FI117055B - Menetelmä asyloidun insuliinin valmistamiseksi - Google Patents

Menetelmä asyloidun insuliinin valmistamiseksi Download PDF

Info

Publication number
FI117055B
FI117055B FI961220A FI961220A FI117055B FI 117055 B FI117055 B FI 117055B FI 961220 A FI961220 A FI 961220A FI 961220 A FI961220 A FI 961220A FI 117055 B FI117055 B FI 117055B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
leu
glu
cys
insulin
ala
Prior art date
Application number
FI961220A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI961220A0 (fi
FI961220A (fi
Inventor
Svend Havelund
Jan Markussen
Ib Jonassen
John Broberg Halstroem
Asser Sloth Andersen
Original Assignee
Novo Nordisk As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26065125&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=FI117055(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from DK104493A external-priority patent/DK104493D0/da
Application filed by Novo Nordisk As filed Critical Novo Nordisk As
Publication of FI961220A0 publication Critical patent/FI961220A0/fi
Publication of FI961220A publication Critical patent/FI961220A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI117055B publication Critical patent/FI117055B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/01—DNA viruses
    • C07K14/02—Hepadnaviridae, e.g. hepatitis B virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/62—Insulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/28—Insulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

11
Menetelmä asyloidun insuliinin valmistamiseksi Keksinnön ala Tämä keksintö liittyy menetelmään uusien humaani 5 johdannaisten valmistamiseksi, jotka johdannaiset o siä ja joilla on pitkävaikutteinen vaikutustapa.
Keksinnön tausta
Useita diabetespotilaita hoidetaan monilla päi insuliini-injektioilla hoito-ohjelmassa, joka sisä 10 tarpeen tyydyttämiseksi yhden tai kaksi päivittä: vaikutteisen insuliinin injektiota, joiden täyd käytetään nopeavaikutteisen insuliinin bolusinjekti oihin liittyvän tarpeen tyydyttämiseksi.
Pitkävaikutteiset insuliinikoostumukset ovat tällä 15 nettuja. Siten yksi päätyyppi pitkävaikutteisista koostumuksista sisältää insuliinikiteitä tai amor: liinia sisältäviä vesipitoisia injektiosuspensiod .1·1. koostumuksissa ovat käytetyt yhdisteet tyypillisest *# 1 .·. ; ni-insuliinia, sinkki-insuliinia tai protamiini-s · 20 liinia.
• · · • · • « **"1 Insuliinisuspensioiden käyttöön liittyy tiettyjä
Siten tarkan annostelun varmistamiseksi on insulii ; lit suspendoitava homogeenisiksi ennen kuin määi suspensiota imetään pullosta tai työnnetään ulos p : 25 Insuliinisuspensioiden varastoinnin kyseessä olles * 1 1 .···. lämpötila pidettävä kokkareiden tai koaguloitumise: • · * 2 seen [Samuel, et al., Studies on the immunogenicit; mines in humans and experimental animals by n micro-complement fixation test, Clin. Exp. Immunol 252-260].
5 On myös saatu todisteita siitä, että protamiini kompleksi on itsessään immunogeeninen [Kurtz, et ai ting IgG antibody to protamine in patients tr protamine-insulins. Diabetologica 25 (1983) 322-: syystä on joillakin potilailla vältettävä protamii 10 tavien pitkävaikutteisten insuliinikoostumusten käy
Toisentyyppiset pitkävaikutteiset insuliinikoostur liuoksia, joiden pH-arvo on sen fysiologisen pH:n a josta insuliini saostuu, sen pH-arvon nousun joh< tapahtuu liuoksen injektion jälkeen. Näiden liuost 15 on se, että injektoitaessa kudokseen muodostunee! partikkelikokojakautuma ja siten lääkityksen ajoit puvainen veren virtauksesta injektiokohdassa ja m metreistä jossakin määrin ennustamattomalla tavc yksi haitta on se, että kiinteät insuliinipartikk 20 vaikuttaa ärsyttävänä tekijänä, joka aiheuttaa kude tumisen injektiokohdalla.
« * I ·
* M
.·, : Julkaisussa WO 91/12 817 (Novo Nordisk A/S) kuvai * * * vaikutteisia liukoisia insuliinikoostumuksia, jotka , koboltti(III)-insuliinikomplekseja. Näiden kompleki • · · ’;j;* 25 vaikutteisuus on ainoastaan keskinkertaista ja ni » » · *·* * ginen hyötyosuus on pieni.
ϊ Humaani-insuliinissa on kolme primaarista aminoryh .···. jun ja B-ketjun N-terminaalinen ryhmä ja LysB29:n ε-
β M
3 GB-patenttijulkaisun 1 492 997 (Nat. Res. Dev. Co: on havaittu, että karbamyylilla NeB29:stä substitu< liinin hypoglykeeminen vaikutusprofiili on parantun
Julkiseksi tulleessa JP-patenttihakemusjulkaisussc 5 (Kodama Co. , Ltd.) kuvataan insuliinia, jossa Ph' ryhmään tai LysB29: n ε -aminoryhmään tai näihin kui kiinnitetty rasvahappo. Johdannaisten valmistamisen seksi mainitaan farmakologisesti hyväksyttävän py; liinivalmisteen aikaansaaminen* 10 Insuliineja, joissa B30-asemassa on vähintään viis mia sisältävä aminohappo, joka ei välttämättä ole tripletin koodaama, on kuvattu julkiseksi tulleessa tihakemusjulkaisussa 57-067 548 (Shionogi). Insulii koskevien patenttivaatimusten mukaan nämä ovat käyt 15 diabetes mellituksen hoidossa erityisesti potila: ovat insuliiniresistenttejä siitä syystä, että näi dostunut naudaninsuliinivasta-aineita tai sianinsn aineita.
"Insuliinijohdannaisella" tarkoitetaan tässä keks: ·***· 20 distettä, jonka molekyylirakenne vastaa humaani ««« molekyylirakennetta, joka sisältää CysA7:n ja CysB7:n t ♦ A20 #·. ; CyS :n ja Cys :n välisen disulfidisillan sekä • ·* '"l CysA11:n välisen sisäisen disulf idisillan ja jossa • · . niaktiivisuutta.
• ♦ · • · « :V: 25 Tarvitaan kuitenkin edelleen käyttöön pitkävaikutte toi tavia insuliinikoos turmiksi a, jotka ovat liuoksi • sisältävät insuliineja, jotka pysyvät liuoksessa ··· · .···. jälkeen ja joiden tulehdukselliset ja immunogeeni; 4
Keksinnön yhteenveto Tässä keksinnössä on yllättäen havaittu, että tiett ni-insuliinijohdannaisten, joilla Lys“*:n ε-amino] lipofiilinen substituentti, vaikutusprofiili on p 5 teinen ja ne ovat liukoisia fysiologisissa pH-arvoi Tämän mukaisesti tämä keksintö liittyy laajimmassa insuliinijohdannaisen valmistusmenetelmään, jonka j sekvenssi on:
A-ketju S-------------------S
10 | 7 |
Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-1 2 3 4 5 6 | 8 9 10 11 12
S
15 B-ketju S
Xaa-Val-Xaa-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-123456789 10 11 12 A-ketju (jatkoa) 20 20
Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Xaa (SEQ ID NO:l) 13 14 15 16 17 18 19 | 21
----S
25 B-ketju (jatkoa) S
* · I
• « | V\ Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe- v·: 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 • » · *· I 30 B-ketju (jatkoa) • · β #· Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Xaa (SEQ ID NO:2) 25 26 27 28 29 30 ··· • · · ♦ · t 35 jossa • · ♦ · # ·** * asemissa A21 ja B3 oleva Xaa on Lys:ä, Arg:a tai Cy 5
LysB29:n ε-aminoryhmään, (b) Lys:ä, Arg:a tai Cy ottamatta mikä tahansa aminohapporyhmä, joka voi o tisen koodin koodaama, jossa tapauksessa LysB29:n massa on lipofiilinen substituentti, tai (c) delet 5 tapauksessa LysB29:n e-aminoryhmässä on lipofiilir tuentti; ja mikä tahansa sen Zn2+ -komplekseista seen, edellyttäen, että silloin kun asemassa B30 o Thr tai Ala, asemissa A21 ja B3 oleva Xaa on kumpi asemassa Bl oleva Xaa on Phe, niin insuliinijohd< 10 Zn2+-kompleksi.
Yhdessä edullisessa sovellutusmuodossa keksinnöl humaani-insuliinijohdannainen, jossa B30-aminohap del etoi tu tai se on Lys:ä, Arg:a tai Cys:ä luku mikä tahansa aminohapporyhmä, joka voi olla geneett 15 koodaama; A21- ja B3-aminohapporyhmät ovat Lys:ä,
Cys:ä lukuunottamatta toisistaan riippumatta mi aminohapporyhmä; PheB1 voi olla deletoitu; Lys^n mässä on vähintään 6-hiiliatominen lipofiilinen sub ja kuhunkin insuliiniheksameeriin voi olla sitoutun 20 ionia, edellyttäen, että silloin kun B30 on Thr tai ... ja B3 ovat kumpikin Asn, eikä PheB1 ole deletoitu, • .
*·1. liinijohdannaisen kuhunkin heksameeriin on liittyn • · · • ·» · 1 ionia.
* i « 1 1 • f» * · ·:··: Vielä yhdessä edullisessa sovellutusmuodossa keksi: . 25 daan humaani-insuliinijohdannainen, jossa B30-amin *»1 on deletoitu tai se on Lys:ä, Arg:a tai Cys;ä luku • » · mikä tahansa aminohapporyhmä, joka voi olla geneett . 1 koodaama; A21- ja B3-aminohapporyhmät ovat Lys:ä, • · · ♦ · ·
Cys:ä lukuunottamatta toisistaan riippumatta mi • » • « ~ « Ί , , - , - - ... - . , 6 ryhmä on deletoitu tai se on Lys:ä, Arg:a tai Cy: ottamatta mikä tahansa aminohapporyhmä, joka voi o tisen koodin koodaama; A21- ja B3-aminohapporyhmät sistaan riippumatta Lys:ä, Arg:a tai Cys:ä luku 5 mikä tahansa aminohapporyhmä, joka voi olla geneett koodaama; PheB1 voi olla deletoitu; LysB29 :n ε-amino: vähintään 6-hiiliatominen lipofiilinen substituent hunkin insuliiniheksameeriin on sitoutunut 2-4 Zn2+-
Vielä yhdessä edullisessa sovellutusmuodossa keksi: 10 daan humaani-insuliinijohdannainen, jossa B30-amin on deletoitu.
Vielä yhdessä edullisessa sovellutusmuodossa keksi: daan humaani-insuliinijohdannainen, jossa B30-amin on Asp.
15 Vielä yhdessä edullisessa sovellutusmuodossa keksi: daan humaani-insuliinijohdannainen, jossa B30-amin on Glu.
Vielä yhdessä edullisessa sovellutusmuodossa keksi: ... daan humaani-insuliinijohdannainen, jossa B30-amin *···* 20 on Thr.
- · « • · · • 1« • i
Vielä yhdessä edullisessa sovellutusmuodossa keksi: • * daan humaani-insuliini johdannainen, jossa B30-ami . .·. vähintään 10-hiiliatominen lipofiilinen aminohappo.
• · * ··« ·»» • · 9 *·* * Vielä yhdessä edullisessa sovellutusmuodossa keksi: 25 daan humaani-insuliinijohdannainen, jossa B30-ami » · : 10-24-hiiliatominen lipofiilinen a~aminohappo.
*· · • · • * 7
Vielä yhdessä edullisessa sovellutusmuodossa keksi daan humaani-insuliinijohdannainen, jossa B30-aminc tai L-Ns-dodekanoyylilysiini.
Vielä yhdessä edullisessa sovellutusmuodossa keksi 5 daan humaani-insuliinijohdannainen, jossa B30-anu α-aminodekaanihappo.
Vielä yhdessä edullisessa sovellutusmuodossa keksi daan humaani-insuliinijohdannainen, jossa B30-amd α-aminoundekaanihappo.
10 Vielä yhdessä edullisessa sovellutusmuodossa keksi daan humaani-insuliinijohdannainen, jossa B30-am: a-aminododekaanihappo.
Vielä yhdessä edullisessa sovellutusmuodossa keksi daan humaani-insuliinijohdannainen, jossa B30-am: 15 a-aminotridekaanihappo.
Vielä yhdessä edullisessa sovellutusmuodossa keksi daan humaani-insuliini johdannainen, jossa B30-arrd α-aminotetradekaanihappo.
• · * • * • · ·« # : Vielä yhdessä edullisessa sovellutusmuodossa keksi *· *t ,·, ; 20 daan humaani-insuliinijohdannainen, jossa B30-am: • * * l α-aminopentadekaanihappo.
* * ·.·.· Vielä yhdessä edullisessa sovellutusmuodossa keksi lV: daan humaani-insuliinijohdannainen, jossa B30-anu α-aminoheksadekaanihappo.
• * » « * *;:/ 25 Vielä yhdessä edullisessa sovellutusmuodossa keksi 8
Vielä yhdessä edullisessa sovellutusmuodossa keksi daan humaani-insuliinijohdannainen, jossa A21-amir on Gin.
Vielä yhdessä edullisessa sovellutusmuodossa keksi 5 daan humaani-insuliinijohdannainen, jossa A21-amir on Gly.
Vielä yhdessä edullisessa sovellutusmuodossa keksi daan humaani-insuliinijohdannainen, jossa A21-amir on Ser.
10 Vielä yhdessä edullisessa sovellutusmuodossa keksi daan humaani-insuliinijohdannainen, jossa B3-amir on Asp.
Vielä yhdessä edullisessa sovellutusmuodossa keksi daan humaani-insuliinijohdannainen, jossa B3-amir 15 on Gin.
Vielä yhdessä edullisessa sovellutusmuodossa keksi daan humaani-insuliinijohdannainen, jossa B3-amir on Thr.
« « « · ««« ,·, ; Vielä yhdessä edullisessa sovellutusmuodossa keksi • ·· * l 20 daan humaani-insuliini johdannainen, jossa LysB29:n e
* M
[ sisältää lipofiilisen substituentin, joka on asyyld vastaa vähintään 6-hiiliatomista karboksyylihappoa.
t » « i · · ··· :***: Vielä yhdessä edullisessa sovellutusmuodossa keksi « daan humaani-insuliinijohdannainen, jossa LysB29:n ε : ,·. 25 sisältää lipofiilisen substituentin, joka on haaro I I · « ,···. haaroi ttumaton asyyliryhmä, joka vastaa karboks * 9
Vielä yhdessä edullisessa sovellutusmuodossa keksi] daan humaani-insuliinijohdannainen, jossa Lys :n ε sisältää lipofiilisen substituentin, joka on asyyli vastaa lineaarista, tyydyttynyttä 6-24-hiiliatomi1 5 syy1ihappoa.
Vielä yhdessä edullisessa sovellutusmuodossa keksi: daan humaani-insuliinijohdannainen, jossa Lys829 : n ε sisältää lipofiilisen substituentin, joka on asyyli vastaa lineaarista, tyydyttynyttä 8-12-hiiliatomi1 10 syylihappoa.
Vielä yhdessä edullisessa sovellutusmuodossa keksi: daan humaani-insuliini johdannainen, jossa Lys829 : n ε sisältää lipofiilisen substituentin, joka on asyyli vastaa lineaarista, tyydyttynyttä 10-16-hiiliatomi 15 syylihappoa.
Vielä yhdessä edullisessa sovellutusmuodossa keksi: daan humaani-insuliini johdannainen, jossa LysB29:n ε sisältää lipofiilisen substituentin, joka on oligo-niryhmä, joka sisältää korkeintaan 10, edullisesti 20 5, oksietyleeniyksikköä.
«it • · J · · • Vielä yhdessä edullisessa sovellutusmuodossa keksi: *· 1! daan humaani-insuliini johdannainen, jossa Lys829 : n ε ·"1· sisältää lipofiilisen substituentin, joka on oligo leeniryhmä, joka sisältää korkeintaan 10, ja edull ij : 25 keintaan 5, oksipropyleeniyksikköä.
. Vielä yhdessä edullisessa sovellutusmuodossa keksi] « 1 · **·/ daan humaani-in suliini johdannainen, jossa kukin in : : ____ , ^ „ 2+ . .
10
Vielä yhdessä edullisessa sovellutusmuodossa keksi: daan humaani-insuliinijohdannainen, jossa kukin heksameeri sitoo 4 Zn2+-ionia.
Keksinnön mukaisesti saatua humaani-insuliinijohdan 5 daan käyttää diabeteksen hoitoon tarkoitetun lääkk tamiseksi.
Tässä hakemuksessa kuvataan myös diabeteksen hoiti tettu farmaseuttinen koostumus tällaisen hoidon tar vaa potilasta varten, joka koostumus sisältää terä 10 tehokkaan määrän tämän keksinnön mukaisesti saati insuliinijohdannaista yhdessä farmaseuttisesti hy kantaja-aineen kanssa.
Tässä hakemuksessa kuvataan myös diabeteksen hoiti tettuun farmaseuttiseen koostumukseen tällaisen l· 15 peessa olevaa potilasta varten, joka koostumus sis peuttisesti tehokkaan määrän tämän keksinnön mukais humaani-insuliinijohdannaista, yhdistettynä insul insuliinianalogiin, jolla on nopeasti alkava vaikut farmaseuttisesti hyväksyttävän kantaja-aineen kanss III • «
• I
20 Tässä hakemuksessa kuvataan myös farmaseuttinen • i i • *· joka sisältää tämän keksinnön mukaisesti saatua hu • · ! *· *· liinijohdannaista, joka on liukoinen fysiologisissa »in· * · sa.
# · *
• · I
Ml /:·. Tässä hakemuksessa kuvataan myös farmaseuttinen *·* * 25 joka sisältää tämän keksinnön mukaisesti saatua hu , , liinijohdannaista, joka on liukoinen pH-arvoissa noin 6,5 - noin 8,5.
11 1200 nmol/ml, edullisesti noin 600 nmol/ml, tämäi mukaisesti saatua humaani-insuliinijohdannaista.
Tässä hakemuksessa kuvataan myös menetelmä diabete miseksi tällaisen hoidon tarpeessa olevaa potila: 5 joka menetelmä käsittää sen, että potilaalle ann peuttisesti tehokas määrä tämän keksinnön mukais» insuliinijohdannaista yhdessä farmaseuttisesti h^ kantaja-aineen kanssa.
Tässä hakemuksessa kuvataan myös menetelmä diabete 10 miseksi tällaisen hoidon tarpeessa olevalla potil menetelmä sisältää sen, että potilaalle annetaan sesti tehokas määrä tämän keksinnön mukaisesti saat nijohdannaista yhdistettynä insuliiniin tai insu giin, jonka vaikutus käynnistyy nopeasti, yhdessä f 15 sesti hyväksyttävän kantaja-aineen kanssa.
Esimerkkejä tämän keksinnön mukaisesti saaduista humaani-insuliinijohdannaisista, joihin ei ole lainkaan Zn2+-ioneja, ovat seuraavat: NEB29-tridekanoyyli-des (B30) -humaani-insuliini, j * J··] 20 N£B29-tetradekanoyyli-des (B30) -humaani-insuliini, *· *5 N£B29-dekanoyyli-des (B30) -humaani-insuliini, *· *5 NeB29-dodekanoyyli-des (B30)-humaani-insuliini, ***** N^-tridekanoyyli-Gly^-des (B30) -humaani - insul i ini, :,{e: N^-tetradekanoyyli-Gly^-des (B30) -humaani-insuliin 25 N^-dekanoyyli-Gly^-des (B3 0) -humaani-insuli ini, N^-dodekanoyyli-Gly^-des (B30) -humaani - insuliini, ; .·. N^-tridekanoyyli-Gly^-Gln^-des (B30) -humaani-insul.
,···, NeB29-tetradekanoyyli-GlyA21-GlnB3-des (B30) -humaani-insi 12 N^-tetradekanoyyli-Ala^-Gln^-des (B30) -humaani-ins- N^-dekanoyyli-Ala^-Gln^-des (B30) -humaani-insuliin rjeB29_dodekanoyyli-AlaA21-GlnB3-des (B30) -humaani-insuli
NeB29-tridekanoyyli-GlnB3-des (B30) -humaani-insuliini, 5 NeE29-tetradekanoyyli-GlnB3-des (B30) -humaani-insuliini
NeE29-dekanoyyli-GlnB3-des (B30) -humaani-insuliini, N£B29-dodekanoyyli-GlnB3-des (B30) -humaani-insuliini, ΝεΒ29“ tr idekanoyyli -GlyA21-humaani -insul iini, N£B29-tetradekanoyyli-GlyÄ21-humaani-insuliini, 10 N^-dekanoyyli-Gly^-humaani- insuliini,
NeB29-d0dekan0yyli-GlyAn-humaani-insul iini,
NeB29-tridekanoyyli-GlyAZ1-Gin83-humaani-insuliini,
NeB2S-1 etradekanoyy 1 i -Glywi -GlnB3 -humaani - insuliini, N£B29-dekanoyyli -Gly^-Gln03-humaani - insul iini, 15 N£B29-dodekanoyyli-GlyA21-GlnB3-humaani-insuliini, N£B29- tr idekanoyy 1 i-AlaÄ21-humaani- insuliini, ΝεΒ29- te tradekanoyy 1 i - Ai a*2 ^humaani - insuliini, N£B29-dekanoyyli-AlaA21-humaani-insuliini, N£B29-dodekanoyyli -Ala^-humaani - insuliini, 2 0 N£B29 - tr idekanoyyl i - AlaA21GlnB3 -humaani - insuliini, N6*29-tetradekanoyy li-Ala^-Gln113-humaani-insuliini, ,··, NeB29-dekanoyyli-AlaÄ21-GlnB3-humaani- insuliini,
NeB29-dodekanoyyli-AlaA21-GlnB3-humaani-insuliini, l I N£B29-tridekanoyyli-Gin83-humaani-insuliini, * * * • · 25 NeB2s- tetradekanoyyl i -Gin03-humaani - insul i ini, N£029-dekanoyyli-GlnB3-humaani-insuliini, *·!·* NeB29-dodekanoyyli-GlnB3-humaani-insuliini, «I» V : NeB^9-tr idekanoyyl i-GluB30-humaani-insul i ini, ΝεΒ29- tetradekanoyyli -GluB30-humaani - insul i ini, f :*J 3 0 NeB29-dekanoyyli-GluB30-humaani-insuliini, ••f * ···_ .τεΒ29 a m,,130 -u______a 4____η . . _ 4 13
NcB29-dodekanoyyli-GlyA21-GlnB3-GluB30-humaani- insuliini, ΝεΒ29-tr idekanoyyli-Ala^-Glu^-humaani-insuliini, ΝεΒ29- tetradekanoyyli -Ala*21-Glu830-humaani - insuliini, ΝεΒ29 - dekanoyyl i -Ala^-Glu530 - humaani - insul i ini, 5 NcB29-dodekanoyyli-Al a*2 ^Glu330-humaani-insuliini,
NcB29-tridekanoyyli-AlaA21-GlnB3-GluB30-humaani-insuliini ΝεΒ29- tetradekanoyyli -AlaÄ21-GlnB3-GluB3°-humaani - insul ii ΝεΒ29- dekanoyyl i - Ai aA2i-Gin83-GluB3°-humaani- insuliini, N€B29-dodekanoyyli-AlaA21-GlnB3-GluB30-humaani-insuliini, 10 NeB29-tridekanoyyli-GlnB3-GluB30-humaani-insuliini, ΝεΒ29- tetradekanoyyli -GlnB3-GluB3°-humaani- insuliini, ΝεΒ29 - dekanoyyl i -GlnB3 -GluB3°-humaani - insul i ini j a Νε“9 - dodekanoyy 1 i -GlnB3 -GluB3°-humaani - insul i ini .
Esimerkkejä edullisista tämän keksinnön mukaisest: 15 humaani-insuliinijohdannaisista, joissa insuliini kohti on kiinnittynyt kaksi Zn2+-ionia, ovat seuraav (N£B29-tridekanoyyli-des (B30) -humaani-insuliini) 6, 2 ! <NsB29-tetradekanoyyli-des (B30) -humaani-insuliini) 6, : (N£B29-dekanoyyli-des ΪΒ30)-humaani-insuliini) 6, 2 Zn2+ 20 (NEB29-dodekanoyyli-des (B30) -humaani-insuliini) 6, 2 Zi ϊ.ββϊ (NEB29-tridekanoyyli-GlyA21-des (B30) -humaani-insuliini :*·,· (NEBM-tetradekanoyyli-GlyM1-des (B30) -humaani-insulii] * · • \! (NeB29-dekanoyyli-GlyA21-des (B30) -humaani-insuliini) 6, • * (N£B29-dodekanoyyli-GlyA21-des (B30) -humaani-insuliini) ( , 25 (N£B29-tridekanoyyli-GlyA21-GlnB3-des (B30) -humaani-insu! ♦ · » ··· Ä 2* ..... 2 Zn , • (ncB29-tetradekanoyyli-GlyA21-GlnB3-des (B30) -humaani-in: : 2 Zn" ··· : (N^-dekanoyyli-Gly^-Gln^-des (B30) -humaani-insuliii ··· ! I -> Λ /·κτεΒ29 _______-] -,-ι A21 -, B3 J _ / τ-, -> Λ \ 1_____ Ί 14 (N^-tridekanoyyli-Ala^-Gln^-des (B30) -humaani-insu] 2 Zn2+, (N^-tetradekanoyyli-Ala^-Gln^-des (B30) -humaani-ins 2 Zn2+ 5 (N^-dekanoyyli-Ala^-Gln^-des (B30) -humaani-insuliir (N^-dodekanoyyli-Ala^-Gln^-des (B30)-humaani-insul: 2 Zn2+, (NeB29-tridekanoyyli-GlnB3-des (B30) -humaani-insuliini) (NeB29-tetradekanoyyli-GlnB3-des (B30) -humaani-insuliin 10 (N^-dekanoyyli-Gln^-des (B30) -humaani-insuliini) 6, 1 (N£B29-dodekanoyyli-GlnB3-des (B30) -humaani-insuliini) 6, (ΝεΒ29- tr idekanoyy 1 ihumaani - insul i ini) 6, 2 Zn2+, (NeB29-tetradekanoyylihumaani-insuliini) 6, 2 Zn2+, (NeB29-dekanoyylihumaani-insuliini) 6, 2 Zn2+, 15 (NeB29-dodakanoyylihumaani-insuliini) 6, 2 Zn2+, {NEB29-tridekanoyyli-GlyA21-humaani-insuliini) 6/ 2 Zn2*, {NeB29-tetradekanoyyli-GlyA21-humaani-insuliini) 6, 2 Zn (NeB29-dekanoyyli-GlyA21-huinaani-insuliini)6, 2 Zn2\ (N£B29-dodekanoyyli-GlyA2i-huinaani-insuliini) 6, 2 Zn2", 20 (NeB29-tridekanoyyli-GlyA21-GlnB3-humaani-insuliini)6/ 2 (N£B29-tetradekanoyyli-Gly^-Gln^-humaani-insuliini) 6, ·*··. (NeB29-dekanoyyli-GlyA21-GlnE3-humaani-insuliini) 6, 2 Zn : (NeB29-dodekanoyyli-GlyA21-GlnB3-humaani-insuliini) 6/ 2 ,·. ; (NEB29-tridekanoyyli-AlaA21-humaani-insuliini) 6, 2 Zn2+, • · · I 25 (N^-tetradekanoyyli-Ala^-humaani-insuliini) 6, 2 Zn . (N£:B29-dekanoyyli-AlaA21-humaani-insuliini) 6/ 2 Zn2+, * * * **|·* (NeB29-dodekanoyyli-AlaA21-humaani-insuliini) 6# 2 Zn2+, *·* * (N£B29-tridekanoyyli-AlaA21-GlnB3-humaani-insuliini)6, 2 (N£B29-tetradekanoyyli-AlaA21-GlnB3-humaani-insuliini) 6, 30 (NeB29-dekanoyyli-AlaA21-GlnB3-humaani-insuliini)6, 2 Zn : (NeB29-dodekanoyyli-AlaA21-GlnB3-humaani-insuliini),, 2 4 15 (NeB29-dodekanoyyli-GluB30-humaani-insuliini)6, 2 Zn2+, {N^-tridekanoyyli-Gly^-Glu^-humaani-insuliini) 6, I (N^-tetradekanoyyli-Gly^-Glu^-humaani-insuliini) 6, (N^-dekanoyyli-Gly^-Glu^-humaani-insuliini) 6, 2 Zi 5 (N^-dodekanoyyli-Gly^-Glu^-humaani-insuliini) 6, 2 (N^-tridekanoyyli-Gly^-Gln^-Glu^-humaani-insuliin (tj^-tetradekanoyyli-Gly^-Gln^-Glu^-humaani-insuli (N^-dekanoyyli-Gly^-Gln^-Glu^-humaani-insuliini) 6, (N£B29-dodekanoyyli-GlyA21-GlnB3-GluB30-humaani-insuliini 10 (KfsB29-tridekanoyyli-AlaA21-GluB30-humaani-insuliini) 6, ^ (NeB29-tetradekanoyyli-AlaA21-GluB30-huinaani-insuliini) 6J (NeB29-dekanoyyli-AlaA21-GluB30-humaani-insuliini) 6, 2 Zi (N£B29-dodekanoyyli-AlaA21-GluB30-humaani-insuliini) 6/ 2 (N£B29-tridekanoyyli-AlaA21-GlnB3-GluB30-humaani-insuliin 15 (NEB29-tetradekanoyyli-AlaA21-GlnB3-GluB30-humaani-insuli (NcB29“dekanoyyli-AlaA21-GlnB3-GluB30-huinaani-insuliini) gJ (NEB29-dodekanoyyli-AlaA21-GlnB3-GluB30-humaani-insuliini (NEB29-tridekanoyyli-GlnB3-GluB30-humaani-insuliini) 6, 2 (NEB29-tetradekanoyyli-GlnB3-GluB3“-humaani-insuliini) 6, 20 ( NeB2 9-dekanoyyli-GlnB3-GluB3°-humaani-insuliini) 6, 2 Zn (NeBZ9-dodekanoyyli-GlnB3-GluB30-huinaani-insuliini) 6, 2 ·»· • · • * *·’. Esimerkkejä tämän keksinnön mukaisesti saaduista * · · *; *| humaani-insuliini johdannaisista, joissa insuliini *· kohti on kiinnittynyt kolme Zn -ionia, ovat seuraav * « . 25 (N£B29-tridekanoyyli-des (B30) -humaani-insuliini) 6, 3 ; (NEB29-tetradekanoyyli-des (B30) -humaani-insuliini) 6, ; f t » (NEB29-dekanoyyli-des (B30) -humaani-insuliini) 6, 3 Zn2\ . , (NeB29-dodekanoyyli-des (B30) -humaani-insuliini),, 3 Zi * * * (NEB29-tridekanoyyli-GlyA21-des (B30) -humaani-insuliini] ! · -j λ /TkTSB29 . ,____, , ____, . A21 j -i . ....
16 (NcB29-dekanoyyli-Gly"l-GlnB3-des (B30) -humaani-insulii] (NeB29-dodekanoyyli-GlyA21-GlnB3-des (B3O) -humaani-insu: 3 Zn\ (N^-tridekanoyyli-Ala^-des (B30) -humaani-insuliini 5 {neB29- tetradekanoyyl i - Ala*21-des (B30) -humaani-insul ii] (N^-dekanoyyli-Ala^-des (B30) -humaani-insuliini) 6, (N^-dodekanoyyli-Ala^-des (B30) -humaani-insuliini) < (N^-tridekanoyyli-Ala^-GlnBS-des (B30) -humaani-insi 3 Zn2+, 10 (N^-tetradekanoyyli-Ala^-Gln^-des (B30) -humaani-in; 3 Zn\ (N^-dekanoyyli-Ala^-Gln^-des (B3 0) -humaani-insul ii] (N£B29-dodekanoyyli-Alawl-GlnB5-des (B30) -humaani-insul (N£B29-tridekanoyyli-GlnB3-des (B30) -humaani-insuliini) 15 (N£B29-tetradekanoyyli-GlnB3-des (B30) -humaani-insuliir {N£B29-dekanoyyli-GlnB3-des (B30) -humaani-insuliini)6, : (NsB29-dodekanoyyli-GlnB3-des (B30) -humaani-insuliini) 6 {NeB29-tridekanoyylihumaani-insuliini) 6, 3 Zn2+ {N£B29-tetradekanoyylihumaani- insuliini )6, 3 Zn2+, 20 (NeB29-dekanoyylihumaani-insuliini) 6, 3 Zn2+, (N£B29-dodekanoyylihumaani-insuliini)6, 3 Zn2+, .···. (NcB29-tridekanoyyli-GlyA21-humaani-insuliini) fi, 3 Zn2+, ,·, * (N£B29-tetradekanoyyli-Gly*21-humaani-insuliini) , 3 Zn 9 9 9 /·' I (N£B29-dekanoyyli-GlyA21-humaani-insuliini) 6, 3 Zn2+, ] * 25 (N£B29-dodekanoyyli-GlyA21-humaani-insuliini) 6, 3 Zn2+ (N£B29-tridekanoyyli-GlyA21-GlnB3-humaani-insuliini)6, 3 * * * *···* (NErB29-tetradekanoyyli-GlyA21-GlnB3-humaani-insuliini),, *.* * (N£B29-dekanoyyli-GlyA21-GlnB3-humaani-insuliini) 6, 3 Zn (N£B29-dodekanoyyli-GlyA21-GlnB3-humaani-insuliini)6, 3 ;.· · 30 (N£B29-tridekanoyyli-Ala^-humaani-insuliini)6, 3 Zn2+, * * / — kot" oV^ri Ari Ί 7V"| _Vn ima an i nnoiil ΐ \ O 7 n 17 (NEB29-tetradekanoyyli-GlnB3-humaani-insuliini) 6, 3 Zn2 (NeB29-dekan0yyli-GlnB3-humaani-insuliini) 6, 3 Zn2+, (jjeB29_dodekan0yyli-Gin03-humaani-insuliini)6, 3 Zn2+, (NcB29-tridekanoyyli-GluB30-humaani-insuliini)6, 3 Zn2+, 5 (NEB29-tetradekanoyyli-GluB30-humaani-insuliini)6, 3 Zn (NEB29-dekanoyyli-GluB30-humaani-insuliini} 6, 3 Zn2\ (NeE29-dodekanoyyli-GluB:i0-humaani-insuliini) 6, 3 Zn2+, (NeB29-tridekanoyyli-GlyA21-GluB30-humaani-insuliini) 6, ; (N^-tetnadekanoyyli-Gly^^Glu^^huinaani-insuliini) 6, 10 (N^-dekanoyyli-Gly^-Glu^-humaani-insuliini) 6, 3 Zi (NEB29-dOdekanOyyli-GlyA21-GluB30-huinaani-insuliini) 6, 3 (NeB29-tridekanoyyli-GlyA21-GlnB3-GluB30-humaani-insuliin (NeB29-tetradekanoyyli-GlyA2i-GlnB3-GluB30-humaani-insuli
(N^-dekanoyyli-Gly^-Gln^-Glu830-humaani-insuliini) 6J
15 (N^-dodekanoyyli-Gly^-Gln^-Glu^-humaani- insuliini (N^-tridekanoyyli-Ala^-Glu^-humaani-insuliini) 6, ! (ΝεΒ29 -1 e tradekanoyyl i - AlaA21-GluB30-humaani -insuli ini) 6, (N£rB29-dekanoyyli-AlaA21“GluB30-humaani-insuliini) 6/ 3 Zi (NEB29-dodekanoyyli-AlaA21-GluB30-humaani-insuliini) 6, 3 2 0 (jjeBZ9-tridekanoyyli-AlaA21-GlnB3-GluB30-humaani-insuliin (NEB29-tetradekanoyyli-AlaA21-GlnB3-GluB30-humaani-insuli .··*. (N2829-dekanoyyli-AlaA21-GlnB3-GluB30-humaani-insuliini) 6, ,·. : (N2B29-dodekanoyyli-AlaA21-GlnB3-GluB30-humaani-insuliini I (NeB29-tridekanoyyli-GlnD3-GluB30-humaani-insuliini)6, 3 * 25 (N^-tetradekanoyyli-Gln^-Glu^-humaani-insuliini) 6, (ΝεΒ29-dekanoyyli-Gin83-Glu830-humaani-insuliini)6# 3 Zn *·:·* (ΝεΒ29-dodekanoyyli-Gin83-GluB30-humaani-insuliini),, 3 • ·* 0 • · * • · *
Esimerkkejä tämän keksinnön mukaisesti saaduista : humaani-insuliinijohdannaisista, joissa insuliini ι·« a .···, 30 kohti on kiinnittynyt neljä Zn+-ionia, ovat seuraav « φ 4 18 (N£B29-dekanoyyli-Glywl-des (B30) -humaani-insuliini) 6, (Nt:029-dodekanoyyli-GlyA21-des (B30} -humaani-insuliini), (N^-tridekanoyyli-Gly^-Gln^-des (B30) -humaani-insu 4 Zn2+, 5 GsreB29-tetradekanoyyli-GlyA21-GlnB3-des (B30) -humaani-in 4 Zn\ (N^-dekanoyyli-Gly^-Gln^-des (B30) -humaani-insulii: (N^-dodekanoyyli-Gly^-Gln^-des (B30) -humaani-insul 4 Zn\ 10 (N^-tridekanoyyli-Ala^-des (B30) -humaani-insuliini (N^-tetradekanoyyli-Ala^-des (B30) -humaani-insulii: {N^-dekanoyyli-Ala^-des (B30) -humaani-insuliini) 6, (N'^-dodekanoyyli-Ala^-des (B30) -humaani-insuliini) (NeB29-tridekanoyyli-AlaA21-Glne3-des (B30) -humaani-insu 15 4 Ζη2% (N^’-tetradekanoyyli-Ala^-Gln^-des (B30) -humaani-in 4 Zn% (NsB29-dekanoyyli-AlaA21-GlnB3-des (B30) -humaani-insul ii (N£B29-dodekanoyyli-AlaA21-GlnB3-des (B30) -humaani-insul 2 0 {Nc929-tridekanoyyli-GlnB3-des (B30) -humaani-insuliini) (N£B29-tetradekanoyyli-GlnB3-des (B30) -humaani-insuliir .···. (NEB29-dekanoyyli-GlnB3-des (B30) -humaani-insuliini) 6, .·*** (N?B29-dodekanoyyli-GlnB3-des (B30) -humaani-insuliini) 6 Λ ΛΛ ^ J (N£B29-tridekanoyylihumaani-insuliini) 6, 4 Zn2+, * J 25 (NsB29-tetradekanoyylihumaani-insuliini) 6, 4 Zn2+, (N5B29-dekanoyylihumaani-insuliini) 6, 4 Zn2\ *···* (NeB29-dodekanoyylihumaani-insuliini),, 4 Zn2+, *.* * {NeB29-tridekanoyyli-GlyA21-humaani-insuliini) 6, 4 Zn2+, (NeB29-tetradekanoyyli-GlyA21-humaani-insuli ini) 6, 4 Zr 30 (NEB29-dekanoyyli-GlyA21-humaani-insuli ini) 6, 4 Zn2+, ·***· (-KT£'s29-dnrieal<-arir>w1 i -fit v^-hiirrwani -1 nsnl π ϊ η i \ Δ 7!n2+.
19 (N£B29-dodekanoyy li-Ala^-humaani-insuliini)6, 4 Zn2+, (N^-tridekanoyyli-Ala^-Gln^-humaani-insuliini) 6/ 4 (N^-tetradekanoyyli-Ala^-Gln^-humaani-insuliini) 6, (Νε“9-dekanoyyli-Ala"1-Gln“-humaani-insuliini)6/ 4 Zn 5 (NeB29-dodekanoyyli-Al a*21-GlnB3-humaani-insuliini)6, 4 (NEB29-tridekanoyyli-GlnB3-humaani-insuliini)6, 4 Zn2+, (NEB29-tetradekanoyyli-GlnB3-humaani-insuliini) 6, 4 Zn2 (NsB29-dekanoyyli-Gin153-humaani-insuli ini) 6, 4 Zn2+, (NeB29-dodekanoyyli-GlnB3-humaani-insuliini) 6, 4 Zn2+, 10 (NeB29-tridekanoyyli-GluB30-humaani-insuliini) 6, 4 Zn2+, (NEB29-tetradekanOyyli-GluB30-humaani-insuliini)6, 4 Zn (NeB29-dekanoyyli-GluB30-humaani-insuliini) 6, 4 Zn2+, (NeB29-dodekanoyyli-GluB30-humaani-insuliini) 6, 4 Zn2+, (NeB29-tridekanoyyli-GlyA21-GluB30-huinaani-insuliini)6, < 15 (NeB29-tetradekanoyyli-GlyA21-GluB30-humaani-insuliini) 6, (N£B29-dekanoyyli-GlyA21-GluB30-h-uinaani-insuliini)6, 4 Zi (NeB29-dodekanoyyli-GlyA21-GluB30-humaani-insuliini) 6, 4 (NeB29-tridekanoyyli-GlyA21-GlnB3-GluB30-humaani-insuliin (NeB29-tetradekanOyyli-GlyA21-GlnB3-GluB30-humaani-insuli 20 (NeB29-dekanoyyli-GlyA21-GlnB3-GluB30-humaani-insuliini) 6, (N£B29-dodekanoyyl i -Gly^-Gln63 -GluB30-humaani - insul i ini :***; (NEB29-tridekanoyyli-AlaA21-GluB30-humaani-insuliini),, < J (NE;B29-tetradekanoyyli-AlaA21-GluB30-huinaani-insuliini) 6l : (NeB29-dekanoyyli-AlaA21-GluB30-huiaaani-insuliini),, 4 Zr • ·· b 25 (NeB29-dodekanoyyli-AlaA21-GluB30-humaani-insuliini) 6, 4 . (NEB29-tridekanoyyli-AlaA21-GlnB3-GluB30-huinaani-insuliin * · · “I (NeB29-tetradekanoyyli-AlaA21-GlnB3-GluB30-humaani-insuli ‘ (NeB29-dekanoyyli-AlaA21-GlnB3-GluB30-humaani-insuliini) 6, (NEB29-dodekanoyyli-AlaA21-GlnB3-GluB30-humaani-insuliini * :.: : 3 0 (NsB29-tridekanoyyli-GlnB3-GluB30-humaani-insuliini)6, 4 (NeB29-tetradekanoyyli-GlnB3-GluB30-humaani-insuliini),, 20 kuvio 1 on esitys plasmidin pEA5.3.2 konstruoirmist kuvio 2 on esitys plasmidin pEAl08 konstruoinnista; kuvio 3 on esitys plasmidin pEA113 konstruoinnista.
Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus 5 Terminologia Tässä keksinnössä käytetyt aminohapporyhmien kolmi ja yksikirjaimiset koodit ovat koodeja, jotka c julkaisussa J. Biol. Chem. 243, p. 3558 (1968).
DNA-sekvensseissä A on adeniini, C on sytosiini, G 10 ja T on tyrniini.
Keksinnössä käytetään seuraavia lyhenteitä: DMSO tarkoittaa dimetyylisulfoksidia, DMF dimetyyli Boc tert-butoksikarbonyyliä, RP-HPLC korkean sr käänteisfaasinestekromatografiaa, X-OSu on N-hydrc 15 midiesteri, X on asyyliryhmä ja TFA trifluorietikka
Lipofiilisten insuliinijohdannaisten valmistus Tämän keksinnön mukaisia insuliini johdannaisia v< * a ·/·: mistaa muun muassa seuraavan kuvauksen mukaisesti: » » * · 9 • »· 1. Insuliinijohdonnaiset, jotka sisältävät asemassa • · . 2 0 happoryhmän, joka voi olla geneettisen koodin koo * 1 1
Hl merkiksi treoniini (humaani-insuliini) tai alan V: insuliini) 111 Valmistus lähtien humaani-insuliinista 21 laisen N-hydroksisukkinimidiesterin kanssa, jolle X-OSu, jossa X on liitettävä asyyliryhmä. Viimeises sa käytetään TFA:ta Boc-ryhmien poistamiseksi N^-X-hiimaani-insuliini, eristetään.
5 1.2 Valmistus lähtien yksiketjuisesta insuliiniprek Lähtöaineena voidaan käyttää yksiketjuista insulii ria, jota on pidennetty Bl-asemasta pidennyss (Ext), j oka 1i i ttyy Bl:een argini ini ryhmän välit jossa B30:stä Ai:een kulkeva silta on arginiinii 10 lähtöaine on toisin sanoen yleisen kaavan Ext A Arg-A(l-21) mukainen yhdiste. Kun tämä lähtöaine sellaisen yleisen kaavan X-OSu mukaisella N-hydroks diesterillä, jossa X on asyyliryhmä, niin lähtöaine tyy asyyliryhmä X, joka menee prekursorin LysB29:n 15 mään ja N-terminaaliseen aminoryhmään. Kun ti (ΝεΒ29-Χ) , X-Ext-Arg-B (1-30) -Arg-A( 1-21) mukaista prekursoria käsitellään trypsiinillä veden ja sop: sekoittuvan orgaanisen liuottimen, esimerkiksi DM1 tai alemman alkoholin, kanssa, niin saada 20 (NeB29-X) , ArgB31-insuliini mukaista välituotetta. Kä \.t* tätä välituotetta karboksipeptidaasi B:llä saadac tuotetta (ΝεΒ29-Χ) insuliinia.
• ♦ ♦ · ·
• M
\ 2. Insuliinijohdannaiset, joissa asemassa B30 ei e • * * nohapporyhmää, toisin sanoen des(B30) insuliinit • i * i · » • ; 25 2»1 Valmistus humaani-insuliinista tai sian i lahtien • « • « * • · » ***,· Kun humaani-insuliinia ja sian insuliinia käsitellä • · ·· . . .. ....
22 kiksi käyttäen HPLC:ää, jälkeen molekyyliin liitet ε-aminoryhmään asyyliryhmä antamalla tuotteen reago sen kaavan X-OSu mukaisen N-hydroksisukkinimidieste jossa X on liitettävä asyyliryhmä. Viimeisessä vai: 5 tetään TFA:ta Boc-ryhmien poistamiseksi ja tuote, {B30)insuliini, eristetään.
2.2 Valmistus yksiketjuisesta humaani-insuliinipr lähtien Käyttökelpoinen lähtöaine voi olla yksiketjuinen 10 prekursori, jota on pidennetty Bl-asemasta piden sillä (Ext), joka liittyy Bl:een arginiiniryhmän v ja jossa B30:stä Al:een kulkeva silta. Tämä silta sesti sellaisen kaavan Yn-Arg mukainen peptidi, koodittuva aminohappo, paitsi lysiini ja arginiin 15 nolla tai väliltä 1-35 oleva kokonaisluku. Kun N > voivat merkitä eri aminohappoja. Edullisia esimerkk Ai:een ulottuvasta sillasta ovat: AlaAlaArg
SerAspAspAlaArg ja Arg (eurooppalainen patenttiji 163 529). Kun tällaista yleisen 2 0 Ext-Arg-B (1-30) -Y-Arg-A( 1-21) mukaista prekursori * * * * lään lysyyliendopeptidaasilla, esimerkiksi Ac :('*i lyticuksen proteaasilla, saadaan Ext-Arg-B (1-29) Tl : (l-21)des (B30) insuliinia. Kun tätä välituotetta • » ·;*** sellaisen yleisen kaavan X-OSu mukaisella N-hydroks • 25 diesterillä, jossa X on asyyliryhmä, niin asy liittyy Ly s :n ε-aminoryhmään ja A-ketjun j« *· * * N-terminaali seen amino ryhmään, mistä . (N'B2s-X)X-Ext-Arg-B (1-29 )X-Thr-Yn-Arg-A( 1-21) des (B30) ***.· nia. Kun tätä välituotetta käsitellään trypsiinil] • * • ai ^ Π c n t ra ta t γδ Ή αωπ o qVa -ί 4— 4— ι ιττη n λκ-λ· -=¾ -¾ -ΐ 1 ·! n λ 4- *- -! m t 23
Jonkin tietyn insuliinijohdannaisen lipofiilisyys humaani - insul i ini, k'rel, määritettiin LiChrosorb f 250 x 4 mm) HPLC-kolonnissa eluoimalla kolonnia sesti 40 °C:ssa käyttäen eluontiliuoksina seoksia, 5 valmistettu A) 0,1 M natriumfosfaattipuskurista, j< 7,3 ja joka sisälsi 10 % asetonitriiliä, ja B) 50 1 riiliä vedessä. Eluoitumista monitoroitiin seuraama tin UV-absorptiota 214 nm:n kohdalta. Ulkoista tila taava aika, t0, havaittiin ruiskuttamalla 0,1 mM : 10 raattia. Humaani-insuliinin retentioaika, thianiiani/ vähintään arvoon 2 t0 muuttamalla A- ja B-liuost suhdetta. k'tel = / (t^^-t,) .
Veren glukoosipitoisuutta alentavan vaikutuksen astetta tutkittiin kaniineissa. Kukin insuliinij 15 tutkittiin injektoimalla 12 nmol tätä ihonalaisest kuudesta kaniinista yhden päivän retardaatiotut
Verinäytteet glukoosianalyysia varten otettiin er tiota ja 1, 2, 4 ja 6 tuntia injektion jälkeen. Ha' koosiarvot on ilmoitettu prosentteina lähtöarvoista 20 kutteisuuskerroin, joka laskettiin veren glukoosia: β·.*β suhteutetulla asteikolla ilmoitettu pitkävaikuttei * * Γ\ (vaikutuksen keston piteneminen), ks. s. 211 julka: · *
• | kussen, et ai., Protein Engineering 1 (1987) 2 0E
* * · ’· kaavaa on muokattu sellaisen asteikon mukaiseksi, ft • ’ 25 arvon 100 ultralente-naudaninsuliinilla ja arvon 0 insuliinilla (Novo Nordisk A/S, 2880 Bagsvaerd, Tan • *« • · · « · *
Taulukossa 1 lueteltuja insuliinijohdannaisia annet • β·β sissa, jotka sisälsivät 3 Zn2+:aa insuliiniheksame
Il,* niitä tapauksia lukuunottamatta, joiden on nim Ϊ 5 i AA Π n — J J_ _ 1. i * 1_____ _ _ Π Π _ J_ J. _ * ·' I 1 U *1 ^ U mm 24 (125I)-analogista on hävinnyt injektiokohdasta uiko: malaskijalla määritettynä [Ribel, U., et ai., Th( Model for Subcutaneous Absorption in Man. Teoksessa no-Rios and P.J. Lefebre (Eds): Diabetes 1985; Proi 5 the 12th Congress of the International Diabetes : Madrid, Spain, 1985 (Excerpta Medica, Amsterdam, 96] .
Taulukossa 2 on esitetty hyvin pitkävaikutteisten analogien sarjan T50 %-arvot. Nämä analogit annett 10 sissa, jotka sisälsivät 3 Zn2+:aa insuliiniheksameer; II» • 1 2 3 * » • 1 « · · • ··
• I
• « « · »
• M
• i • * » • e » • 1 1 « «1 ··1 • I · • · « • I « 2 • « « » * » 3 25
β III
H
I O
‘d - H ooochaimtnoooor^OLnLn^o >-γΗ0) iHCNrO'^m'XtUDOOr'CTirqrn^HrHCNl
:(0 <D M H
Λ! -O ED -IJ 4J β -H pl β a< λ; m__________________
rHT-toocriHOHaiinin^^OT-i I OHnHCO^aJCNm^COhrOCTiCM
*H(0 ^ c^coor-r-^o^r-cooooocomcoco O -P__________________
4J ω LO
-HO rl COmiDhOCnmHMCriO'i ^CO
-HM m W(0 OOVOVOUaVDVDVDI^-OOCOVDr^^r^Ui O Pt__________________
0 M
X H _, ffiioicmooo^oooMOirohfO
β (Ö Λ ...............
iH oochr-co-stiLnmoooqmLncNjoooo 01 dP tN Ln^^ininvoLncDOioiL^uic^in^
St/1 Xj ^riinoHmnH^ifiojinnoiffi m 3 , LnroiOLDr^^mooHoooovooorom
Iff M 1-1 ιηιηΐο^ιηΓ^Γ^οοσΐσιΐΓίΓ'σιιηιη
-H I M
hH 3 8SS£S;°".->.°«S*«S5g
JjHh H H h n m n ^ 3 ® f; H ^ ^ n H o
Λ β -H pj O -H
M CM__________________ ··» * *
• * _ I
:*·. ~ a a : \: ä =o -h
• · :0 ·Η JJ -H
.· · 4-> fi -H -H —- I
: \: -h -h β λ; β o • · λ; -H -H -H -H β :0 w ...,: β β rH -Η β -H 4-> β
• · -H -H β «H — -H CQ -H -H -H
CO -H W β -H -H -H — M I β
. w ιΗ β 10 β rl Cj β -H -H
β -H β -H β -H -H -H ι-H -H
·*· ββ-ΗΙιΗβιΗ -H * !>ι β
·' * -H -H >-* -H β -H β -H β CO
-H I >i «H CO I CQ H -H (Ö β -H
H Ή S >ι β — β -H β β r—I -H β
~ -H β H β -H -H -H O -H β M -H «J I -H
·. * β CO >ι O O β I β m I -H β -H -H -H -H
* # * Ή ^ »H ^ ·Η O ·Η Β λ· -H H ‘H H H H H
·** * β -H -H 4J & CU -H m -H -- O rl β | β ^ S β .···. <D H I d)OHHBHMf03-H-H!oSSoi • · β β-HCQ M (Ö β^—β(1)ΡΡ CQ-HH β β CQ β 26
Taulukko 2 [Humaani-insuliinij ohdan- Suhteellinen Ihoni nainen hydrofobisuus hävii __sioi! 600 ^iM, k rcl Tso, 3 Zn /heksameeri, fenoli 0,3 %, glyseroli 1,6 %, pH 7,5___
NeB29dekanoyyli-des (B30) - 11,0 insuliini___ NEB29undekanoyyli-des (B30) - 19,7 insuliini___ N£B:i3lauroyyli-des (B30) -insu- 37 1i ini___ UN^tridekanoyyli-des (B30) - 65 linsuliini___ |WeB29myristoyyli-des (B30) - 113 insuliini___
Nepalini toyyli-des (B30) - 346 insuliini___ N^sukkinimidimyristiinihap 10,5 poinsuliini___ N^myristoyyli-insuliini _113__ [iHumaani -NPH _ ···
Liukoisuus • · « · · *· *· ,·, · 5 Kaikkien taulukossa 1 mainittujen NcB29-modifioituj *· ** #βββ· nien, jotka sisältävät 3 Zn2+-ionia insuliiniheksame • · . liukoisuus ylittää 600 nmol/ml neutraalissa (pH 7, | · · ···’ toisessa farmaseuttisessa formulaatiossa, joka lis I · * *·* * tää säilyteaineena 0,3 % fenolia ja isotonisuuden e 10 seen käytettyä l,6-%:ista glyserolia. 600 nmol/ml c • · :.j : ni-insuliinikonsentraatio, jota käytetään 100 IU/i v·· ϊ ί tri eea Ιλλλ o fnmiiVfi *ί ββο ^ 4- a nai οοσο ♦•otto 1 1 -1 27 Tämän keksinnön mukaisesti saatua humaani-insul naista sisältäviä farmaseuttisia koostumuksia voi parenteraalisesti tällaisen hoidon tarpeessa οΙθλ laille. Koostumuksia voidaan antaa parenteraalisest 5 maila sitä ihonalaisesti, lihaksensisäisesti tai s sesti ruiskulla, mahdollisesti kynää muistuttavalla Koostumusta voidaan vaihtoehtoisesti antaa parent infuusiopumpulla. Vielä yksi vaihtoehto on koostumu olla jauhe tai neste, joka on tarkoitettu humaani 10 johdannaisen antamiseen nenäsumutteen muodossa.
Humaani-insuliinin injektiokoostumuksia voidaan käyttäen farmaseuttisten valmisteiden teollisessa sessa käytettäviä tavanomaisia menetelmiä, joih ainesosien liuottaminen ja yhdistäminen asiaankuu: 15 valla halutun lopputuotteen aikaansaamiseksi.
Siten yhden menetelmän mukaisesti humaani-insuliini ta liuotetaan sellaiseen määrään vettä, joka on jo pienempi kuin valmistettavan koostumuksen lopulline Seokseen lisätään tarpeen mukaan isotonisuuden a 20 ainetta, säilyteainetta ja puskuria ja liuoksen pH-
• M
·.··* tään - tarvittaessa - käyttäen happoa, esimerkiksi • * ·/*: dihappoa, tai emästä, esimerkiksi vesipitoista nat : *.ί sidia sen mukaan, millainen määrä tätä tarvitae • * ·;··; liuoksen tilavuus säädetään vedellä sellaiseksi, i . 25 osien konsentraatio saadaan halutuksi.
mi • ·· « « « *·* * Esimerkkejä isotonisuutta tuottavista aineista ovi kloridi, mannitoli ja glyseroli.
• t • · « • · · «M ♦ .·*·. Esimerkkejä säilyteaineista ovat fenoli, m-kresoli, 28
Insuliinikoostumuksia voidaan käyttää diabeteksei Optimaalinen annosmäärä minkä tahansa potilaa ollessa on riippuvainen useista erilaisista tekijc ovat käytetyn tietyn nimenomaisen humaani-insu3 5 naisen tehokkuus, potilaan ikä, ruumiinpaino, i aktiivisuus ja ruokavalio, sen mahdollisesta yhc muihin lääkkeisiin ja diabetestapauksen vakavu suositeltavaa, että tämän keksinnön mukaisen humac nijohdannaisen päivittäisannos määritetään alan c 10 muksen perusteella kullekin yksittäiselle potilaa tavoin kuin mitä menetellään tunnettujen insuliinil· kyseessä ollessa.
Humaani-insuliinijohdannaisia voidaan käyttää ^ muihin insuliinityyppeihin, esimerkiksi humaani-15 tai sianinsuliiniin tai insuliinianalogeihin, joid käynnistyy nopeammin, silloin kun tällainen me tarkoituksenmukaista. Esimerkkejä näistä insuliini on kuvattu esimerkiksi eurooppalaisissa patenttihal· suissa, joiden julkaisunumerot ovat EP 214 826 (M 20 A/S), EP 375 437 {Novo Nordisk A/S) ja EP 383 472 <
Co. ) .
• · ·«· • * Tätä keksintöä kuvataan tarkemmin seuraavien · ϊ/** avulla, joiden ei kuitenkaan ole katsottava olevan *:*·; piiriä rajoittavia. Edellä olevassa selityksessä je : ;*· 25 sa esimerkeissä kuvatut ominaisuudet voivat sekä ei ··* minä tahansa yhdistelmänä olla materiaalia tämäi käyttämiseksi sen erilaisissa muodoissa.
• · : Esimerkit • · • * 29 di on saatavilla talletetusta E. coli -kannasta (A Nämä plasmidit sisältävät lisäksi S. cerevisiaen faatti-isomeraasin promoottorin ja terminaattorin ( Ne ovat identtiset pMT742:n (Egel-Mitani, M., et a 5 (1988) 113-120) (ks. kuvio 1) suhteen luku
EcoRI-Xbal-restriktiokohtien väliin jäävää aluettc sältää signaali/j ohtosekvenssi/tuote-yhdistelmää alueen.
Synteettiset DNA-fragmentit syntetoitiin automaatti 10 syntetointilaitteessa (Applied Biosystems malli 38C fosforamidiittikemiaa ja kaupallisesti saatavilla genssej a [Beaucage, S.L. ja Caruthers, M.H., Letters 22 (1981) 1859-1869].
Kaikki muut käytetyt menetelmät ja materiaalit o 15 tunnetun tekniikan tason mukaisia menetelmiä (ks. teos Sambrook, J., Fritsch, E.F. ja Maniatis, T. Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1989).
Analyysien suorittamisesta «s· • s • e !**. 20 Valmistettujen insuliinien suhteelliset moolimas · e • · tettiin käyttäen MS:aa (massaspektroskopiaa) j • · · *· ** avulla (plasmadesorptiomassaspektrometria) Bio-Ie * · teella (Bio-Ion Nordic AB, Uppsala, Sweden) tai *
avulla (elektrospraymassaspektrometria) API III E
Oi S.i ί 2 5 Mass Analyzer -laitteella (Perkin-Elmer Sciex 1
Thornhill, Kanada), • « • · e :;i.: Esimerkki 1 « e s & 30 #98 5'-TGGCTAAGAGATTCGTTGACCAACACTTGTGCGGTTCTCACTTG TGTAC TTGGTTTGTGGTGAAAGAGGTTTC TTC TACACTC CAAAGTCTGACG. (Asp03) (SEQ ID NO: 3) #128 5'-CTGCGGGCTGCGTCTAAGCACAGTAGTTTTCCAATTGGTACAA 5 GAAGTACAACATTGTTCAACGATACCCTTAGCGTCGTCAGACTTTGG-3' (SEQ ID NO:4)
#126 5 ' -GTCGCCATGGCTAAGAGATTCGTTG-3 ' (Asp03) (SEQ ID
#16 5'-CTGCTCTAGAGCCTGCGGGCTGCGTCT-3' (SEQ ID NO:6)
Suoritettiin seuraava polymeraasiketjureaktio (PCI 10 Gene Amp -PCR-reagenssipakkausta (Perkin Elmer, Avewalk, CT 06859, USA) valmistajan ohjeiden PCR-seoksen päälle pipetoitiin kaikissa tapauksis! kerros mineraaliöljyä (Sigma Chemical Co., St. USA) .
15 2,5 μΐ oligonukleotidia #98 (2,5 pmol) 2,5 μΐ oligonukleotidia #128 (2,5 pmol) 10 μΐ 10 X PCR-puskuria 16 μΐ dNTP-seosta 0,5 μΐ Taq-entsyymiä *♦* ·*·β· 20 58,5 μΐ vettä • * * · · *· Yksi sykli suoritettiin: 94 °C:ssa 45 s, 49 °C: * * 72 °C:ssa 2 min.
· * • · · Tämän jälkeen seokseen lisättiin 5 μΐ oligonukleoti #126 ja suoritettiin 15 sykliä: 94 °C:ssa 45 s, • 25 1 min, 72 °C:ssa 1,5 min. PCR-seos pipetoitiin 2 • · · *!!.* agaroosigeeliin ja tälle suoritettiin elektroforeei * · 31 ja pilkottiin restriktioendonukleaaseilla Ncol vakiomenetelmien mukaisesti, ajettiin 2,5 %:isess geelissä ja puhdistettiin käyttäen Gene Clean -tes kuvatulla tavalla.
5 Plasmidi pAKl88 muodostuu 412 ep:n suuruisesta I sistä, joka koostuu synteettistä hiivan sigr sekvenssigeeniä koodaavasta LaC212spx3-EcoRI/NcoI-f {tämä on kuvattu julkaisun W0 89/02 463 esimerkis seuraa sellaista insuliinin Ml5-prekursoria koodaa 10 tinen Ncol/Xbal-fragmentti, joka sisältää B29- j. happoryhmät yhdistävän SerAspAspAlaLys-silian (ks . ID NO 14, 15 ja 16) ja joka on liitetty IIsk(+/-)vektorin (fagimidin) (Stratagene, USA) fragmenttiin. Plasmidi pAK188 on esitetty kuviossa 15 Plasmidi pAKl88 pilkottiin myös restriktioendom
Ncol ja Xbal ja eristettiin 3139 ep:n suuruint fragmentti. Nämä kaksi DNA-fragmenttia ligatoit käyttäen T4-DNA-ligaasia ja vakio-olosuhteita {S< ai., Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Labors 20 1989). Ligaatioseos transformoitiin kompetenttia -kantaan (R-, M+) , minkä jälkeen suoritettiin valir * · ; liiniresistenssin suhteen. Tulokseksi saaduistc 9 9 -pesäkkeistä eristettiin plasmidit käyttäen tava • | ·;·*! minipreparaat t imene telmää (Sambrook, et ai., . 25 Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 3 ♦ ** .···, tarkistettiin käyttäen asiaankuuluvia restriktioenc 9 9 9 ja, toisin sanoen EcoRI:tä, Xba I:tä, NcoI:tä ; . , Valittujen plasmidien osoitettiin DNA:n sekvensoint :;j/ (Sequenase, U.S. Biochemical Corp.) perusteella Ϊ Z - _ . _ _ m-JI Dl _ . .
32 mentti, joka koodaa synteettistä aprotiniinigeeni fuusioitu oikeassa lukukehyksessä hiivan mating-i l:n signaali-johtosekvenssiin. pKFNl627:ssä ole\ 184 ep:n suuruinen sekvenssi koodaa insuliir 5 MI5:ttä (GluBl, GluB28) (toisin sanoen B(l-29, GluE SerAspAspAlaLys-A(l-21):tä), joka on fuusioitu oik kehyksessä mating-tekijä alfa l:n sekvenssiin (ks. ID NO: 17, 18 ja 19). Vektori pKFNl627 on esitetty pEA5.3 pilkottiin restriktioendonukleaaseilla EcoRl 10 tästä eristettiin pilkkomisesta tulokseksi saat suuruinen DNA-fragmentti. Hiivailmentämisvektor: pilkottiin restriktioendonukleaaseilla Ncol ja Xbal EcoRl ja ensimmäisestä pilkkomisesta eristettiir suuruinen DNA-fragmentti ja toisesta 1644 ep:n suu 15 fragmentti. 412 ep:n suuruinen EcoRl/Xbal-fragment tiin sitten kahteen muuhun fragmenttiin, toi 9273 ep:n suuruiseen Ncol I/Xbal-fragmenttiin jc suuruiseen Ncol/EcoRl-fragmenttiin väkiomenetelmiä
Ligaatioseos transformoitiin E. coliin edellä kuvat 20 la. Tulokseksi saadusta E. colista peräisin ole1 eristettiin vakiomenetelmiä käyttäen ja se te asiaankuuluvilla restriktioendonukleaaseilla, toi • ψ
EcoRl :llä, Xbal:llä, NcoI:llä, Hpa I:llä. Valitu: • · osoitettiin DNA: n sekvenssianalyysin perusteelle . .·. 25 Sequenase-reagenssipakkausta, U.S. Biochemical, « * ·
.··! kuvaamalla tavalla) sisältävän oikean Alawl AspB
» « · insuliiniprekursorin DNA-sekvenssin ja olevan . . LaC212spx3-signaali/johtosekvenssin DNA:ta kooda • « * "5/ jälkeen. Tälle plasmidille annettiin nimitys PEA5.3 • » 33
Esimerkki 2
Ala*21 ThrB3 - humaani-insuliiniprekur s orin synteesi 1: ta yEA005 LaC212spx3-signaali/johtosekvenssiä käytt
Syntetoitiin seuraavat oligonukleotidit: 5 #101 5'-tggctaagagattcgttactcaacacttgtgcggttctcacti TTGTACTTGGTTTGTGGTGAAAGAGGTTTCTTCTACACTCCAAAGTCTGAC (ThrB3) (SEQ ID N0:7) #128 5'-CTGCGGGCTGCGTCTAAGCACAGTAGTTTTCCAATTGGTACA? GAAGTACAACATTGTTCAACGATACCCTTAGCGTCGTCAGACTTTGG-3' 10 (SEQ ID NO:4)
#15 5'-GTCGCCATGGCTAAGAGATTCGTTA-3' (ThrB3) {SEQ ID
#16 51-CTGCTCTAGAGCCTGCGGGCTGCGTCT-3' (SEQ ID NO:6)
Ala*21 ThrB3 -humaani-insuliiniprekursoria koodaava E
oitiin menetellen samoin kuin esimerkissä 1 kuvatu] 15 -humaani-insuliiniprekursorin kyseessä ollessa.
signaali/johtosekvenssi/Ala*21 ThrB3 -humaani-insulin ri kompleksi a koodaava DNA-sekvenssi ja tämän amd V*! venssi ovat SEKVENSSIT ID NO: 23, 24 ja 25. Plasmic « * · • ; osoitettiin sisältävän halutun sekvenssin, se trar tv» *· 20 S. cerevisiae -kantaan MT663 esimerkissä 1 kuvatu Λ • * ja tulokseksi saadulle kannalle annettiin nimitys y * • · Λ I « ·
Esimerkki 3 • · *
Gly*31 Asp63 -humaani-insuliiniprekursorin synteesi 1: : ta yEA007 LaC212spx3-signaali /johtosekvenssiä käytt • · · • a 34
#127 5 ' -CTGCGGGCTGCGTCTAACCACAGTAGTTTTCCAATTGG'I
GATAGAAGTACAACATTGTTCAACGATACCCTTAGCGTC GTCAGAC TTTGG (SEQ ID NO :9)
#12 6 5 ’ -GTCGCCATGGCTAAGAGATTCGTTG-3 ’ (AspB3) (SEQ IE
5 #16 5'-CTGCTCTAGAGCCTGCGGGCTGCGTCT-3’ (SEQ ID NO:6)
Gly*21 Asp53 -humaani-insuliiniprekursoria koodaava t oitiin menetellen samoin kuin esimerkissä 1 kuvatu: -humaani-insuliiniprekursoria koodaavan DNA:n syi seessä ollessa. LaC212spx3-signaali/johtosekvenssd 10 -humaani-insuliiniprekursorikompleksia koodaava Γ aminohapposekvenssi ovat SEKVENSSIT ID NO: 26, 27 -midin pEAl.5.6 osoitettiin sisältävän halutun sek transformoitiin S. cerevisiae -kantaan MT663 es: kuvatulla tavalla ja tulokseksi saadulle kannall 15 nimitys yEA007.
Esimerkki 4
Gly*21 Thr” -humaani-insuliiniprekursorin synteesi 1: ta yEA006 LaC212spx3-signaali/johtosekvenssiä käytt **· • · • « ·*«
Syntetoitiin seuraavat oligonukleotidit: ψ · ^ ^ * ’· 20 #101 51-TGGCTAAGAGATTCGTTACTCAACACTTGTGCGGTTCTCACTn ♦
*:**J TTGTACTTGGTTTGTGGTGAAAGAGGTTTCTTCTACACTCCAAAGTCTGAC
(Thr83) (SEQ ID NO: 7) ··♦ *· * * #127 5'-CTGCGGGCTGCGTCTAACCACAGTAGTTTTCCAATTGGTACA? . . GAAGTACAACATTGTTCAACGATACCCTTAGCGTCGTCAGACTTTGG-3' * · · !:i.: 25 (SEQ ID NO:9) • · * * 35 seessä ollessa. LaC212spx3-signaali/johtosekvenssi -humaani-insuliiniprekursorikompleksia koodaava Dl· ja sen aminohapposekvenssi ovat SEKVENSSIT ID NO: 31. Plasmidin pEA4,4.11 osoitettiin sisältävän h 5 venssin, se transformoitiin S. cerevisiae -kantaan merkissä 1 kuvatulla tavalla ja tulokseksi saadul annettiin nimitys yEA006.
Esimerkki 5 N-terminaalisella pidennyssekvenssillä (GluGluA] 10 AlaArg) varustetun yksiköt j ui sen ArgB_1 ArgB31-huxnaani prekursorin synteesi hiivakannasta yEA113 käyttäen johtosekvenssiä A)
Syntetoitiin seuraavat oligonukleotidit: 15 #220 51-ACGTACGTTCTAGAGCCTGCGGGCTGC-3' (SEQ ID NO:] #263 5 ’ -CACTTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGTGGTGAAAGAGGT1] TCCAAAGACTAGAGGTATCGTTGAA-31 (SEQ ID NO: 11) m m · • « V*! #307 5’-GCTAACGTCGCCATGGCTAAGAGAGAAGAAGCTGAAGCTGi GTTAACCAACAC-3 ’ (SEQ ID NO: 12) « t * % e· • e
*:*·* 20 Suoritettiin seuraava polymeraasiketjureaktio (PC
j ♦*. Gene Amp -PCR-reagenssipakkausta (Perkin Elmer, .··*. Avewalk, CT 06859, USA) valmistajan ohjeiden e e » PCR-seoksen päälle pipetoitiin kaikissa tapauksis ♦ , kerros mineraaliöljyä (Sigma Chemical co, St. Louis • < « 25 Plasmidi pAK220 (tämä on identtinen pAK188:n suhte 36 5 μΐ oligonukleotidia #220 (100 pmol) 5 μΐ oligonukleotidia #263 (100 pmol) 10 μΐ 10 X PCR-puskuria 16 μΐ dNTP-seosta 5 0,5 μΐ Taq-entsyymiä 0,5 μΐ mallijuosteena toimivaa pAK220-plasmidia identtinen pAK188:n suhteen) (0,2 μ9 DNA:ta) 63 μΐ vettä
Suoritettiin yhteensä 16 sykliä ja kukin sykli kä 10 nuutin 95 °C:ssa; 1 minuutin 40 °C:ssa; ja 72 °C:ssa. PCR-seos pipetoitiin sitten 2 %:iseer geeliin ja sille suoritettiin elektroforeesi väki käyttäen. Tulokseksi saatu DNA-fragmentti irrote roosista leikkaamalla se geelistä ja eristettiin kä 15 Clean -reagenssipakkausta (Bio 101 Inc., PO BO:
Jolla, CA 92038, USA) valmistajan ohjeita noudatta tettu PCR-DNA-fragmentti liuotettiin 10 μ1^3η restriktioendonukleaasipuskuria ja se pilkottiin ]
Xbal-restriktioendonukleaaseilla väkiomenetelmiä 20 HindiII/XbaI-DNA-fragmentti puhdistettiin käyttäen ... -reagenssipakkausta kuvatulla tavalla.
• » • · • · ί/.ί Plasmidi pAK406 koostuu 520 ep:n suuruisesta DNA-se joka sisältää pMT636:sta peräisin olevan Eco • · ·;·«; fragmentin (tämä on kuvattu julkaisussa WO 90/10 . 25 koodaa hiivan alfatekijän johtosekvenssiä ja osaa
• M
.*··, prekursoria, joka on ligatoitu pAKl88:sta peräis • * *
Hindlll/Xbal-fragmenttiin, joka koodaa loppuosaa . , prekursorista MI5 (ks. SEKVENSSIT ID NO:32, 33 ja • * · on liitetty cPOT-vektoriin. Vektori pAK406 oi • * 37 geeni ja joka on liitetty vektoriin cPOT. Plasmid: esitetty kuviossa 2.
Plasmidi pAK233 pilkottiin restriktioendonukleaasei
Xbal ja eristettiin 9273 ep:n suuruinen vektori 5 Plasmidi pAK406 pilkottiin restriktioendonukleaasei
Hindlll ja eristettiin 2012 ep:n suuruinen vektori Nämä kaksi DNA-fragmenttia ligatoitiin yhteen Hi PCR-fragmentin kanssa käyttäen T4-DNA-ligaasia olosuhteita. Ligaatioseos transformoitiin sitten ko 10 E. coli kantaan (R-, M+) , minkä jälkeen suoritett ampisilliiniresistenssin suhteen. Tulokseksi saadui -pesäkkeistä eristettiin plasmidit käyttäen väki DNA:n minipreparaatin valmistamiseksi ja nämä ta asiaankuuluvilla restriktioendonukleaasei11a, toi 15 EcoRI:llä, Xbal:llä, NcoI:llä, Hindlll:llä. Valitu osoitettiin DNA-sekvensointianalyysien perusteella oikean yksiket juisen ArgB31-humaani-insuliiniprekui sekvenssin ja olevan liittynyt S. cerevisiaen DNA:ta koodaavan DNA:n perään. Plasmidille annett 20 pEAl08 ja se on esitetty kuviossa 2. Alfatekijän jo ... si/yksiketjuinen Arg031 -humaani-insuliiniprekursori • · ··*, koodaava DNA-sekvenssi ja tämän aminohappo s ekvens s.
*| VENSSIT ID NO: 38, 39 ja 40. Plasmidi pEAl08 tran * · * *· " S. cerevisiae -kantaan MT663 esimerkissä 1 kuvatu ·’** 2 5 ja tulokseksi saadulle kannalle annettiin nimitys y • t » 9 » I I «·· ··· B) • · « ^ * • · ·
Seuraava polymeraasiketjureaktio (PCR) suoritettij · · Gene Amp -PCR-reagenssipakkausta (Perkin Elmer, ί · Δτγοτ«.τα Λ V ΟΦ TTC Ä \ tra 1 τη·ϊ o+-a-l an aVi A οι fa 38 0,5 μΐ Taq-entsyymi 0,2 μΐ mallijuosteenä käytettyä pEAl08-plasmid DNA:ta) 63 μΐ vettä 5 Suoritettiin yhteensä 16 sykliä, ja kukin syk 1 minuutin 95 °C:ssa; 1 minuutin 40 °C:ssa; ja 72 °C:ssa. PCR-seos pipetoitiin sitten 2 %:iseei geeliin ja sille suoritettiin elektroforeesi väki käyttäen. Tulokseksi saatu DNA-fragmentti irrota 10 roosista leikkaamalla se geelistä ja se eristetti Gene Clean -testipakkausta (Bio 101 Inc., PO BC Jolla, CA 92038, USA) valmistajan ohjeiden mukai distettu PCR-DNA-fragmentti liuotettiin 10 pl:aa] restriktioendonukleaasipuskuria ja se pilkottiin 15 endonukleaaseilla Ncol ja Xbal vakiomenetelmien NcoI/Xbal-DNA-fragmentti puhdistettiin käyttäen -reagenssipakkausta kuvatulla tavalla.
Plasmidi pAK401 muodostuu 523 ep:n suuruisesta E sistä, joka koostuu pMT636:sta peräisin olevasta 20 fragmentista (tämä on kuvattu julkaisussa W0 90/10 «·* on konstruoitu liittämällä Ncol-kohta alfan joht • * V·· 3'-päähän kohdemutageneesillä) ja joka koodaa
Ja\: johtosekvenssiä ja tätä seuraavaa Ncol/Xbal- fragme *:·*· on peräisin pAK188:sta ja joka koodaa insuliiniprek . 25 (ks. SEKVENSSIT ID NO: 41, 42 ja 43), joka c .·;·* pBLUESCRIPT IIsk{ + /-) -vektoriin (fagimidiin) ( « * > USA). Plasmidi pAK401 on esitetty kuviossa 3.
* » ; Plasmidi pAK401 pilkottiin restriktioendonukleaasei *·· • · V'U-h.X _ Ae_J n A . i J - w Ä _ _________J _ ___η , Ä _ r *j 39 pilkottiin EcoRI:llä ja Xbal:llä ja eristettii suuruinen fragmentti.
Plasmidi pAK233 pilkottiin restriktioendonukleaasei
Xbal, sekä EcoRI/NcoI:llä ja eristettiin 92’ 5 1644 ep:n suuruiset fragmentit. Nämä kaksi DNA- ligatoitiin yhteen pll3A:sta peräisin olevan fragmentin kanssa käyttäen T4-DNA-ligaasia ja suhteita. Ligaatioseos transformoitiin sitten kompe coli -kantaan {R-, M+), minkä jälkeen suoritett: 10 ampisilliiniresistenssin suhteen. Tulokseksi saadui -pesäkkeistä eristettiin plasmidit käyttäen väki DNA: n minipreparaatin valmistamiseksi ja nämä ta asiaankuuluvilla restriktioendonukleaaseilla, toi
EcoRI:llä, Xbal:llä, NcoI:llä, HindIII:llä. Valitu 15 osoitettiin DNA:n sekvensointianalyysien perusteel vän oikean N-terminaalisella pit
GluGluAlaGluAlaGluAlaArg varustetun yksiketjuii humaani-insuliiniprekursori-DNA:n sekvenssin ja ole
nyt S. cerevisiaen alfatekijän DNA:ta koodaavan DN
2 0 Tälle plasmidille annettiin nimitys pEAll3 ja se kuviossa 3. Alfatekijän johtosekvenssistä ja N-tern ***. pidenny sosal la (GluGluAlaGluAlaGluAlaArg) varus t et » * » *· ketjuisesta ArgB_1 ArgB31 -humaani-insuliiniprekursori « * * *· *· tuvaa yhdistelmää koodaava DNA-sekvenssi ja tämän *:"5 25 sekvenssi ovat SEKVENSSIT ID NO: 44, 45 ja 46. Plas transformoitiin S. cerevisiae -kantaan MT663 esd * *» l kuvatulla tavalla ja tulokseksi saadulle kannall< nimitys yEAH3 .
• * t » » “f/ Esimerkki 6 • s * m 40 #389 5'-GCTAACGTCGCCATGGCTAAGAGAGAAGAAGCTGAAGCGAAGC GTTAACCAACAC-3’ {SEQ ID NO:13)
Suoritettiin seuraava PCR käyttäen Gene Amp -PCF pakkausta 5 5 μΐ oligonukleotidiä #220 (100 pmol) 5 μΐ oligonukleotidiä #389 (100 pmol) 10 μΐ 10 X PCR-puskuria 16 μΐ dNTP-seosta 0,5 μΐ Taq-entsyymiä 10 2 μΐ mallijuosteena käytettyä pEA113-plasmidia (0,5 63 μΐ vettä
Suoritettiin yhteensä 12 sykliä ja kukin sykli kä nuutin 95 °C:ssa; 1 minuutin 37 °C:ssa; ja 72 °C:ssa. 1
Alfatekijän johtosekvenssistä ja N-terminaalisell osalla (GluGluAlaGluAlaGluAlaGluArg) varustetusta s es ta Arg8*1 Arg831 -humaani-insuliiniprekur sorista yhdistelmää koodaava DNA konstruoitiin menetellen #···β esimerkissä 5 kuvatun alfatekijän johtosekve]
2 0 N-terminaalisella pidennysosalla (GluGluAlaGluAJ
• · · *· varustetusta yksi ket j ui s es ta Arg8'1 Arg831 -humaani • * * *· “2 prekursorista muodostuvaa yhdistelmää koodaavan DN2
«•««S
ollessa. Tälle plasmidille annettiin nimitys pEA13£ » jän johtosekvenssistä ja N-terminaalisella pic IJi 2 5 (GluGluAlaGluAlaGluAlaGluArg) varustetusta yksi
Arg8'1 ArgB31 -humaani-insuliiniprekursorista muodost ; ·*; telmää koodaava DNA-sekvenssi ja tämän aminohaj "V ovat SEKVENSSIT TD NO: 47. 4R ιλ 4Q . Plasmidi nRAI^ 41
Esijnerkki 7 (ΑΙ,ΒΙ)-diBoc-humaani-insuliinin synteesi 5 g sinkitöntä humaani-insuliinia liuotettiin DMSO:ta. Tähän liuokseen lisättiin 3,090 ml et 5 Reaktio suoritettiin huoneenlämmössä ja se käi lisäämällä seokseen 565 mg di-tert-butyylipyrokc joka oli liuotettu 5,650 ml:aan DMSO:ta. Reaktio: edetä 5½ tuntia ja se pysäytettiin sitten lisääm etanoliamiinia. Tuote saostettiin lisäämällä seoks 10 asetonia. Saostuma eristettiin sentrifugoimalla ja vakuumissa. Saannoksi saatiin 6,85 g n (ΑΙ,ΒΙ)-diBoc-insuliini puhdistettiin käänteisfaa seuraavasti: raakatuote liuotettiin 100 ml:aan λ mistettua 25 %:ista etanolia, jonka pH oli säädetty 15 HCl:llä, ja johdettiin kolonniin (läpimitta 5 c 30 cm) , johon oli pakattu oktadekyylidimetyyl substituoituja silikapartikkeleita (partikkelien 15 μΐη, huokoskoko 0,1 nm (100 A)) ja joka oli tas eluointipuskurilla. Kolonni eluoitiin käyttäen ( 20 1 mM vesipitoisen HCl:n seoksia, 0,3 M KCl:a virtaa ^«11 2 1/h. Insuliini eluoitiin lisäämällä etanoli • 1 *,2 3; 30 %: sta 45 %:iin. Asiaankuuluva fraktio laimennet • 1 • ··! etanolipa,toisuuteen 3a saostettiin pH-arvossa 4, 8 *;2: materiaali eristettiin sentrifugoimalla ja kuivat
. 25 missä. Näin menetellen saatiin 1,701 g (Al,Bl)-diE
II1 insuliinia, jonka puhtausaste oli 94,5 %.
f 1 1 i 2 • ♦ « III «•l 4 3 * Λ 42
Esimerkki 8 (NeB39-bentsoyyli-humaani-insuliini) 6, 3 Zn2*:n syntec 400 mg (Al,Bl)-diBoc-humaani-insuliinia liuotetti. DMSOrta. Tähän liuokseen lisättiin 748 μΐ seosta, : 5 N-metyylimorfoliinia ja DMSO:ta (seossuhde 1:9, tio suoritettiin 15 °C:ssa ja se käynnistettiin seokseen 14,6 mg bentsoehappo-N-hydroksisukkinin joka oli liuotettu 132 μΐ:aan DMF:ää. Reaktio 2 tunnin kuluttua lisäämällä seokseen 100 ml asetor 10 nut materiaali eristettiin sentrifugoimalla ja vakuumissa. Saatiin talteen 343 mg materiaalia.
Suojaavat Boc-ryhmät poistettiin lisäämällä see TFA:a. Liuotettua materiaalia inkuboitiin 30 minui saostettiin sitten lisäämällä 50 ml asetonia 15 eristettiin sentrifugoimalla ja kuivattiin vakuumis N£B29-bentsoyylihumaani-insuliini puhdistettiin kä£ HPLCrllä esimerkissä 7 kuvatulla tavalla. Saanno 230 mg. Kun materiaali kiteytettiin uudelleen vesipitoisesta etanolista, joka sisälsi 6 mM Zn2+: • 4 20 sitraattia pH-arvossa 5,5, saatiin otsikon mukaise « 4 · kiteitä, jotka eristettiin sentrifugoimalla ja 4 4 4 *· *· vakuumissa. Saanto oli 190 mg.
• · . Suhteellinen moolimassa, havaittu käyttäen MS:ää: *44 reettinen arvo: 5911.
• 4 * 4 25 Esimerkki 9 4 « • 4 « • 4 4 1 (NEB29-litokoloyyli-humaani-insuliini)., 3 Zn2+:n svnt 43 2 tuimin kuluttua lisäämällä seokseen 100 ml aset tunut materiaali eristettiin sentrifugoimalla ja vakuumissa. Saatiin 331 mg materiaalia.
Suojaavat Boc-ryhmät poistettiin lisäämällä 4 5 Liuotettua materiaalia inkuboitiin 30 minuuttia ja tiin sitten lisäämällä seokseen 50 ml asetonia. Sac tettiin sentrifugoimalla ja kuivattiin vakuumissa. 376 mg.
B29-litokoloyyli-insuliini puhdistettiin kä£ 10 HPLCtllä esimerkissä 7 kuvatulla tavalla. Lopulli noksi saatiin 67 mg, ja puhtausaste oli 94 %. Kun kiteytettiin uudelleen 15 %:isesta vesipitoisesta joka sisälsi 6 mM Zn2+:aa ja 50 mM sitraattia pH-a saatiin otsikon mukaisen yhdisteen kiteitä, jotka 15 sentrifugoimalla ja kuivattiin vakuumissa. Saanto c
Suhteellinen moolimassa, havaittu arvo käyttäen M teoreettinen arvo: 6166.
Esimerkki 10 • e « (NeU9-dekanoyyli-huxnaani-insuliini)G, 3 Zn2+in syntee « € • s s ** ** : 20 400 mg (A1,B1)-diBoc-humaani-insuliinia liuotetti.
• *· '"l DMSO:ta. Tähän liuokseen lisättiin 748 μΐ seosta, : • * * N-metyylimorfoliinia ja DMSO:ta (seossuhde 1 : 9, ! ϊ a
Hl tio suoritettiin 15 °C:ssa ja se käynnistettiin SS* *·* * seokseen 18,0 mg dekaanihappo-N-hydroksisukkinin 1 joka oli liuotettu 132 ylraan DMFrää. Reaktio • m :J : 60 minuutin kuluttua ja tuote saostettiin lisäämäl • f* m » -1 ΛΛ 1 . I < . . i 4 44 eristettiin sentrifugoimalla ja kuivattiin vakuumi tuotteen saanto oli 420 mg.
Raakatuote puhdistettiin käänteisfaasi-HPLC esi kuvatulla tavalla. Lopulliseksi saannoksi saatiin 2 5 kon mukaista tuotetta. Puhtausaste oli 96,1 %. Kun kiteytettiin uudelleen 15 %:isesta vesipitoisesta joka sisälsi 6 iriM Zn2t:aa ja 50 mM sitraattia, pH-a saatiin otsikon mukaisen yhdisteen kiteitä, jotka sentrifugoimalla ja kuivattiin vakuumissa. Saanto c 10 Suhteellinen moolimassa, havaittu arvo MS:ää käy teoreettinen arvo: 5962.
Esimerkki 11 des (B30) -humaani-insuliinin synteesi
Des(B30)-humaani-insuliinin synteesi suoritettiin h 15 (Metods in diabetes research, Voi. I, Laboratory n B, 404-410. Ed: J. Larner ja S. Phol, John Wiley & kuvaamalla tavalla. 5 g humaani-insuliinia 500 ml:aan vettä samalla kun liuoksen pH pidettiin * · · lisäämällä seokseen 0,5 M rikkihappoa. Tämän jälkee 20 ulossuolattiin lisäämällä seokseen 100 g ammoniumsi.
• e saostuma eristettiin sentrifugoimalla. Nappi • · 800 ml:aan 0,1 M ammoniuravetykarbonaattia ja 1 . ,·. säädettiin 1 M ammoniakilla arvoon 8,4.
« m · • ψ » V 50 mg naudan karboksipeptidaasia A suspendoitiii 25 vettä ja se eristettiin sentrifugoimalla. Kiteet sv : 25 ml:aan vettä ja suspensioon lisättiin 1 M e «·« , , * , , - . _ _ 45 samalla sekoittaen. Tämän jälkeen pH säädettiin a* kiteytymisen annettiin edistyä 20 tuntia seostc sekoittaen. Kiteen eristettiin 1,2 pm:n suodattime] 250 ml:11a jääkylmää 2-propanolia ja kuivatti 5 vakuumissa.
Esimerkki 12 (AlfBl)-diBoc-des(B30)-humaani-insuliinin synteesi
Otsikon mukainen yhdiste syntetoitiin menetelmälle samanlainen kuin esimerkissä 7 kuvattu menetelm 10 lähtöaineena sian des(B30)-insuliinia. Raakatuote asetonilla ja kuivattiin vakuumissa. (Al,Bl)-diBc humaani-insuliini puhdistettiin käänteisfaasi-HPI esimerkissä 7 kuvatulla tavalla.
Esimerkki 13 15 NeB39-dekanoyyli-des (B30) -humaani-insuliinin synteesi 400 mg (Ai,B1)-diBoc-des(B30)-humaani-insuliinia lähtömateriaalina NsS29-dekanoyyli-des (B30) -humaani .***. synteesiin noudattaen esimerkissä 10 kuvattuja *« e * vaiheita. Raakatuote saostettiin asetonilla, kuivat • »e . 20 missä ja suojaus poistettiin käyttäen TFA:ta. Tulol· • » · l tuote saostettiin asetonilla ja kuivattiin
NcB29-dekanoyyli-des (B30)-humaani-insuliini puhdista • * if ten käänteisfaasi-HPLC: llä esimerkissä 10 kuvatulle 9 9 * 9 9 9 9 9 9 9
Suhteellinen moolimassa, havaittu tulos MS:llä : 25 reettinen arvo: 5861.
• « 4 • 99 9 1 99 46 tettiin 4 ml:aan laskeutunutta MiniLeak® Medium -g oli pesty samalla puskurilla {MiniLeak on divinyyl aktivoitu Sepharose CL 6B, tämä on saatu yhtiöst Kööpenhamina). Geeliä pidettiin suspensiossa se 5 sitä varovasti 24 tuntia huoneenlämmössä. Tämän jä eristettiin suodattamalla, pestiin vedellä ja su 20 ml:aan 1 M etanoliamiinipuskuria, jonka pH oli S pidettiin suspensiossa 24 tuntia huoneenlämmössä, tiin lopuksi vedellä ja tämän jälkeen 0,1 M etikk 10 varastoitiin 4 °C:ssa. Suodoksessa oleva entsyymi oli 13 % lähtöliuoksen aktiivisuudesta, mikä viit että immobilisaatioreaktion saanto on noin 87 %.
b. Sian trypsiinin immobi li sointi
Sian trypsiiniä immobilisoitiin MiniLeak® Low -n 15 käyttäen edellä olevia A. lyticuksen immobilisoinn ollessa kuvatuissa olosuhteissa siten, että su asteeksi saatiin 1 mg geeliini lii litraa kohti.
c. Glu(GluAla)3Arg-B(l-29), ThrArg-A( 1-21) insuliini käyttäen imnobi li soitua A. lyticuksen proteaasia »i» ♦ · ’··[ 2 0 200 mg:aan yksiketjuista Glu(GluAla)3Arg-B{1-29) - • * * *· *5 21)-humaani-insuliinin prekursoria, joka oli • · 20 mlraan 0,1 M NaHC03-puskuria, jonka pH oli 9,0 4 ml geeliä, joka sisälsi immobi li soitua A. lyticu aasia. Kun geeliä oli pidetty suspensiossa reakt :*·*: 25 6 tuntia huoneenlämmössä, oli hydrolyysi mennyt tässä oli muodostunut Glu-{GluAla) 3-Ai : ThrArg-A(l-21)-humaani-insuliinia (reaktiota seura • a 4 «·· 4 _ _UDT n * 1 1 ö ^ riöol ·ί ΙΛΛ i -I Vii v-λΊ ιπτί* 47 d. N“xl, N01"11 N1B2a-tridodekanoyyliGlu (GluAla) 3Arg-B (1-29 Λ(1-21>-humaani-insuliinin synteesi käyttäen dod€ N-hydroksisukkinimidiesteriä 190 mg (30 μπιοί) Glu(GluAla) 3Arg-B(l-29)-ThrArg-A( 5 liinia liuotettiin 1 ml:aan DMS0:ta ja 1,05 ml:< valmistettua 0,572 M N,N-di-isopropyylietyyliami Liuos jäähdytettiin 15 °C:een ja siihen lisät (12 0 μπιοί) dodekaanihappo-N-hydroksisukkinimidiest oli liuotettu 0,6 ml:aan DMSCkta. Reaktio me 10 24 tunnissa. Lipofiilistä otsikon mukaista yhd eristetty.
e. N2 339-dodekanoyyli-de s (B30)-insuliinin synteesi
Tuote, joka oli peräisin edellisestä vaiheesta, c oli valmistettu noin 2,65 ml: aan DMSO / DMF /N, N- di - d 15 etyyliamiini-seosta, laimennettiin 10,6 ml :11a 50 n puskuria, joka sisälsi 20 % etanolia, ja pH säädet 10 NaOH:lla. Kun seos oli saanut seista yhden huoneenlämmössä, siihen lisättiin 1 ml MiniLeak-g sisälsi 1 mg immobilisoitua trypsiiniä kutakin ge .1·1. 2 0 litraa kohti. Reaktioseosta sekoitettiin varovast
«M
: huoneenlämmössä. Halutun tuotteen eristämiseksi johdettiin käänteisfaasi-HPLC-kolonniin (läpimitta * 1t * 1 keus 30 cm) , joka oli pakattu oktadekyylidimetyy] « . substituoituja silikapartikkeleita (partikkelien • · « *···' 25 15 pm, huokoskoko 0,1 nm (100 Λ) ) . Eluointiin käyte “·1 1 Tris/HCl-puskureita, joiden pH oli säädetty arv joissa oli nouseva etanolipitoisuus 40 %:sta 44 % ψ 1 2 * virtausnopeudella 2000 ml/h. Pääpiikki, joka eli 3 • 1 Λ Ί Λ Λ H . A «.J aJ- -1 J Mj.«.
Suhteellinen moolimassa/ havaittu MS :n avulla: reettinen tulos: 5890.
48
Esimerkki 15 N*b2S- (N-myristoyyli-a-glutainyyli) humaani-insuliinin 5 500 mg (Ai,Bl)-diBoc-humaani-insuliinia liuotettiin DMSO:ta ja seokseen lisättiin 428 μΐ etyylidi-i amiinia, joka oli laimennettu 2,5 ml :11a DMS0:r suhteessa 1/1 (v/v) valmistettua seosta. Lämpötila 15 °C:een ja seokseen lisättiin 85 mg N-myristoyyli 10 N-hydroksisukkinimidi es teriä, joka oli liuotettu DMSO:n ja DMF:n suhteessa 1/1 (v/v) valmistettua se tioseos yhdistettiin 30 min kuluttua 60 ml:aan säädettiin arvoon 5 ja saostuma eristettiin sentri
Saostuma kuivattiin vakuumissa. Kuivattu reaktiose 15 ti in 25 ml: aan TFA: ta ja liuos jätettiin 30 mimr neenlämpöön. TFA poistettiin haihduttamalla vakuumi
lömäinen jäännös liuotettiin 60 ml:aan vettä ja pH
arvoon 11,2 käyttäen väkevää ammoniakkia. Otsikc
yhdiste kiteytettiin tästä liuoksesta säätämällä pH
.***. 2 0 käyttäen 6 N HCl:ää. Tuote eristettiin sentrifugoi • * · : tiin kerran 10 ml :11a vettä ja kuivattiin vakuumi .·. j oli 356 mg. Puhtaus HPLC:n perusteella oli 94 %.
i ·· • · *·**· Tämän esimerkin mukainen tuote on siten humaani 5.·,· jossa LysB29:n ε-aminoryhmässä on substituentti, jo :T: 25 on seuraava: CH3 (CH2) 12CONHCH(CH2CH2COOH) CO- .
. . Suhteellinen moolimassa, havaittu arvo MS:n perust •j/ teoreettinen arvo: 6148.
• « 49 nimidiesterin tilalla undekaanihappo-N-hydroksis esteriä.
Tuotteen suhteellinen moolimassa, havaittu arvo I teella: 5876, teoreettinen arvo: 5876.
5 Esimerkki 17 N^-tridekanoyyli-des(B30)-humaani-insuliinin synt€
Otsikon mukainen yhdiste syntetoitiin analogisest: kanoyyli-des(B30)-humaani-insuliinin suhteen 14 kuvatulla tavalla käyttäen dodekaanihappo-N-hyd 10 nimidiesterin tilalla tridekaanihappo-N-hydroksis esteriä.
Tuotteen suhteellinen moolimassa, havaittu arvo I teella; 5899, teoreettinen arvo: 5904.
Esimerkki 18 15 N*M9-myristoyyli-des(B30) -humaani-insuliinin syntees
Otsikon mukainen yhdiste syntetoitiin analogises dekanoyyli-des (B30)-humaani-insuliinin suhteen esi: e * ·,*·· kuvatulla tavalla käyttäen dodekaanihappo-N-hydroks ίβ*.: diesterin tilalla myristiinihappo-N-hydroksisukki ·:*·· 20 riä.
« • · *
Hl Tuotteen suhteellinen moolimassa, havaittu arvo I
* * * **’ " teella: 5923, teoreettinen arvo: 5918.
**· Esimerkki 19 » » »
Tuotteen suhteellinen moolimassa, havaittu arvo teella: 5944, teoreettinen arvo: 5946.
50
Esimerkki 20 N*829- suberoyyli-D-tyroksiini -humaani - insuliinin synt 5 a. N-(sukkinimidyylisuberoyyli)-D-tyroksiinin valmi
Disukkinimidyylisuberaattia (1,0 g, Pierce) DMF;ään (50 ml) ja seokseen lisättiin 20 °C:ssa D-(2,0 g, Aldrich) seosta samalla sekoittaen. Tyroksi hitaasti ja liuotin poistettiin 20 tunnin kuluttue 10 maila vakuumissa. Öljymäinen jäännös kiteytettiin lista, mistä saatiin 0,6 g N- (sukkinimidyylisuberc roksiinia, jonka sp. oli 128-133 °C.
b. (Ai,Bl)-diBoc-humaani-insuliinin reaktio N-(suki suberoyyl!)-D-tyroksiinin kanssa 15 (AI,Bl)-diBoc humaani-insuliini (200 mg) liuotett DMF:ään (10 ml) lisäämällä seokseen trietyyliamii huoneenlämmössä. Seokseen lisättiin sitten N-(suk) suberoyyli) -D-tyroksiinia (80 mg) . Reaktiota seura **· : teisfaasi-HPLC: llä ja kun reaktio oli mennyt noir
## * J
,·, * 20 loppuun, niin liuotin poistettiin vakuumissa. Ha: « »* * 1 nökseen lisättiin vedetöntä trifluorietikkahappoc • m , liuosta pidettiin yhden tunnin ajan huoneenlär *··** tri fluori et ikkahappo oli poistettu vakuumissa, ja v · · tettiin 1 M etikkahapon (5 ml) ja asetonitriil: 1 seokseen, puhdistettiin preparatiivisella käc • « : HPLC: llä ja siitä poistettiin suolat PD-10- ***_ ,,rB29 , ...... ..
Tuotteen suhteellinen moolimassa, havaittu arvo ] teella: 6724, teoreettinen arvo: 6723.
51
Esimerkki 21 N*829- (2 - sukkinyy liamido) myristiinihappohumaani-insu] 5 teesi a. a-aroinomyristiinihappometyyliesteri . HCl:n valm
Metanoliin (5 ml, Merck), jota pidettiin -10 °C;ssc pisaroittain seosta voimakkaasti sekoittaen tion} (0,2 ml, Aldrich). Tämän jälkeen seokseen lisätti 10 myristiinihappoa (0,7 g, valmistettu a-bromihapostc kanssa suoritetulla reaktiolla). Reaktioseosta s huoneenlämmössä yön yli ja se haihdutettiin sitte Raakatuotetta (0,7 g) käytettiin suoraan vaiheeseer b. N-sukkinoyyli-a-aminorayristiinihappometyylieste 15 tus a-aminomyristiinihappometyyliesteri - HCl:ää (0,7 tiin kloroformiin (25 ml, Merck). Seokseen lisi ·1· etyyliamiinia (0,35 ml, Fluka) , minkä jälkeen siihi • * i ; meripihkahappoanhydridiä (0,3 g, Fluka). Reaktiose » ; 20 tettiin huoneenlämmössä 2 tuntia se väkevöitiin * *» • l jäännös kiteytettiin uudelleen etyyliasetaatin • * . eetterin seoksesta (1/1). Saanto: 0,8 g.
• · · I « I « « · c. N- (sukkinimidyylisukkinpyyli) -a-aminomyristiini liesterin valmistus • · • · · ••j#· 25 N-sukkinoyyli-a-aminomyristiinihappometyyliesteriä • s 52 kinoyyli) -α-aminomyristiinihappometyyliesterin saar sp. 64-66 °C.
d. (Ai,Bl)-diBoc-humaani-insuliinin reaktio N- (suki sukkinoyyli) -ot-aminomyristiinihappometyyl ies terin h 5 Reaktio suoritettiin esimerkin 20 b. mukaisesti, taen N-(sukkinimidyylisuberoyyli)-D-tyroksiinin N-(sukkinimidyylisukkinoyyli)-a-aminomyristiinihapp teriä (16 mg) . Kun trifluorietikkahappo oli poist missä, haihdutusjäännöstä käsiteltiin 0,1 M natri 10 dilla 0 °C:ssa metyyliesterin saippuoimiseksi. Kui tumisen arvioitiin menneen loppuun käänteisfaasi-rusteella, niin liuoksen pH-arvo säädettiin 3:ksd lyofilisoitiin. Kun materiaali oli puhdistettu pi sella käänteisfaasi-HPLC:11a ja suolat poistetti 15 lonnissa, niin ΝεΒ29-(2-sukkinyyliamido)myristiiniha insuliinin saanto oli 39 mg.
Tämän esimerkin mukainen tuote on siten humaani j ossa Lys®29: n ε-aminoryhmässä on substituent ti, j o on seuraava: CH3 (CHa) nCH (COOH)NHCOCH2CH2CO- .
te· i « *', 2 0 Tuotteen suhteellinen moolimassa, havaittu arvo ] • · # 1 2 *· teella: 6130, teoreettinen arvo: 6133.
I ♦ • f · • Φ» • * ···«· Esimerkki 22 • · · **j<* N*829-oktyylioksikarbonyy 1 i humaani-insuliinin syntee • · » ♦ · ·
Synteesi suoritettiin kuten esimerkissä 20 b. mut • *·. 25 N-(sukkinimidyylisuberoyyli)-D-tyroksiinin tilalla 2 · .···. oksikarbonyyli-N-hydroksisukkinimidiä (9 mg,
Tuotteen suhteellinen moolimassa, havaittu arvo ] teella: 5960, teoreettinen arvo: 5964.
53
Esimerkki 23
NeB29 - (2 - sukkinyy 1 iamido) palmiti inihappohumaani * insu] 5 teesi a. N- (sukkinimidyylisukkinoyyli) -a-arainopalmitiina lies terin valmistus Tämä yhdiste valmistettiin esimerkissä 21 kohdissa vatulla tavalla käyttäen a-aminomyristiinihap( 10 a-aminopalmitiinihappoa.
b. (Ai,Bl) -diBoc humaani-insuliinin reaktio N-(suk* sukkinoyyli) -a-aminopalmitiinihapponietyyliesterin li
Reaktio suoritettiin esimerkin 21 d. mukaisesti mut N-(sukkinimidyylisukkinoyyli)-a-aminopalmitiinihapp 15 esterin tilalla N-(sukkinimidyylisukkinoyyli)-a-tiinihappometyyliä ja tästä saatiin NcB29- (2-sukkir palmiti inihappohumaani-insuliinia.
I«l • · Tämän esimerkin mukainen tuote on siten humaani * « ’· ** jossa LysB29:n ε-aminoryhmässä on substituentti, jo :.*‘j 20 on seuraava: CH3 (CH2) 13CH (COOH) NHCOCH2CH2CO- .
ttt* I « · . Esimerkki 24 « « « • ·· • * * B29 *·* * Ne - (2-sukkinyyliamidoetyyIloksi)palmitiinihappohun liinin synteesi • · • e * • · i t>« i rt * M— ( milrkinifni dvvl ϊ «n VH nnw1 i \ nnAfvvl i nlrei 54 b, (Ai,Bl)-diBoc humaani-insuliinin reaktio N-(sukk sukkinoyyli) -2-aminoetyylioksipalmitiinihappometyyl kanssa
Reaktio suoritettiin esimerkin 21 d. mukaisesti mu 5 mällä N-(sukkinimidyylisukkinoyyli)-a-aminomyris metyyliesterin tilalla N-(sukkinimidyylisukkinoyyl etyylioksipalmitiinihappometyyliesteriä, ja täst Νε*29- (2-sukkinyyliamidoetyylioksi)palmitiinihappohun suliinia.
10 Tämän esimerkin mukainen tuote on siten humaani B29 jossa Lys :n ε-aminoryhmässä on substituentti, jo: on seuraava: CH3 (CH2) l3CH (COOH)NHCH2CH2OCOCH2CH2CO- .
Esimerkki 25 N*W9-litokoloyyli-a-glutamyyli-des (B30) -humaani-insu 15 synteesi
Synteesi suoritettiin kuten esimerkissä 13 käyttä' happo-N-hydroksisukkinimidiesterin tilalla N-li L-glutamiinihappo-a-N-hydroksisukkinimidiesteri-y-t tyyliesteriä.
» · • » « ** ** β·β · 20 Tämän esimerkin mukainen tuote on siten des(B3 * l insuliini, jossa LysB29:n ε-aminoryhmässä on sub
. jonka rakenne on seuraava: litokoloyyli-NKCH(CH,CH2C
• » · • I I ·»·
:"Γ: Tuotteen suhteellinen moolimassa, havaittu arvo I
teella: 6194, teoreettinen arvo: 6193.
» * *·· 25 Esimerkki 26 es* • ·
Tuotteen suhteellinen moolimassa, havaittu arvo I
teella: 6536, teoreettinen arvo: 6538.
55
Esimerkki 27 N®B2S-L-tyroksyy 1 i-humaani-insuliinin synteesi 5 Synteesi suoritettiin kuten esimerkissä 10 käyttä' happo-N-hydroksisukkinimidiesterin tilalla Boc-L-ty hydroksisukkinimidiesteriä.
Tuotteen suhteellinen moolimassa, havaittu arvo 1 teella: 6572, teoreettinen arvo: 6567.
10 Esimerkki 28
Farmaseuttinen koostumus, joka sisältää 600 nxnol/m noyyli-des (B30)-humaani-insuliini, Zn3+:a liuoksi NEB29-dekanoyyli-des (B30)-humaani-insuliinia (1,2 μι tettiin veteen (0,8 ml) ja pH säädettiin arvoon 7,5 15 seokseen 0,2 M natriumhydroksidia. Seokseen lisätt sinkkiasetaattia (60 μΐ) ja liuos, joka sisälsi 0,7 .*·. ja 4 % glyserolia (0,8 ml). Liuoksen pH säädettiin * » 9 : käyttäen 0,2 M natriumhydroksidia ja liuoksei • »· I ! säädettiin 2 ml:ksi vedellä.
• · m
• M
* 9 « 2 0 Tulokseksi saatu liuos steriloitiin suodattaman, rettiin aseptisesti patruunaan tai pulloon.
* « · « * ·
Esimerkki 29 : Farmaseuttinen koostumus, joka sisältää 600 nmol/m ··· · ***** nnuvl ΐ kinani * in* U a· 1 ΐι.Αΐ*ΑΛηη> 56
Tulokseksi saatu liuos steriloitiin suodattamalla tiin aseptisesti patruunaan tai pulloon.
Esimerkki 30
Farmaseuttinen koostumus, joka sisältää 600 nm 5 litokoloyyli-humaani-insuliinia liuoksessa 1,2 μπιοί otsikon mukaista yhdistettä suspendoit (0,8 ml) ja liuotettiin säätämällä liuoksen pH 0,2 M natriumhydroksidilla. Tähän liuokseen lisäi jälkeen 0,8 ml kantaliuosta, joka sisälsi 0,75 % 10 4 % glyserolia vedessä. pH säädettiin uudelleen ar liuoksen tilavuus säädettiin 2 ml:ksi vedellä.
Tulokseksi saatu liuos steriloitiin suodatt siirrettiin aseptisesti patruunaan tai pulloon.
• 9 • f < t t»ft • 9 9 • 9 • · 9 9 β* • I • • # m • · · • » « • 9 9 9 99 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 ··» « ·· · • * 57 SEKVENSSILISTAUS (1) YLEISET TIEDOT: 5 (i) HAKIJA:
(A) NIMI: Novo Nordisk A/S
(B) KATU: NOVO Alle (C) KAUPUNKI: DK-2880 Bagsvaerd (E) MAA: Tanska 10 (G) PUHELIN: +45 44448888 (H) TELEFAX: +45 44490555 (I) TELEX: 37173
(ii) KEKSINNÖN NIMITYS: ASYLOITU INSULIINI
15 (iii) SEKVENSSIEN LUKUMÄÄRÄ: 49 (iv) KIRJEENVAIHTO-OSOITE:
20 (A) VASTAANOTTAJA: Novo Nordisk A/S
Corporate Patents (B) KATU: Novo Alle (C) KAUPUNKI: DK-2880 Bagsvaerd (E) MAA: Tanska 25 tv) KONEKOODIMUOTO: (A) VÄLINETYYPPI: Disketti (B) TIETOKONE: IBM PC -yhteensopiva
(C) KÄYTTÖJÄRJESTELMÄ: PC-DOS/MS-DOS
30 (D) OHJELMISTO: Patentin Release #1.0, Versio #1.25 {vi) NYKYISEN HAKEMUKSEN TIEDOT: (A) HAKEMUSNUMERO: (B) JÄTTÖPÄIVÄMÄÄRÄ: 35 (C) LUOKITUS: (vii) ETUOIKEUSHAKEMUKSEN TIEDOT: (A) HAKEMUSNUMEROT: DK 1044/93 ja US 08/190 829 (8) JÄTTÖPÄIVÄMÄÄRÄT: 09-SEP-1993 ja 02-FEB-1994 40 (Viii) ASIAMIEHEN TIEDOT: ; ·,* (A) NIMI: Jorgensen, Dan, et. ai,
; ' (C) VIITE/LUETTELONUMERO: 3985.204-WO,DJ
: it • · 45 ·:··; (ix) TIETOLIIKENNEYHTEYSTIEDOT: . (A) PUHELIN: +45 44448888 : : : (B) TELEFAX: +45 44493256 :T: 50 (2) SEKVENSSIN ID NO:l TIEDOT: ti) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: . . (A) PITUUS: 21 aminohappoa ί : : (B) TYYPPI: aminohappo ***/ 55 {D) TOPOLOGIA: lineaarinen * * 58 (2) SEKVENSSIN ID NO:2 TIEDOT: ti) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 30 aminohappoa 5 (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini 10 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:2:
Xaa Vai Xaa Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Vai Glu Ala Leu 15 10 15
Leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Xaa 15 20 25 30 (2) SEKVENSSIN ID NO:3 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: 20 (A) PITUUS: 110 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen
25 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:3:
TGGCTAAGAG ATTCGTTGAC CAACACTTGT GCGGTTCTCA CTTGGTTGAA GCTTTGTACT 30 TGGTTTGTGG TGAAAGAGGT TTCTTCTACA CTCCAAAGTC TGACGACGCT
(2) SEKVENSSIN ID NO:4 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: 35 (A) PITUUS: 100 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen {DJ TOPOLOGIA: lineaarinen
·**; 40 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:4: • ♦ • * ·
*· *· CTGCGGGCTG CGTCTAAGCA CAGTAGTTTT CCAATTGGTA CAAAGAACAG ATAGAAGTAC
I AACATTGTTC AACGATACCC TTAGCGTCGT CAGACTTTGG
45 (2) SEKVENSSIN ID NO:5 TIEDOT: * * <i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: • (A) PITUUS: 25 emäsparia ***** (B) TYYPPI: nukleiinihappo 50 (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen *·* * (D) TOPOLOGIA: lineaarinen
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA
: (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID N0:5: •••cc ·*· · 00 59 (2) SEKVENSSIN ID NO:7 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 110 emäsparia 5 (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen
(D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA
{xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:7: 10
TGGCTAAGAG ATTCGTTACT CAACACTTGT GCGGTTCTCA CTTGGTTGAA GCTTTGTACT TGGTTTGTGG TGAAAGAGGT TTCTTCTACA CTCCAAAGTC TGACGACGCT
(2) SEKVENSSIN ID NO:8 TIEDOT: 15 (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 25 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen 20 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:8:
GTCGCCATGG CTAAGAGATT CGTTA
25 (2) SEKVENSSIN ID NO:9 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 100 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo 30 (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D} TOPOLOGIA: 1ineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:9:
35 CTGCGGGCTG CGTCTAACCA CAGTAGTTTT CCAATTGGTA CAAAGAACAG ATAGAAGTAC AACATTGTTC AACGATACCC TTAGCGTCGT CAGACTTTGG
(2) SEKVENSSIN ID NO:10 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: . — . 40 (A) PITUUS: 27 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo : (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen \ ·: (D) TOPOLOGIA: lineaarinen
.·, : (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA
\ *: 45 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:10: ACGTACGTTC TAGAGCCTGC gggctgc * *·ϊ·· (2) SEKVENSSIN ID NO: 11 TIEDOT: 5 0 (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: V * (A) PITUUS: 78 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen I (D) TOPOLOGIA: lineaarinen
··· · 55 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA
.···. xxl 60
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:12: 5
GCTAACGTCG CCATGGCTAA GAGAGAAGAA GCTGAAGCTG AAGCTAGATT CGTTAACCAA CAC
(2) SEKVENSSIN ID NO:13 TIEDOT: 10 (li SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 65 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen
(D) TOPOLOGIA: lineaarinen 15 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:13:
GCTAACGTCG CCATGGCTAA GAGAGAAGAA GCTGAAGCGA AGCTGAAAGA TTCGTTAACC AACAC
20 (2) SEKVENSSIN ID NO:14 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 415 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo 25 (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen {D) TOPOLOGIA: 1ineaarinen
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
(ix) OMINAISPIIRTEET:
30 (A) NIMI/SELITYS: CDS
(B) ASEMA: 80..391 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:14:
35 ATCGAATTCC ATTCAAGAAT AGTTCAAACA AGAAGATTAC AAACTATCAA TTTCATACAC AATATAAACG ACCAAAAGA ATG AAG GCT GTT TTC TTG GTT TTG TCC TTG ATC
Met Lys Ala Vai Phe Leu Vai Leu Ser Leu Ile 1 5 10
GGA TTC TGC TGG GCC CAA CCA GTC ACT GGC GAT GAA TCA TCT GTT GAG
40 Gly Phe Cys Trp Ala Gin Pro Vai Thr Gly Asp Glu Ser Ser Vai Glu 15 20 25
··· ATT CCG GAA GAG TCT CTG ATC ATC GCT GAA AAC ACC ACT TTG GCT AAC
S Ile Pro Glu Glu Ser Leu Ile Ile Ala Glu Asn Thr Thr Leu Ala Asn \ *: 30 35 40
; 45 GTC GCC ATG GCT AAG AGA TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGC GGT TCT CAC
·, ·· Vai Ala Met Ala Lys Arg Phe Vai Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His * 45 50 55
·:**: TTG GTT GAA GCT TTG TAC TTG GTT TGT GGT GAA AGA GGT TTC TTC TAC
. Leu Vai Glu Ala Leu Tyr Leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr ; : : 50 60 65 70 75
·** ACT CCA AAG TCT GAC GAC GCT AAG GGT ATC GTT GAA CAA TGT TGT ACT
Thr Pro Lys Ser Asp Asp Ala Lys Gly Ile Vai Glu Gin Cys Cys Thr • 80 85 90 TCT ATC TGT TCT TTG TAC CAA TTG GAA AAC TAC TGT AAC TAGACGCAGC 55 Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn • 95 100
: CCGCAGGCTC TAGA
61
Gin Pro Vai Thr Gly Asp Glu Ser Ser Vai Glu Ile Pro Glu Glu 20 25 30
Leu Ile Ile Ala Glu Asn Thr Thr Leu Ala Asn Vai Ala Met Ala 35 40 45 5 Arg Phe Vai Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Vai Glu Ala 50 55 60
Tyr Leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Ser 65 70 75
Asp Ala Lys Gly Ile Vai Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser 10 85 90 95
Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 100 (2) SEKVENSSIN ID NO:16 TIEDOT: 15 (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 415 emäsparia {B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen 20 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen
ΐ ii} MOLEKYYLITYYPPI: DNA
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:16: 25
TAGCTTAAGG TAAGTTCTTA TCAAGTTTGT TCTTCTAATG TTTGATAGTT AAAGTATGTG TTATATTTGC TGGTTTTCTT ACTTCCGACA AAAGAACCAA AACAGGAACT AGCCTAAGAC GACCCGGGTT GGTCAGTGAC CGCTACTTAG TAGACAACTC TAAGGCCTTC TCAGAGACTA GTAGCGACTT TTGTGGTGAA ACCGATTGCA GCGGTACCGA TTCTCTAAGC AATTGGTTGT 3 0 GAACACGCCA AGAGTGAACC AACTTCGAAA CATGAACCAA ACACCACTTT CTCCAAAGAA GATGTGAGGT TTCAGACTGC TGCGATTCCC ATAGCAACTT GTTACAACAT GAAGATAGAC AAGAAACATG GTTAACCTTT TGATGACATT GATCTGCGTC GGGCGTCCGA GATCT
(2) SEKVENSSIN ID NO: 17 TIEDOT: 35 (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 523 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen ··· 40 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • ·
ϊ\ (ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
• · · • *♦ II (ix) OMINAISPIIRTEET:
45 (A) NIMI/SELITYS: CDS
(B) ASEMA: 80..499 ♦ * , (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:17: *·$·*
f.M 50 ATCGAATTCC ATTCAAGAAT AGTTCAAACA AGAAGATTAC AAACTATCAA TTTCATACAC
1/ ·' AATATAAACG ATTAAAAGA ATG AGA TTT CCT TCA ATT TTT ACT GCA GTT TTA
Met Arg phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Vai Leu 15 10 TTC GCA GCA TCC TCC GCA TTA GCT GCT CCA GTC AAC ACT ACA AGA GAA • 2*j 55 Phe Ala Ala Ser Ser Ala Leu Ala Ala Pro Vai Asn Thr Thr Thr Glu ··· * 15 20 25
GAT GAA ACG GCA CAA ATT CCG GCT GAA GCT GTC ΑΤΓ GGT TAG ΤΓΑ GAT
62
GGT TTC TTC TAC ACT GAA AAG TCT GAC GAC GCT AAG GGT ATC GTT GAA
Gly Phe Phe Tyr Thr Glu Lys Ser Asp Asp Ala Lys Gly Ile Val Glu 110 115 120
CAA TGT TGT ACT TCT ATC TGT TCT TTG TAC CAA TTG GAA AAC TAC TGT
5 Gin Cys Cys Thr Ser lie Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys 125 130 135 AAC TAGACGCAGC CCGCAGGCTC TAGA ASH 140 10 (2) SEKVENSSIN ID NO:18 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 140 aminohappoa 15 (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini 20 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:18:
Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Vai Leu Phe Ala Ala Ser 15 10 15
Ala Leu Ala Ala Pro Vai Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala 25 20 25 30
Ile Pro Ala Glu Ala Vai Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp 35 40 45
Asp Vai Ala Vai Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu 50 55 60 30 Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly 65 70 75
Ser Leu Asp Lys Arg Glu Vai Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His 85 90 95
Vai Glu Ala Leu Tyr Leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr 35 100 105 110
Glu Lys Ser Asp Asp Ala Lys Gly Ile Vai Glu Gin Cys Cys Thr 115 120 125
Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 130 135 140 40 : : (2) SEKVENSSIN ID NO:19 TIEDOT: ·« » :\j (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: * * (A) PITUUS: 523 emäsparia • *·· 45 (B) tyyppi; nukleiinihappo • (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen Ψ
: · Ϊ (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA
::: 50 V · (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:19:
TAGCTTAAGG TAAGTTCTTA TCAAGTTTGT TCTTCTAATG TTTGATAGTT AAAGTATGTG
* , TTATATTTGC TAATTTTCTT ACTCTAAAGG AAGTTAAAAA TGACGTCAAA ATAAGCGTCG
: : : 55 TAGGAGGCGT AATCGACGAG gtcagttgtg atgttgtctt ctactttgcc gtgtttaagg
* CCGACTTCGA CAGTAGCCAA TGAGTCTAAA TCTTCCCCTA AAGCTACAAC GACAAAACGG
Λ _ ma Λ Λ ΆΓΓΦίηη /-* * *. * m* mmm * my-» 63
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: CDNA
(ix) OMINAISPIIRTEET: (A) NIMI/SELITYS: CDS 5 (B) ASEMA: 80..391 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:20:
ATCGAATTCC ATTCAAGAAT agttcaaaca agaagattac aaactatcaa tttcatacac 10 AATATAAACG ACCAAAAGA ATG AAG GOT GTT TTC TTG GTT TTG TCC TTG ATC
Met Lys Ala Val Phe Leu Val Leu Ser Leu lie 15 10
GGA TTC TGC TGG GCC CAA CCA GTC ACT GGC GAT GAA TCA TCT GTT GAG
Gly Phe Cys Trp Ala Gin Pro Val Thr Gly Asp Glu Ser Ser Val Glu 15 15 20 25
ATT CCG GAA GAG TCT CTG ATC ATC GOT GAA AAC ACC ACT TTG GCT AAC
lie Pro Glu Glu Ser Leu lie lie Ala Glu Asn Thr Thr Leu Ala Asn 30 35 40
GTC GCC ATG GCT AAG AGA TTC GTT GAC CAA CAC TTG TGC GGT TCT CAC
20 Val Ala Met Ala Lys Arg Phe Val Asp Gin His Leu Cys Gly Ser His 45 50 55
TTG GTT GAA GCT TTG TAC TTG GTT TGT GGT GAA AGA GGT TTC TTC TAC
Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr 60 65 70 75
25 ACT CCA AAG TCT GAC GAC GCT AAG GGT ATC GTT GAA CAA TGT TGT ACT
Thr Pro Lys Ser Asp Asp Ala Lys Gly lie Val Glu Gin Cys Cys Thr 80 85 90 TCT ATC TGT TCT TTG TAC CAA TTG GAA AAC TAC TGT GCT TAGACGCAGC Ser lie Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Ala 30 95 100
CCGCAGGCTC TAGA
{2) SEKVENSSIN ID NO:21 TIEDOT: 35 (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 104 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 40 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini S***· (Xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:21:
«M
5 ·,· Met Lys Ala Vai Phe Leu Vai Leu Ser Leu Ile Gly Phe Cys Trp
Il 45 1 5 10 15 ; ·,· Gin Pro Vai Thr Gly Asp Glu Ser Ser Vai Glu Ile Pro Glu Glu e : 20 25 30 ·;·*; Leu Ile Ile Ala Glu Asn Thr Thr Leu Ala Asn Vai Ala Met Ala . 35 40 45 * ; : 50 Arg Phe Vai Asp Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Vai Glu Ala ::: 50 55 eo S : : Tyr Leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Ser * 65 70 75
Asp Ala Lys Gly Ile Vai Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser . , 55 85 90 95 : : ; Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Ala ... . 1Q0 ·** J- v v • * 64
GACCCGGGTT GGTCAGTGAC CGCTACTTAG TAGACAACTC TAAGGCCTTC TCAGAGACTA GTAGCGACTT TTGTGGTGAA ACCGATTGCA GCGGTACCGA TTCTCTAAGC AACTGGTTGT GAACACGCCA AGAGTGAACC AACTTCGAAA CATGAACCAA ACACCACTTT CTCCAAAGAA GATGTGAGGT TTCAGACTGC TGCGATTCCC ATAGCAACTT GTTACAACAT GAAGATAGAC 5 AAGAAACATG GTTAACCTTT TGATGACACG AATCTGCGTC GGGCGTCCGA GATCT
(2) SEKVENSSIN ID NO:23 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: 10 (A) PITUUS: 415 emäsparia {B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen
15 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
(ix) OMINAISPIIRTEET:
(A) NIMIf SELITYS : CDS
(B) ASEMA: 80..391 20 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:23: ATCGAATTCC ATTCAAGAAT AGTTCAAACA AGAAGATTAC AAACTATCAA TTTCATACAC AATATAAACG ACCAAAAGA ATG AAG GCT GTT TTC TTG GTT TTG TCC TIG ATC 25 Met Lys Ala Vai Phe Leu Vai Leu Ser Leu Ile 15 10
GGA TTC TGC TGG GCC CAA CCA GTC ACT GGC GAT GAA TCA TCT GTT GAG
Gly Phe Cys Trp Ala Gin Pro Vai Thr Gly Asp Glu Ser Ser Vai Glu 15 20 25
30 ATT CCG GAA GAG TCT CTG ATC ATC GCT GAA AAC ACC ACT TTG GCT AAC
Ile Pro Glu Glu Ser Leu Ile Ile Ala Glu Asn Thr Thr Leu Ala Asn 30 35 40
GTC GCC ATG GCT AAG AGA TTC GTT ACT CAA CAC TTG TGC GGT TCT CAC
Vai Ala Met Ala Lys Arg Phe Vai Thr Gin His Leu Cys Gly Ser His 35 45 50 55
TTG GTT GAA GCT TTG TAC TTG GTT TGT GGT GAA AGA GGT TTC TTC TAC
Leu Vai Glu Ala Leu Tyr Leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr 60 65 70 75
ACT CCA AAG TCT GAC GAC GCT AAG GGT ATC GTT GAA CAA TGT TGT ACT
40 Thr Pro Lys Ser Asp Asp Ala Lys Gly Ile Vai Glu Gin Cys Cys Thr 80 85 90
.··*, TCT ATC TGT TCT TTG TAC CAA TTG GAA AAC TAC TGT GCT TAGACGCAGC
*··.* Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Ala • 95 100
·/·· 45 CCGCAGGCTC TAGA
* t \*·· (2) SEKVENSSIN ID NO:24 TIEDOT: • (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: 50 (A) PITUUS: 104 aminohappoa ·.·.· (B) TYYPPI: aminohappo ··· (D) TOPOLOGIA: 1ineaarinen
• Φ I
• · I
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini 55 • (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:24: • · ♦ ··· · .··% Met Lys Ala Vai Phe Leu Vai Leu Ser Leu Ile Gly Phe Cys Trp (2) SEKVENSSIN ID NO:25 TIEDOT: 65 (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 415 emäsparia 5 (B} TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA
10 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:25:
TAGCTTAAGG TAAGTTCTTA TCAAGTTTGT TCTTCTAATG TTTGATAGTT AAAGTATGTG TTATATTTGC TGGTTTTCTT ACTTCCGACA AAAGAACCAA AACAGGAACT AGCCTAAGAC 15 GACCCGGGTT GGTCAGTGAC CGCTACTTAG TAGACAACTC TAAGGCCTTC TCAGAGACTA GTAGCGACTT TTGTGGTGAA ACCGATTGCA GCGGTACCGA TTCTCTAAGC AATGAGTTGT GAACACGCCA AGAGTGAACC AACTTCGAAA CATGAACCAA ACACCACTTT CTCCAAAGAA GATGTGAGGT TTCAGACTGC TGCGATTCCC ATAGCAACTT GTTACAACAT GAAGATAGAC AAGAAACATG GTTAACCTTT TGATGACACG AATCTGCGTC GGGCGTCCGA GATCT
20 (2) SEKVENSSIN ID NO:26 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 415 emäsparia 25 (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
30 (ix) OMINAISPIIRTEET:
(A) NIMI/SELITYS : CDS
(B) ASEMA: 80..391 35 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:26:
ATCGAATTCC ATTCAAGAAT AGTTCAAACA AGAAGATTAC AAACTATCAA TTTCATACAC AATATAAACG ACCAAAAGA ATG AAG GCT GTT TTC TTG GTT TTG TCC TTG ATC
Met Lys Ala Vai Phe Leu Vai Leu Ser Leu Ile 40 1 5 10
.***. GGA TTC TGC TGG GCC CAA CCA GTC ACT GGC GAT GAA TCA TCT GTT GAG
*···* Gly Phe Cys Trp Ala Gin Pro Vai Thr Gly Asp Glu Ser Ser Vai Glu .·. : 15 20 25
\ *: ATT CCG GAA GAG TCT CTG ATC ATC GCT GAA AAC ACC ACT TTG GCT AAC
• * 45 Ile Pro Glu Glu Ser Leu Ile Ile Ala Glu Asn Thr Thr Leu Ala Asn */·· 30 35 40
. GTC GCC ATG GCT AAG AGA TTC GTT GAC CAA CAC TTG TGC GGT TCT CAC
·:··: Vai Ala Met Ala Lys Arg Phe Vai Asp Gin His Leu Cys Gly Ser His 45 50 55
: 50 TTG GTT GAA GCT TTG TAC TTG GTT TGT GGT GAA AGA GGT TTC TTC TAC
··* Leu Vai Glu Ala Leu Tyr Leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr ·*:*, 60 65 70 75
V * ACT CCA AAG TCT GAC GAC GCT AAG GGT ATC GTT GAA CAA TGT TGT ACT
Thr Pro Lys Ser Asp Asp Ala Lys Gly Ile Vai Glu Gin Cys Cys Thr 55 80 85 90
• . TCT ATC TGT TCT TTG TAC CAA TTG GAA AAC TAC TGT GGT TAGACGCAGC
! * ί Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Gly 95 loo 66
Met Lys Ala Val Phe Leu Val Leu Ser Leu lie Gly Phe Cys Trp 15 10 15
Gin Pro Val Thr Gly Asp Glu Ser Ser Val Glu lie Pro Glu Glu 20 25 30 5 Leu lie lie Ala Glu Asn Thr Thr Leu Ala Asn Val Ala Met Ala 35 40 45
Arg Phe Val Asp Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala 50 55 60
Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Ser 10 65 70 75
Asp Ala Lys Gly lie Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser lie Cys Ser 85 90 95
Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Gly 100 15 (2) SEKVENSSIN ID NO:28 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 415 emäsparia 20 (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA
25 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:28:
TAGCTTAAGG TAAGTTCTTA TCAAGTTTGT TCTTCTAATG TTTGATAGTT AAAGTATGTG TTATATTTGC TGGTTTTCTT ACTTCCGACA AAAGAACCAA AACAGGAACT AGCCTAAGAC 30 GACCCGGGTT GGTCAGTGAC CGCTACTTAG TAGACAACTC TAAGGCCTTC TCAGAGACTA GTAGCGACTT TTGTGGTGAA ACCGATTOCA GCGGTACCGA TTCTCTAAGC AACTGGTTGT GAACACGCCA AGAGTGAACC AACTTCGAAA CATGAACCAA ACACCACTTT CTCCAAAGAA GATGTGAGGT TTCAGACTGC TGCGATTCCC ATAGCAACTT GTTACAACAT GAAGATAGAC AAGAAACATG GTTAACCTTT TGATGACACC AATCTGCGTC GGGCGTCCGA GATCT
35 (2) SEKVENSSIN ID NO:29 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 415 emäsparia e·.. 40 ΐB) TYYPPI: nukleiinihappo {C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen * . (D) TOPOLOGIA: lineaarinen v « « • ··
II (ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
45 ! (ix) OMINAISPIIRTEET:
(A) NIMI/SELITYS : CDS
(B) ASEMA: 80. .391 • * lllm 50 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:29: • # »
ATCGAATTCC ATTCAAGAAT AGTTCAAACA AGAAGATTAC AAACTATCAA TTTCATACAC AATATAAACG ACCAAAAGA ATG AAG GOT GTT TTC TTG GTT TTG TCC TTG ATC
• . Met Lys Ala Vai Phe Leu Vai Leu Ser Leu Ile : ;: 55 i 5 10
GGA TTC TGC TGG GCC CAA CCA GTC ACT GGC GAT GAA TCA TCT GTT GAG
• * Glv Phe Cvs Tm Ala Gin Pm Vai Thr Glv Asn Gin Sei- Vai Gin 67
Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Gly 95 100
CCGCAGGCTC TAGA
5 (2) SEKVENSSIN ID NO:30 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 104 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 10 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini <xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:30: 15
Met Lys Ala Vai Phe Leu Vai Leu Ser Leu Ile Gly Phe Cys Trp 15 10 15
Gin Pro Vai Thr Gly Asp Glu Ser Ser Vai Glu Ile Pro Glu Glu 20 25 30 20 Leu Ile Ile Ala Glu Asn Thr Thr Leu Ala Asn Vai Ala Met Ala 35 40 45
Arg Phe Vai Thr Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Vai Glu Ala 50 55 60
Tyr Leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Ser 25 65 70 75
Asp Ala Lys Gly Ile Vai Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser 85 90 95
Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Gly 100 30 (2) SEKVENSSIN ID NO:31 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 415 emäsparia 3 5 (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA
« 40 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:31: « · » » *
’· *ί TAGCTTAAGG TAAGTTCTTA TCAAGTTTGT TCTTCTAATG TTTGATAGTT AAAGTATGTG
.·. J TTATATTTGC TGGTTTTCTT ACTTCCGACA AAAGAACCAA AACAGGAACT AGCCTAAGAC
·, *; 45 GACCCGGGTT GGTCAGTGAC CGCTACTTAG TAGACAACTC TAAGGCCTTC TCAGAGAC TA
• gtagcgactt ttgtggtgaa accgattgca GCGGTACCGA TTCTCTAAGC AATGAGTTGT
***** GAACACGCCA AGAGTGAACC AACTTCGAAA CATGAACCAA ACACCACTTT CTCCAAAGAA
. GATGTGAGGT TTCAGACTGC TGCGATTCCC ATAGCAACTT GTTACAACAT GAAGATAGAC
: ; : AAGAAACÄTG GTTAACCTTT TGATGACACC aatctgcgtc gggcgtccga gatct ::: so :T: (2) SEKVENSSIN ID NO:32 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: , . (A) PITUUS: 523 emäsparia : : : 55 (8J TYYPPI: nukleiinihappo **'.* (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen 68
TTC GCA GCA TCC TCC GCA TTA GCT GCT CCA GTC AAC ACT ACA ACA GAA
Phe Ala Ala Ser Ser Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu 15 20 25
GAT GAA ACG GCA CAA ATT CCG GCT GAA GCT GTC ATC GGT TAC TCA GAT
5 Asp Glu Thr Ala Gin He Pro Ala Glu Ala Val He Gly Tyr Ser Asp 30 35 40
TTA GAA GGG GAT TTC GAT GTT GCT GTT TTG CCA TTT TCC AAC AGC ACA
Leu Glu Gly Asp Phe Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr 45 50 55
10 AAT AAC GGG TTA TTG TTT ΑΤΑ AAT ACT ACT ATT GCC AGC ATT GCT GCT
Asn Asn Gly Leu Leu Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser He Ala Ala 60 65 70 75
AAA GAA GAA GGG GTA TCT TTG GAT AAG AGA TTC GTT AAC CAA CAC TTG
Lys Glu Glu Gly Val Ser Leu Asp Lys Arg Phe Val Asn Gin His Leu 15 80 85 90
TGC GGT TCT CAC TTG GTT GAA GCT TTG TAC TTG GTT TGT GGT GAA AGA
Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg 95 100 105
GGT TTC TTC TAC ACT CCA AAG TCT GAC GAC GCT AAG GGT ATC GTT GAA
20 Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Ser Asp Asp Ala Lys Gly lie Val Glu 110 115 120
CAA TGT TGT ACT TCT ATC TGT TCT TTG TAC CAA TTG GAA AAC TAC TGT
Gin Cys Cys Thr Ser He Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys 125 130 135 25 AAC TAGACGCAGC CCGCAGGCTC TAGA Asn 140 (2) SEKVENSSIN ID NO:33 TIEDOT: 30 (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 140 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 35 (ii) MOLEKYYLITYYPPl: proteiini (Xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:33: 1
Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Vai Leu Phe Ala Ala Ser 1 5 10 15 .***. Ala Leu Ala Ala Pro Vai Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala '···· 20 25 30 : Ile Pro Ala Glu Ala Vai Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp ·. ·: 45 35 40 45 ·*. : Asp Vai Ala Vai Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu 50 55 60
Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly • " 65 70 75 . 50 Ser Leu Asp Lys Arg Phe Vai Asn Gin Hi s Leu Cys Gly Ser His *··* 85 90 95
Vai Glu Ala Leu Tyr Leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr • * 100 105 110
Pro Lys Ser Asp Asp Ala Lys Gly Ile Vai Glu Gin Cys Cys Thr 55 115 120 125 ; ·*· Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn **· · 130 135 140 ··♦ • » • « . Ä . ________ (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:34: 69
TAGCTTAAGG TAAGTTCTTA TCAAGTTTGT TCTTCTAATG TTTGATAGTT AAAGTATGTG TTATATTTGC TAATTTTCTT ACTCTAAAGG AAGTTAAAAA TGACGTCAAA ATAAGCGTCG 5 TAGGAGGCGT AATCGACGAG GTCAGTTGTG ATGTTGTCTT CTACTTTGCC GTGTTTAAGG CCGACTTCGA CAGTAGCCAA TGAGTCTAAA TCTTCCCCTA AAGCTACAAC GACAAAACGG TAAAAGGTTG TCGTGTTTAT TGCCCAATAA CAAATATTTA TGATGATAAC GGTCGTAACG ACGATTTCTT CTTCCCCATA GAAACCTATT CTCTAAGCAA TTGGTTGTGA ACACGCCAAG AGTGAACCAA CTTCGAAACA TGAACCAAAC ACCACTTTCT CCAAAGAAGA TGTGAGGTTT 10 CAGACTGCTG CGATTCCCAT AGCAACTTGT TACAACATGA AGATAGACAA GAAACATGGT TAACCTTTTG ATGACATTGA TCTGCGTCGG GCGTCCGAGA TCT
(2) SEKVENSSIN ID NO:35 TIEDOT: 15 {i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 409 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 20
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
(ix) OMINAISPIIRTEET: (A) NIMI/SELITYS : CDS 25 (B) ASEMA: 80,,385 {xi} SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:35:
ATCGAATTCC ATTCAAGAAT AGTTCAAACA AGAAGATTAC AAACTATCAA TTTCATACAC 30 AATATAAACG ACCAAAAGA ATG AAG GCT GTT TTC TTG GTT TTG TCC TTG ATC
Met Lys Ala Vai Phe Leu Vai Leu Ser Leu Ile 15 10
GGA TTC TGC TGG GCC CAA CCA GTC ACT GGC GAT GAA TCA TCT GTT GAG
Gly Phe Cys Trp Ala Gin Pro Vai Thr Gly Asp Glu Ser Ser Vai Glu 35 15 20 25
ATT CCG GAA GAG TCT CTG ATC ATC GCT GAA AAC ACC ACT TTG GCT AAC
Ile Pro Glu Glu Ser Leu Ile Ile Ala Glu Asn Thr Thr Leu Ala Asn 30 35 40
GTC GCC ATG GCT AAG AGA TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGC GGT TCT CAC
40 Vai Ala Met Ala Lys Arg Phe Vai Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His ... 45 50 55
: I TTG GTT GAA GCT TTG TAC TTG GTT TGT GGT GAA AGA GGT TTC TTC TAC
'·* Leu Vai Glu Ala Leu Tyr Leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr 60 65 70 75
• * 45 ACT CCT AAG GAA AAG AGA GGT ATC GTT GAA CAA TGT TGT ACT TCT ATC
; Thr Pro Lys Glu Lys Arg Gly Ile Vai Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile *: 80 85 90 TGT TCT TTG TAC CAA TTG GAA AAC TAC TGT GGT TAGACGCAGC CCGCAGGCTC, • · Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Gly . 50 95 100
ϊ : : TAGA
• * * ... 409 *## * ( 2) SEKVENSSIN ID NO:36 TIEDOT: 55 . (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: ;.· * (A) PITUUS: 102 aminohappoa • ·. (8} TYYPPI: aminohappo 1 ! inl ΦΛΠΛΤ r^TT, . Ί J_____J ___ 70
Arg Phe Vai Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala 50 55 60
Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Glu 65 70 75 5 Arg Gly lie Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser lie Cys Ser Leu Tyr 85 90 95
Leu Glu Asn Tyr Cys Gly 100 10 (2) SEKVENSSIN ID NO:37 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 409 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo 15 <C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA
20 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:37:
TAGCTTAAGG TAAGTTCTTA TCAAGTTTGT TCTTCTAATG TTTGATAGTT AAAGTATGTG TTATATTTGC TGGTTTTCTT ACTTCCGACA AAAGAACCAA AACAGGAACT AGCCTAAGAC GACCCGGGTT GGTCAGTGAC CGCTACTTAG TAGACAACTC TAAGGCCTTC TCAGAGACTA 25 GTAGCGACTT TTGTGGTGAA ACCGATTGCA GCGGTACCGA TTCTCTAAGC AATTGGTTGT GAACACGCCA AGAGTGAACC AACTTCGAAA CATGAACCAA ACACCACTTT CTCCAAAGAA GATGTGAGGA TTCCTTTTCT CTCCATAGCA ACTTGTTACA ACATGAAGAT AGACAAGAAA CATGGTTAAC CTTTTGATGA CACCAATCTG CGTCGGGCGT CCGAGATCT
30 (2) SEKVENSSIN ID NO:38 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 511 emäsparia {8) TYYPPI: nukleiinihappo 35 (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
.··*. 40 (ix) OMINAISPIIRTEET:
%..· (A) NIMI/SELITYS : CDS
.·. : (8) ASEMA: 77..487 • »* ; (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:38: \ ·: 45
GAATTCCATT CAAGAATAGT TCAAACAAGA AGATTACAAA CTATCAATTT CATACACAAT
• · ATAAACGATT AAAAGA ATG AGA TTT CCT TCA ATT TTT ACT GCA GTT TTA
. Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Vai Leu ϊ: : 1 5 10
Γ*; 50 TTC GCA GCA TCC TCC GCA TTA GCT GOT CCA GTC AAC ACT ACA ACA GAA
l t l Phe Ala Ala Ser Ser Ala Leu Ala Ala Pro Vai Asn Thr Thr Thr Glu * 15 20 25 GAT GAA ACG GCA CAA ATT CCG GCT GAA GCT GTC ATC GGT TAC TCA GAT Asp Glu Thr Ala Gin Ile Pro Ala Glu Ala Vai Ile Gly Tyr Ser Asp : 55 30 35 40
: TTA GAA GGG GAT TTC GAT GTT GCT GTT TTG CCA TTT TCC AAC AGC ACA
.···. Leu Glu Gly Asp Phe Asp Vai Ala Vai Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr 71 ACT TCT ATC TGT TCT TTG TAC CAA TTG GAA AAC TAC TGC AAC Thr Ser lie Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 125 130 135
TAGACGCAGC CCGCAGGCTC TAGA
5 (2} SEKVENSSIN ID NO:39 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 137 aminohappoa 10 (8) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: 1ineaarinen {ii} MOLEKYYLITYYPPI: proteiini 15 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:39:
Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Vai Leu Phe Ala Ala Ser 15 10 15
Ala Leu Ala Ala Pro Vai Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala 20 20 25 30
Ile Pro Ala Glu Ala Vai Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp 35 40 45
Asp Vai Ala Vai Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu 50 55 60 25 Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly 65 70 75
Ser Met Ala Lys Arg Phe Vai Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His 85 90 95
Vai Glu Ala Leu Tyr Leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr 30 100 105 110
Pro Lys Thr Arg Gly Ile Vai Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys 115 120 125
Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 130 135 35 (2) SEKVENSSIN ID NO:40 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 511 emäsparia .***· 40 (B) TYYPPI: nukleiinihappo ·*" (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen ;*·.· (D} TOPOLOGIA: lineaarinen ♦ ·
5 {ii} MOLEKYYLITYYPPI: DNA
• : 45 ·;··· (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 40:
; j*j CTTAAGGTAA GTTCTTATCA AGTTTGTTCT TCTAATGTTT GATAGTTAAA GTATGTGTTA
··'·' TATTTGCTAA TTTTCTTACT CTAAAGGAAG ttaaaaatga CGTCAAAATA AGCGTCGTAG
50 GAGGCGTAAT CGACGAGGTC AGTTGTGATG TTGTCTTCTA CTTTGCCGTG TTTAAGGCCG
V * ACTTCGACAG TAGCCAATGA GTCTAAATCT TCCCCTAAAG CTACAACGAC AAAACGGTAA
AAGGTTGTCG TGTTTATTGC CCAATAACAA ATATTTATGA TGATAACGGT CGTAACGACG ATTTCTTCTT CCCCATAGGT ACCGATTCTC TAAGCAATTG GTTGTGAACA CGCCAAGGGT • . GAACCAACTT CGAAACATGA ACCAAACACC ACTTTCTCCA AAGAAGATOT GAGGTTTCTG
: : : 55 atctccatag CAACTTGTTA CAACATGAAG ATAGACAAGA AACATGGTTA accttttgat
GACGTTGATC TGCGTCGGGC GTCCGAGATC T
: : (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:41: 72
ATCGAATTCC ATTCAAGAAT AGTTCAAACA AGAAGATTAC AAACTATCAA TTTCATACAC 5 AATATAAACG ATTAAAAGA ATG AGA TTT CCT TCA ATT TTT ACT GCA GTT TTA
Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu 15 10
TTC GCA GCA TCC TCC GCA TTA GCT GCT CCA GTC AAC ACT ACA ACA GAA
Phe Ala Ala Ser Ser Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu 10 15 20 25
GAT GAA ACG GCA CAA ATT CCG GCT GAA GCT GTC ATC GGT TAC TCA GAT
Asp Glu Thr Ala Gin lie Pro Ala Glu Ala Val lie Gly Tyr Ser Asp 30 35 40
TTA GAA GGG GAT TTC GAT GTT GCT GTT TTG CCA TTT TCC AAC AGC ACA
15 Leu Glu Gly Asp Phe Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr 45 50 55
AAT AAC GGG TTA TTG TTT ΑΤΑ AAT ACT ACT ATT GCC AGC ATT GCT GCT
Asn Asn Gly Leu Leu Phe lie Asn Thr Thr lie Ala Ser lie Ala Ala 60 65 70 75
20 AAA GAA GAA GGG GTA TCC ATG GCT AAG AGA TTC GTT AAC CAA CAC TTG
Lys Glu Glu Gly Val Ser Met Ala Lys Arg Phe Val Asn Gin His Leu 80 85 90
TGC GGT TCC CAC TTG GTT GAA GCT TTG TAC TTG GTT TGC GGT GAA AGA
Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg 25 95 100 105
GGT TTC TTC TAC ACT CCT AAG TCT GAC GAT GCT AAG GGT ATT GTC GAG
Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Ser Asp Asp Ala Lys Gly lie Val Glu 110 115 120
CAA TGC TGT ACC TCC ATC TGC TCC TTG TAC CAA TTG GAA AAC TAC TGC
30 Gin Cys Cys Thr Ser He Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys 125 130 135 AAC TAGACGCAGC CCGCAGGCTC TAGA Asn 140 35 ¢2} SEKVENSSIN ID NO:42 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 140 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 40 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID N0;42: s/·: 45 * l Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Vai Leu Phe Ala Ala Ser :Λ: 15 10 15
Ala Leu Ala Ala Pro Vai Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala 20 25 30 . 50 Ile Pro Ala Glu Ala Vai Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp \:.ί 35 40 45 ··. Asp Vai Ala Vai Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu · 50 55 60
Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly 55 65 70 75 * · Ser Met Ala Lys Arg Phe Vai Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His : 85 90 95 e**· Vai Glu Ala Leu Tyr Leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr • 2 1 nn 1 ne i -i n 4 73
t ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:43: 5
TAGCTTAAGG TAAGTTCTTA TCAAGTTTGT TCTTCTAATG TTTGATAGTT AAAGTATGTG TTATATTTGC TAATTTTCTT ACTCTAAAGG AAGTTAAAAA TGACGTCAAA ATAAGCGTCG TAGGAGGCGT AATCGACGAG GTCAGTTGTG ATGTTGTCTT CTACTTTGCC GTGTTTAAGG CCGACTTCGA CAGTAGCCAA TGAGTCTAAA TCTTCCCCTA AAGCTACAAC GACAAAACGG 10 TAAAAGGTTG TCGTGTTTAT TGCCCAATAA CAAATATTTA TGATGATAAC GGTCGTAACG ACGATTTCTT CTTCCCCATA GGTACCGATT CTCTAAGCAA TTGGTTGTGA ACACGCCAAG GGTGAACCAA CTTCGAAACA TGAACCAAAC GCCACTTTCT CCAAAGAAGA TGTGAGGATT CAGACTGCTA CGATTCCCAT AACAGCTCGT TACGACATGG AGGTAGACGA GGAACATGGT TAACCTTTTG ATGACGTTGA TCTGCGTCGG GCGTCCGAGA TCT
15 (2) SEKVENSSIN ID NO:44 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 535 emasparia 20 ΐB) TYYPPI: nukleiinihappo <C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
25 (ix) OMINAISPIIRTEET:
(A) NIMI/SELITYS : CDS
(B) ASEMA: 77..511 1 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:44: GAATTCCATT CAAGAATAGT TCAAACAAGA AGATTACAAA CTATCAATTT CATACACAAT ATAAACGATT AAAAGA ATG AGA TTT CCT TCA ATT TTT ACT GCA GTT TTA Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Vai Leu 3 5 1 5 10
TTC GCA GCA TCC TCC GCA TTA GCT GCT CCA GTC AAC ACT ACA ACA GAA
Phe Ala Ala Ser Ser Ala Leu Ala Ala Pro Vai Asn Thr Thr Thr Glu 15 20 25
GAT GAA ACG GCA CAA ATT CCG GCT GAA GCT GTC ATC GGT TAC TCA GAT
40 Asp Glu Thr Ala Gin Ile Pro Ala Glu Ala Vai Ile Gly Tyr Ser Asp ,···. 30 35 40
TTA GAA GGG GAT TTC GAT GTT GCT GTT TTG CCA TTT TCC AAC AGC ACA
• · Leu Glu Gly Asp Phe Asp Vai Ala Vai Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr : 45 50 55
J * 45 AAT AAC GGG TTA TTG TTT ATA AAT ACT ACT ATT GCC AGC ATT GCT GCT
Ϊ Asn Asn Gly Leu Leu Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala * · 60 65 70 75 AAA GAA GAA GGG GTA TCC ATG GCT AAG AGA GAA GAA GCT GAA GCT GAA * Lys Glu Glu Gly Vai Ser Met Ala Lys Arg Glu Glu Ala Glu Ala Glu . 50 80 85 90 GCT AGA TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGC GGT TCC CAC TTG GTT GAA GCT ,*;* Ala Arg Phe Vai Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Vai Glu Ala V · 95 100 105
TTG TAC TTG GTT TGT GGT GAA AGA GGT TTC TTC TAC ACT CCA AAG ACT
55 Leu Tyr Leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr . , 110 115 120
: ; · AGA GGT ATC GTT GAA CAA TGT TGT ACT TCT ATC TGT TCT TTG TAC CAA
*·· · Arg Gly Ile Vai Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin ·“*. 125 130 135 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:45: 74
Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser 15 10 15 5 Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala 20 25 30 lie Pro Ala Glu Ala Val lie Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp 35 40 45
Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu 10 50 55 60
Phe lie Asn Thr Thr lie Ala Ser lie Ala Ala Lys Glu Glu Gly 65 70 75
Ser Met Ala Lys Arg Glu Glu Ala Glu Ala Glu Ala Arg Phe Val 85 90 95 15 Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val 100 105 110
Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Gly He Val 115 120 125
Gin Cys Cys Thr Ser lie Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr 20 130 135 140
Asn 145 {2) SEKVENSSIN ID NO:46 TIEDOT: 25 (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 535 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen 30 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:46: 35
CTTAAGGTAA GTTCTTATCA AGTTTGTTCT TCTAATGTTT GATAGTTAAA GTATGTGTTA
TATTTGCTAA TTTTCTTACT CTAAAGGAAG TTAAAAATGA CGTCAAAATA AGCGTCGTAG
GAGGCGTAAT CGACGAGGTC AGTTGTGATG TTGTCTTCTA CTTTGCCGTG TTTAAGGCCG
ACTTCGACAG TAGCCAATGA GTCTAAATCT TCCCCTAAAG CTACAACGAC AAAACGGTAA
.**·. 40 AAGGTTGTCG TGTTTATTGC CCAATAACAA ATATTTATGA TGATAACGGT CGTAACGACG
'···1 ATTTCTTCTT CCCCATAGGT ACCGATTCTC TCTTCTTCGA CTTCGACTTC GATCTAAGCA
: ATTGGTTGTG AACACGCCAA GGGTGAACCA ACTTCGAAAC ATGAACCAAA CACCACTTTC
*. 1; TCCAAAGAAG ATGTGAGGTT TCTGATCTCC ATAGCAACTT GTTACAACAT GAAGATAGAC
• . AAGAAACATG GTTAACC TTT TGATGACGTT GATCTGCGTC GGGCGTCCGA GATCT
V·: 45 (2) SEKVENSSIN ID NO: 47 TIEDOT: • · „ .· (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: \:.5 (A) PITUUS: 538 emäsparia .·1· 50 (B) TYYPPI: nukleiinihappo ; (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen
. (ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
: 55 .···1 (ix) OMINAISPIIRTEET: 9 m / Ά \ TSTTTUTT- / COT T/TIVO - ΠΑΓ1 ä 75
GAT GAA ACG GCA CAA ATT CCG GCT GAA GCT GTC ATC GGT TAC TCA GAT
Asp Glu Thr Ala Gin Ile Pro Ala Glu Ala Vai Ile Gly Tyr Ser Asp 30 35 40
TTA GAA GGG GAT TTC GAT GTT GCT GTT TTG CCA TTT TCC AAC AGC ACA
5 Leu Glu Gly Asp Phe Asp Vai Ala Vai Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr 45 50 55
AAT AAC GGG TTA TTG TTT ATA AAT ACT ACT ATT GCC AGC ATT GCT GCT
Asn Asn Gly Leu Leu Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala 60 65 70 75
10 AAA GAA GAA GGG GTA TCC ATG GCT AAG AGA GAA GAA GCT GAA GCT GAA
Lys Glu Glu Gly Vai Ser Met Ala Lys Arg Glu Glu Ala Glu Ala Glu 80 85 90
GCT GAA AGA TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGC GGT TCC CAC TTG GTT GAA
Ala Glu Arg Phe Vai Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Vai Glu 15 95 100 105
GCT TTG TAC TTG GTT TGT GGT GAA AGA GGT TTC TTC TAC ACT CCA AAG
Ala Leu Tyr Leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys 110 115 120 ACT AGA GGT ATC GTT GAA CAA TGT TGT ACT TCT ATC TGT TCT TTG TAC- 20 Thr Arg Gly Ile Vai Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr 125 130 135 CAA TTG GAA AAC TAC TGC AAC TAGACGCAGC CCGCAGGCTC TAGA Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 140 145 25 (2) SEKVENSSIN ID NO:48 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 146 aminohappoa 30 (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini 35 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:48:
Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Vai Leu Phe Ala Ala Ser 15 10 15
Ala Leu Ala Ala Pro Vai Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala 40 20 25 30 „ Ile Pro Ala Glu Ala Vai Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp : : 35 40 45 *'* Asp Vai Ala Vai Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu : 50 55 60 * J 45 Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly : 65 70 75 * ' Ser Met Ala Lys Arg Glu Glu Ala Glu Ala Glu Ala Glu Arg Phe ·:··: 85 90 95 , Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Vai Glu Ala Leu Tyr Leu : r: 50 100 105 no
Hl Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Gly Ile : : : 115 120 125
Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn 130 135 140 . . 55 Cys Asn : : : 145 ··« · :***: (2) SEKVENSSIN ID NO: 49 TIEDOT: • * Λ i 76
GAGGCGTAÄT CGACGAGGTC AGTTGTGATG TTGTCTTCTA CTTTGCCGTG TTTAAGGCCG ACTTCGACAG TAGCCAATGA GTCTAAATCT TCCCCTAAAG CTACAACGAC AAAACGGTAA AAGGTTGTCG TGTTTATTGG CCAATAACAA ATATTTATGA TGATAACGGT CGTAACGACG ATTTCTTCTT CCCCATAGGT ACCGATTCTC TCTTCTTCGA CTTCGACTTC GACTTTCTAA 5 GCAATTGGTT GTGAACACGC CAAGGGTGAA CCAACTTCGA AACATGAACC AAACACCACT TTCTCCAAAG AAGATGTGAG GTTTCTGATC TCCATAGCAA CTTGTTACAA CATGAAGATA GACAAGAAAC ATGGTTAACC TTTTGATGAC GTTGATCTGC GTCGGGCGTC CGAGATCT
• I
• ft «·· * ft • · ft • ft# * ft * 1 •ft ft • · 8 » ft ft • 1 • • · ft ft ft • ft1 •ft1 • ft · • ft ft ft • ft ft · ft • ft ft ftftft ft · ft • ft ft ft •ft ft

Claims (30)

  1. 77 Pat entt i vaat ixnukset
  2. 1. Menetelmä insuliinijohdannaisen valmistamise johdannaisella on sekvenssi: A-ketju S-------------------S 5 | 7 | Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-1 2 3 4 5 6 | 8 9 10 11 12 S i
  3. 10 B-ketju S i Xaa~Val-Xaa-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-123456789 10 11 12 A-ketju (jatkoa) 15 20 Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Xaa (SEQ ID NO 13 14 15 16 17 18 19 | 21 ----S
  4. 20 B-ketju (jatkoa) S Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 B-ketju (jatkoa) 25 Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Xaa (SEQ ID Ν0:ί 25 26 27 28 29 30 • · ***** joissa • · t · I • ·· ♦ · :\J asemissa A21 ja B3 olevat Xaa:t ovat toisistaan * i ····: 30 Lys:ä, Arg:a ja Cys:ä lukuun ottamatta mikä tah . ,·, happoryhmä, joka voi olla geneettisen koodin koodac • 9 · «a· ««« « I I V * asemassa Bl oleva Xaa on Phe tai se on deletoitu; ; .·. asemassa B3 0 oleva Xaa on Lys:ä, Arg:a ja Cys:ä 1 *·· matta mikä tahansa aminohappo ryhmä, joka voi olla 78 asemassa Bl oleva Xaa on Phe, niin insuliinijohd Zn2+-kompleksi, tunnettu siitä, että menetelmässä asyloidaan insul sori, jolla on edellä mainittu SEQ ID N0:1 ja 2 5 asylointiaineella lipofiilisen substituentin aikaa aseinaan B29.
  5. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunn että asemissa A21 ja B3 olevat Xaa:t on Lys:ä, Arg lukuun ottamatta toisistaan riippumatta mikä tab 10 happoryhmä, joka voi olla geneettisen koodin koodaa asemassa Bl oleva Xaa on Phe tai se on deletoitu; asemassa B30 oleva Xaa on koodittumaton lipofi 24-hiillatominen aminohappo ja asyyliryhmä liit ε-aminoryhmään, jossa asyyliryhmä on korkeintae 15 atomisen monokarboksyylihapon tai korkeintaan 5-hd dikarboksyylihapon asyyliryhmä.
  6. 3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunn että • « • · asemissa A21 ja B3 olevat Xaa:t ovat Lys:ä, Arg:a j * ; 20 kuun ottamatta toisistaan riippumatta mikä tahansa *· * * ryhmä, joka voi olla geneettisen koodin koodaama; • * asemassa Bl oleva Xaa on Phe tai se on deletoitu; ··· • · · *·" * asemassa B30 oleva Xaa on deletoitu tai se on Lys; • Cys:ä lukuun ottamatta mikä tahansa aminohappory hm ···/ 25 olla geneettisen koodin koodaama ja LysB29:n ε-aminc 79
  7. 5. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tuns että LysB29:n ε-aminoryhmään liittynyt asyyliryhmä c asetyyli, propionyyli tai n-butyryyli.
  8. 6. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunn 5 että LysB29:n ε-aminoryhmään liittynyt asyyliryhmä kahapon asyyliryhmä.
  9. 7. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunn että asemassa B30 oleva Xaa on deletoitu.
  10. 8. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunr 10 että asemassa B30 oleva Xaa on Asp, Glu tai Thr.
  11. 9. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunr että LysB29:n ε-aminoryhmään liittynyt lipofiilir tuentti on vähintään 6-hiiliatomisesta karboksyyli räisin oleva asyyliryhmä.
  12. 10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunr että asyyliryhmä, joka voi olla haaroittunut, si atomia pitkän hiiliatomipääketjun. .··*, 11. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tum • « ·«· .·. ; että asyyliryhmä on vähintään 6-hi il latominen • »· Il 20 asyyliryhmä. • · · • «
  13. 12. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tum Z/./· että asyyliryhmä on lineaarisen, tyydyttyneen karbc :***: asyyliryhmä, joka on 6-24 hiiliatomin pituinen. . . 13. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tum • 99 :·|β: 25 että asyyliryhmä on dodekaanihappo, tridekaan • ♦ 80
  14. 16. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä tunx että asemassa Bl oleva Xaa on deletoitu.
  15. 17. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunn että valmistetaan ihmisen N^-tetradekanoyyli-des (E 5 ni.
  16. 18. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunn että valmistetaan ihmisen N6 -tetradekanoyyli-des(Έ nin mikä tahansa Zn2+-kompleksi.
  17. 19. Patenttivaatimuksen 18 mukainen menetelmä, turn 10 että valmistetaan ihmisen N^-tetradekanoyyli-de liinin Zn^-kompleksi, joka sisältää 2, 3 tai 4 Zn2*-liiniheksameeria kohden.
  18. 20. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tuxui että valmistetaan ihmisen NeB29-(litokoloyyli-glut 15 (B30)insuliini.
  19. 21. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunn että valmistetaan ihmisen ΝεΒ29-(litokoloyyli-glut (B30) insuliinin mikä tahansa Zn2+-kömpi eksi. • · · • f • f i·· : 22. Patenttivaatimuksen 21 mukainen menetelmä, turn • *» l' | 20 että valmistetaan ihmisen I'F829-(litokoloyyli-glut a t» j (B3 0) insuliinin Zn "-kompleksi, joka sisältää 2, 3 ionia insuliiniheksameeria kohden. • * · * · · • · · : 25 1. Förfarande för att framställa ett insulinderi * · * .···. derivatet har sekvensen: 81 A-kedj a S-------------------S I 7 I Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-1 2 3 4 5 6 I 8 9 10 11 12
  20. 5 S B-kedja S Xaa-Val-Xaa-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A-kedja (fortsättning) 20 Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Xaa (SEQ ID NO :1 13 14 15 16 17 18 19 | 21 15 ----S B-kedja (fortsättning) S Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-20 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 B-kedja (fortsättning) Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Xaa (SEQ ID NO:2 25 26 27 28 29 30 25 varvid Xaa i läge A21 och B3 är oberoende av varandra vi syragrupp som heist, förutom Lys, Arg och Cys, S' :***: kodad av en genetisk kod; «·« 30 9 9 •\ : Xaa i läge Bl är Phe eller deleterad; • M • « * β ·β Xaa i läge B30 är vilken ami no syragrupp som hel # 1 1 Lys, Arg och Cys, som kan vara kodad av en ge: > « » * 35 eller deleterad; « :,: i och i £-aminogruppen av LysB29 finns en lipofilisk s • « · 82 känneteckxiat av att man vid förfarandet acylerar prekursor, med ovan nämnda SEQ ID N0:1 och 2, me< ligt acyleringsmedel för att ästadkomma en lipofil 5 tuent i läge B29.
  21. 2. Förfarande enligt patentkrav 1, kannetecknat a läge A21 och B3 är oberoende av varandra vilken grupp som heist, förutom Lys, Arg och Cys, som kar 10 av en genetisk kod; Xaa i läge Bl är Phe eller deleterad; Xaa i läge B3Q är en okodad lipofil aminosyra med 15 atomer och acylgruppen är förbunden med E-amii Lys*29, varvid acylgruppen är en acylgrupp av monol< med högst 4 kolatomer eller av dikarboxylsyra n kolatomer. 20 3. Förfarande enligt patentkrav 1, kännetecknat a .·*·. Xaa i läge A21 och B3 är oberoende av varandra vi * * : syragrupp som heist förutom Lys, Arg och Cys, se t lm | kodad av en genetisk kod; • «I 25 Xaa i läge Bl är Phe eller deleterad; ♦ · « • f 4 ♦ ·# V * Xaa i läge B30 är deleterad eller vilken aminosy heist, förutom Lys, Arg och Cys, som kan vara > ·.; · 3 0 genetisk kod och £-aminogruppen i Lys829 har en 41« _ , M m Λ m m - < 83
  22. 5. Förfarande enligt patentkrav 2, kännetecknat a gruppen som är förbunden med £-aminogruppen formyl, acetyl, propionyl eller n-butyryl* 5 6. Förfarande enligt patentkrav 2, kännetecknat a gruppen som är förbunden med ε-aminogruppen i ] acylgrupp av bärnstenssyra.
  23. 7. Förfarande enligt patentkrav 3, kännetecknat a 10 läge B30 är deleterad.
  24. 8. Förfarande enligt patentkrav 3, kännetecknat a läge B30 är Asp, Glu eller Thr. 15 9. Förfarande enligt patentkrav 3, kännetecknat lipofila substituenten som är förbunden med e-ami LysB29är en acylgrupp härstammande frän karbox ätminstone 6 kolatomer. 20 10. Förfarande enligt patentkrav 9, känneteckn acylgruppen, som kan vara förgrenad, innehäller .*··. huvudkedja med en längd av 8-24 atomer. * • * • * · « ·· I 11. Förfarande enligt patentkrav 9, kännetecknat a • · · l 25 gruppen är en acylgrupp av fettsyra med ätminston • e mer. • · · • a · Λ 4 «« m · · ··· * 12. Förfarande enligt patentkrav 9, kännetecknat a gruppen är en acylgrupp av en linjär, mättad karbc * « : 3 0 en längd av 6-24 kolatomer. »»* 84 läget B3 är Asp, Gin eller Thr.
  25. 16. Förfarande enligt patentkrav 1, kännetecknat a läget Bl är deleterad. 5
  26. 17. Förfarande enligt patentkrav 3, kännetecknat framställer mänskligt N^-tetradekanoyl-des (B30) in
  27. 18. Förfarande enligt patentkrav 3, kännetecknat 10 framställer vilket som heist Zn2+-komplex av män; tetradekanoyl-des <B30) insulin.
  28. 19. Förfarande enligt patentkrav 18/ kännetecknat framställer Zn2*-komplex av mänskligt N£B29-tet 15 des(B30)insulin, innehällande 2, 3 eller 4 Zn2 varje insulinhexamer.
  29. 20. Förfarande enligt patentkrav 3, kännetecknat framställer mänskligt N£B29-(litokoloyl-glutamyl 20 insulin.
  30. 21. Förfarande enligt patentkrav 3, kännetecknat : framställer vilket som heist Zn +-kömpi ex av män: "· ** \ (litokoloyl-glutamyl)-des (B30) insulin. * 25 . 22. Förfarande enligt patentkrav 21, kännetecknat * * *·"* framställer ett Zn2t-komplex av mänskligt N^29- ( * * * *** ’ glutamyl) -des (B30) insulin, innehällande 2, 3 el joner för varje insulinhexamer. • « « « · t ·· ·
FI961220A 1993-09-17 1996-03-15 Menetelmä asyloidun insuliinin valmistamiseksi FI117055B (fi)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DK104493A DK104493D0 (da) 1993-09-17 1993-09-17 Hidtil ukendte peptider
DK104493 1993-09-17
US19082994A 1994-02-02 1994-02-02
US19082994 1994-02-02
DK9400347 1994-09-16
PCT/DK1994/000347 WO1995007931A1 (en) 1993-09-17 1994-09-16 Acylated insulin

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI961220A0 FI961220A0 (fi) 1996-03-15
FI961220A FI961220A (fi) 1996-05-14
FI117055B true FI117055B (fi) 2006-05-31

Family

ID=26065125

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI961220A FI117055B (fi) 1993-09-17 1996-03-15 Menetelmä asyloidun insuliinin valmistamiseksi

Country Status (30)

Country Link
US (1) US5750497A (fi)
EP (2) EP0792290B1 (fi)
JP (3) JP3014764B2 (fi)
KR (1) KR100310122B1 (fi)
CN (1) CN1056618C (fi)
AT (1) ATE204882T1 (fi)
AU (2) AU682061B2 (fi)
BG (1) BG61611B1 (fi)
BR (1) BR9407508A (fi)
CA (1) CA2171424C (fi)
CZ (1) CZ287945B6 (fi)
DE (2) DE69428134T2 (fi)
DK (1) DK0792290T3 (fi)
ES (1) ES2163451T3 (fi)
FI (1) FI117055B (fi)
FR (1) FR04C0020I2 (fi)
HU (1) HU217684B (fi)
IL (1) IL110977A (fi)
LU (1) LU91101I2 (fi)
NL (1) NL300160I2 (fi)
NO (3) NO316944B1 (fi)
NZ (1) NZ273285A (fi)
PL (1) PL178466B1 (fi)
PT (1) PT792290E (fi)
RO (1) RO112873B1 (fi)
RU (1) RU2164520C2 (fi)
SI (1) SI0792290T1 (fi)
SK (1) SK282495B6 (fi)
UA (1) UA45321C2 (fi)
WO (1) WO1995007931A1 (fi)

Families Citing this family (185)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9316895D0 (en) * 1993-08-13 1993-09-29 Guy S And St Thomas Hospitals Hepatoselective insulin analogues
US6342225B1 (en) 1993-08-13 2002-01-29 Deutshces Wollforschungsinstitut Pharmaceutical active conjugates
US6869930B1 (en) * 1993-09-17 2005-03-22 Novo Nordisk A/S Acylated insulin
DE4437604A1 (de) * 1994-10-21 1996-04-25 Basf Ag Konjugate aus einem Poly- oder Oligopeptid und einer niedermolekularen lipophilen Verbindung
US5646242A (en) * 1994-11-17 1997-07-08 Eli Lilly And Company Selective acylation of epsilon-amino groups
US5693609A (en) * 1994-11-17 1997-12-02 Eli Lilly And Company Acylated insulin analogs
CZ289343B6 (cs) * 1995-03-17 2002-01-16 Novo Nordisk A/S Inzulinový derivát a farmaceutický prostředek pro léčení diabetes
US6251856B1 (en) 1995-03-17 2001-06-26 Novo Nordisk A/S Insulin derivatives
US20010041786A1 (en) * 1995-06-07 2001-11-15 Mark L. Brader Stabilized acylated insulin formulations
GB9513967D0 (en) * 1995-07-08 1995-09-06 Univ Leicester Insulin
US6451970B1 (en) 1996-02-21 2002-09-17 Novo Nordisk A/S Peptide derivatives
AU720484B2 (en) * 1996-06-20 2000-06-01 Novo Nordisk A/S Insulin preparations containing NaCl
US5905140A (en) * 1996-07-11 1999-05-18 Novo Nordisk A/S, Novo Alle Selective acylation method
EP0938502B1 (en) * 1996-07-11 2004-10-06 Novo Nordisk A/S Selective acylation method
US20020025933A1 (en) * 1996-08-30 2002-02-28 Knudsen Liselotte Bjerre GLP-2 derivatives
US6268343B1 (en) 1996-08-30 2001-07-31 Novo Nordisk A/S Derivatives of GLP-1 analogs
US7235627B2 (en) 1996-08-30 2007-06-26 Novo Nordisk A/S Derivatives of GLP-1 analogs
US6458924B2 (en) 1996-08-30 2002-10-01 Novo Nordisk A/S Derivatives of GLP-1 analogs
US5898067A (en) * 1997-02-07 1999-04-27 Novo Nordisk A/S Crystallization of proteins
US6310038B1 (en) 1997-03-20 2001-10-30 Novo Nordisk A/S Pulmonary insulin crystals
EP1627642A3 (en) * 1997-03-20 2006-04-19 Novo Nordisk A/S Zinc free insulin crystals for use in pulmonary compositions
US6043214A (en) * 1997-03-20 2000-03-28 Novo Nordisk A/S Method for producing powder formulation comprising an insulin
US6444641B1 (en) 1997-10-24 2002-09-03 Eli Lilly Company Fatty acid-acylated insulin analogs
ZA989644B (en) * 1997-10-24 2000-04-25 Lilly Co Eli Insoluble insulen compositions.
US6451762B1 (en) 1997-10-24 2002-09-17 Novo Nordisk A/S Aggregates of human insulin derivatives
PE123799A1 (es) * 1997-10-24 1999-12-13 Lilly Co Eli Composiciones insolubles de insulina
ZA989744B (en) * 1997-10-31 2000-04-26 Lilly Co Eli Method for administering acylated insulin.
US6531448B1 (en) * 1997-12-23 2003-03-11 Eli Lilly And Company Insoluble compositions for controlling blood glucose
EP1396272A1 (en) * 1997-12-23 2004-03-10 Eli Lilly &amp; Company Insoluble Insulin Compositions for Controlling Blood Glucose
JP2002500196A (ja) * 1998-01-09 2002-01-08 ノヴォ ノルディスク アクティーゼルスカブ 安定化させたインスリン組成物
AU2712899A (en) * 1998-02-27 1999-09-15 Novo Nordisk A/S Glp-2 derivatives with helix-content exceeding 25 percent, forming partially structured micellar-like aggregates
DE19825447A1 (de) * 1998-06-06 1999-12-09 Hoechst Marion Roussel De Gmbh Neue Insulinanaloga mit erhöhter Zinkbildung
JP2002518408A (ja) * 1998-06-12 2002-06-25 キングス・カレツジ・ロンドン インスリン類似体
US7169889B1 (en) * 1999-06-19 2007-01-30 Biocon Limited Insulin prodrugs hydrolyzable in vivo to yield peglylated insulin
WO2001072323A2 (en) 2000-03-24 2001-10-04 Genentech, Inc. Use of insulin for the treatment of cartilagenous disorders
WO2001085256A2 (en) * 2000-05-05 2001-11-15 Novo Nordisk A/S Critical illness neuropathy
US7316999B2 (en) 2000-06-02 2008-01-08 Novo Nordisk A/S Glucose dependent release of insulin from glucose sensing insulin derivatives
CA2415425A1 (en) * 2000-07-10 2002-01-17 Btg International Limited Insulin derivatives and synthesis thereof
CN1406131A (zh) * 2000-12-25 2003-03-26 株式会社资生堂 活化交感神经的香料组合物
US6867183B2 (en) * 2001-02-15 2005-03-15 Nobex Corporation Pharmaceutical compositions of insulin drug-oligomer conjugates and methods of treating diseases therewith
US7060675B2 (en) * 2001-02-15 2006-06-13 Nobex Corporation Methods of treating diabetes mellitus
US6653492B2 (en) 2001-05-02 2003-11-25 Novo Nordick A/S Preparation of bile acids
EP1698636A1 (en) * 2001-05-02 2006-09-06 Novo Nordisk A/S Preparation of derivatized peptides from bile acids
US6835802B2 (en) * 2001-06-04 2004-12-28 Nobex Corporation Methods of synthesizing substantially monodispersed mixtures of polymers having polyethylene glycol moieties
US7713932B2 (en) * 2001-06-04 2010-05-11 Biocon Limited Calcitonin drug-oligomer conjugates, and uses thereof
US6828305B2 (en) * 2001-06-04 2004-12-07 Nobex Corporation Mixtures of growth hormone drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
US6828297B2 (en) * 2001-06-04 2004-12-07 Nobex Corporation Mixtures of insulin drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
US6713452B2 (en) * 2001-06-04 2004-03-30 Nobex Corporation Mixtures of calcitonin drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
US6858580B2 (en) * 2001-06-04 2005-02-22 Nobex Corporation Mixtures of drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
US7595172B2 (en) 2001-07-24 2009-09-29 Novo Nordisk A/S Method for making acylated polypeptides
MXPA04001560A (es) 2001-08-28 2004-05-17 Lilly Co Eli Premezclas de glp-1 e insulina basal.
US7176278B2 (en) 2001-08-30 2007-02-13 Biorexis Technology, Inc. Modified transferrin fusion proteins
US6913903B2 (en) * 2001-09-07 2005-07-05 Nobex Corporation Methods of synthesizing insulin polypeptide-oligomer conjugates, and proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same
ATE446971T1 (de) 2001-09-07 2009-11-15 Biocon Ltd Verfahren zur synthese von insulinpolypeptid- oligomer-konjugaten und proinsulinpolypeptid- oligomer-konjugaten und verfahren zu deren synthese
US7196059B2 (en) * 2001-09-07 2007-03-27 Biocon Limited Pharmaceutical compositions of insulin drug-oligomer conjugates and methods of treating diseases therewith
US7166571B2 (en) * 2001-09-07 2007-01-23 Biocon Limited Insulin polypeptide-oligomer conjugates, proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same
US7312192B2 (en) * 2001-09-07 2007-12-25 Biocon Limited Insulin polypeptide-oligomer conjugates, proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same
WO2003031432A1 (en) 2001-10-12 2003-04-17 Novo Nordisk A/S Substituted piperidines and their use for the treatment of diseases related to the histamine h3 receptor
CA2463803A1 (en) 2001-10-19 2003-05-01 Eli Lilly And Company Biphasic mixtures of glp-1 and insulin
BR0213583A (pt) 2001-11-19 2004-08-24 Novo Nordisk As Processo para preparar um composto de insulina, e, composto de insulina
GB0206792D0 (en) 2002-03-22 2002-05-01 Leuven K U Res & Dev Normoglycemia
JP5599543B2 (ja) * 2002-05-07 2014-10-01 ノヴォ ノルディスク アー／エス 単量体インスリン及びアシル化インスリンを含む可溶性製剤
US20040038864A1 (en) * 2002-06-27 2004-02-26 Per Balschmidt Use of dimethyl sulfone as isotonicity agent
KR101131783B1 (ko) * 2002-09-25 2012-03-30 노보 노르디스크 에이/에스 아실화된 펩타이드의 제조방법
US7273921B2 (en) 2002-09-25 2007-09-25 Novo Nordisk A/S Method for producing acylated peptides
US7411039B2 (en) 2002-10-14 2008-08-12 Novo Nordisk A/S GLP-2 compounds, formulations, and uses thereof
US20040138099A1 (en) * 2002-11-29 2004-07-15 Draeger Eberhard Kurt Insulin administration regimens for the treatment of subjects with diabetes
WO2004085472A1 (en) * 2003-03-27 2004-10-07 Novo Nordisk A/S Method for making human insulin precursors and human insulin
ATE482747T1 (de) 2003-04-11 2010-10-15 High Point Pharmaceuticals Llc Neue amide derivate und deren pharmazeutische verwendungen
WO2004096266A1 (en) * 2003-05-02 2004-11-11 Novo Nordisk A/S Improved physical stability of insulin formulations
PL1641616T3 (pl) 2003-06-27 2011-09-30 Novo Nordisk As Wysoce wilgocioszczelny pojemnik dla medycznych mieszanin ciekłych
ES2472421T3 (es) 2003-08-05 2014-07-01 Novo Nordisk A/S Nuevos derivados de insulina
EP2264065B1 (en) 2003-08-05 2017-03-08 Novo Nordisk A/S Novel insulin derivatives
EP1687428A1 (en) 2003-11-14 2006-08-09 Novo Nordisk A/S Processes for making acylated insulin
CN102784386A (zh) 2003-11-20 2012-11-21 诺沃挪第克公司 对于生产和用于注射装置中是最佳的含有丙二醇的肽制剂
ATE517119T1 (de) 2003-12-03 2011-08-15 Novo Nordisk As Einzelketteninsulin
CN1898087A (zh) 2003-12-22 2007-01-17 诺沃挪第克公司 用于储存药物液体的透明、柔性、不可渗透的塑料容器
CA2552043A1 (en) 2004-01-21 2005-08-04 Novo Nordisk A/S Transglutaminase mediated conjugation of peptides
AU2005222613B2 (en) * 2004-03-12 2009-12-17 Biodel, Inc. Rapid acting drug delivery compositions
WO2006008238A1 (en) * 2004-07-16 2006-01-26 Novo Nordisk A/S Method for selective acylation
UA103758C2 (ru) 2004-07-19 2013-11-25 Биокон Лимитед Конъюгаты олигомеров инсулина, их композиции и применение
US7833513B2 (en) 2004-12-03 2010-11-16 Rhode Island Hospital Treatment of Alzheimer's Disease
WO2006082205A1 (en) * 2005-02-02 2006-08-10 Novo Nordisk A/S Insulin derivatives
ES2438145T3 (es) 2005-02-02 2014-01-16 Novo Nordisk A/S Nuevos derivados de insulina
US20090060861A1 (en) * 2005-05-25 2009-03-05 Novo Nordisk A/S Stabilized Polypeptide Formulations
CN101180081B (zh) 2005-05-25 2015-08-26 诺沃-诺迪斯克有限公司 稳定的多肽制剂
EP1888104A2 (en) * 2005-05-26 2008-02-20 Novo Nordisk A/S Acylated insulin with high purity
MX2007015675A (es) 2005-07-04 2008-02-20 Novo Nordisk As Antagonistas del receptor de histamina h3.
EP1910317B1 (en) 2005-07-20 2013-07-03 Eli Lilly And Company 1-amino linked compounds
WO2007020256A1 (en) 2005-08-16 2007-02-22 Novo Nordisk A/S Method for making mature insulin polypeptides
US7741281B2 (en) * 2005-11-03 2010-06-22 Bristol-Myers Squibb Company Hepatitis C virus inhibitors
WO2007123581A1 (en) 2005-11-17 2007-11-01 Eli Lilly And Company Glucagon receptor antagonists, preparation and therapeutic uses
PT1969004E (pt) 2005-12-28 2011-11-25 Novo Nordisk As Composições que compreendem uma insulina acilada e zinco e método para criar tais composições
WO2007084460A2 (en) 2006-01-18 2007-07-26 Qps, Llc Pharmaceutical compositions with enhanced stability
ATE557037T1 (de) 2006-02-27 2012-05-15 Novo Nordisk As Insulin derivate
EP1996223A1 (en) * 2006-03-13 2008-12-03 Novo Nordisk A/S Acylated single chain insulin
WO2007104786A1 (en) 2006-03-15 2007-09-20 Novo Nordisk A/S Mixtures of amylin and insulin
NZ570524A (en) 2006-03-28 2011-08-26 High Point Pharmaceuticals Llc Benzothiazoles having histamine H3 receptor activity
ES2378574T3 (es) 2006-04-24 2012-04-16 Eli Lilly & Company Pirrolidinonas ciclohexilo substituidas como inhibidores de 11-beta-hidroxiesteroide deshidrogenasa 1
CN101437849B (zh) * 2006-05-09 2015-09-30 诺沃-诺迪斯克有限公司 胰岛素衍生物
ES2548393T3 (es) 2006-05-09 2015-10-16 Novo Nordisk A/S Derivado de insulina
ES2553154T3 (es) 2006-05-09 2015-12-04 Novo Nordisk A/S Derivado de la insulina
US7714025B2 (en) * 2006-05-10 2010-05-11 Arizona Biomedical Research Commission Modified chalcone compounds as antimitotic agents
CN101460487A (zh) 2006-05-29 2009-06-17 高点制药有限责任公司 3-(1，3-苯并间二氧杂环戊烯- 5-基)-6-(4-环丙基哌嗪-1-基)-哒嗪、其盐和溶剂合物及其作为组胺h3受体拮抗剂的用途
WO2008008363A1 (en) 2006-07-11 2008-01-17 Qps, Llc Pharmaceutical compositions for sustained release delivery of peptides
JP5550338B2 (ja) 2006-07-31 2014-07-16 ノボ・ノルデイスク・エー／エス ペグ化持続型インスリン
CN101541830A (zh) 2006-09-22 2009-09-23 诺沃-诺迪斯克有限公司 蛋白酶抗性的胰岛素类似物
WO2008037735A1 (en) 2006-09-27 2008-04-03 Novo Nordisk A/S Method for making maturated insulin polypeptides
WO2008049711A1 (en) * 2006-10-27 2008-05-02 Novo Nordisk A/S Peptide extended insulins
ES2563038T3 (es) 2007-04-30 2016-03-10 Novo Nordisk A/S Método para secar una composición proteica, una composición proteica seca y una composición farmacéutica que comprende la proteína seca
JP2011504871A (ja) 2007-06-01 2011-02-17 ノボ・ノルデイスク・エー／エス 固体又は半固体担体中にペプチド薬剤を含む自然に分散可能なプレコンセントレイト
JP5675347B2 (ja) 2007-06-01 2015-02-25 ノボ・ノルデイスク・エー／エス 安定した非水性薬学的組成物
ES2744384T3 (es) 2007-06-13 2020-02-24 Novo Nordisk As Formulación farmacéutica que comprende un derivado de insulina
EP2178909B1 (en) 2007-08-13 2015-10-21 Novo Nordisk A/S Rapid acting insulin analogues
BRPI0818004B8 (pt) * 2007-10-16 2021-05-25 Biocon Ltd composição farmacêutica sólida administrável por via oral e o processo da mesma.
EP2058330A1 (en) * 2007-11-08 2009-05-13 Novo Nordisk A/S Insulin derivative
ES2543393T3 (es) 2007-11-08 2015-08-18 Novo Nordisk A/S Derivado de insulina
PL2209800T3 (pl) 2007-11-16 2013-12-31 Novo Nordisk As Stabilne kompozycje farmaceutyczne zawierające liraglutyd i degludec
AU2009204309B2 (en) * 2008-01-04 2012-11-22 Biodel, Inc. Insulin formulations for insulin release as a function of tissue glucose levels
ES2618073T3 (es) 2008-03-14 2017-06-20 Novo Nordisk A/S Análogos de insulina estabilizados frente a proteasas
EP2910571B1 (en) 2008-03-18 2016-10-05 Novo Nordisk A/S Protease stabilized, acylated insulin analogues
TWI451876B (zh) 2008-06-13 2014-09-11 Lilly Co Eli 聚乙二醇化之離脯胰島素化合物
BRPI0823004B8 (pt) 2008-08-07 2021-05-25 Biocon Ltd processo para preparação de compostos de insulina
US9603904B2 (en) 2008-10-30 2017-03-28 Novo Nordisk A/S Treating diabetes melitus using insulin injections with less than daily injection frequency
CN102223797A (zh) 2008-11-21 2011-10-19 高点制药有限责任公司 金刚烷基苯甲酰胺化合物
WO2010088286A1 (en) 2009-01-28 2010-08-05 Smartcells, Inc. Synthetic conjugates and uses thereof
MA33064B1 (fr) * 2009-01-28 2012-02-01 Smartcells Inc Systemes à base de conjugués pour administration contrôlée de médicaments
US9060927B2 (en) * 2009-03-03 2015-06-23 Biodel Inc. Insulin formulations for rapid uptake
WO2010107519A1 (en) 2009-03-20 2010-09-23 Smartcells, Inc. Terminally-functionalized conjugates and uses thereof
EP2437786B1 (en) 2009-06-01 2016-05-18 Yeda Research and Development Co. Ltd. Prodrugs containing albumin binding probe
WO2011064316A2 (en) 2009-11-25 2011-06-03 Paolo Botti Mucosal delivery of peptides
EP2359843A1 (en) 2010-01-21 2011-08-24 Sanofi Pharmaceutical composition for treating a metabolic syndrome
US9981017B2 (en) 2010-04-02 2018-05-29 Hanmi Science Co., Ltd. Insulin conjugate using an immunoglobulin fragment
AR081066A1 (es) 2010-04-02 2012-06-06 Hanmi Holdings Co Ltd Conjugado de insulina donde se usa un fragmento de inmunoglobulina
TW201141513A (en) 2010-04-14 2011-12-01 Sanofi Aventis Insulin-siRNA conjugates
AU2011252127B2 (en) * 2010-05-10 2014-02-20 Novo Nordisk A/S Process for the preparation of insulin-zinc complexes
EP2627670A2 (en) * 2010-10-15 2013-08-21 Novo Nordisk A/S Novel n-terminally modified insulin derivatives
BR112013010345A2 (pt) 2010-10-27 2017-07-25 Novo Nordisk As tratamento de diabetes melitus usando as injeções de insulina administradas com intervalos de variação da injeção
KR102025442B1 (ko) 2010-12-22 2019-09-25 박스알타 인코퍼레이티드 단백질에 수용성 지방산 유도체를 접합하기 위한 물질 및 방법
AU2012208349A1 (en) 2011-01-20 2013-07-18 Zealand Pharma A/S Combination of acylated glucagon analogues with insulin analogues
US10130684B2 (en) 2011-02-03 2018-11-20 Pharmedica Ltd. Oral dissolving films for insulin administration, for treating diabetes
US9480751B2 (en) 2011-04-11 2016-11-01 Yeda Research And Development Co. Ltd. Albumin binding probes and drug conjugates thereof
EP2548570A1 (en) 2011-07-19 2013-01-23 Sanofi Pharmaceutical composition for treating a metabolic syndrome
CN102504022A (zh) * 2011-11-30 2012-06-20 苏州元基生物技术有限公司 含有保护赖氨酸的胰岛素原及使用其制备胰岛素的方法
WO2013086927A1 (zh) * 2011-12-15 2013-06-20 上海恒瑞医药有限公司 人胰岛素类似物及其酰化衍生物
CA2870313A1 (en) 2012-04-11 2013-10-17 Novo Nordisk A/S Insulin formulations
WO2013164375A1 (en) 2012-05-01 2013-11-07 Novo Nordisk A/S Pharmaceutical composition
EP2925345B1 (en) 2012-12-03 2018-09-05 Merck Sharp & Dohme Corp. Method for making o-glycosylated carboxy terminal portion (ctp) peptide-based insulin and insulin analogues
EP2991672A1 (en) 2013-04-30 2016-03-09 Novo Nordisk A/S Novel administration regime
ES2927607T3 (es) 2013-09-13 2022-11-08 Scripps Research Inst Agentes terapéuticos modificados y composiciones de los mismos
WO2015052088A1 (en) * 2013-10-07 2015-04-16 Novo Nordisk A/S Novel derivative of an insulin analogue
EP4212180A1 (en) 2013-12-18 2023-07-19 The Scripps Research Institute Modified therapeutic agents, stapled peptide lipid conjugates, and compositions thereof
AR099569A1 (es) 2014-02-28 2016-08-03 Novo Nordisk As Derivados de insulina y los usos médicos de estos
WO2015196174A1 (en) 2014-06-20 2015-12-23 Greene Howard E Infusion delivery devices and methods
CN107921098A (zh) 2015-06-17 2018-04-17 加州生物医学研究所 修饰的治疗剂及其组合物
JP2018531900A (ja) 2015-08-25 2018-11-01 ノヴォ ノルディスク アー／エス 新規インスリン誘導体及びその医学的使用
EP3495384A4 (en) * 2016-08-02 2020-02-26 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. ACYLATED DERIVATIVE OF HUMAN INSULIN OR ANALOGUE OF IT
EP3329930A1 (en) 2016-12-05 2018-06-06 Nuritas Limited Pharmaceuctical compositions
ES2932498T3 (es) 2016-12-05 2023-01-20 Nuritas Ltd Composiciones que comprenden el péptido WKDEAGKPLVK
MX2019006463A (es) 2016-12-16 2019-08-14 Novo Nordisk As Composiciones farmaceuticas que contienen insulina.
KR102665710B1 (ko) 2017-08-24 2024-05-14 노보 노르디스크 에이/에스 Glp-1 조성물 및 그 용도
KR20190038456A (ko) * 2017-09-29 2019-04-08 한미약품 주식회사 효력이 향상된 지속성 단백질 결합체
WO2019125879A2 (en) 2017-12-18 2019-06-27 Merck Sharp & Dohme Corp. Conjugate based systems for controlled insulin delivery
EP3727424A4 (en) 2017-12-18 2021-10-27 Merck Sharp & Dohme Corp. CONJUGATE-BASED SYSTEMS FOR CONTROLLED INSULIN RELEASE
EP3750998A4 (en) 2018-02-09 2022-02-23 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. CODON-OPTIMIZED PRECURSOR GENE AND SIGNAL PEPTID GENE OF HUMAN INSULIN ANALOGUE
EP3805257A4 (en) 2018-05-24 2022-03-16 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. METHOD OF PRODUCTION OF A PRECURSOR OF RECOMBINANT HUMAN INSULIN OR ANALOGUE THEREOF
US10335464B1 (en) 2018-06-26 2019-07-02 Novo Nordisk A/S Device for titrating basal insulin
KR102666154B1 (ko) 2018-08-08 2024-05-20 주식회사 대웅제약 지속형 인슐린 아날로그 및 그 복합체
CA3122637A1 (en) 2018-12-11 2020-06-18 Sanofi Peptide binder
KR20200080748A (ko) 2018-12-27 2020-07-07 주식회사 폴루스 음이온 교환 크로마토그래피를 이용한 인슐린 전구체의 정제방법
KR20200080747A (ko) 2018-12-27 2020-07-07 주식회사 폴루스 인슐린 전구체의 인슐린 효소 전환용 조성물 및 이를 이용하여 인슐린 전구체를 인슐린으로 전환하는 방법
CN111909255A (zh) * 2019-05-10 2020-11-10 宁波鲲鹏生物科技有限公司 胰岛素衍生物及其制备方法
TWI844709B (zh) 2019-07-31 2024-06-11 美商美國禮來大藥廠 鬆弛素(relaxin)類似物及其使用方法
BR112022009510A2 (pt) 2019-12-11 2022-08-16 Novo Nordisk As Análogo de insulina, composição farmacêutica, e, método de tratamento, prevenção ou alívio de uma doença ou distúrbio ou condição
JP2023510218A (ja) 2019-12-30 2023-03-13 ガン アンド リー ファーマスゥーティカルズ カンパニー リミテッド 長時間作用型ｇｌｐ－１化合物
CN118420744A (zh) 2019-12-30 2024-08-02 甘李药业股份有限公司 胰岛素衍生物
US20230082544A1 (en) 2020-02-18 2023-03-16 Novo Nordisk A/S Pharmaceutical formulations
AU2021247169A1 (en) 2020-03-31 2022-10-20 Protomer Technologies Inc. Conjugates for selective responsiveness to vicinal diols
CA3198757A1 (en) 2020-11-19 2022-05-27 Protomer Technologies Inc. Aromatic boron-containing compounds and insulin analogs
EP4299057A1 (en) 2022-06-30 2024-01-03 Adocia Solid compositions comprising a peptide or a protein and an acylated amino acid
EP4180060A1 (en) 2021-11-15 2023-05-17 Adocia Solid compositions comprising a peptide or a protein and an acylated amino acid
WO2023084118A1 (en) 2021-11-15 2023-05-19 Adocia Solid compositions comprising a peptide or a protein and an acylated amino acid
CN118574842A (zh) 2022-01-28 2024-08-30 甘李药业股份有限公司 酰化胰岛素
EP4299071A1 (en) 2022-07-01 2024-01-03 Adocia Compositions comprising a peptide or a protein and an acylated amino acid
WO2024051787A1 (zh) * 2022-09-09 2024-03-14 北京惠之衡生物科技有限公司 一种长效酰化胰岛素衍生物及其应用

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3823125A (en) * 1969-10-14 1974-07-09 American Home Prod N-aminoacyl-substituted insulins
US3950517A (en) * 1970-05-08 1976-04-13 National Research Development Corporation Insulin derivatives
GB1381273A (en) * 1971-01-28 1975-01-22 Nat Res Dev Insulin derivatives
GB1381274A (en) * 1971-01-28 1975-01-22 Nat Res Dev Insulin derivatives
US3907763A (en) * 1972-03-01 1975-09-23 Bayer Ag Insulin derivatives crosslinked by a dicarboxylic acid moiety
DK319780A (da) * 1980-07-24 1982-01-25 Forenede Bryggerier As Fremgangsmaade til enzymatisk udskiftning af b-30 aminosyren i insuliner
IL68769A (en) * 1983-05-23 1986-02-28 Hadassah Med Org Pharmaceutical compositions containing insulin for oral administration
US5008241A (en) * 1985-03-12 1991-04-16 Novo Nordisk A/S Novel insulin peptides
JPH01254699A (ja) * 1988-04-05 1989-10-11 Kodama Kk インスリン誘導体及びその用途
AU8091091A (en) * 1990-07-26 1992-02-18 University Of Iowa Research Foundation, The Novel drug delivery systems for proteins and peptides using albumin as a carrier molecule
US5336782A (en) * 1991-04-24 1994-08-09 Kuraray Co., Ltd. Long chain carboxylic acid imide ester

Also Published As

Publication number Publication date
EP0792290A1 (en) 1997-09-03
EP0792290B1 (en) 2001-08-29
DE122004000035I2 (de) 2009-08-06
EP1132404A3 (en) 2002-03-27
NL300160I2 (nl) 2005-07-01
NO2017041I1 (no) 2017-08-01
IL110977A (en) 2000-06-29
WO1995007931A1 (en) 1995-03-23
SK282495B6 (sk) 2002-02-05
CN1056618C (zh) 2000-09-20
CZ287945B6 (cs) 2001-03-14
CZ78996A3 (en) 1996-10-16
AU7652094A (en) 1995-04-03
JPH09502867A (ja) 1997-03-25
NO961070D0 (no) 1996-03-15
EP1132404A2 (en) 2001-09-12
RU2164520C2 (ru) 2001-03-27
BG61611B1 (bg) 1998-01-30
DK0792290T3 (da) 2001-10-01
SI0792290T1 (en) 2001-12-31
FI961220A0 (fi) 1996-03-15
NO2004006I1 (no) 2004-10-11
JP2002308899A (ja) 2002-10-23
CN1133598A (zh) 1996-10-16
KR960704925A (ko) 1996-10-09
HU217684B (hu) 2000-03-28
NZ273285A (en) 1997-10-24
JP2000060556A (ja) 2000-02-29
JP3917333B2 (ja) 2007-05-23
AU4846197A (en) 1998-02-19
CA2171424C (en) 2002-06-04
DE69428134D1 (de) 2001-10-04
PT792290E (pt) 2002-01-30
AU682061B2 (en) 1997-09-18
KR100310122B1 (ko) 2002-04-24
NO2004006I2 (fi) 2008-02-04
DE69428134T2 (de) 2002-05-02
BG100420A (bg) 1996-12-31
JP3014764B2 (ja) 2000-02-28
ES2163451T3 (es) 2002-02-01
RO112873B1 (ro) 1998-01-30
HU9600676D0 (en) 1996-05-28
JP4060583B2 (ja) 2008-03-12
DE122004000035I1 (de) 2005-02-24
NO2017041I2 (no) 2018-11-19
HUT75991A (en) 1997-05-28
FR04C0020I2 (fr) 2005-05-27
CA2171424A1 (en) 1995-03-23
SK32496A3 (en) 1996-11-06
ATE204882T1 (de) 2001-09-15
LU91101I2 (en) 2004-11-08
PL313444A1 (en) 1996-07-08
US5750497A (en) 1998-05-12
BR9407508A (pt) 1997-01-07
IL110977A0 (en) 1994-11-28
UA45321C2 (uk) 2002-04-15
NL300160I1 (nl) 2004-12-01
FI961220A (fi) 1996-05-14
NO316944B1 (no) 2004-07-05
NO961070L (no) 1996-05-15
PL178466B1 (pl) 2000-05-31
FR04C0020I1 (fi) 2004-10-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI117055B (fi) Menetelmä asyloidun insuliinin valmistamiseksi
US6869930B1 (en) Acylated insulin
US6011007A (en) Acylated insulin
US6251856B1 (en) Insulin derivatives
JP3872105B2 (ja) インスリン誘導体
AU745983B2 (en) Acylated insulin
MXPA97007056A (en) Insulated derivatives

Legal Events

Date Code Title Description
FG Patent granted

Ref document number: 117055

Country of ref document: FI

SPCF Supplementary protection certificate application filed

Spc suppl protection certif: L20060006

SPCG Supplementary protection certificate granted

Spc suppl protection certif: 273

Extension date: 20181110

MA Patent expired
SPCE Application for extension of a supplementary protection certificate [pediatric extension]

Spc suppl protection certif: L20060006

SPCP Extension of a supplementary protection certificate [pediatric extension]

Spc suppl protection certif: 273

Extension date: 20190510