KR20220031044A - 릴랙신 유사체 및 이를 사용하는 방법 - Google Patents

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스테이시 린 리
페트라 베르디노
샤오준 왕
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일라이 릴리 앤드 캄파니
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Abstract

천연 인간 RLN과 비교될 때 반감기를 증가시키고 RXFP1 수용체에 대한 선택성을 유지하고 개선된 약물성 특성 및 더 적은 면역원성을 위해 시험관내 및 생체내 안정성을 제공하는 변형을 포함하는 릴랙신 (RLN) 유사체가 개시되어 있다. 제약상 허용되는 담체에 본원에 기재된 RLN 유사체 중 하나 이상을 포함하는 제약 조성물이 또한 개시되어 있다. 특히 심혈관, 폐 및/또는 신장 병태, 질환 또는 장애를 치료하기 위한 RLN 유사체의 제조 및 사용 방법이 또한 개시되어 있다.

Description

릴랙신 유사체 및 이를 사용하는 방법
본 개시내용은 일반적으로 생물학 및 의학에 관한 것이며, 보다 구체적으로 릴랙신 (RLN) 유사체, 특히 RLN/인슐린-유사 패밀리 펩티드 (RXFP) 수용체, 예컨대 RXFP1 수용체에 결합하여 이에 의해 RXFP 수용체 효능제로서 기능할 수 있는 장시간-작용성 단일-쇄 RLN 유사체에 관한 것이다. 본 개시내용은 추가로 이를 포함하는 조성물 및 심혈관, 폐 및/또는 신장 병태, 질환 또는 장애의 치료에서의 그의 용도에 관한 것이다.
릴랙신 (RLN)은 인슐린 슈퍼패밀리의 일부이며, 인간에서 구조는 높지만 서열, 유사성이 낮은 7개의 펩티드를 포함한다 - RLN1 (H1RLX, RLXH1 또는 H1), RLN2 (H2RLX, RLXH2 또는 H2), RLN3 (RXN3, ZINS4 또는 H3), 인슐린-유사 (INSL) 펩티드 3 (INSL3), INSL4, INSL5 및 INSL6. 여기에서 특히 관심있는 것은 RLN2이며, 이는 각각 1개의 분자내 디술피드 결합을 추가로 갖는 A 쇄와 2개의 디술피드 결합에 의해 연결된 24개 및 29개 아미노산 (A 쇄 및 B 쇄)의 2개 펩티드 쇄의 이종이량체이다 (문헌 [Schwabe & McDonald (1977) Science 197:914-915] 참조). RLN2는 그의 프로호르몬인 프로릴랙신으로부터 이로부터의 C 펩티드를 절단함으로써 생성된다.
생리학적으로, RLN2는 비록 처음에 임신 호르몬으로 기재되었지만, 심혈관, 간, 신경, 췌장, 폐 및 신장 적응, 예컨대 혈관확장, 항-섬유증 및 혈관신생 효과를 조정하는 다양한 기능들을 나타낸다. RLN2 신호전달은 두 가지 상이한 부류의 G-단백질-커플링된 수용체 (GPCR), 즉, 류신-풍부 반복부-함유 GPCR LGR7 및 LGR8 (현재 각각 RXFP1 및 RXFP2 수용체로 지칭됨)을 통해 발생한다. 이 패밀리의 다른 두 수용체는 RXFP3 및 RXFP4 수용체를 포함한다. RLN2는 짧은 반감기 (t½)를 가지며, 이는 치료제로 사용할 때 어려움을 제공한다. 사실, 천연 RLN2는 생체내에서 수분의 t½를 갖는다. 결과적으로, 임상의는 지속적인 정맥내 주입에 의해 RLN2를 투여하며, 이는 종종 RLN 화합물을 받는 개체에게 불편을 초래하고 단기간 효능을 초래한다.
개선된 t½을 갖는 다수의 RLN2 유사체가 존재한다. 예를 들어, 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2018/148419는 t½을 개선하기 위해 링커, 중합체 및/또는 약동학적 인핸서가 부착될 수 있는 파라-아세틸-페닐알라닌과 같은 비천연 아미노산 잔기를 포함하는 유사체를 기재한다. 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2018/138170은 적어도 15개 아미노산의 링커 및 t½을 개선하기 위해 반감기 연장 모이어티를 갖는 A 쇄 및 B 쇄의 융합체인 유사체를 기재한다. 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2017/201340은 t½을 개선하기 위해 가변 경쇄 단편을 갖는 A 쇄 및 B 쇄의 융합체인 유사체를 기재한다. 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2015/067791은 t½을 개선하기 위한 담체-연결된 전구약물인 유사체, 특히 PEG-기반 담체를 기재한다 (또한, 추가의 PEG-연결된 유사체에 대해서는 WO 2012/024452 참조). 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2014/102179는 t½을 개선하기 위해 IgG2 또는 IgG4의 Fc 모이어티를 갖는 A 쇄 및 B 쇄의 융합체인 유사체를 기재한다. 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2013/004607은 t½을 개선하기 위해 적어도 5개의 아미노산이지만 15개 미만의 아미노산의 링커를 갖는 A 쇄 및 B 쇄의 융합체 또는 t½을 개선하기 위해 항체의 Fc 도메인을 갖는 A 쇄 및 B 쇄의 융합체인 유사체를 기재한다.
RLN의 다양한 생리학적 역할에 대한 이해의 증가의 관점에서, 개선된 t½을 갖는 장시간-작용성 RLN 유사체에 대한 요구가 남아있다.
이러한 필요성을 다루기 위해, 본 개시내용은 먼저 RXFP1 수용체에서 주요 활성을 갖는 (즉, RXFP1 수용체 효능제로서 작용하는) 단일-쇄 RLN 유사체를 기재한다. 이러한 RXFP1 수용체 효능제는 하기의 아미노-말단 (N-말단)에서 카르복시-말단 (C-말단)까지의 기본 구조를 포함한다:
VHH-L1-A-L2-B,
VHH-L1-B-L2-A,
A-L2-B-L1-VHH, 또는
B-L2-A-L1-VHH,
여기서 VHH는 약동학적 인핸서로서 작용할 수 있는 모이어티이고, A는 RLN A 쇄이고, B는 RLN B 쇄이고, L1은 제1 링커이고, L2는 제2 링커이다.
일부 경우에, VHH 모이어티는 서열식별번호(SEQ ID NO):10, 11, 12 또는 13, 특히 서열식별번호:10 또는 12의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 다른 경우에, VHH 모이어티가 서열식별번호:10, 11, 12 또는 13 중 어느 하나와 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 갖도록 VHH 모이어티는 하나 이상의 첨가, 결실, 삽입 또는 치환을 가질 수 있다 (예를 들어, 서열식별번호:45-66 참조).
일부 경우에, A 쇄는 서열식별번호:2, 5 또는 8, 특히 서열식별번호:5의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 다른 경우에, A 쇄가 서열식별번호:2, 5 또는 8 중 어느 하나와 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 갖도록 A 쇄는 하나 이상의 첨가, 결실, 삽입 또는 치환을 가질 수 있다. 예를 들어, A 쇄는 서열식별번호:5의 des1-4일 수 있다.
일부 경우에, B 쇄는 서열식별번호:3, 6 또는 9, 특히 서열식별번호:6의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 다른 경우에, B 쇄가 서열식별번호:3, 6 또는 9 중 어느 하나와 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 갖도록 B 쇄는 하나 이상의 첨가, 결실, 삽입 또는 치환을 가질 수 있다. 예를 들어, B 쇄는 서열식별번호:6의 des1일 수 있다.
일부 경우에, L1은 (GGGGQ)n (서열식별번호:14), (GGGQ)n (서열식별번호:15), (GGGGS)n (서열식별번호:16), (PGPQ)n (서열식별번호:17) 또는 (PGPA)n (서열식별번호:18)의 아미노산 서열을 가질 수 있으며, 여기서 n은 1 내지 10, 특히 약 5 내지 약 8일 수 있다. 다른 경우에, L1은 서열식별번호:19, 20 또는 21의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 또 다른 경우에, L1이 서열식별번호:14 내지 21 중 어느 하나와 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 갖도록 L1은 하나 이상의 첨가, 결실, 삽입 또는 치환을 가질 수 있다.
일부 경우에, L2는 서열식별번호:22, 23 또는 67의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 다른 경우에, L2는 하나 이상의 첨가, 결실, 삽입 또는 치환을 가질 수 있다.
특정 경우에, RLN 유사체는 서열식별번호:10, 11, 12 또는 13의 VHH; 서열식별번호:2, 5 또는 8의 A 쇄; 서열식별번호:3, 6 또는 9의 B 쇄; 서열식별번호:19, 20 또는 21의 L1; 및 서열식별번호:22, 23 또는 67의 L2를 포함하는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 대안적으로, RLN 유사체는 서열식별번호:10, 11, 12 또는 13의 VHH; 서열식별번호:2, 5 또는 8의 A 쇄; 서열식별번호:3, 6 또는 9의 B 쇄; 서열식별번호:19, 20 또는 21의 L1; 및 서열식별번호:22, 23 또는 67의 L2를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
특정 경우에, RLN 유사체는 서열식별번호:24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 또는 39, 특히 서열식별번호:26, 27, 30, 31, 34 또는 35의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 대안적으로, RLN 유사체는 서열식별번호:24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 또는 39, 특히 서열식별번호:26, 27, 30, 31, 34 또는 35의 아미노산 서열과 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
일부 경우에, RLN 유사체는 천연 인간 RLN2 (서열식별번호:5 및 6)의 결합 친화성에 필적하는 RXFP1 수용체에서의 결합 친화성을 갖는다. 다른 경우에, RLN 유사체는 천연 인간 RLN2 (서열식별번호:5 및 6)보다 더 큰 RXFP1 수용체에서의 결합 친화성을 갖는다. 또 다른 경우에, RLN 유사체는 천연 인간 RLN2 (서열식별번호:5 및 6)보다 더 적은 RXFP1 수용체에서의 결합 친화성을 갖는다.
일부 경우에, RLN 유사체는 인간에게 투여될 때 최대 약 20일 내지 약 30일 더 긴 것을 포함하여 천연 인간 RLN2 (서열식별번호:5 및 6)보다 더 긴 t½을 갖는다.
상기 조성물은 대안적으로 본원에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열, 뿐만 아니라 본원의 RLN 유사체를 발현시키기 위한 이를 포함하는 벡터 및 숙주 세포일 수 있다.
둘째, 본원의 적어도 하나의 RLN 유사체 또는 그의 제약상 허용되는 염 (예를 들어, 트리플루오로아세테이트 염, 아세테이트 염 또는 히드로클로라이드 염) 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물이 기재되어 있다. 일부 경우에, 제약상 허용되는 담체는 완충제, 예컨대, 예를 들어, 생리 염수, 포스페이트-완충 염수, 시트레이트-완충 염수 또는 히스티딘-완충 염수이다. 특정 경우에, 완충제는 히스티딘, 히스티딘 완충제 또는 히스티딘-완충 염수이다. 다른 경우에, 제약 조성물은 담체, 희석제 및/또는 부형제를 추가로 포함할 수 있다.
더욱이, 제약 조성물은 적어도 하나의 추가 치료제, 예컨대, 예를 들어, 심혈관, 폐 및/또는 신장 병태, 질환 또는 장애에서 표준 치료로 사용되는 작용제를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 적어도 하나의 추가 치료제는 항응고제, 안지오텐신-전환 효소 (ACE) 억제제, 안지오텐신 II 수용체 차단제 (ARB), ARB 네프릴리신 억제제 (ARNI), β-차단제, 이뇨제, 디기탈리스, 디곡신, 히드랄라진/이소소르비드 디니트레이트, 무기질코르티코이드 수용체 길항제 (MRA; 또는 알도스테론 길항제), 나트륨-글루코스 공동수송체-2 (SGLT2) 억제제, 스타틴 및/또는 항혈당제일 수 있다.
셋째, 본원의 RLN 유사체를 사용하는 방법, 특히 심혈관, 폐 및/또는 신장 병태, 질환 또는 장애를 치료하기 위한 RLN 유사체를 사용하는 방법이 기재되어 있다. 방법은 유효량의 본원의 적어도 하나의 RLN 유사체 또는 그의 제약상 허용되는 염을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 적어도 포함한다.
일부 경우에, RLN 유사체는 임의의 표준 투여 경로를 통해, 예컨대, 예를 들어, 근육내로, 정맥내로, 비경구로, 피하로 또는 경피로 투여될 수 있다. 특정 경우에, RLN 유사체는 피하로 (SQ), 근육내로 (IM) 또는 정맥내로 (IV) 투여된다. 특정 경우에, RLN 유사체는 개체에게 SQ 또는 IV 투여될 수 있다.
마찬가지로, 및 일부 경우에, RLN 유사체는 매일, 격일로, 1주마다 3회, 1주마다 2회, 1주마다 1회 (즉, 매주), 2주마다 (즉, 격주로), 1개월마다 1회 (즉, 매월), 2개월마다 (즉, 격월로), 또는 심지어 3개월마다 투여될 수 있다. 특정 경우에, RLN 유사체는 격일로 SQ, 1주마다 3회 SQ, 1주마다 2회 SQ, 1주마다 1회 SQ, 격주로 SQ, 또는 1개월마다 1회 SQ 투여될 수 있다. 특정 경우에, RLN 유사체는 1주마다 1회 (QW) SQ 투여된다.
대안적으로, RLN 유사체는 개체에게 IV 투여될 수 있다. 상기와 같이, RLN 유사체는 매일, 격일로, 1주마다 3회, 1주마다 2회, 1주마다 1회 (즉, 매주), 2주마다 (즉, 격주로), 또는 매월 투여될 수 있다. 특정 경우에, RLN 유사체는 격일로 IV, 1주마다 3회 IV, 1주마다 2회 IV, 1주마다 1회 IV, 격주로 IV, 또는 1개월마다 1회 IV 투여될 수 있다. 특정 경우에, RLN 유사체는 1주마다 1회 IV 투여된다.
방법은 또한 유효량의 적어도 하나의 추가 치료제와 조합하여 RLN 유사체를 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 간단히 말해서, 본원의 많은 병태/질환/장애에 대한 표준 치료는 항응고제, ACE 억제제, ARB, ARNI, β-차단제, 이뇨제, 디기탈리스, 디곡신, 히드랄라진/이소소르비드 디니트레이트, MRA 또는 다른 알도스테론 길항제, SGLT2 억제제, 스타틴 및/또는 항혈당제, 뿐만 아니라 고콜레스테롤, 고혈압, 심방 세동 및 당뇨병을 포함하나 이에 제한되지는 않는 동반질환을 제어하기 위한 다른 치료제를 포함한다. 일부 경우에, 추가 치료제는 RLN 유사체와 동시에, 별도로 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
예를 들어, 추가 치료제는 RLN 유사체와 동일한 빈도로 (즉, 격일로, 1주마다 2회, 매주 또는 심지어 매월) 투여될 수 있다. 다른 경우에, 추가 치료제는 RLN 유사체와 구별되는 빈도로 투여될 수 있다. 다른 경우에, 추가 치료제는 SQ 또는 IV 투여될 수 있다. 또 다른 경우에, RLN 유사체는 SQ 투여되고, 추가 치료제는 경구로 또는 IV 투여될 수 있다. 대안적으로, RLN 유사체는 IV 투여되고, 추가 치료제는 SQ 투여된다.
일부 경우에, 필요로 하는 개체는 당뇨병, 신장 기능 장애가 있는 고혈압 및/또는 비만이다.
방법은 또한 혈압을 측정 또는 수득하는 단계 및 이러한 수득된 값을 하나 이상의 기준선 값 또는 이전에 수득된 값과 비교하여 치료/요법의 유효성을 평가하는 단계와 같은 단계를 포함할 수 있다.
방법은 또한 식이 및 운동과 조합될 수 있고/거나, 상기 논의된 것 이외의 추가 치료제와 조합될 수 있다.
넷째, 본원의 RLN 유사체 중 적어도 하나를 포함하는 용도가 기재되어 있다. 예를 들어, 본원의 RLN 유사체는 요법, 특히 심혈관, 폐 및/또는 신장 병태, 질환 또는 장애를 치료하는데 사용하기 위해 제공될 수 있다. RLN 유사체는 임의로 적어도 하나의 추가 치료제와 동시에, 별도로 또는 순차적으로 (즉, 조합하여) 투여될 수 있다. 마찬가지로, 심혈관, 폐 및/또는 신장 병태, 질환 또는 장애를 치료하기 위한 의약의 제조에서의 본원의 RLN 유사체의 용도가 제공되며, 여기서 의약은 임의로 상기 언급된 바와 같은 하나 이상의 추가 치료제를 추가로 포함할 수 있다.
다섯째, 하기의 아미노산 서열을 포함하는 화합물이 제공된다:
Figure pct00001
(서열식별번호:10). 일부 경우에, 화합물은 서열식별번호:10과 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
대안적으로, 하기의 아미노산 서열을 포함하는 화합물이 제공된다:
Figure pct00002
(서열식별번호:11). 일부 경우에, 화합물은 서열식별번호:11과 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
대안적으로, 하기의 아미노산 서열을 포함하는 화합물이 제공된다:
Figure pct00003
(서열식별번호:12). 일부 경우에, 화합물은 서열식별번호:12와 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
대안적으로, 하기의 아미노산 서열을 포함하는 화합물이 제공된다:
Figure pct00004
(서열식별번호:13). 일부 경우에, 화합물은 서열식별번호:13과 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
대안적으로, 하기의 아미노산 서열을 포함하는 화합물이 제공된다:
Figure pct00005
(서열식별번호:45). 일부 경우에, 화합물은 서열식별번호:45와 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
대안적으로, 하기의 아미노산 서열을 포함하는 화합물이 제공된다:
Figure pct00006
(서열식별번호:46). 일부 경우에, 화합물은 서열식별번호:46과 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
대안적으로, 하기의 아미노산 서열을 포함하는 화합물이 제공된다:
Figure pct00007
(서열식별번호:47). 일부 경우에, 화합물은 서열식별번호:47과 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
대안적으로, 하기의 아미노산 서열을 포함하는 화합물이 제공된다:
Figure pct00008
(서열식별번호:48). 일부 경우에, 화합물은 서열식별번호:48과 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
대안적으로, 하기의 아미노산 서열을 포함하는 화합물이 제공된다:
Figure pct00009
(서열식별번호:49). 일부 경우에, 화합물은 서열식별번호:49와 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
대안적으로, 하기의 아미노산 서열을 포함하는 화합물이 제공된다:
Figure pct00010
(서열식별번호:50). 일부 경우에, 화합물은 서열식별번호:50과 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
대안적으로, 하기의 아미노산 서열을 포함하는 화합물이 제공된다:
Figure pct00011
(서열식별번호:51). 일부 경우에, 화합물은 서열식별번호:51과 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
대안적으로, 하기의 아미노산 서열을 포함하는 화합물이 제공된다:
Figure pct00012
(서열식별번호:52). 일부 경우에, 화합물은 서열식별번호:52와 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
대안적으로, 하기의 아미노산 서열을 포함하는 화합물이 제공된다:
Figure pct00013
(서열식별번호:53). 일부 경우에, 화합물은 서열식별번호:53과 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
대안적으로, 하기의 아미노산 서열을 포함하는 화합물이 제공된다:
Figure pct00014
(서열식별번호:54). 일부 경우에, 화합물은 서열식별번호:54와 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
대안적으로, 하기의 아미노산 서열을 포함하는 화합물이 제공된다:
Figure pct00015
(서열식별번호:55). 일부 경우에, 화합물은 서열식별번호:55와 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
대안적으로, 하기의 아미노산 서열을 포함하는 화합물이 제공된다:
Figure pct00016
(서열식별번호:56). 일부 경우에, 화합물은 서열식별번호:56과 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
대안적으로, 하기의 아미노산 서열을 포함하는 화합물이 제공된다:
Figure pct00017
(서열식별번호:57). 일부 경우에, 화합물은 서열식별번호:57과 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
대안적으로, 하기의 아미노산 서열을 포함하는 화합물이 제공된다:
Figure pct00018
(서열식별번호:58). 일부 경우에, 화합물은 서열식별번호:58과 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
대안적으로, 하기의 아미노산 서열을 포함하는 화합물이 제공된다:
Figure pct00019
(서열식별번호:59). 일부 경우에, 화합물은 서열식별번호:59와 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
대안적으로, 하기의 아미노산 서열을 포함하는 화합물이 제공된다:
Figure pct00020
(서열식별번호:60). 일부 경우에, 화합물은 서열식별번호:60과 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
대안적으로, 하기의 아미노산 서열을 포함하는 화합물이 제공된다:
Figure pct00021
(서열식별번호:61). 일부 경우에, 화합물은 서열식별번호:61과 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
대안적으로, 하기의 아미노산 서열을 포함하는 화합물이 제공된다:
Figure pct00022
(서열식별번호:62). 일부 경우에, 화합물은 서열식별번호:62와 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
대안적으로, 하기의 아미노산 서열을 포함하는 화합물이 제공된다:
Figure pct00023
(서열식별번호:63). 일부 경우에, 화합물은 서열식별번호:63과 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
대안적으로, 하기의 아미노산 서열을 포함하는 화합물이 제공된다:
Figure pct00024
(서열식별번호:64). 일부 경우에, 화합물은 서열식별번호:64와 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
대안적으로, 하기의 아미노산 서열을 포함하는 화합물이 제공된다:
Figure pct00025
(서열식별번호:65). 일부 경우에, 화합물은 서열식별번호:65와 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
대안적으로, 하기의 아미노산 서열을 포함하는 화합물이 제공된다:
Figure pct00026
(서열식별번호:66). 일부 경우에, 화합물은 서열식별번호:66과 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
본원의 RLN 유사체의 장점은 이들이 단일-쇄 폴리펩티드 (즉, 단량체)로서 화학적으로 또는 재조합적으로 합성될 수 있고, 그러므로 생물학적 활성을 위한 내단백질분해 프로세싱을 필요로 하지 않는다는 것이다. 그러나, 일부 경우에, VHH 모이어티는 단일-쇄 RLN 뿐만 아니라 2-쇄 RLN (예를 들어, 천연)에도 접합될 수 있는 것으로 고려된다. VHH 모이어티에서, N- 및 C-말단 뿐만 아니라 VHH의 임의의 표면-노출된 아미노산에도 접합할 수 있다 (단, 이러한 접합이 알부민 결합을 완전히 폐지하지는 않음).
본원의 RLN 유사체의 장점은 VHH 모이어티가 천연 A 쇄 및 B 쇄 서열 뿐만 아니라 그의 변형된 서열과 함께 사용될 수 있다는 것이다. 더욱이, VHH 모이어티는 VHH 모이어티에 부착되는 다른 펩티드/단백질 융합체 또는 소분자를 통해 향상된 또는 추가의 기능성을 갖도록 추가로 변형될 수 있다.
본원의 RLN 유사체의 장점은 VHH 모이어티가 포유동물, 예컨대 인간에서 연장된 작용 지속기간을 제공하고, 약 20일 내지 약 30일의 t½을 가질 수 있으며, 이에 의해 천연 인간 RLN, 특히 천연 인간 RLN2 (서열식별번호:5 및 6)와 비교될 때 적어도 매주 또는 2주마다 투여를 허용하며, 이는 순응도를 개선할 수 있다.
본원의 RLN 유사체의 장점은 천연 인간 RLN2 (서열식별번호:5 및 6)와 비교될 때 RXFP2 수용체보다 RXFP1에 대해 유사한 또는 더 나은 선택성, 친화성 및/또는 효력을 갖는다는 것이다. 대안적으로 언급하면, 본원의 RLN 유사체는 RXFP1 수용체에서 충분한 활성을 초래하고, RXFP2, RXFP3 및 RXFP4 수용체 중 하나 이상에서 감소된 또는 불충분한 활성을 초래한다.
본원의 RLN 유사체의 장점은 VHH 모이어티의 알부민 친화성을 변화시킴으로써 달성되는 조정가능한 약동학을 갖는다는 것이다.
본원의 RLN 유사체의 장점은 천연 인간 RLN2 (서열식별번호:5 및 6) 또는 Fc 융합체를 갖는 RLN 유사체와 비교될 때 보존된 제형에서 개선된 안정성을 갖는다는 것이다.
더욱이, VHH 모이어티의 장점은 인간 혈청 알부민 뿐만 아니라 개, 원숭이, 마우스, 돼지 및 래트 혈청 알부민에도 동등한 결합을 가지며, 이는 약역학, 약동학 및 독성학 연구가 이들 종으로부터 인간으로 보다 용이하게 번역하는 것을 허용한다는 것이다.
VHH 모이어티의 장점은 천연 인간 RLN2 (서열식별번호:5 및 6)와 비교될 때 본원의 RLN 유사체의 t½을 개선하는데 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 다른 생물학적 활성 펩티드 및 단백질, 예컨대, 예를 들어, 인슐린, 성장 분화 인자 15 (GDF-15) 또는 글루코스-의존적 인슐린 분비 자극 펩티드 1 (GLP-1)의 t½을 개선하는데 사용될 수 있다는 것이다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시내용이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사한 또는 동등한 임의의 방법 및 재료가 RLN 유사체, 제약 조성물 및 방법의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료는 본원에 기재되어 있다.
더욱이, 단수 형태 "하나"에 의한 구성요소에 대한 언급은 문맥이 명백하게 하나 및 단 하나의 구성요소가 존재함을 요구하지 않는 한 하나 초과의 구성요소가 존재할 가능성을 배제하지 않는다. 그러므로 단수 형태 "하나"는 일반적으로 "적어도 하나"를 의미한다.
정의
본원에서 사용된 바와 같은 "약"은 예를 들어, 언급된 농도, 길이, 분자량, pH, 서열 유사성, 시간 프레임, 온도, 부피 등과 같은 값 또는 값들의 통계적으로 의미있는 범위 이내를 의미한다. 이러한 값 또는 범위는 주어진 값 또는 범위의 한 자릿수 이내, 전형적으로 20% 이내, 더 전형적으로 10% 이내, 및 보다 더 전형적으로 5% 이내일 수 있다. "약"에 포함된 허용가능한 변동은 연구 중인 특정 시스템에 의존할 것이며, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 이해될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 및 RXFP 수용체 중 하나 이상과 관련하여, "활성", "활성화시키다", "활성화시키는" 등은 관련 기술분야에 공지된 검정, 예컨대 하기 기재된 시험관내 검정을 사용하여 측정된 바와 같이 그의 수용체(들)에 결합하고 반응을 유도하는 본원의 RLN 유사체와 같은 화합물의 능력을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같은 "아미노산"은 화학적 관점에서 하나 이상의 아민 기 및 하나 이상의 카르복실산 기의 존재에 의해 특징화되고 다른 관능기를 함유할 수 있는 분자를 의미한다. 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 표준 아미노산으로 지정되고 임의의 생물에 의해 생성되는 대부분의 펩티드/단백질의 빌딩 블록으로 사용될 수 있는 20개의 아미노산 세트가 있다. 본 개시내용의 아미노산 서열은 20개의 표준 아미노산에 대한 표준 단일 문자 또는 3개 문자 코드를 함유한다.
본원에서 사용된 바와 같은 "유사체"는 표적 수용체를 활성화시키고 그 수용체에 대한 천연 효능제에 의해 유도되는 적어도 하나의 생체내 또는 시험관내 효과를 유도하는 합성 펩티드 또는 폴리펩티드와 같은 화합물을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같은 "보존적 치환"은 그의 아미노산 서열에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 것을 제외하고 참조 분자와 동일한 참조 펩티드 또는 폴리펩티드의 변이체를 의미한다. 일반적으로, 보존적으로 변형된 변이체는 참조 아미노산 서열과 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 보다 구체적으로, 보존적 치환은 유사한 특징 (예를 들어, 전하, 측쇄 크기, 소수성/친수성, 백본 입체형태 및 강직성 등)을 갖고 생성된 치환된 펩티드 또는 폴리펩티드의 생물학적 활성에 대한 최소 영향을 갖는 아미노산으로 아미노산을 치환하는 것을 지칭한다. 기능적으로 유사한 아미노산의 보존적 치환은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고 그러므로 본원에서 철저하게 설명될 필요는 없다.
본원에서 사용된 바와 같은 "유효량"은 단일 또는 다중 용량 투여 시 이를 필요로 하는 개체에게 진단 또는 치료 중인 이러한 개체에서 원하는 효과를 제공하는 하나 이상의 본원의 RLN 유사체 또는 그의 제약상 허용되는 염의 양 또는 용량을 의미한다 (즉, 예를 들어, 심장, 신장, 간 또는 폐에서 증가된 혈관신생, 증가된 혈관 순응도, 증가된 심장 혈류, 증가된 간 혈류, 증가된 폐 혈류, 증가된 신장 혈류, 증가된 사구체 여과율, 감소된 혈압, 감소된 (또는 예방된) 염증 및/또는 감소된 (또는 예방된) 섬유증과 같은 개체의 병태의 임상적으로 측정가능한 차이를 생성할 수 있음). 유효량은 공지된 기술을 사용하고 유사한 상황 하에 수득된 결과를 관찰함으로써 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 개체에 대한 유효량을 결정하는데 있어서, 포유동물의 종, 그의 크기, 연령 및 일반적인 건강, 관련된 특정 질환 또는 장애, 질환 또는 장애의 관련 정도 또는 관련 또는 중증도, 개체의 반응, 투여된 특정 RLN 유사체, 투여 방식, 투여된 제제의 생체이용률 특징, 선택된 용량 요법, 병용 약제의 사용, 및 다른 관련 상황을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다수의 인자가 고려된다.
본원에서 사용된 바와 같은 "연장된 작용 지속기간"은 본원의 RLN 유사체에 대한 결합 친화성 및 활성이 천연 RLN, 특히 천연 인간 RLN2 (서열식별번호:5 및 6)보다 긴 기간 동안 지속되어, 적어도 1일 1회 또는 심지어 1주마다 3회, 1주마다 2회 또는 1주마다 1회만큼 드물게 투여하는 것을 허용함을 의미한다. RLN 유사체의 시간 작용 프로파일은 공지된 약동학적 시험 방법, 예컨대 하기 실시예에서 사용된 것을 사용하여 측정될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 "반감기" 또는 "t½"은 화합물, 예컨대 천연 RLN 또는 본원의 RLN 유사체의 양의 1/2이 생물학적 프로세스에 의해 유체 또는 다른 생리학적 공간, 예컨대 개체의 혈청 또는 혈장으로부터 제거되는데 걸리는 시간을 의미한다. 대안적으로, t½은 또한 이러한 화합물의 양이 그의 약리학적, 생리학적 또는 방사선학적 활성의 1/2을 잃는데 걸리는 시간을 의미할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 "절반-최대 유효 농도" 또는 "EC50"은 검정 종점, 예컨대 용량-반응 곡선의 50% 활성화/자극을 초래하는 화합물의 농도를 의미한다 (예를 들어, cAMP, PI3K-Akt, NFκβ, VEGF 및/또는 산화질소 (NO) 신호전달 경로).
본원에서 사용된 바와 같은 "와 조합하여"는 본원의 RLN 유사체 중 적어도 하나를 하나 이상의 추가 치료제와 동시에, 순차적으로 또는 단일 조합 제형으로 투여하는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같은 "이를 필요로 하는 개체"는 예를 들어, 본원에 나열된 것을 포함하는 치료 또는 요법을 필요로 하는 병태, 질환, 장애 또는 증상을 갖는 포유동물, 예컨대 인간을 의미한다. 특히, 치료될 개체는 인간이다.
본원에서 사용된 바와 같은 "장시간-작용성"은 본원의 RLN 유사체의 결합 친화성 및 활성이 천연 인간 RLN2 (서열식별번호:5 및 6)보다 긴 기간 동안 지속되어, 적어도 1일 1회 또는 심지어 1주마다 3회, 1주마다 2회, 1주마다 1회 또는 매월만큼 드물게 투여하는 것을 허용함을 의미한다. RLN 유사체의 시간 작용 프로파일은 공지된 약동학적 시험 방법, 예컨대 하기 실시예에 기재된 것을 사용하여 측정될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 "비표준 아미노산"은 세포에서 자연적으로 발생할 수 있지만 펩티드 합성에는 참여하지 않는 아미노산을 의미한다. 비표준 아미노산은 펩티드의 구성요소일 수 있으며, 종종 펩티드의 표준 아미노산을 변형시킴으로써 생성된다 (즉, 번역후 변형을 통해). 비표준 아미노산은 D-아미노산을 포함할 수 있으며, 이는 상기 표준 아미노산의 반대 절대 키랄성을 갖는다.
본원에서 사용된 바와 같은 "제약상 허용되는 완충제"는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 표준 제약 완충제를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같은 "RLN"은 임의의 종, 예컨대 포유동물 종, 특히 인간으로부터 수득되거나 유래된 릴랙신을 의미하며, 여기서 천연 형태는 2개의 디술피드 결합을 통해 연결된 2개의 펩티드 쇄 (예를 들어, A 쇄 및 B 쇄)를 갖고 A 쇄가 단일 분자내 디술피드 결합을 추가로 갖는 이종이량체 펩티드이다. RLN은 천연 RLN (즉, 전장) 및 그의 변이 (즉, 천연 RLN의 첨가, 결실, 삽입 및/또는 치환)를 모두 포함한다. 인간에는 세 가지 천연 RLN 이소형 - RLN1, RLN2 및 RLN3이 있다. RLN 프로세싱은 프리프로릴랙신으로 시작되며, 이는 프로릴랙신 (A 쇄, B 쇄 및 C 펩티드 포함; 천연 RLN은 B-C-A의 구조를 가짐)으로 프로세싱되며, 여기서 천연 인간 proRLN1의 서열은 서열식별번호:1에 제시되어 있고 (또한, 유니프롯/스위스프롯(UniProt/SwissProt) 데이터베이스 수탁 번호 P04808 참조), 천연 인간 proRLN2의 서열은 서열식별번호:4에 제시되어 있고 (또한, 유니프롯/스위스프롯 데이터베이스 수탁 번호 P04090 참조), 천연 인간 proRLN3의 서열은 서열식별번호:7에 제시되어 있다 (또한, 유니프롯/스위스프롯 데이터베이스 수탁 번호 Q8WXF3 참조). 프로릴랙신은 C 펩티드가 절단되어 RLN에 도달하는 추가 프로세싱을 거친다. 천연 인간 RLN1, RLN2 및 RLN3의 A 쇄에 대한 서열은 각각 서열식별번호:2, 5 및 8에 제시되어 있다. 마찬가지로, 천연 인간 RLN1, RLN2 및 RLN3의 B 쇄에 대한 서열은 각각 서열식별번호:3, 6 및 9에 제시되어 있다.
인간에는 4개의 RLN 수용체가 있다 - RXFP1 (서열식별번호:40; 또한, 유니프롯/스위스프롯 데이터베이스 수탁 번호 Q9HBX9 참조), RXFP2 (서열식별번호:41; 또한, 유니프롯/스위스프롯 데이터베이스 수탁 번호 Q8WXD0 참조), RXFP3 (서열식별번호:42; 또한, 유니프롯/스위스프롯 데이터베이스 수탁 번호 Q9NSD7 참조) 및 RXFP4 (서열식별번호:43; 또한, 유니프롯/스위스프롯 데이터베이스 수탁 번호 Q8TDU9 참조) - GPCR로서 작용함 (문헌 [Halls et al. (2007) Br. J. Pharmacol. 150:677-691] 참조). 본원에서 관심있는 것은 RXFP1 및 RXFP2 수용체이며, 이들 둘 모두는 RLN1 및 RLN2에 결합할 수 있다. RXFP1 수용체는 뇌, 혈액 세포, 뼈, 심장, 신장, 폐, 간 및 혈관계에서 발견되는 반면, RXFP2 수용체는 보다 더 제한적이며 뼈 및 소대에서 발견되었다. RXFP1 및 RXFP2 수용체의 자극은 아데닐레이트 시클라제, 단백질 키나제 A, 단백질 키나제 C, 포스파티딜이노시톨 3-키나제 및/또는 세포외 신호-조절된 키나제 (Erk1/2)를 포함하는 신호 도입 네트워크를 활성화시킨다.
본원에서 사용된 바와 같은 "RLN 유사체" 등은 하나 이상의 RXFP 수용체에서 천연 RLN의 하나 이상의 효과를 유도하지만 천연 RLN과 비교될 때 아미노산 서열과 관련하여 일부 방식으로 변하는 화합물, 예컨대 펩티드 또는 폴리펩티드를 의미한다. RLN 유사체는 또한 RLN과 기능적으로 동등하지만 단편이거나 완전한 서열이지만 첨가, 결실, 삽입 및/또는 치환을 갖는 서열을 갖는 이들 화합물의 변이체를 포함할 수 있다. 본원에 기재된 비변형된 또는 변형된 RLN의 아미노산 위치에 대한 모든 언급은 달리 명시되지 않는 한 천연 인간 RLN2의 서열식별번호:5의 A 쇄 또는 서열식별번호:6의 B 쇄에서 상응하는 위치에 기초한다. 일부 경우에, 본원의 RLN 유사체는 더 높은 또는 더 낮은 친화성으로 RXFP에 결합할 수 있지만, 천연 RLN, 특히 천연 인간 RLN2 (서열식별번호:5 및 6)와 비교될 때 생체내 또는 시험관내에서 더 긴 t½을 나타낼 수 있다. 이러한 방식으로, 본원의 RLN 유사체는 RXFP 수용체 효능제로서 작용하는 합성 화합물이다.
본원에서 사용된 바와 같은 "서열 유사성"은 생물학적 화합물의 2개 이상의 핵산 서열 또는 아미노산 서열의 정량적 특성, 예컨대, 예를 들어, 전체 길이에 대한 상응 또는 2개 이상의 서열의 비교 창을 의미한다. 서열 유사성은 (1) 퍼센트 동일성 또는 (2) 퍼센트 유사성에 의해 측정될 수 있다. 퍼센트 동일성은 2개의 생물학적 화합물 사이에 동일한 잔기를 가장 짧은 서열의 길이로 나눈 백분율을 측정하는 반면; 퍼센트 유사성은 동일성을 측정하고, 추가로 평가에서 서열 갭 및 잔기 유사성을 포함한다. 서열 유사성을 결정하기 위한 방법 및 알고리즘은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 그러므로 본원에서 철저하게 설명될 필요는 없다. 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 위치의 특정된 백분율은 적어도 약 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이다.
본원에서 사용된 바와 같은 "단일-쇄 릴랙신", "scRLN" 등은 A-L2-B 또는 B-L2-A에서와 같이 A 및 B 쇄가 링커 (즉, L2)에 의해 서로 연결된 RLN 폴리펩티드를 의미한다. 더욱이, scRLN은 정확한 구조적 폴딩을 유지하기 위해 천연 쇄간 및/또는 쇄내 디술피드 결합 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 "2-쇄 릴랙신", "tcRLN" 등은 A 및 B 쇄가 하나 이상의 쇄간 및/또는 쇄내 디술피드 결합에 의해 서로 연결되지만 임의의 링커에 의해서는 연결되지 않아 천연 RLN과 같은 정확한 구조적 폴딩을 유지하는 RLN 폴리펩티드를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같은 "치료하는" 또는 "치료함"은 RLN 유사체 투여가 병태, 질환, 장애 및/또는 증상의 진행 또는 중증도를 약독화, 저지, 역전, 감속 또는 중지할 목적으로 표시된 병태, 질환, 장애 또는 증상을 갖는 개체를 관리하고 돌보는 것을 의미한다. 치료는 증상 또는 합병증의 발병을 예방하기 위해 본원의 RLN 유사체 또는 본원의 RLN 유사체를 함유하는 조성물을 개체에게 투여하는 것, 증상 또는 합병증을 경감시키는 것, 또는 병태, 질환, 장애 또는 증상을 제거하는 것을 포함한다. 치료는 RLN 유사체 또는 본원의 RLN 유사체를 함유하는 조성물을 개체에게 투여하여 예컨대, 예를 들어, 심장, 신장, 간 또는 폐에서 증가된 혈관신생, 증가된 혈관 순응도, 증가된 심장 혈류, 증가된 간 혈류, 증가된 폐 혈류, 증가된 신장 혈류, 증가된 사구체 여과율, 감소된 혈압, 감소된 (또는 예방된) 염증 및/또는 감소된 (또는 예방된) 섬유증을 초래하는 것을 포함한다. 치료될 개체는 포유동물, 특히 인간이다.
본원에서 사용된 바와 같은 "개체", "환자" 및 "대상체"는 상호교환적으로 사용되며, 포유동물, 특히 인간을 의미한다. 특정 경우에, 개체는 본원의 RLN 유사체의 투여로부터 이익을 얻을 병태, 질환, 장애 및/또는 증상으로 추가로 특징화된다.
본원에서 사용된 바와 같은 "VHH" 또는 "VHH 모이어티"는 단일-도메인 항체의 형태, 특히 중쇄 전용 항체 (HcAb)의 단일 단량체 가변 영역의 항체 단편을 의미하며, 이는 약 15 kDa의 매우 작은 크기를 갖는다. VHH 모이어티는 약동학적 인핸서로서 사용되어 본원의 RLN 유사체의 작용 지속기간을 연장하고/거나 t½을 개선할 수 있음이 본원에서 밝혀졌다. 본원의 VHH 모이어티는 혈청 알부민에 결합하지만; VHH 모이어티는 IgG (Fc 도메인 포함), 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 또는 다른 장시간-지속성 혈청 단백질에 결합하는데 사용될 수 있다. 본원의 VHH 모이어티는 RLN의 t½을 개선하는데 사용되지만, 마찬가지로 다른 생물학적 활성 펩티드/단백질, 예컨대, 예를 들어, 인슐린, GDF-15 또는 GLP-1의 t½을 개선하는데 사용될 수 있다.
특정 약어는 하기와 같이 정의된다: "ACR"은 소변 알부민/소변 크레아티닌 비를 지칭하고; "amu"는 원자 질량 단위를 지칭하고; "AUC"는 곡선하 면적을 지칭하고; "Boc"는 tert-부톡시카르보닐을 지칭하고; "cAMP"는 시클릭 아데노신 모노포스페이트를 지칭하고; "CMV"는 사이토메갈로바이러스를 지칭하고; "CV"는 컬럼 부피를 지칭하고; "DNA"는 데옥시리보핵산을 지칭하고; "DMF"는 디메틸포름아미드를 지칭하고; "DMSO"는 디메틸 술폭시드를 지칭하고; "EDC"는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 히드로클로라이드를 지칭하고; "EDTA"는 에틸렌디아민테트라아세트산을 지칭하고; "EIA/RIA"는 효소 면역검정/방사선면역검정을 지칭하고; "ETA"는 에탄올아민을 지칭하고; "GS"는 글루타민 신세타제를 지칭하고; "HIC"는 소수성 상호작용 크로마토그래피를 지칭하고; "hr"는 시간 또는 시간들을 지칭하고; "HTRF"는 균질 시간-분해 형광을 지칭하고; "IV"는 정맥내를 지칭하고; "IP"는 복강내를 지칭하고; "kDa"는 킬로달톤을 지칭하고; "LC/MS"는 액체 크로마토그래피-질량 분광법을 지칭하고; "min"은 분 또는 분들을 지칭하고; "MS"는 질량 분광법을 지칭하고; "MSX"는 메티오닌 술폭시민을 지칭하고; "NaOAc"는 아세트산나트륨을 지칭하고; "NHS"는 N-히드록시숙신이미드를 지칭하고; "OtBu"는 O-tert-부틸을 지칭하고; "Pbf"는 NG-2,2,4,6,7-펜타메틸디히드로벤조푸란-5-술포닐을 지칭하고; "PEI"는 폴리에틸렌이민을 지칭하고; "RP-HPLC"는 역상 고성능 액체 크로마토그래피를 지칭하고; "RU"는 공명 단위를 의미하고; "sec"는 초 또는 초들을 지칭하고; "SPR"은 표면 플라즈몬 공명을 지칭하고; "SQ"는 피하를 지칭하고; "SEC"는 크기-배제 크로마토그래피를 지칭하고; "SEM"은 평균의 표준 오차를 지칭하고; "TFA"는 트리플루오로아세트산을 지칭하고; "Trt"는 트리틸을 지칭한다.
RLN 유사체
본원의 RLN 유사체는 천연 인간 RLN과 구조적 유사성을 갖지만 많은 구조적 차이를 갖는다. 예를 들어, 천연 인간 RLN2 (서열식별번호:5 및 6)와 비교될 때, RLN 유사체는 천연 인간 RLN2에 존재하는 하나 이상의 아미노산을 갖지 않고, A 쇄 및 B 쇄 사이에 펩티드 링커를 포함하고, 알부민-결합 VHH 모이어티를 포함한다. RLN 유사체는 RXFP1 수용체에서 충분한 활성을 초래하고, RXFP2, RXFP3 및 RXFP4 수용체 중 하나 이상에서 감소된 또는 불충분한 활성을 초래한다. 마찬가지로, RLN 유사체는 수용액에서의 개선된 용해도, 개선된 화학적 및 물리적 제형 안정성, 연장된 약동학적 프로파일 (혈청 알부민에 대한 VHH 친화성에 기초하여 조정될 수 있음), 및/또는 면역원성에 대한 최소화된 잠재성을 포함하여 치료적 치료로서의 개발 가능성과 관련된 유익한 속성을 갖는다.
간단히 말해서, 본원의 RLN 유사체는 하기 구조 중 하나를 갖는 N-말단에서 C-말단까지의 아미노산 서열을 포함한다:
VHH-L1-A-L2-B,
VHH-L1-B-L2-A,
A-L2-B-L1-VHH, 또는
B-L2-A-L1-VHH,
여기서 VHH는 약동학적 인핸서로서 작용하는 모이어티이고, A는 RLN A 쇄이고, B는 RLN B 쇄이고, L1은 제1 펩티드 링커이고, L2는 제2 펩티드 링커이고, 여기서 L1 및 L2는 서로 별개이다 (즉, 각각은 동일하지 않은 아미노산 서열을 갖는다).
A 쇄와 관련하여, 이는 천연 RLN A 쇄, 예컨대 천연 인간 RLN1 A 쇄 (서열식별번호:2); 천연 인간 RLN2 A 쇄 (서열식별번호:5); 또는 천연 인간 RLN3 A 쇄 (서열식별번호:8)일 수 있다. 대안적으로, A 쇄는 그의 변이체일 수 있다. 예를 들어, 하나의 A 쇄 변이체는 서열식별번호:5의 잔기 1 내지 4를 갖지 않는 아미노산 서열을 가질 수 있다 (즉, des1-4 인간 RLN2 A 쇄 또는 desA1-4).
마찬가지로, 및 B 쇄와 관련하여, 이는 천연 RLN B 쇄, 예컨대 천연 인간 RLN1 B 쇄 (서열식별번호:3); 천연 인간 RLN2 B 쇄 (서열식별번호:6); 또는 천연 인간 RLN3 B 쇄 (서열식별번호:9)일 수 있다. 대안적으로, B 쇄는 그의 변이체일 수 있다. 예를 들어, 하나의 B 쇄 변이체는 서열식별번호:6의 잔기 1을 갖지 않는 아미노산 서열을 가질 수 있다 (즉, des1 인간 RLN2 B 쇄 또는 desB1).
일부 경우에, A 쇄는 천연 인간 RLN1 A 쇄 (서열식별번호:2)일 수 있고 B 쇄는 천연 인간 RLN1 B 쇄 (서열식별번호:3)일 수 있거나; A 쇄는 천연 인간 RLN2 A 쇄 (서열식별번호:5)일 수 있고 B 쇄는 천연 인간 RLN2 B 쇄 (서열식별번호:6)일 수 있거나; A 쇄는 천연 인간 RLN3 A 쇄 (서열식별번호:8)일 수 있고 B 쇄는 천연 인간 RLN3 B 쇄 (서열식별번호:9)일 수 있거나; A 쇄는 천연 인간 RLN1 A 쇄 (서열식별번호:2)일 수 있고 B 쇄는 천연 인간 RLN2 B 쇄 (서열식별번호:6)일 수 있거나; A 쇄는 천연 인간 RLN1 A 쇄 (서열식별번호:2)일 수 있고 B 쇄는 천연 인간 RLN3 B 쇄 (서열식별번호:9)일 수 있거나; A 쇄는 천연 인간 RLN2 A 쇄 (서열식별번호:5)일 수 있고 B 쇄는 천연 인간 RLN1 B 쇄 (서열식별번호:3)일 수 있거나; A 쇄는 천연 인간 RLN2 A 쇄 (서열식별번호:5)일 수 있고 B 쇄는 천연 인간 RLN3 B 쇄 (서열식별번호:9)일 수 있거나; A 쇄는 천연 인간 RLN3 A 쇄 (서열식별번호:8)일 수 있고 B 쇄는 천연 인간 RLN1 B 쇄 (서열식별번호:3)일 수 있거나; 또는 A 쇄는 천연 인간 RLN3 A 쇄 (서열식별번호:8)일 수 있고 B 쇄는 천연 인간 RLN2 B 쇄 (서열식별번호:6)일 수 있다.
일부 경우에, A 쇄는 잔기 1 내지 4를 갖지 않는 (desA1-4) RLN2 A 쇄 변이체일 수 있고 B 쇄는 임의의 천연 B 쇄일 수 있다. 다른 경우에, A 쇄는 임의의 천연 A 쇄일 수 있고 B 쇄는 잔기 1을 갖지 않는 (desB1) RLN2 B 쇄 변이체일 수 있다. 또 다른 경우에, A 쇄는 잔기 1 내지 4를 갖지 않는 (desA1-4) RLN2 A 쇄 변이체일 수 있고 B 쇄는 잔기 1을 갖지 않는 (desB1) RLN2 B 쇄 변이체일 수 있다. 특정 경우에, A 쇄는 desA1-4 변이체이다. 특정 경우에, B 쇄는 desB1 변이체이다.
본원의 RLN 유사체에 사용될 수 있는 다른 A 및 B 쇄는 예를 들어, 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2018/148419, WO 2018/138170, WO 2017/201340, WO 2016/149501, WO 2015/157829, WO 2015/067791, WO 2015/067113, WO 2014/102179, WO 2013/177529, WO 2013/007563, WO 2013/004607, WO 2012/031326 및 WO 2012/024452; 및 미국 특허 출원 공개 번호 US 2011/0243942에 기재되어 있다. 또한, 문헌 [Chan et al. (2012) J. Biol. Chem. 287:41152-41164]; [Claasz et al. (2002) Eur. J. Biochem. 269:6287-6293]; [Hossain et al. (2015) Org. Biomol. Chem. 13:10895-10890]; [Hossain et al. (2016) Chem. Sci. 7:3805-3819]; [Park et al. (2008) J. Biol. Chem. 283:32099-32109] 및 [Wilkinson et al. (2005) BMC Evol. Biol. 5:14]을 참조한다.
L1과 관련하여, 이는 약 1개 아미노산 내지 약 50개 아미노산의 펩티드일 수 있다. 대안적으로, L1은 약 1, 약 5, 약 10, 약 15, 약 20, 약 25, 약 30, 약 35, 약 40, 약 45 또는 약 50개 아미노산일 수 있다. 대안적으로 여전히, L1은 약 5개 아미노산 내지 약 10개 아미노산, 약 10개 아미노산 내지 약 15개 아미노산, 약 15개 아미노산 내지 약 20개 아미노산, 약 20개 아미노산 내지 약 25개 아미노산, 약 25개 아미노산 내지 약 30개 아미노산, 약 30개 아미노산 내지 약 35개 아미노산, 약 35개 아미노산 내지 약 40개 아미노산, 약 40개 아미노산 내지 약 45개 아미노산, 또는 약 45개 아미노산 내지 약 50개 아미노산일 수 있다. 일부 경우에, A 쇄 또는 B 쇄가 VHH 모이어티에 직접 접합되도록 L1은 생략될 수 있다. 일부 경우에, L1은 (GGGGQ)n (서열식별번호:14)의 반복 서열을 포함할 수 있으며, 여기서 n은 약 1 내지 약 10, 특히 5일 수 있다 (즉, (GGGGQ)5; 서열식별번호:19). 다른 경우에, L1은 (PGPQ)n (서열식별번호:17)의 반복 서열을 포함할 수 있으며, 여기서 n은 약 1 내지 약 10, 특히 8일 수 있다 (즉, (PGPQ)8; 서열식별번호:20). 또 다른 경우에, L1은 (PGPA)n (서열식별번호:18)의 반복 서열을 포함할 수 있으며, 여기서 n은 약 1 내지 약 10, 특히 8일 수 있다 (즉, (PGPA)8; 서열식별번호:21).
RLN 유사체에서 L1로서 사용될 수 있는 다른 링커는 (GGGQ)n (서열식별번호:15) 또는 (GGGGS)n (서열식별번호:16)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
L2와 관련하여, 이는 약 1개 아미노산 내지 약 15개 아미노산의 펩티드일 수 있다. 대안적으로, L2는 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 또는 약 15개 아미노산일 수 있다. 대안적으로 여전히, L2는 약 1개 아미노산 내지 약 5개 아미노산, 약 5개 아미노산 내지 약 10개 아미노산, 약 10개 아미노산 내지 약 15개 아미노산, 특히 10개 아미노산 내지 15개 아미노산일 수 있다. 일부 경우에, L2는 Ala/A, Gln/Q, Gly/G, Pro/P 및 Ser/S 잔기의 믹스를 포함할 수 있다. 다른 경우에, L2는 서열식별번호:22, 23 또는 67일 수 있다.
VHH와 관련하여, 이는 혈청 알부민 또는 긴 t½을 갖는 또 다른 혈청 단백질에 결합할 수 있는 약 50개 아미노산 내지 약 200개 아미노산, 특히 약 125개 아미노산 내지 약 150개 아미노산의 폴리펩티드일 수 있다. 일부 경우에, VHH는 서열식별번호:10 내지 13 중 어느 하나일 수 있다. 대안적으로, VHH는 서열식별번호:45-66 중 어느 하나일 수 있다. 이들 VHH 모이어티의 구조적 특징은 천연 RLN, 특히 천연 인간 RLN2 (서열식별번호:5 및 6)와 비교될 때 더 긴 t½을 갖는 RLN 유사체를 초래한다. 본원의 VHH 모이어티가 혈청 알부민을 표적화한다는 점을 감안할 때, RLN 유사체의 t½은 따라서 RLN 유사체가 투여되는 종의 혈청 알부민과 유사할 것으로 예상될 수 있다 (임의의 표적 매개된 약물 성향을 고려함).
본 개시내용에 기재된 변경에 더하여, 본원의 RLN 유사체는 하나 이상의 추가 아미노산 변형, 특히 보존적 치환을 포함할 수 있지만, 단, RLN 유사체는 RXFP1 수용체에 결합하고 이를 활성화시킬 수 있는 상태로 유지된다.
종합하면, 예시적인 RLN 유사체는 하기와 같다:
VHH 모이어티 (밑줄), (G4Q)5 L1 (이탤릭체), RLN2의 A 쇄, 10개 잔기의 L2 (굵게 표시) 및 RLN2의 B 쇄 (desB1)를 포함하는 RLN 유사체 1 또는 그의 제약상 허용되는 염은 하기 아미노산 서열을 갖고:
Figure pct00027
(서열식별번호:24);
VHH 모이어티 (밑줄), (PGPA)8 L1 (이탤릭체), RLN2의 A 쇄, 10개 잔기의 L2 (굵게 표시) 및 RLN2의 B 쇄 (desB1)를 포함하는 RLN 유사체 2 또는 그의 제약상 허용되는 염은 하기 아미노산 서열을 갖고:
Figure pct00028
(서열식별번호:25);
VHH 모이어티 (밑줄), (G4Q)5 L1 (이탤릭체), RLN2의 B 쇄 (desB1), 10개 잔기의 L2 (굵게 표시) 및 RLN2의 A 쇄를 포함하는 RLN 유사체 3 또는 그의 제약상 허용되는 염은 하기 아미노산 서열을 갖고:
Figure pct00029
(서열식별번호:26);
VHH 모이어티 (밑줄), (PGPQ)8 L1 (이탤릭체), RLN2의 B 쇄 (desB1), 10개 잔기의 L2 (굵게 표시) 및 RLN2의 A 쇄를 포함하는 RLN 유사체 4 또는 그의 제약상 허용되는 염은 하기 아미노산 서열을 갖고:
Figure pct00030
(서열식별번호:27);
RLN2의 B 쇄 (desB1), 10개 잔기의 L2 (굵게 표시), RLN2의 A 쇄, (G4Q)5 L1 (이탤릭체) 및 VHH 모이어티 (밑줄)를 포함하는 RLN 유사체 5 또는 그의 제약상 허용되는 염은 하기 아미노산 서열을 갖고:
Figure pct00031
(서열식별번호:28);
RLN2의 B 쇄 (desB1), 10개 잔기의 L2 (굵게 표시), RLN2의 A 쇄, (PGPQ)8 L1 (이탤릭체) 및 VHH 모이어티 (밑줄)를 포함하는 RLN 유사체 6 또는 그의 제약상 허용되는 염은 하기 아미노산 서열을 갖고:
Figure pct00032
(서열식별번호:29);
VHH 모이어티 (밑줄), (G4Q)5 L1 (이탤릭체), RLN2의 B 쇄 (desB1), 10개 잔기의 L2 (굵게 표시) 및 RLN2의 A 쇄를 포함하는 RLN 유사체 7 또는 그의 제약상 허용되는 염은 하기 아미노산 서열을 갖고:
Figure pct00033
(서열식별번호:30);
VHH 모이어티 (밑줄), (PGPQ)8-L1 (이탤릭체), RLN2의 B 쇄 (desB1), 10개 잔기의 L2 (굵게 표시) 및 RLN2의 A 쇄를 포함하는 RLN 유사체 8 또는 그의 제약상 허용되는 염은 하기 아미노산 서열을 갖고:
Figure pct00034
(서열식별번호:31);
RLN2의 B 쇄 (desB1), 10개 잔기의 L2 (굵게 표시), RLN2의 A 쇄, (G4Q)5 L1 (이탤릭체) 및 VHH 모이어티 (밑줄)를 포함하는 RLN 유사체 9 또는 그의 제약상 허용되는 염은 하기 아미노산 서열을 갖고:
Figure pct00035
(서열식별번호:32);
RLN2의 B 쇄 (desB1), 10개 잔기의 L2 (굵게 표시), RLN2의 A 쇄, (PGPQ)8 L1 (이탤릭체) 및 VHH 모이어티 (밑줄)를 포함하는 RLN 유사체 10 또는 그의 제약상 허용되는 염은 하기 아미노산 서열을 갖고:
Figure pct00036
(서열식별번호:33);
VHH 모이어티 (밑줄), (G4Q)5 L1 (이탤릭체), RLN2의 B 쇄 (desB1), 13개 잔기의 L2 (굵게 표시) 및 RLN2의 A 쇄 (desA1-4)를 포함하는 RLN 유사체 11 또는 그의 제약상 허용되는 염은 하기 아미노산 서열을 갖고:
Figure pct00037
(서열식별번호:34);
VHH 모이어티 (밑줄), (G4Q)5 L1 (이탤릭체), RLN2의 B 쇄 (desB1), 13개 잔기의 L2 (굵게 표시) 및 RLN2의 A 쇄 (desA1-4)를 포함하는 RLN 유사체 12 또는 그의 제약상 허용되는 염은 하기 아미노산 서열을 갖고:
Figure pct00038
(서열식별번호:35);
VHH 모이어티 (밑줄), (G4Q)5 L1 (이탤릭체), RLN2의 A 쇄 (desA1-4), 10개 잔기의 L2 (굵게 표시) 및 RLN2의 B 쇄 (desB1)를 포함하는 RLN 유사체 13 또는 그의 제약상 허용되는 염은 하기 아미노산 서열을 갖고:
Figure pct00039
(서열식별번호:36);
VHH 모이어티 (밑줄), (PGPQ)8 L1 (이탤릭체), RLN2의 A 쇄 (desA1-4), 10개 잔기의 L2 (굵게 표시) 및 RLN2의 B 쇄 (desB1)를 포함하는 RLN 유사체 14 또는 그의 제약상 허용되는 염은 하기 아미노산 서열을 갖고:
Figure pct00040
(서열식별번호:37);
VHH 모이어티 (밑줄), (G4Q)5 L1 (이탤릭체), RLN2의 B 쇄 (천연), 10개 잔기의 L2 (굵게 표시) 및 RLN2의 A 쇄 (천연)를 포함하는 RLN 유사체 15 또는 그의 제약상 허용되는 염은 하기 아미노산 서열을 갖고:
Figure pct00041
(서열식별번호:38);
VHH 모이어티 (밑줄), (PGPA)8 L1 (이탤릭체), RLN2의 B 쇄 (천연), 10개 잔기의 L2 (굵게 표시) 및 RLN2의 A 쇄 (천연)를 포함하는 RLN 유사체 16 또는 그의 제약상 허용되는 염은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
Figure pct00042
(서열식별번호:39).
본원의 RLN 유사체의 반감기는 예를 들어, 하기 실시예에 기재된 것들을 포함하는 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 마찬가지로, 상이한 종의 알부민에 대한 RLN 유사체의 친화성은 결합 친화성을 측정하기 위한 관련 기술분야에 공지된 방법, 예를 들어, 하기 실시예에 기재된 것들을 사용하여 측정될 수 있으며, 일반적으로 평형 해리 상수 (KD) 값으로 표현된다. 더욱이, 각각의 RXFP 수용체에서의 RLN 유사체의 활성은 예를 들어, 하기 기재된 시험관내 활성 검정을 포함하는 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 측정될 수 있으며, 일반적으로 EC50 값으로 표현된다.
상기 기재된 변형의 결과로서, 본원의 RLN 유사체는 포유동물, 특히 인간에게 투여될 때 천연 RLN, 특히 천연 인간 RLN2 (서열식별번호:5 및 6)보다 더 긴 t½을 갖는다. 상기 언급된 바와 같이, 본원의 VHH 모이어티는 혈청 알부민을 표적화하고; 따라서, 본원의 RLN 유사체의 t½은 RLN 유사체가 투여되는 종의 혈청 알부민과 유사할 것으로 예상될 수 있다. 일부 경우에, RLN 유사체는 약 1일 내지 약 31일, 약 5일 내지 약 25일, 약 10일 내지 약 20일, 또는 심지어 약 15일의 t½을 가질 수 있다. 다른 경우에, RLN 유사체는 약 1일 내지 약 5일, 약 6일 내지 약 10일, 약 11일 내지 약 15일, 약 16일 내지 약 20일, 약 21 내지 약 25일, 또는 심지어 약 26 내지 약 31일의 t½을 가질 수 있다. 다른 경우에, RLN 유사체는 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 7일, 약 8일, 약 9일, 약 10일, 약 11일, 약 12일, 약 13일, 약 14일, 약 15일, 약 16일, 약 17일, 약 18일, 약 19일, 약 20일, 약 21일, 약 22일, 약 23일, 약 24일, 약 25일, 약 26일, 약 27일, 약 28일, 약 29일, 약 30일, 또는 심지어 약 31일의 t½을 가질 수 있다. 특정 경우에, RLN 유사체는 인간에게 투여될 때 약 20일의 t½을 가질 수 있다.
마찬가지로, 본원의 RLN 유사체는 인간에게 투여될 때 예를 들어, 천연 인간 RLN2 (서열식별번호:5 및 6)의 약 10배 내지 약 100배 이내의 RXFP1 수용체에서의 효력을 갖는다.
제약 조성물 및 키트
본원의 RLN 유사체는 비경구 경로 (예를 들어, 정맥내, 복강내, 근육내, 피하 또는 경피)에 의해 투여될 수 있는 제약 조성물로서 제형화될 수 있다. 이러한 제약 조성물 및 이를 제조하기 위한 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Remington, "The Science and Practice of Pharmacy" (D.B. Troy ed., 21st Ed., Lippincott, Williams & Wilkins, 2006)]을 참조한다. 특정 경우에, RLN 유사체는 SQ 또는 IV 투여된다. 대안적으로, 그러나, RLN 유사체는 다른 제약상 허용되는 경로를 위한 형태, 예컨대, 예를 들어, 경구 투여를 위한 정제 또는 다른 고체; 시간 방출 캡슐, 및 크림, 로션, 흡입제 등을 포함하여 현재 사용되는 임의의 다른 형태로 제형화될 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 그리고 이들의 생체내 적합성 및 유효성을 개선하기 위해, 본원의 RLN 유사체는 임의의 수의 무기 및 유기 산/염기와 반응하여 제약상 허용되는 산/염기 부가 염을 형성할 수 있다. 제약상 허용되는 염 및 이를 제조하기 위한 일반적인 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Stahl et al., "Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use" (2nd Revised Ed. Wiley-VCH, 2011)] 참조). 본원에서 사용하기 위한 제약상 허용되는 염은 나트륨, 트리플루오로아세테이트, 히드로클로라이드 및 아세테이트 염을 포함한다.
본원의 RLN 유사체는 의사에 의해 투여될 수 있거나 주사를 사용하여 자기-투여될 수 있다. 게이지 크기 및 주사 부피의 양은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있음이 이해된다. 그러나, 주사 부피의 양은 ≤ 약 2 mL 또는 심지어 ≤ 약 1 mL일 수 있고, 바늘 게이지는 ≥ 약 27 G 또는 심지어 ≥ 약 29 G일 수 있다.
본 개시내용은 또한 본원의 RLN 유사체 또는 그의 제약상 허용되는 염을 합성하는데 유용한 신규 중간체 및 방법을 제공하고 이에 따라 포괄한다. 중간체 및 RLN 유사체는 관련 기술분야에 널리 공지된 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 재조합 합성을 사용하는 방법은 하기 실시예에 예시되어 있다. 기재된 각 기술에 대한 특정 단계는 RLN 유사체를 제조하기 위해 상이한 방식으로 조합될 수 있다. 시약 및 출발 물질은 관련 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 입수가능하다.
본원의 RLN 유사체는 일반적으로 넓은 투여량 범위에 걸쳐 효과적이다. RLN 유사체 또는 이를 포함하는 제약 조성물의 예시적인 용량은 개체 킬로그램 (kg) 당 밀리그램 (mg) 또는 마이크로그램 (μg), 나노그램 (ng), 또는 피코그램 (pg) 양일 수 있다. 이러한 방식으로, 1일 용량은 약 1 μg 내지 약 100 mg일 수 있다.
여기서, 제약 조성물 내 RLN 유사체의 유효량은 약 0.25 mg 내지 약 5.0 mg의 용량일 수 있다. 그러나, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 일부 경우에 유효량 (즉, 용량/투여량)이 상기 언급된 범위의 하한 미만일 수 있고, 적절한 것보다 클 수 있지만, 다른 경우에 유효량은 더 많은 용량일 수 있고 허용가능한 부작용으로 사용될 수 있음을 이해한다.
본원의 RLN 유사체에 더하여, 제약 조성물은 또한 적어도 하나의 추가 치료제, 특히 심혈관, 폐 및 신장 병태, 질환 및 장애에서 표준 치료로서 전형적으로 사용되는 치료제를 포함할 수 있다.
이러한 방식으로, 제약 조성물은 유효량의 본원의 적어도 하나의 RLN 유사체, 제약상 허용되는 담체 및 임의로 적어도 하나의 추가 치료제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 제약 조성물은 유효량의 서열식별번호:24의 RLN 유사체 및 제약상 허용되는 담체, 유효량의 서열식별번호:25의 RLN 유사체 및 제약상 허용되는 담체, 유효량의 서열식별번호:26의 RLN 유사체 및 제약상 허용되는 담체, 유효량의 서열식별번호:27의 RLN 유사체 및 제약상 허용되는 담체, 유효량의 서열식별번호:28의 RLN 유사체 및 제약상 허용되는 담체, 유효량의 서열식별번호:29의 RLN 유사체 및 제약상 허용되는 담체, 유효량의 서열식별번호:30의 RLN 유사체 및 제약상 허용되는 담체, 유효량의 서열식별번호:31의 RLN 유사체 및 제약상 허용되는 담체, 유효량의 서열식별번호:32의 RLN 유사체 및 제약상 허용되는 담체, 유효량의 서열식별번호:33의 RLN 유사체 및 제약상 허용되는 담체, 유효량의 서열식별번호:34의 RLN 유사체 및 제약상 허용되는 담체, 유효량의 서열식별번호:35의 RLN 유사체 및 제약상 허용되는 담체, 유효량의 서열식별번호:36의 RLN 유사체 및 제약상 허용되는 담체, 유효량의 서열식별번호:37의 RLN 유사체 및 제약상 허용되는 담체, 유효량의 서열식별번호:38의 RLN 유사체 및 제약상 허용되는 담체, 또는 유효량의 서열식별번호:39의 RLN 유사체 및 제약상 허용되는 담체를 포함할 수 있다.
대안적으로, 본원의 RLN 유사체는 키트의 일부로서 제공될 수 있다. 일부 경우에, 키트는 적어도 하나의 RLN 유사체 (및 임의로 적어도 하나의 추가 치료제)를 개체에게 투여하기 위한 장치를 포함한다. 특정 경우에, 키트는 적어도 하나의 RLN 유사체 (및 임의로 적어도 하나의 추가 치료제)를 투여하기 위한 주사기 및 바늘을 포함한다. 특정 경우에, RLN 유사체 (및 임의로 적어도 하나의 추가 치료제)는 주사기 내의 수용액으로 미리 제형화된다.
RLN 유사체의 제조 및 사용 방법
본원의 RLN 유사체는 관련 기술분야에 공지된 임의의 수의 표준 재조합 DNA 방법 또는 표준 화학적 펩티드 합성 방법을 통해 제조될 수 있다. 재조합 DNA 방법과 관련하여, 표준 재조합 기술을 사용하여 RLN 유사체에 대한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 구축하고, 그 폴리뉴클레오티드를 재조합 발현 벡터에 혼입하고, 벡터를 숙주 세포, 예컨대 박테리아, 효모 및 포유동물 세포에 도입하여 RLN 유사체를 생산할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Green & Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 4th ed. 2012)]을 참조한다.
재조합 DNA 방법과 관련하여, 본원의 화합물은 재조합 DNA 기술을 사용하여 단백질 또는 전구체 단백질 분자를 생성함으로써 제조될 수 있다. cDNA 및 합성 DNA를 포함하는 DNA는 이중-가닥 또는 단일-가닥일 수 있고, 본원의 화합물을 코딩하는 그 안의 코딩 서열은 유전자 코드의 중복성 또는 축퇴성의 결과로 다양할 수 있다. 간단히 말해서, 본원의 화합물을 코딩하는 DNA 서열은 화합물 또는 그의 전구체를 생성하기 위해 숙주 세포에 도입된다. 숙주 세포는 박테리아 세포, 예컨대 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)의 K12 또는 B 균주, 진균 세포, 예컨대 효모 세포, 또는 포유동물 세포, 예컨대 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포일 수 있다.
적절한 숙주 세포는 본원의 화합물 또는 그의 전구체를 생산하기 위해 발현 시스템, 예컨대 발현 벡터로 일시적으로 또는 안정적으로 형질감염 또는 형질전환된다. 발현 벡터는 전형적으로 숙주 유기체에서 에피솜으로서 또는 숙주 염색체 DNA의 통합 부분으로서 복제가능하다. 일반적으로, 발현 벡터는 원하는 DNA 서열로 형질전환된 세포의 선택을 허용하기 위해 선택 마커, 예컨대, 예를 들어, 테트라사이클린, 네오마이신, G418 및 디히드로폴레이트 리덕타제를 함유할 것이다.
본원에 기재된 각 단계에 대한 특정 생합성 또는 합성 단계는 본원의 화합물을 제조하기 위해 상이한 방식으로 사용되거나, 사용되지 않거나, 조합될 수 있다.
화학적 펩티드 합성 방법과 관련하여, 표준 수동 또는 자동 고체상 합성 절차를 사용할 수 있다. 예를 들어, 자동 펩티드 합성기는 예를 들어, 어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems) (미국 캘리포니아주 포스터 시티) 및 프로테인 테크놀로지스 인크.(Protein Technologies Inc.) (미국 애리조나주 투손)로부터 상업적으로 입수가능하다. 고체상 합성용 시약은 상업적 공급원으로부터 용이하게 입수가능하다. 고체상 합성기는 간섭 그룹 차단, 반응 동안 아미노산 보호, 미반응 아미노산의 커플링, 탈보호 및 캡핑에 대한 제조업체의 지침에 따라 사용될 수 있다. 합성 RLN의 제조에 대한 추가 세부사항은 미국 특허 번호 4,835,251 및 5,166,191에서 찾을 수 있다.
본원의 RLN 유사체의 한 가지 용도는 심혈관 병태, 질환 및/또는 장애를 치료하기 위한 것이다. 예시적인 심혈관 병태, 질환 및 장애는 급성 심부전, 만성 심부전, 죽상경화증, 관상 동맥 질환, 당뇨병, 뇌졸중, 고콜레스테롤혈증, 고혈압, 허혈, 혈관수축 및 심실 비대를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원의 RLN 유사체의 또 다른 용도는 폐 병태, 질환 및/또는 장애를 치료하기 위한 것이다. 예시적인 폐 병태, 질환 및 장애는 폐 고혈압 및 만성 폐쇄성 폐질환 (COPD)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원의 RLN 유사체의 또 다른 용도는 신장 병태, 질환 및/또는 장애를 치료하기 위한 것이다. 예시적인 신장 병태, 질환 및 장애는 만성 신장 질환 및 당뇨병 신장병증을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
방법은 본원에 기재된 단계를 포함할 수 있고, 이들은 기재된 바와 같은 순서로 수행될 수 있지만 반드시 그런 것은 아니다. 그러나, 다른 순서도 생각할 수 있다. 더욱이, 개별 또는 다중 단계는 병렬로 및/또는 시간 중첩 및/또는 개별적으로 또는 다중 반복 단계로 수행될 수 있다. 또한, 방법은 특정되지 않은 추가 단계를 포함할 수 있다.
따라서 이러한 방법은 심혈관 병태, 질환 또는 장애를 갖거나 이에 걸리기 쉬운 개체를 선택하는 것을 포함할 수 있다. 대안적으로, 방법은 폐 병태, 질환 또는 장애를 갖거나 이에 걸리기 쉬운 개체를 선택하는 것을 포함할 수 있다. 대안적으로, 방법은 신장 병태, 질환 또는 장애를 갖거나 이에 걸리기 쉬운 개체를 선택하는 것을 포함할 수 있다. 특정 경우에, 방법은 당뇨병, 신장 기능 장애가 있는 고혈압 및/또는 비만인 개체를 선택하는 것을 포함할 수 있다.
방법은 또한 유효량의 본원의 적어도 하나의 RLN 유사체 (또한 본원에 기재된 바와 같은 제약 조성물의 형태일 수 있음)를 개체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 경우에, RLN 유사체/제약 조성물은 추가 치료제, 예컨대 항응고제, ACE 억제제, ARB, ARNI, β-차단제, 이뇨제, 디기탈리스, 디곡신, 히드랄라진/이소소르비드 디니트레이트, MRA 또는 다른 알도스테론 길항제, SGLT2 억제제, 스타틴 및/또는 항혈당제, 뿐만 아니라 고콜레스테롤, 고혈압, 심방 세동 및 당뇨병을 포함하나 이에 제한되지는 않는 동반질환을 제어하기 위한 다른 치료제를 포함할 수 있다.
RLN 유사체 및 임의의 추가 치료제의 농도/용량/투여량은 본원의 다른 곳에서 논의된다.
투여 경로와 관련하여, RLN 유사체 또는 이를 포함하는 제약 조성물은 공지된 방법에 따라, 예컨대, 예를 들어, 경구로; 주사에 의해 (즉, 동맥내로, 정맥내로, 복강내로, 대뇌내로, 뇌실내로, 근육내로, 안구내로, 문맥내로 또는 병변내로); 지속 방출 시스템에 의해, 또는 이식 장치에 의해 투여될 수 있다. 특정 경우에, RLN 유사체 또는 이를 포함하는 제약 조성물은 볼루스 주사에 의해 또는 지속적으로 SQ 투여될 수 있다.
투여 빈도와 관련하여, RLN 유사체 또는 이를 포함하는 제약 조성물은 매일, 격일로, 1주마다 3회, 1주마다 2회, 1주마다 1회 (즉, 매주), 2주마다 (즉, 격주로), 또는 매월 투여될 수 있다. 특정 경우에, RLN 유사체 또는 이를 포함하는 제약 조성물은 격일로 SQ, 1주마다 3회 SQ, 1주마다 2회 SQ, 1주마다 1회 SQ, 격주로 SQ 또는 매월 SQ 투여된다. 특정 경우에, RLN 유사체 또는 이를 포함하는 제약 조성물은 1주마다 1회 (QW) SQ 투여된다.
RLN 유사체 또는 이를 포함하는 제약 조성물이 유효량의 적어도 하나의 추가 치료제와 조합하여 투여되는 경우와 관련하여, 추가 치료제는 RLN 유사체 또는 이를 포함하는 제약 조성물과 동시에, 별도로 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
더욱이, 추가 치료제는 RLN 유사체 또는 이를 포함하는 제약 조성물과 동일한 빈도로 (즉, 격일로, 1주마다 2회, 또는 심지어 매주) 투여될 수 있다. 대안적으로, 추가 치료제는 RLN 유사체 또는 이를 포함하는 제약 조성물과 구별되는 빈도로 투여될 수 있다. 다른 경우에, 추가 치료제는 SQ 투여될 수 있다. 다른 경우에, 추가 치료제는 IV 투여될 수 있다. 또 다른 경우에, 추가 치료제는 경구로 투여될 수 있다.
방법은 식이 및 운동과 조합될 수 있고/거나 상기 논의된 것들 이외의 추가 치료제와 조합될 수 있다는 것이 추가로 고려된다.
실시예
하기 비제한적인 실시예는 제한이 아니라 예시의 목적으로 제공된다.
폴리펩티드 발현
실시예 1: RLN 유사체 1의 재조합 발현
실시예 1은 하기의 아미노산 서열을 갖는 RLN 유사체이다:
Figure pct00043
(서열식별번호:24).
여기서, 서열식별번호:24의 RLN 유사체는 CHOK1 세포 유도체를 사용하여 포유동물 세포 발현 시스템에서 생성된다. 서열식별번호:24를 코딩하는 cDNA 서열은 GS-함유 발현 플라스미드 백본 (pEE12.4-기반 플라스미드)으로 서브클로닝된다. cDNA 서열은 RLN 유사체의 조직 배양 배지로의 분비를 향상시키기 위해 신호 펩티드 서열, METDTLLLWVLLLWVPGSTG (서열식별번호:44)의 코딩 서열과 프레임 내에서 융합된다. 발현은 바이러스 CMV 프로모터에 의해 구동된다.
일시적 형질감염을 통해 RLN 유사체를 생성하기 위해, CHOK1 세포를 PEI-기반 방법을 사용하여 재조합 발현 플라스미드로 형질감염시킨다. 간단히 말해서, 4 x 106 세포/mL 밀도의 적절한 부피의 CHOK1 현탁액 세포를 진탕 플라스크로 옮기고, PEI 및 재조합 플라스미드 DNA를 모두 세포에 첨가한다. 세포를 32℃에서 6일 동안 현탁액 배양물에서 인큐베이션한다. 인큐베이션 기간의 종료 시, 세포를 저속 원심분리에 의해 제거하고, RLN 유사체 단백질을 조건화 배지로부터 정제한다.
대안적으로, 그리고 안정적 형질감염을 통해 RLN 유사체를 생성하기 위해, CHOK1 세포를 전기천공 및 적절한 양의 재조합 발현 플라스미드를 사용하여 안정적으로 형질감염시키고, 형질감염된 세포를 현탁액 배양물에서 적절한 세포 밀도로 유지한다. 형질감염된 세포의 선택을 25 μM MSX-함유 무혈청 배지에서의 성장에 의해 성취하고, 약 35℃-37℃ 및 약 5%-7% CO2에서 인큐베이션한다.
RLN 유사체는 CHO 세포로부터 배지로 분비되고, 이를 단백질 A 친화성 크로마토그래피, 이어서 이온 교환 및 소수성 상호작용 크로마토그래피 또는 크기-배제 크로마토그래피에 의해 정제한다. 구체적으로, 수확된 배지로부터의 RLN 유사체를 Mab 선택 단백질 A 수지 (GE)에 포획한다. 그 후, 수지를 러닝 완충제, 예컨대 포스페이트-완충 염수 (PBS; pH 7.4) 또는 Tris를 함유하는 완충제로 간단히 세척하여 비특이적으로 결합된 물질을 제거한다. 단백질을 낮은 pH 용액, 예컨대 10 mM 시트르산 pH 3을 사용하여 수지로부터 용리한다. RLN 유사체를 함유하는 분획을 풀링하고, 잠재적인 바이러스를 불활성화시키기 위해 낮은 pH에서 유지할 수 있다. 염기, 예컨대 0.1 M Tris pH 8.0을 첨가함으로써 pH를 중화할 수 있다. 수지, 예컨대 포로스(Poros) 50 HS (써모피셔(ThermoFisher))를 사용하는 이온 교환 크로마토그래피에 의해 RLN 유사체를 추가로 정제할 수 있다. 15 컬럼 부피에 걸쳐 20 mM NaOAc, pH 5.0에서 0 내지 500 mM NaCl 구배를 사용하여 컬럼으로부터 RLN 유사체를 용리한다.
캅토 페닐 ImpRes HIC 컬럼 (지이 헬스케어(GE Healthcare))를 사용함으로써 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 RLN 유사체를 추가로 정제할 수 있다. 컬럼 충전 용액을 약 0.5 M 황산나트륨으로 조정하고 20 mM Tris pH 8 용액에서 0.5 M 내지 0 M 황산나트륨의 10 CV 구배를 사용하여 용리함으로써 정제를 수행한다. HIC 후, PBS pH 7.4 또는 20mM 히스티딘, 50 mM NaCl pH 6.0에서 등용매 용리로 수퍼덱스(Superdex)200 (지이 헬스케어)에 농축된 캅토 페닐 ImpRes 풀을 로딩함으로써 SEC에 의해 RLN 유사체를 보다 더 정제할 수 있다.
정제된 RLN 유사체를 바이러스 체류 필터, 예컨대 플라노바(Planova) 20N (아사히 카세이 메디칼(Asahi Kasei Medical))을 통해 통과시킨 후, 재생 셀룰로스 막 (밀리포어(Millipore))에서 접선 유동 한외여과를 사용하여 20 mM 히스티딘, 20 mM NaCl pH 6으로 농축/정용여과할 수 있다.
따라서 RLN 유사체는 이러한 방식으로 또는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 유사한 방식으로 제조된다.
실시예 2: RLN 유사체 2의 재조합 발현
실시예 2는 하기의 아미노산 서열을 갖는 RLN 유사체이다:
Figure pct00044
(서열식별번호:25).
여기서, 서열식별번호:25의 RLN 유사체는 서열식별번호:25를 코딩하는 cDNA 서열이 발현 플라스미드에 사용되는 것을 제외하고는 본질적으로 실시예 1에 대해 기재된 바와 같이 생성된다.
실시예 3: RLN 유사체 3의 재조합 발현
실시예 3은 하기의 아미노산 서열을 갖는 RLN 유사체이다:
Figure pct00045
(서열식별번호:26).
여기서, 서열식별번호:26의 RLN 유사체는 서열식별번호:26을 코딩하는 cDNA 서열이 발현 플라스미드에 사용되는 것을 제외하고는 본질적으로 실시예 1에 대해 기재된 바와 같이 생성된다.
실시예 4: RLN 유사체 4의 재조합 발현
실시예 4는 하기의 아미노산 서열을 갖는 RLN 유사체이다:
Figure pct00046
(서열식별번호:27).
여기서, 서열식별번호:27의 RLN 유사체는 서열식별번호:27을 코딩하는 cDNA 서열이 발현 플라스미드에 사용되는 것을 제외하고는 본질적으로 실시예 1에 대해 기재된 바와 같이 생성된다.
실시예 5: RLN 유사체 5의 재조합 발현
실시예 5는 하기의 아미노산 서열을 갖는 RLN 유사체이다:
Figure pct00047
(서열식별번호:28).
여기서, 서열식별번호:28의 RLN 유사체는 서열식별번호:28을 코딩하는 cDNA 서열이 발현 플라스미드에 사용되는 것을 제외하고는 본질적으로 실시예 1에 대해 기재된 바와 같이 생성된다.
실시예 6: RLN 유사체 6의 재조합 발현
실시예 6은 하기의 아미노산 서열을 갖는 RLN 유사체이다:
Figure pct00048
(서열식별번호:29).
여기서, 서열식별번호:29의 RLN 유사체는 서열식별번호:29를 코딩하는 cDNA 서열이 발현 플라스미드에 사용되는 것을 제외하고는 본질적으로 실시예 1에 대해 기재된 바와 같이 생성된다.
실시예 7: RLN 유사체 7의 재조합 발현
실시예 7은 하기의 아미노산 서열을 갖는 RLN 유사체이다:
Figure pct00049
(서열식별번호:30).
여기서, 서열식별번호:30의 RLN 유사체는 서열식별번호:30을 코딩하는 cDNA 서열이 발현 플라스미드에 사용되는 것을 제외하고는 본질적으로 실시예 1에 대해 기재된 바와 같이 생성된다.
실시예 8: RLN 유사체 8의 재조합 발현
실시예 8은 하기의 아미노산 서열을 갖는 RLN 유사체이다:
Figure pct00050
(서열식별번호:31).
여기서, 서열식별번호:31의 RLN 유사체는 서열식별번호:31을 코딩하는 cDNA 서열이 발현 플라스미드에 사용되는 것을 제외하고는 본질적으로 실시예 1에 대해 기재된 바와 같이 생성된다.
실시예 9: RLN 유사체 9의 재조합 발현
실시예 9는 하기의 아미노산 서열을 갖는 RLN 유사체이다:
Figure pct00051
(서열식별번호:32).
여기서, 서열식별번호:32의 RLN 유사체는 서열식별번호:32를 코딩하는 cDNA 서열이 발현 플라스미드에 사용되는 것을 제외하고는 본질적으로 실시예 1에 대해 기재된 바와 같이 생성된다.
실시예 10: RLN 유사체 10의 재조합 발현
실시예 10은 하기의 아미노산 서열을 갖는 RLN 유사체이다:
Figure pct00052
(서열식별번호:33).
여기서, 서열식별번호:33의 RLN 유사체는 서열식별번호:33을 코딩하는 cDNA 서열이 발현 플라스미드에 사용되는 것을 제외하고는 본질적으로 실시예 1에 대해 기재된 바와 같이 생성된다.
실시예 11: RLN 유사체 11의 재조합 발현
실시예 11은 하기의 아미노산 서열을 갖는 RLN 유사체이다:
Figure pct00053
(서열식별번호:34).
여기서, 서열식별번호:34의 RLN 유사체는 서열식별번호:34를 코딩하는 cDNA 서열이 발현 플라스미드에 사용되는 것을 제외하고는 본질적으로 실시예 1에 대해 기재된 바와 같이 생성된다.
실시예 12: RLN 유사체 12의 재조합 발현
실시예 12는 하기의 아미노산 서열을 갖는 RLN 유사체이다:
Figure pct00054
(서열식별번호:35).
여기서, 서열식별번호:35의 RLN 유사체는 서열식별번호:35를 코딩하는 cDNA 서열이 발현 플라스미드에 사용되는 것을 제외하고는 본질적으로 실시예 1에 대해 기재된 바와 같이 생성된다.
실시예 13: RLN 유사체 13의 재조합 발현
실시예 13은 하기의 아미노산 서열을 갖는 RLN 유사체이다:
Figure pct00055
(서열식별번호:36).
여기서, 서열식별번호:36의 RLN 유사체는 서열식별번호:36을 코딩하는 cDNA 서열이 발현 플라스미드에 사용되는 것을 제외하고는 본질적으로 실시예 1에 대해 기재된 바와 같이 생성된다.
실시예 14: RLN 유사체 14의 재조합 발현
실시예 14은 하기의 아미노산 서열을 갖는 RLN 유사체이다:
Figure pct00056
(서열식별번호:37).
여기서, 서열식별번호:37의 RLN 유사체는 서열식별번호:37을 코딩하는 cDNA 서열이 발현 플라스미드에 사용되는 것을 제외하고는 본질적으로 실시예 1에 대해 기재된 바와 같이 생성된다.
실시예 15: RLN 유사체 15의 재조합 발현
실시예 15는 하기의 아미노산 서열을 갖는 RLN 유사체이다:
Figure pct00057
(서열식별번호:38).
여기서, 서열식별번호:38의 RLN 유사체는 서열식별번호:38을 코딩하는 cDNA 서열이 발현 플라스미드에 사용되는 것을 제외하고는 본질적으로 실시예 1에 대해 기재된 바와 같이 생성된다.
실시예 16: RLN 유사체 16의 재조합 발현
실시예 16은 하기의 아미노산 서열을 갖는 RLN 유사체이다:
Figure pct00058
(서열식별번호:39).
여기서, 서열식별번호:39의 RLN 유사체는 서열식별번호:39를 코딩하는 cDNA 서열이 발현 플라스미드에 사용되는 것을 제외하고는 본질적으로 실시예 1에 대해 기재된 바와 같이 생성된다.
시험관내 기능
실시예 17: SPR을 통한 RLN 유사체 알부민-결합
인간, 시노몰구스 원숭이, 마우스, 래트, 돼지, 개, 소 및 토끼 혈청 알부민에 대한 RLN 유사체의 시험관내 결합은 SPR에 의해 결정된다. 특히, 이들 종의 혈청 알부민에 대한 실시예 1 내지 14의 RLN 유사체의 친화성은 하기 표 1 내지 14에 요약되어 있다.
다양한 혈청 알부민에 대한 실시예 1 내지 14의 RLN 유사체의 결합은 비아코어(Biacore) 8K 기기에서 수행된다. 시리즈 S 센서 칩 CM5 표면에 대한 혈청 알부민의 고정화는 제조업체의 지침 (아민 커플링 키트 BR-1000-50)에 따라 수행된다. 간단히 말해서, 센서 칩 표면 (유동 셀 1 및 2) 상의 카르복실기는 75 mg/mL EDC 및 11.5 mg/mL NHS를 함유하는 혼합물 70 μL를 10 μL/분으로 주사함으로써 활성화된다. 인간, 시노몰구스 원숭이, 마우스, 래트, 돼지, 개, 소 및 토끼 혈청 알부민을 10 mM 아세트산나트륨 pH 4.0 (BR-1003-49)에 0.5, 0.5, 2.2, 0.6, 0.6, 0.8, 0.6 및 0.3 μg/mL로 희석한 후, 활성화된 칩 표면 (유동 셀 2, 채널 1 내지 8) 위에 10 μL/분으로 180초 동안 주사한다 (인간, 마우스, 래트, 돼지 및 소 혈청 알부민은 시그마 알드리치(Sigma Aldrich) (미국 미주리주 세인트루이스)로부터 수득되고; 시노몰구스 원숭이 혈청 알부민은 홀첼 디아그노스티카(Holzel Diagnostika) (독일 쾰른)로부터 수득되고; 개 혈청 알부민은 몰레큘라 이노베이션스(Molecular Innovations) (미국 미시간주 노바이)로부터 수득되고; 토끼 혈청 알부민은 피츠제랄드 인더스트리즈 인터내셔널(Fitzgerald Industries Intl.) (미국 매사추세츠주 액튼)로부터 수득된다. 다양한 혈청 알부민은 약 100 (62-145) RU의 표면 밀도를 표적화하는 카르복시메틸 덱스트란-코팅된 센서 칩 CM5에 유리 아민을 통해 공유결합으로 고정화된다. 표면 (유동 셀 1 및 2) 상의 과량의 반응성 기는 70 μL의 1 M ETA HCl-NaOH pH 8.5를 주사함으로써 탈활성화된다.
실시예 1 내지 14의 RLN 유사체를 1000, 333.3, 111.1, 37.04, 12.35, 4.12, 1.37, 0.457, 0.152, 0.051 및 0.017 nM의 농도로 HBS-EP+ 완충제 (10 mM HEPES pH 7.6, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% 폴리소르베이트 20)에 희석한다. 150 μl의 샘플을 칩 표면 상의 고정화된 혈청 알부민에 순차적으로 개별적으로 주사하고, 25℃에서 50 μL/분 유속으로 600초 동안 해리한다. 10 mM 글리신-HCl pH 1.5 (BR-1003-54)를 50 μL/분으로 100초 동안 주사함으로써 표면을 재생한다. 비아코어 8K 인사이트 평가 소프트웨어 (버전 2.0.15.12933) 1:1 결합 동역학 모델 적합화를 사용하여 생성된 센서그램을 분석하여 결합 동역학 파라미터 회합률 (ka), 해리율 (kd), 및 평형 해리 상수 (KD)를 계산한다.
<표 1>
25℃에서 인간, 시노몰구스 원숭이, 마우스, 래트, 돼지, 개, 소 및 토끼 혈청 알부민에 대한 실시예 1의 RLN 유사체의 결합 동역학.
Figure pct00059
KD는 실시예 1의 RLN 유사체와의 인간, 시노몰구스 원숭이, 마우스, 래트, 돼지, 개 및 소 혈청 알부민 결합에 대해 각각 0.1, 0.5, 3.3, 2.1, 7.1, 1.2 및 37 nM로 결정된다.
<표 2>
25℃에서 인간, 시노몰구스 원숭이, 마우스, 래트, 돼지, 개, 소 및 토끼 혈청 알부민에 대한 실시예 2의 RLN 유사체의 결합 동역학.
Figure pct00060
KD는 실시예 2의 RLN 유사체와의 인간, 시노몰구스 원숭이, 마우스, 래트, 돼지, 개 및 소 혈청 알부민 결합에 대해 각각 0.1, 0.45, 3.8, 3.0, 8.0, 1.4 및 50 nM로 결정된다.
<표 3>
25℃에서 인간, 시노몰구스 원숭이, 마우스, 래트, 돼지, 개, 소 및 토끼 혈청 알부민에 대한 실시예 3의 RLN 유사체의 결합 동역학.
Figure pct00061
KD는 실시예 3의 RLN 유사체와의 인간, 시노몰구스 원숭이, 마우스, 래트, 돼지, 개 및 소 혈청 알부민 결합에 대해 각각 0.08, 0.36, 2.4, 1.6, 4.8, 0.7 및 26 nM로 결정된다.
<표 4>
25℃에서 인간, 시노몰구스 원숭이, 마우스, 래트, 돼지, 개, 소 및 토끼 혈청 알부민에 대한 실시예 4의 RLN 유사체의 결합 동역학.
Figure pct00062
KD는 실시예 4의 RLN 유사체와의 인간, 시노몰구스 원숭이, 마우스, 래트, 돼지, 개 및 소 혈청 알부민 결합에 대해 각각 0.09, 0.42, 3.0, 2.1, 6.2, 1.0 및 37 nM로 결정된다.
<표 5>
25℃에서 인간, 시노몰구스 원숭이, 마우스, 래트, 돼지, 개, 소 및 토끼 혈청 알부민에 대한 실시예 5의 RLN 유사체의 결합 동역학.
Figure pct00063
KD는 실시예 5의 RLN 유사체와의 인간, 시노몰구스 원숭이, 마우스, 래트, 돼지, 개 및 소 혈청 알부민 결합에 대해 각각 0.45, 1.8, 14, 10, 23, 4.7 및 120 nM로 결정된다.
<표 6>
25℃에서 인간, 시노몰구스 원숭이, 마우스, 래트, 돼지, 개, 소 및 토끼 혈청 알부민에 대한 실시예 6의 RLN 유사체의 결합 동역학.
Figure pct00064
KD는 실시예 6의 RLN 유사체와의 인간, 시노몰구스 원숭이, 마우스, 래트, 돼지, 개 및 소 혈청 알부민 결합에 대해 각각 0.51, 2.3, 12, 9.7, 24, 4.1 및 130 nM로 결정된다.
<표 7>
25℃에서 인간, 시노몰구스 원숭이, 마우스, 래트, 돼지, 개, 소 및 토끼 혈청 알부민에 대한 실시예 7의 RLN 유사체의 결합 동역학.
Figure pct00065
KD는 실시예 7의 RLN 유사체와의 인간, 시노몰구스 원숭이, 마우스, 래트, 돼지, 개 및 소 혈청 알부민 결합에 대해 각각 0.06, 0.29, 2.1, 1.4, 3.7, 0.69 및 25 nM로 결정된다.
<표 8>
25℃에서 인간, 시노몰구스 원숭이, 마우스, 래트, 돼지, 개, 소 및 토끼 혈청 알부민에 대한 실시예 8의 RLN 유사체의 결합 동역학.
Figure pct00066
KD는 실시예 8의 RLN 유사체와의 인간, 시노몰구스 원숭이, 마우스, 래트, 돼지, 개 및 소 혈청 알부민 결합에 대해 각각 0.08, 0.32, 1.8, 1.7, 4.1, 0.66 및 21 nM로 결정된다.
<표 9>
25℃에서 인간, 시노몰구스 원숭이, 마우스, 래트, 돼지, 개, 소 및 토끼 혈청 알부민에 대한 실시예 9의 RLN 유사체의 결합 동역학.
Figure pct00067
KD는 실시예 9의 RLN 유사체와의 인간, 시노몰구스 원숭이, 마우스, 래트, 돼지, 개 및 소 혈청 알부민 결합에 대해 각각 0.19, 0.86, 9.5, 8.2, 14, 3.8 및 84 nM로 결정된다.
<표 10>
25℃에서 인간, 시노몰구스 원숭이, 마우스, 래트, 돼지, 개, 소 및 토끼 혈청 알부민에 대한 실시예 10의 RLN 유사체의 결합 동역학.
Figure pct00068
KD는 실시예 10의 RLN 유사체와의 인간, 시노몰구스 원숭이, 마우스, 래트, 돼지, 개 및 소 혈청 알부민 결합에 대해 각각 0.37, 1.5, 9.7, 7.8, 20, 3.4 및 100 nM로 결정된다.
<표 11>
25℃에서 인간, 시노몰구스 원숭이, 마우스, 래트, 돼지, 개, 소 및 토끼 혈청 알부민에 대한 실시예 11의 RLN 유사체의 결합 동역학.
Figure pct00069
KD는 실시예 11의 RLN 유사체와의 인간, 시노몰구스 원숭이, 마우스, 래트, 돼지, 개 및 소 혈청 알부민 결합에 대해 각각 0.17, 0.48, 3.6, 1.3, 7.3, 1.3 및 27 nM로 결정된다.
<표 12>
25℃에서 인간, 시노몰구스 원숭이, 마우스, 래트, 돼지, 개, 소 및 토끼 혈청 알부민에 대한 실시예 12의 RLN 유사체의 결합 동역학.
Figure pct00070
KD는 실시예 12의 RLN 유사체와의 인간, 시노몰구스 원숭이, 마우스, 래트, 돼지, 개 및 소 혈청 알부민 결합에 대해 각각 0.14, 0.47, 2.6, 1.7, 4.2, 0.77 및 30 nM로 결정된다.
<표 13>
25℃에서 인간, 시노몰구스 원숭이, 마우스, 래트, 돼지, 개, 소 및 토끼 혈청 알부민에 대한 실시예 13의 RLN 유사체의 결합 동역학.
Figure pct00071
KD는 실시예 13의 RLN 유사체와의 인간, 시노몰구스 원숭이, 마우스, 래트, 돼지, 개 및 소 혈청 알부민 결합에 대해 각각 0.14, 0.49, 2.6, 2.0, 5.0, 0.92 및 29 nM로 결정된다.
<표 14>
25℃에서 인간, 시노몰구스 원숭이, 마우스, 래트, 돼지, 개, 소 및 토끼 혈청 알부민에 대한 실시예 14의 RLN 유사체의 결합 동역학.
Figure pct00072
KD는 실시예 14의 RLN 유사체와의 인간, 시노몰구스 원숭이, 마우스, 래트, 돼지, 개 및 소 혈청 알부민 결합에 대해 각각 0.16, 0.61, 3.1, 2.2, 6.0, 1.1 및 34 nM로 결정된다.
실시예 18: RXFP1 및 RXFP2 수용체에서 RLN 유사체 시험관내 효력
CHO-CRE-Luc 세포주 생성: CHO-K1 세포 (ATCC)를 20 mM HEPES, 40 μg/mL L-프롤린, 1x 항생제를 갖는 5% FBS와 함께 DMEM-F12 3:1에서 배양하고, TrypLE™ 익스프레스 (깁코(Gibco))를 사용하여 2-3일마다 1:5 분할한다. 세포를 제조업체의 지침에 따라 pGL4.29[luc2P/CRE/Hygro] (프로메가(Promega)) 및 푸진(Fugene) HD (프로메가)의 플라스미드 DNA로 형질감염시킨다. 형질감염된 세포를 3-4주 동안 1 mg/mL의 히그로마이신 B로 선택한다. 클론 계통을 96-웰 플레이트로의 제한된 희석 클로닝에 의해 수득하고, 브라이트-글로(Bright-Glo) 시약 (프로메가)을 사용한 루시페라제 검정에 의해 포스콜린 반응으로 확인한다. 클론을 확장하고, 수확하고, 동결 배지에 재현탁하고, 냉동바이알에 분취하고, 장기간 저장을 위해 액체 질소에 보관한다. 최고 반응자는 인간 RXFP1 및 RXFP2 수용체를 사용한 후속 형질감염을 위해 최선의 포스콜린 반응 (신호 대 배경 비율), 클론 계통 # 2B6으로 선택한다.
CHO 인간 RXFP1- 및 인간 RXFP2-발현 세포주 생성: CHO-CRE-Luc 계통 # 2B6 세포를 20 mM HEPES, 40 μg/mL L-프롤린, 1x 항생제, 1 mg/mL 히그로마이신 B를 갖는 5% FBS와 함께 DMEM-F12 3:1에서 배양하고, TrypLE 익스프레스 (깁코)를 사용하여 2-3일마다 1:5 분할한다. 세포를 제조업체의 지침에 따라 인간 RXFP1 수용체 또는 인간 RXFP2 수용체 및 푸진 HD (프로메가)의 플라스미드 DNA로 형질감염시킨다. 형질감염된 세포를 3-4주 동안 히그로마이신 B (1 mg/mL) 및 퓨로마이신 (6 μg/mL)으로 선택한다. 클론 계통을 96-웰 플레이트로의 제한된 희석 클로닝에 의해 수득한다. 클론 계통을 인간 RLN2 반응에 의해 확인한다. 클론을 확장하고, 수확하고, 동결 배지에 재현탁하고, 냉동바이알에 분취하고, 장기간 저장을 위해 액체 질소 하에 동결 보관한다. 검정 검증을 위해 인간 RLN2에 대한 최선의 반응 (신호 대 배경 비율)으로 클론 계통을 선택한다.
인간 RXFP1 및 RXFP2 수용체 루시페라제 검정: 인간 RXFP1 또는 인간 RXFP2를 발현하는 CHO 세포주를 선택 배지 (20 mM HEPES, 40 μg/mL L-프롤린, 1x 항생제, 6 μg/mL 퓨로마이신, 1 mg/mL 히그로마이신 B를 갖는 5% FBS와 함께 DMEM-F12 3:1)로 배양한다. -1일차 (cAMP CRE 루시페라제 리포터 검정 전날)에, 세포를 PBS로 1회 세척하고, 세포 해리 용액 (무효소 세포 해리 용액, 깁코 cat# 13151-014:TrypLE™ 익스프레스 = 30:1)이 있는 플라스크로부터 들어 올리고, 플레이팅 배지 (20 mM HEPES, 1x 항생제, 0.5% FBS를 갖는 DMEM-F12 3:1)에 재현탁한다. 세포를 96-웰 플레이트 (팔콘(Falcon) Cat# 353219)에 20,000개 세포/0.1 mL/웰로 플레이팅한다. 세포를 37℃ 5% CO2에서 밤새 배양한다. 1일차 (cAMP CRE 루시페라제 리포터 검정 당일)에, 배지를 제거하고, 90 μL 무혈청 배지 (20 mM HEPES, 1x 항생제를 갖는 DMEM-F12 3:1)로 대체한다. 플레이트를 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션한 후, 10 μL의 10x 리간드를 첨가한다 (RLN2, 최종 1x). 플레이트를 37℃에서 추가 4시간 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 기간이 완료된 후, 플레이트를 15분 동안 실온으로 가져온다. 그 후, 50 μL의 브라이트-글로™를 각 웰에 첨가하고, Gen5 소프트웨어로 바이오텍(Biotek) Neo2 판독기에서 플레이트를 판독한다.
데이터의 통계적 분석: 바이오텍 Neo2 판독기로부터 그래프패드(GraphPad) 프리즘(Prism)® 소프트웨어 (그래프패드 소프트웨어, 엘엘씨; 미국 캘리포니아주 라호이아; 버전 7)로 데이터를 불러온다. 가변 기울기-4 파라미터 용량 반응 곡선 분석에 의해 EC50 값을 생성한다.
<표 15>
RXPF1 및 RXPF2 수용체에 대한 RLN 유사체의 시험관내 효력.
Figure pct00073
생체내 기능
실시예 19: 수컷 스프라그 돌리 래트에서 RLN 유사체의 약동학
수컷 스프라그 돌리 래트에게 1.0 mL/kg의 부피로 His-NaCl 완충제 (pH 6.0) 중 200 nmol/kg의 RLN 유사체의 단일 SQ 용량을 투여한다. 약동학적 특징화를 위해 투여 후 3, 6, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168 및 240시간에 혈액을 수집한다.
RLN 유사체의 혈장 농도는 일라이 릴리 앤드 캄파니(Eli Lilly and Company)에서 적격한 LC/MS 방법에 의해 결정된다. 실시예 화합물 및 유사체 내부 표준을 인간 RLN 항체를 사용하여 100% 래트 혈장으로부터 추출한 후, Q-Exactive(큐-엑스액티브)™ 오비트랩(Orbitrap)® 질량 분광기를 사용하여 N-말단 트립신 펩티드를 검출한다.
실시예 4 및 7의 RLN 유사체에 대한 데이터는 하기 표 16에 제공된다.
<표 16>
수컷 스프라그 돌리 래트에게 단일 200 nmol/kg SQ 투여 후 RLN 유사체에 대한 평균 혈장 약동학적 파라미터.
Figure pct00074
참고: 약어: t½ = 반감기, Tmax = 최대 농도까지의 시간, Cmax = 최대 관찰 혈장 농도, AUC0-inf = 0시간에서 무한대까지의 곡선하 면적, CL/F = 청소율/생체이용률, N = 3마리 동물/그룹/시점.
표 16에 나타낸 바와 같이, 실시예 4 및 7의 RLN 유사체는 스프라그 돌리 래트에서 연장된 약동학적 프로파일을 나타낸다.
실시예 20: 수컷 스프라그 돌리 래트에서 IV 투여 후 신장 혈류에 대한 RLN 유사체의 생체내 효과
수컷 5주령 스프라그 돌리 래트 (찰스 리버 래보러토리즈, 인크.(Charles River Laboratories, Inc.))를 실험 시작 전 1주 동안 정상적인 명암 주기로 사육장에 수용한다. 그 후, 래트를 체중을 기준으로 하여 하기 처리 그룹: 비히클 (20 mM His/20 mM NaCl, pH 6.0 완충제) 및 실시예 7의 RLN 유사체로 무작위화한다. RLN 유사체를 2.44 μg/kg IV 볼루스 이어서 0.36 μg/kg/hr IV 주입, 8.13 μg/kg IV 볼루스 이어서 1.2 μg/kg/hr IV 주입, 24.4 μg/kg IV 볼루스 이어서 3.6 μg/kg/hr IV 주입, 및 81.3 μg/kg IV 볼루스 이어서 11.9 μg/kg/hr IV 주입으로 투여한다.
신장 혈류에 대한 RLN 유사체의 효과를 측정하기 위해, 래트를 우레탄 (1.2 g/kg, IP)으로 마취하고, 복부/신장 초음파 영상화 및 신장 동맥 펄스파 도플러 혈류 측정 (비쥬얼소닉스(VisualSonics), 모델 베보(Vevo) 3100 초음파 시스템; 후지필름(Fujifilm))을 위해 준비한다. IV 볼루스 및 주입 투여를 위해 만성 꼬리 정맥 카테터를 배치한다. 30분 순응 기간 후, 기준선 및 투여 시작 3시간 후 신장 혈류 측정을 획득한다.
<표 17>
건강한 래트에서 신장 혈류에 대한 IV 투여된 RLN 유사체의 효과.
Figure pct00075
참고: 평균 ± SD로 표현된 결과, † 기준선 p<0.001 ANOVA와 유의하게 상이함, * 비히클 p<0.001 ANOVA와 유의하게 상이함, 처리 그룹 당 N = 5.
표 17에서 알 수 있는 바와 같이, 실시예 7의 RLN 유사체는 노출 3시간 후 8.13 μg/kg IV 볼루스 이어서 1.2 μg/kg/hr IV 주입, 24.4 μg/kg IV 볼루스 이어서 3.6 μg/kg/hr IV 주입, 및 81.3 μg/kg IV 볼루스 이어서 11.9 μg/kg/hr IV 주입 처리된 그룹에서 신장 혈류를 26.6, 48.8 및 60.4%만큼 유의하게 증가시킨다.
실시예 21: 수컷 스프라그 돌리 래트에서 SQ 투여 후 신장 혈류에 대한 RLN 유사체의 생체내 효과
수컷 5주령 스프라그 돌리 래트 (찰스 리버 래보러토리즈, 인크.)를 실험 시작 전 1주 동안 정상적인 명암 주기로 사육장에 수용한다. 그 후, 래트를 체중을 기준으로 하여 하기 처리 그룹: 비히클 (20 mM His/20 mM NaCl, pH 6.0 완충제) 및 실시예 7의 RLN 유사체로 무작위화한다. RLN 유사체를 180 μg/kg으로 SQ 투여한다.
신장 혈류에 대한 RLN 유사체의 효과를 측정하기 위해, 투여 48시간 후, 래트를 우레탄 (1.2 g/kg, IP)으로 마취하고, 복부/신장 초음파 영상화 및 신장 동맥 펄스파 도플러 혈류 측정 (비쥬얼소닉스, 모델 베보 3100 초음파 시스템; 후지필름)을 위해 준비한다. 30분 순응 기간 후, 신장 혈류 측정을 획득한다.
<표 18>
건강한 래트에서 신장 혈류에 대한 SQ 투여된 RLN 유사체의 효과.
Figure pct00076
참고: 평균 ± SD로 표현된 결과, * 비히클 p<0.001 ANOVA와 유의하게 상이함, 처리 그룹 당 N = 10.
표 18에서 알 수 있는 바와 같이, 실시예 7의 RLN 유사체는 180 μg/kg의 SQ 용량에 대한 노출 48시간 후 신장 혈류를 유의하게 증가시킨다.
서열
하기 핵산 및/또는 아미노산 서열이 본 개시내용에서 언급되고, 참조를 위해 하기에 제공된다.
서열식별번호:1 - 인간 프로-RLN1
Figure pct00077
서열식별번호:2 - 인간 RLN1 A 쇄
Figure pct00078
서열식별번호:3 - 인간 RLN1 B 쇄
Figure pct00079
서열식별번호:4 - 인간 프로-RLN2
Figure pct00080
서열식별번호:5 - 인간 RLN2 A 쇄
Figure pct00081
서열식별번호:6 - 인간 RLN2 B 쇄
Figure pct00082
서열식별번호:7 - 인간 프로-RLN3
Figure pct00083
서열식별번호:8 - 인간 RLN3 A 쇄
Figure pct00084
서열식별번호:9 - 인간 RLN3 B 쇄
Figure pct00085
서열식별번호:10 - VHH 모이어티 #1 (C22)
Figure pct00086
서열식별번호:11 - VHH 모이어티 #2 (C22.43)
Figure pct00087
서열식별번호:12 - VHH 모이어티 #3 (C80)
Figure pct00088
서열식별번호:13 - VHH 모이어티 #4 (C80.43)
Figure pct00089
서열식별번호:14 - L1 ((GGGGQ)n의 기본 서열)
Figure pct00090
서열식별번호:15 - L1 ((GGGQ)n의 기본 서열)
Figure pct00091
서열식별번호:16 - L1 ((GGGGS)n의 기본 서열)
Figure pct00092
서열식별번호:17 - L1 ((PGPQ)n의 기본 서열)
Figure pct00093
서열식별번호:18 - L1 ((PGPA)n의 기본 서열)
Figure pct00094
서열식별번호:19 - L1 #1 ((GGGGQ)5)
Figure pct00095
서열식별번호:20 - L1 #2 ((PGPQ)8)
Figure pct00096
서열식별번호:21 - L1 #3 (PGPA)8
Figure pct00097
서열식별번호:22 - L2 #1
Figure pct00098
서열식별번호:23 - L2 #2
Figure pct00099
서열식별번호:24 - RLN2 유사체 #1 (C22-(G4Q)5-A10B(desB1)RLN)
Figure pct00100
서열식별번호:25 - RLN2 유사체 #2 (C22-(PGPA)8-A10B(desB1)RLN)
Figure pct00101
서열식별번호:26 - RLN2 유사체 #3 (C22-(G4Q)5-B10A(desB1)RLN)
Figure pct00102
서열식별번호:27 - RLN2 유사체 #4 (C22-(PGPQ)8-B10A(desB1)RLN)
Figure pct00103
서열식별번호:28 - RLN2 유사체 #5 (B10A(desB1)RLN-(G4Q)5-C22.43)
Figure pct00104
서열식별번호:29 - RLN2 유사체 #6 (B10A(desB1)RLN-(PGPQ)8-C22.43)
Figure pct00105
서열식별번호:30 - RLN2 유사체 #7 (C80-(G4Q)5-B10A(desB1)RLN)
Figure pct00106
서열식별번호:31 - RLN2 유사체 #8 (C80-(PGPQ)8-B10A(desB1)RLN)
Figure pct00107
서열식별번호:32 - RLN2 유사체 #9 (B10A(desB1)RLN-(G4Q)5-C80.43)
Figure pct00108
서열식별번호:33 - RLN2 유사체 #10 (B10A(desB1)RLN-(PGPQ)8-C80.43)
Figure pct00109
서열식별번호:34 - RLN2 유사체 #11 (C22-(G4Q)5-B13A(desB1, desA1-4)RLN)
Figure pct00110
서열식별번호:35 - RLN2 유사체 #12 (C80-(G4Q)5-B13A(desB1, desA1-4)RLN)
Figure pct00111
서열식별번호:36 - RLN2 유사체 #13 (C80-(G4Q)5-A10B(desB1, desA1-4)RLN)
Figure pct00112
서열식별번호:37 - RLN2 유사체 #14 (C80-(PGPQ)8-A10B(desB1, desA1-4)RLN)
Figure pct00113
서열식별번호:38 - RLN2 유사체 #15 (C22-(G4Q)5-B10ARLN)
Figure pct00114
서열식별번호:39 - RLN2 유사체 #16 (C22-(PGPA)8-B10ARLN)
Figure pct00115
서열식별번호:40 - 인간 RXFP1 수용체
Figure pct00116
서열식별번호:41 - 인간 RXFP2 수용체
Figure pct00117
서열식별번호:42 - 인간 RXFP3 수용체
Figure pct00118
서열식별번호:43 - 인간 RXFP4 수용체
Figure pct00119
서열식별번호:44 - 신호 펩티드
Figure pct00120
서열식별번호:45 - VHH 모이어티 #5 (MC6.1)
Figure pct00121
서열식별번호:46 - VHH 모이어티 #6 (MC6.1C6)
Figure pct00122
서열식별번호:47 - VHH 모이어티 #7 (C22-G26Y)
Figure pct00123
서열식별번호:48 - VHH 모이어티 #8 (C22-R27A)
Figure pct00124
서열식별번호:49 - VHH 모이어티 #9 (C22-I57E)
Figure pct00125
서열식별번호:50 - VHH 모이어티 #10 (C22-I57Q)
Figure pct00126
서열식별번호:51 - VHH 모이어티 #11 (C22-Y59A)
Figure pct00127
서열식별번호:52 - VHH 모이어티 #12 (C22-Y59E)
Figure pct00128
서열식별번호:53 - VHH 모이어티 #13 (C22-Y59Q)
Figure pct00129
서열식별번호:54 - VHH 모이어티 #14 (C22-Y59S)
Figure pct00130
서열식별번호:55 - VHH 모이어티 #15 (C22-Y59T)
Figure pct00131
서열식별번호:56 - VHH 모이어티 #16 (C22-R102K)
Figure pct00132
서열식별번호:57 - VHH 모이어티 #17 (C22-R102Q)
Figure pct00133
서열식별번호:58 - VHH 모이어티 #18 (C22-R102S)
Figure pct00134
서열식별번호:59 - VHH 모이어티 #19 (C22-P103E)
Figure pct00135
서열식별번호:60 - VHH 모이어티 #20 (C22-P103Q)
Figure pct00136
서열식별번호:61 - VHH 모이어티 #21 (C22-P103S)
Figure pct00137
서열식별번호:62 - VHH 모이어티 #22 (C22-L104E)
Figure pct00138
서열식별번호:63 - VHH 모이어티 #23 (C22-L104G)
Figure pct00139
서열식별번호:64 - VHH 모이어티 #24 (C22-L104Q)
Figure pct00140
서열식별번호:65 - VHH 모이어티 #25 (C22-L104T)
Figure pct00141
서열식별번호:66 - VHH 모이어티 #26 (C22-S107E)
Figure pct00142
서열식별번호:67 - L2 #3
Figure pct00143
SEQUENCE LISTING <110> Eli Lilly and Company <120> Relaxin-LA <130> X22483 <160> 67 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 185 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Pro Arg Leu Phe Leu Phe His Leu Leu Glu Phe Cys Leu Leu Leu 1 5 10 15 Asn Gln Phe Ser Arg Ala Val Ala Ala Lys Trp Lys Asp Asp Val Ile 20 25 30 Lys Leu Cys Gly Arg Glu Leu Val Arg Ala Gln Ile Ala Ile Cys Gly 35 40 45 Met Ser Thr Trp Ser Lys Arg Ser Leu Ser Gln Glu Asp Ala Pro Gln 50 55 60 Thr Pro Arg Pro Val Ala Glu Ile Val Pro Ser Phe Ile Asn Lys Asp 65 70 75 80 Thr Glu Thr Ile Ile Ile Met Leu Glu Phe Ile Ala Asn Leu Pro Pro 85 90 95 Glu Leu Lys Ala Ala Leu Ser Glu Arg Gln Pro Ser Leu Pro Glu Leu 100 105 110 Gln Gln Tyr Val Pro Ala Leu Lys Asp Ser Asn Leu Ser Phe Glu Glu 115 120 125 Phe Lys Lys Leu Ile Arg Asn Arg Gln Ser Glu Ala Ala Asp Ser Asn 130 135 140 Pro Ser Glu Leu Lys Tyr Leu Gly Leu Asp Thr His Ser Gln Lys Lys 145 150 155 160 Arg Arg Pro Tyr Val Ala Leu Phe Glu Lys Cys Cys Leu Ile Gly Cys 165 170 175 Thr Lys Arg Ser Leu Ala Lys Tyr Cys 180 185 <210> 2 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Pro Tyr Val Ala Leu Phe Glu Lys Cys Cys Leu Ile Gly Cys Thr Lys 1 5 10 15 Arg Ser Leu Ala Lys Tyr Cys 20 <210> 3 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Val Ala Ala Lys Trp Lys Asp Asp Val Ile Lys Leu Cys Gly Arg Glu 1 5 10 15 Leu Val Arg Ala Gln Ile Ala Ile Cys Gly Met Ser Thr Trp Ser 20 25 30 <210> 4 <211> 185 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Pro Arg Leu Phe Phe Phe His Leu Leu Gly Val Cys Leu Leu Leu 1 5 10 15 Asn Gln Phe Ser Arg Ala Val Ala Asp Ser Trp Met Glu Glu Val Ile 20 25 30 Lys Leu Cys Gly Arg Glu Leu Val Arg Ala Gln Ile Ala Ile Cys Gly 35 40 45 Met Ser Thr Trp Ser Lys Arg Ser Leu Ser Gln Glu Asp Ala Pro Gln 50 55 60 Thr Pro Arg Pro Val Ala Glu Ile Val Pro Ser Phe Ile Asn Lys Asp 65 70 75 80 Thr Glu Thr Ile Asn Met Met Ser Glu Phe Val Ala Asn Leu Pro Gln 85 90 95 Glu Leu Lys Leu Thr Leu Ser Glu Met Gln Pro Ala Leu Pro Gln Leu 100 105 110 Gln Gln His Val Pro Val Leu Lys Asp Ser Ser Leu Leu Phe Glu Glu 115 120 125 Phe Lys Lys Leu Ile Arg Asn Arg Gln Ser Glu Ala Ala Asp Ser Ser 130 135 140 Pro Ser Glu Leu Lys Tyr Leu Gly Leu Asp Thr His Ser Arg Lys Lys 145 150 155 160 Arg Gln Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Asn Lys Cys Cys His Val Gly Cys 165 170 175 Thr Lys Arg Ser Leu Ala Arg Phe Cys 180 185 <210> 5 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Gln Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Asn Lys Cys Cys His Val Gly Cys Thr 1 5 10 15 Lys Arg Ser Leu Ala Arg Phe Cys 20 <210> 6 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Asp Ser Trp Met Glu Glu Val Ile Lys Leu Cys Gly Arg Glu Leu Val 1 5 10 15 Arg Ala Gln Ile Ala Ile Cys Gly Met Ser Thr Trp Ser 20 25 <210> 7 <211> 142 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Met Ala Arg Tyr Met Leu Leu Leu Leu Leu Ala Val Trp Val Leu Thr 1 5 10 15 Gly Glu Leu Trp Pro Gly Ala Glu Ala Arg Ala Ala Pro Tyr Gly Val 20 25 30 Arg Leu Cys Gly Arg Glu Phe Ile Arg Ala Val Ile Phe Thr Cys Gly 35 40 45 Gly Ser Arg Trp Arg Arg Ser Asp Ile Leu Ala His Glu Ala Met Gly 50 55 60 Asp Thr Phe Pro Asp Ala Asp Ala Asp Glu Asp Ser Leu Ala Gly Glu 65 70 75 80 Leu Asp Glu Ala Met Gly Ser Ser Glu Trp Leu Ala Leu Thr Lys Ser 85 90 95 Pro Gln Ala Phe Tyr Arg Gly Arg Pro Ser Trp Gln Gly Thr Pro Gly 100 105 110 Val Leu Arg Gly Ser Arg Asp Val Leu Ala Gly Leu Ser Ser Ser Cys 115 120 125 Cys Lys Trp Gly Cys Ser Lys Ser Glu Ile Ser Ser Leu Cys 130 135 140 <210> 8 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Asp Val Leu Ala Gly Leu Ser Ser Ser Cys Cys Lys Trp Gly Cys Ser 1 5 10 15 Lys Ser Glu Ile Ser Ser Leu Cys 20 <210> 9 <211> 27 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Arg Ala Ala Pro Tyr Gly Val Arg Leu Cys Gly Arg Glu Phe Ile Arg 1 5 10 15 Ala Val Ile Phe Thr Cys Gly Gly Ser Arg Trp 20 25 <210> 10 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 10 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Tyr Ile Asp Glu Thr 20 25 30 Ala Val Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Gly Ile Gly Gly Gly Val Asp Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Arg Pro Gly Arg Pro Leu Ile Thr Ser Lys Val Ala Asp Leu 100 105 110 Tyr Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 11 <211> 128 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 11 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Tyr Ile Asp Glu Thr 20 25 30 Ala Val Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Gly Ile Gly Gly Gly Val Asp Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Arg Pro Gly Arg Pro Leu Ile Thr Ser Lys Val Ala 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Synthetic Construct <400> 53 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Tyr Ile Asp Glu Thr 20 25 30 Ala Val Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Gly Ile Gly Gly Gly Val Asp Ile Thr Gln Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Arg Pro Gly Arg Pro Leu Ile Thr Ser Lys Val Ala Asp Leu 100 105 110 Tyr Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 54 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 54 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Tyr Ile Asp Glu Thr 20 25 30 Ala Val Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Gly Ile Gly Gly Gly Val Asp Ile Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Arg Pro Gly Arg Pro Leu Ile Thr Ser Lys Val Ala Asp Leu 100 105 110 Tyr Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 55 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 55 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Tyr Ile Asp Glu Thr 20 25 30 Ala Val Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Gly Ile Gly Gly Gly Val Asp Ile Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Arg Pro Gly Arg Pro Leu Ile Thr Ser Lys Val Ala Asp Leu 100 105 110 Tyr Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 56 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 56 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Tyr Ile Asp Glu Thr 20 25 30 Ala Val Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Gly Ile Gly Gly Gly Val Asp Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Arg Pro Gly Lys Pro Leu Ile Thr Ser Lys Val Ala Asp Leu 100 105 110 Tyr Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 57 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 57 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Tyr Ile Asp Glu Thr 20 25 30 Ala Val Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Gly Ile Gly Gly Gly Val Asp Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Arg Pro Gly Gln Pro Leu Ile Thr Ser Lys Val Ala Asp Leu 100 105 110 Tyr Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 58 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 58 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Tyr Ile Asp Glu Thr 20 25 30 Ala Val Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Gly Ile Gly Gly Gly Val Asp Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Arg Pro Gly Ser Pro Leu Ile Thr Ser Lys Val Ala Asp Leu 100 105 110 Tyr Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 59 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 59 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Tyr Ile Asp Glu Thr 20 25 30 Ala Val Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Gly Ile Gly Gly Gly Val Asp Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Arg Pro Gly Arg Glu Leu Ile Thr Ser Lys Val Ala Asp Leu 100 105 110 Tyr Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 60 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 60 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Tyr Ile Asp Glu Thr 20 25 30 Ala Val Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Gly Ile Gly Gly Gly Val Asp Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Arg Pro Gly Arg Gln Leu Ile Thr Ser Lys Val Ala Asp Leu 100 105 110 Tyr Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 61 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 61 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Tyr Ile Asp Glu Thr 20 25 30 Ala Val Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Gly Ile Gly Gly Gly Val Asp Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Arg Pro Gly Arg Ser Leu Ile Thr Ser Lys Val Ala Asp Leu 100 105 110 Tyr Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 62 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 62 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Tyr Ile Asp Glu Thr 20 25 30 Ala Val Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Gly Ile Gly Gly Gly Val Asp Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Arg Pro Gly Arg Pro Glu Ile Thr Ser Lys Val Ala Asp Leu 100 105 110 Tyr Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 63 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 63 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Tyr Ile Asp Glu Thr 20 25 30 Ala Val Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Gly Ile Gly Gly Gly Val Asp Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Arg Pro Gly Arg Pro Gly Ile Thr Ser Lys Val Ala Asp Leu 100 105 110 Tyr Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 64 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 64 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Tyr Ile Asp Glu Thr 20 25 30 Ala Val Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Gly Ile Gly Gly Gly Val Asp Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Arg Pro Gly Arg Pro Gln Ile Thr Ser Lys Val Ala Asp Leu 100 105 110 Tyr Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 65 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 65 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Tyr Ile Asp Glu Thr 20 25 30 Ala Val Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Gly Ile Gly Gly Gly Val Asp Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Arg Pro Gly Arg Pro Thr Ile Thr Ser Lys Val Ala Asp Leu 100 105 110 Tyr Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 66 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 66 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Tyr Ile Asp Glu Thr 20 25 30 Ala Val Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Gly Ile Gly Gly Gly Val Asp Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Arg Pro Gly Arg Pro Leu Ile Thr Glu Lys Val Ala Asp Leu 100 105 110 Tyr Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 67 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 67 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 10

Claims (47)

  1. 하기 구조를 포함하는 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염:
    VHH-L1-A-L2-B,
    VHH-L1-B-L2-A,
    A-L2-B-L1-VHH, 또는
    B-L2-A-L1-VHH,
    여기서 VHH는 서열식별번호:10, 11, 12 및 13으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이와 적어도 90% 서열 유사성을 갖는 서열을 포함하고,
    여기서 A는 서열식별번호:2, 5 및 8로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이와 적어도 90% 서열 유사성을 갖는 서열을 포함하는 릴랙신 A 쇄이고,
    여기서 B는 서열식별번호:3, 6 및 9로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이와 적어도 90% 서열 유사성을 갖는 서열을 포함하는 릴랙신 B 쇄이고,
    여기서 L1은
    (GGGGQ)n (서열식별번호:14),
    (PGPQ)n (서열식별번호:17) 및
    (PGPA)n (서열식별번호:18)
    으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 제1 링커이고, 여기서 n은 1 내지 10일 수 있고,
    여기서 L2는 서열식별번호:22, 23 및 67로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 제2 링커이다.
  2. 제1항에 있어서, A가 서열식별번호:2인 화합물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, B가 서열식별번호:3인 화합물.
  4. 제1항에 있어서, A가 서열식별번호:5인 화합물.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, B가 서열식별번호:6인 화합물.
  6. 제1항에 있어서, A가 서열식별번호:5이고 처음 4개의 아미노산을 갖지 않는 (desA1-4) 것인 화합물.
  7. 제1항에 있어서, B가 서열식별번호:6이고 첫 번째 아미노산을 갖지 않는 (desB1) 것인 화합물.
  8. 제1항에 있어서,
    A가 서열식별번호:5이고 처음 4개의 아미노산을 갖지 않고 (desA1-4),
    B가 서열식별번호:6이고 첫 번째 아미노산을 갖지 않는 (desB1) 것인
    화합물.
  9. 제1항에 있어서, A가 서열식별번호:8인 화합물.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, B가 서열식별번호:9인 화합물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, L1이 서열식별번호:19인 화합물.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, L1이 서열식별번호:20인 화합물.
  13. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, L1이 서열식별번호:21인 화합물.
  14. 서열식별번호:24 내지 39로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이와 적어도 90% 서열 유사성을 갖는 서열을 포함하는 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
  15. 서열식별번호:24 내지 39로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이와 적어도 90% 서열 유사성을 갖는 서열로 본질적으로 이루어진 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
  16. 서열식별번호:24 내지 39로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이와 적어도 90% 서열 유사성을 갖는 서열로 이루어진 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염; 및
    제약상 허용되는 완충제
    를 포함하는 제약 조성물.
  18. 유효량의 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 화합물 또는 제17항의 제약 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 심장, 폐 및/또는 신장 병태, 질환 및/또는 장애를 치료하는 방법.
  19. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 요법에 사용하기 위한 화합물.
  20. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 심장, 폐 및/또는 신장 병태, 질환 및/또는 장애를 치료하는데 사용하기 위한 화합물.
  21. 심장, 폐 및/또는 신장 병태, 질환 및/또는 장애를 치료하기 위한 의약을 제조하기 위한 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 화합물의 용도.
  22. Figure pct00144
    (서열식별번호:10)의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 90% 서열 유사성을 갖는 서열을 포함하는 화합물.
  23. Figure pct00145
    (서열식별번호:11)의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 90% 서열 유사성을 갖는 서열을 포함하는 화합물.
  24. Figure pct00146
    (서열식별번호:12)의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 90% 서열 유사성을 갖는 서열을 포함하는 화합물.
  25. Figure pct00147
    (서열식별번호:13)의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 90% 서열 유사성을 갖는 서열을 포함하는 화합물.
  26. Figure pct00148
    (서열식별번호:45)의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 90% 서열 유사성을 갖는 서열을 포함하는 화합물.
  27. Figure pct00149
    (서열식별번호:46)의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 90% 서열 유사성을 갖는 서열을 포함하는 화합물.
  28. Figure pct00150
    (서열식별번호:47)의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 90% 서열 유사성을 갖는 서열을 포함하는 화합물.
  29. Figure pct00151
    (서열식별번호:48)의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 90% 서열 유사성을 갖는 서열을 포함하는 화합물.
  30. Figure pct00152
    (서열식별번호:49)의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 90% 서열 유사성을 갖는 서열을 포함하는 화합물.
  31. Figure pct00153
    (서열식별번호:50)의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 90% 서열 유사성을 갖는 서열을 포함하는 화합물.
  32. Figure pct00154
    (서열식별번호:51)의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 90% 서열 유사성을 갖는 서열을 포함하는 화합물.
  33. Figure pct00155
    (서열식별번호:52)의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 90% 서열 유사성을 갖는 서열을 포함하는 화합물.
  34. Figure pct00156
    (서열식별번호:53)의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 90% 서열 유사성을 갖는 서열을 포함하는 화합물.
  35. Figure pct00157
    (서열식별번호:54)의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 90% 서열 유사성을 갖는 서열을 포함하는 화합물.
  36. Figure pct00158
    (서열식별번호:55)의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 90% 서열 유사성을 갖는 서열을 포함하는 화합물.
  37. Figure pct00159
    (서열식별번호:56)의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 90% 서열 유사성을 갖는 서열을 포함하는 화합물.
  38. Figure pct00160
    (서열식별번호:57)의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 90% 서열 유사성을 갖는 서열을 포함하는 화합물.
  39. Figure pct00161
    (서열식별번호:58)의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 90% 서열 유사성을 갖는 서열을 포함하는 화합물.
  40. Figure pct00162
    (서열식별번호:59)의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 90% 서열 유사성을 갖는 서열을 포함하는 화합물.
  41. Figure pct00163
    (서열식별번호:60)의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 90% 서열 유사성을 갖는 서열을 포함하는 화합물.
  42. Figure pct00164
    (서열식별번호:61)의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 90% 서열 유사성을 갖는 서열을 포함하는 화합물.
  43. Figure pct00165
    (서열식별번호:62)의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 90% 서열 유사성을 갖는 서열을 포함하는 화합물.
  44. Figure pct00166
    (서열식별번호:63)의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 90% 서열 유사성을 갖는 서열을 포함하는 화합물.
  45. Figure pct00167
    (서열식별번호:64)의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 90% 서열 유사성을 갖는 서열을 포함하는 화합물.
  46. Figure pct00168
    (서열식별번호:65)의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 90% 서열 유사성을 갖는 서열을 포함하는 화합물.
  47. Figure pct00169
    (서열식별번호:66)의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 90% 서열 유사성을 갖는 서열을 포함하는 화합물.
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