JP3014764B2 - アシル化インスリン - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、可溶性であり、且つ遅延型の活性プロフィ
ールを有する新規のヒトインスリン誘導体、かかる誘導
体の提供方法、それらを含む薬理組成物、及び糖尿病の
処置におけるかかるインスリンの利用に関する。

発明の背景 多くの糖尿病患者は、食事に関係する必要条件をカバ
ーするため、即効性インスリンのボーラス注射により補
給される基底Ｘ要条件をカバーする遅延型インスリンの
１又は２回の日常注射を含んで成る療法での複数回の日
常のインスリン注射で処置される。

遅延型インスリン組成物は当業界において公知であ
る。即ち、遅延型インスリン組成物の一の主要タイプは
結晶インスリン又はアモルファスインスリンの注射用水
性懸濁物を含んで成る。これらの組成物において、利用
されるインスリン化合物は一般にプロタミンインスリ
ン、亜鉛インスリン又はプロタミン亜鉛インスリンであ
る。

インスリン懸濁物の利用には所定の欠点がある。即
ち、正確な投与量を保障するため、所定容量のこの懸濁
物をバイアルから抜き取る又はカートリッジから押し出
す前にインスリン粒子をゆっくりと振盪させることによ
って均質に懸濁しておかねばならない。また、インスリ
ン懸濁物の保存のためには、凝塊の形成又は凝集を避け
るため、インスリン溶液よりも幅の狭い域値内に温度を
保たねばならない。

プロタミンは当初は非免疫原であると信じられていた
が、しかし現在ではプロタミンはヒトにおいて免疫原で
ありうる、また医療目的のためのその用途は抗体の形成
を招きうるものと明らかとなった（Samuelら、Studies
on the immunogenecity of protamines in humans and
experimental animals by means of a micro−compleme
nt fixation tesr,Clin.Exp.lmmunol.33,pp252−260（1
988））。

また、プロタミン−インスリン複合体はそれ自体免疫
原であることがわかった（Kurtzら、Circulating IgG a
ntibody to protamine in patients treated with prot
amine−insulins,Diabetologica25,pp322−324（198
3））。従って、一部の患者については、プロタミン含
有インスリン組成物の使用は避けねばならない。

別のタイプの遅延型インスリン組成物は生理学的pHよ
り低いpH値を有する溶液であり、その溶液を注射したと
きのpH値の上昇を理由に、インスリンはその溶液から沈
殿し出す。このような溶液の欠点は、注射により組織の
中で形成される沈殿物の粒度分布、そしてそれ故薬物治
療のタイミングが、注射部位の血流及びその他のやや予
測できない状況のパラメーターに依存する点にある。更
なる欠点は、インスリンの固体粒子が注射部位において
組織炎症を引き起こす局所刺激物として作用しうること
にある。

WO91/12817（Novo Nordisk A/S）はコバルト（III）
のインスリン複合体を含んで成る遅延型可溶性インスリ
ン組成物を開示する。これらの複合体の遅延性はほんの
中間的であり、そしてその生物学的利用能は低い。

ヒトインスリンは３個の第一アミノ基を有する:A−鎖
及びＢ−鎖のＮ−末端基並びにLys^B29のε−アミノ基。
これらの一又は複数の基において置換されているいくつ
かのインスリン誘導体が従来技術において知られてい
る。即ち、米国特許第3,528,960（Eli Lilly）はＮ−カ
ルボキシアロイルインスリンであって、そのインスリン
分子の1,2又は３個の第一アミノ基がカルボキシアロイ
ル基を有するインスリンに関する。具体的なＮ^εB29置
換化インスリンは開示されていない。

GB特許第1,492,997号（Nat.Res.Dev.Corp.）によれ
ば、Ｎ^εB29においてカルバミル置換を有するインスリ
ンは向上した低血糖作用プロフィールを有する。

日本特許公開公報第１−254699の（Kodama Co.,Lt
d.）は、脂肪酸がPhe^B1のアミノ基に、もしくはLys^B29
のε−アミノ基に、又はその両者に結合しているインス
リンを開示する。その誘導化の記述の目的は、薬理学的
に許容される安定なインスリン製剤の獲得にある。

B30において、ヌクレオチドトリプレットにより必ず
しもコードされない少なくとも５個の炭素原子を有する
アミノ酸を有するインスリンが日本国特許公開公報第57
−067,548号（Shionogi）に記載されている。そのイン
スリン類似体は真性糖尿病、特にウシ又はブタインスリ
ン抗体の発生によりインスリン耐性となっている患者の
真性糖尿病の処置において有用であると主張されてい
る。

本明細書で用いている「インスリン誘導体」とは、ヒ
トインスリンの分子構造と類似のそれを有し、Cys^A7とC
ys^B7との間及びCys^A20とCys^B19との間にジスルフィド架
橋を、そしてCys^A6とCys^A11との間に内部ジスルフィド
架橋を有し、更にインスリン活性を有する化合物を意味
する。

ところで、可溶性であり、且つ注射を経た後に溶液の
中に残り、そして最少限の炎症及び免疫原特性をもつイ
ンスリンを含む遅延型注射用インスリン組成物について
の要望がまだある。

本発明の一の目的は、遅延型の活性プロフィールをも
ち、生理学的pH値において可溶性であるヒトインスリン
誘導体を提供することにある。

本発明の別の目的は、本発明に係るヒトインスリン誘
導体を含んで成る薬理組成物の提供にある。

本発明の更なる目的は、本発明のヒトインスリン誘導
体を作るための方法の提供にある。

発明の概要 驚くべきことに、Lys^B29のε−アミノ基が親油性置換
基を有している一定のヒトインスリン誘導体は遅延型の
活性プロフィールを有し、且つ生理学的pH値において可
溶性であることが明らかにされた。

従って、最も広い観点において、本発明は以下の配列
を有するインスリン誘導体： （式中、 A21及びB3位にあるXaaは独立して、Lys,Arg及びCysを
除く、遺伝子コードによりコードされうる任意のアミノ
酸残基であり;B1位にあるXaaはPheであるか又は欠失し
ており;B30位にあるXaaは（ａ）10〜24個の炭素原子を
有するコードされ得ない親油性アミノ酸、この場合５個
までの炭素原子を有するカルボン酸のアシル基がLys^B29
のε−アミノ基に結合している、（ｂ）Lys,Arg及びCys
を除く、遺伝子コードによりコードされうる任意のアミ
ノ酸残基、この場合、Lys^B29のε−アミノ基は親油性置
換基を有する、又は（ｃ）欠失している、この場合、Ly
s^B29のε−アミノ基は親油性置換基を有する）及びその
任意のZn²⁺複合体に関し、ただしB30位にあるXaaがThr
又はAla,A21及びB3位にあるXaaが共にAsn、そしてB1位
にあるXaaがPheであるとき、このインスリン誘導体はZn
²⁺複合体となっている。

一の好適な態様において、本発明は、B30アミノ酸残
基が欠失しているか、又はLys,Arg及びCysを除く遺伝子
コードによってコードされうる任意のアミノ酸残基であ
り;A21及びB3アミノ酸残基が独立して、Lys,Arg及びCys
を除く遺伝子コードによりコードされうる任意のアミノ
酸残基であり;Phe^B1が欠失していてよく;Lys^B29ε−ア
ミノ基が少なくとも６個の炭素原子を含んで成る親油性
置換基を有し；そして２〜４個のZn²⁺イオンが各インス
リンヘキサマーに結合していることのあるヒトインスリ
ン誘導体に関連し、ただしB30がThr又はAlaであり、そ
してA21及びB3が共にAsnであり、そしてPhe^B1が欠失し
ていないとき、２〜４個のZn²⁺イオンがこのインスリン
誘導体の各ヘキサマーに結合している。

別の好適な態様において、本発明は、B30アミノ酸残
基が欠失しているか又はLys,Arg及びCysを除く遺伝子コ
ードによりコードされうる任意のアミノ酸残基であり;A
21及びB3アミノ酸残基が独立してLys,Arg及びCysを除く
遺伝子コードによりコードされうる任意のアミノ酸残基
であり、ただしB30アミノ酸残基がAla又はThrなら、残
基A21及びB3の少なくとも一方が、Asn以外のものであ
り;Phe^B1が欠失していてよく；そしてLys^B29のε−アミ
ノ基が少なくとも６個の炭素原子を含んで成る親油性置
換基であるヒトインスリン誘導体に関する。

別の好適な態様において、本発明は、B30アミノ酸残
基が欠失しているか又はLys,Arg及びCysを除く遺伝子コ
ードによりコードされうる任意のアミノ酸残基であり;A
21及びB3アミノ酸残基が独立してLys,Arg及びCysを除く
遺伝子コードによりコードされうる任意のアミノ酸残基
であり;Phe^B1が欠失してよく;Lys^B29のε−アミノ基が
少なくとも６個の炭素原子を含んで成る親油性置換基で
あり；そして２〜４個のZn²⁺イオンが各インスリン亢量
体に結合している、ヒトインスリン誘導体に関する。

別の好適な態様において、本発明はB30アミノ酸残基
が欠失しているヒトインスリン誘導体に関する。

別の好適な態様において、本発明はB30アミノ酸残基
がApsであるヒトインスリン誘導体に関する。

別の好適な態様において、本発明はB30アミノ酸残基
がGluであるヒトインスリン誘導体に関する。

別の好適な態様において、本発明はB30アミノ酸残基
がThrであるヒトインスリン誘導体に関する。

別の好適な態様において、本発明はB30アミノ酸残基
が少なくとも10個の炭素原子を有する親油性アミノ酸で
あるヒトインスリン誘導体に関する。

別の好適な態様において、本発明はB30アミノ酸が10
〜24個の炭素原子を有する親油性α−アミノ酸であるヒ
トインスリン誘導体に関する。

別の好適な態様において、本発明はB30アミノ酸が10
〜24個の炭素原子を有する直鎖・飽和・脂肪族α−アミ
ノ酸であるヒトインスリン誘導体に関する。

別の好適な態様において、本発明はB30アミノ酸がＤ
−又はＬ−Ｎ^ε−ドデカノイルリジンであるヒトインス
リン誘導体に関する。

別の好適な態様において、本発明はB30アミノ酸がα
−アミノデカノン酸であるヒトインスリン誘導体に関す
る。

別の好適な態様において、本発明はB30アミノ酸がα
−アミノウンデカノン酸であるヒトインスリン誘導体に
関する。

別の好適な態様において、本発明はB30アミノ酸がα
−アミノドデカノン酸であるヒトインスリン誘導体に関
する。

別の好適な態様において、本発明はB30アミノ酸がα
−アミノトリデカノン酸であるヒトインスリン誘導体に
関する。

別の好適な態様において、本発明はB30アミノ酸がα
−アミノテトラデカノン酸であるヒトインスリン誘導体
に関する。

別の好適な態様において、本発明はB30アミノ酸がα
−アミノペンタデカノン酸であるヒトインスリン誘導体
に関する。

別の好適な態様において、本発明はB30アミノ酸がα
−アミノヘキサデカノン酸であるヒトインスリン誘導体
に関する。

別の好適な態様において、本発明はB30アミノ酸がα
−アミノ酸であるヒトインスリン誘導体に関する。

別の好適な態様において、本発明はA21アミノ酸がAla
であるヒトインスリン誘導体に関する。

別の好適な態様において、本発明はA21アミノ酸がGln
であるヒトインスリン誘導体に関する。

別の好適な態様において、本発明はA21アミノ酸がGly
であるヒトインスリン誘導体に関する。

別の好適な態様において、本発明はA21アミノ酸がSer
であるヒトインスリン誘導体に関する。

別の好適な態様において、本発明はB3アミノ酸がAsp
であるヒトインスリン誘導体に関する。

別の好適な態様において、本発明はB3アミノ酸がGln
であるヒトインスリン誘導体に関する。

別の好適な態様において、本発明はB3アミノ酸がThr
であるヒトインスリン誘導体に関する。

別の好適な態様において、本発明はLys^B29のε−アミ
ノ基が少なくとも６個の炭素原子を有するカルボン酸に
対応するアシル基である親油性置換基を有するヒトイン
スリン誘導体に関する。

別の好適な態様において、本発明はLys^B29のε−アミ
ノ基が８〜12原子長の炭素鎖を有するカルボン酸に対応
する枝分れした又は枝分れしていないアシル基である親
油性置換基を有するヒトインスリン誘導体に関する。

別の好適な態様において、本発明はLys^B29のε−アミ
ノ基が少なくとも６個の炭素原子を有する脂肪酸に対応
するアシル基である親油性置換基を有するヒトインスリ
ン誘導体に関する。

別の好適な態様において、本発明はLys^B29のε−アミ
ノ基が６〜24個の炭素原子を有する直鎖・飽和カルボン
酸に対応するアシル基である親油性置換基を有するヒト
インスリン誘導体に関する。

別の好適な態様において、本発明はLys^B29のε−アミ
ノ基が８〜24個の炭素原子を有する直鎖・飽和カルボン
酸に対応するアシル基である親油性置換基を有するヒト
インスリン誘導体に関する。

別の好適な態様において、本発明はLys^B29のε−アミ
ノ基が10〜16個の炭素原子を有する直鎖・飽和カルボン
酸に対応するアシル基である親油性置換基を有するヒト
インスリン誘導体に関する。

別の好適な態様において、本発明はLys^B29のε−アミ
ノ基が10個まで、好ましくは５個までのオキシエチレン
単位を含んで成るオリゴオキシエチレン基である親油性
置換基を有するヒトインスリン誘導体に関する。

別の好適な態様において、本発明はLys^B29のε−アミ
ノ基が10個まで、好ましくは５個までのオキシプロピレ
ン単位を含んで成るオリゴノキシプロピレン基である親
油性置換基を有するヒトインスリン誘導体に関する。

別の好適な態様において、本発明は各インスリンヘキ
サマーが２個のZn²⁺イオンと結合しているヒトインスリ
ン誘導体に関する。

別の好適な態様において、本発明は各インスリンヘキ
サマーが３個のZn²⁺イオンと結合しているヒトインスリ
ン誘導体に関する。

別の好適な態様において、本発明は各インスリンヘキ
サマーが４個のZn²⁺イオンと結合しているヒトインスリ
ン誘導体に関する。

別の好適な態様において、本発明は糖尿病を処置する
ための医薬品の調製のための本発明に係るヒトインスリ
ン誘導体の利用に関する。

別の好適な態様において、本発明は、治療的に有効な
量の本発明に係るヒトインスリン誘導体を薬理学的に許
容される担体と共に含んで成る糖尿病の処置を必要とす
る患者のかかる処置のための薬理組成物に関する。

別の好適な態様において、本発明は、治療的に有効な
量の本発明に係るヒトインスリン誘導体を、即効性を有
するインスリン又はインスリン類似体と混合されて、薬
理学的に許容される担体と共に含んで成る糖尿病の処置
を必要とする患者のかかる処置のための薬理組成物に関
する。

別の好適な態様において、本発明は、生理学的pH値に
おいて可溶性である本発明に係るヒトインスリン誘導体
を含んで成る薬理組成物に関する。

別の好適な態様において、本発明は約6.5〜約8.5の間
隔の中のpH値において可溶性である本発明に係るヒトイ
ンスリン誘導体を含んで成る組成物に関する。

別の好適な態様において、本発明は、本発明に係るヒ
トインスリン誘導体を含んで成る遅延型薬理組成物に関
する。

別の好適な態様において、本発明は、約120nmol/ml〜
約1200nmol/ml、好ましくは約600nmol/mlの本発明に係
るヒトインスリン誘導体を含む溶液である薬理組成物に
関する。

別の好適な態様において、本発明は、治療的に有効な
量の本発明に係るインスリン誘導体を薬理学的に許容さ
れる担体と共に糖尿病の処置を必要とする患者に投与す
ることを含んで成る、かかる処置を必要とする患者の糖
尿病の処置のための方法に関する。

別の好適な態様において、本発明は、治療的に有効な
量の本発明に係るインスリン誘導体を、即効性を有する
インスリン又はインスリン類似体と混合して、薬理学的
に許容される担体と共に、糖尿病の処置を必要とする患
者に投与することを含んで成る、かかる処置を必要とす
る患者の糖尿病の処置のための方法に関する。

Zn²⁺イオンが結合していない本発明に係る好適なヒト
インスリン誘導体の例は以下の通りである： Ｎ^εB29−トリデカノイル デス（B30）ヒトインスリ
ン、 Ｎ^εB29−テトラデカノイル デス（B30）ヒトインス
リン、 Ｎ^εB29−デカノイル デス（B30）ヒトインスリン、 Ｎ^εB29−ドデカノイル デス（B30）ヒトインスリ
ン、 Ｎ^εB29−トリデカノイルGly^A21デス（B30）ヒトイン
スリン、 Ｎ^εB29−テトラデカノイルGly^A21デス（B30）ヒトイ
ンスリン、 Ｎ^εB29−デカノイルGly^A21デス（B30）ヒトインスリ
ン、 Ｎ^εB29−ドデカノイルGly^A21デス（B30）ヒトインス
リン、 Ｎ^εB29−トリデカノイルGly^A21Gln^B3デス（B30）ヒ
トインスリン、 Ｎ^εB29−テトラデカノイルGly^A21Gln^B3デス（B30）
ヒトインスリン、 Ｎ^εB29−デカノイルGly^A21Gln^B3デス（B30）ヒトイ
ンスリン、 Ｎ^εB29−ドデカノイルGly^A21Gln^B3デス（B30）ヒト
インスリン、 Ｎ^εB29−トリデカノイルAla^A21デス（B30）ヒトイン
スリン、 Ｎ^εB29−テトラデカノイルAla^A21デス（B30）ヒトイ
ンスリン、 Ｎ^εB29−デカノイルAla^A21デス（B30）ヒトインスリ
ン、 Ｎ^εB29−ドデカノイルAla^A21デス（B30）ヒトインス
リン、 Ｎ^εB29−トリデカノイルAla^A21Gln^B3デス（B30）ヒ
トインスリン、 Ｎ^εB29−テトラデカノイルAla^A21Gln^B3デス（B30）
ヒトインスリン、 Ｎ^εB29−デカノイルAla^A21Gln^B3デス（B30）ヒトイ
ンスリン、 Ｎ^εB29−ドデカノイルAla^A21Gln^B3デス（B39）ヒト
インスリン、 Ｎ^εB29−トリデカノイルGln^B3デス（B30）ヒトイン
スリン、 Ｎ^εB29−テトラデカノイルGln^B3デス（B30）ヒトイ
ンスリン、 Ｎ^εB29−デカノイルGln^B3デス（B30）ヒトインスリ
ン、 Ｎ^εB29−ドデカノイルGln^B3デス（B30）ヒトインス
リン、 Ｎ^εB29−トリデカノイルGly^A21ヒトインスリン、 Ｎ^εB29−テトラデカノイルGly^A21ヒトインスリン、 Ｎ^εB29−デカノイルGly^A21ヒトインスリン、 Ｎ^εB29−ドデカノイルGly^A21ヒトインスリン、 Ｎ^εB29−トリデカノイルGly^A21Gln^B3ヒトインスリ
ン、 Ｎ^εB29−テトラデカノイルGly^A21Gln^B3ヒトインスリ
ン、 Ｎ^εB29−デカノイルGly^A21Gln^B3ヒトインスリン、 Ｎ^εB29−ドデカノイルGly^A21Gln^B3ヒトインスリン、 Ｎ^εB29−トリデカノイルAla^A21ヒトインスリン、 Ｎ^εB29−テトラデカノイルAla^A21ヒトインスリン、 Ｎ^εB29−デカノイルAla^A21ヒトインスリン、 Ｎ^εB29−ドデカノイル、Ala^A21ヒトインスリン、 Ｎ^εB29−トリデカノイルAla^A21Gln^B3ヒトインスリ
ン、 Ｎ^εB29−テトラデカノイルAla^A21Gln^B3ヒトインスリ
ン、 Ｎ^εB29−デカノイルAla^A21Gln^B3ヒトインスリン、 Ｎ^εB29−ドデカノイルAla^A21Gln^B3ヒトインスリン、 Ｎ^εB29−トリデカノイルGln^B3ヒトインスリン、 Ｎ^εB29−テトラデカノイルGln^B3ヒトインスリン、 Ｎ^εB29−デカノルGln^B3ヒトインスリン、 Ｎ^εB29−ドデカノイルGln^B3ヒトインスリン、 Ｎ^εB29−トリデカノイルGlu^B30ヒトインスリン、 Ｎ^εB29−テトラデカノイルGlu^B30ヒトインスリン、 Ｎ^εB29−デカノイルGlu^B30ヒトインスリン、 Ｎ^εB29−ドデカノイルGlu^B30ヒトインスリン、 Ｎ^εB29−トリデカノイルGly^A21Glu^B30ヒトインスリ
ン、 Ｎ^εB29−テトラデカノイルGly^A21Glu^B30ヒトインス
リン、 Ｎ^εB29−デカノイルGly^A21Glu^B30ヒトインスリン、 Ｎ^εB29−ドデカノイルGly^A21Glu^B30ヒトインスリ
ン、 Ｎ^εB29−トリデカノイルGly^A21Gln^B3Glu^B30ヒトイン
スリン、 Ｎ^εB29−テトラデカノイルGly^A21Gln^B3Glu^B30ヒトイ
ンスリン、 Ｎ^εB29−デカノイルGly^A21Gln^B3Glu^B30ヒトインスリ
ン、 Ｎ^εB29−ドデカノイルGly^A21Gln^B3Glu^B30ヒトインス
リン、 Ｎ^εB29−トリデカノイルAla^A21Glu^B30ヒトインスリ
ン、 Ｎ^εB29−テトラデカノイルAla^A21Glu^B30ヒトインス
リン、 Ｎ^εB29−デカノイルAla^A21Glu^B30ヒトインスリン、 Ｎ^εB29−ドデカノイルAla^A21Glu^B30ヒトインスリ
ン、 Ｎ^εB29−トリデカノイルAla^A21Gln^B3Glu^B30ヒトイン
スリン、 Ｎ^εB29−テトラデカノイルAla^A21Gln^B3Glu³⁰ヒトイ
ンスリン、 Ｎ^εB29−デカノイルAla^A12Gln^B3Glu^B30ヒトインスリ
ン、 Ｎ^εB29−ドデカノイルAla^A21Gln^B3Glu^B30ヒトインス
リン、 Ｎ^εB29−トリデカノイルGln^B3Glu^B30ヒトインスリ
ン、 Ｎ^εB29−テトラデカノイルGln^B3Glu^B30ヒトインスリ
ン、 Ｎ^εB29−デカノイルGln^B3Glu^B30ヒトインスリン、及
び Ｎ^εB29−ドデカノイルGln^B3Glu^B30ヒトインスリン。

２個のZn²⁺イオンが一のインスリンヘキサマー当りに
結合している本発明に係る好適なヒトインスリン誘導体
の例は以下の通りである： （Ｎ^εB29−トリデカノイル デス（B30）ヒトインス
リン）₆,2Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−テトラデカノイル デス（B30）ヒトイン
スリン）₆,2Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−デカノイル デス（B30）ヒトインスリ
ン）₆,2Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−ドデカノイル デス（B30）ヒトインスリ
ン）₆,2Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−トリデカノイルGly^A21デス（B30）ヒトイ
ンスリン）₆,2Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−テトラデカノイルGly^A21デス（B30）ヒト
インスリン）₆,2Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−デカノイルGly^A21デス（B30）ヒトインス
リン）₆,2Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−ドデカノイルGly^A21デス（B30）ヒトイン
スリン）₆,2Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−トリデカノイルGly^A21Gln^B3デス（B30）
ヒトインスリン）₆,2Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−テトラデカノイルGly^A21Gln^B3デス（B3
0）ヒトインスリン）₆,2Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−デカノイルGly^A21Gln^B3デス（B30）ヒト
インスリン）₆,2Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−ドデカノイルGly^A21Gln^B3デス（B30）ヒ
トインスリン）₆,2Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−トリデカノイルAla^A21デス（B30）ヒトイ
ンスリン）₆,2Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−テトラデカノイルAla^A21デス（B30）ヒト
インスリン）₆,2Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−デカノイルAla^A21デス（B30）ヒトインス
リン）₆,2Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−ドデカノイルAla^A21デス（B30）ヒトイン
スリン）₆,2Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−トリデカノイルAla^A21Gln^B3デス（B30）
ヒトインスリン）₆,2Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−テトラデカノイルAla^A21Gln^B3デス（B3
0）ヒトインスリン）₆,2Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−デカノイルAla^A21Gln^B3デス（B30）ヒト
インスリン）₆,2Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−ドデカノイルAla^A21Gln^B3デス（B30）ヒ
トインスリン）₆,2Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−トリデカノイルGln^B3デス（B30）ヒトイ
ンスリン）₆,2Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−テトラデカノイルGln^B3デス（B30）ヒト
インスリン）₆,2Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−デカノイルGln^B3デス（B30）ヒトインス
リン）₆,2Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−ドデカノイルGln^B3デス（B30）ヒトイン
スリン）₆,2Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−トリデカノイル ヒトインスリン）₆,2Zn
²⁺、 （Ｎ^εB29−テトラデカノイル ヒトインスリン）₆,2
Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−デカノイル ヒトインスリン）₆,2Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−ドデカノイル ヒトインスリン）₆,2Z
n²⁺、 （Ｎ^εB29−トリデカノイルGly^A21ヒトインスリ
ン）₆,2Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−テトラデカノイルGly^A21ヒトインスリ
ン）₆,2Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−デカノイルGly^A21ヒトインスリン）₆,2Zn
²⁺、 （Ｎ^εB29−ドデカノイルGly^A21ヒトインスリン）₆,2
Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−トリデカノイルGly^A21Gln^B3ヒトインスリ
ン）₆,2Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−テトラデカノイルGly^A21Gln^B3ヒトインス
リン）₆,2Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−デカノイルGly^A21Gln^B3ヒトインスリン）
₆,2Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−ドデカノイルGly^A21Gln^B3ヒトインスリ
ン）₆,2Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−トリデカノイルAla^A21ヒトインスリ
ン）₆,2Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−テトラデカノイルAla^A21ヒトインスリ
ン）₆,2Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−デカノイルAla^A21ヒトインスリン）₆,2Zn
²⁺、 （Ｎ^εB29−ドデカノイルAla^A21ヒトインスリン）₆,2
Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−トリデカノイルAla^A21Gln^B3ヒトインスリ
ン）₆,2Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−テトラデカノイルAla^A21Gln^B3ヒトインス
リン）₆,2Zn²⁺、 （ ²⁹−デカノイルAla^A21Gln^B3ヒトインスリ
ン）₆,2Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−ドデカノイルAla^A21Gln^B3ヒトインスリ
ン）₆,2Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−トリデカノイルGln^B3ヒトインスリン）₆,
2Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−テトラデカノイルGln^B3ヒトインスリン）
₆,2Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−デカノイルGln^B3ヒトインスリン）₆,2Zn
²⁺、 （Ｎ^εB29−ドデカノイルGln^B3ヒトインスリン）₆,2Z
n²⁺、 （Ｎ^εB29−トリデカノイルGlu^B30ヒトインスリ
ン）₆,2Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−テトラデカノイルGlu^B30ヒトインスリ
ン）₆,2Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−デカノイルGlu^B30ヒトインスリン）₆,2Zn
²⁺、 （Ｎ^εB29−ドデカノイルGlu^B30ヒトインスリン）₆,2
Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−トリデカノイルGly^A21Glu^B30ヒトインス
リン）₆,2Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−テトラデカノイルGly^A21Glu^B30ヒトイン
スリン）₆,2Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−デカノイルGly^A21Glu^B30ヒトインスリ
ン）₆,2Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−ドデカノイルGly^A21Glu^B30ヒトインスリ
ン）₆,2Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−トリデカノイルGly^A21Gln^B3Glu^B30ヒトイ
ンスリン）₆,2Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−テトラデカノイルGly^A21Gln^B3Glu^B30ヒト
インスリン）₆,2Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−デカノイルGly^A21Gln^B3Glu^B30ヒトインス
リン）₆,2Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−ドデカノイルGly^A21Gln^B3Glu^B30ヒトイン
スリン）₆,2Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−トリデカノイルAla^A21Glu^B30ヒトインス
リン）₆,2Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−テトラデカノイルAla^A21Glu^B30ヒトイン
スリン）₆,2Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−デカノイルAla^A21Glu^B30ヒトインスリ
ン）₆,2Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−ドデカノイルAla^A21Glu^B30ヒトインスリ
ン）₆,2Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−トリデカノイルAla^A21Gln^B3Glu^B30ヒトイ
ンスリン）₆,2Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−テトラデカノイルAla^A21Gln^B3Glu^B30ヒト
インスリン）₆,2Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−デカノイルAla^A21Gln^B3Glu^B30ヒトインス
リン）₆,2Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−ドデカノイルAla^A21Gln^B3Glu^B30ヒトイン
スリン）₆,2Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−トリデカノイルGln^B3Glu^B30ヒトインスリ
ン）₆,2Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−テトラデカノイルGln^B3Glu^B30ヒトインス
リン）₆,2Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−デカノイルGln^B3Glu^B30ヒトインスリン）
₆,2Zn²⁺及び （Ｎ^εB29−ドデカノイルGln^B3Glu^B30ヒトインスリ
ン）₆,2Zn²⁺。

３個のZn²⁺イオンが一のインスリンヘキサマー当りに
結合している本発明に係る好適なヒトインスリン誘導体
の例は以下の通りである： （Ｎ^εB29−トリデカノイル デス（B30）ヒトインス
リン）₆,3Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−テトラデカノイル デス（B30）ヒトイン
スリン）₆,3Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−デカノイル デス（B30）ヒトインスリ
ン）₆,3Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−ドデカノイル デス（B30）ヒトインスリ
ン）₆,3Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−トリデカノイルGly^A21デス（B30）ヒトイ
ンスリン）₆,3Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−テトラデカノイルGly^A21デス（B30）ヒト
インスリン）₆,3Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−デカノイルGly^A21デス（B30）ヒトインス
リン）₆,3Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−ドデカノイルGly^A21デス（B30）ヒトイン
スリン）₆,3Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−トリデカノイルGly^A21Gln^B3デス（B30）
ヒトインスリン）₆,3Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−テトラデカノイルGly^A21Gln^B3デス（B3
0）ヒトインスリン）₆,3Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−デカノイルGly^A21Gln^B3デス（B30）ヒト
インスリン）₆,3Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−ドデカノイルGly^A21Gln^B3デス（B30）ヒ
トインスリン）₆,3Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−トリデカノイルAla^A21デス（B30）ヒトイ
ンスリン）₆,3Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−テトラデカノイルAla^A21デス（B30）ヒト
インスリン）₆,3Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−デカノイルAla^A21デス（B30）ヒトインス
リン）₆,3Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−ドデカノイルAla^A21デス（B30）ヒトイン
スリン）₆,3Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−トリデカノイルAla^A21Gln^B3デス（B30）
ヒトインスリン）₆,3Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−テトラデカノイルAla^A21Gln^B3デス（B3
0）ヒトインスリン）₆,3Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−デカノイルAla^A21Gln^B3デス（B30）ヒト
インスリン）₆,3Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−ドデカノイルAla^A21Gln^B3デス（B30）ヒ
トインスリン）₆,3Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−トリデカノイルGln^B3デス（B30）ヒトイ
ンスリン）₆,3Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−テトラデカノイルGln^B3デス（B30）ヒト
インスリン）₆,3Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−デカノイルGln^B3デス（B30）ヒトインス
リン）₆,3Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−ドデカノイルGln^B3デス（B30）ヒトイン
スリン）₆,3Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−トリデカノイル ヒトインスリン）₆,3Zn
²⁺、 （Ｎ^εB29−テトラデカノイル ヒトインスリン）₆,3
Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−デカノイル ヒトインスリン）₆,3Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−ドデカノイル ヒトインスリン）₆,3Z
n²⁺、 （Ｎ^εB29−トリデカノイルGly^A21ヒトインスリ
ン）₆,3Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−テトラデカノイルGly^A21ヒトインスリ
ン）₆,3Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−デカノイルGly^A21ヒトインスリン）₆,3Zn
²⁺、 （Ｎ^εB29−ドデカノイルGly^A21ヒトインスリン）₆,3
Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−トリデカノイルGly^A21Gln^B3ヒトインスリ
ン）₆,3Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−テトラデカノイルGly^A21Gln^B3ヒトインス
リン）₆,3Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−デカノイルGly^A21Gln^B3ヒトインスリン）
₆,3Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−ドデカノイルGly^A21Gln^B3ヒトインスリ
ン）₆,3Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−トリデカノイルAla^A21ヒトインスリ
ン）₆,3Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−テトラデカノイルAla^A21ヒトインスリ
ン）₆,3Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−デカノイルAla^A21ヒトインスリン）₆,3Zn
²⁺、 （Ｎ^εB29−ドデカノイルAla^A21ヒトインスリン）₆,3
Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−トリデカノイルAla^A21Gln^B3ヒトインスリ
ン）₆,3Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−テトラデカノイルAla^A21Gln^B3ヒトインス
リン）₆,3Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−デカノイルAla^A21Gln^B3ヒトインスリン）
₆,3Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−ドデカノイルAla^A21Gln^B3ヒトインスリ
ン）₆,3Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−トリデカノイルGln^B3ヒトインスリン）₆,
3Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−テトラデカノイルGln^B3ヒトインスリン）
₆,3Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−デカノイルGln^B3ヒトインスリン）₆,3Zn
²⁺、 （Ｎ^εB29−ドデカノイルGln^B3ヒトインスリン）₆,3Z
n²⁺、 （Ｎ^εB29−トリデカノイルGlu^B30ヒトインスリ
ン）₆,3Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−テトラデカノイルGlu^B30ヒトインスリ
ン）₆,3Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−デカノイルGlu^B30ヒトインスリン）₆,3Zn
²⁺、 （Ｎ^εB29−ドデカノイルGlu^B30ヒトインスリン）₆,3
Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−トリデカノイルGly^A21Glu^B30ヒトインス
リン）₆,3Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−テトラデカノイルGly^A21Glu^B30ヒトイン
スリン）₆,3Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−デカノイルGly^A21Glu^B30ヒトインスリ
ン）₆,3Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−ドデカノイルGly^A21Glu^B30ヒトインスリ
ン）₆,3Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−トリデカノイルGly^A21Gln^B3Glu^B30ヒトイ
ンスリン）₆,3Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−テトラデカノイルGly^A21Gln^B3Glu^B30ヒト
インスリン）₆,3Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−デカノイルGly^A21Gln^B3Glu^B30ヒトインス
リン）₆,3Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−ドデカノイルGly^A21Gln^B3Glu^B30ヒトイン
スリン）₆,3Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−トリデカノイルAla^A21Glu^B30ヒトインス
リン）₆,3Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−テトラデカノイルAla^A21Glu^B30ヒトイン
スリン）₆,3Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−デカノイルAla^A21Glu^B30ヒトインスリ
ン）₆,3Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−ドデカノイルAla^A21Glu^B30ヒトインスリ
ン）₆,3Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−トリデカノイルAla^A21Gln^B3Glu^B30ヒトイ
ンスリン）₆,3Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−テトラデカノイルAla^A21Gln^B3Glu^B30ヒト
インスリン）₆,3Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−デカノイルAla^A21Gln^B3Glu^B30ヒトインス
リン）₆,3Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−ドデカノイルAla^A21Gln^B3Glu^B30ヒトイン
スリン）₆,3Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−トリデカノイルGln^B3Glu^B30ヒトインスリ
ン）₆,3Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−テトラデカノイルGln^B3Glu^B30ヒトインス
リン）₆,3Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−デカノイルGln^B3Glu^B30ヒトインスリン）
₆,3Zn²⁺及び （Ｎ^εB29−ドデカノイルGln^B3Glu^B30ヒトインスリ
ン）₆,3Zn²⁺。

４個のZn²⁺イオンがこのインスリンヘキサマー当りに
結合している本発明に係る好適なヒトインスリン誘導体
の例は以下の通りである： （Ｎ^εB29−トリデカノイル デス（B30）ヒトインス
リン）₆,4Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−テトラデカノイル デス（B30）ヒトイン
スリン）₆,4Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−デカノイル デス（B30）ヒトインスリ
ン）₆,4Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−ドデカノイル デス（B30）ヒトインスリ
ン）₆,4Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−トリデカノイルGly^A21デス（B30）ヒトイ
ンスリン）₆,4Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−テトラデカノイルGly^A21デス（B30）ヒト
インスリン）₆,4Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−デカノイルGly^A21デス（B30）ヒトインス
リン）₆,4Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−ドデカノイルGly^A21デス（B30）ヒトイン
スリン）₆,4Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−トリデカノイルGly^A21Gln^B3デス（B30）
ヒトインスリン）₆,4Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−テトラデカノイルGly^A21Gln^B3デス（B3
0）ヒトインスリン）₆,4Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−デカノイルGly^A21Gln^B3デス（B30）ヒト
インスリン）₆,4Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−ドデカノイルGly^A21Gln^B3デス（B30）ヒ
トインスリン）₆,4Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−トリデカノイルAla^A21デス（B30）ヒトイ
ンスリン）₆,4Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−テトラデカノイルAla^A21デス（B30）ヒト
インスリン）₆,4Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−デカノイルAla^A21デス（B30）ヒトインス
リン）₆,4Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−ドデカノイルAla^A21デス（B30）ヒトイン
スリン）₆,4Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−トリデカノイルAla^A21Gln^B3デス（B30）
ヒトインスリン）₆,4Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−テトラデカノイルAla^A21Gln^B3デス（B3
0）ヒトインスリン）₆,4Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−デカノイルAla^A21Gln^B3デス（B30）ヒト
インスリン）₆,4Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−ドデカノイルAla^A21Gln^B3デス（B30）ヒ
トインスリン）₆,4Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−トリデカノイルGln^B3デス（B30）ヒトイ
ンスリン）₆,4Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−テトラデカノイルGln^B3デス（B30）ヒト
インスリン）₆,4Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−デカノイルGln^B3デス（B30）ヒトインス
リン）₆,4Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−ドデカノイルGln^B3デス（B30）ヒトイン
スリン）₆,4Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−トリデカノイル ヒトインスリン）₆,4Zn
²⁺、 （Ｎ^εB29−テトラデカノイル ヒトインスリン）₆,4
Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−デカノイル ヒトインスリン）₆,4Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−ドデカノイル ヒトインスリン）₆,4Z
n²⁺、 （Ｎ^εB29−トリデカノイルGly^A21ヒトインスリ
ン）₆,4Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−テトラデカノイルGly^A21ヒトインスリ
ン）₆,4Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−デカノイルGly^A21ヒトインスリン）₆,4Zn
²⁺、 （Ｎ^εB29−ドデカノイルGly^A21ヒトインスリン）₆,4
Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−トリデカノイルGly^A21Gln^B3ヒトインスリ
ン）₆,4Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−テトラデカノイルGly^A21Gln^B3ヒトインス
リン）₆,4Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−デカノイルGly^A21Gln^B3ヒトインスリン）
₆,4Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−ドデカノイルGly^A21Gln^B3ヒトインスリ
ン）₆,4Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−トリデカノイルAla^A21ヒトインスリ
ン）₆,4Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−テトラデカノイルAla^A21ヒトインスリ
ン）₆,4Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−デカノイルAla^A21ヒトインスリン）₆,4Zn
²⁺、 （Ｎ^εB29−ドデカノイルAla^A21ヒトインスリン）₆,4
Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−トリデカノイルAla^A21Gln^B3ヒトインスリ
ン）₆,4Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−テトラデカノイルAla^A21Gln^B3ヒトインス
リン）₆,4Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−デカノイルAla^A21Gln^B3ヒトインスリン）
₆,4Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−ドデカノイルAla^A21Gln^B3ヒトインスリ
ン）₆,4Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−トリデカノイルGln^B3ヒトインスリン）₆,
4Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−テトラデカノイルGln^B3ヒトインスリン）
₆,4Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−デカノイルGln^B3ヒトインスリン）₆,4Zn
²⁺、 （Ｎ^εB29−ドデカノイルGln^B3ヒトインスリン）₆,4Z
n²⁺、 （Ｎ^εB29−トリデカノイルGlu^B30ヒトインスリ
ン）₆,4Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−テトラデカノイルGlu^B30ヒトインスリ
ン）₆,4Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−デカノイルGlu^B30ヒトインスリン）₆,4Zn
²⁺、 （Ｎ^εB29−ドデカノイルGlu^B30ヒトインスリン）₆,4
Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−トリデカノイルGly^A21Glu^B30ヒトインス
リン）₆,4Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−テトラデカノイルGly^A21Glu^B30ヒトイン
スリン）₆,4Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−デカノイルGly^A21Glu^B30ヒトインスリ
ン）₆,4Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−ドデカノイルGly^A21Glu^B30ヒトインスリ
ン）₆,4Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−トリデカノイルGly^A21Gln^B3Glu^B30ヒトイ
ンスリン）₆,4Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−テトラデカノイルGly^A21Gln^B3Glu^B30ヒト
インスリン）₆,4Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−デカノイルGly^A21Gln^B3Glu^B30ヒトインス
リン）₆,4Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−ドデカノイルGly^A21Gln^B3Glu^B30ヒトイン
スリン）₆,4Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−トリデカノイルAla^A21Glu^B30ヒトインス
リン）₆,4Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−テトラデカノイルAla^A21Glu^B30ヒトイン
スリン）₆,4Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−デカノイルAla^A21Glu^B30ヒトインスリ
ン）₆,4Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−ドデカノイルAla^A21Glu^B30ヒトインスリ
ン）₆,4Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−トリデカノイルAla^A21Gln^B3Glu^B30ヒトイ
ンスリン）₆,4Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−テトラデカノイルAla^A21Gln^B3Glu^B30ヒト
インスリン）₆,4Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−デカノイルAla^A21Gln^B3Glu^B30ヒトインス
リン）₆,4Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−ドデカノイルAla^A21Gln^B3Glu^B30ヒトイン
スリン）₆,4Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−トリデカノイルGln^B3Glu^B30ヒトインスリ
ン）₆,4Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−テトラデカノイルGln^B3Glu^B30ヒトインス
リン）₆,4Zn²⁺、 （Ｎ^εB29−デカノイルGln^B3Glu^B30ヒトインスリン）
₆,4Zn²⁺及び （Ｎ^εB29−ドデカノイルGln^B3Glu^B30ヒトインスリ
ン）₆,4Zn²⁺。

図面の簡単な説明 本発明を添付図面を参考に更に説明する。

図１はプラスミドpEA5.3.2の構築を示す； 図２はプラスミドpEA108の構築を示す；そして 図３はプラスミドpEA113の構築を示す。

発明の詳細な説明 用語 本明細書において用いているアミノ酸残基についての
３文字コード及び１文字コードはJ.Biol.Chem.243,p.35
58（1968）に記載されているものである。

このDNA配列において、Ａはアデニン、Ｃはシトシ
ン、Ｇはグアニン、そしてＴはチミンである。

以下の頭文字語を使用した： ジメチルスルホキシドについてはDMSO、ジメチルホル
ムアミドについてはDMF,tert・ブトキシカルボニルにつ
いてはBoc、逆相高性能液体クロマトグラフィーについ
てはRP−HPLC,X−OSuはＮ−ヒドロキシスクシニミドエ
ステル、Ｘはアシル基、そしてトリフルオ酢酸について
は、TFA。

親油性インスリン誘導体の調製 本発明に係るインスリン誘導体はとりわけ以下に記載
の通りにして調製できる： 1. B30位における遺伝子コードによりコードされうる
アミノ酸残基、例えばスレオニン（ヒトインスリン）又
はアラニン（ブタインスリン）を特徴とするインスリン
誘導体 1.1 ヒトインスリンからの出発 ヒトインスリンをBoc−試薬（例えばジ−tert−ブチ
ルジカルボネート）で処理して（A1,B1）−ジBocヒトイ
ンスリン、即ち、両鎖のＮ−末端がBoc基によって保護
されているヒトインスリンを生成する。HPLC等による任
意的な精製後、その生成物をＸが導入すべきアシル基で
ある式Ｘ−OSuのＮ−ヒドロキシスクシニミドエステル
と反応させることによりアシル基をLys^B29のε−アミノ
基の中に導入する。最終段階において、TFAをBoc基を除
去するために使用し、次いで生成物Ｎ^εB29−Ｘヒトイ
ンスリンを単離する。

1.2 一本鎖インスリン前駆体からの出発 B1位においてアルギニン残基を介してそのB1に接続さ
れている伸長部（Exp）で伸長され、且つB30とA1との架
橋がアルギニン残基である一本鎖インスリン前駆体、即
ち、一般式Ext−Arg−Ｂ（１−30）−Arg−Ａ（１−2
1）の化合物を出発材料として用いてよい。Ｘがアシル
基である一般式Ｘ−OSuのＮ−ヒドロキシススクシニミ
ドエステルによるこの出発材料のアシル化は、Lys^B29の
ε−アミノ基の中及び前駆体のＮ−末端アミノ基の中に
アシル基Ｘを導入する。一般式（Ｎ^εB29−Ｘ）のこの
アシル化前駆体、即ちＸ−Ext−Arg−Ｂ（１−30）−Ar
g−Ａ（１−21）を、水と適当な水混和性有機溶媒、例
えばDMF,DMSO又は低級アルコールとの混合物の中でトリ
プシンにより処理することで、式（Ｎ^εB29−Ｘ）の中
間体Arg^B31インスリンが得られる。この中間体をカルボ
キシペプチダーゼＢで処理すると所望の生成物（Ｎ
^εB29−Ｘ）インスリンが得られる。

2. B30位においてアミノ酸残基を有さないインスリン
誘導体、即ちデス（B30）インスリン 2.1 ヒトインスリン又はブタインスリンからの出発 アンモニアバッファー中でのカルボキシペプチダーゼ
Ａによる処理により、ヒトインスリン及びブタインスリ
ンは共にデス（B30）インスリンとなる。任意的な精製
の後、デス（B30）インスリンをBoc試薬（例えばジ−te
rt−ブチルジカルボネート）で処理して（A1,B1）−ジB
ocデス（B30）インスリン、即ち、両鎖のＮ−末端がBoc
−基により保護されているインスリンを生成する。HPLC
の如くによる任意的な精製の後、その生成物をＸが導入
すべきアシル基である式Ｘ−OSuのＮ−ヒドロキシスク
シニミドエステルと反応させることによりLys^B29のε−
アミノ基の中にアシル基を導入する。最終工程におい
て、Boc基を除去するのにTFAを使用し、そして生成物
（Ｎ^εB29−Ｘ）デス（B30）インスリンを単離する。

2.2 一本鎖ヒトインスリン前駆体からの出発 B1位においてアルギニン残基を介してそのB1位に接続
されている伸長部（Exp）で伸長され、且つB30とA1とに
架橋を有する一本鎖インスリン前駆体が有用な出発材料
となりうる。好ましくは、この架橋は式Yn−Argのペプ
チドであり、ここでＹはリジン及びアルギニンを除くコ
ード可能なアミノ酸であり、そしてｎは０又は１〜35の
整数である。ｎ＞１のとき、Ｙは辺々のアミノ酸を表示
しうる。B30とA1との架橋の好適な例はAlaAlaArg,SerAr
g,SerAspAspAlaArg及びArg（ヨーロッパ特許第163529
号）である。一般式Ext−Arg−Ｂ（１−30）−Yn−Arg
−Ａ（１−21）のかかる前駆体のシリルエンドペプチダ
ーゼ、例えばアクロモバクター・リティカス（Achromob
acter lyticus）プロテアーゼによる処理はExt−Arg−
Ｂ（１−29）−Thr−Yn−Arg−Ａ（１−21）デス（B3
0）インスリンをもたらした。この中間体の、一般式Ｘ
−OSuのＮ−ヒドロキシスクシニミドエステル（ここで
Ｘはアシル基である）によるアシル化は、アシル基Ｘを
Lys^B29のε−アミノ基の中に並び並びにＡ−鎖及びＢ−
鎖の中にＮ−末端アミノ基を導入し、（Ｎ^εB29−Ｘ）
Ｘ−Ext−Arg−Ｂ（１−29）Ｘ−Thr−Yn−Arg−Ａ（１
−21）デス（B30）インスリンをもたらす。この中間体
は、水と適当な有機溶媒、例えばDMF,DMSO又は低級アル
コールとの混合物の中での処理により、所望の誘導体
（Ｎ^εB29−Ｘ）デス（B30）ヒトインスリンをもたら
す。

Ｎ^εB29修飾インスリンのデーター Ｎ^εB29修飾インスリンの一定の実験データーを表１
に示す。

インスリン誘導体の、ヒトインスリンに対する親油性
k'relを、LiChrosord RP18（５μm,250×4mm）HPLCカラ
ムで、（Ａ）10％のアセトニトリルを含む0.1Mのリン酸
ナトリウムバッファーpH7.3及び（Ｂ）50％アセトニト
リル水溶液の混合物を溶出液として用いて40℃でのイソ
クラチック溶出により測定した。この溶出は溶出液のUV
吸収を214nmで追跡することによりモニターした。ボイ
ド時間toは、0.1mMの硝酸ナトリウムの注入により確認
した。ヒトインスリンについての保持時間t humanは、
ＡとＢ溶液との比を変えることによって少なくとも2to
となるように調整した。

k'rel＝（t derivative−to）／（t human−to） 血流グルコース低下作用の延長の度合いをウサギで試
験した。各インスリン誘導体は一日遅延試験で６羽づつ
のウサギに12nmolのそれを皮下注射することによって試
験した。グリコール分析用の血液採取は注射の前、並び
に注射して1,2,4及び６時間後に行った。実現グルコー
ス値は初期値の％として表わす。血液グルコース値より
計算した遅延指数は等級付け遅延（延長）指数である。
Markussenら、Protein Engineering I（1987）205−213
におけるp211を参照のこと。その方式は、ウシ・ウルト
ラレンテ・インスリンについて100の値、そしてActrapi
d（商標）（Novo Nordisk A/S,2880Bagsraerd,Denmar
k）について０の値とするように等級付している。

表１に挙げているインスリン誘導体は、Znを含まない
と特定されているものを除き、インスリンヘキサマー当
り３個のZn²⁺を含む溶液として投与した。

非常に遅延型の類似体にとってはウサギのモデルは不
適当であり、なぜなら初期値からの血液グルコースの低
下は遅延指数を評価するには小さすぎるからである。か
かる類似体の延長はブタでの消失率による方がより良く
特性決定される。T50％は、外部γ−カウンターで測定
したときに、注射部位からA14Tyr（¹²⁵I）類似体の50％
が消失した時間とする（Ribel,Uら、The Pig as a Mode
l for Subcutaneous Absorption in Man.In:M.serrano
−Rios and P.J.Lefebre（編）:Diabetes1985;Proceedi
ng of the 12th Congress of the International Diabe
tes Federation,Madrid,Spain,1985（Excerpta Medica,
Amsterdam,（1986）891−96）。

表２には一連の非常に延長型のインスリン類似体のT5
0％値を示す。これらの類似体はヘキサマー当り３個のZ
n²⁺を含む溶液として投与した。

溶解度 インスリンヘキサマー当り３個のZn²⁺イオンを含む表
１に挙げるＮ^εB29修飾インスリン全ての溶解度が、防
腐剤としての0.3％のフェノール及び等張性を達しめる
ための1.6％のグリセロールを更に含んで成る中性（pH
7.5）で水性の薬理製剤の中で600nmol/mlを超えてい
た。600nmol/mlは、臨床において通常採用される100IU/
mlの組成物で認められるヒトインスリンの濃度である。

ε−B29アミノ基は、アミド結合、スルホンアミド結
合、カルバミド、チオカルバミド又はカルバメートの成
分でありうる。ε−B29アミノ基により担持される親油
基はアルキル基でもありうる。

本発明に係るヒトインスリン誘導体を含む、薬理組成
物はかかる処置を必要とする患者に非経口投与してよ
い。非経口投与はシリンジ、任意的にはペン型シリンジ
により、皮下、筋肉内又は静脈内注射によって実施され
うる。他方、非経口投与は点滴ポンプによって行ってよ
い。更なる任意は、鼻スプレー式でヒトインスリン誘導
体を投与するための粉末又は液体でありうる。

本発明の注射用ヒトインスリン組成物は薬品産業の慣
用の技術を利用して調製してよく、それは成分を適宜溶
解及び混合して所望の最終製品にすることを含む。

即に、一手順に従うと、このヒトインスリン誘導体
を、調製すべき組成物の最終容量より若干少ない量の水
に溶かす。等張剤、防腐剤及びバッファーを適宜加え、
次いで溶液のpHを必要ならば例えば塩酸、又は塩基、例
えば水性水酸化ナトリウムを用いて必要に応じて調整す
る。最後に、溶液の容量を水で調整して所望の成分濃度
にする。

等張剤の例は、塩化ナトリウム、マンニトール及びグ
リセロールである。

防腐剤の例は、フェノール、ｍ−クロゾール、メチル
ｐ−ヒドロキシベンゾエート及びベンジルアルコールで
ある。

適当なバッファーの例は酢酸ナトリウム及びリン酸ナ
トリウムである。

本発明に係るインスリン誘導体の鼻投与用組成物は、
例えば、ヨーロッパ特許第272,097号（Novo Nordisk A/
S）に記載の通りにして調製できうる。

本発明のインスリン組成物は糖尿病の処置に利用でき
うる。任意の患者のための最適投与レベルは様々な要
因、例えば採用する特定のヒトインスリン誘導体の薬
効、患者の年齢、肉体的活動力及び食事、他の薬剤との
可能な組合せ、並びに糖尿病の症度に応じるであろう。
本発明のヒトインスリン誘導体の日常の投与量は公知の
インスリン組成物についてと似たようにして当業者によ
り各個別の患者について決定されることが推奨される。

好都合なら、本発明のヒトインスリン誘導体はその他
のタイプのインスリン、例えばヒトインスリンもしくは
ブタインスリン、又はより即効性を有するインスリン類
似体と混合して利用してよい。かかるインスリン類似体
の例は例えばヨーロッパ特許出願、公開番号EP214,826
（Novo Nordisk A/S）,EP375,437（Novo Nordisk A/S）
及びEP383,472（Eli Lilly ＆ Co.）に記載されてい
る。

本発明を以下の実施例で更に説明するが、しかしなが
らそれらを保護範囲を狭めるものではない。以上の説明
及び以下の実施例に開示の特徴は、それぞれ独立して、
又は組合されて、本発明を様々な形態で実施するための
資料となりうる。

実施例 プラスミド及びDNA材料 発現プラスミドは全てcPOTタイプである。かかるプラ
スミドはEP特許出願第171,142号に記載され、そしてプ
ラスミドの選別及び安定化の目的でシゾサッカロマイセ
ス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）トリオース
ミリン酸イソメラーゼ遺伝子（POT）を含むことを特徴
とする。POT−遺伝子を含むプラスミドは寄託されてい
るE.コリ（E.coli）株（ATCC39685）より入手できる。
このプラスミドは更にS.セレビジエ（S.cerevisiae）ト
リオースミリン酸イソメラーゼプロモーター及びターミ
ネーター（P_TP1及びT_TP1）を含む。これらはpMT742（Eg
el−Mitani,Mら、Gene 73（1988）113−120）（図１参
照のこと）と、シグナル／リーダー／生成物についての
コード領域を含むEcoR I−Xba I制限部位によって規定
される領域を除き、同一である。

合成DNAフラグメントを自動DNA合成装置（Applied Bi
osystemsモデル380A）で、ホスホラミジット薬品及び市
販の試薬を用いて合成した（Beaucage,S.L.and Caruthe
rs,M.H.,Tetrahedron Letters 22（1981）1859−186
9）。

利用したその他の方法及び材料は全て当業界公知一般
事項である（例えばSambrook,J.,Fritsch,E.F.and Mani
atis,T.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold
Spring Harbor Laboratory Press,New York,1989を参
照のこと）。

分析 調製したインスリンの分子量はMS（マススペクトル）
によって、Bio−Ion20装置（Bio−Ion Nordic AB,Uppsa
la,Sweden）を利用するPDMS（プラズマ脱離マススペク
トル）、又はAPI III Biomolecular Mass Analyzer（Pe
rkin−Elmer Sciex Instruments,Thornhill,（Canada）
を用いるESMS）エレクトロスプレー・マススペクトル）
のいづれかにより得た。

実施例１ LaC212spx3シグナル／リーダーを用いる酵母株yEA002か
らのAla^A21Asp^B3ヒトインスリン前駆体の合成 以下のオリゴヌクレオチドを合成した： 以下のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）をGene Amp PCR
試薬キット（Perkin Elmer,761 Main Avewalk,CT06859,
USA）を用い、製造者の仕様書に従って行った。全ケー
スにおいて、PCR混合物に100μｌのミネラル油（Sigma
Chemical Co.,St.Louis,MO,USA）をかぶせた。

2.5μｌのオリゴヌクレオチド＃98（2.5pmol） 2.5μｌのオリゴヌクレオチド”＃128（2.5pmol） 10μｌの10X PCRバッファ 16μｌのdNTR混合物 0.5μｌのTaq酵素 58.5μｌの水 １サイクルを行った:94℃で45sec,49℃で1min,72℃で
2min。

次に、５μｌのオリゴヌクレオチド＃16及び＃126を
加え、そして15サイクルを行った:94℃で45sec,45℃で1
min,72℃で1.5min。PCR混合物を2.5％のアガロースゲル
に載せ、そして電気泳動に標準の技術を利用してかけた
（Sambrookら、Molecular Cloning,Cold Spring Harbou
r Laboratory Pres,1989）。得られるDNAフラグメント
をアガロースゲルから切り取り、そしてGene Clean Kit
（Bio101 Inc.,PO BOX2284,La Jolla,CA92038,USA）を
用いてその製造者の仕様書に従って単離した。精製した
PCR DNAフラグメントを10μｌの水及び制限エンドヌク
レアーゼの中に溶かし、そして制限エンドヌクレアーゼ
Nco I及びXba Iにより標準の技術に従って切り、2.5％
のアガロースゲルで泳動させ、そしてGene Clean Kitを
用いて記載の通りに精製した。

プラスミドpAK188は、ベクター（ファージミド）pBLU
ESCRIPT II sk（＋／−）（Stratagene,USA）のEcoR I/
Xba Iフラグメントの中に挿入されている合成酵母シグ
ナル／リーダー遺伝子LaC212spx3（WO89/02463のExampl
e3記載）をコードするEcoR I/Nco Iフラグメントより成
る412bpのDNA配列、それに続くB29とA1のアミノ酸残基
をつなぐSer Asp Asp Ala Lys架橋を有するインスリン
前駆体M15をコードする合成Nco I/Xba Iより成る。この
プラスミドpAK188を図１に示す。

プラスミドpAK188を制限エンドヌクレアーゼNco I及
びXba Iで切り、そして3139bpのベクターフラグメント
を単離した。２本のDNAフラグメントをT4DNAリガーゼ及
び標準の条件を利用して互いとライゲーションさせた
（Sambrookら、Molecular Cloning,Cold Spring Habour
Laboratory Press,1989）。そのライゲーション混合物
をコンビテントE.コリ株（R^-,M⁺）の中に形質転換し、
次いでアンピシリン耐性について選別した。プラスミド
を、得られるE.コリ コロニーから、標準のDNAミニプ
レップ技術（Sambrookら、Molecular Cloning,Cold Spr
ing Harbour Laboratory Press,1989）で単離し、適当
な制限エンドヌクレアーゼ、即ちEcoR I,Xba I,Nco I及
びHpa Iでチェックした。選別したプラズミドはDNA配列
決定分析（Sequenase,U.S.Biochemical（orp.）によ
り、Ala^A21,Asp^B3ヒトインスリン前駆体についての適正
な配列を含むことが示され、pEA5.3と命名した。

プラスミドpKFN1627はE.コリーS.セレビジエシャトル
ベクターであり、EP特許第375,718号に記載のプラスミ
ドpKFN1003とは、固有Xba I部位の上流は短いDNA配列を
除き同じである。pKFN1003において、この配列は酵母接
合因子アルファー１シグナル−リーダー配列とインフレ
ームで融合した合成アプロチニン遺伝子をコードする17
8bpのフラグメントである。pKFN1627において、対応の1
84bpの配列は接合因子アルファー１配列とインフレーム
で融合したインスリン前駆体MI5（Glu^B1,Glu^B28）（即
ち、Ｂ（１−29）,Glu^B1,Clu^B28）−Ser Asp Asp Ala L
ys−Ａ（１−21）をコードする（SEQ 1D No.17,18及び1
9を参照のこと）。ベクターpKFN1627を図１に示す。

pEA5.3を制限エンドヌクレアーゼEcoR I及びXba Iで
切り、そして得られる412bpのDNAフラグメントを単離し
た。酵母発現ベクターpKFN1627を制限エンドヌクレアー
ゼNco I及びXba I、並びにNco I及びEcoR Iで切り、927
3bpのDNAフラグメントが１回目の消化より単離され、そ
して1644pbのDNAフラグメントが２回より単離された。
次に412bpのEcoR I/Xba Iフラグメントを他の２つのフ
ラグメント、即ち、9273bpのNco I/Xba Iフラグメント
及び1644bpのNco I/EcoR Iフラグメントに標準の技術を
利用してライゲーションさせた。

そのライゲーション混合物を上記の廻りにしてE.コリ
の中に形質転換せしめた。得られるE.コリ由来のプラス
ミドを標準の技術を利用してチェックし、単離し、そし
て適当な制限エンドヌクレアーゼ、即ち、EcoR I,Xba
I,Nco I,Hpa Iでチェックした。選別したプラスミドはD
NA配列分析により（Sequenase kitを用い、その製造者
U.S.Biochemicalにより述べられている通りにして）、A
la^A21Asp^B3ヒトインスリン前駆体DNAの適正な配列を含
み、且つLaC212spx3シグナル／リーダーDNAをコードす
るDNAの後に挿入されていることを示した。このプラス
ミドをpEA5.3.2と命名し、そして図１に示す。LaC212sp
x3シグナル／リーダー/Ala^A21Asp^B3ヒトインスリン前駆
体複合体をコードするDNA配列及びそのアミノ酸配列をS
EQ ID No.20,21及び22に示す。プラスミドpEA5.3.2をヨ
ーロッパ特許出願公開番号214,826の記載の通りにして
S.セレビジエ株MT663に形質転換し、そして得られる株
をyEA002と命名した。

実施例２ LaC212spx3シグナル／リーダーを用いる酵母株yEA005
からのAla^A21Thr^B3ヒトインスリン前駆体の合成 以下のオリゴヌクレオチドを合成した： Ala^A21Thr^B3ヒトインスリン前駆体をコードするDNA
は、実施例１のAla^A21Asp^B3ヒトインスリン前駆体をコ
ードするDNAについて述べたのと同じようにして構築し
た。LaC212spx3シグナル／リーダー/Ala^A21Thr^B3ヒトイ
ンスリン前駆体複合体をコードするDNA配列及びそのア
ミノ酸配列をSEQ ID No.23,24及び25に示す。プラスミ
ドpEA8.1.1は所望の配列を含むことが示され、実施例１
に記載の通りにしてS.セレビジエ株MT663に形質転換さ
せ、そして得られる株をyEA005と命名した。

実施例３ LaC212spx3シグナル／リーダーを用いる酵母株yEA007か
らのGly^A21Asp^B3ヒトインスリン前駆体の合成 以下のオリゴヌクレオチドを合成した： Gly^A21Asp^B3ヒトインスリン前駆体をコードするDNA
は、実施例１のAla^A21Asp^B3ヒトインスリン前駆体をコ
ードするDNAについて述べたのと同じようにして構築し
た。LaC212spx3シグナル／リーダー/Gly^A21Asp^B3ヒトイ
ンスリン前駆体複合体をコードするDNA配列及びそのア
ミノ酸配列をSEQ ID No.26,27及び28に示す。プラスミ
ドpEA1.5.6は所望の配列を含むことが示され、実施例１
に記載の通りにしてS.セレビジエ株MT663に形質転換さ
せ、そして得られる株をyEA007と命名した。

実施例４ LaC212spx3シグナル／リーダーを用いる酵母株yEA006か
らのGly^A21Thr^B3ヒトインスリン前駆体の合成 以下のオリゴヌクレオチドを合成した： Gly^A21Thr^B3ヒトインスリン前駆体をコードするDNA
は、実施例１のAla^A21Asp^B3ヒトインスリン前駆体をコ
ードするDNAについて述べたのと同じようにして構築し
た。LaC212spx3シグナル／リーダー/Gly^A21Thr^B3ヒトイ
ンスリン前駆体複合体をコードするDNA配列及びそのア
ミノ酸配列をSEQ ID No.29,30及び31に示す。プロスミ
ドpEA4.4.11は所望の配列を含むことが示され、実施例
１に記載の通りにしてS.セレビジエ株MT663に形質転換
させ、そして得られる株をyEA006と命名した。

実施例５ アルファー因子リーダーを用いる酵母株yEA113からのＮ
−末端伸長部（Glu Glu Ala Glu Ala Glu Ala Arg）を
有するArg^B-1Arg^B31一本鎖ヒトインスリン前駆体の合成 Ａ） 以下のオリゴヌクレオチドを合成した： 以下のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を、Gene Amp PC
R試薬キット（Perkin Elmer,761 Main Avewalk,CT0685
9,USA）を用い、その製造者の仕様書に従って行った。
全ケースにおいて、PCR混合物に100μｌのミネラル油
（Sigma Chemical Co.St.Louis,MO,USA）をかぶせた。
プラスミドpAK220（これはpAK188と同一である）は、ベ
クター（ファージミド）pBLUESCRIPT II sk（＋／−）
（Stratagene,USA）の中に挿入された、合成酵母シグナ
ル／リーダーLaC212spx3（WO89/02463のExample3に記
載）をコードする412bpのDNA配列、それに続くインスリ
ン前駆体MI5（SEQ ID No.14,15及び16参照のこと）より
成る。

５μｌのオリゴヌクレオチド＃220（100pmol） ５μｌのオリゴヌクレオチド＃263（100pmol） 10μｌの10XのPCRバッファー 16μｌのdNTP混合物 0.5μｌのTaq酵素 0.5μｌのpAK220プラスミド（pAK188と同じ）を鋳型と
して（0.2μｇのDNA） 63μｌの水 全部16サイクルを行い、各サイクルは95℃で１分、40
℃で１分及び72℃で２分より成る。PCR混合物を２％の
アガロースゲルに載せ、そして標準の技術を利用して電
気泳動にかけた。得られるDNAフラグメントをアガロー
スゲルから切り出し、そしてGene Clean Kit（Bio101In
c.,PO BOX2284,La Jolla,CA92038,USA）を用い、その製
造者の仕様書に従って単離した。精製したPCR DNAフラ
グメントを10μｌの水及び制限エンドヌクレアーゼバッ
ファーに溶かし、そして制限エンドヌクレアーゼHind I
II及びXba Iで標準の技術を用いて切った。このHind II
I/Xba I DNAフラグメントをGene Clean Kitを用い、上
記の通りに精製した。

プラスミドpAK406は、酵母アルファー因子リーダーを
コードするpMT636（WO90/10075に記載）の由来のEcoR I
/Hind IIIフラグメントを含んで成る520bpのDNA配列と
ベクターcPOTの中に挿入されたインスリン前駆体MI5の
残りをコードするpAK188由来のHind III/Xba Iフラグメ
ント（SEQ ID No.32,33及び34参照のこと）にライゲー
ションされたインスリン前駆体の一部より成る。ベクタ
ーpAK406を図２に示す。

プラスミドpAK233は、合成酵母シグナル／リーダーLa
C212spx3（WO89/02463のExample3記載）をコードする41
2bpのDNA配列、それに続くベクターcPOTの中に挿入され
たインスリン前駆体Ｂ（１−29）−GluLysArg−Ａ（１
−21）（A21−Gly）（SEQ ID No.35,36及び37参照のこ
と）についての遺伝子より成る。プラスミドpAK233を図
２に示す。

プラスミドpAK233を制限エンドヌクレアーゼNco I及
びXba Iで切り、そして9237bpのベクターフラグメント
が単離された。このプラスミドpAK406を制限エンドヌク
レアーゼNco I及びHind IIIで切り、そして2012bpのベ
クターフラグメントが単離された。これら２本のDNAフ
ラグメントを一緒にHind III/Xba I PCRフラグメントに
T4DNAリガーゼ及び標準の条件を用いてライゲーション
させた。このライゲーション混合物を次にコンビテント
E.コリ株（R^-,M⁺）に形質転換し、続いてアンピシリン
耐性について選別した。プラスミドを、得られるE.コリ
コロニーから標準のミニプレップ技術を用いて単離
し、そして適当な制限エンドヌクレアーゼ、即ち、EcoR
I,Xba I,Nco I,Hind IIIでチェックした。選別したプ
ラスミドはDNA配列決定により、Arg^B31一本鎖ヒトイン
スリン前駆体DNAについての適正な配列を含み、且つS.
セレビジエアルファー因子DNAをコードするDNAの後に挿
入されていることを示した。このプラスミドをpEA108と
命名し、そして図２に示す。アルファー因子リーダー/A
rg^B31一本鎖ヒトインスリン前駆体複合体をコードするD
NA及びそのアミノ酸配列はSEQ ID No.38,39及び40であ
る。プラスミドpEA108を実施例１に記載の通りにしてS.
セレビジエ株MT663の中に形質転換させ、そして得られ
る株をyEA108と命名した。

Ｂ） 以下のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を、Gene Amp PC
R試薬キット（Perkin Elmer,761Main Avewalk,CT06859,
USA）を用い、その製造者の仕様書に従って行った。全
ケースにおいて、PCR混合物に100μｌのミネラル油（Si
gma Chemical Co.St.Louis,MO,USA）をかぶせた。

５μｌのオリゴヌクレオチド＃220（100pmol） ５μｌのオリゴヌクレオチド＃307（100pmol） 10μｌの10XのPORバッファー 16μｌのdNTP混合物 0.5μｌのTaq酵素 0.5μｌのpEA108プラスミドを鋳型として（0.1μｇのDN
A） 63μｌの水 全部16サイクルを行い、各サイクルは95℃で１分、40
℃で１分及び72℃で２分より成る。PCR混合物を２％の
アガロースゲルに載せ、そして標準の技術を利用して電
気泳動にかけた。得られるDNAフラグメントをアガロー
スゲルから切り出し、そしてGene Clean Kit（Bio101In
c.,PO BOX2284,La Jolla,CA92038,USA）を用い、その製
造者の仕様書に従って単離した。精製したPCR DNAフラ
グメントを10μｌの水及び制限エンドヌクレアーゼバッ
ファーに溶かし、そして制限エンドヌクレアーゼNco I
及びXba Iで標準の技術を用いて切った。このNco I/Xba
I DNAフラグメントをGene Clean Kitを用い、上記の通
りに精製した。

プラスミドpAK401は、アルファー因子リーダーをコー
ドするpMT636（WO90/10075に記載）（部位特異的突然変
異誘発によりアルファーリーダーの３′末端の中にNco
部位を導入して構築）由来のEcoR I/Nco Iフラグメント
を含んで成る523bpのDNA配列ベクター（ファージミド）
pBLVESCRIPT（＋／−）（Stratagene,USA）の中に挿入
されたインスリン前駆体MI5をコードするpAK188由来のN
co I/Xba Iフラグメント（SEQ ID No.41,42及び43参照
のこと）より成る。ベクターpAK401を図３に示す。

プラスミドpAK401を制限エンドヌクレアーゼNco I及
びXba Iで切り、そして3254bpのベクターフラグメント
が単離され、そしてNco I/Xba I PCRフラグメントで一
緒にライゲーションさせた。このライゲーション混合物
をコンビテントE.コリ株の中に形質転換し、そして得ら
れるE.コリ コロニーから標準のDNAミニプレップ技術
を利用してプラスミドを単離し、そして適当な制限エン
ドヌクレアーゼ、即ち、EcoR I,Xba I,Nco Iでチェック
した。選別したプラスミドをp113Aと命名し（図３に示
す）、EcoR I及びXba Iで切り、そして535bpのフラグメ
ントが単離された。

プラスミドpAK233を制限エンドヌクレアーゼNco I及
びXba Iで切り、そして9237bp及び1644bpのフラグメン
トが単離された。これら２本のDNAフラグメントを一緒
にEcoR I/Xba I PCRフラグメントにT4DNAリガーゼ及び
標準の条件を用いてライゲーションさせた。このライゲ
ーション混合物を次にコンビテントE.コリ株（R^-,M⁺）
に形質転換し、続いてアンピリシン耐性について選別し
た。プラスミドを、得られるE.コリ コロニーから標準
のミニプレップ技術を用いて単離し、そして適当な制限
エンドヌクレアーゼ、即ち、EcoR I,Xba I,Nco I,Hind
IIIでチェックした。選別したプラスミドはDNA配列決定
により、Ｎ末端伸長部Glu Glu Ala Glu Ala Glu Ala Ar
gを有するArg^B31一本鎖ヒトインスリン前駆体DNAについ
ての適正な配列を含み、且つS.セレビジエアルファー因
子DNAをコードするDNAの後に挿入されていることを示し
た。このプラスミドをpEA113と命名し、そして図３に示
す。Ｎ末端伸長部（Glu Glu Ala Glu Ala Glu Ala Ar
g）アルファー因子リーダー/Arg^B-1Arg^B31一本鎖ヒトイ
ンスリン前駆体複合体をコードするDNA及びそのアミノ
酸配列はSEQ ID No.44,45及び46である。プラスミドpEA
113を実施例１に記載の通りにしてS.セレビジエ株MT663
の中に形質転換させ、そして得られる株をyEA113と命名
した。

実施例６ アルファー因子リーダーを用いる酵母株yEA136からのＮ
−末端伸長部（Glu Glu Ala Glu Ala Glu Ala Glu Ar
g）を有するArg^B-1Arg^B1一本鎖ヒトインスリン前駆体の
合成 以下のオリゴヌクレオチドを合成した： 以下のPCRをGene Amp PCR試薬キットを用いて実施し
た。

５μｌのオリゴヌクレオチド＃220（100pmol） ５μｌのオリゴヌクレオチド＃389（100pmol） 10μｌの10XのPCRバッファー 16μｌのdNTP混合物 0.5μｌのTaq酵素 ２μｌのpEA113プラスミドを鋳型として（0.5μｇのDN
A） 63μｌの水 全部で12サイクルを行い、各サイクルは95℃で１分、
37℃で１分、及び72℃で２分より成る。

Ｎ−末端伸長部（Glu Glu Ala Glu Ala Glu Ala Glu
Arg）を有するアルファー因子リーダー/Arg^B-1Arg^B1一
本鎖ヒトインスリン前駆体をコードするDNAを、実施例
５のＮ−末端伸長部（Glu Glu Ala Glu Ala Glu Ala Ar
g）を有するアルファー因子リーダー/Arg^B-1Arg^B1一本
鎖ヒトインスリン前駆体をコードするDNAに記載と同じ
ようにして構築した。Ｎ−末端伸長部（Glu Glu Ala Gl
u Ala Glu Ala Glu Arg）を有するアルファー因子リー
ダー/Arg^B-1Arg^B1一本鎖ヒトインスリン前駆体をコード
するDNA配列及びそのアミノ酸配列はSEQ ID No.47,48及
び49である。このプラスミドを実施例１記載の通りにし
てS.セレビジエ株MT663に形質転換し、そして得られる
株をyEA136と命名した。

実施例７ （A1,B1）−ジBocヒトインスリンの合成 5gの亜鉛非含有インスリンを41.3mlのDMSOに溶かし
た。この溶液に3,090mlの酢酸を加えた。反応を室温で
行い、そして5,650mlのDMSOに溶かした565mgのジ−tert
−ブチルピロ炭酸塩の添加により開始させた。反応を5l
/2時間進行させ、そして250μｌのエタノールアミノの
添加により停止させた。生成物を1500mlのアセトンの添
加により沈殿させた。その沈渣を遠心により単離し、そ
して真空乾燥して、6.85gの収量の物質が得られた。

（A1,B1）−ジBocインスリンを以下のようにして逆相
HPLCにより精製した。粗生成物を100mlの25％のエタノ
ール水溶液に溶かし、pHをHClで3.0に合わせ、そしてオ
クタデシルジメチルシリル−置換化シリカ粒子（平均粒
子サイズ15μｍ、孔サイズ100Å）の充填したカラム
（直径5cm、高さ30cm）に載せ、そして溶出バッファー
で平衡にした。溶出はエタノールと1mMの水性HCl,0.3M
のkclの混合物を用いて2l/hの流速で行った。インスリ
ンはエタノール含有量を30％から45％に上昇させること
により溶出した。適切な画区を20％のエタノールで希釈
し、そしてpH4.8で沈殿させた。沈殿した物質を遠心に
より単離し、そして真空乾燥した。これにより、1.701g
の（A1,B1）−ジBocヒトインスリンが94.5％の純度で得
られた。

実施例８ （Ｎ^εB29−ベンゾイルヒトインスリン）₆,3Zn²⁺の合成 400mgの（A1,B1）−ジBocヒトインスリンを2mlのDMSO
に溶かした。この溶液にＮ−メチルモルホリンとDMSOと
の（1:9,V/V）混合物748μｌを加えた。反応は15℃で行
い、そして132μｌのDMFに溶かした14.6mgの安息香酸Ｎ
−ヒドロキシスクシニミドエステルの添加により開始さ
せた。反応は２時間後に100mlのアセトンを添加するこ
とにより停止させた。沈殿した物質を遠心により単離
し、そして真空乾燥した。343mgの物質が回収できた。

Boc保護基を4mlのTFAの添加により除去した。溶解物
質を30分インキュベートし、そして50mlのアセトンの添
加により沈殿させた。この沈渣を遠心により単離し、そ
して真空乾燥した。

Ｎ^εB29−ベンゾイルヒトインスリンを実施例７に記
載の通りにして逆相HPLCにより精製した。230mgの収量
が得られた。6mMのZn²⁺及び50mMのクエン酸を含むpH5.5
の15％の水性エタノールからの再結晶化は、表題の化合
物の結晶をもたらし、これを遠心により単離し、そして
真空乾燥した。収量は190mgであった。

MSによる分子量は5911;理論値は5911である。

実施例９ （Ｎ^εB29−リトコロイルヒトインスリン）₆,3Zn²⁺の合
成 400mgの（A1,B1）−ジBocヒトインスリンを2mlのDMSO
に溶かした。この溶液にＮ−メチルモルホリンとDMSOと
の（1:9,v/v）混合物748μｌを加えた。反応は15℃で行
い、そして300μｌのDMFに溶かした31.94mgのリトコリ
ン酸Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルの添加により
開始させた。反応は２時間後に100mlのアセトンを添加
することにより停止させた。沈殿した物質を遠心により
単離し、そして真空乾燥した。331mgの物質が回収でき
た。

Boc保護基を4mlのTFAの添加により除去した。溶解物
質を30分インキュベートし、そして50mlのアセトンの添
加により沈殿させた。この沈渣を遠心により単離し、そ
して真空乾燥した。収量は376mgであった。

B29−リトコロイルインスリンを実施例７に記載の通
りにして逆相HPLCにより精製した。67mgの最終収量が94
％の純度で得られた。6mMのZn²⁺及び50mMのクエン酸を
含むpH5.5の15％の水性エタノールからの再結晶化は、
表題の化合物の結晶をもたらし、これを遠心により単離
し、そして真空乾燥した。収量は49mgであった。

MSによる分子量は6160;理論値は6166である。

実施例10 （Ｎ^εB29−ベンゾイルヒトインスリン）₆,3Zn²⁺の合成 400mgの（A1,B1）−ジBocヒトインスリンを2mlのDMSO
に溶かした。この溶液にＮ−メチルモルホリンとDMSOと
の（1:9,v/v）混合物748μｌを加えた。反応は15℃で行
い、そして132μｌのDMFに溶かした18.0mgのデカノン酸
Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルの添加により開始
させた。反応は60分後に100mlのアセトンを添加するこ
とにより停止させた。沈殿した物質を遠心により単離
し、そして真空乾燥した。420mgの中間生成物が回収で
きた。

Boc保護基を4mlのTFAの添加により除去した。溶解物
質を30分インキュベートし、そして生成物を50mlのアセ
トンの添加により沈殿させた。この沈渣を遠心により単
離し、そして真空乾燥した。粗生成物の収量は420mgで
あった。

その粗生成物を実施例７に記載の通りにして逆相HPLC
により精製した。表題の生成物の254mgの最終収量が得
られた。6mMのZn²⁺及び50mMのクエン酸を含むpH5.5の15
％の水性エタノールからの再結晶化は、表題の化合物の
結晶をもたらし、これを遠心により単離し、そして真空
乾燥した。収量は217mgであった。

MSによる分子量は5962;理論値は5962である。

実施例11 デス（B30）ヒトインスリンの合成 デス（B30）ヒトインスリンの合成はMarkussen（Meth
ods in diabetes research.Vol.I,Laboratory methods,
part B,404−410.Ed:J.Larner and S.Phol.,John Wiley
＆ Sons,1984）に記載の通りにして実施した。5gのヒ
トインスリンを500mlの水に溶かし、その間溶液のpH値
は0.5Mの硫酸の添加により2.6に保っておいた。次に、
インスリンを100gの硫酸アンモニウムの添加により塩析
し、そして沈渣を遠心により単離した。そのペレットを
800mlの0.1mの炭酸水素アンモニウムの中に溶かし、そ
してその溶液のpH値を1Mのアンモニアで8.4に調整し
た。

50mgのウシカルボキシペプチダーゼＡを25mlの水に懸
濁し、そして遠心により単離した。その結晶を25mlの水
に懸濁し、そして透明な溶液が得られる最終pH10となる
まで0.1Mのアンモニアを加えた。このカルボキシペプチ
ダーゼ溶液をインスリン溶液に加え、そしてその反応を
24時間進行させた。数滴のトルエンを反応中の防腐剤と
して働くように加えた。

24時間後、デス（B30）ヒトインスリンを、その溶液
を撹拌しながら80gの塩化ナトリウムを逐次添加するこ
とによって結晶化させた。次いでpH値を8.3に調整し、
そして結晶化をゆっくり撹拌しながら20時間進行させ
た。結晶を1.2μｍのフィルター上で単離し、250mlの氷
冷２−プロパノールで洗い、そして最後に真空乾燥し
た。

実施例12 （A1,B1）−ジBocデス（B30）ヒトインスリンの合成 表題の化合物を実施例７に記載と類似の方法で、出発
物質としてデス（B30）ブタインスリンを用いて合成し
た。その粗生成物をアセトンにより沈殿させ、そして真
空乾燥した。（A1,B1）−ジBocデス（B30）ヒトインス
リンを実施例７記載の通りにして逆相HPLCにより精製し
た。

実施例13 Ｎ^εB29−デカノイルデス（B30）ヒトインスリンの合成 400mgの（A1,B1）−ジBocデス（B30）ヒトインスリン
を、実施例10記載の手順に従うＮ^εB29−デカノイルデ
ス（B30）ヒトインスリンの合成のための出発物質とし
て用いた。その粗生成物をアセトンにより沈殿させ、真
空乾燥し、TFAを用いて脱保護した。得られる生成物を
アセトンにより沈殿させ、そして真空乾燥した。次いで
Ｎ^εB29−デカノイルデス（B30）ヒトインスリンを実施
例10に記載の通りにして逆相HPLCにより精製した。

MSにより認められる分子量5856;理論値5861。

実施例14 Ｎ^εB29−ドデカノイルデス（B30）ヒトインスリンの合
成 a.A.リティカスプロテアーゼの固定化 5mlの水性の0.2MのNaHCO₃バッファーpH9.4に溶解した
13mgのA.リティカスプロテアーゼを、同じバッファーで
洗っておいた4mlの沈降させたMiniLeak（商標）メディ
ウムゲルと混合した（MiniLeakは、Kem En Tec,Copenha
genより入手したジビニルスルホン活性化Sepharose CL
6Bである）。このゲルを室温で24時間ゆっくり撹拌する
ことにより懸濁を保った。次に、このゲルを濾過により
単離し、水で洗い、そして20mlの1Mのエタノールアミン
pH9.4に懸濁し、そして室温で24時間懸濁に保った。最
後に、このゲルを水、次いで0.1Mの酢酸で洗い、そして
４℃で保存した。濾液の酵素活性は当初の溶液の13％で
あり、約87％の固定化反応が得られたことを示唆する。

b.ブタトリプシンの固定化 ブタトリプシンをMiniLeak（商標）Lowに、A.リティ
カスの固定化について上記した条件を利用し、1mlのゲ
ル当り1mgの置換度となるように固定化した。

c.固定化A.リティカスプロテアーゼを用いるGlu（GluAl
a）₃Arg−Ｂ（１−29）,ThrArg−Ａ（１−21）インスリ
ンの合成 20mlの0.1MのNaHCO₃バッファーpH9.0に溶かした200mg
のGlu（GluAla）₃Arg−Ｂ（１−29）−ThrArg−Ａ（１
−21）一本鎖ヒトインスリン前駆体に固定化A.リティカ
スプロテアーゼを担持するゲル4mlを加えた。そのゲル
を室温で６時間反応混合物の中で懸濁に保った後、加水
分解は完了し、Glu（GluAla）_３−Arg−Ｂ（１−29）,T
hrArg−Ａ（１−21）ヒトインスリンが得られる（反応
は逆相HPLCにより追跡）。加水分解後、ゲルを濾過によ
り除去した。その濾液に5mlのエタノール及び15μｍの1
MのZnCl₂を加え、そしてpHをHClを用いて5.0に合わせ
た。生成物の沈殿は４℃で一夜ゆっくり撹拌しながら放
置することで完了した。その生成物を遠心により単離し
た。1mlの氷冷20％エタノールで１回洗い、そして真空
乾燥した後、収量は190mgであった。

d.ドデカノン酸Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルを
用いるＮ^αA1,N^αB1,N^εB29−トリドデカノイルGlu（Gl
uAla）₃Arg−Ｂ（１−29）,Thr−Arg−Ａ（１−21）ヒ
トインスリンの合成 190mg（30μmol）のGlu（GluAla）₃Arg−Ｂ（１−2
9）,ThrArg−Ａ（１−21）インスリンを1mlのDMSO及び
1.05mlの0.572MのN,N−ジイソプロピルエチルアミンのD
MF溶液に溶かした。この溶液を15℃に冷やし、そして0.
6mlのDMSOに溶解した36mg（120μmol）のドデカノン酸
Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルを加えた。反応は
24時間以内に完了した。親油性の表題の化合物は単離し
なかった。

e.N^εB29−ドデカノイルデス（B30）インスリンの合成 約2.65mlのDMSO/DMF/N,N−ジイソプロピルエチルアミ
ンの中に含まれている先の工程ｄ由来の生成物を20％の
エタノールを含んで成る10.6mlの50mMのグリシンバッフ
ァーで希釈し、そしてpHをNaOHで10に調整した。室温で
１時間放置後、1mgの固定化トリプシンを1mlのゲル当り
担持している1mlのMiniLeakゲルを加えた。その反応混
合物を室温で48時間ゆっくり撹拌した。所望の生成物を
単離するため、反応混合物を、オクタデシルジメチルシ
リル−置換化シリカ粒子（平均粒子サイズ15μｍ、孔サ
イズ100Å）で充填した逆相HPLCカラム（直径5cm、高さ
30cm）に載せた。溶出のためには、pH7.7に調整され、
エタノール濃度が40％から44％（v/v）に上昇する20mM
のトリス/HClバッファーを2000ml/hの流速で用いた。約
43〜44％のエタノールで溶出する主要ピークが表題の化
合物を含んでいた。主要ピークを含む画分をプール、エ
タノール濃度を20％（v/v）に下げるように水を加え、
そしてpHを5.5に調整した。その溶液を−20℃で一夜放
置し、これにより生成物を沈殿させた。その沈渣を−８
℃での遠心により単離し、そして真空乾燥した。表題の
化合物の収量は90mgであった。MSにより認められる分子
量は5892;理論値は5890。

実施例15 Ｎ^εB29−（Ｎ−ミリストイル−α−グルタミル）ヒト
インスリンの合成 500mgの（A1,B1）−ジBocヒトインスリンを2.5mlのDM
SOに溶かし、そして2.5mlの1/1のDMSO/DMF（v/v）に希
釈しておいた428μｌのエチルジイソプロピルアミドを
加えた。その温度を15℃にし、そして2.5mlの1/1のDMSO
/DMF（v/v）に溶解した85mgのＮ−ミリストイル−Glu
（OBut）Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルを加え
た。30分後、その反応混合物を60mlの水に注ぎ、pHを５
にし、そしてその沈渣を遠心により単離した、その沈渣
を真空乾燥した。乾燥反応混合物を25mlのTFAに溶か
し、そしてその溶液を室温で30分放置した。TFAを真空
でエバポレーションした。ゼラチン状の残渣を60mlに水
に溶かし、そしてpHを濃アンモニアを用いて11.2にし
た。表題の化合物は6NのHClを用いてpHを8.5にすること
によってこの溶液から結晶化した。その生成物を遠心に
より単離し、10mlの水で洗い、そして真空乾燥した。収
量356mg・HPLCにより純度94％。

本例の生成物は、Lys^B29のε−アミノ基が以下の構造
を有する置換基を有するヒトインスリンである： CH₃（CH₂）₁₂CONHCH（CH₂CH₂COOH）CO− MSにより認められた分子量6146:理論値6148。

実施例16 Ｎ^εB29−ウンデカノイルデス（B30）ヒトインスリンの
合成 表題の化合物は実施例14に記載のＮ^εB29−ドデカノ
イルデス（B30）ヒトインスリンと類似にして、ドデカ
ノン酸Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルの代わりに
ウンデカノン酸Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルを
利用することにより合成した。

MSにより認められたこの生成物の分子量5876:理論値5
876。

実施例17 Ｎ^εB29−トリデカノイルデス（B30）ヒトインスリンの
合成 表題の化合物は実施例14に記載のＮ^εB29−ドデカノ
イルデス（B30）ヒトインスリンと類似にして、ドデカ
ノン酸Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルの代わりに
トリデカノン酸Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルを
利用することにより合成した。

MSにより認められたこの生成物の分子量5899:理論値5
904。

実施例18 Ｎ^εB29−ミリストイルデス（B30）ヒトインスリンの合
成 表題の化合物は実施例14に記載のＮ^εB29−ドデカノ
イルデス（B30）ヒトインスリンと類似にして、ドデカ
ノン酸Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルの代わりに
ミリスチン酸Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルを利
用することにより合成した。

MSにより認められたこの生成物の分子量5923:理論値5
918。

実施例19 Ｎ^εB29−パルミトイルデス（B30）ヒトインスリンの合
成 表題の化合物は実施例14に記載のＮ^εB29−ドデカノ
イルデス（B30）ヒトインスリンと類似にして、ドデカ
ノン酸Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルの代わりに
パルミチン酸Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルを利
用することにより合成した。

MSにより認められたこの生成物の分子量5944:理論値5
946。

実施例20 Ｎ^εB29−スベロイル−Ｄ−チロキシンヒトインスリン a.N−（スクシニミジルスベロイル）−Ｄ−チロキシン
の調製 ジスクシニミジルスベレート（1.0g,Pierce）をDMF
（50ml）に溶かし、そしてＤ−チロキシン（2.0g,Aldri
ch）を20℃で撹拌しながら加えた。チロキシンをゆっく
り溶かし、そして20時間後、溶媒を真空エバポレーショ
ンにより除去した。油状の残渣を２−プロパノールから
結晶化させ、0.6gのＮ−（スクシニミジルスベロイル）
−Ｄ−チロキシンを得た。m.p.128−133℃。

b.（A1,A2）−ジBocヒトインスリンとＮ−（スクシニミ
ジルスベロイル）−Ｄ−チロキシンとの反応 （A1,B1）−ジBocヒトインスリン（200mg）をドライD
MF（10ml）の中に、室温でトリエチルアミン（20μｌ）
の添加により溶かした。次にＮ−（スクシニミジルスベ
ロイル）−Ｄ−チロキシン（80mg）を加えた。この反応
を逆相HPLCによりモニターし、そして反応が約90％完了
したら、溶媒を真空除去した。このエバポレーション残
渣に無水トリフルオロ酢酸（5ml）を加え、そしてこの
溶液を室温に１時間保った。真空でトリフルオロ酢酸を
除去した後、その残渣を1Mの酢酸（5ml）のアセトニト
リル（1.5ml）との混合物に溶かし、調製逆相HPLCによ
り精製し、そしてPD−10カラムで脱塩した。Ｎ^εB29−
スベロイル−Ｄ−チロキシンヒトインスリンの収量は50
mgであった。

本例の生成物はLys^B29のε−アミノ基が以下の構造の
置換基を有するヒトインスリンである:Thyrox−CO（C
H₂）₆CO（ここでThyroxは、α−アミノ基に対するアミ
ド結合を介してオクタンジオン酸成分に結合しているチ
ロキシンである）。

MSにより認められたこの生成物の分子量は6724:理論
値6723。

実施例21 Ｎ^εB29−（２−スクシニルアミド）ミリスチン酸ヒト
インスリンの合成 a.α−アミノミリスチン酸メチルエステル・HClの調製 −10℃においてメタノール（5ml,Merck）に塩化チオ
ニル（0.2ml,Aldrich）を強力に撹拌しながら滴下し
た。次にα−アミノミリスチン酸（0.7g;α−ブロモ酸
からアンモニアとの反応により調製）を加えた。その反
応混合物を室温で一夜撹拌し、次いで乾くまでエバポレ
ートした。粗生成物（0.7g）を工程ｂに直接用いた。

b.N−スクシノイル−α−アミノミリスチン酸メチルエ
ステルの調製 α−アミノミリスチン酸メチルエステル・HCl（0.7
g）をクロロホルム（25ml,Merck）に溶かした。トリエ
チルアミン（0.35ml,Fluka）を、次いで無水コハク酸
（0.3g,Fluka）を加えた。その反応混合物を室温で２時
間撹拌し、乾くまで濃縮し、そしてその残渣を酢酸エチ
ル／石油エーテル（1/1）から再結晶化させた。収量:0.
8g。

c.N−（スクシニミジルスクシノイル）−α−アミノミ
リスチン酸メチルエステルの調製 Ｎ−スクシノイル−α−アミノミリスチン酸メチルエ
ステル（0.8g）をドライDMF（10ml,Merck,4Åモレキュ
ラーシーブで乾燥）に溶かした。ドライピリジン（80μ
l,Merck）及びジ（Ｎ−スクシニミジル）炭酸塩（1.8g,
Fluka）を加え、そしてその反応混合物を室温で一夜撹
拌した。そのエバポレーション残渣をシリカゲル60（Me
ck）でのフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、
そして２−プロパノール／石油エーテル（1/1）から再
結晶化させた。Ｎ−（スクシニミジルスクシノイル）−
α−アミノミリスチン酸メチルエステルの収量:0.13g,
m.p.64−66℃。

d.（A1,B1）−ジBocヒトインスリンとＮ−（スクシニミ
ジルスクシノイル）−α−アミノミリスチン酸メチルエ
ステルとの反応 反応は実施例20bに記載の通りに実施したが、ただし
Ｎ−（スクシニミジルスベロイル）−Ｄ−チロキシンの
代わりにＮ−（スクシニミジルスクシノイル）−α−ア
ミノミリスチン酸メチルエステル（16mg）を使用した。
真空でトリフルオロ酢酸を除去後、そのエバポレーショ
ン残渣を0.1Mの水酸化ナトリウムにより０℃で処理して
メチルエステルをけん化した。けん化が逆相HPLCによっ
て完了していると判定できたら、溶液中のpH値を３に
し、そして溶液を凍結乾燥した。調製逆相HPLCによる精
製及びPD−10カラムでの脱塩の後、Ｎ^εB29−（２−ス
クシニルアミド）ミリスチン酸ヒトインスリンの収量は
39mgであった。

本例の生成物は、Lys^B29のε−アミノ基が次の構造式
の置換基を有するヒトインスリンである:CH₃（CH₂）₁₁C
H（COOH）NHCOCH₂CH₂CO−。

MSにより認められた分子量は6130:理論値6133。

実施例22 Ｎ^εB29−オクチルオキシカルボニルヒトインスリンの
合成 この合成は実施例20bに記載の通りに実施したが、た
だしＮ−（スクシニミジルスベロイル）−Ｄ−チロキシ
ンの代わりに、ｎ−オクチルオキシカルボニルＮ−ヒド
ロキシスクシニミド（9mg;n−オクチルクロロホルメー
ト（Aldrich）及びＮ−ヒドロキシスクシニミドより調
製）を用いた。Ｎ^εB29−オクチルオキシカルボニルヒ
トインスリンの収量は86mgであった。

本例の生成物は、Lys^B29のε−アミノ基が次の構造式
の置換基を有するヒトインスリンである:CH₃（CH₂）₇OC
O−。

MSにより認められた分子量は5960:理論値5964。

実施例23 Ｎ^εB29−（２−スクシニルアミド）パルミチン酸ヒト
インスリン a.N−（スクシニミジルスクシノイル）−α−アミノパ
ルミチン酸メチルエステルの調製 本化合物は実施例21a.〜c.に記載の通りにして、α−
アミノミリスチン酸の代わりにα−アミノパルミチン酸
を用いて調製した。

b.（A1,B1）−ジBocヒトインスリンとＮ−（スクシニミ
ジルスクシノイル）−α−アミノパルミチン酸メチルエ
ステルとの反応 この反応は実施例21dに記載の通りに実施したが、た
だしＮ−（スクシニミジルスクシノイル）−α−アミノ
パルミチン酸メチルエステルの代わりにＮ−（スクシニ
ミジルスクシノイル）−α−アミノパルミチン酸を用
い、Ｎ^εB29−（２−スクシニルアミド）パルミチン酸
ヒトインスリンを得た。

本例の生成物はLys^B29のε−アミノ基が以下の構造式
の置換基を有するヒトインスリンである:CH₃（CH₂）₁₃C
H（COOH）NHCOCH₂CH₂CO−。

実施例24 Ｎ^εB29−（２−スクシニルアミドエチルオキシ）パル
ミチン酸ヒトインスリン a.N−（スクシニミジルスクシノイル）−２−アミノエ
チルオキシパルミチン酸メチルエステルの調製 本化合物は実施例21a.〜c.に記載の通りにして、α−
アミノミリスチン酸の代わりにα−アミノエチルオキシ
パルミチン酸（R.TenBrink,J.Org.Chem.52（1987）418
−422記載の一般手順により合成）を用いて調製した。

b.（A1,B1）−ジBocヒトインスリンとＮ−（スクシニミ
ジルスクシノイル）−α−アミノエチルオキシパルミチ
ン酸エチルエステルとの反応 この反応は実施例21dに記載の通りに実施したが、た
だしＮ−（スクシニミジルスクシノイル）−α−アミノ
ミリスチン酸メチルエステルの代わりにＮ−（スクシニ
ミジルスクシノイル）−α−アミノエチルオキシパルミ
チン酸を用い、Ｎ^εB29−（２−スクシニルアミドエチ
ルオキシ）パルミチン酸ヒトインスリンを得た。

本例の生成物はLys^B29のε−アミノ基が以下の構造式
の置換基を有するヒトインスリンである:CH₃（CH₂）₁₃C
H（COOH）NHCH₂CH₂OCOCH₂CH₂CO−。

実施例25 Ｎ^εB29−リトコロイル−α−グルタミルデス（B30）ヒ
トインスリンの合成 この合成は、実施例13に記載の通りにして、デカノン
酸Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルの代わりに、Ｎ
−リトコロイル−Ｌ−グルタミン酸α−Ｎ−ヒドロキシ
スクシニミドエステル、γ−tert−ブチルエステルを用
いて実施した。

本例の生成物はLys^B24のε−アミノ基が以下の構造式
の置換基を有するデス（B30）ヒトインスリンである：
リトコロイル−NHCH（CH₂CH₂COOH）CO−。

MSにより認められたこの生成物の分子量は6194:理論
値6193。

実施例26 Ｎ^εB29−3,3′,5,5′−テトラヨードチロアセチルヒト
インスリンの合成 この合成は実施例10に記載の通りにして、デカノン酸
Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルの代わりに3,3′,
5,5′−テトラヨードチロ酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシニ
ミドエステルを用いて実施した。

MSにより認められたこの生成物の分子量は6536:理論
値6538。

実施例27 Ｎ^εB29−Ｌ−チロキシルヒトインスリンの合成 この合成は実施例10に記載の通りにして、デカノン酸
Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルの代わりにBoc−
Ｌ−チロキシンＮ−ヒドロキシスクシニミドエステルを
用いて実施した。

MSにより認められたこの生成物の分子量は6572:理論
値6567。

実施例28 溶液において600nmol/mlのＮ^εB29−デカノイルデスＢ
（30）ヒトインスリン・1/3 Zn²⁺を含んで成る薬理組成
物 Ｎ^εB29−デカノイルデス（B30）ヒトインスリン（1.
2μmol）を水（0.8ml）に溶かし、そしてpH値を0.2Mの
水酸化ナトリウムの添加により7.5にした。0.01Mの酢酸
亜鉛（60μｌ）と、0.75％のフェノール及び４％のグリ
セロールを含む溶液（0.8ml）とを加えた。この溶液のp
H値を0.2Mの水酸化ナトリウムを用いて7.5にし、そして
この溶液の容量を水で2mlにした。

得られる溶液を濾過により滅菌し、そして無菌状態で
カートリッジ又はバイアルに移し入れた。

実施例29 溶液において600nmol/mlのＮ^εB29−デカノイルデスＢ
（30）ヒトインスリン・1/2 Zn²⁺を含んで成る薬理組成
物 表題の化合物1.2μmolを水（0.8ml）に溶かし、そし
てpH値を0.2Mの水酸化ナトリウムの添加により7.5にし
た。0.75％のフェノール及び1.75％の塩化ナトリウムを
含む溶液（0.8ml）とを加えた。この溶液のpH値を0.2M
の水酸化ナトリウムを用いて7.5にし、そしてこの溶液
の容量を水で2mlにした。

得られる溶液を濾過により滅菌し、そして無菌状態で
カートリッジ又はバイアルに移し入れた。

実施例30 溶液において600nmol/mlのＮ^εB29−リトコロイルヒト
インスリンを含んで成る薬理組成物 表題の化合物1.2μmolを水（0.8ml）に溶かし、そし
て0.2Mの水酸化ナトリウムを用いて溶液のpH値を8.5に
することによって溶解させた。その溶液に0.75％のクレ
ゾール及び４％のグリセロールを含むストック水溶液0.
8mlを加えた。最後に、そのpHを再び8.5にし、そして溶
液の容量を水で2mlにした。

得られる溶液を濾過により滅菌し、そして無菌状態で
カートリッジ又はバイアルに移し入れた。

配列表 （１）一般情報： （ｉ）出願人： （Ａ）名称:NOVO NORDISK A/S （Ｂ）通り:Novo Alle （Ｃ）市:DK−2880 Bagsvaerd （Ｅ）国:DENMARK （Ｇ）電話番号：＋45 44448888 （Ｈ）ファックス番号：＋45 4449 3256 （Ｉ）テレックス番号:37304 （ii）発明の名称：アシル化インスリン （iii）配列の数:49 （iv）連絡先 （Ａ）宛先:Novo Nordisk A/S Corporate Patents （Ｂ）通り:Novo Alle （Ｃ）市:DK 2880 Bagsvaerd （Ｅ）国:DENMARK （iv）コンピューター読取フォーム： （Ａ）媒体タイプ:Floppy disk （Ｂ）コンピューター:IBM PC compatible （Ｃ）作動システム:PC−DOS/MS−DOS （Ｄ）ソフトウェア:PatentIn Release＃1.0,Version
＃1.25 （vi）現出願データー： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （vii）先の出願データー： （Ａ）出願番号:DK 1044/93及びUS 08/190,829 （Ｂ）出願日:1993年９月９日及び1994年２月２日 （viii）代理人／代理店情報： （Ａ）名称:Jorgensen,Danら （Ｃ）参照／事件番号:3895,204−WO,DJ （iv）通信情報： （Ａ）電話番号：＋45 44448888 （Ｂ）ファックス：＋45 4449 3256 （２）SEQ ID NO:1についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:21アミノ酸 （Ｂ）タイプ：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ii）分子のタイプ：タンパク質 （xi）配列の詳細:SEQ ID NO:1: （２）SEQ ID NO:2についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:30アミノ酸 （Ｂ）タイプ：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ii）分子のタイプ：タンパク質 （xi）配列の詳細SEQ ID NO:2: （２）SEQ ID NO:3:についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:110塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ii）分子のタイプ:DNA （xi）配列の詳細:SEQ ID NO:3: （２）SEQ ID NO:4についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:100塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ii）分子のタイプ:DNA （xi）配列の詳細:SEQ ID NO:4: （２）SEQ ID NO:5についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:25塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ii）分子のタイプ:DNA （xi）配列の詳細:SEQ ID NO:5: （２）SEQ ID NO:6についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:27塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ii）分子のタイプ:DNA （xi）配列の詳細:SEQ ID NO:6: （２）SEQ ID NO:7についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:110塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 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フロントページの続き (72)発明者 ヨナセン，イブ デンマーク国，デーコー―2500 バルビ ー，バルビー ランガゼ 10 (72)発明者 アンデルセン，アセル スロート デンマーク国，デーコー―1864 フレデ リクスベルウ セー，グルントビクスバ イ 35，２．テーベー. (72)発明者 マルクセン，ヤン デンマーク国，デーコー―2730 ヘルレ ウ，キクトバッケン ７ (56)参考文献 特開 平１−254699（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−101022（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−85815（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07K 14/62 A61K 37/26 C12N 15/00 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (24)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】以下の配列を有するインスリン誘導体： （式中、 A21及びB3位にあるXaaは、独立して、Lys,Arg及びCysを
   除く遺伝子コードによりコードされうる任意のアミノ酸
   残基であり； B1にあるXaaはPheであるか、又は欠失しており； B30にあるXaaは、（ａ）コードされ得ない10〜24個の炭
   素原子を有する親油性アミノ酸、この場合５個までの炭
   素原子を有するカルボン酸のアシル基がLys^B29のε−ア
   ミノ基に結合している、（ｂ）Lys,Arg及びCysを除く遺
   伝子コードによりコードされうる任意のアミノ酸残基、
   この場合、Lys^B29のε−アミノ基は親油性置換基を有す
   る、又は（ｃ）欠失している、この場合、Lys^B29のε−
   アミノ基は親油性置換基を有する）； ただし、B30位にあるXaaが（ｂ）又は（ｃ）であると
   き、前記インスリン誘導体はZn²⁺複合体となっている、
   前記インスリン誘導体。
2. 【請求項２】A21およびB3位にあるXaaが、独立して、Ly
   s,Arg及びCysを除く遺伝子コードによりコードされうる
   任意のアミノ酸残基であり； B1位にあるXaaがPheであるか、又は欠失しており； B30位にあるXaaが、10〜24個の炭素原子を有しており、
   且つアシル基がLys^B29のε−アミノ基に結合しているコ
   ードされ得ない親油性アミノ酸である；ここでこのアシ
   ル基は４個までの炭素原子を有するモノカルボン酸又は
   ５個までの炭素原子を有するジカルボン酸のアシル基で
   ある； 請求項１記載のインスリン誘導体。
3. 【請求項３】A21及びB3位のXaaが、独立して、Lys,Arg
   及びCysを除く遺伝子コードによりコードされうる任意
   のアミノ酸残基であり； B1位にあるXaaがPheであるか、又は欠失しており； B30位にあるXaaが欠失しているか、又はLys,Arg及びCys
   を除く遺伝子コードによりコードされうる任意のアミノ
   酸残基であり、そしてLys^B29のε−アミノ基が少なくと
   も６個の炭素原子を含んで成る親油性置換基を有してい
   る； 請求項１記載のインスリン誘導体。
4. 【請求項４】B30位にあるXaaがα−アミノデカノン酸、
   α−アミノドデカノン酸、α−アミノテトラデカノン酸
   及びα−アミノヘキサデカノン酸より成る群から選ばれ
   る、請求項２記載のインスリン誘導体。
5. 【請求項５】Lys^B29のε−アミノ基に結合しているアシ
   ル基がホルミル、アセチル、プロピオニル及びｎ−ブチ
   リルより成る群から選ばれる、請求項２記載のインスリ
   ン誘導体。
6. 【請求項６】Lys^B29のε−アミノ基に結合しているアシ
   ル基がコハク酸のアシル基である、請求項２記載のイン
   スリン誘導体。
7. 【請求項７】B30位にあるXaaが欠失している、請求項３
   記載のインスリン誘導体。
8. 【請求項８】B30位にあるXaaが、Asp,Glu又はThrであ
   る、請求項３記載のインスリン誘導体。
9. 【請求項９】Lys^B29のε−アミノ基に結合している親油
   性置換基が少なくとも６個の炭素原子を有するカルボン
   酸に由来するアシル基である、請求項３記載のインスリ
   ン誘導体。
10. 【請求項１０】枝分れしていることのある前記アシル基
    が８〜24原子長の炭素原子主鎖を含んで成る、請求項９
    記載のインスリン誘導体。
11. 【請求項１１】前記アシル基が少なくとも６個の炭素原
    子を有する脂肪酸のアシル基である、請求項９記載のイ
    ンスリン誘導体。
12. 【請求項１２】前記アシル基が６〜24個の炭素原子を有
    する直鎖状の飽和カルボン酸のアシル基である、請求項
    ９記載のインスリン誘導体。
13. 【請求項１３】前記アシル基がドデカノン酸、トリデカ
    ノン酸及びテトラデカノン酸を含んで成る群から選ばれ
    る、請求項９記載のインスリン誘導体。
14. 【請求項１４】A21にあるXaaがAla,Gln,Gly又はSerであ
    る、請求項１記載のインスリン誘導体。
15. 【請求項１５】B3位にあるXaaが、Asp,Gln又はThrであ
    る、請求項１記載のインスリン誘導体。
16. 【請求項１６】B1位にあるXaaが欠失している、請求項
    １記載のインスリン誘導体。
17. 【請求項１７】Ｎ^εB29−テトラダカノイルデス（B30）
    ヒトインスリンである、請求項３記載のインスリン誘導
    体。
18. 【請求項１８】Ｎ^εB29−テトラダカノイルデス（B30）
    ヒトインスリンの任意のZn²⁺複合体である、請求項３記
    載のインスリン誘導体。
19. 【請求項１９】一のインスリンヘキサマー当たり２、
    ３、又は４個のZn²⁺イオンを含む、Ｎ^εB29−テトラダ
    カノイルデス（B30）ヒトインスリンの任意のZn²⁺複合
    体である、請求項３記載のインスリン誘導体。
20. 【請求項２０】Ｎ^εB29−（リトコロイル−グルタミ
    ル）デス（B30）ヒトインスリンである、請求項３記載
    のインスリン誘導体。
21. 【請求項２１】Ｎ^εB29−（リトコロイル−グルタミ
    ル）デス（B30）ヒトインスリンの任意のZn²⁺複合体で
    ある、請求項３記載のインスリン誘導体。
22. 【請求項２２】一のインスリンヘキサマー当たり２、
    ３、又は４個のZn²⁺イオンを含む、Ｎ^εB29−（リトコ
    ロイル−グルタミル）デス（B30）ヒトインスリンの任
    意のZn²⁺複合体である、請求項３記載のインスリン誘導
    体。
23. 【請求項２３】糖尿病の処置を必要とする患者のかかる
    処置のための薬理組成物であって、治療的な有効な量の
    請求項１記載のインスリン誘導体を薬理学的に許容され
    る担体と一緒に含んで成る薬理組成物。
24. 【請求項２４】糖尿病の処置を必要とする患者のかかる
    処置のための薬理組成物であって、治療的に有効な量の
    請求項１記載のインスリン誘導体を、即効性を有するイ
    ンスリン又はインスリン類似体との混合において、薬理
    学的に許容される担体と一緒に含んで成る、薬理組成
    物。