンＢ鎖の１、２、３、５、８、１０、１２、１６、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９及び３０番のアミノ酸、Ａ鎖の１、２、５、８、１０、１２、１４、１６、１７、１８、１９及び２１番のアミノ酸からなる群から選択された一つまたはそれ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたものであってもよく、より具体的にはＢ鎖の８、１６、２３、２４、及び２５番のアミノ酸；及びＡ鎖の１、２、１４及び１９番のアミノ酸からなる群から選択された一つまたはそれ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたものであってもよい。具体的に、前記記述したアミノ酸で１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、２０以上、２１以上、２２以上、２３以上、２４以上、２５以上、２６以上または２７以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたものであってもよいが、これに制限されない。
前記記述した位置のアミノ酸残基は、またアラニン、グルタミン酸、アスパラギン、イソロイシン、バリン、グルタミン、グリシン、リジン、ヒスチジン、システイン、フェニルアラニン、トリプトパン、プロリン、セリン、トレオニン及び/またはアスパラギン酸に置換されてもよい。その例として、天然型インスリンＡ鎖の１４番アミノ酸であるチロシンがグルタミン酸に置換されたものであってもよい。
前記アミノ酸の置換または付加の際には、ヒトタンパク質で通常観察される２０個のアミノ酸だけでなく、非定型または非自然的発生アミノ酸を用いてもよい。 非定型アミノ酸の商業的な出処には、Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ、ＣｈｅｍＰｅｐ及びＧｅｎｚｙｍｅｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓが含まれてもよい。このようなアミノ酸が含まれたペプチドと典型的なペプチド配列は、商業化されたペプチド合成会社、例えば、米国のＡｍｅｒｉｃａｎ ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｍｐａｎｙ、Ｂａｃｈｅｍや韓国のＡｎｙｇｅｎを通じて合成及び購入可能である。
より具体的に、前記インスリンアナログは下記一般式（１）で表される配列番号３のＡ鎖、及び/または下記一般式（２）で表される配列番号４のＢ鎖を含むものであってもよい。また、前記Ａ鎖及びＢ鎖の配列がジスルフィド結合で相互連結された形態であってもよい。ただし、これに制限されるものではない。
一般式（１）
Figure 2018531007
 前記一般式（１）において、
Ｘａａ１ は、グリシンまたはアラニンであり、
Ｘａａ２ は、イソロイシンまたはアラニンであり、
Ｘａａ３ は、チロシン、グルタミン酸、アスパラギン、ヒスチジン、リジン、アラニンまたはアスパラギン酸であり、
Ｘａａ４ は、チロシン、グルタミン酸、セリン、トレオニンまたはアラニンである。
一般式（２）
Figure 2018531007
 前記一般式（２）において、
Ｘａａ５ は、グリシンまたはアラニンであり、
Ｘａａ６ は、チロシン、グルタミン酸、セリン、トレオニンまたはアスパラギン酸であり、
Ｘａａ７ は、グリシンまたはアラニンであり、
Ｘａａ８は、フェニルアラニンまたはアラニンであり、
Ｘａａ９は、フェニルアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アラニンまたは欠失である。
より具体的に、前記インスリンアナログは、
ｉ）前記一般式（１）でＸａａ１はアラニンであり、Ｘａａ２はイソロイシンであり、Ｘａａ３はチロシンであり、Ｘａａ４はチロシンであるＡ鎖及び前記一般式（２）でＸａａ５はグリシンであり、Ｘａａ６はチロシンであり、Ｘａａ７はグリシンであり、Ｘａａ８はフェニルアラニンであり、Ｘａａ９はフェニルアラニンであるＢ鎖を含むか；
ｉｉ）前記一般式（１）でＸａａ１はグリシンであり、Ｘａａ２はアラニンであり、Ｘａａ３はチロシンであり、Ｘａａ４はチロシンであるＡ鎖及び前記一般式（２）でＸａａ５はグリシンであり、Ｘａａ６はチロシンであり、Ｘａａ７はグリシンであり、Ｘａａ８はフェニルアラニンであり、Ｘａａ９はフェニルアラニンであるＢ鎖を含むか；
ｉｉｉ）前記一般式（１）でＸａａ１はグリシンであり、Ｘａａ２はイソロイシンであり、Ｘａａ３はグルタミン酸、アスパラギン、ヒスチジン、リジン、アラニンまたはアスパラギン酸であり、Ｘａａ４はチロシンであるＡ鎖及び前記一般式（２）でＸａａ５はグリシンであり、Ｘａａ６はチロシンであり、Ｘａａ７はグリシンであり、Ｘａａ８はフェニルアラニンであり、Ｘａａ９はフェニルアラニンであるＢ鎖を含むか；
ｉｖ）前記一般式（１）でＸａａ１はグリシンであり、Ｘａａ２はイソロイシンであり、Ｘａａ３はチロシンであり、Ｘａａ４はアラニン、グルタミン酸、セリンまたはトレオニンであるＡ鎖及び前記一般式（２）でＸａａ５はグリシンであり、Ｘａａ６はチロシンであり、Ｘａａ７はグリシンであり、Ｘａａ８はフェニルアラニンであり、Ｘａａ９はフェニルアラニンであるＢ鎖を含むか；
ｖ）前記一般式（１）でＸａａ１はグリシンであり、Ｘａａ２はイソロイシンであり、Ｘａａ３はチロシンであり、Ｘａａ４はチロシンであるＡ鎖及び前記一般式（２）でＸａａ５はアラニンであり、Ｘａａ６はチロシンであり、Ｘａａ７はグリシンであり、Ｘａａ８はフェニルアラニンであり、Ｘａａ９はフェニルアラニンであるＢ鎖を含むか；
ｖｉ）前記一般式（１）でＸａａ１はグリシンであり、Ｘａａ２はイソロイシンであり、Ｘａａ３はチロシンであり、Ｘａａ４はチロシンであるＡ鎖及び前記一般式（２）でＸａａ５はグリシンであり、Ｘａａ６はグルタミン酸、セリン、トレオニンまたはアスパラギン酸であり、Ｘａａ７はグリシンであり、Ｘａａ８はフェニルアラニンであり、Ｘａａ９はフェニルアラニンであるＢ鎖を含むか；
ｖｉｉ）前記一般式（１）でＸａａ１はグリシンであり、Ｘａａ２はイソロイシンであり、Ｘａａ３はチロシンであり、Ｘａａ４はチロシンであるＡ鎖及び前記一般式（２）でＸａａ５はグリシンであり、Ｘａａ６はチロシンであり、Ｘａａ７はアラニンであり、Ｘａａ８はフェニルアラニンであり、Ｘａａ９はフェニルアラニンであるＢ鎖を含むか；
ｖｉｉｉ）前記一般式（１）でＸａａ１はグリシンであり、Ｘａａ２はイソロイシンであり、Ｘａａ３はチロシンであり、Ｘａａ４はチロシンであるＡ鎖及び前記一般式（２）でＸａａ５はグリシンであり、Ｘａａ６はチロシンであり、Ｘａａ７はグリシンであり、Ｘａａ８はアラニンであり、Ｘａａ９はフェニルアラニンであるＢ鎖を含むものであってもよい。
ｉｘ）前記一般式（１）でＸａａ１はグリシンであり、Ｘａａ２はイソロイシンであり、Ｘａａ３はチロシンであり、Ｘａａ４はチロシンであるＡ鎖及び前記一般式（２）でＸａａ５はグリシンであり、Ｘａａ６はチロシンであり、Ｘａａ７はグリシンであり、Ｘａａ８はフェニルアラニンであり、Ｘａａ９はアラニン、アスパラギン酸またはグルタミン酸であるＢ鎖を含むものであってもよい。
ｘ）前記一般式（１）でＸａａ１はグリシンであり、Ｘａａ２はイソロイシンであり、Ｘａａ３はグルタミン酸であり、Ｘａａ４はチロシンであるＡ鎖及び前記一般式（２）でＸａａ５はグリシンであり、Ｘａａ６はチロシンであり、Ｘａａ７はグリシンであり、Ｘａａ８はフェニルアラニンであり、Ｘａａ９は欠失されたものであるＢ鎖を含むものであってもよい。
ｘｉ）前記一般式（１）でＸａａ１はグリシンであり、Ｘａａ２はイソロイシンであり、Ｘａａ３はアラニンであり、Ｘａａ４はチロシンであるＡ鎖及び前記一般式（２）でＸａａ５はグリシンであり、Ｘａａ６はグルタミン酸であり、Ｘａａ７はグリシンであり、Ｘａａ８はフェニルアラニンであり、Ｘａａ９は欠失されたものであるＢ鎖を含むものであってもよいが、これに制限されない。
例えば、前記記述した特徴的なアミノ酸配列を含みながら、該当インスリンアナログと７０％以上、具体的には８０％以上、より具体的には９０％以上、さらに具体的には９５％以上の相同性を有し、血糖調節機能を有するペプチドも、本発明の範囲に含まれる。
本発明で用語、「相同性」は、天然型タンパク質のアミノ酸配列またはそれをコードするポリヌクレオチド配列との類似度を示すためのもので、本発明のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列と前記のようなパーセント以上の同一の配列を有する配列を含む。このような相同性は２つの配列を肉眼で比較して決定してもよいが、比較対象となる配列を並べて相同性の程度を分析してくれる生物情報アルゴリズム（bioinformatic algorithm）を用いて決定してもよい。前記二つのアミノ酸配列間の相同性はパーセントとして示してもよい。有用な自動化されたアルゴリズムは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ（Genetics Computer Group、Madison、W、USA）のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡとＴＦＡＳＴＡコンピュータソフトウェアモジュールで利用可能である。
前記モジュールの自動化された配列アルゴリズムは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆ＷｕｎｓｃｈとＰｅａｒｓｏｎ＆ＬｉｐｍａｎとＳｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ配列の配列アルゴリズムを含む。他の有用な配列に対するアルゴリズムと相同性の決定は、ＦＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ２、ＰＳＩＢＬＡＳＴとＣＬＵＳＴＡＬ Ｗを含むソフトウェアで自動化されている。
前記インスリンアナログは、Ａ１Ｇ → Ａ、Ａ２Ｉ→ Ａ、Ａ１９Ｙ → Ａ、Ｂ８Ｇ →
Ａ、Ｂ２３Ｇ → Ａ、Ｂ２４Ｆ → Ａ、Ｂ２５Ｆ → Ａ、Ａ１９Ｙ → Ｅ、Ａ１９Ｙ →
Ｎ、Ａ１４Ｙ → Ｈ、Ａ１４Ｙ → Ｋ、Ａ１９Ｙ → Ｅ、Ａ１９Ｙ → Ｓ、Ａ１９Ｙ →
Ｔ、Ｂ１６Ｙ → Ｅ、Ｂ１６Ｙ → Ｓ、Ｂ１６Ｙ → Ｔ、Ａ１４Ｙ → Ａ、Ａ１４Ｙ →
Ｄ、Ｂ１６Ｙ → Ｄ、Ｂ２５Ｆ → Ｄ、Ｂ２５Ｆ → Ｅ、Ａ１４Ｙ → Ｄ/Ｂ２５Ｆ → 欠失及び/またはＡ１４Ｙ → Ｄ/Ｂ１６Ｙ → Ｅ/Ｂ２５Ｆ → 欠失のような変異を有してもよいが、これに制限されない（ここで、一番前端に記載されたＡもしくはＢはインスリンＡ鎖またはＢ鎖をいい、記載された数字は該当の鎖におけるアミノ酸番号をいう。後ろに記載されたアルファベットはＩＵＰＡＣに従って命名されるアミノ酸の略語を称する。例えば、Ｇ → Ａの場合、グリシンがアラニンに置換されたことをいう。）。
本発明に適用できるインスリンアナログの例は、前述したことに制限されるものではなく、当業界に公知の多様なインスリンアナログを本発明の方法に適用しうる。
また、このようなインスリンアナログをプロインスリンアナログで設計して適用することは、当業者に容易な範囲である。
本発明の方法に用いられる前記プロインスリンは、微生物で発現した後、これを部分精製して収得したものであってもよいが、これに制限されない。特に、前記プロインスリンは、陽イオン交換カラムにより部分精製されたものであってもよい。
具体的に、前記プロインスリンは（ａ）封入体（inclusion body）形態として微生物内で発現した後、これから封入体を分離する段階；（ｂ）分離されたプロインスリンを含む封入体からプロインスリンをリフォールディングする段階；及び（ｃ）前記（ｂ）段階で収得したプロインスリンを精製する段階を含んでもよい。
例えば、前記精製は下記のような過程を介して行われてもよい。
具体的に、封入体形態として微生物内で発酵を介してプロインスリンを発現及び形成させる。微生物内部に形成された封入体を分離するために、高圧細胞破砕装置を用いて微生物の細胞膜を破砕する。細胞膜が破砕された微生物を遠心分離と清浄過程を行い、インスリン前駆体を含む封入体のみを単離及び獲得する。
獲得した封入体ペレットに含まれているインスリン前駆体タンパク質のジスルフィド結合を還元させるためにグリシン溶液緩衝液で還元剤と反応させた後、 カオトロピック補助剤を添加してタンパク質構造を線形化しうる。その後、遠心分離を介して残存物を除去し、低温で蒸留水で希釈してカオトロピック補助剤と還元剤の濃度を下げることにより、正確なインスリン前駆体の構造を有するタンパク質を形成しうる。
その後、正確に形成されたプロインスリンを単離するために、陽イオンまたは陰イオン交換カラムを適用しうる。
本発明の方法は、プロインスリンから酵素転換されたインスリンを含む試料を精製する段階をさらに含んでもよい。
具体的に、プロインスリンから転換されたインスリンを含む試料をクロマトグラフィーに適用してインスリンに適用してもよい。
前記クロマトグラフィーは、インスリンの効果的な精製ができれば、特にその種類に制限されないが、陽イオン交換クロマトグラフィーまたは逆相クロマトグラフィーであってもよい。
本発明で用語、「陽イオン交換クロマトグラフィー」は、陽イオン交換樹脂を充填したカラムを用いたクロマトグラフィーをいう。前記陽イオン交換樹脂は他の水溶液に添加され、水溶液中の陽イオンとそれ自身の陽イオンを交換する役割をする合成樹脂である。前記陽イオン交換樹脂は当業界で通常に用いられるものを多様に用いてもよく、これに制限されないが、具体的にＣＯＯ−またはＳＯ３ ２−の作用基を有するカラムを用いてもよく、その例としてメチルスルホネート（Ｓ）、スルホプロピル（ＳＰ）、カルボキシメチル
（ＣＭ）、ポリアスパラギン酸、スルホエチル（ＳＥ）、スルホプロピル（ＳＰ）、ホスフェート（Ｐ）またはスルホネート（Ｓ）などを有するカラムを用いてもよい。
前記陽イオン交換クロマトグラフィーは平衡化された陽イオン交換カラムに前記試料を適用してインスリンをカラムに結合させた後、溶出緩衝液を用いて溶出させることにより行われてもよい。
前記陽イオン交換カラムの平衡は多様な緩衝溶液を用いて行ってもよく、その例として、シトレート、アセテート、ホスフェート、ＭＯＰＳまたはＭＥＳ緩衝液などを用いてもよい。
前記溶出緩衝液は多様な塩溶液を用いて行ってもよく、その例としてＮａＣｌまたはＫＣｌ塩緩衝液を用いてもよい。前記溶出は線形濃度勾配、またはステップワイズ濃度勾配などの方法を用いてもよいが、前記記述したことに制限されるものではない。
また、インスリンの精製は陽イオン交換クロマトグラフィーを行った後に逆相クロマトグラフィーを行うことを含んでもよい。
前記「逆相クロマトグラフィー」は、極性が低い固定相と極性が大きい移動相の組み合わせを用いて混合物を分離するクロマトグラフィーをいう。
前記逆相クロマトグラフィー樹脂は、当業界で通常に用いられるものを多様に用いてもよく、これに制限されないが、具体的にシリカやポリマーマトリックスに炭素体形態の作用基またはポリマーマトリックス自体が作用基として作用できるカラムを用いてもよく、その例として、Ｃ２，Ｃ４，Ｃ８、Ｃ１８またはポリスチレン/ジビニルベンゼンなどを有するカラムを用いてもよいが、これに制限されない。
前記逆相クロマトグラフィーは、平衡化されたカラムに前記試料を適用してインスリンをカラムに結合させた後、溶出緩衝液を用いて溶出させることにより行われてもよい。
前記逆相クロマトグラフィーの平衡化は、多様な溶液を用いて行ってもよく、その例としてホスフェート緩衝液またはＴＦＡ/ＴＡＥなどが含まれた水などを用いてもよい。
前記溶出緩衝液は、多様な有機溶媒溶液を用いて行ってもよく、その例として、エタノール、イソプロパノールまたはアセトニトリルなどを用いてもよい。前記溶出が、線形濃度勾配またはステップワイズ濃度勾配などの方法を用いてもよいが、前記記述したことに制限されるものではない。
また、プロインスリン及びインスリンの精製は陽イオン交換クロマトグラフィーを行った後に陰イオン交換クロマトグラフィーを行うことを含んでもよい。
本発明で用語、「陰イオン交換クロマトグラフィー」は、陰イオン交換樹脂を充填したカラムを用いたクロマトグラフィーをいう。前記陰イオン交換樹脂は異なる水溶液に添加され水溶液中の陰イオンとそれ自身の陰イオンを交換する役割をする合成樹脂である。前記陰イオン交換樹脂は当業界で通常に用いられるものを多様に用いてもよく、これに制限されないが、具体的にＮ＋作用基を有しているカラムを用いてもよく、その例として第四級アンモニウム（Ｑ）、第四級アミノエチル（ＱＡＥ）、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ジメチルアミノメチル（ＤＭＡＥ）またはトリメチルアミノエチル（ＴＭＡＥ）などを有するカラムを用いてもよいが、これに制限されない。
前記陰イオン交換クロマトグラフィーは平衡化された陰イオン交換カラムに前記試料を適用してプロインスリン及びインスリンをカラムに結合させた後、溶出緩衝液を用いて溶出させることにより行われてもよい。
前記陰イオン交換カラムの平衡は多様な緩衝溶液を用いて行ってもよく、その例としてトリス、ビストリス、ヒスチジンまたはＨＥＰＥＳ緩衝液などを用いてもよい。
前記溶出緩衝液は多様な塩溶液を用いて行ってもよく、その例としてＮａＣｌまたはＫＣｌ塩緩衝液を用いてもよい。前記溶出は、線形濃度勾配またはステップワイズ濃度勾配などの方法を用いてもよいが、前記記述したことに制限されるものではない。
また、本発明の酵素反応を用いたインスリン製造のために用いられるプロインスリンは、陽イオン交換カラムまたは逆相カラムに部分精製されたものであってもよいが、これに制限されない。
一方、特にこれに制限されないが、本発明の方法によるとＤｅｓ-Ｔｈｒ（Ｂ３０）インスリン不純物の含量が５％未満、具体的に３％未満、より具体的に２％未満、さらに具体的に１％未満でインスリンを製造しうる。
本発明を具現するための他の様態は、高濃度のプロインスリンを酵素分解してインスリンに転換して、インスリンを含む試料製造する段階；及び前記製造された試料を精製工程に適用する段階を含む、インスリンの精製方法を提供する。
前記精製方法は、クロマトグラフィー工程により行われてもよい。
前述したインスリンを含む試料の製造段階、精製段階、クロマトグラフィー工程については前述したとおりである。
本発明を具現する他の様態は、前記方法で製造されたインスリンを提供する。
前記方法及びインスリンについては前述したとおりである。
（実施例）
以下、下記実施例により本発明をより詳細に説明する。ただし、下記実施例は本発明を例示するためのもので、本発明の範囲がこれらに限定されるものではない。
実施例１：プロインスリンアナログの発現
Ｔ７プロモーター調節下の組み換えプロインスリンアナログの発現を行った。各アナログのインスリンに該当する部分の配列を表１に示した。
Figure 2018531007
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それぞれの組み換えインスリンアナログ発現ベクターとしてＥ.ｃｏｌｉ ＢＬ２１-ＤＥ３ (E. coli B F-dcm ompT hsdS(rB-mB-) gal λDE3)；Novagen）を形質転換した。形質転換方法は Ｎｏｖａｇｅｎ社で推薦する方法を従った。各組み換え発現ベクターが形質転換された各々の単一コロニーを取り、アンピシリン（５０μｇ/ｍｌ）が含まれた２×ルリアブロス（ＬＢ）培地に接種して３７℃で１５時間培養した。組み換え菌株培養液と３０％グリセロールとが含まれた２×ＬＢ培地を１：１（ｖ/ｖ）の比率で混合して各１ｍｌずつクライオチューブに分注し、−１４０℃で保管した。これを組み換えプロインスリンタンパク質の生産のための細胞ストックとして用いた。
組み換えプロインスリンアナログの発現のために、各細胞ストック１バイアルを溶かして５００ｍｌの２×ルリアブロスに接種して３７℃で１０〜１８時間振とう培養した培養液の中で２００ｍｌを取って、新鮮な５００ｍｌの２×ルリアブロスが入った２つのフラスコにそれぞれ１００ｍｌずつ接種して３７℃で１〜５時間振とう培養し、これを種培養液として用いた。５０Ｌ発酵機（MSJ-U2, B.E.MARUBISHI、日本）を用いて種培養液を１７Ｌの発酵培地に接種して初期回分式発酵を始めた。培養条件は３７℃の温度、２０Ｌ/分（１ｖｖｍ）の空気量、５００ｒｐｍの攪拌速度及び３０％アンモニア水を用いてｐＨ６．７０で維持させた。発酵の進行は培養液内の栄養素が制限されたとき、追加培地（feeding solution）を添加して流加培地を進行した。菌株の成長はＯＤ値によりモニタリングし、ＯＤ値が１００以上で最終濃度５００μＭのＩＰＴＧを導入した。培養は導入した後、約２０〜２５時間までさらに進行し、培養の終了後、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥを用いて過発現されたプロインスリンアナログを確認した。プロインスリンアナログが過発現された組み換え菌株は遠心分離機を用いて収穫し、使用時まで−８０℃で保管した。
実施例２：組み換えプロインスリンアナログの回収及びリフォールディング
前記実施例１で発現させた組み換えプロインスリンアナログを可溶性の形態に変えるために細胞を破砕してリフォールディングした。細胞ペレット１７０ｇ（wet weight）を１Ｌ溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、１ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０．２Ｍ ＮａＣｌ及び０．５％トリトンＸ-１００）に再浮遊した。微細溶液化プロセッサＭ−１１０ＥＨ（AC Technology Corp. Model M1475C）を用いて１５，０００ｐｓｉの圧力で行い、細胞を破砕した。破砕された細胞溶解物を１２，０００ｇ、４℃で３０分遠心分離して上清液を捨てて、１Ｌ洗浄緩衝液（０．５％トリトンＸ−１００及び５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．２Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ）に再浮遊した。１２，０００ｇ、４℃で３０分間遠心分離してペレットを蒸留水に再浮遊した後、同様な方法で遠心分離した。ペレットを取り６００ｍｌの緩衝液（１Ｍグリシン、３．７８ｇシステイン−ＨＣｌ、ｐＨ１０．６）に再浮遊し、常温で１．５時間攪拌した。再浮遊された組み換えプロインスリンアナログの回収するためにウレアを添加した後、常温で攪拌した。 可溶化された組み換えプロインスリンアナログをリフォールディングのために４℃で４０分遠心分離して上清液を取った後、３〜１２Ｌの蒸留水に蠕動ポンプ（peristaltic pump）を用いて入れながら４〜８℃で１７時間以上攪拌した。
実施例３：陽イオン交換クロマトグラフィー精製
エタノールが含まれた２０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）緩衝液で平衡化されたＳＰ−ＦＦ（GE healthcare、米国）カラムにリフォールディングが終わった試料をｐＨ調整した後に結合させた後、塩化カリウム０．５Ｍとエタノールが含まれた２０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）緩衝液を用いて濃度が０％から１００％になるように線形硬度勾配でプロインスリンアナログタンパク質を溶出した。
実施例４：酵素処理によるプロインスリンのインスリンへの転換
実施例１で記載されたアナログの中で８番のアナログを代表として用いて酵素処理によるプロインスリンのインスリンへの転換実験を行った。ＳＰ−ＦＦカラムにより溶出されたプロインスリンアナログ試料を最終ｐＨ７．０〜８．５に調節した後、濃縮してタンパク質の濃度が５〜３００ｍｇ/ｍｌがなるようにする。本酵素反応はメーカーのプロトコルに基づいて行われた。５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌに添加されたタンパク質試料にタンパク量の約１/３，９００〜１/６２，４００重量比に該当するトリプシン（Rocheドイツ）と１/６４４〜１/１９，３００重量比に該当するカルボキシペプチダーゼＢ（Roche、ドイツ）を添加した後、約４〜２５℃で０〜５５時間攪拌した。酵素反応を終了するためにｐＨを３．５以下に下げた。
実施例５：酵素転換方法における不純物の減少効果の確認
前記実施例４では、Ｄｅｓ-Ｔｈｒ（Ｂ３０）インスリンアナログ不純物を最小化するための最適化された高濃度の条件を確立した。プロインスリンを５ｍｇ/ｍｌ、５０ｍｇ/ｍｌ、１００ｍｇ/ｍｌ、２００ｍｇ/ｍｌ、３００ｍｇ/ｍｌの各濃度の条件下で、タンパク量の１/３，９００〜１/６２，４００重量比に該当するトリプシンと１/６４４〜１/１９，３００重量比に該当するカルボキシペプチダーゼＢを添加した後、実施例４で言及した攪拌及び反応終了方法に従って実施し、ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｃ４）分析法を用いて、各濃度条件下でのＤｅｓ-Ｔｈｒ（Ｂ３０）インスリン不純物含有量を確認した。
その結果、Ｄｅｓ-Ｔｈｒ（Ｂ３０）インスリンアナログ不純物はタンパク量の１/３，９００〜１/６２，４００重量比に該当するトリプシンと１/６４４重量比のカルボキシペプチダーゼＢとを処理したときの条件下でプロインスリン５〜５０ｍｇ/ｍｌの濃度条件で約１．６〜６．４％発生したが、１００ｍｇ/ｍｌ〜３００ｍｇ/ｍｌの高濃度条件では、発生程度を大幅に下げて約１％前後に発生を抑制することができた（表２及び図１）。
反応温度による最適化時間も０時から３６時間以上（最大５５時間）までテストし、各温度に応じた温度条件を図２に示した。低温から室温までの温度に応じて反応速度は異なるが、減少効果は同様であることを確認した。ｐＨ条件に応じたトリプシンの最適条件も確認し、図３に示した。
Figure 2018531007
また、カルボキシペプチダーゼＢの重量比によってもＤｅｓ-Ｔｈｒ（Ｂ３０）インスリンアナログ不純物の生成が調節されることを確認した。
これは、トリプシン（１/３１，２００重量比に該当する）とカルボキシペプチダーゼＢ（１/６４４〜１/１９，３００重量比に該当する）を処理したとき、１００ｍｇ/ｍｌの高濃度条件で１％前後にＤｅｓ-Ｔｈｒ（Ｂ３０）インスリンアナログ不純物の発生を抑制できることを確認した（表３）。
Figure 2018531007
実施例６：陽イオン交換クロマトグラフィー精製
反応が終わった試料を２０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）緩衝液で平衡化されたＳＰ−ＨＰ（GE healthcare、米国）カラムに再び結合させた後、塩化カリウム０．５Ｍとエタノールが含まれた２０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）緩衝液を用いた線形濃度勾配を用い、インスリンアナログのタンパク質を溶出した。
実施例７：逆相クロマトグラフィー精製
前記実施例６で得られた試料からインスリンアナログを純粋分離するためにリン酸ナトリウムとイソプロパノールとを含む緩衝液で平衡化された逆相クロマトグラフィーＳｏｕｒｃｅ３０ＲＰＣ（GE healthcare、米国）に結合させた後、リン酸ナトリウムとイソプロパノールとを含む緩衝液を用いて線形濃度勾配でインスリンアナログのタンパク質を溶出した。
Ｄｅｓ-Ｔｈｒ（Ｂ３０）インスリンアナログを過量（約１０％）に含むインスリンアナログの分析はＨＰＬＣ（図４）で確認し、Ｄｅｓ-Ｔｈｒ（Ｂ３０）インスリン不純物を最小化するための酵素転換工程が適用されて精製された最終的なインスリンアナログの純度と不純物の確認はＨＰＬＣ（図５）の分析を介して確認した。その結果、主な不純物であるＤｅｓ-Ｔｈｒ（Ｂ３０）インスリンアナログと脱アミノ化形態のインスリンアナログは、それぞれ１％未満であり、全体の純度は９８．５％以上であった。
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者は本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更せず、他の具体的な形態で実施できることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例は、すべての面で例示的なものであり、限定的なものではないと理解するべきである。本発明の範囲は、前記の詳細な説明ではなく、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導出されるすべての変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。

Claims (26)

  1. ５０ｍｇ/ｍｌ以上の濃度のプロインスリンを酵素分解してインスリンに転換させる段階を含む、プロインスリンからインスリンを製造する方法。
  2. 前記酵素が、トリプシン、カルボキシぺプチダーゼＢまたはこれらの組み合わせである、請求項１に記載の方法。
  3. 前記プロインスリンの濃度が、５０ｍｇ/ｍｌ〜３００ｍｇ/ｍｌである、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記プロインスリンの濃度が、１００ｍｇ/ｍｌ〜３００ｍｇ/ｍｌである、請求項３に記載の方法。
  5. 前記プロインスリンの濃度が、２００ｍｇ/ｍｌ〜３００ｍｇ/ｍｌである、請求項３に記載の方法。
  6. 前記トリプシンの比率が、プロインスリンに比べて１/７，５００〜１/４０，０００（weight/weight）である、請求項２に記載の方法。
  7. 前記トリプシンの比率が、プロインスリンに比べて１/１５，０００〜１/４０，０００（weight/weight）である、請求項２に記載の方法。
  8. 前記トリプシンの比率が、プロインスリンに比べて１/２０，０００〜１/４０，０００（weight/weight）である、請求項２に記載の方法。
  9. 前記トリプシンの比率が、プロインスリンに比べて１/３０，０００〜１/４０，０００（weight/weight）である、請求項２に記載の方法。
  10. 前記カルボキシぺプチダーゼＢの比率が、プロインスリンに比べて１/６００〜１/２０，０００（weight/weight）である、請求項２及び請求項６〜９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記カルボキシぺプチダーゼＢの比率が、プロインスリンに比べて１/６００〜１/１５，０００（weight/weight）である、請求項２及び請求項６〜９のいずれか一項に記載の方法。
  12. 酵素反応におけるｐＨが、６．５〜９．０である、請求項１または２に記載の方法。
  13. 酵素反応におけるｐＨが、７．０〜８．５である、請求項１または２に記載の方法。
  14. 酵素反応における温度が、４．０℃〜２５．０℃である、請求項１または２に記載の方法。
  15. 酵素反応における時間が、４．０時間〜５５時間である、請求項１または２に記載の方法。
  16. 前記プロインスリンまたはインスリンが、アナログ形態である、請求項１に記載の方法。
  17. 前記方法が、プロインスリンから転換されたインスリンを含む試料をクロマトグラフィーに適用してインスリンを精製する段階をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  18. 前記クロマトグラフィーが、陽イオン交換クロマトグラフィーまたは逆相クロマトグラフィーである、請求項１７に記載の方法。
  19. 逆相クロマトグラフィーまたは陰イオン交換クロマトグラフィーを行う段階をさらに含む、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記プロインスリンが、陽イオン交換カラムまたは逆相カラムにより部分精製されたものである、請求項１に記載の方法。
  21. 前記方法で製造されたインスリンを含む試料が、Ｄｅｓ-Ｔｈｒ（Ｂ３０）インスリン不純物の含量が５％未満である、請求項１に記載の方法。
  22. 酵素反応の緩衝液が、１ｍＭ〜１００ｍＭのＴｒｉｓ-ＨＣｌである、請求項１に記載の方法。
  23. 酵素反応の緩衝液が、金属イオンを含まないものである、請求項１に記載の方法。
  24. （ａ）請求項１に記載の方法により、インスリンを含む試料を製造する段階；及び
    （ｂ）前記試料をクロマトグラフィー工程に適用する段階を含む、インスリンの精製方法。
  25. 前記クロマトグラフィーが、陽イオン交換クロマトグラフィーまたは逆相クロマトグラフィーである、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記試料を逆相クロマトグラフィーまたは陰イオン交換クロマトグラフィーに適用する段階をさらに含む、請求項２５に記載の方法。
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