KR102025442B1

KR102025442B1 - 단백질에 수용성 지방산 유도체를 접합하기 위한 물질 및 방법

Info

Publication number: KR102025442B1
Application number: KR1020137019066A
Authority: KR
Inventors: 위르겐 지크만; 리하르드 샤이넥커; 한스페터 로텐스타이너; 페터 투레첵
Original assignee: 박스알타 인코퍼레이티드; 박스앨타 게엠베하
Priority date: 2010-12-22
Filing date: 2011-12-16
Publication date: 2019-09-25
Also published as: EP3673921A1; EP2654794A1; US8945897B2; TW201305090A; BR112013015898A2; AU2011349574B2; PT2654794T; EA201390940A1; AU2011349574A1; ES2800983T3; CA2822591C; EP2654794B8; AU2011349574B9; CN103269723A; MX345608B; JP2014501262A; KR20130129254A; AR084576A1; MX2013007369A; PL2654794T3

Abstract

본 발명은 치료학적 단백질에 수용성 지방산 유도체를 접합하는 물질 및 방법에 관한 것이며, 이는 접합을 허용하는 조건 하에 활성화 수용성 지방산 유도체와 치료학적 단백질을 접촉시키는 단계를 포함한다.

Description

단백질에 수용성 지방산 유도체를 접합하기 위한 물질 및 방법{MATERIALS AND METHODS FOR CONJUGATING A WATER SOLUBLE FATTY ACID DERIVATIVE TO A PROTEIN}

본 발명의 분야

본 발명은 단백질에 수용성 지방산 유도체를 접합하기(conjugating) 위한 물질 및 방법에 관한 것이다.

본 발명의 배경

환자에게 투여 후 접합된 치료학적 단백질의 반감기를 증가시키기 위하여 치료학적 단백질에 접합하는 것에 대하여 다양한 분자 및/또는 화합물이 설명되었다 (Veronese FM and Mero A, BioDrugs 2008;22:315-29; Gregoriadis G et al., Int J Pharm 2005; 300:125-30; 및 Shechter Y et al.; International Journal of Peptide Research and Therapeutics 2007; Vol 13 :105-17).

지방산 (FA)은 치료학적 단백질에 접합되어 더 긴-활성 유도체를 형성할 수 있다. 단백질 또는 펩티드 반감기의 연장을 위한 이러한 원리는 FA가 인간 혈청 알부민 (HSA; 알부민 결합 프로브라고도 또한 불림)에 결합할 수 있다는 사실에 기반한다. 치료학적 단백질이 신생아 Fc 수용체를 통하여 알부민과 함께 재순환할 것이기 때문에 혈류내 인간 혈청 알부민과의 FA의 연관성은 치료학적 단백질 반감기의 실질적인 연장을 야기할 수 있다. FA 및 이의 유도체 (가령, 상응하는 메틸 에스테르)는 유사한 알부민-결합 특성을 보였다 (Spector AA, J Lipid Res 1975;16:165-79).

이러한 더 긴-활성 원리에 대한 한 가지 현저한 예시는 Novo Nordisk로부터의 인슐린 디터머(insulin detemir) (Levemir®)이다. 인슐린 디터머에서, FA의 카르복실기는 인슐린 단백질의 리신 잔기의 ε-아미노기에 공유결합으로 커플링된다 (가령, US 5,866,538; US 6,011,007; 및 US 6,869,930을 참고). 다른 연구 그룹이 유사한 기법을 설명했다 (Shechter Y et al., Bioconj Chem 2005;16:913-20; 및 Sasson K et al., J Control Release 2010;142:214-20). 예를 들어, 이들 그룹은 단백질의 아미노기에 커플링시키기 위한 활성 NHS 에스테르를 함유한 방출가능한 FMOC 시스템을 설명한다. 하지만, 차이점은 이러한 개념에서 FA는 ω-위치내 작용기(functional group)를 통하여 단백질에 연결되고 그렇게 됨으로써 온전한 카르복실기는 만든다는 점이다. 따라서, 연장된-활성 프로드러그(prodrug)는 인간 혈청 알부민에 결합하지만 생리학적 조건 하에 FMOC 시스템이 느린 가수분해를 겪는 동안 시간이 지남에 따라 분리되는 것으로 제조될 수 있다 (Sasson K et al., J Control Release 2010;142:214-20).

지방산뿐만 아니라, 수용성 폴리머(polymer) 및 치료학적 단백질 사이의 공유결합 형성에 의한 접합체(conjugate)의 제조가 다양한 화학적 방법에 의해 수행될 수 있다. 폴리펩티드 약물의 페길화(PEGylation)는 순환에서 폴리펩티드 약물을 보호하고 그들의 약역학적 및 약동학적 프로파일을 향상시킨다 (Harris and Chess, Nat Rev Drug Discov. 2003;2:214-21). 페길화 과정은 에틸렌 글리콜 (폴리에틸렌 글리콜 (PEG))의 반복하는 유닛을 폴리펩티드 약물에 부착한다. PEG 분자는 큰 유체역학적 부피 (구형 단백질 크기의 5-10배)를 가지고, 매우 수용성이고 수화되고, 비-독성, 비-면역성이며 그리고 신체로부터 빠르게 제거된다. 분자의 페길화는 효소적 분해에 대한 약물의 증가된 내성, 생체내 증가된 반감기, 감소된 투약 빈도, 감소된 면역원성, 증가된 물리적 및 열 안정성, 증가된 용해도, 증가된 액체 안정성 및 감소된 집합성을 야기할 수 있다. 첫번째 페길화 약물은 1990년대 초반에 FDA에 의해 승인되었다. 그 이후로, FDA는 경구, 주사가능한 및 국부적 투여를 위한 여러 가지 페길화 약물을 승인하였다.

콜로민산 (CA)이라고도 불리는, 폴리시알산 (PSA)은 자연적으로 발생한 다당류이다. 이는 α(2→8) 케토시딕 결합(ketosidic linkage)을 가진 N-아세틸뉴라민산의 동종폴리머이고 이의 비-환원 말단에서 인접한 디올기를 함유한다. 이는 음전하이고 인체의 자연 성분이다. 이는 박테리아로부터 많은 양으로 그리고 사전-결정된 물리적 특성을 가지고 쉽게 생성될 수 있다 (미국 특허 번호 제5,846,951호). 박테리아에 의해-생성된 PSA는 신체에서 생성된 PSA와 화학적으로 그리고 면역학적으로 동일하기 때문에, 박테리아성 PSA는 심지어 단백질에 커플링될 때에도, 비-면역성이다. 일부 폴리머와는 다르게, PSA 산은 생분해성이다. 카탈라아제 및 아스파라기나아제에 콜로민산의 공유결합은 단백질 분해효소 또는 혈장의 존재에서 효소의 안정성을 증가시키는 것으로 나타났다. 폴리시알릴화된 그리고 비변형된 아스파라기나아제를 이용한 생체내 비교연구는 폴리시알릴화가 효소의 반감기를 증가시켰다는 것으로 밝혀졌다 (Fernandes and Gregoriadis, Int J Pharm. 2001;217:215-24).

펩티드 또는 단백질에 PEG-유도체의 커플링은 Roberts et al. (Adv Drug Deliv Rev 2002;54:459-76)에 의해 검토된다. 치료학적 단백질에 수용성 폴리머를 커플링시키기 위한 한 가지 기법은 단백질의 탄수화물 모이어티(moiety)를 통한 폴리머의 접합이다. 단백질내 탄수화물의 인접한 하이드록실 (OH)기는 나트륨 퍼아이오데이트 (NaIO4)로 쉽게 산화되어 활성 알데하이드기를 형성할 수 있다 (Rothfus and Smith, J Biol Chem 1963; 238:1402-10; van Lenten and Ashwell, J Biol Chem 1971;246:1889-94). 차후에 폴리머는 예를 들어, 활성 하이드라지드기를 함유한 시약의 사용에 의해 탄수화물의 알데하이드기에 결합할 수 있다 (Wilchek M and Bayer EA, Methods Enzymol 1987;138:429-42). 더욱 최근의 기술은 알데하이드와 반응하여 옥심 결합을 형성하는 아미노옥시기를 함유한 시약의 사용이다 (WO 96/40662, WO2008/025856).

치료학적 단백질에 수용성 폴리머의 접합을 설명하는 추가적인 예시는 폰 빌레브란트 인자내 탄수화물 모이어티의 산화 및 하이드라지드 화학을 이용하여 PEG에 차후 커플링을 교시하는 WO 06/071801; rFVIII의 산화 및 하이드라지드 화학을 이용하여 PEG 및 기타 수용성 폴리머 (가령, PSA, HES, 덱스트란)에 차후 커플링을 교시하는 미국 공개공보 번호 제2009/0076237호; 상이한 응고 인자, 가령, rFIX, FVIII 및 FVIIa의 산화 및 옥심 결합을 형성함으로써 아미노옥시를 이용하여, 가령, PEG에 차후 커플링을 교시하는 WO 2008/025856; 및 FIX의 산화 및 하이드라지드 화학을 이용하여 PEG에 차후 커플링을 교시하는 미국 특허 번호 제5,621,039호에서 설명된다.

단백질 접합을 위한 상기 물질 및 방법에도 불구하고, 예를 들어, 안정한 단백질 접합체의 조작 및 제조를 허용하는 새로운 물질 및 방법이 요구된다. 지방산이 HAS를 결합하는 혜택을 제공할 수 있지만, 지방산은 종종 수성 환경에서 조작하기가 어렵고 시간이 지남에 따라 이의 단백질 결합 파트너로부터 방출되거나 제거될 수 있다.

본 발명의 개요

본 발명은 단백질에 폴리머 및 수용성 지방산 유도체를 접합하기 위한 물질 및 방법을 제공하며, 이는 다양한 시약과 연관된 비용 및 접합 반응이 친핵성 촉매에 의해 촉매될 때 환자 수혜자에 대한 건강 위험요소를 최소화하는 반면, 단백질의 약역학적 및/또는 약동학적 특성을 향상시킨다. 본 발명은 수성 용액에서 단백질에 수용성 지방산 유도체를 접합하기 위한 물질 및 방법을 제공하고, 그렇게 함으로써 안정한 단백질 접합체를 생성하며, 여기서 지방산 유도체는 시간이 지남에 따라 방출되지 않는다.

본 발명의 한 가지 구체예에서, 수용성 지방산 유도체는 수용성 연결자(linker)에 부착된 지방산 또는 지방산 에스테르를 포함하여 제공되고, 상기 지방산 유도체는 치료학적 단백질에 안정하게 부착된다. 또 다른 구체예에서, 지방산 유도체는 시험관내 또는 생체 내에서 인간 혈청 알부민 (HSA)과 결합한다. 또 다른 구체예에서, 지방산 유도체 - 치료학적 단백질 접합체는 자연형(native) 치료학적 단백질에 비해 증가된 반감기를 갖는다. 또 다른 구체예에서, 전술한 지방산 유도체는 포화된 지방산 또는 불포화된 지방산을 포함한다. 관련된 구체예에서, 지방산은 포화된 지방산이다. 또 다른 구체예에서, 지방산은 분지형 사슬 지방산이다.

지방산 유도체에서 다양한 길이의 지방산이 고려된다. 한 가지 구체예에서 전술한 지방산 유도체가 제공되며 여기서 지방산은 홀수의 탄소수를 가진 합성 지방산을 포함하여, C10 내지 C24의 사슬 길이를 포함한다. 한 가지 구체예에서, 전술한 지방산 유도체가 제공되며 여기서 지방산은 C10, C12, C14, C16, C18, C20, C20, C22 및 C24로 구성된 군에서 선택되는 사슬 길이를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 지방산은 C14, C16 및 C18로 구성된 군에서 선택되는 사슬 길이를 갖는다. 또 다른 구체예에서, 지방산은 C13, C15 및 C17로 구성된 군에서 선택되는 사슬 길이를 갖는다.

또 다른 구체예에서, 전술한 지방산 유도체가 제공되며 여기서 지방산은 말단 카르복실기 및 ω기로 구성된 군에서 선택되는 지방산의 기에서 수용성 연결자에 부착된다. 또 다른 구체예에서, 지방산은 ω기에서 수용성 연결자에 부착된다. 또 다른 구체예에서, ω기는 하이드록실, 아미노, 티오, 및 카르복실로 구성된 군에서 선택된다.

본 발명의 한 가지 구체예에서, 전술한 지방산 유도체가 제공되며 여기서 지방산은 16-하이드록시헥사데칸산이다.

다른 구체예에서, 지방산 유도체가 제공되며 여기서 지방산 에스테르는 메틸 에스테르 및 에틸 에스테르로 구성된 군에서 선택된다. 또 다른 구체예에서, 지방산 에스테르는 16-하이드록시헥사데칸산 메틸 에스테르이다.

다양한 수용성 연결자가 본 발명에서 고려된다. 한 가지 구체예에서, 전술한 지방산 유도체가 제공되며 여기서 수용성 연결자는 치료학적 단백질에 부착되는 수용성 폴리머 및 적어도 하나의 작용기를 포함한다. 한 가지 구체예에서, 치료학적 단백질에 부착되는 작용기는 음성 또는 양성 전하를 주는 능력을 가지며, 그렇게 함으로써 연결자 수용성을 만든다. 또 다른 구체예에서, 작용기는 설포기, 카르복실기, 하이드록실기, 아미노기, 아미도기, 말레이미도기, 아미노옥시기 및 하이드라지드기로 구성된 군에서 선택된다. 한 가지 구체예에서, 작용기는 아미노옥시기이다.

수많은 수용성 폴리머가 본 발명에서 고려된다. 한 가지 구체예에서, 전술한 지방산 유도체가 제공되며 여기서 연결자의 일체화된 부분(integral part)인 수용성 폴리머는 하기 군에서 선택된다: 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 분지형 PEG, 폴리시알산 (PSA), 하이드록시알킬 전분 (HAS), 하이드록시에틸 전분 (HES), 탄수화물, 다당류, 플루란, 키토산, 히알루론산, 콘드로이틴 설페이트, 데르마탄 설페이트, 전분, 덱스트란, 카르복시메틸-덱스트란, 폴리알킬렌 옥사이드 (PAO), 폴리알킬렌 글리콜 (PAG), 폴리프로필렌 글리콜 (PPG), 폴리옥사졸린, 폴리아크릴로일모르폴린, 폴리비닐 알코올 (PVA), 폴리카르복실레이트, 폴리비닐피롤리돈, 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린, 폴리에틸렌-코-말레산 무수물, 폴리스티렌-코-말레산 무수물, 폴리(1-하이드록실메틸에킬렌 하이드록시메틸포르말) (PHF), 및 2-메타아크릴로일옥시-2'-에틸트리메틸암모늄포스페이트 (MPC). 또 다른 구체예에서, 수용성 폴리머는 PEG이다. 다양한 길이의 수용성 폴리머가 또한 본 명세서에서 고려된다. 한 가지 구체예에서, 지방산 유도체가 제공되며 여기서 수용성 폴리머는 O3, O5, O7, O9, O11, O13 및 O15로 구성된 군에서 선택되는 사슬 길이를 포함한다.

한 가지 구체예에서, 지방산 유도체가 제공되며 여기서 수용성 연결자는 하기로 구성된 군에서 선택된다:

3-옥사펜탄-1,5-디옥시아민

;

3,6,9-트리아옥사운데칸-1,11-디옥시아민

;

3,6,9,12,15-펜타옥사헵타데칸-1,17-디옥시아민;

; 및

3,6,9,12,15,18,21-헵타옥사트리코산-1,23-디옥시아민

.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 지방산 유도체가 제공되며 여기서 지방산 유도체는 옥심 결합에 의해 치료학적 단백질에 안정하게 부착된다. 또 다른 구체예에서, 옥심 결합은 수용성 연결자 상의 옥심기 및 치료학적 단백질 상의 산화된 탄수화물의 알데하이드기 사이에서 형성된다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 지방산 유도체가 제공되며 여기서 지방산 유도체는 수용성 연결자 상의 말레이미드기에 의해 치료학적 단백질 상의　유리 설프하이드릴기에 부착되어 상기 치료학적 단백질에 안정하게 부착된다. 또 다른 구체예에서, 지방산 유도체는 수용성 연결자 상의 N-하이드록시석신이미드 에스테르에 의해 치료학적 단백질 상의 유리 아미노기에 부착되어 상기 치료학적 단백질에 안정하게 부착된다.

본 발명의 한 가지 구체예에서, 지방산 유도체가 제공되며 여기서 지방산 유도체는 하기로 구성된 군에서 선택된다:

a) 하기 화학식의 16-(2-(2-(2-(2-아미노옥시에톡시)-에톡시)-에톡시)-에톡시이미노)-헥사데칸산 나트륨 염:

; 및

b) 16-(2-(2-(2-(2-아미노옥시에톡시)-에톡시)-에톡시)-에톡시아미노)-헥사데칸산 메틸 에스테르,

.

다양한 치료학적 단백질이 본 발명에서 고려된다. 한 가지 구체예에서, 전술한 지방산 유도체가 제공되며 여기서 치료학적 단백질은 하기로 구성된 군에서 선택된다: 인자 IX (FIX), 인자 VIII (FVIII), 인자 VIIa (FVIIa), 폰 빌레브란트 인자 (VWF), 인자 FV (FV), 인자 X (FX), 인자 XI (FXI), 인자 XII (FXII), 트롬빈 (FII), 단백질 C, 단백질 S, tPA, PAI-1, 조직 인자 (TF), ADAMTS 13 프로테아제, IL-1 알파, IL-1 베타, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-11, 집락 자극 인자-1 (CSF-1), M-CSF, SCF, GM-CSF, 과립구 집락 자극 인자 (G-CSF), EPO, 인터페론-알파 (IFN-알파), 컨센서스 인터페론(consensus interferon), IFN-베타, IFN-감마, IFN-오메가, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-31, IL-32 알파, IL-33, 트롬보포이에틴 (TPO), Ang-1, Ang-2, Ang-4, Ang-Y, 안지오포이에틴-유사 폴리펩티드 1 (ANGPTL1), 안지오포이에틴-유사 폴리펩티드 2 (ANGPTL2), 안지오포이에틴-유사 폴리펩티드 3 (ANGPTL3), 안지오포이에틴-유사 폴리펩티드 4 (ANGPTL4), 안지오포이에틴-유사 폴리펩티드 5 (ANGPTL5), 안지오포이에틴-유사 폴리펩티드 6 (ANGPTL6), 안지오포이에틴-유사 폴리펩티드 7 (ANGPTL7), 비트로넥틴, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 안지오제닌, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 골 형성 단백질-1, 골 형성 단백질-2, 골 형성 단백질-3, 골 형성 단백질-4, 골 형성 단백질-5, 골 형성 단백질-6, 골 형성 단백질-7, 골 형성 단백질-8, 골 형성 단백질-9, 골 형성 단백질-10, 골 형성 단백질-11, 골 형성 단백질-12, 골 형성 단백질-13, 골 형성 단백질-14, 골 형성 단백질-15, 골 형성 단백질 수용체 IA, 골 형성 단백질 수용체 IB, 골 형성 단백질 수용체 II, 뇌 유래 신경영양 인자, 카디오트로핀-1, 섬모 신경영양 인자, 섬모 신경영양 인자 수용체, 크립토, 크립틱, 사이토카인-유도 중성구 주화성 인자 1, 사이토카인-유도 중성구, 주화성 인자 2α, 사이토카인-유도 중성구 주화성 인자 2β, β 내피세포 성장 인자, 엔도텔린 1, 상피 성장 인자, 에피겐, 에피레귤린, 상피-유래 중성구 유인물질, 섬유아세포 성장 인자 4, 섬유아세포 성장 인자 5, 섬유아세포 성장 인자 6, 섬유아세포 성장 인자 7, 섬유아세포 성장 인자 8, 섬유아세포 성장 인자 8b, 섬유아세포 성장 인자 8c, 섬유아세포 성장 인자 9, 섬유아세포 성장 인자 10, 섬유아세포 성장 인자 11, 섬유아세포 성장 인자 12, 섬유아세포 성장 인자 13, 섬유아세포 성장 인자 16, 섬유아세포 성장 인자 17, 섬유아세포 성장 인자 19, 섬유아세포 성장 인자 20, 섬유아세포 성장 인자 21, 산성 섬유아세포 성장 인자, 염기성 섬유아세포 성장 인자, 신경교 세포주-유래 신경영양 인자 수용체 α1, 신경교 세포주-유래 신경영양 인자 수용체 α2, 성장 관련 단백질, 성장 관련 단백질 α, 성장 관련 단백질 β, 성장 관련 단백질 γ, 헤파린 결합 상피 성장 인자, 간세포 성장 인자, 간세포 성장 인자 수용체, 간암-유래 성장 인자, 인슐린-유사 성장 인자 I, 인슐린-유사 성장 인자 수용체, 인슐린-유사 성장 인자 II, 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질, 케라틴세포 성장 인자, 백혈병 저해 인자, 백혈병 저해 인자 수용체 α, 신경 성장 인자 신경 성장 인자 수용체, 뉴로포이에틴,뉴트로핀-3, 뉴트로핀-4, 온코스타틴 M (OSM), 태반 성장 인자, 태반 성장 인자 2, 혈소판-유래 내피세포 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자 A 사슬, 혈소판 유래 성장 인자 AA, 혈소판 유래 성장 인자 AB, 혈소판 유래 성장 인자 B 사슬, 혈소판 유래 성장 인자 BB, 혈소판 유래 성장 인자 수용체 α, 혈소판 유래 성장 인자 수용체 β, 전(pre)-B 세포 성장 자극 인자, 줄기세포 인자 (SCF), 줄기세포 인자 수용체, TNF, TNF0, TNF1, TNF2, 형질전환 성장 인자 α, 형질전환 성장 인자 β, 형질전환 성장 인자 β1, 형질전환 성장 인자 β1.2, 형질전환 성장 인자 β2, 형질전환 성장 인자 β3, 형질전환 성장 인자 β5, 잠재적 형질전환 성장 인자 β1, 형질전환 성장 인자 β 결합 단백질 I, 형질전환 성장 인자 β 결합 단백질 II, 형질전환 성장 인자 β 결합 단백질 III, 흉선 기질 림포포이에틴 (TSLP), 종양 괴사 인자 수용체 유형 I, 종양 괴사 인자 수용체 유형 II, 우로키나아제-유형 플라스미노겐 활성자 수용체, 포스포리파아제-활성화 단백질 (PUP), 인슐린, 렉틴 리신, 프로락틴, 융모성 성선자극호르몬, 여포-자극 호르몬, 갑상선 자극 호르몬, 조직 플라스미노겐 활성자, IgG, IgE, IgM, IgA, 및 IgD, α-갈락토시다아제, β-갈락토시다아제, DNAse, 페투인, 황체형성 호르몬, 에스트로겐, 인슐린, 알부민, 리포단백질, 태아단백질, 트랜스페린, 트롬보포이에틴, 우로키나아제, 인테그린, 트롬빈, 렙틴, 휴미라(Humira) (안달리무맙), 프롤리아(Prolia) (데노수맙), 엔브렐(Enbrel) (에타너셉트), 표 1에서의 단백질, 또는 생물학적 활성 단편, 유도체 또는 이의 변이체. 또 다른 구체예에서, 치료학적 단백질은 FVIIa이다. 또 다른 구체예에서, 치료학적 단백질은 FVIII이다. 또 다른 구체예에서, 치료학적 단백질은 FIX이다.

지방산 유도체를 제조하는 방법이 또한 본 명세서에서 고려된다. 구체예에서, 본 명세서에서 설명된 지방산 유도체를 제조하는 방법이 제공되며, 이는 하기 단계를 포함한다: a) 지방산 상의 ω-하이드록시기를 산화하여 지방산 상에 알데하이드기를 발생시키는 단계; 및 b) 활성 아미노옥시기를 포함한 수용성 연결자를 알데하이드기에 커플링시켜 안정한 옥심 결합을 형성하는 단계, 여기서 지방산 유도체는 수용성임. 한 가지 구체예에서, 전술한 방법이 제공되며 여기서 ω-하이드록시기는 하기로 구성된 군에서 선택되는 산화 시약에 의해 산화된다: 데스 마틴 퍼아이오디난 시약(Dess Martin periodinane reagent), 템포 시약(Tempo reagent), 옥살릴 클로라이드/DMSO, 테트라프로필암모늄퍼루테네이트 (TPAP)를 이용한 스원(Swern) 산화, 크롬 VI 시약, 가령 콜린스 시약(Collins reagent), 피리디니움 클로로 크로메이트(PCC), 및 피리디니움 디크로메이트. 또 다른 구체예에서, 산화 시약은 데스 마틴 퍼아이오디난이다.

또 다른 구체예에서, 전술한 방법이 제공되며 여기서 지방산은 포화된 지방산 또는 불포화된 지방산이다. 또 다른 구체예에서, 지방산은 포화된 지방산이다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 전술한 방법이 제공되며 여기서 지방산은 분지형 사슬 지방산이다.

또 다른 구체예에 따라서, 전술한 방법이 또한 제공되며 여기서 지방산은 홀수의 탄소수를 가진 합성 지방산을 포함하여, C10 내지 C24의 사슬 길이를 포함한다. 한 가지 구체예에서, 전술한 지방산 유도체가 제공되며 여기서 지방산은 C10, C12, C14, C16, C18, C20, C20, C22 및 C24로 구성된 군에서 선택되는 사슬 길이를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 지방산은 C14, C16 및 C18로 구성된 군에서 선택되는 사슬 길이를 갖는다. 또 다른 구체예에서, 지방산은 C13, C15 및 C17로 구성된 군에서 선택되는 사슬 길이를 갖는다.

또 다른 구체예에서, 전술한 방법이 제공되며 여기서 수용성 연결자는 수용성 폴리머 및 적어도 하나의 아미노옥시기를 포함한다.

수많은 수용성 폴리머가 전술한 방법에서 사용하기 위해 본 발명에서 고려된다. 한 가지 구체예에서, 전술한 방법이 제공되며 여기서 수용성 폴리머는 하기로 구성된 군에서 선택된다: 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 분지형 PEG, 폴리시알산 (PSA), 하이드록시알킬 전분 (HAS), 하이드록시에틸 전분 (HES), 탄수화물, 다당류, 플루란, 키토산, 히알루론산, 콘드로이틴 설페이트, 데르마탄 설페이트, 전분, 덱스트란, 카르복시메틸-덱스트란, 폴리알킬렌 옥사이드 (PAO), 폴리알킬렌 글리콜 (PAG), 폴리프로필렌 글리콜 (PPG), 폴리옥사졸린, 폴리아크릴로일모르폴린, 폴리비닐 알코올 (PVA), 폴리카르복실레이트, 폴리비닐피롤리돈, 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린, 폴리에틸렌-코-말레산 무수물, 폴리스티렌-코-말레산 무수물, 폴리(1-하이드록실메틸에킬렌 하이드록시메틸포르말) (PHF), 및 2-메타아크릴로일옥시-2'-에틸트리메틸암모늄포스페이트 (MPC). 한 가지 구체예에서, 수용성 폴리머는 PEG이다.

다양한 길이의 수용성 폴리머가 또한 고려된다. 한 가지 구체예에서, 전술한 방법이 제공되며 여기서 수용성 폴리머는 O5, O7, O9, O11, O13 및 O15로 구성된 군에서 선택되는 사슬 길이를 포함한다.

또 다른 구체예에서, 전술한 방법이 제공되며 여기서 수용성 연결자는 하기로 구성된 군에서 선택된다:

a) 하기 화학식의 3-옥사펜탄-1,5-디옥시아민:

;

b) 하기 화학식의 3,6,9-트리아옥사운데칸-1,11-디옥시아민:

;

c) 하기 화학식의 3,6,9,12,15-펜타옥사헵타데칸-1,17-디옥시아민:

; 및

d) 하기 화학식의 3,6,9,12,15,18,21-헵타옥사트리코산-1,23-디옥시아민:

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또 다른 구체예에서, 전술한 방법이 제공되며 여기서 수용성 연결자는 하기 화학식의 3,6,9-트리아옥사운데칸-1,11-디옥시아민이다:

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또 다른 구체예에서, 전술한 방법이 제공되며 여기서 수용성 연결자는 하기 화학식의 3,6,9,12,15-펜타옥사헵타데칸-1,17-디옥시아민이다:

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지방산 유도체를 만들기 위한 또 다른 방법이 본 명세서에서 고려된다. 한 가지 구체예에서, 전술한 지방산 유도체를 제조하는 방법이 제공되며 이는 하기 단계를 포함한다: a) 지방산 상의 카르복실기를 에스테르화하여 지방산 상에 에스테르를 발생시키는 단계; b) 단계 a)의 지방산 상의 메실기 도입에 의해 지방산 상의 ω-하이드록시기를 활성화하는 단계; 및 c) 단계 b)의 메실기를 치환시킴으로써 활성화 아미노옥시기를 포함한 수용성 연결자를 커플링시키고 그렇게 함으로써 안정한 옥시아민-메틸렌 결합을 형성하는 단계; 여기서 지방산 유도체는 수용성임.

한 가지 구체예에서, 전술한 것이 제공되며 여기서 카르복실기는 아세틸 클로라이드, 산의 존재에서 메탄올, 산의 존재에서 에탄올, 디아조메탄, 및 메틸아이오다이드로 구성된 군에서 선택되는 에스테르화제에 의해 에스테르화된다. 또 다른 구체예에서, 에스테르화제는 아세틸 클로라이드이다.

또 다른 구체예에서, 전술한 것이 제공되며 여기서 ω-하이드록시기는 메실 클로라이드, 토실 클로라이드 및 노실 클로라이드로 구성된 군에서 선택되는 활성화제에 의해 활성화된다. 한 가지 구체예에서, 활성화제는 메실 클로라이드이다.

다양한 지방산이 전술한 방법에서 사용하기 위해 고려된다. 한 가지 구체예에서, 전술된 것이 제공되며 여기서 지방산은 포화된 지방산 또는 불포화된 지방산이다. 또 다른 구체예에서, 지방산은 포화된 지방산이다. 또 다른 구체예에서, 지방산은 분지형 사슬 지방산이다.

또 다른 구체예에서, 전술한 방법이 제공되며 여기서 지방산은 홀수의 탄소수를 가진 합성 지방산을 포함하여, C10 내지 C24의 사슬 길이를 포함한다. 한 가지 구체예에서, 전술한 지방산 유도체가 제공되며 여기서 지방산은 C10, C12, C14, C16, C18, C20, C20, C22 및 C24로 구성된 군에서 선택되는 사슬 길이를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 지방산은 C14, C16 및 C18로 구성된 군에서 선택되는 사슬 길이를 갖는다. 또 다른 구체예에서, 지방산은 C13, C15 및 C17로 구성된 군에서 선택되는 사슬 길이를 갖는다.

다양한 수용성 폴리머가 또한 전술한 방법에서 사용하기 위해 고려된다. 한 가지 구체예에서, 전술한 방법이 제공되며 여기서 수용성 연결자는 수용성 폴리머 및 적어도 하나의 아미노옥시기를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 수용성 폴리머는 하기로 구성된 군에서 선택된다: 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 분지형 PEG, 폴리시알산 (PSA), 하이드록시알킬 전분 (HAS), 하이드록시에틸 전분 (HES), 탄수화물, 다당류, 플루란, 키토산, 히알루론산, 콘드로이틴 설페이트, 데르마탄 설페이트, 전분, 덱스트란, 카르복시메틸-덱스트란, 폴리알킬렌 옥사이드 (PAO), 폴리알킬렌 글리콜 (PAG), 폴리프로필렌 글리콜 (PPG), 폴리옥사졸린, 폴리아크릴로일모르폴린, 폴리비닐 알코올 (PVA), 폴리카르복실레이트, 폴리비닐피롤리돈, 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린, 폴리에틸렌-코-말레산 무수물, 폴리스티렌-코-말레산 무수물, 폴리(1-하이드록실메틸에킬렌 하이드록시메틸포르말) (PHF), 및 2-메타아크릴로일옥시-2'-에틸트리메틸암모늄포스페이트 (MPC). 또 다른 구체예에서, 수용성 폴리머는 PEG이다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 전술한 방법이 제공되며 여기서 수용성 폴리머는 O3, O5, O7, O9, O11, O13 및 O15로 구성된 군에서 선택되는 사슬 길이를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 수용성 연결자는 [0050]로 구성된 군에서 선택된다.

접합된 단백질을 제공하는 방법이 또한 본 발명에서 고려된다. 한 구체예에서, 접합된 치료학적 단백질을 제조하는 방법이 제공되며 이는 접합을 허용하는 조건 하에 치료학적 단백질 상의 산화된 탄수화물 모이어티를 전술한 지방산 유도체 (또는 본 명세서에서 설명된 바와 같은 수용성 폴리머)와 접촉시키는 단계를 포함하고; 상기 탄수화물 모이어티는 나트륨 퍼아이오데이트 (NaIO4), 납 테트라아세테이트 (Pb(OAc)4) 및 칼륨 퍼루테네이트 (KRuO4)로 구성된 군에서 선택되는 산화제를 포함하는 완충액과 인큐베이션에 의해 산화되고; 여기서 옥심 결합은 지방산 유도체 상의 산화된 탄수화물 모이어티 및 활성 아미노옥시기 사이에서 형성되고; 그리고 여기서 상기 옥심 결합 형성은 o-아미노 벤조산, m-아미노 벤조산, p-아미노 벤조산, 설파닐산, o-아미노벤즈아미드, o-톨루이딘, m-톨루이딘, p-톨루이딘, o-아니시딘, m-아니시딘, 및 p-아니시딘으로 구성된 군에서 선택되는 친핵성 촉매에 의해 촉매된다.

또 다른 구체예에서, 전술한 방법이 제공되며 여기서 치료학적 단백질이 하기로 구성된 군에서 선택된다: 인자 IX (FIX), 인자 VIII (FVIII), 인자 VIIa (FVIIa), 폰 빌레브란트 인자 (VWF), 인자 FV (FV), 인자 X (FX), 인자 XI (FXI), 인자 XII (FXII), 트롬빈 (FII), 단백질 C, 단백질 S, tPA, PAI-1, 조직 인자 (TF),ADAMTS 13 프로테아제, IL-1 알파, IL-1 베타, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-11, 집락 자극 인자-1 (CSF-1), M-CSF, SCF, GM-CSF, 과립구 집락 자극 인자 (G-CSF), EPO, 인터페론-알파 (IFN-알파), 컨센서스 인터페론, IFN-베타, IFN-감마, IFN-오메가, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-31, IL-32 알파, IL-33, 트롬보포이에틴 (TPO), Ang-1, Ang-2, Ang-4, Ang-Y, 안지오포이에틴-유사 폴리펩티드 1 (ANGPTL1), 안지오포이에틴-유사 폴리펩티드 2 (ANGPTL2), 안지오포이에틴-유사 폴리펩티드 3 (ANGPTL3), 안지오포이에틴-유사 폴리펩티드 4 (ANGPTL4), 안지오포이에틴-유사 폴리펩티드 5 (ANGPTL5), 안지오포이에틴-유사 폴리펩티드 6 (ANGPTL6), 안지오포이에틴-유사 폴리펩티드 7 (ANGPTL7), 비트로넥틴, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 안지오제닌, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 골 형성 단백질-1, 골 형성 단백질-2, 골 형성 단백질-3, 골 형성 단백질-4, 골 형성 단백질-5, 골 형성 단백질-6, 골 형성 단백질-7, 골 형성 단백질-8, 골 형성 단백질-9, 골 형성 단백질-10, 골 형성 단백질-11, 골 형성 단백질-12, 골 형성 단백질-13, 골 형성 단백질-14, 골 형성 단백질-15, 골 형성 단백질 수용체 IA, 골 형성 단백질 수용체 IB, 골 형성 단백질 수용체 II, 뇌 유래 신경영양 인자, 카디오트로핀-1, 섬모 신경영양 인자, 섬모 신경영양 인자 수용체, 크립토, 크립틱, 사이토카인-유도 중성구 주화성 인자 1, 사이토카인-유도 중성구, 주화성 인자 2α, 사이토카인-유도 중성구 주화성 인자 2β, β 내피세포 성장 인자, 엔도텔린 1, 상피 성장 인자, 에피겐, 에피레귤린, 상피-유래 중성구 유인물질, 섬유아세포 성장 인자 4, 섬유아세포 성장 인자 5, 섬유아세포 성장 인자 6, 섬유아세포 성장 인자 7, 섬유아세포 성장 인자 8, 섬유아세포 성장 인자 8b, 섬유아세포 성장 인자 8c, 섬유아세포 성장 인자 9, 섬유아세포 성장 인자 10, 섬유아세포 성장 인자 11, 섬유아세포 성장 인자 12, 섬유아세포 성장 인자 13, 섬유아세포 성장 인자 16, 섬유아세포 성장 인자 17, 섬유아세포 성장 인자 19, 섬유아세포 성장 인자 20, 섬유아세포 성장 인자 21, 산성 섬유아세포 성장 인자, 염기성 섬유아세포 성장 인자, 신경교 세포주-유래 신경영양 인자 수용체 α1, 신경교 세포주-유래 신경영양 인자 수용체 α2, 성장 관련 단백질, 성장 관련 단백질 α, 성장 관련 단백질 β, 성장 관련 단백질 γ, 헤파린 결합 상피 성장 인자, 간세포 성장 인자, 간세포 성장 인자 수용체, 간암-유래 성장 인자, 인슐린-유사 성장 인자 I, 인슐린-유사 성장 인자 수용체, 인슐린-유사 성장 인자 II, 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질, 케라틴세포 성장 인자, 백혈병 저해 인자, 백혈병 저해 인자 수용체 α, 신경 성장 인자 신경 성장 인자 수용체, 뉴로포이에틴,뉴트로핀-3, 뉴트로핀-4, 온코스타틴 M (OSM), 태반 성장 인자, 태반 성장 인자 2, 혈소판-유래 내피세포 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자 A 사슬, 혈소판 유래 성장 인자 AA, 혈소판 유래 성장 인자 AB, 혈소판 유래 성장 인자 B 사슬, 혈소판 유래 성장 인자 BB, 혈소판 유래 성장 인자 수용체 α, 혈소판 유래 성장 인자 수용체 β, 전-B 세포 성장 자극 인자, 줄기세포 인자 (SCF), 줄기세포 인자 수용체, TNF, TNF0, TNF1, TNF2, 형질전환 성장 인자 α, 형질전환 성장 인자 β, 형질전환 성장 인자 β1, 형질전환 성장 인자 β1.2, 형질전환 성장 인자 β2, 형질전환 성장 인자 β3, 형질전환 성장 인자 β5, 잠재적 형질전환 성장 인자 β1, 형질전환 성장 인자 β 결합 단백질 I, 형질전환 성장 인자 β 결합 단백질 II, 형질전환 성장 인자 β 결합 단백질 III, 흉선 기질 림포포이에틴 (TSLP), 종양 괴사 인자 수용체 유형 I, 종양 괴사 인자 수용체 유형 II, 우로키나아제-유형 플라스미노겐 활성자 수용체, 포스포리파아제-활성화 단백질 (PUP), 인슐린, 렉틴 리신, 프로락틴, 융모성 성선자극호르몬, 여포-자극 호르몬, 갑상선 자극 호르몬, 조직 플라스미노겐 활성자, IgG, IgE, IgM, IgA, 및 IgD, α-갈락토시다아제, β-갈락토시다아제, DNAse, 페투인, 황체형성 호르몬, 에스트로겐, 인슐린, 알부민, 리포단백질, 태아단백질, 트랜스페린, 트롬보포이에틴, 우로키나아제, 인테그린, 트롬빈, 렙틴, 휴미라 (안달리무맙), 프롤리아 (데노수맙), 엔브렐 (에타너셉트), 또는 표 1에서의 단백질, 생물학적 활성 단편, 유도체 또는 이의 변이체.

또 다른 구체예에서, 전술한 방법이 제공되며 여기서 치료학적 단백질은 FVIIa이다. 또 다른 구체예에서, 전술한 방법이 제공되며 여기서 치료학적 단백질은 FVIII이다. 또 다른 구체예에서, 전술한 방법이 제공되며 여기서 치료학적 단백질은 FIX이다.

또 다른 구체예에서, 전술한 방법이 제공되며 여기서 산화제는 나트륨 퍼아이오데이트 (NaIO4)이다. 또 다른 구체예에서, 전술한 방법이 제공되며 여기서 친핵성 촉매는 m-톨루이딘이다.

또 다른 구체예에서, 전술한 방법이 제공되며 이는 접합된 치료학적 단백질을 정제하는 단계를 추가로 포함한다.

또 다른 구체예에서, 전술한 방법이 제공되며 여기서 지방산 유도체는 본 명세서에서 설명된 바와 같은 방법에 의해 제조된다.

지방산 유도체를 제조하는 또 다른 방법이 본 발명에서 고려된다. 한 가지 구체예에서, 전술한 지방산 유도체를 제조하는 방법이 제공되며 이는 하기 단계를 포함한다: a) 지방산 상의 카르복실기를 에스테르화하여 지방산 상에 에스테르를 발생시키는 단계; 및 b) 활성 말레이미드기를 포함하는 수용성 연결자를 유리 설프하이드릴 (SH)기에 커플링시켜, 그렇게 함으로써 안정한 티오에테르 결합을 형성하는 단계; 여기서 지방산 유도체는 수용성임.

또 다른 구체예에서, 전술한 지방산 유도체를 제조하는 방법이 제공되며 이는 하기 단계를 포함한다: a) 지방산 상의 카르복실기를 에스테르화하여 지방산 상에 에스테르를 발생시키는 단계; b) 단계 a)에서 기인한 지방산을 아지드 시약과 반응시켜, 그렇게 함으로써 상응하는 지방산 아지드를 생성하는 단계; c) 단계 b)의 지방산 아지드를 수소화하여 상응하는 지방산 아민을 생성하는 단계; 및 d) 활성 NHS기를 포함한 수용성 연결자를 유리 아민기에 커플링시켜, 그렇게 함으로써 안정한 결합을 형성하는 단계; 여기서 지방산 유도체는 수용성임.

도면

도 1은 수용성 연결자 3-옥사펜탄-1,5-디옥시아민의 합성을 나타낸다.

본 발명의 상세한 설명

치료학적 단백질의 약물학적 및 면역학적 특성은 화학적 변형 및 폴리머 화합물, 가령 본 발명에 따른 지방산 및 지방산 유도체와의 접합에 의해 향상될 수 있다.

본 명세서에서 설명된 수용성 지방산 유도체의 첨가는 치료학적 단백질, 가령 혈액 응고 단백질 인자 IX (FIX), 인자 VIII (FVIII), 인자 VIIa (FVIIa), 폰 빌레브란트 인자 (VWF), 인자 FV (FV), 인자 X (FX), 인자 XI (FXI), 인자 XII (FXII), 트롬빈 (FII), 단백질 C, 단백질 S, tPA, PAI-1, 조직 인자 (TF) 또는 ADAMTS 13 프로테아제, 그리고 기타 공지된 단백질 또는 생물학적으로/치료학적으로 활성인 이의 단편의 특성을 향상시키는 한 가지 기법이다.

치료학적 단백질

본 발명의 특정한 구체예에서, 전술한 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드는 다음 치료학적 단백질에 의해 예시화된다: 효소, 항원, 항체, 수용체, 혈액 응고 단백질, 성장 인자, 호르몬 및 리간드. 특정한 구체예에서, 치료학적 단백질은 혈액 응고 단백질, 가령 인자 IX (FIX), 인자 VIII (FVIII), 인자 VIIa (FVIIa), 폰 빌레브란트 인자 (VWF), 인자 FV (FV), 인자 X (FX), 인자 XI (FXI), 인자 XII (FXII), 트롬빈 (FII), 단백질 C, 단백질 S, tPA, PAI-1, 조직 인자 (TF) 또는 ADAMTS 13 프로테아제이다.

특정한 구체예에서, 치료학적 단백질은 면역글로불린, 사이토카인 가령, IL-1 알파, IL-1 베타, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-11, 집락 자극 인자-1 (CSF-1), M-CSF, SCF, GM-CSF, 과립구 집락 자극 인자 (G-CSF), EPO, 인터페론-알파 (IFN-알파), 컨센서스 인터페론, IFN-베타, IFN-감마, IFN-오메가, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-31, IL-32 알파, IL-33, 트롬보포이에틴 (TPO), 안지오포이에틴, 예를 들면Ang-1, Ang-2, Ang-4, Ang-Y, 인간 안지오포이에틴-유사 폴리펩티드 ANGPTL1 내지 7, 비트로넥틴, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 안지오제닌, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 골 형성 단백질-1, 골 형성 단백질-2, 골 형성 단백질-3, 골 형성 단백질-4, 골 형성 단백질-5, 골 형성 단백질-6, 골 형성 단백질-7, 골 형성 단백질-8, 골 형성 단백질-9, 골 형성 단백질-10, 골 형성 단백질-11, 골 형성 단백질-12, 골 형성 단백질-13, 골 형성 단백질-14, 골 형성 단백질-15, 골 형성 단백질 수용체 IA, 골 형성 단백질 수용체 IB, 골 형성 단백질 수용체 II, 뇌 유래 신경영양 인자, 카디오트로핀-1, 섬모 신경영양 인자, 섬모 신경영양 인자 수용체, 크립토, 크립틱, 사이토카인-유도 중성구 주화성 인자 1, 사이토카인-유도 중성구, 주화성 인자 2α, 사이토카인-유도 중성구 주화성 인자 2β, β 내피세포 성장 인자, 엔도텔린 1, 상피 성장 인자, 에피겐, 에피레귤린, 상피-유래 중성구 유인물질, 섬유아세포 성장 인자 4, 섬유아세포 성장 인자 5, 섬유아세포 성장 인자 6, 섬유아세포 성장 인자 7, 섬유아세포 성장 인자 8, 섬유아세포 성장 인자 8b, 섬유아세포 성장 인자 8c, 섬유아세포 성장 인자 9, 섬유아세포 성장 인자 10, 섬유아세포 성장 인자 11, 섬유아세포 성장 인자 12, 섬유아세포 성장 인자 13, 섬유아세포 성장 인자 16, 섬유아세포 성장 인자 17, 섬유아세포 성장 인자 19, 섬유아세포 성장 인자 20, 섬유아세포 성장 인자 21, 산성 섬유아세포 성장 인자, 염기성 섬유아세포 성장 인자, 신경교 세포주-유래 신경영양 인자 수용체 α1, 신경교 세포주-유래 신경영양 인자 수용체 α2, 성장 관련 단백질, 성장 관련 단백질 , 성장 관련 단백질 β, 성장 관련 단백질 γ, 헤파린 결합 상피 성장 인자, 간세포 성장 인자, 간세포 성장 인자 수용체, 간암-유래 성장 인자, 인슐린-유사 성장 인자 I, 인슐린-유사 성장 인자 수용체, 인슐린-유사 성장 인자 II, 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질, 케라틴세포 성장 인자, 백혈병 저해 인자, 백혈병 저해 인자 수용체 α, 신경 성장 인자 신경 성장 인자 수용체, 뉴로포이에틴,뉴트로핀-3, 뉴트로핀-4, 온코스타틴 M (OSM), 태반 성장 인자, 태반 성장 인자 2, 혈소판-유래 내피세포 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자 A 사슬, 혈소판 유래 성장 인자 AA, 혈소판 유래 성장 인자 AB, 혈소판 유래 성장 인자 B 사슬, 혈소판 유래 성장 인자 BB, 혈소판 유래 성장 인자 수용체 α, 혈소판 유래 성장 인자 수용체 β, 전-B 세포 성장 자극 인자, 줄기세포 인자 (SCF), 줄기세포 인자 수용체, TNF0, TNF1, TNF2를 포함한 TNF, 형질전환 성장 인자 α, 형질전환 성장 인자 β, 형질전환 성장 인자 β1, 형질전환 성장 인자 β1.2, 형질전환 성장 인자 β2, 형질전환 성장 인자 β3, 형질전환 성장 인자 β5, 잠재적 형질전환 성장 인자 β1, 형질전환 성장 인자 β 결합 단백질 I, 형질전환 성장 인자 β 결합 단백질 II, 형질전환 성장 인자 β 결합 단백질 III, 흉선 기질 림포포이에틴 (TSLP), 종양 괴사 인자 수용체 유형 I, 종양 괴사 인자 수용체 유형 II, 우로키나아제-유형 플라스미노겐 활성자 수용체, 혈관 내피 성장 인자, 및 키메라 단백질 및 생물학적으로 또는 면역학적으로 활성인 이의 단편이다.

특정한 구체예에서, 치료학적 단백질은 알파-, 베타-, 및 감마-인터페론, 과립구 집락 자극 인자를 포함한 집락 자극 인자, 섬유아세포 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자, 포스포리파아제-활성화 단백질 (PUP), 인슐린, 식물 단백질, 가령 렉틴 및 리신, 종양 괴사 인자 및 관련된 대립형질, 종양 괴사 인자 수용체의 가용성 형태, 인터루킨 수용체 및 인터루킨 수용체의 가용성 형태, 성장 인자, 가령 조직 성장 인자, 가령 TGFα 또는 TGFβ 및 상피 성장 인자, 호르몬, 소마토메딘, 색소성 호르몬, 시상하부 방출 인자, 항이뇨 호르몬, 프로락틴, 융모성 성선자극호르몬, 여포-자극 호르몬, 갑상선 자극 호르몬, 조직 플라스미노겐 활성자, 및 면역글로불린, 가령 IgG, IgE, IgM, IgA, 및 IgD, 갈락토시다아제, α-갈락토시다아제, β-갈락토시다아제, DNAse, 페투인, 황체형성 호르몬, 에스트로겐, 코르코스테로이드, 인슐린, 알부민, 리포단백질, 태아단백질, 트랜스페린, 트롬보포이에틴, 우로키나아제, DNase, 인테그린, 트롬빈, 조혈 성장 인자, 렙틴, 글리코시다아제, 휴미라 (안달리무맙), 프롤리아 (데노수맙), 엔브렐 (에타너셉트), 및 이의 단편, 또는 상기 언급된 단백질 또는 이의 단편 중 하나를 포함하는 임의의 융합 단백질이다. 전술한 단백질뿐만 아니라, 다음 표 1은 본 발명에 의해 고려되는 치료학적 단백질을 제공한다:

본 명세서에서 제공된 치료학적 단백질을 유일한 것으로 간주해서는 안된다. 더 정확히 말하면, 본 명세서에서 제공된 개시로부터 명확한 것과 같이, 본 발명의 방법은 임의의 단백질에 적용가능하며 여기서 수용성 지방산 유도체의 부착은 본 발명에 따르는 것이 바람직하다. 예를 들어, 치료학적 단백질은 미국 2007/0026485에서 설명되며, 이는 이의 전체로 본 명세서에 참조로서 편입된다.

혈액 응고 단백질

하나의 측면에서, 본 발명의 시작 물질은 혈액 응고 단백질이며, 이는 인간 혈장으로부터 파생될 수 있거나, 또는 미국 특허 번호 제4,757,006호; 미국 특허 번호 제5,733,873호; 미국 특허 번호 제5,198,349호; 미국 특허 번호 제5,250,421호; 미국 특허 번호 제5,919,766호; 및 EP 306 968에서 설명된 바와 같이, 재조합 공학 기술에 의해 생성될 수 있다.

인자 IX (FIX), 인자 VIII (FVIII), 인자 VIIa (FVIIa), 폰 빌레브란트 인자 (VWF), 인자 FV (FV), 인자 X (FX), 인자 XI (FXI), 인자 XII (FXII), 트롬빈 (FII), 단백질 C, 단백질 S, tPA, PAI-1, 조직 인자 (TF) 및 ADAMTS 13 프로테아제를 포함하여 혈액 응고 단백질과 같은 치료학적 폴리펩티드는 신속하게 단백질분해 효소에 의해 분해되거나 항체에 의해 중성화된다. 이는 그들의 반감기 및 순환 시간을 감소시키고, 그렇게 함으로써 그들의 치료적 효과를 제한한다. 상대적으로 높은 용량 및 빈번한 투약이 이들 응고 단백질의 바람직한 치료적 또는 예방 효과에 도달하고 유지하는 데에 필요하다. 결과로서, 적절한 용량 조절을 얻기가 어렵고 빈번한 정맥내 투여의 필요성이 환자 삶의 방식에서 제한을 부과한다.

본 명세서에서 설명된 바와 같이, 인자 IX (FIX), 인자 VIII (FVIII), 인자 VIIa (FVIIa), 폰 빌레브란트 인자 (VWF), 인자 FV (FV), 인자 X (FX), 인자 XI, 인자 XII (FXII), 트롬빈 (FII), 단백질 C, 단백질 S, tPA, PAI-1, 조직 인자 (TF) 및 ADAMTS 13 프로테아제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 혈액 응고 단백질은 본 발명에 의해 고려된다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "혈액 응고 단백질"은 임의의 인자 IX (FIX), 인자 VIII (FVIII), 인자 VIIa (FVIIa), 폰 빌레브란트 인자 (VWF), 인자 FV (FV), 인자 X (FX), 인자 XII (FXII), 트롬빈 (FII), 단백질 C, 단백질 S, tPA, PAI-1, 조직 인자 (TF) 및 ADAMTS 13 프로테아제를 나타내고 이는 특정한 자연형 혈액 응고 단백질과 연관되는 생물학적 활성도를 나타낸다.

혈액 응고 캐스캐이드(cascade)는 세 가지 분명한 부분으로 나뉜다: 내인성, 외인성, 및 일반적인 경로 (Schenone et al., Curr Opin Hematol. 2004;11:272-7). 캐스캐이드는 일련의 세린 프로테아제 효소 (자이모겐) 및 단백질 공동인자를 포함한다. 요구될 때, 불활성 자이모겐 전구체는 활성 형태로 전환되며, 이는 캐스캐이드에서 다음 효소를 전환시킨다.

내재성 경로는 응고 인자 VIII, IX, X, XI, 및 XII를 요구한다. 내재성 경로의 개시는 프레칼리크레인, 고-분자-무게 키니노겐, 인자 XI (FXI) 및 인자 XII (FXII)가 음으로 전하된 표면에 노출될 때 발생한다. 또한 혈소판으로부터 분비된 칼슘 이온 및 인지질이 요구된다.

외재성 경로는 혈관의 혈관 루멘(vascular lumen)이 손상될 때 시작된다. 막 글리코단백질 조직 인자가 노출되고 이후에 순환하는 인자 VII (FVII) 및 이미 존재하는 적은 양의 이의 활성화 형태 FVIIa에 결합한다. 이 결합은 FVIIa로의 FVII의 완전한 전환 및 차후에, 칼슘 및 인지질의 존재에서, 인자 IXa (FIXa)로의 인자 IX (FIX)의 전환, 및 인자 Xa (FXa)로의 인자 X (FX)의 전환을 촉진한다. 조직 인자와의 FVIIa의 연관성은 기질 (FIX 및 FX)에 대한 FVII의 결합 부위를 더 가까운 근거리로 이동시킴으로써 그리고 FVIIa의 효소 활성도를 증진시키는 구조형태 변화를 유도함으로써 단백질분해의 활성도를 증진시킨다.

FX의 활성화는 두 가지 경로의 공통 지점이다. 인지질 및 칼슘과 함께, 인자 Va (FVa) 및 Xa는 프로트롬빈을 트롬빈 (프로트롬비나아제 복합체)으로 전환시키며, 이는 이후 피브로겐을 절단하여 피브린 모노머(monomer)를 형성한다. 모노머를 폴리머화하여 피브린 가닥을 형성한다. 인자 XIIIa (FXIIIa)는 이들 가닥을 서로 공유결합시켜 단단한 망(mesh)을 형성한다.

또한 FVIIa로의 FVII의 전환은 트롬빈, FIXa, FXa, 인자 XIa (FXIa), 및 인자 XIIa (FXIIa)를 포함한, 다수의 프로테아제에 의해 촉매된다. 캐스캐이드 초기 단계의 저해를 위하여, 조직 인자 경로 저해제는 FVIIa/조직 인자/FXa 산물 복합체를 표적한다.

인자 VIIa

FVII (안정한 인자 또는 프로콘버틴(proconvertin)으로도 공지됨)는 지혈 및 응고에서 중추적인 역할은 하는 비타민 K-의존 세린 프로테아제 글리코단백질이다 (Eigenbrot, Curr Protein Pept Sci. 2002;3:287-99).

FVII는 간에서 합성되고 48 kD의 단일-사슬 글리코단백질로서 분비된다. FVII는 지질막과의 단백질의 상호작용의 원인이 되는 9-12 잔기를 가진 아미노-말단 감마-카르복시글루탐산 (Gla) 도메인으로 구성된 유사 단백질 도메인 구조, 카르복시-말단 세린 프로테아제 도메인 (촉매 도메인), 및 조직 인자와의 상호작용을 매개하는 칼슘 이온 결합 부위를 함유한 두 개의 상피 성장 인자-유사 도메인을 모든 비타민 K-의존 세린 프로테아제 글리코단백질과 공유한다. 감마-글루타밀 카르복실라아제는 분자의 아미노-말단 일부에서 Gla 잔기의 카르복실화를 촉매한다. 카르복실라아제는 이의 작용을 위해 환원된 형태의 비타민 K에 의존하며, 이는 에폭사이드 형태로 산화된다. 비타민 K 에폭사이드 환원효소는 비타민 K의 에폭사이드 형태를 환원된 형태로 다시 전환시키는 데에 요구된다.

FVII의 주요 부분은 자이모겐 형태로 혈장에서 순환하고, 이 형태의 활성화는 아르기닌 152 및 이소류신 153 사이의 펩티드 결합의 절단을 야기한다. 결과적 활성화 FVIIa는 단일 디설파이드 결합 (Cys 135 내지 Cys 262)을 통하여 연결된 NH2-유도 경쇄 (20 kD) 및 COOH 말단-유래 중쇄 (30 kD)로 구성된다. 경쇄는 막-결합 Gla 도메인을 함유하고, 반면에 중쇄는 촉매 도메인을 함유한다.

유전적 및 환경적 인자에 의해 결정되는 FVII의 혈장 농도는 약 0.5 mg/mL이다 (Pinotti et al., Blood. 2000;95:3423-8). 상이한 FVII 유전자형은 평균 FVII 레벨에서 몇 배의 차이를 야기할 수 있다. 혈장 FVII 레벨은 건강한 여성의 임신 동안에 상승되고 또한 연령에 따라 증가하며 그리고 여성에서 및 고중성지방혈증이 있는 인간에서 더 높다. FVII는 모든 응혈촉진 인자 중 가장 짧은 반감기를 갖는다 (3-6 시간). FVIIa의 평균 혈장 농도는 건강한 개체에서 3.6 ng/mL이고 순환하는 FVIIa의 반감기는 기타 응고 인자와비교하여 상대적으로 길다 (2.5 시간).

유전적인 FVII 결핍은 일반적인 인구 중 500,000명 당 1 사례로 추정되는 유병률을 가진 드문 상염색체 열성 출혈 질환이다 (Acharya et al., J Thromb Haemost. 2004;2248-56). 저해제로부터 후천적 FVII 결핍도 또한 매우 드물다. 약물 가령, 세팔로스포린, 페니실린, 및 경구 항응고제와 연관되어 발생하는 결핍 사례가 또한 보고되었다. 추가적으로, 후천적 FVII 결핍은 자발적으로 발생하거나 또는 기타 질환, 가령 골수종, 패혈증, 재생불량성 빈혈과 함께, 인터루킨-2 및 항흉선세포 글로불린 요법과 함께 발생하는 것으로 보고되었다.

참고 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드는 가령, 게놈 서열을 위한 GenBank 수탁 번호 제J02933호, cDNA (Hagen et al. PNAS 1986; 83: 2412-6)를 위한 제M13232호, 및 폴리펩티드 서열 (이들 전체로 본 명세서에 편입된 참조문헌)을 위한 제P08709호를 포함한다. FVII의 다양한 다형성이 설명되었고, 예를 들어 Sabater-Lleal et al. (Hum Genet. 2006; 118:741-51) (이의 전체로 본 명세서에 편입된 참조문헌)를 참고한다.

인자 IX

FIX는 칼슘 이온, 인지질 및 FVIIIa의 존재에서 FX를 이의 활성 형태로 전환시킴으로써 혈액 응고의 내재성 경로에서 참여하는 비타민 K-의존 혈장 단백질이다. FIX 의 우세한 촉매 능력은 FX 내의 특정한 아르기닌-이소류신 결합에 대한 특이성을 가진 세린 프로테아제와 같은 것이다. FIX의 활성화는 FXIa에 의해 발생하며, 이는 FIX로부터 활성화 펩티드의 제거를 야기하여 하나 이상의 디설파이드 결합에 의해 유지되는 두 개의 사슬을 포함한 활성화 FIX 분자를 생성한다. FIX의 결핍은 열성 X-연관 혈우병 B의 원인이다.

혈우병 A 및 B는 각각, FVIII 및 FIX 폴리펩티드에서의 결핍에 의해 특징되는 유전적 질병이다. 결핍의 근본적인 원인은 흔히 FVIII 및 FIX 유전자내 돌연변이의 결과이며, 상기 유전자 둘 모두는 X 염색체 상에 위치한다. 혈우병에 대한 전통 요법은 종종 정상 개체로부터의 풀링된 혈장 또는 반-정제된 응고 단백질의 정맥내 투여를 수반한다. 이들 제조물은 병원체 또는 바이러스, 가령 감염성 프리온, HIV, 파르보바이러스, 간염 A, 및 간염 C에 의해 오염될 수 있다. 따라서, 인간 혈청의 이용이 요구되지 않는 치료제에 대한 필요성이 시급하다.

FIX 활성도에서 레벨 감소는 혈우병 B의 중증도와 직접적으로 비례한다. 혈우병 B의 현재 치료는 혈장-유도 또는 재조합 FIX에 의한 손실 단백질의 대체로 구성된다 (소위 FIX 치환 또는 대체 치료 또는 요법).

FIX의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열은 예를 들어 UniProtKB/Swiss-Prot 수탁 번호 제P00740호, 및 미국 특허 번호 제6,531,298호에서 찾을 수 있다.

인자 VIII

응고 인자 VIII (FVIII)은 혈장에서 매우 낮은 농도로 순환하고 폰 빌레브란트 인자 (VWF)에 비-공유결합으로 결합된다. 지혈 동안에, FVIII은 VWF로부터 분리되고 칼슘 및 인지질 또는 세포 막의 존재에서 활성화 속도를 증진시킴으로써 활성화 인자 IX (FIXa)-매개 FX 활성화를 위한 공동 인자로서 작용한다.

FVIII은 도메인 구조 A1-A2-B-A3-C1-C2를 지닌 대략적으로 270-330 kD의 단일-사슬 전구체로서 합성된다. 혈장으로부터 정제될 때 (가령, "혈장-유도" 또는 "혈장성"), FVIII은 중쇄 (A1-A2-B) 및 경쇄 (A3-C1-C2)로 구성된다. 경쇄의 분자 질량은 80 kD인 반면에, B 도메인 내의 단백질분해 때문에, 중쇄는 90-220 kD의 범위에 있다.

FVIII은 출혈 질환에서 치료학적 용도를 위한 재조합 단백질로서 또한 합성된다. 다양한 시험관내 분석은 치료학적 약물로서 재조합 FVIII (rFVIII)의 잠재적인 효능을 결정하기 위해 고안되었다. 이들 분석은 내생 FVIII의 생체내 효과를 모방한다. FVIII의 시험관내 트롬빈 치료는 시험관내 분석에 의해 측정된 바와 같이, 이의 응혈촉진 활성도에서의 빠른 증가 및 차후 감소를 야기한다. 이 활성화 및 불활성화는 특이적 제한 단백질분해와 함께 중쇄 및 경쇄 둘 모두에서 동시에 일어나며, 이는 FVIII내 상이한 결합 에피토프의 이용가능성을 변경한다, 가령 FVIII이 VWF로부터 분리되게끔 및 인지질 표면에 결합하게끔 허용하거나 또는 특정한 단일클론 항체에 결합하는 능력을 변경한다.

FVIII의 부족 또는 기능이상은 가장 빈번한 출혈 질환인, 혈우병 A와 연관된다. 혈우병 A의 관리를 위해 선택되는 치료는 혈장 유래 또는 rFVIII 농축물로의 대체 요법이다. 1% 이하의 FVIII 레벨을 지닌 심각한 혈우병 A를 앓는 환자는 FVIII을 용량 사이에서 1% 이상으로 유지하는 것을 목표로 하여 일반적으로 예방 요법으로 치료한다. 순환에서 다양한 FVIII 산물의 평균 반감기를 고려하여, 이 결과는 일반적으로 주마다 FVIII을 2 내지 3배 제공함으로써 성취될 수 있다.

참고 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열은 가령, UniProtKB/Swiss-Prot P00451 (FA8_HUMAN); Gitschier J et al., Characterization of the human Factor VIII gene, Nature, 312(5992): 326-30 (1984); Vehar GH et al., Structure of human Factor VIII, Nature, 312(5992):337-42 (1984); Thompson AR. Structure and Function of the Factor VIII gene and protein, Semin Thromb Hemost, 2003:29;11-29 (2002)를 포함한다.

폰 빌레브란트 인자

폰 빌레브란트 인자 (VWF)는 약 500 내지 20,000 kD 크기 범위에 있는 일련의 멀티머(multimer)로서 혈장에서 순환하는 글리코단백질이다. VWF의 멀티머 형태는 디설파이드 결합으로 함께 연결된 250 kD 폴리펩티드 서브유닛으로 구성된다. VWF는 손상된 혈관 벽의 내피-하층으로 초기 혈소판 부착을 매개한다. 오로지 더 큰 멀티머만 지혈 활성도를 나타낸다. 내피 세포는 VWF의 거대 폴리머 형태를 분비하고 낮은 분자량을 갖는 VWF의 이들 형태 (낮은 분자량 VWF)는 단백질분해 절단으로부터 발생하는 것으로 추정된다. 거대 분자 질량을 갖는 멀티머는 내피 세포의 바이벨-펠라드(Weibel-Pallade) 소체 에 저장되고 자극시 유리된다.

VWF는 광범위한 반복 도메인으로 구성되는 거대 프리프로(prepro)-VWF로서 내피 세포 및 거핵세포에 의해 합성된다. 신호 펩티드의 절단시, 프로-VWF는 이의 C-말단 영역에서 디설파이드 결합을 통하여 다이머화된다. 다이머(dimer)는 멀티머화를 위해 프로토머(protomer)로서 역할을 하며, 이는 유리 끝 말단 사이의 디설파이드 연결에 의해 좌우된다. 멀티머에 대한 조립 다음에 프로펩티드 서열의 단백질분해성 제거가 일어난다 (Leyte et al., Biochem. J. 274 (1991), 257-261).

VWF의 클로닝된 cDNA로부터 예측되는 일차 전사 산물은 2813-잔기 전구체 폴리펩티드 (프리프로-VWF)이다. 프리프로- VWF는 22 아미노산 신호 펩티드 및 741 아미노산 프로펩티드로 구성되며, 여기서 성숙 VWF는 2050 아미노산을 포함한다 (Ruggeri Z.A., and Ware, J., FASEB J., 308-316 (1993).

VWF에서의 결함은 대략 뚜렷한 출혈 표현형으로 특징되는 폰 빌레브란트 질병 (VWD)에 대한 원인이 된다. VWD 유형 3은 VWF가 완전하게 사라지는 가장 심각한 증상이고, VWD 유형 1은 VWF의 정량적 손실과 관련되고 이의 표현형은 매우 약할 수 있다. VWD 유형 2는 VWF의 질적인 결핍과 관련되고 VWD 유형 3만큼 심각할 수 있다. VWD 유형 2는 많은 하위-형태를 가지며, 몇 가지는 고분자량 멀티머의 손실 또는 감소와 연관된다. 폰 빌레브란트 질병 유형 2a (VWD-2A)는 중간체 및 거대 멀티머 둘 모두의 손실로 특징된다. VWD-2B는 가장 높은 분자량 멀티머의 손실로 특징된다. VWF와 관련된 기타 질병 및 질환은 해당분야에서 공지된다.

프리프로-VWF의 폴리뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 각각, GenBank 수탁 번호 제NM_000552호 및 제NP_000543호에서 이용가능하다.

본 발명에 따른 기타 혈액 응고 단백질은 해당 분야, 가령 Mann KG, Thromb Haemost, 1999;82:165-74에서 설명된다.

A. 폴리펩티드

하나의 측면에서, 본 발명의 시작 물질은 단백질 또는 폴리펩티드이다. 본 명세서에서 설명된 바와 같이, 용어 치료학적 단백질은 임의의 치료학적 단백질 분자를 나타내며, 이는 치료학적 단백질과 연관된 생물학적 활성도를 나타낸다. 본 발명의 한 가지 구체예에서, 치료학적 단백질 분자는 전장(full-length) 단백질이다.

치료학적 단백질 분자는 전장 단백질, 전장 단백질의 전구체, 전장 단백질의 생물학적 활성 서브유닛 또는 단편, 그리고 치료학적 단백질의 이들 형태 중 어느 하나의 생물학적 활성 유도체 및 변이체를 포함한다. 따라서, 치료학적 단백질은 (1) 본 명세서에서 설명된 참조 핵산 또는 아미노산에 의해 인코딩되는 폴리펩티드에 대하여, 적어도 약 25, 약 50, 약 100, 약 200, 약 300, 약 400개, 또는 이보다 더 많은 아미노산의 영역에 걸쳐, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 초과 또는 이보다 더 큰 아미노산 서열 동일성을 지닌 아미노산 서열을 갖는 것들; 및/또는 (2) 항체, 가령, 본 명세서에서 설명된 바와 같은 참고 아미노산 서열을 포함한 면역원, 이의 면역원성 단편, 및/또는 보존적으로 변형된 이의 변이체에 대항하여 발생시킨 다클론 또는 단일클론 항체에 특이적으로 결합하는 것들을 포함한다.

본 발명에 따라서, 용어 "재조합 치료학적 단백질"은 재조합 DNA 기술을 통하여 얻은 임의의 치료학적 단백질을 포함한다. 특정한 구체예에서, 상기 용어는 본 명세서에서 설명된 단백질을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, "내생 치료학적 단백질"은 치료를 받는 것으로 의도된 포유류로부터 기원한 치료학적 단백질을 포함한다. 또한 상기 용어는 상기 포유류에서 존재하는 전이유전자 또는 임의의 기타 외래 DNA로부터 전사된 치료학적 단백질을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "외생 치료학적 단백질"은 치료를 받는 것으로 의도된 포유류로부터 기원하지 않은 혈액 응고 단백질을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, "혈장-유도 혈액 응고 단백질" 또는 "혈장성"은 응고 경로에 참여하는 특성을 갖는 포유류로부터 얻은 혈액에서 발견되는 단백질의 모든 형태를 포함한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, "생물학적 활성 유도체" 또는 "생물학적 활성 변이체"는 상기 분자의 동일한 기능적 및/또는 생물학적 특성, 가령 결합 특성, 및/또는 동일한 구조적 기반, 가령 펩티드 백본 또는 염기성 폴리머 유닛을 실질적으로 갖는 분자의 임의의 유도체 또는 변이체를 포함한다.

"유사체(analog)", "변이체"　또는　"유도체"는,　비록 특정한 경우에는 정도가 상이하지만,　자연적으로-발생한 분자에 대해 구조에서 실질적으로 유사하고 그리고 동일한 생물학적 활성도를 갖는 화합물이다. 예를 들어, 폴리펩티드 변이체는 참조 폴리펩티드와 유사한 구조를 실질적으로 공유하는 및 동일한 생물학적 활성도를 갖는 폴리펩티드를 나타낸다. 변이체 또는 유사체는 유사체가 파생되는 자연적으로-발생한 폴리펩티드와 비교하여 이들의 아미노산 서열의 조성물에 있어 상이하며, 상기 변이체 또는 유사체는 (i) 하나 이상의 폴리펩티드 말단 및/또는 자연적으로-발생한 폴리펩티드 서열 (가령, 단편)의 하나 이상의 내부 영역에서 하나 이상의 아미노산 잔기의 결실, (ii) 하나 이상의 폴리펩티드 말단 (전형적으로 "첨가" 또는 "융합") 및/또는 자연적으로-발생한 폴리펩티드 서열의 하나 이상의 내부 영역 (전형적으로 "삽입")에서 하나 이상의 아미노산의 삽입 또는 첨가 또는 (iii) 자연적으로 발생한 폴리펩티드 서열에서 기타 아미노산에 대한 하나 이상의 아마노산의 치환을 수반하는 하나 이상의 돌연변이에 기반한다. 예로써, "유도체"는 가령, 화학적으로 변형된 참고 폴리펩티드와 동일하거나 또는 실질적으로 유사한 구조를 공유하는 폴리펩티드를 나타낸다.

다양한 구체예에서, 유사체, 변이체 또는 유도체는 예를 들어, 단백질 유사체, 변이체 또는 유도체에 또 다른 분자의 접합을 허용하도록 설계되고, 그렇게 됨으로써 본 발명에 따른 접합된 단백질을 형성한다.

변이체 또는 유사체 폴리펩티드는 삽입 변이체를 포함하며, 여기서 하나 이상의 아미노산 잔기는 본 발명의 치료학적 단백질 아미노산 서열에 첨가된다. 삽입은 단백질의 어느 한쪽 또는 양쪽 말단에 위치될 수 있고, 및/또는 치료학적 단백질 아미노산 서열의 내부 영역 내에 위치될 수 있다. 어느 한쪽 또는 양쪽 말단에서 추가적인 잔기를 가진, 삽입 변이체는 예를 들어, 융합 단백질 및 아미노산 태그 또는 기타 아미노산 라벨을 포함한 단백질을 포함한다. 하나의 측면에서, 혈액 응고 단백질 분자는 특히 분자가 대장균(E. coli)과 같은 박테리아 세포에서 재조합적으로 발현될 때, N-말단 Met를 선택적으로 함유한다.

결실 변이체에서, 본 명세서에서 설명된 바와 같은 치료학적 단백질 폴리펩티드내 하나 이상의 아미노산 잔기가 제거된다. 결실은 치료학적 단백질 폴리펩티드의 한쪽 또는 양쪽 말단에 영향을 줄 수 있다. 따라서, 결실 변이체는 치료학적 단백질 폴리펩티드 서열의 단편을 포함한다.

치환 변이체에서, 치료학적 단백질 폴리펩티드의 하나 이상의 아미노산 잔기가 제거되고 대안적인 잔기로 대체된다. 하나의 측면에서, 치환은 자연에서 보존적이고 이 유형의 보존적 치환은 해당 분야에서 잘 공지된다. 대안적으로, 본 발명은 비-보존적인 치환도 또한 포함한다. 예시적인 보존적 치환은 [Biochemistry, 2nd Edition; Worth Publishers, Inc., New York (1975), pp.71-77]에서 설명되고 그리고 바로 아래에 배열된다.

대안적으로, 예시적인 보조적 치환은 바로 아래에 배열된다.

B. 폴리뉴클레오티드

본 발명의 치료학적 단백질을 인코딩하는 핵산은 예를 들어 그리고 제한 없이, 유전자, 전-mRNA, mRNA, cDNA, 다형성 변이체, 대립형질, 합성 및 자연적으로-발생한 돌연변이를 포함한다.

또한 본 발명의 치료학적 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 제한 없이, (1) 엄격한 혼성화 조건 하에 본 명세서에서 설명된 바와 같은 참고 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산, 및 보존적으로 변형된 이의 변이체와 특이적으로 혼성화한 것들; (2) 본 명세서에서 설명된 바와 같은 참고 핵산에 대해 적어도 약 25, 약 50, 약 100, 약 150, 약 200, 약 250, 약 500, 약 1000개, 또는 이보다 더 많은 뉴클레오티드 (성숙 단백질의 1218개 뉴클레오티드의 최대 전장 서열까지)의 영역에 걸쳐, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 초과, 또는 이보다 더 높은 뉴클레오티드 서열 동일성을 지닌 핵산 서열을 갖는 것들을 포함한다. 예시적인 "엄격한 혼성화" 조건은 50% 포름아마이드내 42oC, 5X SSC, 20 mM Na·PO4, pH 6.8에서 혼성화; 그리고 30분 동안 55oC에서 1X SSC로 세척하는 것을 포함한다. 이들 예시적인 조건에서 변이체는 혼성화되어야 할 서열의 길이 및 GC 뉴클레오티드 함량에 기반하여 만들어질 수 있다는 점이 이해된다. 해당 분야내 화학식 기준은 적절한 혼성화 조건을 결정하기 위해 적절하다. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Second ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) §§ 9.47-9.51을 참고.

"자연적으로-발생하는" 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열은 영장류, 가령, 인간; 설치류, 가령, 랫트, 쥐, 햄스터; 소, 돼지, 말, 양, 또는 임의의 포유류를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 포유류부터 전형적으로 유래한 것이다. 본 발명의 핵산 및 단백질은 재조합 분자 (가령, 비상동 그리고 야생형 유형 서열 또는 이의 변이체, 또는 비-자연적으로 발생한 것을 인코딩)일 수 있다.

C. 치료학적 단백질의 생성

치료학적 단백질의 생성은 (i) 유전자 조작에 의한 재조합 DNA의 생성, (ii) 예를 들어 그리고 제한 없이, 형질감염, 전기천공법 또는 미세주입법으로 원핵세포 또는 진핵세포 내로 재조합 DNA를 도입, (iii) 상기 형질변환된 세포를 재배, (iv) 가령, 본질적으로 또는 유도시, 치료학적 단백질을 발현, 및 (v) 정제된 치료학적 단백질을 얻기 위하여, 가령, 배양 배지로부터 또는 형질변환된 세포를 수확함으로써 상기 혈액 응고단백질을 분리하기 위한 해당 분야에서의 공지된 임의의 방법을 포함한다.

기타 측면에서, 약물학적으로 허용되는 혈액 응고 단백질 분자를 생성함으로써 특징되는 적합한 원핵 또는 진핵 호스트 시스템(host system)내 발현에 의해 치료학적 단백질이 생성된다. 진핵세포의 예시는 포유류 세포, 가령 CHO, COS, HEK 293, BHK, SK-Hep, 및 HepG2이다.

매우 다양한 벡터가 치료학적 단백질의 제조를 위해 사용되고 그리고 진핵 및 원핵 발현 벡터에서 선택된다. 원핵 발현을 위한 벡터의 예시는 플라스미드, 가령 제한 없이, pRSET, pET, 및 pBAD를 포함하며, 여기서 원형 발현 벡터에서 사용된 프로모터는 제한 없이, lac, trc, trp, recA, 또는 araBAD 중 하나 이상을 포함한다. 진핵 발현을 위한 벡터의 예시는 다음을 포함한다: (i) 효소에서 발현을 위해, 프로모터, 가령 제한 없이, AOX1, GAP, GAL1, 또는 AUG1을 이용한, 벡터, 가령 제한 없이, pAO, pPIC, pYES, 또는 pMET; (ii) 곤충 세포에서 발현을 위해, 프로모터, 가령 제한 없이, PH, p10, MT, Ac5, OpIE2, gp64, 또는 polh를 이용한, 벡터, 가령 제한 없이, pMT, pAc5, pIB, pMIB, 또는 pBAC, 및 (iii) 포유류 세포에서 발현을 위해, 프로모터, 가령 제한 없이, CMV, SV40, EF-1, UbC, RSV, ADV, BPV, 및 β-액틴을 이용한, 벡터, 가령 제한 없이 pSVL, pCMV, pRc/RSV, pcDNA3, 또는 pBPV, 및 하나의 측면에서, 바이러스 시스템, 가령 제한 없이, 우두 바이러스, 아데노-연관 바이러스, 헤르페스 바이러스, 또는 레트로바이러스에서 유래된 벡터.

본 발명의 다양한 구체예에서, 치료학적 단백질은 치료학적 단백질 상의 하나 이상의 탄수화물에 수용성 지방산 유도체 또는 수용성 연결자를 접합함으로써 변형된다. 따라서, 한 가지 구체예에서, 치료학적 단백질은 글리코단백질이고 그리고 글리코실화를 허용하는 숙주세포로부터 정제된다 (즉, 단백질은 생체 내에서 글리코실화되고 이후에 글리코단백질로서 정제된다.). 다양한 구체예에서, 숙주 세포로부터 정제 후 치료학적 단백질은 숙주 글리코단백질이거나 또는 아니고 그리고 시험관 내에서 글리코실화된다. 시험관내 글리코실화 방법은 해당 분야에서 잘 공지된다 (가령, Meynial-Salles I and　Combes D, Journal of Biotechnology 1996, 46:1-14;/ Sola RJ and Griebenow K, BioDrugs 2010, 24:9-21을 참고). 물론, 해당 분야의 통상의 기술자는 (1) 치료학적 단백질을 정제; (2) 치료학적 단백질을 변형 (가령, 아미노산 결실/삽입/치환)하여 시험관 내에서 선택적으로 부위-특이적, 글리코실화를 허용; 및 (3) 해당 분야에서 공지된 절차에 따라서 시험관내 변형된 단백질을 글리코실화할 수 있다.

D. 투여

한 가지 구체예에서, 본 발명의 접합된 치료학적 단백질은 주사, 가령, 정맥내, 근육내, 또는 복강내 주사로 투여될 수 있다.

본 발명의 접합된 치료학적 단백질을 포함하는 조성물을 인간 또는 시험 동물에게 투여하기 위해, 하나의 측면에서, 상기 조성물은 하나 이상의 제약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 용어 "제약학적으로" 또는 "약물학적으로 허용되는"은 하기 설명된 바와 같이, 안정한 분자 독립체 및 조성물을 나타내고, 단백질 분해, 가령 집합체 및 절단 산물을 저해하고, 그리고 추가적으로 해당 분야에서 잘-공지된 경로를 이용하여 투여될 때 알러지성, 또는 기타 역반응을 유발하지 않는다. "제약학적으로 허용되는 담체"는 상기 개시된 이들 물질을 포함하여, 임상학적으로 유용한 용매, 분산 매체, 코팅제, 항박테리아 및 항균제, 등장성 및 흡수지연제 등을 모두 포함한다.

본 명세서에서 설명된 바와 같이, "유효량"은 질병 또는 질환을 치료하기 위해 또는 질병 또는 질환의 증상을 개선시키기 위해 적합한 용량을 포함한다. 한 가지 구체예에서, "유효량"은 본 명세서에서 설명된 바와 같은 출혈 질환을 가진 포유류를 치료하기 위해 적절한 용량을 포함한다.

조성물은 경구로, 국부적으로, 경피로, 비경구로, 흡입 스프레이로, 질로, 직장으로, 또는 두개내 주사로 투여될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 비경구는 피하 주사, 정맥내, 근육내, 조내 주사, 또는 주입 기술을 포함한다. 정맥내, 피내, 근육내, 유방내, 복강내, 경막내, 안구후, 폐내 주사에 의한 투여 및 또는 특정 부위에서의 수술 이식이 또한 고려된다. 일반적으로, 조성물은 발열원, 그리고 수여자에서 유해할 수 있는 기타 불순물에 기본적으로 자유롭다.

조성물의 단일 또는 다수 투여는 내과의사에 의해 선택되는 용량 레벨 및 양식으로 수행될 수 있다. 질병의 예방 또는 치료를 위해, 적절한 용량은 약물이 예방 또는 치료 목적, 이전(previous) 요법, 약물에 대한 반응 및 환자의 병력, 및 담당 의사의 재량에 따라 투여되는 것에 상관없이, 상기 설명된 바와 같이, 치료되어야할 질병의 유형, 질병의 중증도 및 전개에 의존할 것이다.

본 발명은 본 명세서에서 설명된 바와 같은 접합된 치료학적 단백질의 유효량을 포함하는 제약학적 조성물과 또한 관련된다. 제약학적 조성물은 제약학적으로 허용되는 담체, 희석제, 염, 완충액, 또는 부형제를 추가로 포함한다. 제약학적 조성물은 상기-정의된 출혈 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 제약학적 조성물은 용액 또는 동결건조 산물일 수 있다. 제약학적 조성물의 용액은 임의의 적절한 동결건조 공정을 겪을 수 있다. 추가적인 측면으로서, 본 발명은 개체에게 투여를 위한 이의 용도를 촉진하는 방식으로 포장된 본 발명의 조성물을 포함한 키트를 포함한다. 한 가지 구체예에서, 이러한 키트는 본 명세서에서 설명된 화합물 또는 조성물 (가령, 접합된 치료학적 단백질을 포함하는 조성물)을 포함하며, 이는 용기, 가령 용기에 부착된 라벨이 있는 봉인된 병 또는 관에 포장되거나 또는 방법을 실시하는 데에 있어 화합물 또는 조성물의 용도를 설명한 포장물에 포함된 다. 한 가지 구체예에서, 키트에는 접합된 치료학적 단백질을 포함한 조성물을 가진 첫 번째 용기 및 첫 번째 용기내 조성물을 위한 생리학적으로 허용되는 복원성 용액을 가진 두 번째 용기가 들어있다. 하나의 측면에서, 화합물 또는 조성물은 유닛 제형(dosage form)으로 포장된다. 키트는 투여의 특이적 경로에 따라 조성물을 투여하는 데에 적합한 장비를 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게, 키트에는 치료학적 단백질 또는 펩티드 조성물의 용도를 설명한 라벨이 들어있다.

지방산, 지방산 유도체, 및 단백질-지방산 유도체 접합체

하나의 측면에서, 본 명세서에서 제공된 치료학적 단백질 유도체 (즉, 접합된 치료학적 단백질) 분자는 수용성 지방산 유도체에 결합된다. 본 명세서에서 설명된 바와 같이, "수용성 지방산 유도체"는 본 명세서에서 설명된 바와 같은 수용성 연결자 (가령, 아미노옥시 연결자)에 접합된 지방산 (즉, 카르복실산)을 포함한다. 이러한 지방산 유도체는, 본 발명에 따라서, 안정하고 (즉, 단백질로부터 방출되지 않음), 수용성이며, 그리고 인간 혈청 알부민에 결합할 수 있다.

A. 지방산

지방산 (즉, FA 또는 FAs)은 본 발명에 따라 인간 혈청 알부민에 결합할 수 있는 포화된 지방산, 불포화된 지방산, 분지형 사슬 지방산 (Mukheriji et al., Prog Lipid Res 2003;42:359-76) 및 이의 유도체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

예로써, 지방산은 다음의 일반적인 구조를 갖는다:

포화된 FA: 일반적인 구조

포화된 FA 메틸 에스테르: 일반적인 구조

포화된 FA 에틸 에스테르: 일반적인 구조

본 발명의 다양한 구체예에 따라서, 지방산은 또한 다양한 대안적인 구조 (가령, 메틸- 또한 에틸 에스테르) 또는 기타 구조, 가령 ω-위치내 말단기 (가령, 하이드록실기, 아미노기, 티오기 및 카르복실기)를 함유한 것을 포함한다.

한 가지 구체예에서, 지방산은 자연적으로-발생한 지방산이다. 다양한 구체예에서, 지방산은 짧은 사슬 지방산 (가령, 6개 미만의 탄소), 중간 사슬 지방산 (가령, 6-12개 탄소), 긴 사슬 지방산 (가령, 12개 탄소보다 더 긴), 또는 매우 긴 사슬 지방산 (가령, 22개 탄소보다 더 긴)이다. 또 다른 구체예에서, 지방산은 4 내지 28개 탄소를 갖는다. 한 가지 구체예에서, 지방산은 시스(cis) 구조형태로 있다. 또 다른 구체예에서, 지방산은 트랜스(trans) 구조형태로 있다.

한 가지 구체예에서, 지방산은 12 내지 20개의 탄소 길이로 포화된 지방산이다. 이러한 지방산은 해당 분야에서 공지된다, 가령, C12 (도데칸산, 라우르산), C14 (테트라데칸산, 미리스트산), C16 (헥사데칸산, 팔미트산), C18 (옥타데칸산, 스테아르산) 및 C20 (에이코산산, 아라키드산). 불포화된 지방산의 예시는 미리스트올레산 (C14:1), 팔미톨레산(C16:1), 올레산 (C18:1), 리놀레산 (C18:2) 및 아라키돈산 (C20:4)이다. 대부분의 지방산은 상업적으로 이용가능하고 상이한 화학적 방법에 의해 제조될 수 있다 (Recent Developments in the Synthesis of Fatty Acid Derivatives, Editors: Knothe G and Derksen JTB, AOCS Press 1999, ISBN 1-893997-00-6.)

본 발명의 다양한 구체예에서, 지방산은 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 또는 50개 탄소를 포함한다.

B. 지방산 유도체

본 발명은 인간 혈청 알부민에 결합할 수 있는 신규한 종류의 활성화 지방산 유도체 (FA 유도체)의 제조법을 제공한다. FA 유도체는 수용성 스페이서(spacer) 또는 연결자를 함유하며, 이는 수성 용액내 FA 유도체의 처리 및 조작을 허용한다 (즉, 본 발명에 따른 지방산 유도체는 그들이 유래한 상응하는 지방산과는 달리, 수용성임). 한 가지 구체예에서, FA 유도체는 활성 아미노옥시기를 함유하며, 이는 치료학적 단백질의 산화된 탄수화물 모이어티 (대개 N-글리칸)와의 FA 유도체의 커플링을 허용하여 안정한 옥심 결합을 형성한다. 본 명세서에서 설명된 바와 같이, "안정한" 결합은 공유결합이 "비-방출적인" 또는 비-가수분해적인 것으로 형성된다는 것을 의미한다.

탄수화물을 통한 화학적 변형은 높은 잔효성(residual activity)을 가진 접합체를 형성하기 위해 FVIII, FIX 및 FVIIa와 같은 응고 단백질을 위한 바람직한 선택일 수 있다.

예로서 그리고 제한 없이, 다음 전략은 활성 아미노옥시기를 함유한 수용성 FA 유도체를 제조하기 위한 본 발명에 따른 한 가지 구체예를 나타낸다.

전략 1:

FA 유도체 (가령, 16-하이드록시헥사데칸산)의 ω-하이드록시기를 데스 마틴 퍼아이오디난으로 산화하여 알데하이드기를 발생시킨다. 다음 단계에서, 수용성 PEG 사슬 (가령, 3,6,9-트리아옥사운데칸-1,11-디옥시아민)을 함유한 디아미노옥시 연결자를 이 알데하이드기에 커플링시켜 안정한 옥심 결합을 형성한다. 다음 도식은 전략 1에 따른 한 가지 예시를 나타낸다:

단계 1: 16-하이드록시스테아르산을 데스-마틴 시약을 이용하여 선택적으로 산화하여 16-옥소스테아르산을 수득하였다. 분리제로서 실리카 겔을 이용하여 크로마토그래피로 미가공 산물을 정제하였다.

단계 2: 16-옥소스테아르산 나트륨 염의 16-옥소 모이어티를 3,6,9-트리아옥사운데칸-1,11-디옥시아민과 반응시켰다. 분리제로서 실리카 겔을 이용하여 크로마토그래피로 미가공 산물을 정제하였다.

대안적으로, 또 다른 구체예에서, 다음 전략을 이용하여 활성 아미노옥시기를 함유한 수용성 FA 유도체를 제조한다.

전략 2:

ω-하이드록시 지방산 (가령, 16-하이드록시헥사데칸산)의 카르복실기를 아세틸 클로라이드로 에스테르화한다. 이 메틸 에스테르 유도체의 ω-하이드록시기는 메실 클로라이드로 활성화하여 더 나은 이탈기를 도입한다. 이후 메실기는 수용성 PEG 사슬 (가령, 3,6,9-트리아옥사운데칸-1,11-디옥시아민)을 함유한 디아미노옥시 연결자와 반응시켜 안정한 아미노옥시-메틸렌 결합을 형성한다. 선택적으로 메틸 에스테르는 알칼리 용액에서 가수분해되어 유리 카르복실기를 발생시킬 수 있다. 다음 도식은 전략 2에 따른 한 가지 예시를 나타낸다:

단계 1: 메틸화 시약으로서 아세틸 클로라이드를 이용하여 메틸 에스테르를 형성함으로써 16-하이드록시헥사데칸산의 카르복실산 모이어티를 보호하였다.

단계 2: 더 나은 이탈기인, 메실로 하이드록시기를 치환함으로써 16-하이드록시헥사데칸산 메틸 에스테르의 16-하이드록시 모이어티를 활성화하였다.

단계 3: 이작용(bifunctional) 3,6,9-트리아옥사운데칸-1,11-디옥시아민의 한 가지 아미나옥시 모이어티에 의해 16-메틸설포닐헥사데칸산 메틸 에스테르의 16-메실 모이어티를 치환하였다. 분리제로서 실리카 겔을 이용하여 크로마토그래피로 미가공 산물을 정제한다.

또한 추가적인 전략이 본 발명에 의해 고려된다. 예를 들어, 본 발명은 산화된 탄수화물 잔기의 알데하이드기에 커플링시키기 위한 아미노옥시 화학으로 제한되지 않는다. 본 명세서에서 설명된 바와 같이, 알데하이드기에 커플링시키기 위한 하이드라지드, 아미노기에 커플링시키기 위한 NHS 에스테르 및 치료학적 단백질의 유리 SH-그룹에 커플링시키기 위한 말레이미드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 기타 화학의 용도가 또한 고려된다.

예로서, 상기 설명된 바와 같이 제조된 지방산 메틸 에스테르는 본 명세서에서 설명된 바와 같이 상업적으로-이용가능한 MAL-PEG-COOH (mal-PEG(12)-COOH / IRIS Biotech GmbH, Marktredwitz, Germany)와 반응된다. 또 다른 예로서, 반응성 아미노기를 가진 지방산 에스테르는 본 명세서에서 설명된 바와 같이 상업적으로 이용가능한 NHS-PEG-NHS (NHS-dPEG(4)-NHS / IRIS Biotech GmbH, Marktredwitz, Germany)와 반응된다.

수용성 연결자는 수용성 폴리머 (가령, PEG)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 연결자는 이의 물 용해도를 증가시키는 하나 이상의 작용기를 함유한 임의의 화학 구조로 구성될 수 있다. 이들 작용기는 음성 또는 양성 전하를 형성하는 능력을 가질 수 있고, 그렇게 함으로써 연결자 수용성을 만든다. 한 가지 구체예에서 이러한 작용기는 설포기 또는 카르복실기를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 추가적으로 임의의 극성 작용기는 연결자를 더욱 수용성으로 만드는 데에 이용될 수 있다. 이를 위한 예시는 하이드록실기, 아미노기, 아미도기, 말레이미도기, 아미노옥시기 및 하이드라지드기 그리고 N-하이드록시 석신이미드 (NHS) 에스테르 및 설포 NHS 에스테르이다.

다양한 구체예에서, 수용성 폴리머는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 분지형 PEG, 폴리시알산 (PSA), 하이드록시알킬 전분 (HAS), 하이드록시에틸 전분 (HES), 탄수화물, 다당류, 플루란, 키토산, 히알루론산, 콘드로이틴 설페이트, 데르마탄 설페이트, 전분, 덱스트란, 카르복시메틸-덱스트란, 폴리알킬렌 옥사이드 (PAO), 폴리알킬렌 글리콜 (PAG), 폴리프로필렌 글리콜 (PPG), 폴리옥사졸린, 폴리아크릴로일모르폴린, 폴리비닐 알코올 (PVA), 폴리카르복실레이트, 폴리비닐피롤리돈, 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린, 폴리에틸렌-코-말레산 무수물, 폴리스티렌-코-말레산 무수물, 폴리(1-하이드록실메틸에킬렌 하이드록시메틸포르말) (PHF), 2-메타아크릴로일옥시-2'-에틸트리메틸암모늄포스페이트 (MPC)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

한 가지 구체예에서, 수용성 폴리머는 PEG이다. 본 발명의 다양한 구체예에서, 수용성 폴리머는 대약적으로 3 내지 25개 산소의 사슬 길이를 포함한다. 예를 들어, 수용성 폴리머는 본 발명에 따른 다양한 구체예에서, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 또는 25개 산소를 포함한다.

C. 단백질-지방산 유도체 접합체

아미노옥시 연결자 시스템 (즉, 여기서 수용성 지방산 유도체는 아미노옥시 연결자를 포함함)은 본 발명에 의해 고려된다. 예를 들어, 본 발명의 한 가지 구체예에서, 옥심기를 형성하기 위해 (가령, 나트륨 퍼아이오데이트에 의한 산화 후 탄수화물 모이어티 상에서) 알데하이드와의 하이드록실아민 또는 하이드록실 아민 유도체의 반응이 단백질 접합체의 제조에 적용된다. 예를 들어, 글리코단백질 (가령, 본 발명에 따른 치료학적 단백질)은 산화제, 가령 나트륨 퍼아이오데이트 (NaIO4)로 일차 산화된다 (Rothfus JA et Smith EL., J Biol Chem 1963, 238, 1402-10; 및 Van Lenten L and Ashwell G., J Biol Chem 1971, 246, 1889-94). 글리코단백질의 퍼아이오데이트 산화는 활성 알데하이드기를 형성하기 위해 퍼아이오데이트를 이용한 인접한 디올의 산화인, 1928년에 설명된 고전적인 말라프레이드(Malaprade) 반응에 기반한다 (Malaprade L., Analytical application, Bull Soc Chim France, 1928, 43, 683-96). 이러한 산화제에 대한 추가적인 예시는 납 테트라아세테이트 (Pb(OAc)4), 망간 아세테이트 (MnO(Ac)3), 코발트 아세테이트 (Co(OAc)2), 탈륨 아세테이트 (TlOAc), 세륨 설페이트 (Ce(SO4)2) (US 4,367,309) 또는 칼륨 퍼루테네이트 (KRuO4) (Marko et al., J Am Chem Soc 1997,119, 12661-2)이다. "산화제"에 따르면, 약한 산화 화합물은 탄수화물내 인접한 디올을 산화하여, 그렇게 함으로써 생리학적 반응 조건 하에 활성 알데하이드기를 발생시킬 수 있는 것으로 의미된다.

두 번째 단계는 옥심 결합을 형성하기 위한 산화된 탄수화물 모이어티에 아미노옥시기를 함유한 폴리머 (가령, 지방산 유도체)의 커플링이다. 본 발명의 한 가지 구체예에서, 이 단계는 친핵성 촉매 아닐린 또는 아닐린 유도체의 촉매량의 존재에서 수행될 수 있다 (Dirksen A et Dawson PE, Bioconjugate Chem. 2008; Zeng Y et al., Nature Methods 2009;6:207-9). 아닐린 촉매는 매우 낮은 농도의 시약의 사용을 허용하는 옥심 결찰을 급격히 가속화한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서 옥심 결합은 NaCNBH3을 이용한 환원에 의해 안정화되어 알콕시아민 결합을 형성한다. 추가적인 촉매는 하기 설명된다. 또 다른 구체예에서, 이 단계는 m-톨루이딘의 존재에서 수행된다.

본 발명의 한 가지 구체예에서, 단백질에 수용성 연결자 (가령, 지방산 유도체)를 접합하기 위한 반응 단계는 별도로 및 연속적으로 수행된다 (즉, 시작 물질 (가령, 치료학적 단백질, 수용성 연결자, 등), 시약 (가령, 산화제, 아닐린, 등) 및 반응 산물 (가령, 치료학적 단백질 상의 산화된 탄수화물, 활성화 아미노옥시 수용성 연결자, 등)은 개별적인 반응 단계 사이에서 분리됨). 또 다른 구체예에서, 본 발명에 따른 접합 반응을 완료하는 데에 필수적인 시작 물질 및 시약은 단일 관에서 수행된다. 한 가지 구체예에서, 자연형 단백질은 아미노옥시- 폴리머 시약과 혼합된다. 이후에 산화 시약이 참가되고 접합 반응이 수행된다.

아미노옥시 기술 상의 추가적인 정보는 다음 참고문헌에서 찾을 수 있으며, 이들 각각은 이들 전체로 편입된다: EP 1681303A1 (HAS화(HASylated) 에리트로포이에틴); WO 2005/014024 (옥심 연결기에 의해 연결된 폴리머 및 단백질의 접합체); WO96/40662 (아미노옥시-함유 연결자 화합물 및 접합체에서의 이들의 적용); WO 2008/025856 (변형된 단백질); Peri F et al., Tetrahedron 1998, 54, 12269-78; Kubler-Kielb J and Pozsgay V., J Org Chem 2005, 70, 6887-90; Lees A et al., Vaccine 2006, 24(6), 716-29; 및 Heredia KL et al., Macromolecules 2007, 40(14), 4772-9.

가령, 단백질 상의 유리 설프히드릴기 또는 유리 아미노기를 통하여 또는 본 명세서에서 설명된 연결자 분자를 통하여, 단백질에 직접적으로 커플링시킴으로써 수용성 연결자의 커플링이 수행될 수 있다. 하나의 측면에서 접합은 안정한 결합의 형성 하에 치료학적 단백질에 수용성 연결자의 직접적인 커플링 (또는 연결자 시스템을 통하여 커플링)에 의해 수행된다.

따라서, 본 발명의 다양한 구체예에서, 본 명세서에서 설명된 지방산 유도체는 치료학적 단백질에 접합을 허용하는 것으로 설계된다. 예를 들어, 지방산 유도체는 본 명세서에서 설명된 바와 같이, 다양한 말단 반응기를 포함하는 것으로 설계된다.

특정한 측면에서, 치료학적 단백질은 다양한 화학적 방법 중 어느 하나에 의해 수용성 지방산 유도체에 접합된다 (Roberts JM et al., Advan Drug Delivery Rev 2002;54:459-76). 예를 들어, 한 가지 구체예에서 치료학적 단백질은 N-하이드록시석신이미드 (NHS) 에스테르를 이용하여 단백질의 유리 아미노기에 지방산의 유도체의 접합으로 변형된다. 또 다른 구체예에서 수용성 지방산 유도체는 말레이미드 화학을 이용하여 유리 SH 기에 커플링된다. 또 다른 구체예에서 수용성 지방산 유도체는 앞선 산화 후 하이드라지드 또는 아미노옥시 화학의 용도에 의해 치료학적 단백질의 탄수화물 모이어티에 커플링된다.

본 발명의 한 가지 구체예에서, 치료학적 단백질은 N-하이드록시석신이미드 (NHS) 에스테르를 함유한 수용성 지방산 유도체의 이용에 의해 리신 잔기를 통하여 변형된다. 이 유도체는 안정한 아미드 결합을 형성함으로써 약한 조건 하에 치료학적 단백질의 리신 잔기와 반응한다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 단백질 또는 지방산 유도체 중 어느 하나의 카르복실기와 단백질 또는 지방산 유도체의 아민기 사이의 펩티드 결합을 통한 결합, 또는 단백질 또는 지방산 유도체의 카르복실기와 치료학적 단백질 또는 지방산 유도체의 하이드록실기 사이의 에스테르 결합이 고려된다. 치료학적 단백질이 지방산 유도체에 공유결합으로 결합되게 하는 또 다른 결합은 가령, 지방산의 말단 끝에서 형성된 알데하이드기와 반응하는 단백질 상의 유리 아미노기 사이의 쉬프(Schiff) 염기를 통해 일어난다. 발생된 쉬프 염기는 하나의 측면에서 NaCNBH3을 이용한 특이적 환원에 의해 안정화되어 이차 아민을 형성한다. 대안적인 기법은 앞선 산화 후 NH4Cl을 이용한 환원성 아민화에 의한 지방산 유도체내 말단 유리 아미노기의 발생이다. 두 개의 아미노기 또는 두 개의 하이드록실기를 연결하기 위해 이작용 시약이 사용될 수 있다. 예를 들어, 아미노기를 함유한 지방산 유도체는 BS3 (비스(설포석신이미딜)수버레이트 / Pierce, Rockford, IL)과 같은 시약을 가진 단백질의 아미노기에 커플링된다. 추가적으로 Sulfo-EMCS (N-ε-말레이디도카프로일옥시) 설포석신이미드 에스테르/ Pierce)와 같은 이종이작용(heterobifunctional) 가교 시약이 예를 들어 아민기 및 티올기를 연결하는 데에 사용된다.

또 다른 기법에서, 활성 하이드라지드기를 가진 지방산 유도체는 제조되고 그리고 앞선 산화 및 알데하이드 기능의 발생 후 단백질의 탄수화물 모이어티에 커플링된다.

상기 설명된 바와 같이, 치료학적 단백질의 유리 아민기는 지방산 유도체의 1-카르복실기와 반응하여 펩티딜 결합을 형성하거나 또는 단백질 상의 1-카르복실산 기 및 하이드록실기 또는 기타 적합한 활성기 사이에서 에스테르 결합이 형성된다.

다양한 구체예에서, 치료학적 단백질은 화학량적 양으로 지방산 유도체와 연결되거나 연관된다 (가령, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:7, 1:8, 1:9, 또는 1:10 등). 다양한 구체예에서, 1-6, 7-12 또는 13-20개 지방산 유도체는 단백질과 연결된다. 또 다른 구체예에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 이상의 지방산 유도체는 단백질과 연결된다.

다양한 구체예에서, 치료학적 단백질은 변형되어 글리코실화 부위 (즉, 자연형 글리코실화 부위 외에 부위)로 도입된다. 이러한 변형은 해당 분야에서 공지된 표준 분자의 생물학적 기술을 이용하여 수행될 수 있다. 더욱이, 치료학적 단백질은, 하나 이상의 탄수화물 모이어티를 통한 수용성 연결자와의 접합에 앞서, 생체내 또는 시험관 내에서 글리코실화될 수 있다. 이들 글리코실화 부위는 수용성 연결자와의 단백질의 접합을 위한 타겟으로서 역할할 수 있다 (미국 특허 출원 제20090028822호, 미국 특허 출원 제2009/0093399호, 미국 특허 출원 제2009/0081188호, 미국 특허 출원 제2007/0254836호, 미국 특허 출원 제2006/0111279호, 및 DeFrees S. et al., Glycobiology, 2006, 16, 9, 833-43).

한 가지 구체예에서, 접합된 단백질은 자연형 치료학적 단백질 산물의 전체 기능 활성도를 유지하고, 그리고 자연형 치료학적 단백질 산물과 비교하여, 생체 내에서 연장된 반감기를 제공한다. 또 다른 구체예에서, 접합된 단백질은 자연형 단백질에 비해 적어도 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44. 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56,57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 또는 150 퍼센트 (%) 생물학적 활성도를 보유한다.

관련된 측면에서, 접합된 단백질 및 자연형 혈액 응고 단백질의 생물학적 활성도는 발색성 활성도 대 혈액 응고 인자 항원 값 (혈액 응고 인자:Chr: 혈액 응고 인자:Ag)의 비에 의해 결정된다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 접합된 단백질의 반감기는 자연형 치료학적 단백질의 생체내 반감기에 비해 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10-배 감소되거나 또는 증가된다.

친핵성 촉매

본 명세서에서 설명된 바와 같이, 치료학적 단백질에 수용성 지방산 유도체의 접합은 아닐린에 의해 촉매될 수 있다. 아닐린은 아민과의 알데하이드 및 케톤의 수성 반응을 강하게 촉매하여 하이드라존 및 옥심과 같은 안정한 이민을 형성한다. 다음 도식은 비촉매화 대 아닐린-촉매화 옥심 결찰 반응을 비교한다 (Kohler JJ, ChemBioChem 2009;10:2147-50으로부터 개작됨).

하지만, 아닐린과 연관된 수많은 건강 위험요소를 고려하면, 대안적인 촉매가 바람직하다. 본 발명은 대안적인 옥심 결찰 촉매로서 아닐린 유도체를 제공한다. 이러한 아닐린 유도체는 o-아미노 벤조산, m-아미노 벤조산, p-아미노 벤조산, 설파닐산, o-아미노벤즈아미드, o-톨루이딘, m-톨루이딘, p-톨루이딘, o-아니시딘, m-아니시딘, 및 p-아니시딘을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 다음 도식은 비촉매화 대 m-톨루이딘-촉매화 옥심 결찰 반응을 비교한다 (PCT/US2011/45873):

본 발명의 한 가지 구체예에서, m-톨루이딘 (메타-톨루이딘, m-메틸아닐린, 3-메틸아닐린, 또는 3-아미노-1-메틸벤젠으로도 알려짐)은 본 명세서에서 설명된 접합 반응을 촉매하는 데에 사용된다. M-톨루이딘 및 아닐린은 유사한 물리적 특성 및 본질적으로 동일한 pKa 값 (m-톨루이딘:pKa 4.73, 아닐린:pKa 4.63)을 갖는다.

본 발명의 친핵성 촉매는 옥심 결찰 (가령, 아미노옥시 결합을 이용) 또는 하이드라존 형성 (가령, 하이드라지드 화학을 이용)을 위해 유용하다. 본 발명의 다양한 구체예에서, 친핵성 촉매는 0.1, 0.2, 0.3, 0.5, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50 mM의 농도로 접합 반응에서 제공된다. 한 가지 구체예에서, 친핵성 촉매는 1 내지 10 mM로 제공된다. 본 발명의 다양한 구체예에서, 접합 반응의 pH의 범위는 4.0 내지 7.0, 4.5 내지 7.0, 5.0 내지 6.5, 5.0 내지 6.5이다. 다양한 구체예에서, 접합 반응의 pH는 pH 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0 및 7.5이다. 한 가지 구체예에서, pH는 5.5 내지 6.5이다.

접합된 단백질의 정제

다양한 구체예에서, 본 발명에 따라서 산화제와 인큐베이션되었던 단백질 및/또는 수용성 지방산 유도체와 접합되었던 치료학적 단백질의 정제가 바람직하다. 수많은 정제 기술은 해당 분야에서 공지되고 그리고 크로마토그래피 방법, 여과 방법, 및 침전 방법을 제한 없이 포함한다 (가령, Guide to Protein Purification, Meth. Enzymology Vol 463 (edited by Burgess RR and Deutscher MP), 2nd edition, Academic Press 2009를 참고).

다음 실시예는 제한되는 것으로 의도된 것이 아니라 본 발명의 특정 구체예의 예시일 뿐이다.

실시예

실시예 1

동종이작용(homobifunctional) 연결자 NH ₂ [OCH ₂ CH ₂ ] ₂ ONH ₂ 의 제조

동종이작용 연결자 NH₂[OCH₂CH₂]₂ONH₂

Boturyn et al. (Tetrahedron 1997;53:5485-92)에 따라 일차 아민의 변형된 가브리엘-합성법(Gabriel-Synthesis)을 활용한 두 단계의 유기 반응으로 두 개의 활성 아미노옥시기를 함유한 3옥사펜탄-1,5-디옥시아민을 합성하였다 (도 1). 첫 번째 단계에서, 2,2-디클로로디에틸에테르의 하나의 분자를 DMF내 엔도-N-하이드록시-5-노르보르넨-2,3-디카르복시미드의 두 개의 분자와 반응시켰다. 에탄올내 하이드라진분해에 의한 결과적 중간체로부터 바람직한 동종이작용 산물을 제조하였다.

실시예 2

동종이작용 연결자 NH ₂ [OCH ₂ CH ₂ ] ₆ ONH ₂ 의 제조

동종이작용 연결자 NH₂[OCH₂CH₂]₆ONH₂

Boturyn et al. (Tetrahedron 1997;53:5485-92)에 따라 일차 아민의 변형된 가브리엘-합성법을 활용한 두 단계의 유기 반응으로 두 개의 활성 아미노옥시기를 함유한 3,6,9,12,15-펜타옥사-헵타데칸-1,17-디옥시아민을 합성하였다. 첫 번째 단계에서, 헥사에틸렌 글리콜 디클로라이드의 하나의 분자를 DMF내 엔도-N-하이드록시-5-노르보르넨-2,3-디카르복시미드의 두 개의 분자와 반응시켰다. 에탄올내 하이드라진분해에 의한 결과적 중간체로부터 바람직한 동종이작용 산물을 제조하였다.

실시예 3

동종이작용 연결자 NH ₂ [OCH ₂ CH ₂ ] ₄ ONH ₂ 의 제조

Boturyn et al. (Tetrahedron 1997;53:5485-92)에 따라 일차 아민의 변형된 가브리엘-합성법을 활용한 두 단계의 유기 반응으로 두 개의 활성 아미노옥시기를 함유한 동종이작용 연결자 NH₂[OCH₂CH₂]₄ONH₂ (3,6,9-트리아옥사운데칸-1,11-디옥시아민)를 합성하였다: 첫 번째 단계에서, 비스-(2-(2-클로로에톡시)-에틸)-에테르의 하나의 분자를 DMF내 엔도-N-하이드록시-5-노르보르넨-2,3-디카르복시미드의 두 개의 분자와 반응시켰다. 에탄올내 하이드라진분해에 의한 결과적 중간체로부터 최종 동종이작용 산물을 제조하였다.

실시예 4

16-(2-(2-(2-(2-아미노옥시에톡시)-에톡시)-에톡시)-에톡시이미노)-헥사데칸산 나트륨 염의 제조

Halligan and Nair (Arkivoc 2006 (ii) 101-106) 및 Hubbs and Heathcock (J Am Chem Soc, 2003;125:12836-43)에 따라 두단계 반응으로 지방산-아미노옥시 연결자 16-(2-(2-(2-(2-아미노옥시에톡시)-에톡시)-에톡시)-에톡시이미노)-헥사데칸산 나트륨 염을 합성하였다.

중간체 1: 16-옥소헥사데칸산 나트륨 염

디클로로메탄 (10ml) 및 테트라하이드로푸란 (20ml)내 16-하이드록시헥사데칸산 (800 mg, 2.9 mmol)의 냉각시킨 용액 (0℃)에 데스-마틴 퍼아이오디난 (1636 mg, 3.7 mmol)을 0℃에서 첨가하였다. 혼합물을 Ar-대기(atmosphere) 하에 0℃에서 3.5시간 동안 그리고 실온에서 2.5시간 동안 교반하였다. 이후 포화된 나트륨 바이카르보네이트 용액내 나트륨 티오설페이트의 15%-용액을 첨가하였고, 혼합물을 1.5시간 동안 실온에서 교반하였다. 디에틸에테르로 중간체 1을 추출하였고, 나트륨 설페이트로 건조시킨 후 유기층을 건조상태까지 증발시켰고 그리고 분리제로서 실리카 겔 및 톨루엔 / 에틸아세테이드의 용매 혼합물을 이용한 칼럼 크로마토그래피로 정제하였다. 수득률: 34% (백색 고형).

산물: 16-(2-(2-(2-(2-아미노옥시에톡시)-에톡시)-에톡시)-에톡시이미노)-헥사데칸산 나트륨 염

무수 테트라하이드로푸란 (3ml)내 3,6,9-트리아옥사운데칸-1,11-디옥시아민 (146mg, 0.65mmol)의 용액에 중간체 1 (19.1 mg, 0.07 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 Ar-대기 하에 실온에서 1.5시간 동안 교반하였다. 이후 혼합물을 건조상태까지 증발시켰고 그리고 분리제로서 실리카 겔 및 디클로로메탄 / 메탄올 / 후니그 염기의 용매 혼합물을 이용한 칼럼 크로마토그래피로 정제하였다. 수득률: 71% (백색 고형).

질량 분석법 (ESI): m/z = [M+2H]⁺에 대해 477,3529

실시예 5

16-(2-(2-(2-(2-아미노옥시에톡시)-에톡시)-에톡시)-에톡시아미노)-헥사데칸산 메틸 에스테르의 제조

Hang et al. (J Am Chem Soc 2007;129:2744-5)에 따라 세 단계 반응으로 지방산 메틸 에스테르-아미노옥시 연결자 16-(2-(2-(2-(2-아미노옥시에톡시)-에톡시)-에톡시)-에톡시아미노)-헥사데칸산 메틸 에스테르를 합성하였다.

중간체 1: 16-하이드록시헥사데칸산 메틸 에스테르

무수 메탄올 (27 ml)내 16-하이드록시헥사데칸산 (3000 mg, 10.79mmol)의 냉각된 용액 (0℃)에 아세틸 클로라이드 (3.837 ml, 53.96 mmol)를 2분 내에 0℃에서 점적하여 첨가하였고, 이후 혼합물을 Ar-대기 하에 3.5시간 동안 실온에서 교반하였다. 그 다음에 혼합물을 건조상태까지 증발시켰고, 잔여물을 디클로로메탄 (100 ml)에서 용해시켰고, 포화된 나트륨 바이카르보네이트 용액 (2x50ml) 및 염수(Brine) 용액 (1x50 ml)으로 세척하였다. 나트륨 설페이트로 건조시킨 후 수집된 유기층을 건조상태까지 증발하였고 그리고 실온에서 진공 건조시켰다. 수득률: 92% (백색 고형).

중간체 2: 16-메틸설포닐헥사데칸산 메틸 에스테르

디클로로메탄 (40ml)내 중간체 1 (2807 mg, 9.80 mmol)의 냉각된 용액 (0℃)에 트리에틸아민 (1.502 ml, 10.78mmol)을 첨가하였고, 이후 디클로로메탄 (5ml)내 메실 클로라이드 (0.834ml, 10.78 mmol)의 사전냉각된 용액 (0℃)을 0℃에서 10분 내에 점적하여 첨가하였다. 혼합물을 0℃에서 30분 동안 및 실온에서 2.75시간 동안 교반하였다. 이후 혼합물을 디클로로메탄 (150 ml)으로 희석하였고, 물 (1x100 ml), 포화된 나트륨 바이카르보네이트 용액 (2x100 ml) 및 염수 용액(1x100 ml)으로 세척하였다. 나트륨 설페이트로 건조시킨 후 수집된 유기층을 건조상태까지 증발시켰고 그리고 실온에서 진공 건조시켰다. 수득률: 95% (백색 옅은 황색 고형).

산물: 16-(2-(2-(2-(2-아미노옥시에톡시)-에톡시)-에톡시)-에톡시아미노)-헥사-데칸산 메틸 에스테르

무수 N,N-디메틸포름아미드 (22 ml)내 3,6,9-트리아옥사운데칸-1,11-디옥시아민 (517 mg, 2.30 mmol)의 용액에 무수 N,N-디메틸포름아미드 (7ml)내 중간체 2 (70 mg, 0.19mmol)의 용액을 Ar-대기 하에 실온에서 1시간 동안 점적하여 첨가하였고; 혼합물을 상이한 온도 (실온, 50℃, 80℃)에서 2일 동안 교반하여 반응을 완성시켰다. 이후 혼합물을 건조상태까지 증발시켰고, 분리제로서 실리카 겔 및 디클로로메탄 / 메탄올의 용매 혼합물을 이용한 칼럼 크로마토그래피로 미가공 산물을 정제하였다. 수득률: 31% (무색의 부분적으로 굳은 백색 오일).

질량 분석법 (ESI): m/z = [M+H]⁺에 대해 493,3824

실시예 6

응고 인자 VIII의 탄수화물 모이어티에 16-(2-(2-(2-(2-아미노옥시에톡시)-에톡시)-에톡시)-에톡시아미노)-헥사-데칸산 메틸 에스테르의 커플링

두-단계 절차를 이용함으로써 FA-rFVIII을 제조한다. 첫 번째 단계에서 rFVIII을 NaIO₄로 산화하고 음이온 교환 크로마토그래피 (AEC)로 정제한다. 그 다음에 산화된 rFVIII을 FA-아미노옥시 시약으로 변형시킨다.

rFVIII (45mg의 시작 물질)을 NaIO₄로 산화한다 (최종 농도 200 μM). 30분의 인큐베이션 시간 후 (22℃), 1 M 수성 L-시스테인 용액을 첨가함으로써 산화 반응을 중지시킨다 (최종 농도: 10 mM). 산화된 rFVIII을 EMD TMAE(M) 상에서 음이온 교환 크로마토그래피로 정제한다. 이후 DMSO내 16-(2-(2-(2-(2-아미노옥시에톡시)-에톡시)-에톡시)-에톡시아미노)-헥사-데칸산 메틸 에스테르의 10% (w/v) 용액 25 μl (실시예 3에 따라 제조됨)를 용출액 (단백질 농도 2 mg/ml)에 첨가하고 그리고 커플링 반응을 4℃에서 18시간 동안 수행한다. 이후 페닐 세파로오스(Phenyl Sepharose) 4 FF 상에서의 HIC로 FA-rFVIII 접합체를 추가 정제한다. 최종적으로 30kD 막 (MILLIPORE)을 이용한 UF/DF로 용출액을 농축시킨다.

실시예 7

응고 인자 IX의 탄수화물 모이어티에 16-(2-(2-(2-(2-아미노옥시에톡시)-에톡시)-에톡시)-에톡시아미노)-헥사-데칸산 메틸 에스테르의 커플링

10 mg rFIX를 반응 완충액 (20　mM L-히스티딘, 5　mM CaCl₂, 150　mM NaCl, pH　6.0)에서 용해시켜 2.5 mg/ml의 최종 농도를 제공한다. 이 용액에 5mM 수성 NaIO₄ 용액을 첨가하여 100μM의 최종 농도를 얻는다. 어두운 곳에서 부드러운 교반 하에 4℃에서 1시간 동안 반응 혼합물을 인큐베이션하였다. 이후 초과 NaIO₄의 제거를 위해 사전-평형된 PD-10 탈염(desalting) 칼럼 상에 혼합물을 로딩한다. 이 혼합물에 DMSO내 16-(2-(2-(2-(2-아미노옥시에톡시)-에톡시)-에톡시)-에톡시아미노)-헥사-데칸산 메틸 에스테르의 10% (w/v) 용액 8μl (실시예 3에 따라 제조됨)를 첨가하고 그리고 4℃에서 18시간 동안 pH 6.0에서 커플링 반응을 수행한다. 이후 Q-세파로오스 FF 상에서의 IEX로 접합체를 추가 정제한다. 최종적으로 비바스핀(Vivaspin) 장비를 이용한 UF/DF로 용출액을 농축시킨다.

실시예 8

응고 인자 VIIa의 탄수화물 모이어티에 16-(2-(2-(2-(2-아미노옥시에톡시)-에톡시)-에톡시)-에톡시아미노)-헥사-데칸산 메틸 에스테르의 커플링

10 mg rFVIIa를 반응 완충액 ((50 mM Hepes, 150 mM 나트륨 클로라이드, 5　mM 칼슘 클로라이드, pH 6.0)에서 용해시켜 2.0 mg/ml의 최종 농도를 제공한다. 이 용액에 5 mM 수성 NaIO₄ 용액을 첨가하여 50 μM의 최종 농도를 얻는다. 어두운 곳에서 부드러운 교반 하에 4℃에서 1시간 동안 반응 혼합물을 인큐베이션한다. 이후 초과 NaIO₄의 제거를 위해 사전-평형된 PD-10 탈염 칼럼 상에 혼합물을 로딩한다. 이 혼합물에 DMSO내 16-(2-(2-(2-(2-아미노옥시에톡시)-에톡시)-에톡시)-에톡시아미노)-헥사-데칸산 메틸 에스테르의 10% (w/v) 용액 8μl (실시예 3에 따라 제조됨)을 첨가하고 그리고 4℃에서 18시간 동안 pH 6.0에서 커플링 반응을 수행한다. 이후 Q-세파로오스 FF상에서의 IEX로 접합체를 추가 정제한다. 최종적으로 비바스핀 장비를 이용한 UF/DF로 용출액을 농축시킨다.

실시예 9

10 mg rFVIII을 Hepes-완충액 (50 mM Hepes, 150 mM NaCl, 5 mM 칼슘 클로라이드, pH 6.0)에서 용해시켜 2 mg/ml의 단백질 농도를 얻었다. 이후 DMSO내 16-(2-(2-(2-(2-아미노옥시에톡시)-에톡시)-에톡시)-에톡시아미노)-헥사-데칸산 메틸 에스테르의 10% (w/v) 용액 10μl (실시예 3에 따라 제조됨)를 FVIII 용액에 첨가한다. 그 다음에 친핵성 촉매 m-톨루이딘 (50 mM)의 수성 용액을 제조하고 그리고 15분 내에 혼합물에 첨가하여 10 mM의 최종 농도를 얻는다. 최종적으로 40 mM 수성 나트륨 퍼아이오데이트 용액을 첨가하여 400 μM의 농도를 제공한다. 부드러운 교반 하에 22℃의 온도에서의 어두운 곳에서 120분 동안 반응 혼합물을 인큐베이션한다. 이후 수성 L-시스테인 용액 (1 M)을 첨가함으로써 반응을 중지시켜 반응 혼합물내 10 mM의 최종 농도 및 60분 동안의 인큐베이션을 제공한다. 그 다음에 Q-세파로오스 FF로 채워진 IEX 칼럼 (1.6 x 8 cm)상에 반응 혼합물을 로딩하였다. 칼럼을 20 칼럼 부피의 평형 완충액 (20 mM Hepes, 5 mM CaCl₂, pH 7.4)으로 세척하고 그리고 완충액 B (20 mM Hepes, 5. mM CaCl₂, 0.5 M NaCl, pH 7.4)로 FA-rFVIII 접합체를 용출한다. 최종적으로 정용여과(diafiltration) 완충액으로서 Hepes 완충액, 7.4 (20 mM Hepes, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl₂, pH 7.4)을 이용하여 비바스핀 장비로 산물을 UF/DF 처리한다.

실시예 10

7 mg rFIX를 His - 완충액 (20 mM His, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl₂, pH 6.0)에서 용해시켜 2 mg/ml의 단백질 농도를 얻는다. 이후 DMSO내 16-(2-(2-(2-(2-아미노옥시에톡시)-에톡시)-에톡시)-에톡시아미노)-헥사-데칸산 메틸 에스테르의 10% (w/v) 용액 7μl (실시예 3에 따라 제조됨)를 FIX 용액에 첨가한다. 이후 친핵성 촉매 m-톨루이딘 (50 mM)의 수성 용액을 제조하고 그리고 15분 내에 혼합물에 첨가하여 10 mM의 최종 농도를 얻는다. 최종적으로 40 mM 수성 나트륨 퍼아이오데이트 용액을 첨가하여 250 μM의 농도를 얻는다. 부드러운 교반 하에 22℃의 온도에서의 어두운 곳에서 120분 동안 반응 혼합물을 인큐베이션한다. 그 다음에 실온에서 30분 동안 L-시스테인의 첨가로 반응을 퀀칭한다 (최종 농도: 5 mM).

음이온 교환 크로마토그래피로 FA-rFIX 접합체를 정제한다. 반응 혼합물을 10 ml 완충액 A (50 mM Hepes, 5 mM CaCl₂, pH 7.5)로 희석하고 그리고 완충액 A로 평형된 5ml HiTrap Q FF 칼럼 (GE Healthcare, Fairfield, CT) 상에 로딩한다. 동일한 완충액을 이용한 5 CV로 칼럼을 세척한다. 이후 완충액 B (50 mM Hepes, 1 M NaCl, 5 mM CaCl₂, pH 7.5)로 칼럼을 용출한다. 재생된 셀룰로오스로 만든 10 kD 막을 이용한 UF/DF로 접합체 함유 단편을 농축시킨다. 150 mM NaCl 및 5 mM CaCl₂를 함유한 20 mM Hepes 완충액, pH 7.2에 대해 최종 정용여과 단계를 수행한다.

실시예 11

10 mg rFVIIa를 Hepes 완충액 (50 mM Hepes, 150 mM 나트륨 클로라이드, 5　mM 칼슘 클로라이드, pH 6.0)에서 용해시킨다. 이후 DMSO내 16-(2-(2-(2-(2-아미노옥시에톡시)-에톡시)-에톡시)-에톡시아미노)-헥사-데칸산 메틸 에스테르의 10% (w/v) 용액 10 μl (실시예 3에 따라 제조됨)를 FVIIa에 첨가한다. 그 다음에 친핵성 촉매 m-톨루이딘 (50 mM)의 수성 용액을 제조하고 15분 내에 혼합물에 첨가하여 10 mM의 최종 농도를 얻는다. 최종적으로, 40 mM 수성 나트륨 퍼아이오데이트 용액을 첨가하여 250 μM의 농도를 얻는다. 부드러운 교반 하에 22℃의 온도에서의 어두운 곳에서 120분 동안 반응 혼합물을 인큐베이션 한다. 그 다음 실온에서 30분 동안 L-시스테인의 첨가로 반응을 퀀칭한다 (최종 농도: 5 mM). 음이온 교환 크로마토그래피로 FA-rFVIIa 접합체를 정제한다. 반응물을 10 ml 완충액 A (50 mM Hepes, pH 7.4)으로 희석하고 완충액 A로 평형된 5 ml HiTrap Q FF 칼럼 (GE Healthcare, Fairfield, CT) 상에 로딩한다. 동일한 완충액을 이용한 5 CV로 칼럼을 세척한다. 이후 완충액 B (50 mM Hepes, 1 M NaCl, 5 mM CaCl₂, pH 7.4)로 칼럼을 용출한다. 재생된 셀룰로오스로 만든 10 kD 막을 이용한 UF/DF로 접합체 함유 단편을 농축시킨다. 150 mM NaCl 및 5 mM CaCl₂를 함유한 20 mM Hepes 완충액, pH 7.2에 대해 최종 정용여과 단계를 수행한다.

실시예 12

친핵성 촉매의 존재에서 산화된 탄수화물 모이어티에 활성 아미노옥시기를 함유한 FA 유도체의 커플링

산화된 치료학적 단백질 (가령, 본 명세서의 표 1에서 제시된 단백질)에 활성 아미노옥시기를 함유한 FA 유도체의 커플링이 또한 제공된다.

아미노옥시기를 함유한 FA 유도체의 커플링을 위하여, 치료학적 단백질 (가령, EPO, G-CSF, 또는 인슐린; 표 1을 참고; 농도: 0.5-3 mg/ml)의 탄수화물 모이어티 (대부분 N-글리칸)를 NaIO₄ (농도: 200 μM)로 일차 산화한다. 이후 L-시스테인의 첨가로 반응을 중지시키고 (최종 농도: 5 mM) 그리고 UF/DF로 시약을 분리한다. 정용여과 후 25 M 초과량을 이용하여 FA 아미노옥시 시약 (즉, FA 유도체)을 첨가하고 그리고 친핵성 촉매 m-톨루이딘 (농도: 10 mM)의 존재에서 부드러운 교반 하에 실온에서 1시간 동안 pH 6.0에서 커플링 반응을 수행한다. 그 다음 이온 교환 (IEX) 칼럼 상에 반응 혼합물을 로딩한다. > 5 CV 세척 완충액으로 칼럼을 세척하고 그리고 선형 NaCl 구배로 접합체를 용출한다. 최종적으로 접합체 함유 단편을 UF/DF 처리한다.

실시예 13

친핵성 촉매의 존재에서 산화된 탄수화물 모이어티에 활성 아미노옥시기를 함유한 FA유도체의 커플링

치료학적 단백질의 탄수화물 모이어티에 아미노옥시기를 함유한 FA 유도체의 커플링을 위하여, 친핵성 촉매 m-톨루이딘 (농도: 10 mM)의 존재에서 실온에서 1시간 동안 NaIO₄ (농도: 300 μM)와 pH 6.0에서 상기 단백질 (가령, EPO, G-CSF, 또는 인슐린; 표 1을 참고; 농도: 0.5-3 mg/ml)을 인큐베이션한다. 이후 L-시스테인의 첨가로 반응을 중지시키고 (최종 농도: 5 mM) 그리고 이온 교환 (IEX) 칼럼 상에 반응 혼합물을 로딩한다. > 5 CV 세척 완충액으로 칼럼을 세척하고 선형 NaCl 구배로 접합체를 용출한다. 최종적으로 접합체 함유 단편을 UF/DF 처리한다.

실시예 14

친핵성 촉매의 존재에서 산화된 혈액 응고 단백질에 활성 아미노옥시기를 함유한 FA 유도체의 커플링

2-20 mM의 농도 범위에서의 친핵성 촉매, 가령 m-톨루이딘의 존재에서 산화된 혈액 응고 단백질 (가령, 상기 실시예에서 설명된 바와 같은 FIX, FVIII 및 FVIIa)에 활성 아미노옥시기를 함유한 FA 유도체의 커플링을 수행할 수 있다.

실시예 15

수용성 MAL 지방산 연결자의 제조

ω-위치내 수용성 PEG 사슬을 함유한 지방산 연결자 및 활성 MAL기를 두-단계 합성법으로 제조한다:

단계 1: 16-하이드록시헥사데칸산 메틸 에스테르의 제조:

실시예 3에 따라 실온에서 5시간 동안 메탄올내 아세틸 클로라이드로 상업적으로 이용가능한 16-하이드록시헥사데칸산을 에스테르화하여 상응하는 메틸 에스테르를 제공한다 (Hang et al., Chemical probes for the rapid detection of fatty-acylated proteins in mammalian cells, JACS 2007;129:2744-5).

단계 2: MAL 지방산 연결자의 제조.

하룻밤 동안 실온에서 THF내 츠노부(Mitsunobu) 반응을 활용하여 상업적으로 이용가능한 MAL-PEG-COOH (mal-Peg(12)-COOH / IRIS Biotech GmbH, Marktredwitz, Germany)와 16-하이드록시헥사데칸산 메틸 에스테르를 반응시킨다 (Toyokuni et al., Synthesis of a New Heterobifunctional Linker, N-[4-(Aminooxy)butyl]-maleimide, for Facile Access to a Thiol-Reactive 18F-Labeling Agent, Bioconjugate Chem 2003;14:1253-9).

실시예 16

수용성 NHS 지방산 연결자의 제조

ω-위치내 수용성 PEG 사슬을 함유한 지방산 연결자 및 말단 활성 NHS 에스테르를 네-단계 합성법의 이용으로 제조한다:

단계1: 16-브로모헥사데칸산 메틸 에스테르의 제조

환류 온도에서 하룻밤 동안 메탄올 및 촉매량의 농축된 황산으로 상업적으로 이용가능한 16-브로모헥사데칸산을 에스테르화하여 상응하는 메틸 에스테르를 얻는다 (Zinic et al., Positionally Isomeric Organic Gelators: Structure-Gelation Study, Racemic versus Enantiomeric Gelators, and Solvation Effects, Chem Eur J 2010;16:3066-82).

단계 2: 16-아지도헥사데칸산 메틸 에스테르의 제조

환류 온도에서 4일 동안 아세토니트릴내 나트륨 아지드와 16-브로모헥사데칸산 메틸 에스테르를 반응시켜 상응하는 아지드를 제공한다 (Zinic et al., Positionally Isomeric Organic Gelators: Structure-Gelation Study, Racemic versus Enantiomeric Gelators, and Solvation Effects, Chem. Eur. J. 2010;16:3066-82).

단계 3: 16-아미노헥사데칸산 메틸 에스테르의 제조

3시간 동안 3bar에서 메탄올내 팔라듐 / 활성탄(activated charcoal)으로 16-아지도헥사데칸산 메틸 에스테르를 촉매적으로 수소화하여 상응하는 아민을 제공한다 (Zinic et al., Positionally Isomeric Organic Gelators: Structure-Gelation Study, Racemic versus Enantiomeric Gelators, and Solvation Effects, Chem. Eur. J. 2010;16:3066-82).

단계 4: NHS 지방산 연결자의 제조

3일 동안 실온에서 1,4-디옥산내 상업적으로 이용가능한 NHS-PEG-NHS (NHS-dPEG(4)-NHS / IRIS Biotech GmbH, Marktredwitz, Germany)와 16-아미노헥사데칸산 메틸 에스테르를 반응시켜 NHS 지방산 연결자를 제공한다 (Cline et al., The Aminolysis of N-Hydroxysuccinimide Esters. A Structure-Reactivity Study, JACS 1987;109:3087-91).

실시예 17

단백질 FA 접합체의 분석 특징

본 명세서의 실시예에 따라 제조된 FA-rFVIII, rFIX 또는 FVIIa 샘플의 알부민 결합 특성을 효소 결합 면역흡착 분석 (ELISA) 시스템을 이용함으로써 시험관 내에서 입증한다. 인간 혈청 알부민 (HSA)을 표적으로 하는 다클론 항체로 96 웰 플레이트를 코팅한다. 다음 단계는 PBS-젤라틴 완충액으로 ELISA 플레이트를 차단하는 단계이다. 이후 HSA를 항체에 결합시키고 그 다음 FA-단백질 샘플에 결합시키며, 이를 상이한 농도까지 희석한다. 최종적으로 항-VIII, 항-FIX 또는 항 FVIIa 항체가 표지된 퍼옥시다아제로 HSA-단백질을 검출한다. 기질로서 테트라메틸-벤지딘 (TMB)을 이용하여 퍼옥시다아제 활성도를 검출한다. 발달된 색 강도를 450 nm에서 ELISA 판독기로 측정한다. x-축 상에서 상이한 샘플 농도 및 y-축 상에서 이들의 상응하는 흡수 값을 플롯팅함으로써 HSA와의 FA-단백질 샘플의 결합을 평가한다.

실시예 18

아미노옥시기를 함유한 수용성 페길화 지방산 연결자의 제조

지방산 카르복실기와 연결된 ω-위치에서의 아미노옥시 모이어티와 수용성 PEG 사슬을 함유한 지방산 연결자를 실시예 1에서 설명된 바와 같은 3-옥사펜탄-1,5-디옥시아민을 이용하여 세 단계 합성법으로 제조한다.

단계 1: N-(9-플루오레닐메톡시카르보닐)-3-옥사펜탄-l,5-디옥시아민의 제조

1시간 동안 주위온도에서 1,4-디옥산내 9-플루오레닐메틸클로로포르메이트와 3-옥사펜탄-1,5-디옥시아민을 반응시켰다. 감소된 압력 하에 용액을 증발시켰고 그리고 용매 혼합물로서 디클로로메탄 / 메탄올 20/1 (v/v)로 실리카 겔 크로마토그래피를 활용하여 미가공 산물을 정제하여 순수한 모노-FMOC 보호된 디옥시아민을 얻었다 (Boturyn et al., Synthesis of Fluorescent Probes for the Detection of Abasic Sites in DNA, Tetrahedron 1997; Vol.53, No.15, 5485-92).

단계 2: 헥사데칸산 (2-(2-(N-(9-플루오레닐메톡시카르보닐) 아미노옥시) 에톡시) 에톡시) 아미드의 제조

하룻밤 동안 주위 온도에서 THF내 상업적으로 이용가능한 팔미트산 N-하이드록시석신이미드 에스테르와 N-(9-플루오레닐메톡시카르보닐)-3-옥사펜탄-l,5-디옥시아민을 반응시켜 모노-FMOC 보호된 아미노옥시-지방산 접합체를 얻는다 (Jong et al., Synthesis of ceramides using N-hydroxysuccinimide esters, Journal of Lipid Research 1972; Vol.13, 819-22).

단계 3: 헥사데칸산 (2-(2-아미노옥시에톡시) 에톡시) 아미드의 제조

주위 온도에서 디클로로메탄내 피페리딘과 모노-FMOC 보호된 아미노옥시-지방산 접합체를 반응시켜 최종 산물로서 탈보호된 아미노옥시-지방산 연결자를 얻는다 (Boturyn et al., Synthesis of Fluorescent Probes for the Detection of Abasic Sites in DNA, Tetrahedron 1997; Vol.53, No.15, 5485-92).

실시예 19

A1PI와의 MAL 지방산 연결자의 커플링

실시예 15에서 설명된 바와 같이 미츠노부 반응을 활용하여 상업적으로 이용가능한 MAL-PEG-COOH (mal-Peg(12)-COOH / IRIS Biotech GmbH, Marktredwitz, Germany)와의 16-하이드록시헥사데칸산 메틸 에스테르의 반응으로 MAL기를 함유한 지방산 연결자를 제조한다. 이 연결자를 A1PI의 유리 SH-기에 커플링시킨다.

10 mg의 정제된 A1PI (농도: 1 mg/ml)를 반응 완충액 (20 mM 포스페이트, 5 mM EDTA, pH 7.0)에서 용해시키고 그리고 DMSO내 MAL 지방산 연결자의 5% (w/v) 용액 10 μL를 A1PI 용액에 첨가한다. 실온에서 2시간 동안 변형 반응을 수행하고 그 다음 L-시스테인을 이용하여 퀀칭 단계를 한다 (최종 농도: 10 mM). L-시스테인의 첨가 후 동일한 온도에서 추가로 한 시간 동안 부드러운 진탕 하에 반응 혼합물을 인큐베이션한다. 변형된 A1PI를 평형 완충액 (25 mM 포스페이트, pH 6.5)으로 희석하여 < 4.5 mS/cm까지 용액 전도율을 보정하고 그리고 5 ml의 칼럼 부피 (CV)를 가진 미리-포장된 HiTrap Q FF (GE-Healthcare) 상에 로딩한다. 이후 10 CV 평형 완충액 (유속: 2 ml/분)으로 상기 칼럼을 평형시킨다. 최종적으로 용출 완충액 (25 mM Na₂HPO₄. 1 M NaCl, pH 6.5)을 이용하여 선형 구배로 PEG-A1PI를 용출한다.

실시예 20

응고 인자 VIII과의 NHS 지방산 연결자의 커플링

실시예 16에서 설명된 바와 같이 상업적으로 이용가능한 NHS-PEG-NHS (NHS-dPEG(4)-NHS (IRIS Biotech GmbH, Marktredwitz, Germany)와의 16-하이드록시헥사데칸산 메틸 에스테르의 반응으로 NHS 기를 함유한 지방산 연결자를 제조한다. 이 연결자를 응고 인자 VIII의 리신 잔기의 유리 아미노기에 커플링시킨다.

10 mg rFVIII을 Hepes-완충액 (50 mM Hepes, 150 mM NaCl, 5 mM 칼슘 클로라이드, pH 6.0)에서 용해시켜 2 mg/ml의 단백질 농도를 제공한다. 이후 DMSO내 NHS 지방산 연결자의 10% (w/v) 용액 10 μl를 FVIII 용액에 첨가한다. 부드러운 교반 하에 22℃의 온도에서의 어두운 곳에서 120분 동안 반응 혼합물을 인큐베이션한다. 이후 수성 글리신 용액 (1M)의 첨가로 반응을 중지시켜 반응 혼합물에서 20 mM의 최종 농도를 제공한다. 부드러운 교반 하에 실온에서 15분 동안 혼합물을 인큐베이션하고 그 다음 Q-세파로오스 FF로 채워진 IEX 칼럼 (1.6 x 8 cm) 상에 로딩한다. 20 칼럼 부피의 평형 완충액 (20 mM Hepes, 5 mM CaCl₂, pH 7.4)으로 칼럼을 세척하고 그리고 완충액 B (20 mM Hepes, 5 mM CaCl₂, 0.5 M NaCl, pH 7.4)로 FA-rFVIII 접합체를 용출한다. 최종적으로 정용여과 완충액으로서 Hepes 완충액, 7.4 (20 mM Hepes, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl₂, pH 7.4)을 이용하여 비바스핀 장비로 산물을 UF/DF 처리한다.

Claims

수용성 연결자에 부착된 지방산 또는 지방산 에스테르를 포함하는 수용성 지방산 유도체이되, 상기 지방산 유도체는 안정한 옥심 결합에 의해 치료학적 단백질에 안정하게 부착되며,
상기 수용성 연결자는, 수용성 폴리머, 치료학적 단백질에 부착되는 하나의 제1 작용기(여기서, 제1 작용기는 아미노옥시기임), 및 지방산 또는 지방산 에스테르에 부착되는 제2 작용기(여기서, 제2 작용기는 아미노옥시기임)를 포함하고,
상기 지방산은 C10, C12, C14, C16, C18, C20, C22, 및 C24로 구성된 군에서 선택되는 사슬 길이를 포함하고,
상기 지방산 에스테르는 메틸 에스테르 또는 에틸 에스테르이고,
상기 치료학적 단백질은 글리코단백질 또는 시험관내에서 글리코실화된 치료학적 단백질이고,
상기 치료학적 단백질은 인자 VIII (FVIII), 인자 IX (FIX), 인자 VIIa (FVIIa), EPO (Erythropoietin), 과립구 집락 자극 인자 (G-CSF), 인슐린, 및 A1PI (Alpha-1-proteinase inhibitor)로 이루어진 군으로부터 선택되고,
상기 수용성 폴리머는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이고,
상기 옥심 결합은 수용성 연결자 상의 제1 작용기 및 치료학적 단백질 상의 산화된 탄수화물의 알데하이드기 사이에서 형성되는 것인 수용성 지방산 유도체.
제1항에 있어서, 시험관내 또는 생체내 인간 혈청 알부민 (HSA)을 결합시키는 것을 특징으로 하는 지방산 유도체.
제1항 또는 제2항에 있어서, 자연형(native) 치료학적 단백질에 비해 증가된 반감기를 갖는 것을 특징으로 하는 지방산 유도체.
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제1항에 있어서, 지방산은 C14, C16 및 C18로 구성된 군에서 선택되는 사슬 길이를 갖는 것을 특징으로 하는 지방산 유도체.
제1항 또는 제2항에 있어서, 지방산은 말단 카르복실기 및 ω-기로 구성된 군에서 선택되는 지방산의 기에서 수용성 연결자에 부착되는 것을 특징으로 하는 지방산 유도체.
제9항에 있어서, 지방산은 ω-기에서 수용성 연결자에 부착되는 것을 특징으로 하는 지방산 유도체.
제10항에 있어서, ω-기는 하이드록실, 아미노, 티오, 및 카르복실로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 지방산 유도체.
제1항 또는 제2항에 있어서, 지방산은 16-하이드록시헥사데칸산인 것을 특징으로 하는 지방산 유도체.
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제1항 또는 제2항에 있어서, 지방산 에스테르는 16-하이드록시헥사데칸산 메틸 에스테르인 것을 특징으로 하는 지방산 유도체.
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제1항 또는 제2항에 있어서, 수용성 폴리머는 O3, O5, O7, O9, O11, O13 및 O15로 구성된 군에서 선택되는 사슬 길이를 포함하는 것을 특징으로 하는 지방산 유도체.
제1항 또는 제2항에 있어서, 수용성 연결자는 하기로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 지방산 유도체:
a) 하기 화학식의 3-옥사펜탄-1,5-디옥시아민:

;
b) 하기 화학식의 3,6,9-트리아옥사운데칸-1,11-디옥시아민:

;
c) 하기 화학식의 3,6,9,12,15-펜타옥사헵타데칸-1,17-디옥시아민:

; 및
d) 하기 화학식의 3,6,9,12,15,18,21-헵타옥사트리코산-1,23-디옥시아민:
제21항에 있어서, 수용성 연결자는 하기 화학식의 3,6,9-트리아옥사운데칸-1,11-디옥시아민인 것을 특징으로 하는 지방산 유도체:

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제21항에 있어서, 수용성 연결자는 하기 화학식의 3,6,9,12,15-펜타옥사헵타데칸-1,17-디옥시아민인 것을 특징으로 하는 지방산 유도체:

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제1항 또는 제2항에 있어서, 지방산 유도체는 하기로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 지방산 유도체:
a) 하기 화학식의 16-(2-(2-(2-(2-아미노옥시에톡시)-에톡시)-에톡시)-에톡시이미노)-헥사데칸산 나트륨 염:

; 및
b) 16-(2-(2-(2-(2-아미노옥시에톡시)-에톡시)-에톡시)-에톡시아미노)-헥사데칸산 메틸 에스테르,

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제1항에 있어서, 치료학적 단백질은 FVIIa인 것을 특징으로 하는 지방산 유도체.
제1항에 있어서, 치료학적 단백질은 FVIII인 것을 특징으로 하는 지방산 유도체.
제1항에 있어서, 치료학적 단백질은 FIX인 것을 특징으로 하는 지방산 유도체.
하기 단계를 포함하는 제1항에 따른 지방산 유도체를 제조하는 방법:
a) 지방산 상의 ω-하이드록시기를 산화하여 지방산 상에 알데하이드기를 발생시키는 단계; 및
b) 활성 아미노옥시기를 포함한 수용성 연결자를 알데하이드기에 커플링시켜 안정한 옥심 결합을 형성하는 단계;
여기서 상기 지방산 유도체는 수용성임.
제33항에 있어서, ω-하이드록시기는 하기로 구성된 군에서 선택되는 산화 시약에 의해 산화되는 것을 특징으로 하는 방법: 데스 마틴 퍼아이오디난 시약(Dess Martin periodinane reagent), 템포 시약(Tempo reagent), 옥살릴 클로라이드/DMSO, 테트라프로필암모늄퍼루테네이트 (TPAP) 및 크롬 VI 시약 (콜린스 시약(Collins reagent), 피리디니움 클로로 크로메이트(PCC) 및 피리디니움 디크로메이트).
제34항에 있어서, 산화 시약은 데스 마틴 퍼아이오디난인 것을 특징으로 하는 방법.
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제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 지방산은 C14, C16 및 C18로 구성된 군에서 선택되는 사슬 길이를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제40항에 있어서, 지방산은 16-하이드록시헥사데칸산인 것을 특징으로 하는 방법.
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제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 수용성 폴리머는 O5, O7, O9, O11, O13 및 O15로 구성된 군에서 선택되는 사슬 길이를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 수용성 연결자는 하기로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법:
a) 하기 화학식의 3-옥사펜탄-1,5-디옥시아민:

;
b) 하기 화학식의 3,6,9-트리아옥사운데칸-1,11-디옥시아민:

;
c) 하기 화학식의 3,6,9,12,15-펜타옥사헵타데칸-1,17-디옥시아민:

; 및
d) 하기 화학식의 3,6,9,12,15,18,21-헵타옥사트리코산-1,23-디옥시아민:
제46항에 있어서, 수용성 연결자는 하기 화학식의 3,6,9-트리아옥사운데칸-1,11-디옥시아민인 것을 특징으로 하는 방법:

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제46항에 있어서, 수용자 연결자는 하기 화학식의 3,6,9,12,15-펜타옥사헵타데칸-1,17-디옥시아민인 것을 특징으로 하는 방법:

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하기 단계를 포함하는 제1항에 따른 지방산 유도체를 제조하는 방법:
a) 지방산 상의 카르복실기를 에스테르화하여 지방산 상에 에스테르를 발생시키는 단계;
b) 지방산 상의 ω-하이드록시기를 활성화하여 단계 a)의 지방산 상에 메실기를 발생시키는 단계; 및
c) 단계 b)의 메실기를 치환시킴으로써 활성화 아미노옥시기를 포함한 수용성 연결자를 커플링시키고 그렇게 함으로써 안정한 옥시이민-메틸렌 결합을 형성하는 단계;
여기서 상기 지방산 유도체는 수용성임.
제49항에 있어서, 카르복실기는 아세틸 클로라이드, 산의 존재에서 메탄올, 산의 존재에서 에탄올, 디아조메탄, 및 메틸아이오다이드로 구성된 군에서 선택되는 에스테르화제에 의해 에스테르화되는 것을 특징으로 하는 방법.
제50항에 있어서, 에스테르화제는 아세틸 클로라이드인 것을 특징으로 하는 방법.
제49항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, ω-하이드록시기는 메실 클로라이드, 토실 클로라이드 및 노실 클로라이드로 구성된 군에서 선택되는 활성화제에 의해 활성화되는 것을 특징으로 하는 방법.
제52항에 있어서, 활성화제는 메실 클로라이드인 것을 특징으로 하는 방법.
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제49항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 지방산은 C14, C16 및 C18로 구성된 군에서 선택되는 사슬 길이를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
제58항에 있어서, 지방산은 16-하이드록시헥사데칸산인 것을 특징으로 하는 방법.
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제49항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 수용성 폴리머는 O3, O5, O7, O9, O11, O13 및 O15로 구성된 군에서 선택되는 사슬 길이를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제49항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 수용성 연결자는 하기로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법:
a) 하기 화학식의 3-옥사펜탄-1,5-디옥시아민:

;
b) 하기 화학식의 3,6,9-트리아옥사운데칸-1,11-디옥시아민:

;
c) 하기 화학식의 3,6,9,12,15-펜타옥사헵타데칸-1,17-디옥시아민:

; 및
d) 하기 화학식의 3,6,9,12,15,18,21-헵타옥사트리코산-1,23-디옥시아민:
제64항에 있어서, 수용성 연결자는 하기 화학식의 3,6,9-트리아옥사운데칸-1,11-디옥시아민인 것을 특징으로 하는 방법:

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제64항에 있어서, 수용성 연결자는 하기 화학식의 3,6,9,12,15-펜타옥사헵타데칸-1,17-디옥시아민인 것을 특징으로 하는 방법:

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치료학적 단백질 상의 산화된 탄수화물 모이어티를 제1항에 따른 지방산 유도체와 접촉시키는 단계를 포함하는 접합된 치료학적 단백질을 제조하는 방법이되,
상기 탄수화물 모이어티는 나트륨 퍼아이오데이트 (NaIO₄), 납 테트라아세테이트 (Pb(OAc)₄) 및 칼륨 퍼루테네이트 (KRuO₄)로 구성된 군에서 선택되는 산화제를 포함하는 완충액과 인큐베이션에 의해 산화되고;
그리고 여기서 상기 옥심 결합 형성은 아닐린, o-아미노 벤조산, m-아미노 벤조산, p-아미노 벤조산, 설파닐산, o-아미노벤즈아미드, o-톨루이딘, m-톨루이딘, p-톨루이딘, o-아니시딘, m-아니시딘, 및 p-아니시딘으로 구성된 군에서 선택되는 친핵성 촉매에 의해 촉매되는 방법.
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제67항에 있어서, 치료학적 단백질은 FVIIa인 것을 특징으로 하는 방법.
제67항에 있어서, 치료학적 단백질은 FVIII인 것을 특징으로 하는 방법.
제67항에 있어서, 치료학적 단백질은 FIX인 것을 특징으로 하는 방법.
제67항에 있어서, 산화제는 나트륨 퍼아이오데이트 (NaIO₄)인 것을 특징으로 하는 방법.
제67항에 있어서, 친핵성 촉매는 m-톨루이딘인 것을 특징으로 하는 방법.
제67항에 있어서, 접합된 치료학적 단백질을 정제하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제67항에 있어서, 지방산 유도체는 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 방법.
제67항에 있어서, 지방산 유도체는 제49항 내지 제51항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 방법.
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