PL206536B1 - Kompozycja, kompozycja farmaceutyczna glikozylowanego interferonu-beta-1a, zastosowanie kompozycji glikozylowanego interferonu-beta-1a, sposób in vitro przedłużania aktywności glikozylowanego interferonu-beta-1a - Google Patents

Kompozycja, kompozycja farmaceutyczna glikozylowanego interferonu-beta-1a, zastosowanie kompozycji glikozylowanego interferonu-beta-1a, sposób in vitro przedłużania aktywności glikozylowanego interferonu-beta-1a

Info

Publication number
PL206536B1
PL206536B1 PL347968A PL34796899A PL206536B1 PL 206536 B1 PL206536 B1 PL 206536B1 PL 347968 A PL347968 A PL 347968A PL 34796899 A PL34796899 A PL 34796899A PL 206536 B1 PL206536 B1 PL 206536B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
beta
interferon
activity
ifn
composition
Prior art date
Application number
PL347968A
Other languages
English (en)
Other versions
PL347968A1 (en
Inventor
Blake Pepinsky
Laura Runkel
Margot Brickelmaier
Adrian Whitty
Paula Hochman
Original Assignee
Biogen Idec Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26801696&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL206536(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Biogen Idec Inc filed Critical Biogen Idec Inc
Publication of PL347968A1 publication Critical patent/PL347968A1/xx
Publication of PL206536B1 publication Critical patent/PL206536B1/pl

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A61K38/215—IFN-beta
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S930/00—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/01—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/14—Lymphokine; related peptides
    • Y10S930/142—Interferon

Description

Opis patentowy przedrukowano ze względu na zauważone błędy
Kompozycja, kompozycja farmaceutyczna glikozylowanego interferonu-beta-1a, (54) zastosowanie kompozycji glikozylowanego interferonu-beta-1a, sposób in vitro przedłużania aktywności glikozylowanego interferonu-beta-1a (30) Pierwszeństwo:
16.10.1998, US, 60/104,572 16.02.1999, US, 60/120,161 (43) Zgłoszenie ogłoszono:
22.04.2002 BUP 09/02 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono:
31.08.2010 WUP 08/10 (73) Uprawniony z patentu:
BIOGEN IDEC MA INC., Cambridge, US (72) Twórca(y) wynalazku:
BLAKE PEPINSKY, Arlington, US LAURA RUNKEL, Cambridge, US MARGOT BRICKELMAIER, Boxford, US ADRIAN WHITTY, Hopkinton, US PAULA HOCHMAN, Newton, US (74) Pełnomocnik:
rzecz. pat. Janina Kossowska
PL 206 536 B1
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest kompozycja, kompozycja farmaceutyczna glikozylowanego interferonu-beta-1a, zastosowanie kompozycji glikozylowanego interferonu-beta-1a, sposób in vitro przedłużania aktywności glikozylowanego interferonu-beta-1a.
Stosowanie polipeptydów i białek do systematycznego leczenia pewnych chorób jest obecnie powszechnie akceptowane w praktyce medycznej. Rola, którą te substancje odgrywają w leczeniu jest tak ważna, że wiele badań jest nakierowanych na syntezę dużych ich ilości przez zastosowanie technologii rekombinowania DNA. Wiele z tych polipeptydów to endogenne cząsteczki o dużym potencjale i specyficznoś ci dział ania biologicznego.
Głównym czynnikiem limitującym przydatność tych białkowych substancji w ich planowanym zastosowaniu jest to, że przy podawaniu pozajelitowym są one w krótkim czasie eliminowane z organizmu. Następuje to na skutek metabolizowania przez proteazy albo usuwania przy zastosowaniu normalnych dróg eliminacji białka, takich jak filtracja w nerkach. Doustne drogi podawania tych substancji są nawet bardziej problematyczne, ponieważ w dodatku do proteolizy w żołądku, wysoka kwasowość żołądka niszczy je przed osiągnięciem docelowej tkanki. Problemy związane z tymi drogami podawania białek są dobrze znane w przemyśle farmaceutycznym i stosuje się różne strategie dla ich rozwiązania.
Opublikowano wiele prac dotyczących stabilizacji białek. Znane są różne sposoby koniugowania białek z materiałami polimerowymi, obejmujące zastosowanie dekstranów, poliwinylopirolidonów, glikopeptydów, glikoli polietylenowych i kwasów poliaminowych. Według doniesień, otrzymane w rezultacie koniugaty polipeptydów zachowują swoje aktywności biologiczne i rozpuszczalność w wodzie dla podawania pozajelitowego.
Rodzina białek, na której skupia się wiele prac klinicznych i wysiłków ulepszenia sposobów podawania i bioasymilacji stanowią interferony. Interferony zostały przetestowane w rozmaitych stanach chorobowych. Zastosowanie ludzkiego interferonu beta, jednego z przedstawicieli tej rodziny, jest najbardziej zaawansowane w leczeniu stwardnienia rozsianego. Dwie postaci zrekombinowanego interferonu beta uzyskały ostatnio licencję w Europie i USA na leczenie tej choroby. Jedną z tych postaci jest interferon beta-1a (sprzedawany pod zastrzeżoną nazwą handlową AVONEXR, mfg. Biogen, Inc., Cambridge, MA) i dalej określany wymiennie jako „interferon-beta-la lub „IFN-e-1a lub „interferon-e-1a. Inną postacią jest interferon-beta-1b (sprzedawany pod zastrzeżoną nazwą handlową BETASERON®, Berlex, Richmond CA) i dalej określany jako „interferon-beta-1b. Interferon beta-1a jest wytwarzany w komórkach ssaków przy zastosowaniu naturalnej ludzkiej sekwencji genowej i jest glikozylowany, podczas gdy interferon beta-1b jest wytwarzany w bakterii E. coli przy użyciu zmodyfikowanej ludzkiej sekwencji genu, która zawiera dokonane na drodze inżynierii genetycznej podstawienie cysteiny seryną w pozycji aminokwasowej 17 i jest nieglikozylowana.
Uprzednio, kilkoro z nas bezpośrednio porównało względną siłę działania in vitro interferonubeta-1a i interferonu-beta-1b w testach funkcjonalnych i wykazało, że aktywność specyficzna interferonu beta 1a jest około dziesięciokrotnie większa niż aktywność specyficzna interferonu-beta-1b (Runkel L. et al., 1998, Pharm. Res. 15:641-649). Z badań zaprojektowanych dla zidentyfikowania podstawy strukturalnej tych różnic w aktywności, zidentyfikowaliśmy glikozylację jako jedyną ze znanych różnic strukturalnych między tymi produktami, które wpływają na aktywność specyficzną. Wpływ węglowodanu manifestował się w dużej mierze poprzez rolę stabilizującą strukturę. Wpływ stabilizujący węglowodanu był ewidentny w doświadczeniach z denaturacją termiczną i w analizie SEC. Brak glikozylacji korelował również ze wzrostem agregacji i zwiększeniem wrażliwości na denaturację cieplną. Usuniecie enzymatyczne węglowodanu z interferonu-beta-1a przy użyciu PN Gazy F powodowało intensywną precypitację deglikozylowanego produktu.
Badania te wskazują, że pomimo konserwowania sekwencji pomiędzy interferonem-beta-1a i interferonem-beta-1b, mają one odmienne właściwości biochemiczne, a zatem większość tego, co wiadomo o interferonie-beta-1b nie może być stosowane do interferonu-beta-1a i odwrotnie.
Wykorzystaliśmy zalety glikozylowanego interferonu beta w stosunku do postaci nieglikozylowanych. W szczególności opracowaliśmy kompozycję dla interferonu-beta-1a o zwiększonej aktywności w stosunku do interferonu-beta-1b i która ma również ogólne właściwości białek pegylowanych bez widocznej utraty aktywności w porównaniu z postaciami interferonu-beta-1a, które nie są koniugatami. Zatem, jeżeli dokonuje się modyfikacji w taki sposób, że produkty (koniugaty polimer-interferon-beta 1a) zachowują całą albo większość aktywności biologicznej, można uzyskać następujący wynik: zmianę
PL 206 536 B1 właściwości farmakokinetycznych i farmakodynamicznych prowadzących do zwiększonego okresu półtrwania i zmiany dystrybucji tkankowej (np. zdolności pozostawania w układzie naczyniowym przez dłuższy czas), zwiększoną stabilność w roztworze, zmniejszoną immunogenność, ochronę przed trawieniem proteolitycznym i późniejsze zniesienie aktywności. Taka formulacja stanowi zasadniczy postęp w dziedzinie farmacji i medycyny i będzie mogłaby wnieść znaczący wkład do postępowania w przypadku róż nych chorób, gdzie interferon ma zastosowanie, takich jak stwardnienie rozsiane, zwłóknienie i inne choroby zapalne albo autoimmunologiczne, nowotwory, zapalenie wątroby i inne choroby wirusowe oraz choroby. W szczególności zdolność do pozostawania przez dłuższy czas w układzie naczyniowym umożliwia zastosowanie interferonu-beta-1a do hamowania rozwoju naczyń krwionośnych i potencjalnie przekraczania bariery krew-mózg. Ponadto, stabilność termiczna uzyskiwana przez tworzenie koniugatów polimer-interferon-beta-1a jest korzystna przy wytwarzaniu interferonu-beta-1a w postaci proszku do zastosowania następnie przy podawaniu poprzez inhalację.
Zastosowaliśmy naszą wiedzę o strukturze krystalograficznej interferonu-beta-1a i opracowaliśmy koniugat interferon-beta-1a-polimer, w którym polimer jest połączony z tym miejscem(-ami) interferonu-beta-1a, które umożliwiają koniugatowi zachowanie całej aktywności biologicznej interferonubeta-1a w porównaniu z interferonem-beta-1a, który nie jest skoniugowany.
Kompozycja według wynalazku zawiera glikozylowany interferon-beta-1a, obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w Sekw. Id. Nr: 25, połączoną z resztą glikolu polialkilenowego na N-końcu glikolizowanego interferonu beta-1a.
Korzystnie glikol polialkilenowy jest C1-C4.
Korzystnie reszta C1-C4 polialkilenowa jest połączona z interferonem-beta-1a za pośrednictwem grupy aldehydowej.
Bardziej korzystnie glikol polialkilenowy jest glikolem polietylenowym (PEG).
Korzystnie interferon-beta-1a obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w Sekw. Id. Nr :25 jest białkiem fuzyjnym interferonu-beta-1a.
Bardziej korzystnie białko fuzyjne interferonu-beta-1a zawiera część cząsteczki immunoglobuliny.
Korzystnie glikozylowany interferon-beta-1a jest połączony z resztą glikolu polialkilenowego za pośrednictwem cząsteczki glikanowej interferonu-beta-1a.
Korzystnie glikol polialkilenowy ma ciężar cząsteczkowy od około 5 do około 40 kilodaltonów.
W zakres wynalazku wchodzi też kompozycja farmaceutyczna glikozylowanego interferonu-beta-1a, która zawiera kompozycję interferonu-beta-1a określoną powyżej.
Ponadto wynalazek dotyczy zastosowania kompozycji glikozylowanego interferonu-beta-1a obejmującego sekwencję aminokwasową przedstawioną w Sekw. Id. Nr: 25, połączonego z resztą glikolu polietylenowego na N-końcu tego glikolizowanego interferonu beta-1a do wytwarzania leku do leczenia raka lub nowotworu, stanów autoimmunologicznych, chorób wirusowych, chorób angiogennych.
Korzystnie interferon-beta-1a jest połączony z wymienioną resztą za pośrednictwem reszty glikanowej interferonu-beta-1a.
Korzystnie interferon-beta-1a jest białkiem fuzyjnym interferonu-beta-1a.
Bardziej korzystnie białko fuzyjne interferonu-beta-1a zawiera część cząsteczki immunoglobuliny.
W zakres wynalazku wchodzi również sposób in vitro przedłużania aktywności glikozylowanego interferonu-beta-1a obejmującego sekwencję aminokwasową przedstawioną w Sekw. Id. Nr: 25 w systemie in vitro obejmują cy łączenie takiego interferonu-beta 1a z resztą glikolu polialkilenowego C1-C4 w miejscu, które znajduje się na N-końcu interferonu-beta-1a.
Korzystnie interferon-beta-1a łączy się z resztą glikolu polialkilenowego za pośrednictwem Reszty glikanowej interferonu-beta-1a.
Korzystnie interferon-beta-1a jest białkiem fuzyjnym interferonu-beta-1a.
Korzystnie białko fuzyjne interferonu-beta-1a zawiera część cząsteczki immunoglobuliny.
Korzystnie glikolem polialkilenowym jest glikol polietylenowy.
Wynalazek dotyczy również zastosowania kompozycji określonej powyżej do wytwarzania leku do hamowania angiogenezy u pacjenta.
Niniejszy wynalazek dotyczy aktywnej fizjologicznie kompozycji interferonu-beta-1a zawierającej aktywny fizjologicznie interferon-beta-1a obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w Sekw. Id. Nr: 25, połączoną z resztą glikolu polialkilenowego na N-końcu glikolizowanego interferonu beta-1a
PL 206 536 B1 gdzie części stanowiące interferon-beta-1a i glikol polialkilenowy, są tak zorganizowane, że aktywny fizjologicznie interferon-beta-1a w kompozycji ma zwiększony okres półtrwania w porównaniu z samym interferonem (tj. w postaci nie bę dącej koniugatem, pozbawionej dołączonego polimeru).
Kompozycja interferonu-beta-1a zawierająca aktywny fizjologicznie interferon-beta-1a obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w Sekw. Id. Nr :25, połączoną z resztą glikolu polialkilenowego na N-końcu glikolizowanego interferonu beta-1a może być kompozycją, w której interferonbeta-1a jest białkiem fuzyjnym, korzystnie białkiem fuzyjnym z immunoglobuliną. W takim kompleksie, bliskość końca N (miejsce przyłączenia polimeru) i końca C (miejsce fuzji z częścią Ig) sugeruje, że połączenie z polimerem może zmniejszyć immunogenność białka fuzyjnego.
W kompleksie koniugatu interferonu-beta-1a zawierają cego aktywny fizjologicznie interferon-beta-1a obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w Sekw. Id. Nr: 25 połączony kowalencyjnie z fizjologicznie pasującą resztą glikolu polietylenowego aktywny fizjologicznie interferonbeta-1a może być połączony kowalencyjnie z fizjologicznie pasującą resztą glikolu polietylenowego przez labilne wiązanie kowalencyjne z wolną grupą aminokwasową interferonu-beta-1a, gdzie labilne wiązanie kowalencyjne jest rozbijane in vivo przez hydrolizę biochemiczną i/lub proteolizę.
Modyfikacje interferonu-beta-1a obejmującego sekwencję aminokwasową przedstawioną w Sekw. Id. Nr: 25, połączoną z resztą glikolu polialkilenowego na N-końcu glikolizowanego interferonu beta-1a z nietoksycznym polimerem mogą dostarczyć pewnych korzyści. Jeżeli modyfikacje są dokonane w taki sposób, że produkty (koniugaty polimer-interferon-beta-1a) zachowują całą albo większość aktywności biologicznej, można uzyskać następujący wynik: zmianę właściwości farmakokinetycznych i farmakodynamicznych prowadzących do zwiększonego okresu półtrwania i zmiany dystrybucji tkankowej (np. zdolności pozostawania w układzie naczyniowym przez dłuższy czas), zwiększoną stabilność w roztworze, zmniejszoną immunogenność, ochronę zmodyfikowanego interferonu-beta-1a przed trawieniem proteolitycznym i następującą w wyniku tego utratą aktywności, zwiększoną stabilność termiczną prowadzącą do bardziej wydajnej formulacji sproszkowanego interferonu-beta-1a do zastosowania do podawania doustnego lub przez inhalację.
Interferon-beta-1a o poprawionych właściwościach opisany powyżej może być skuteczny leczniczo po podawaniu doustnie, w aerozolu albo pozajelitowo. Inne drogi podawania, takie jak donosowe i przezskórne, są również możliwe przy zastosowaniu zmodyfikowanego interferonu-beta-1a.
Jeszcze jednym aspektem wynalazku jest zastosowanie kompozycji według wynalazku do hamowania rozwoju naczyń i tworzenia się nowych naczyń obejmujący podawanie osobnikowi skutecznej ilości tej kompozycji. Jako wynik zwiększonego poziomu i trwałości interferonu w układzie naczyniowym, pegylowany produkt będzie szczególnie przydatny jako inhibitor rozwoju naczyń krwionośnych.
W nie-terapeutycznych (np. diagnostycznych) zastosowaniach, bierze się również pod uwagę połączenie diagnostycznych i odczynnikowych rodzajów interferonu-beta. Otrzymany środek skoniugowany jest odporny na środowiskowe czynniki rozkładające, w tym procesy rozkładu z udziałem rozpuszczalników albo roztworów. W wyniku takiej zwiększonej odporności i zwiększonej stabilności interferonu-beta-1a obejmującego sekwencję aminokwasową przedstawioną w Sekw. Id. Nr: 25, połączoną z resztą glikolu polialkilenowego na N-końcu glikolizowanego interferonu beta-1a, stabilność składnika aktywnego może znacząco wzrosnąć, z jednoczesnym zwiększeniem niezawodności kompozycji zawierającej interferon-beta-1a przy specyficznym ostatecznym zastosowaniu, do którego jest on wykorzystywany.
Inne aspekty, właściwości i modyfikacje wynalazku będą bardziej oczywiste z następującego dalej ujawnienia i dołączonych zastrzeżeń.
Krótki opis figur.
Fig. 1. Wiązanie mutantów interferonu-beta-1a z podstawieniami alaninowymi z dimerowym białkiem fuzyjnym zawierającym zewnątrzkomórkową domenę łańcucha receptora interferonu typu I IFNAR2/Ig, (ektodomena IFNAR2/Fc sfugowana z domeną stałą ludzkiej IgG1).
Powinowactwa wiązania mutantów IFN z podstawieniami alaninowymi (Al-E) z łańcuchem receptora IFNAR2 ustalono tak, jak opisano w przykładzie 1 (podrozdział D). Histogram przedstawia ich powinowactwa wiązania w tym teście w stosunku do his-IFN-beta typu dzikiego (% w.t). Wartości % w.t. obliczono jako (powinowactwo his-IFN-beta typu dzikiego)/(powinowactwo mutanta IFN-beta) x 100. Pokazane są % w.t. (o) dla oddzielnych testów (n=3) i średni % w.t. (x) dla zestawu doświadczalnego. Mutanty A2, AB 1, AB2 i E nie wiążą się z IFNAR2/Fc w stężeniach 500-krotnie wyższych niż w.t. hisIFN-beta EC 50 (*).
PL 206 536 B1
Fig. 2. Wiązanie mutantów interferonu-beta-1a z podstawieniami alaninowymi z kompleksami komórkowego powierzchniowego receptora interferonu typu I („kompleks IFNAR1/2) wyrażanymi na komórkach chłoniaka Daudi Burkitt'a. Właściwości wiązania się z receptorem mutantów z podstawieniami alaninowymi (Al-E) określono w oparciu o FASC przy zastosowaniu testu wiązania się z komórkowym powierzchniowym receptorem tak, jak opisano w przykładzie 1 (podrozdział D). Histogram przedstawia ich powinowactwa wiązania receptora w tym teście w stosunku do his-IFN-beta typu dzikiego (% w.t.). Wartości % w.t. dla każdego mutanta obliczono jako (powinowactwo his-IFN-beta typu dzikiego)/(powinowactwo mutanta IFN-beta) x 100. Pokazane są wartości % w.t. (o) dla oddzielnych testów i średnie wartości % w.t. dla zestawu eksperymentalnego (x).
Fig. 3. Aktywności antywirusowe mutantów interferonu-beta-1a z podstawieniami alaninowymi
Aktywności antywirusowe mutantów interferonu-beta z podstawieniami alaninowymi (Al-E) określona w ludzkich komórkach A549 prowokowanych wirusem EMC jak opisano w przykładzie 1 (podrozdział E). Histogram przedstawia ich aktywności w tym teście w stosunku do his-IFN-beta typu dzikiego (% w.t.). Wartość % w.t. obliczono jako odwrotność stężenia mutanta IFN-beta (50% cpe)/stężenie w.t. his-IFN-beta (50% cpe) x 100. Pokazane są % w.t. (o) dla wielokrotnych testów i ś rednia z zestawu danych eksperymentalnych (x).
Fig. 4. Aktywności antyproliferacyjne mutantów interferonu-beta-1a z podstawieniami alaninowymi. Aktywności antyproliferacyjne mutantów interferonu-beta z podstawieniami alaninowymi (Al-E) określono na komórkach chłoniaka Daudi Burkitfa tak, jak opisano w przykładzie 1 (podrozdział E). Histogram przedstawia ich aktywności w tym teście w stosunku do his-IFN-beta typu dzikiego (% w.t.). Wartość% w.t. obliczono jako (stężenie his-IFN-beta w.t. (50% zahamowanie wzrostu)/stężenie zmutowanego IFN-beta (50% zahamowanie wzrostu) x 100. Pokazane są % w.t. (o) dla wielokrotnych testów i średnia z zestawu danych eksperymentalnych (x).
Fig. 5. Względne aktywności antywirusowe i antyproliferacyjne mutantów interferonu-beta-1a z podstawieniami alaninowymi. Porównano relatywne aktywno ś ci mutantów z podstawieniami alaninowymi (A1-E)w testach antywirusowych (oś x) i antyproliferacyjnych (oś y). Do tego porównania użyto średni procent his-IFN-beta typu dzikiego (% w.t.). przedstawiony na fig. 3 i 4. Mutanty, które wykazują zmianę współrzędnej obu aktywności znajdują się na linii przekątnej. Te mutanty, które wykazują zmianę w aktywności antywirusowej nieproporcjonalną do zmiany aktywności antyproliferacyjnej znacząco odbiegają do linii przekątnej (DE1, C, C1). Istotność określano biorąc pod uwagę odchylenia standardowe wynikające ze stosowanych średnich wartości wartości % w.t.
Fig. 6. Lokalizacja miejsca pegylowania przez mapowanie peptydów. Pegylowany i niezmodyfikowany interferon-e-1a poddano analizie mapowania peptydów. Próbki trawiono endoproteinazą Lys-C i poddano HPLC z odwróconymi fazami na kolumnie C4. Kolumnę rozwinięto 0-70% gradientem acetonitrylu w 0,1 % kwasie trichlorooctowym. Eluat z kolumny monitorowano przy 214 nm. Panel a, niezmodyfikowany interferon-e-1a. Panel a, pegylowany interferon-e-1a. Ostrze strzałki oznacza pozycję w eluacie N-końcowego peptydu interferonu-e-1a po endoproteinazie Lys, zawierającego reszty aminokwasowe 1-19.
Fig. 7. Aktywność antywirusowa koniugatów i nie-koniugatów interferon-beta-1a.
Aktywność interferonu-beta-1a lub PEGylowanego interferonu-beta-1a w stężeniach wskazanych na osi X oceniono w teście antywirusowym z zastosowaniem komórek ludzkiego raka płuc (A549) prowokowanych wirusem zapalenia mózgu i mięśnia sercowego (EMC). Po dwóch dniach inkubacji z wirusem, żywe komórki barwiono MTT, płytki odczytywano przy 450 mm i absorpcję, która odzwierciedla żywotność komórek jest pokazana na osi Y. Odchylenia standardowe są pokazane jako pionowe kreski. Stężenie interferonu-beta-1a lub PEGylowanego interferonu-beta-1a, które dawało 50% zabijania wirusem (50% efekt cytopatyczny) (50% maksimum OD450 wynosiło około 11 pgi 50% efekt cytopatyczny dla PEGylowanego interferonu-beta-1a wynosiło około 11 pg.
Fig. 8. Ocenianie stabilizacji koniugatów przy zastosowaniu denaturacji termicznej PEGylowany interferon-beta-1a i nietraktowany interferon-beta-1a jako kontrolę w 20 mM HEPES pH 7,5, 20 mM NaCl podgrzewano ze stałą szybkością 1 stopnia/min. Denaturację śledzono przez monitorowanie zmian absorbancji przy 280 nm. (a) niezmodyfikowany interferon-beta-1a (b) PEGylowany interferon-beta-1a.
Fig. 9. Pomiary aktywności antywirusowej interferonu-beta-1a w osoczu myszy traktowanej interferonem-beta-1a lub PEGylowanym interferonem-beta-1a
Myszom wstrzykiwano iv bądź 50000 jednostek interferonu-beta-1a albo 50000 jednostek pegylowanego interferonu-beta-1a. Krew otrzymuje się przez skrwawianie pozaoczodołowe w różnych
PL 206 536 B1 punktach czasowych po iniekcji interferonu jak wskazano na osi X. Dla każdego punktu czasowego skrwawiono przynajmniej 3 myszy, a osocze otrzymuje się i zamraża do czasu określenia aktywności interferonu-beta-1a w testach antywirusowych z zastosowaniem komórek ludzkiego raka płuc (A549) prowokowanych wirusem zapalenia mózgu i mięśnia sercowego. Żywe komórki barwiono roztworem MTT, płytki odczytano przy 450 mm w celu określenia absorbancji, która odzwierciedla żywotność komórek i aktywność interferonu-beta-1a. Dla każdej płytki sporządza się krzywą standardową stosując interferon-beta-1a i używa się do określenia aktywności inerferonu-beta-1a w każdej próbce. Pokazane są dane od poszczególnych zwierząt.
Fig. 10. Pełna sekwencja DNA genu interferonu beta ze znacznikiem histydynowym i jego produktu białkowego. Pokazane są pełna sekwencja DNA (Id. Sekw. Nr: 1) i białka (Id. Sekw. Nr: 2) IFN-beta-1a ze znacznikiem histydynowym. Odcinana sekwencja sygnałowa VCAM-1 pozostawia 3 aminokońcowe reszty (SerGlyGly) przed znacznikiem histydynowym (His6, pozycje 4-9). Sekwencja łącznikowa enterokinazy (AspAspAspAspLys) jest oddzielona od znacznika histydynowego przez sekwencję odstępnika (pozycje 10-12, SerSerGly). Naturalna sekwencja białkowa IFN-beta-1a łączy pozycje (Met18-Asn 183).
Definicje:
Stosowany tu termin „połączony kowalencyjnie oznacza, że wymienione cząsteczki są albo połączone kowalencyjnie jedna z drugą bezpośrednio, albo są połączone jedna z drugą niebezpośrednio przez cząsteczkę lub cząsteczki rozdzielające, takie jak mostki, odstępniki albo resztę lub reszty łącznikowe.
Interferon- „Interferon (określany również jako „IFN) jest małym, specyficznym gatunkowo pojedynczym łańcuchem polipeptydowym, wytwarzanym przez komórki ssaków w odpowiedzi na ekspozycję na rozmaite induktory, takie jak wirusy, polipeptydy, mitogeny i temu podobne. Najkorzystniejszym interferonem stosowanym w kompozycji według wynalazku jest glikozylowany, ludzki interferon beta, który jest glikozylowany w pozycji 80 (Asn80) i który korzystnie powstał dzięki technologii rekombinowania DNA i który obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną w Sekw. Id. Nr: 25, połączoną z resztą glikolu polialkilenowego na N-końcu glikolizowanego interferonu beta-1a. Korzystny glikozylowany interferon beta-1a jest nazywany „interferonem-beta-la („IFN-beta-la lub „IFN-e-1a lub „interferonem beta 1a lub „interferonem β 1a, wszystkie terminy stosowane są wymiennie). Sposoby rekombinowania DNA do wytwarzania białek, w tym interferonów, są znane w tej dziedzinie. Patrz na przykład patenty USA 4,399,216, 5,149,636, 5,179,017 (Axel et al.) i 4,470,461 (Kaufman).
Korzystne polinukleotydy interferonu-beta-1a które można zastosować w sposobach według niniejszego wynalazku pochodzą z sekwencji genu dla interferonu beta typu dzikiego od różnych kręgowców, korzystnie ssaków i są otrzymane przy zastosowaniu sposobów dobrze znanych specjalistom w tej dziedzinie, takich jak sposoby opisane w następujących patentach USA: Patent USA 5,641,656 (wydany 24 czerwca, 1997: DNA kodujący preproteinę ptasiego interferonu typu I i dojrzały ptasi interferon typu I), Patent USA 5,605,688 (Luty 25, 1997 - zrekombinowane interferony typu I, psi i koński); Patent USA 5,231,176 (Lipiec 27, 1993, cząsteczka DNA kodująca ludzki interferon z leukocytów); Patent USA 5,071,761 (Grudzień 10, 1991, sekwencja DNA kodująca podsekwencje ludzkich limfoblastoidalnych interferonów LylFN-alfa-2 i LyIFN-alfa-3); Patent USA 4,970,161 (Listopad 13, 1990, sekwencja DNA kodująca ludzki interferon-gamma); Patent USA 4,738,931 (Kwiecień 19, 1988, DNA zawierający gen ludzkiego interferonu beta); Patent USA 4,695,543 (Wrzesień 22, 1987, gen ludzkiego alfa-interferonu Gx-1; Patent USA 4,456,748 (Czerwiec 26, 1984, DNA kodujący podsekwencje różnych naturalnie występujących interferonów z leukocytów).
Można również zastosować mutanty interferonu-beta-1a. Mutacje wywołuje się przy zastosowaniu konwencjonalnych metod ukierunkowanej mutagenezy, znanych specjalistom w tej dziedzinie. Ponadto, ujawniono funkcjonalne odpowiedniki polinukleotydów interferonu-beta-1a, które kodują funkcjonalny ekwiwalent polipeptydów interferonu-beta-1a.
Pierwszy polinukleotyd kodujący interferon-beta-1a jest „funkcjonalnym ekwiwalentem w odniesieniu do drugiego polinukleotydu kodującego interferon-beta-1a jeżeli spełnia co najmniej jeden z następujących warunków:
(a) „funkcjonalnym ekwiwalentem jest pierwszy polinukleotyd, który hybrydyzuje z drugim polinukleotydem w standardowych warunkach hybrydyzacji i/lub jest zdegenerowany w stosunku do pierwszej sekwencji polinukleotydowej. Korzystniej, jeżeli koduje on zmutowany interferon mający aktywność interferonu-beta-1a;
PL 206 536 B1 (b) „funkcjonalnym ekwiwalentem jest pierwszy polinukleotyd, który koduje sekwencję aminokwasową kodowaną przez drugi polinukleotyd.
Stosowany tu termin „funkcjonalny ekwiwalent oznacza zatem białko interferonu-beta-1a albo polinukleotyd kodujący białko interferonu-beta-1a, który ma ten sam albo poprawiony korzystny wpływ na ssaka będącego biorcą, jak interferon, w stosunku do którego ma on być funkcjonalnym ekwiwalentem. Specjalista w tej dziedzinie zrozumie, że białko funkcjonalnego ekwiwalentu może być wytworzone przy zastosowaniu technik rekombinowania DNA, np. przez wyrażenie „funkcjonalnie ekwiwalentnego DNA. A zatem będzie oczywiste, że dla danej sekwencji DNA kodującej określony interferon będzie wiele zdegenerowanych sekwencji, które ją kodują. „Fuzja - dotyczy liniowego, kowalencyjnego połączenia dwóch lub więcej białek albo ich fragmentów przez pojedyncze wiązania peptydowe, korzystniej przez ekspresję genetyczną cząsteczki polinukleotydu kodującego takie białka. Korzystne jest, jeżeli białka lub ich fragmenty pochodzą z różnych źródeł. A zatem korzystne białka fuzyjne obejmują białko interferonu beta-1 a lub jego fragment połączony kowalencyjnie z drugą częścią, która nie jest interferonem. Konkretnie, „białko fuzyjne interferon-beta/Ig jest białkiem zawierającym cząsteczkę interferonu beta-1a wchodzącą w skład kompozycji według wynalazku lub jego fragment, połączone z końcem N łańcucha immunoglobuliny, gdzie część N-końcowa immunoglobuliny jest zastąpiona przez interferon beta.
Stosowany tu termin „zrekombinowane oznacza, że białko pochodzi ze zrekombinowanego, ssaczego układu ekspresji. Białko wyrażane w większości hodowli bakteryjnych, np. E. coli, będzie wolne od glikanu, a zatem te systemy ekspresji nie są korzystne. Białko wyrażane w drożdżach może mieć strukturę oligosacharydu, który różni się od wyrażanego w komórkach ssaków.
Termin „aktywny biologicznie stosowany w tym opisie jako cecha interferonu-beta-1a, oznacza że ta konkretna cząsteczka ma dostateczną homologię sekwencji aminokwasowej z ujawnionymi tu wykonaniami wynalazku aby mieć zdolność do wykazywania aktywności antywirusowej mierzonej in vitro w teście antywirusowym typu pokazanego w przykładzie 1 (patrz poniżej).
Stosowany tu termin „kompozycja terapeutyczna oznacza zawierającą białko według wynalazku lub inne fizjologicznie odpowiednie składniki. Kompozycja terapeutyczna może zawierać zaróbki, takie jak woda, minerały i nośniki, takie jak białko.
„Skuteczna ilość czynnika według wynalazku, to ilość która daje wynik albo wywiera wpływ na konkretny leczony stan.
„Aminokwas- monomerowa jednostka peptydu, polipeptydu albo białka. Dwadzieścia dwa aminokwasy znajdują się w naturalnie występujących peptydach, polipeptydach i białkach, wszystkie są izomerami L. Termin obejmuje również analogi aminokwasów i D-izomery aminokwasów białkowych oraz ich analogi.
„Pochodna aminokwasu jest naturalnym albo nienaturalnym aminokwasem, w którym normalnie występujący łańcuch boczny albo grupa końcowa jest zmodyfikowana w reakcji chemicznej. Takie modyfikacje obejmują na przykład gamma-karboksylację, beta-karboksylację, sulfatację, sulfonowanie, fosforylację, amidyzację, estryfikację, N-acetylację, karbobenzylację, tosylację i inne modyfikacje znane w tej dziedzinie. „Pochodna polipeptydowa jest polipeptydem zawierającym jedną lub więcej pochodnych aminokwasu.
„Białko - dowolny polimer składający się zasadniczo z dowolnych z 20 aminokwasów. Jakkolwiek „polipeptyd jest często stosowany w odniesieniu do stosunkowo dużych polipeptydów, a „peptyd jest stosowany w odniesieniu do małych polipeptydów, zastosowanie tych terminów w tej dziedzinie często nakłada się na siebie i jest zmienne. Stosowany tu termin „białko dotyczy peptydów, białek i polipeptydów o ile nie zaznaczono inaczej.
„Mutant - dowolna zmiana w materiale genetycznym organizmu, w szczególności dowolna zmiana (tj. delecja, podstawienie, addycja albo zmiana) w sekwencji polinukleotydowej typu dzikiego albo dowolna zmiana w białku typu dzikiego. Termin: „muteina jest stosowany wymiennie z „mutantem.
„Typ dziki - naturalnie występująca sekwencja polinukleotydowa eksonu białka albo jej część, albo sekwencja białka albo jej część, odpowiednio, taka jak normalnie istnieje in vivo.
„Standardowe warunki hybrydyzacji - warunki soli i temperatury zasadniczo równoważne 0,5 x SSC do około 5 x SSC i 65°C dla obu, hybrydyzacji i przemywania. Stosowany tu termin „standardowe warunki hybrydyzacji jest zatem definicją funkcjonalną i obejmuje zakres warunków hybrydyzacji. Ostrzejsze warunki mogą, na przykład, obejmować hybrydyzację w buforze do hybrydyzacji łysinkowej (0,2% poliwinylopirolidon, 0,2% Ficoll 400; 0,2% albuminy z surowicy wołowej; 50 mM
Tris-HCl (pH 7,5); 1 M NaCl; 0,1% pyrofosforan sodu; 1% SDS); 10% siarczanu dekstranu, i 100 μg/ml
PL 206 536 B1 zdenaturowanego, sonikowanego DNA ze spermy łososia w 65°C przez 12-20 godzin, i płukanie w 75 mM NaCl/7,5 mM cytrynianie sodu (0,5 x SSC)/1% SDS w 65°C. Warunki niższej ostrości mogą, na przykład, obejmować hybrydyzację w buforze do hybrydyzacji łysinkowej, 10% siarczanu dekstranu i 110 μg/ml zdenaturowanego, sonikowanego DNA ze spermy łososia w 55°C przez 12-20 godzin i przemywanie w 300 mM NaCl/30 mM cytrynian sodu (2,0 x SSC)/1% SDS w 55°C. Patrz także Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. New York, podrozdziały 6.3.1-6.3.6, (1989) „Sekwencja kontrolująca ekspresję- sekwencja polinukleotydów, która kontroluje i reguluje ekspresję genów, gdy jest połączona w sposób funkcjonalny z tymi genami.
„Połączona w sposób funkcjonalny - sekwencja polinukleotydowa (DNA, RNA) jest połączona w sposób funkcjonalny z sekwencją kontrolującą ekspresję, gdy sekwencja kontrolująca ekspresję kontroluje i reguluje transkrypcję i translację tej sekwencji polinukleotydowej. Termin „połączona w sposób funkcjonalny obejmuje posiadanie odpowiedniego sygnału startu (np. ATG) na początku sekwencji polinukleotydowej, która ma być wyrażana i utrzymywanie prawidłowej ramki odczytu dla umożliwienia ekspresji sekwencji polinukleotydowej pod kontrolą ekspresji sekwencji kontrolnej i wytwarzania żądanych polipeptydów kodowanych przez sekwencję polinukleotydową.
„Wektor ekspresyjny - polinukleotyd, taki jak DNA plazmidu albo faga (między innymi powszechnymi przykładami), który umożliwia ekspresję co najmniej jednego genu, gdy wektor ekspresyjny jest wstawiony do komórki gospodarza. Wektor może być, lub nie być zdolny do replikacji w komórce.
„Izolowany (stosowany zamiennie z „zasadniczo czystym) - gdy jest stosowany do kwasu nukleinowego tj. sekwencji polinukleotydowych, które kodują polipeptydy, oznacza polinukleotyd RNA albo DNA, część polinukleotydu genomowego, polinukleotydu cDNA albo syntetycznego polinukleotydu, który na skutek swojego pochodzenia albo manipulacji: (i) nie jest związany z całym polinukleotydem, z którym jest związany w naturze (np. jest obecny w komórce gospodarza jako wektor ekspresyjny albo jego część); albo (ii) jest połączony z kwasem nukleinowym albo inną cząsteczką chemiczną inną niż ta, z którą jest połączony w naturze; albo (iii) nie występuje w naturze. „Wyizolowany oznacza ponadto sekwencję polinukleotydową, która jest: (i) powielona in vitro na przykład w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR); (ii) zsyntetyzowana chemicznie; (iii) wytworzona rekombinacyjnie przez DNA; albo (iv) oczyszczona na przykład przez cięcie i rozdział w żelu.
A zatem „zasadniczo czysty kwas nukleinowy jest kwasem nukleinowym, który nie jest ciągły z jedną albo obydwiema sekwencjami kodującymi, z którymi tworzy ciągłość w naturalnie występującym genomie organizmu, z którego kwas nukleinowy pochodzi. Zasadniczo czysty DNA obejmuje również zrekombinowany DNA, który jest częścią hybrydowego genu kodującego dodatkowe sekwencje.
„Izolowany (stosowany zamiennie z „zasadniczo czystym) - gdy jest stosowany w odniesieniu do polipeptydów, oznacza polipeptyd albo jego część, która na skutek swojego pochodzenia albo manipulacji: (i) jest obecna w komórce gospodarza jako produkt ekspresji części wektora ekspresyjnego; albo (ii) jest połączony z białkiem albo inną cząsteczką chemiczną inną niż ta, z którą jest połączona w naturze; albo (iii) nie występuje w naturze. „Wyizolowany oznacza ponadto białko, które jest: (i) zsyntetyzowane chemicznie; (ii) wyrażone w komórce gospodarza i oczyszczone z pozbyciem się towarzyszących białek. Termin oznacza ogólnie polipeptyd, który został oddzielony od innych białek i kwasów nukleinowych, z którymi naturalnie występuje. Korzystne jest, jeżeli polipeptyd jest oddzielony również od substancji, takich jak przeciwciała albo złoże żelowe (poliakryloamid), które zostało zastosowane do jego oczyszczenia.
Zastosowany tu heterologiczny promotor to promotor, który nie jest naturalnie związanym z genem albo odczyszczonym kwasem nukleinowym.
Zastosowany tu termin „homologiczny jest synonimem terminu „identyczność i odnosi się do podobieństwa sekwencji między dwoma peptydami, cząsteczkami albo między dwoma kwasami nukleinowymi. Gdy pozycja w dwóch porównywanych sekwencjach jest zajęta przez tę samą zasadę albo jednostkę aminokwasową (na przykład jeżeli w danej pozycji w dwóch cząsteczkach DNA znajduje się adenina, albo w danej pozycji w dwóch polipeptydach znajduje się lizyna), wówczas odpowiednie cząsteczki są homologiczne w tej pozycji. Procent homologii między dwiema sekwencjami jest funkcją liczby odpowiadających sobie albo homologicznych pozycji dzielonych przez dwie sekwencje podzielone przez liczbę porównywanych pozycji x 100. Przykładowo, jeżeli 6 z 10 pozycji w dwóch sekwencjach odpowiada sobie albo jest homologicznych, wówczas dwie sekwencje są homologiczne w 60%. Jako przykład, sekwencje DNA CTGACT i CAGGTT wykazują 50% homologii (3 z 6 pozycji odpowiadają sobie). Generalnie, porównywanie przeprowadza się po dopasowaniu do siebie dwóch
PL 206 536 B1 sekwencji tak, aby uzyskać maksimum homologii. Takie dopasowanie może być dokonane przy zastosowaniu na przykład metody Needleman et al. J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970), włączonej zwykle do programów komputerowych, takich jak program Align (DNAstar, Inc.). Sekwencje homologiczne mają identyczne albo podobne reszty aminokwasowe, gdzie podobne reszty są konserwatywnymi podstawieniami albo „dowolnymi mutacjami punktowymi odpowiadających sobie reszt aminokwasowych w dopasowanej sekwencji stanowiącej odniesienie. Z tego względu „konserwatywne podstawienie reszty w sekwencji będącej odniesieniem stanowią takie podstawienia, które są fizycznie albo funkcjonalnie podobne do odpowiednich reszt w sekwencji stanowiącej odniesienie np. mają podobny rozmiar, kształt, ładunek elektryczny, właściwości chemiczne, włączając w to zdolność do tworzenia wiązań kowalencyjnych albo wodorowych i temu podobne. Szczególnie korzystnymi podstawieniami konserwatywnymi są takie, które spełniają kryteria określone dla „dopuszczalnych mutacji punktowych w Dayhoff et al., 5: Atlas of Protein Sequence and Structure, 5: Sup. 3, rozdział 22: 354-352, Nat. Biomed. Res. Foundation. Washington, D.C. (1978).
Termin „sekwencja polinukleotydowa i „sekwencja nukleotydowa są tu również stosowane wymiennie.
Termin „angiogeneza i „neowaskularyzacja oznacza w najszerszym sensie powstawanie nowych naczyń krwionośnych. W szczególności „angiogeneza, odnosi się również do powstawania nowych naczyń krwionośnych w miejscu występowania nowotworu.
IFNAR2, IFNAR1, IFNAR1/2 dotyczy białek, o których wiadomo, że tworzą komórkowy receptor powierzchniowy interferonu typu I. Część zewnątrzkomórkowa (ektodomena) łańcucha IFNAR2 sama może wiązać się z interferonem alfa albo beta.
Przy wykonywaniu wynalazku będą stosowane, o ile nie zaznaczono inaczej, konwencjonalne techniki biologii komórki, hodowli komórkowej, biologii molekularnej, mikrobiologii, rekombinowania DNA, chemii białek i immunologii, które są w zakresie umiejętności biegłych w tej dziedzinie. Takie techniki są opisane w literaturze. Patrz, na przykład, Molecular Coning: A Laboratory Manual, wydanie 2-gie. (Sambrook, Fritsch and Maniatis, eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989: DNA Cloning. Tomy I i II (D.N. Glover, wyd.), 1985; Oligonucleotide Synthesis, (MJ. Gait, wyd.), 1984; Patent USA Nr 4.683,195 (Mul lis et al.,); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames and S.J. Higgins, wyd.), 1984; Transcription and Translation (B.D. Hames and S.J. Higgins, eds.). 1984; Culture of Animal Cells (R.I. Freshney, wyd.). Alan R. Liss, Inc., 1987: Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press, 1986; A Practical Guide to Molecular Cloning (B. Perbal).1984: Methods in Enzymology, Vol. 154 i 155 (Wu et al., wyd.), Academic Press, New York; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H. Miller and M.P. Calos, wyd.), 1987, Cold Spring Harbor Laboratory: Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Mayer and Walker, wyd.). Academic Press. London, 1987; Handbook of Experiment Immunology, Vol. I-IV (D.M. Weir and CC. Blackwell, wyd.), 1986; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986.
Interferon-beta
Interferon-beta-1a jest przydatny jak czynnik do leczenia, remisji albo osłabienia stanu chorobowego, stanów fizjologicznych, objawów albo czynników etiologicznych, albo do ich oceny lub diagnozowania. Termin dotyczy również interferonu-beta-1a, który sam jest częścią białka fuzyjnego, takiego jak białko fuzyjne immunoglobulina-interferon-beta-1a, jak opisano w jednocześnie złożonych zgłoszeniach numery seryjne 60/104,572 i 60/120,161). Wytwarzanie białek fuzyjnych generalnie jest dobrze znane przez specjalistę w dziedzinie.
Znaleźliśmy rzadkie miejsce(-a) dla przyłączenia polimeru, które nie niszczą funkcji interferonubeta-1a. Ponadto, zastosowaliśmy również metodę ukierunkowanej mutagenezy w celu niezależnego zbadania miejsca(-sc) przyłączenia polimeru (patrz przykład 1). Pokrótce, przeprowadziliśmy analizę mutacyjną ludzkiego interferonu-beta-1a przez mapowanie reszt wymaganych do aktywności i wiązania receptora. Dostępność trójwymiarowej struktury krystalicznej ludzkiego interferonu-beta-1a (patrz powyżej i przykład 1) umożliwia nam identyfikowanie, dla podstawień alaninowych (lub serynowych), reszt eksponowanych wobec rozpuszczalnika dostępnych dla oddziaływań z receptorem interferonu beta, i zachowanie aminokwasów uczestniczących we wiązaniach wewnątrzcząsteczkowych. Zaprojektowano tabelę piętnastu kolejnych mutacji, które wymieniają dwie i osiem reszt w obrębie odrębnych regionów każdej z helis (A, B, C, D, E) i pętli (AB1, AB2, AB3, CD1, CD2, DE1, DE2) interferonubeta-1a. Patrz Przykład 1.
Aminokońcowy znacznik histydynowy (znacznik „his) został dołączony w celu oczyszczania przez powinowactwo mutantów wyrażanych w komórkach ssaczych (fig. 10 i Id. Sekw. Nr: 1 i 2 dla
PL 206 536 B1 sekwencji cDNA i wydedukowanych sekwencji aminokwasowych, odpowiednio). Konsekwencje funkcjonalne takich mutacji badano w testach antywirusowych i proliferacyjnyych. Opracowano nieradioaktywne testy wiązania w celu przeanalizowania tych mutacji pod kątem ich wiązania z komórkowym receptorem powierzchniowym inetreronu-beta-1a (komórkowy receptor powierzchniowy IFNAIR1/2). Ponadto, zastosowano test w oparciu o ELISA wykorzystujący białko fuzyjne IFNAIR2-ektodomena/Ig do wiązania interferonu w celu mapowania oddziaływań powierzchni między interferonem-beta-1a i IFNAIR2 (patrz przykład 1). Te analizy mutacyjne wykazały, ż e i końce N i C leżą w części cząsteczki interferonu beta, która nie jest ważna dla wiązania receptora albo funkcji biologicznych.
Mutanty są dalszymi wariantami cząsteczki interferonu-beta-1a, które mogą być szczególnie przydatne ponieważ wykazują nowe właściwości nie znajdywane w interferonie-beta-1a typu dzikiego (patrz przykład 1). Zidentyfikowaliśmy trzy typy efektów, które były powodowane przez ukierunkowaną mutagenezę. Efekty te mogą być korzystne przy opracowywaniu leków interferonowych. Te trzy typy efektów są następujące: (a) mutanty o wyższej aktywności antywirusowej niż itnetreron-beta-1a typu dzikiego (np. mutant C1); (b) mutanty, które wykazują aktywność zarówno w testach antywirusowych, jak i antyproliferacyjnych, ale dla których aktywność antyproliferacyjna jest nieproporcjonalnie niższa niż aktywność antywirusowa w porównaniu z intetreronem-beta-1a typu dzikiego (np. mutanty C1, D i DE1); oraz (c) funkcjonalni antagoniści (np. A1, B2, CD2 i DE1), wykazujący aktywności antywirusowe i antyproliferacyjne, które są nieproporcjonalnie niskie w pod względem wiązania się z receptorem w porównaniu do intetreron-beta-1a typu dzikiego.
Cząsteczka polimeru
W szerokim zakresie niniejszego wynalazku, do dołączenia do interferonu-beta 1la moż e być wykorzystana pojedyncza cząsteczka polimeru, jakkolwiek bierze się również pod uwagę to, że może być przyłączonych także więcej niż jedna cząsteczka polimeru. Kompozycje z koniugatem interferonubeta 1a obejmującym sekwencję aminokwasową przedstawioną w Sekw. Id. Nr: 25, połączoną z resztą glikolu polialkilenowego na N-końcu glikolizowanego interferonu beta-1a mogą być przydatne zarówno w zastosowaniach in vivo jak i nie in vivo. Dodatkowo, można zorientować się, że dołączony polimer może wykorzystywać dowolne inne grupy, reszty lub inne rodzaje przyłączonych grup zgodnie z ostatecznym zastosowaniem wynalazku. Przykładowo, być może przydatne w niektórych zastosowaniach kowalencyjne związanie z polimerem reszty funkcjonalnej nadającej polimerowi odporność na degradację przez UV, lub właściwości zapobiegające utlenianiu lub inne właściwości albo cechy charakterystyczne. Jako następny przykład, korzystne może być w niektórych zastosowaniach dodanie do polimeru grupy funkcjonalnej by nadać mu charakter reaktywny lub zdolność do łączenia krzyżowego, by wzmocnić różnorodne właściwości lub cechy całego materiału stanowiącego koniugat. A zatem, polimer moż e zawierać dowolną funkcyjność, powtarzają ce się grupy, wią zania lub inne składniki strukturalne, które nie przeciwdziałają skuteczności kompozycji zawierającej koniugat interferonu-beta 1a w zamierzonych celach. Inne przedmioty i korzyści niniejszego wynalazku staną się bardziej oczywiste z następującego ujawnienia i załączonych zastrzeżeń.
Ilustratywne polimery, które można użytecznie zastosować do osiągnięcia tych pożądanych właściwości są opisane tu poniżej w przykładowych schematach reakcji. W zastosowaniach związanych kowalencyjnie peptydów, polimerowi można nadać funkcyjność i następnie połączyć z wolnym(-i) aminokwasem(-ami) peptydu(-ów) by stworzyć nietrwałe wiązania.
Interferon-beta-1a najbardziej korzystnie sprzęga się przez końcową grupę chemicznie czynną polimeru, chociaż sprzężenia można także dokonać jako rozgałęzienia z grup chemicznie czynnych nie znajdujących się na końcu. Polimer z grupą(-ami) chemicznie aktywną(-ymi) określono tu jako „polimer aktywowany. Grupa chemicznie aktywna wybiórczo reaguje z wolną grupą aminową lub innymi grupami chemicznie aktywnymi białka. Aktywowany(-e) polimer(-y) poddaje się reakcji tak, że może zajść przyłączenie do każdej możliwej grupy aminowej interferonu-beta-1a, takiej jak grupa aminowa alfa lub grupa aminowa epsilon lizyny. Wolne grupy karboksylowe, odpowiednio aktywowane grupy karbonylowe, hydroksylowe, guanidylowe, utlenione reszty węglowodanowe i merkaptowe interferonu-beta 1a (jeśli dostępne) można także wykorzystać jako miejsca przyłączania.
Chociaż polimer można przyłączyć gdziekolwiek do cząsteczki interferonu-beta 1a, najbardziej korzystnym miejscem do przyłączania polimeru jest koniec N interferonu-beta 1a. Miejsce(-a) drugiego rzędu są na końcu C lub w jego pobliżu i przez reszty cukrowe. Możliwe są więc: (i) koniugaty interferonu-beta 1a z polimerem przyłączonym na końcu N. Możliwe są (ii) koniugaty interferonu-beta 1a z polimerem przyłączonym na koń cu C; (iii) koniugaty interferonu-beta-1a z polimerem przyłączonym do cukru; (iv) jak również koniugaty białka fuzyjnego interferonu-beta-1a z polimerem przyłączonym na
PL 206 536 B1 końcu N, końcu C i do cukru. Najbardziej korzystne według wynalazku są (i) koniugaty interferonubeta la z polimerem przyłączonym na końcu N.
Ogólnie, używa się od 1,0 do około 10 moli aktywowanego polimeru na mol białka w zależności od stężenia białka. Końcowa ilość wynika z równowagi między maksymalizacją liczby postępu reakcji a minimalizacją niespecyficznych modyfikacji produktu i równocześnie definiuje warunki reakcji chemicznej utrzymujące optymalną aktywność, optymalizując się w tym samym czasie, jeśli to możliwe, czas półtrwania białka. Korzystne jest, jeżeli zachowuje się przynajmniej około 50% aktywności biologicznej białka, a najbardziej korzystnie, zachowuje się 100%.
Reakcje można przeprowadzać jakąkolwiek odpowiednim sposobem wykorzystywanym do reakcji materiałów aktywnych biologicznie z polimerami obojętnymi, korzystnie w pH 5-7, jeśli grupy chemicznie czynne są na grupie alfa aminowej, na końcu N. Ogólnie proces obejmuje przygotowanie aktywowanego polimeru (który może mieć przynajmniej jedną końcową grupę karboksylową) i następnie reakcję białka z aktywowanym polimerem by wyprodukować rozpuszczalne białko odpowiednie do formulacji. Powyższą reakcję modyfikacji można przeprowadzić kilkoma sposobami, które mogą obejmować jeden lub większą liczbę etapów.
Jak wspomniano powyżej, korzystne wykonania wynalazku wykorzystują koniec N interferonubeta 1a jako łącznik z polimerem. Odpowiednie sposoby są dostępne do selektywnego otrzymywania interferonu-beta 1a zmodyfikowanego na N-końcu. Przykładem jednego ze sposobów jest sposób redukcyjnej alkilacji wykorzystujący różnicową reaktywność różnych typów grup pierwszorzędowych amin w interferonie-beta 1a (grupy aminowe epsilon lizyny versus grupy aminowe na N-końcowej metioninie) odpowiednich do uzyskania pochodnych interferonu-beta 1a. W odpowiednich warunkach selekcji można osiągnąć istotnie selektywne powstawanie pochodnych interferonu-beta 1a na jego końcu N, z grupą karbonylową zawierającą polimer. Reakcję przeprowadza się w pH pozwalającym na wykorzystanie różnic pKa między grupami aminowymi epsilon reszt lizynowych i grupami aminowymi alfa reszty N-końcowej interferonu-beta 1a. Taki typ reakcji chemicznych jest dobrze znany specjalistom w dziedzinie.
Wykorzystaliśmy schemat reakcji, w którym selektywność utrzymuje się przez przeprowadzanie reakcji w niskim pH (ogólnie 5-6), w warunkach gdzie polimer PEG-aldehyd reaguje z interferonembeta 1a w obecności cyjanoborowodorku sodu. Prowadzi to, po oczyszczeniu PEG-interferon-beta 1a i analizie za pomocą SDS-PAGE, spektroskopii masowej MALDI i sekwencjonowaniu/mapowaniu peptydu, do interferonu-beta 1a, do którego N-końca jest specyficznie przyłączona reszta PEG.
Struktura krystaliczna interferonu-beta 1a jest taka, że końce N i C są położone blisko siebie (patrz Karpusas et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 11813-11818). Tak więc modyfikacje C-końca interferonu-beta la powinny także mieć minimalny wpływ na jego aktywność. Jako, że nie ma prostej strategii chemicznej kierowania polimeru glikolu polialkilenowego, takiego jak PEG do końca C, prostym rozwiązaniem byłoby genetyczne zmodyfikowanie miejsca, które można by wykorzystać do kierowania tam reszty polimeru. Na przykład, włączenie Cys w miejscu końca C lub blisko niego pozwoli na specyficzną modyfikację z wykorzystaniem glikolu polialkilenowego (np. PEG) aktywowanego przez maleimid, winylosulfon albo holooctan. Pochodne takie można zastosować specyficznie do modyfikacji wprowadzonych przez inżynierię genetyczną cystein z powodu silnej wybiórczości tych odczynników w stosunku do Cys. Inne strategie, takie jak dołączenie znacznika histydynowego jako celu (Fancy et al., (1996) Chem. & Biol. 3:551) lub dodatkowego miejsca glikozylacji, reprezentują inne sposoby modyfikacji końca C interferonu-beta-1a.
Glikan w interferonie-beta-1a także znajduje się w pozycji umożliwiającej późniejszą modyfikację bez zaburzania aktywności. Sposoby kierowania cukrów w miejsca modyfikacji chemicznej są także dobrze znane, zatem możliwe jest dodanie glikolu polialkilenowego bezpośrednio i specyficznie do cukrów w interferonie-beta 1a aktywowanym przez oksydację. Na przykład, można stworzyć hydrazyd glikolu polietylenowego tworzący względnie stabilne połączenia hydrazonowe przez kondensację z aldehydami i ketonami. Właściwość tę wykorzystano do modyfikacji białek przez połączenia utlenionych oligosacharydów. Patrz Andresz, H. et al., (1978), Makromol. Chem. 179: 301. W szczególności, działanie karboksymetylohydrazydu PEG z azotynem daje karboksymetyloazydek PEG, który jest grupą aktywną elektrofilowo działającą na grupy aminowe. Reakcję taką można także zastosować do przygotowania białek zmodyfikowanych glikolem polialkilenowym. Patrz Patent USA 4,101,380 i 4,179,337.
Wcześniej odkryliśmy, że chemia za pośrednictwem łącznika tiolowego może następnie ułatwić sieciowanie białek. W szczególności, wytworzyliśmy homotypowe multimery LFA-3 i CD4 stosując
PL 206 536 B1 procedurę taką jak tworzenie aldehydów czynnych chemicznie na resztach węglowodanowych za pomocą nadjodanu sodu, tworząc koniugaty cystaminowe przez aldehydy i indukując sieciowanie przez grupy tiolowe na cystaminach. Patrz Pepinsky, B. et al., (1991), J. Biol. Chem., 226: 18244-18249 i Chen. L.L. et al., (1991) J. Biol. Chem., 226: 18237-18243. Tak więc przewidujemy, że ten typ reakcji chemicznej będzie także odpowiedni do modyfikacji polimerami glikolu polialkilenowego, gdzie łącznik przyłącza się do cukru, a polimer glikolu polialkilenowego przyłącza się do łącznika. Kiedy łączniki aminotiolowe lub zawierające hydrazynę pozwolą na dodanie pojedynczej grupy polimerowej, struktura łącznika może zmieniać się tak, że dodawane są liczne polimery i/lub, że zmienia się orientacja przestrzenna polimeru względem interferonu-beta-1a.
Polimer, do którego przyłączone jest białko może być homopolimerem glikolu polietylenowego (PEG) lub jest poliolem polioksyetylowym, dostarczanym we wszystkich przypadkach, gdy polimer jest rozpuszczalny w wodzie, w temperaturze pokojowej. Nie ograniczające przykłady takich polimerów obejmują homopolimery tlenków polialkilenowych, takich jak PEG lub glikole polipropylenowe, glikole polioksyetylenowane, ich kopolimery i ich blokowe kopolimery dostarczone tak, że utrzymywana jest rozpuszczalność w wodzie kopolimeru blokowego. Przykłady polioli polioksyetylowych obejmują, na przykład, glicerol polioksyetylowy, sorbitol polioksyetylowy, glukozę polioksyetylową i podobne. Szkielet glicerolowy glicerolu polioksyetylowego jest takim samym szkieletem, jak występujący naturalnie, na przykład, u zwierząt i ludzi, w mono-, di- i triglicerydach. Tak więc takie rozgałęzianie nie koniecznie będzie rozpoznawane jako czynnik obcy w ciele.
Przy wykonywaniu niniejszego wynalazku, reszty glikolu polialkilenowego glikoli polialkilenowych C1-C4, korzystnie glikolu polietylenowego (PEG) takich glikoli są korzystnie włączane do systemu polimerów będących przedmiotem zainteresowania. Specjaliści w dziedzinie zorientują się, że następująca lista jest zaledwie ilustracją i, że można rozważać wszystkie materiały polimerowe posiadające niniejszym opisane cechy.
Polimery nie muszą mieć żadnej szczególnej masy cząsteczkowej, ale korzystna jest masa cząsteczkowa między około 300 i 100 000, bardziej korzystna między 10 000 a 40 000. W szczególności rozmiary 20 000 i więcej są najlepsze by zapobiec utracie białka przy filtracji w nerkach.
Uzyskiwanie pochodnych glikolu polialkilenowego ma wiele zalet dla tworzenia koniugatów polimer-interferon-beta 1a przy wykonaniu niniejszego wynalazku, związanych z następującymi właściwościami pochodnych glikolu polialkilenowego: poprawienie rozpuszczalności w wodzie, nie wzbudzając jednocześnie żadnej odpowiedzi antygenowej lub immunogennej; wysoki stopień zgodności biologicznej; brak biodegradacji in vivo pochodnych glikolu polialkilenowego; oraz łatwość wydzielania przez żywe organizmy.
Co więcej, w innym aspekcie wynalazku, można wykorzystać interferon-beta 1a związany kowalencyjnie ze składnikiem polimerowym, w którym natura sprzężenia obejmuje kowalencyjne wiązania chemiczne nadające się do przecięcia. Umożliwia to kontrolę czasu, po którym polimer można odciąć od interferonu-beta-1a. Takie wiązanie kowalencyjne miedzy lekiem będącym interferonem-beta-1a a polimerem moż na ciąć w reakcji chemicznej lub enzymatycznej. Produkt polimer-interferon-beta-1a zachowuje dopuszczalną ilość aktywności. Równocześnie, w sprzęganym polimerze obecne są części glikolu polietylenowego by nadać koniugatowi polimer-interferon-beta-1a wysoką rozpuszczalność w wodzie i przedł u ż y ć zdolność krążenia we krwi. W wyniku takich ulepszonych wł a ś ciwoś ci w wynalazku bierze się pod uwagę podawanie pozajelitowe, donosowe i doustne zarówno aktywnych rodzajów interferonu-beta-1a jak i, po cięciu hydrolitycznym, biologicznie dostępnego czystego interferonubeta 1a do zastosowań in vivo.
Będzie zrozumiałe, że opisane tu schematy reakcji dostarczono tylko w celach ilustracyjnych, a niejako ograniczenie w odniesieniu do reakcji i struktur, które można zastosować do modyfikacji interferonu-beta-1a, np. do osiągnięcia rozpuszczalności, stabilności i powinowactwa do błony komórkowej przy podawaniu pozajelitowym i doustnym. Reakcje polimeru z interferonem-beta-1a w celu uzyskania jako produkt najbardziej korzystnych koniugatów można łatwo przeprowadzić przy zastosowaniu rozmaitych schematów reakcji chemicznych. Aktywność i stabilność koniugatów interferonubeta-1a można w różny sposób zmieniać poprzez stosowanie polimerów o różnych rozmiarach cząsteczek. Rozpuszczalność koniugatów można zmieniać poprzez zmianę proporcji i wielkości fragmentów glikolu polietylenowego włączonych do kompozycji polimeru.
Zastosowania
Unikalną właściwość polimerów będących pochodną glikoli polialkilenowych mającą wartość dla zastosowań leczniczych niniejszego wynalazku stanowi ich ogólna zgodność biologiczna. Polimery
PL 206 536 B1 mają rozmaitą rozpuszczalność i są nietoksyczne. Uważa się, że są one nieimmunogenne i nieantygenowe i nie przeszkadzają w aktywności biologicznej cząsteczki interferonu-beta-1a po dołączeniu w opisanych tu warunkach. Pozostają długo w układzie krwionośnym i są łatwo wydalane z żywych organizmów.
Stwierdzono, że produkty według wynalazku są przydatne ze względu na utrzymany czas półtrwania leczniczego interferonu-beta-1 i mogą one być na przykład wytwarzane do podawania terapeutycznego przez rozpuszczenie w wodzie albo w dopuszczalnym podłożu ciekłym. Podawanie przeprowadza się drogą pozajelitową, w aerozolu albo doustną. Drobnocząsteczkowe zawiesiny koloidalne można wytworzyć do podawania pozajelitowego w celu uzyskania działania depot albo drogą doustną, podczas gdy formulacja aerozolowa może mieć postać płynną albo suchego pudru. W przypadku stanu suchego, zliofilizowanego albo formulacji ciekłych fuzje interferonu-beta-1a według niniejszego wynalazku powinny mieć dobrą stabilność przy przechowywaniu. Stabilność termiczna koniugatów interferon-beta-1a (przykład 3) jest korzystna w procesach wytwarzania proszków, które mają etap odwadniania. Patrz np. PCT/US/95/06008 („Methods and Compositions for Dry Powder of Interferons).
Terapeutyczne koniugaty polimerów można stosować w profilaktyce albo leczeniu dowolnego stanu albo choroby, w której składnik interferon-beta-1a jest skuteczny. Ponadto, koniugaty w oparciu o polimery według niniejszego wynalazku można wykorzystywać przy diagnozowaniu komponentów, stanów lub chorób w systemach biologicznych albo próbkach jak również dla celów diagnostycznych w systemach niefizjologicznych.
W zastosowaniu terapeutycznym, rozważa się podawanie kompozycji według wynalazku zwierzęciu mającemu albo w sposób utajony podatnemu na takie stan(-y) lub chorobę(-y) i potrzebującego takiego leczenia, obejmującego poddawanie zwierzęciu skutecznej terapeutycznie ilości koniugatu polimeru według niniejszego wynalazku, która jest skuteczna leczniczo w przypadku takiego stanu albo choroby. Osobniki leczone kompozycją według wynalazku obejmują ssaki, a korzystniej ludzi. W zależności od specyficznego stanu albo choroby, którą się zwalcza, zwierzęciu można podawać koniugaty polimeru interferonu-beta-1a według wynalazku w dowolnej odpowiedniej skutecznej leczniczo i bezpiecznej dawce, co specjalista w tej dziedzinie może łatwo określić bez wykonywania doświadczeń. Z powodu istnienia barier gatunkowych w przypadku interferonów typu I, może być konieczne wytworzenie koniugatów polimeru z interferonem, jak tu opisano, dla interferonów z odpowiednich gatunków.
Aktywność antyproliferacyjna interferonu-beta-1a jest dobrze znana. W szczególności, niektóre opisane tu koniugaty polimeru interferonu-beta-1a są przydatne do leczenia nowotworów i raków, takich jak kostniakomięsak, chłoniak, ostra białaczka limfocytowa, rak sutka, czerniak i rak nosogardzieli, jak również chorób autoimmunologicznych, takich jak zwłóknienie, toczeń i stwardnienie rozsiane. Ponadto, należy się spodziewać, że aktywność antywirusowa wykazywana przez koniugaty polimeru interferonu-beta-1a można zastosować do leczenia chorób wirusowych, takich jak infekcja ECM, grypa i inne choroby dróg oddechowych, wścieklizna i zapalenie wątroby. Należy się również spodziewać, że aktywności immunomodulacyjne interferonu-beta-1a wykazywane przez skoniugowane białka, można zastosować do leczenia chorób autoimmunologicznych i zapalnych, takich jak zwłóknienie, stwardnienie rozsiane. Zdolność interferonów do hamowania wytwarzania nowych naczyń krwionośnych (tj. hamowanie angiogenezy i neowaskularyzacji) umożliwiają zastosowanie kompozycji według wynalazku zawierającej koniugaty białek do leczenia chorób związanych z rozwojem naczyń krwionośnych, takich jak retynopatia cukrzycowa, fibroplazja pozasoczewkowa, zwyrodnienie plamki, odrzucenie przeszczepu rogówkowego, jaskra z nowymi naczyniami krwionośnymi, pozasoczewkowy rozrost włóknisty, rubeoza i zespół Osler-Webber.
Ponadto, aktywność przeciwśródbłonkowa jest znana od pewnego czasu i jednym z potencjalnych mechanizmów działania interferonu może być przeciwdziałanie aktywności komórek śródbłonkowych przez hamowanie wytwarzania albo skuteczności czynników naczyniotwórczych wytwarzanych przez komórki nowotworowe. Niektóre nowotwory naczyniowe, takie jak naczyniaki krwionośne, są szczególnie podatne na leczenie interferonem. Leczenie interferonem alfa jest jedynym udokumentowanym leczeniem tej choroby. Spodziewane jest, że leczenie kompozycją według wynalazku zawierającą koniugaty interferonu-beta-1a będzie dawało zasadnicze korzyści farmakokinetyczne i farmakodynamiczne, ponieważ należy się spodziewać, że koniugat pozostanie dłuższy czas w naczyniach krwionośnych niż interferony nie będące koniugatem, prowadząc zatem do bardziej wydajnego i skutecznego leczenia do zastosowania jako czynnik przeciwdziałający rozwojowi naczyń. Patrz przykład 8.
PL 206 536 B1
Koniugaty polimer-interferon-beta-1a zawarte w kompozycji według wynalazku można podawać jako takie, albo w postaci farmaceutycznie dopuszczalnych estrów, soli i innych fizjologicznie funkcjonalnych pochodnych. W takich farmaceutycznych i leczniczych formulacjach, interfero-beta-1 a korzystnie jest stosowany łącznie z jednym albo większą liczbą dopuszczalnych farmaceutycznie nośników i ewentualnie z innymi składnikami leczniczymi. Nośnik(-i) muszą być dopuszczalne farmaceutycznie w tym znaczeniu, że pozostają w zgodzie z innymi składnikami formulacji i nie są nadmiernie szkodliwe dla ich biorcy. Interferon-beta-1a jest dostarczany w ilości skutecznej dla osiągnięcia pożądanego efektu farmakologicznego, jak opisano powyżej w ilości odpowiedniej dla uzyskania pożądanej dawki dziennej.
Kompozycje obejmują takie, które są odpowiednie do podawania pozajelitowego, jak i niepozajelitowego, a konkretne sposoby podawania obejmują podawanie doustne, doodbytnicze, dopoliczkowe, miejscowe, donosowe, dooczne, podskórne, śródskórne, dożylne, przezskórne, dooponowe, dostawowe, dotętnicze, podpajęczynówkowe, doodskrzelowe, dolimfatyczne, dopochwowe i domaciczne. Korzystne są kompozycje przydatne do podawania doustnego, donosowego i pozajelitowego.
Gdy interferon-beta-1a jest stosowany w kompozycji zawierającej roztwór ciekły, zaletą kompozycji jest możliwość podawania doustnie albo pozajelitowo. Gdy interferon-beta-1a jest stosowany w kompozycji w postaci ciekłej zawiesiny albo proszku w biokompatybilnej kompozycji nośnikowej, korzystne jest podawanie kompozycji doustnie, doodbytowo albo dooskrzelowo.
Gdy interferon-beta-1a jest stosowany bezpośrednio w postaci sproszkowanego materiału stałego, korzystne jest podawanie interferonu-beta-1a doustnie. Alternatywnie, może on być podawany donosowo albo dooskrzelowo przez rozpylenie proszku w nośniku gazowym w celu wytworzenia zawiesiny gazowej proszku, która jest wdychana przez pacjenta z obiegu oddechowego zawierającego odpowiedni nebulizer.
Kompozycje według wynalazku zawierające koniugaty polimeru mogą konwencjonalnie być przygotowane w postaci jednodawkowej i mogą być wytworzone dowolnym sposobem znanym w dziedzinie farmacji. Takie sposoby na ogół obejmują etap łączenia składnika(-ów) aktywnego(-ych) z nośnikiem, który stanowi jeden albo więcej składników dodatkowych. Typowo, kompozycje są przygotowane przez jednorodne i dokładne mieszanie składnika(-ów) aktywnego(-ych) z nośnikiem ciekłym, drobno rozdrobnionym nośnikiem stałym albo obydwoma, a następnie, jeśli to konieczne, formowanie produktu w postać dawek odpowiedniej kompozycji (formulacji).
Kompozycje według niniejszego wynalazku odpowiednie do podawania doustnego mogą być obecne w postaci pojedynczych jednostek, takich jak kapsułki, opłatki, tabletki albo pastylek do ssania, każda zawierająca określoną uprzednio ilość składnika aktywnego jako proszek lub granulki, albo zawiesiny w płynie wodnym lub nie-wodnym, takim jak syrop, eliksir, emulsja albo porcje do łykania.
Tabletki można wytworzyć przez skompaktowanie albo sprasowanie ewentualnie z jednym albo większą liczbą składników dodatkowych. Skompaktowane tabletki można wytworzyć przez skompaktowanie w odpowiednim urządzeniu ze składnikiem aktywnym w postaci wolno płynącej, takiej jak proszek albo granulki, który ewentualnie miesza się dodatkowo z czynnikiem wiążącym, dezintegrantem, substancją smarująca rozpuszczalnikiem obojętnym, składnikiem powierzchniowo czynnym albo czynnikiem rozładowującym. Sprasowane tabletki zawierające mieszaninę sproszkowanych koniugatów polimerowych z odpowiednim nośnikiem można wytwarzać przez sprasowanie w odpowiedniej maszynie.
Syropy można wytwarzać przez dodawanie składników aktywnych do stężonego wodnego roztworu cukru, na przykład sacharozy, do którego można dodawać dowolny składnik(-i) dodatkowy(-e). Takie dodatkowe dodatkowy(-e) składnik(-i) mogą obejmować środki smakowe, odpowiednie środki konserwujące, czynniki opóźniające krystalizację cukru, czynniki zwiększające rozpuszczalność dowolnego innego składnika, takiego jak alkohol polihydroksylowy, na przykład glicerol lub sorbitol.
Kompozycje przydatne do podawania pozajelitowego zwykle zawierają sterylny preparat wodny aktywnego koniugatu, który korzystnie jest izotoniczny z krwią biorcy (np. fizjologiczny roztwór soli). Takie kompozycje mogą obejmować czynniki zawieszające i zagęszczające oraz inne systemy mikrocząsteczkowe, które są zaprojektowane do kierowania związku do składników krwi albo jednego lub większej liczby narządów. Kompozycje mogą być przygotowane w postaci jednodawkowej albo wielodawkowej.
Kompozycje do rozpylania donosowego zawierają oczyszczone roztwory wodne aktywnego koniugatu ze środkami konserwującymi i czynnikami izotonicznymi. Korzystne jest doprowadzenie takich kompozycji do pH i stanu izotoniczności odpowiedniego dla błon śluzówkowych nosa.
PL 206 536 B1
Kompozycje do podawania doodbytniczego można przygotować jako czopki z odpowiednim nośnikiem, takim jak masło kokosowe, utwardzone tłuszcze albo utwardzone kwasy tłuszczowe.
Kompozycje do oczu, takie jak krople do oczu są wytworzone podobnymi metodami jak spreje do nosa, z tą różnicą, że pH i parametry izotoniczności są korzystnie dostosowane do warunków panujących w oku.
Kompozycje miejscowe zawierają koniugaty rozpuszczone albo zawieszone w jednej albo większej liczbie podłóż, takich jak olej mineralny, wazelina, alkohole polihydroksylowe albo inne podłoża stosowane do miejscowych kompozycji farmaceutycznych.
Poza wspomnianymi powyżej składnikami, kompozycje według wynalazku mogą zawierać ponadto jeden albo większą liczbę składników dodatkowych wybranych spośród rozpuszczalników, buforów, środków smakowych, rozdrabniających, środków powierzchniowo czynnych, zagęszczających, środków smarujących, środków konserwujących (włączając w to przeciwutleniacze) i temu podobne.
A zatem zgodnie z niniejszym wynalazkiem możliwe jest dostarczenie odpowiednich polimerów do in vitro stabilizowania interonu-beta-1a w roztworze, jako korzystne przykładowe zastosowanie dla celów nieleczniczych. Takie polimery mogą być wstosowane, na przykład, do zwiększania stabilności termicznej i oporności na enzymatyczny rozkład interferonu-beta-1a. Zwiększenie właściwości stabilności termicznej interferonu-beta-1a przez koniugację sposobów oznacza poprawę czasu przechowywania, stabilności w temperaturze pokojowej i trwałości odczynników i zestawów do badań naukowych.
Następujące dalej przykłady są dostarczone w celu zilustrowania niniejszego wynalazku i nie powinny być traktowane jako jego ograniczenie. W szczególności, będzie zrozumiałe, że opisane tu doświadczenia in vivo na zwierzętach mogą się zmieniać, tak, że możliwe są inne modyfikacje i warianty podstawowej metodologii. Przykładowo, w przykładzie 5 specjalista w tej dziedzinie będzie mógł zastosować test neopteryny albo zmienić liczbę i rodzaj stosowanego zwierzęcia naczelnego. Modyfikacje i warianty przykładów mają być traktowane jako mieszczące się w duchu i zakresie wynalazku.
P r z y k ł a d 1: Badania struktury/aktywności ludzkiego interferonu-beta-1a przy zastosowaniu mutacji-podstawień alanina/seryna: analiza miejsc wiązania receptora i domen funkcjonalnych
A. Część ogólna
Intensywną analizę mutacyjną ludzkiego interferonu-beta-1a(IFN-beta-1a) podjęto poprzez mapowanie reszt wymaganych do aktywności i wiązania receptora. Dostępność trójwymiarowej struktury krystalicznej ludzkiego IFM-beta (Karpusas, M. et al. 1997, Proc. Nalt. Acad. Sci. 94:11813-11818) umożliwiła nam zidentyfikowanie podstawień alaninowych (albo serynowych) reszt eksponowanych na rozpuszczalnik, dostępnych dla oddziaływań z receptorem i do zachowania aminokwasów uczestniczących w wiązaniach wewnątrzcząsteczkowych. Zaprojektowano panel 15 mutacji alaninowych, które zastępowały między 2 a 8 reszt w różnych regionach każdej z helis (ABCDiE)) i pętli (Ab, CD, DE). Aminokońcowy znacznik histydynowy składający się z sześciu reszt histydynowych dołączono w celu oczyszczania przez powinowactwo, jak również miejsce cięcia enterokinazy w celu usunięcia części aminokońcowej. Otrzymane interferony są określane wymiennie jako „znacznik his-interferonu(IFN)beta albo „His- interferon-beta albo „His6- interferon-beta i temu podobne.
Skonstruowano rozmaite plazmidy ekspresyjne ze zmutowanym znacznikiem his-(IFN)beta przy zastosowaniu konstruktu genu IFN-beta typu dzikiego jako matrycy do mutagenezy. Strategia mutagenezy obejmowała najpierw wprowadzenie pojedynczych miejsc cięcia dla enzymów restrykcyjnych w genie genu znaczonego IFN-beta typu dzikiego, a następnie zastąpienie sekwencji DNA między wybranymi miejscami restrykcyjnymi syntetycznymi dupleksami oligonukleotydowymi, które kodują podstawienia alaninowe(lub/serynowe). Na koniec, zmutowane geny IFN sklonowano w plazmidzie, który kierował ekspresją w komórkach ssaczych w linii komórkowej 293 ludzkiej nerki.
Funkcjonalne konsekwencje tych mutacji testowano w testach antywirusowych i antyproliferacyjnych. Opracowano nieradioaktywny test wiązania IFN w celu analizowania tych mutantów pod kątem ich wiązania z powierzchnią receptora (kompleksIFNAR1/2 ludzkich komórek chłoniaka Daudi Burkitta. Ponadto, opracowano test w celu mapowania oddziaływań powierzchniowych między mutantami his-IFN-beta i IFNAR2, który wykorzystuje fuzję białkową IFNAR2/Ig, zawierającą domenę zewnątrzkomórkową białka IFNAR2 będącego receptorem IFN, z domenami zawiasową, CH2 i CH3 ludzkiej IgG1.
1. Wytwarzanie genu interferonu beta jako matrycy dla mutagenezy.
Naszą strategię wytwarzania mutantów IFN-beta z podstawieniami alaninowymi (albo serynowymi) zastosowano najpierw do wytworzenia zmodyfikowanego genu IFN-beta, który koduje białko typu dzikiego, ale które zawiera pojedyncze miejsca restrykcyjne rozmieszczone wzdłuż genu. Poje16
PL 206 536 B1 dyncze miejsca restrykcyjne zastosowano do wymiany sekwencji typu dzikiego na syntetyczne dupleksy oligonukleotydowe, które kodowały zmutowane kodony. W celu uzyskania kasety ekspresyjnej z ludzkim IFN-beta-1a odpowiedniej do wytwarzania zmutowanych genów, cDNA IFN-beta (GenBank nr dostępu #E00029) powielono przez PCR. Wstępne klonowanie genu IFN-beta w plazmidzie pMBJ107, pochodnej pACYC184, patrz Rose et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16(1) 355) było konieczne do przeprowadzenia ukierunkowanej mutagenezy genu w plazmidzie, nieposiadającym specyficznych miejsc restrykcyjnych, które będą wytwarzane przez mutagenezę.
Startery zastosowane do klonowania sekwencji kodujących ludzkiego genu IFN-beta umożliwiły nam, również wprowadzenie miejsca cięcia enterokinazy powyżej i w ramce z genem IFN-beta (starter PCR 5'
5'TTCTCCGGAGACGATGATGACAAGATGAGCTACAACTTGCTTGGATTCCTAC AAAGAAGC-3' (Id. Sekw. Nr: 3: BET-021) i starter PCR 3'
5'-GCCGCTCGAGTTATCAGTTTCGGAGGTAACCTGTAAGTC-3'(Id. Sekw. Nr: 4: BET-022) oraz flankujące miejsca dla enzymów restrykcyjnych (BspEI i XhoI) przydatne do klonowania w miejscach plazmidu pMJB107. Otrzymany w rezultacie DNA jest określany jako fragment A PCR.
Wydajną sekwencję sygnałową z ludzkiej cząsteczki adhezyjnej z komórek naczyń (VCAM-1) oraz znacznik z sześcioma histydynami wprowadzono do ostatecznego konstruktu z drugiego fragmentu DNA wytworzonego z pDSW247 (fragment B). Plazmid pDSW247 jest pochodną pCEP4 (Invitrogen, Carlsbad, CA), z której usunięto gen EBNA-1 i która niesie sekwencje sygnałową VCAM-l(VCAMss) połączoną powyżej i w ramce ze znacznikiem z sześcioma histydynami. Starterami PCR, które zastosowano do wytworzenia części kasety VCAMssl/znacznik histydynowy były KID-369 (starter PCR 5' 5'AGCTTCCGGGGGCCATCATCATCATCATCATAGCT-3': Id. Sekw. Nr: 5) i KID421 (starter PCR 3'
5'-CCGGAGCTATGATGATGATGATGATGGCCCCCGGA-3': Id. Sekw. Nr: 6) zawierające flankujące miejsca cięcia dla enzymów restrykcyjnych (Notl i BspEI), które umożliwiają wycięcie fragmentu B DNA.
W celu wytworzenia wektora plazmidowego, który niesie sekwencję sygnałową VCAM-1, znacznik histydynowy i gen interferonu-beta przeprowadzono przez trójskładnikową ligację przy zastosowaniu oczyszczonych fragmentów DNA z plazmidu wektorowego pMJB107 (przeciętego Notl i XhoI), fragmentu A PCR (przecię tego BspEI i Xhol) i fragmentu B (przeciętego Notl i BspEI). Plazmid po ligacji użyto do transformacji komórek E. coli JA221 lub XL1-Blue i kolonie oporne na ampicylinę pobrano i testowano pod kątem wstawki przez analizę mapy restrykcyjnej. Otrzymano preparaty DNA na dużą skalę i sekwencję wstawki weryfikowano przez sekwencjonowanie DNA. Otrzymany w rezultacie konstrukt nazwano pCMG260.
2. Wytwarzanie mutantów z podstawieniami alaninowymi ludzkiego interferonu-beta w pCMG260
Plazmid pCMG260 użyto jako matrycę do wielu rund mutagenezy (U.S.E. Site Directed Mutagenesis Kit (Boehringer-Mannheim), które wprowadzają pojedyncze miejsca restrykcyjne w pozycjach wzdłuż sekwencji kodującej białka IFN-beta, ale nie zmieniają otrzymanej w rezultacie sekwencji białka. Poddane mutagenezie plazmidy użyto do transformowania do szczepów E. coli JA221 i XL1-Blue i zrekombinowane kolonie selekcjonowano na oporność na chloramfenikol. Kolonie oporne na chloramfenikol testowano dalej na obecność żądanych pojedynczych miejsc ciecia dla enzymu restrykcyjnego przez analizę mapy restrykcyjnej DNA. Otrzymany w rezultacie plazmid IFN-beta, pCMG275.8, zawierający pełen zestaw pojedynczych miejsc ciecia dla enzymów restrykcyjnych i sekwencję DNA genu zweryfikowano. Pełna sekwencja DNA (Sekw. Id. Nr: 1) zmodyfikowanego genu interferonu beta, zawierającego znacznik histydynowy, łącznie z sekwencją kodującą białko (Sekw. Id. Nr: 2) są pokazane na fig. 10).
Pełen zastaw podstawień alaninowych jest przedstawiony w tabeli 1 ( następna strona). Nazwy mutantów określają specyficzny region strukturalny (helisy albo pętle), do których mutacje zostały wprowadzone. Cały zestaw podstawień alaninowych (albo sernowych) dotyczy mutacji w 65 ze 165 aminokwasów ludzkiego IFN -beta.
Wytworzono zestaw mutantów pCMG275.8, przez zastąpienie odcinków DNA między pojedynczymi miejscami restrykcyjnymi przez syntetyczne dupleksy oligonukleotydowe, które zawierają informację genetyczną przedstawioną w tabeli 2 (patrz poniżej). W celu wytworzenia plazmidów z rozmaitymi podstawieniami alaninowymi, oczyszczony z ż elu wektor pCMG275.8 (przecię ty odpowiednim enzymem restrykcyjnym, jak pokazano na liście poniżej dla każdego regionu strukturalnego IFN-beta) i dupleksy oligonukleotydowe (sekwencje nici kodującej są przedstawione w tabeli 2) poddawano razem ligacji. Mieszaniny ligacyjne użyto do transformowania szczepu E.
PL 206 536 B1 coli JA221 i zrekombinowane kolonie selekcjonowano na oporność na ampicylinę. Kolonie oporne na ampicylinę testowano na obecność wstawionych mutacji przez poszukiwanie odpowiednich miejsc restrykcyjnych. Dla dwóch mutantów (A2 i CD2), strategia klonowania zakładała zastosowanie dwóch syntetycznych dupleksów oligonukleotydowych (pokazanych w tabeli 2), które niosą komplementarne wystające końce w celu umożliwienia im ligacji ze sobą i z wektorem zawierającym szkielet IFN-beta w ligacji trójskładnikowej. Następująca lista ilustruje miejsca, które zastosowano do klonowania zmodyfikowanych oligonukleotydów z tabeli 2. Schemat klonowania (część B pokazuje pozycje pojedynczych miejsc restrykcyjnych w genie interferonu beta
T a b e l a 1
Pozycje podstawień alaninowych HUIFN-e
Linia określona jako IFN-β przedstawia sekwencję IFN-β typu dzikiego. Dla każdego mutanta pokazano podstawienia alaniowe lub serynowe reszt IFN-β a kreski poniżej odpowiednich regionów oznaczają sekwencje typu dzikiego. Struktury helis oraz pętli pokazano jako linie proste pod sekwencjami mutantów. Pętla DE rozciąga się pomiędzy helisami D i E. Wytworzono dwa dodatkowe mutanty z postawieniami alaninowymi (H93A, H97A oraz H121 A), a następnie analizowano w teście antywirusowym w celu zbadania efektów zmutowania tych histydyn, które chelatują cynk w strukturze dimerycznej. Oba mutanty zachowały aktywność formy nie zmutowanej w testach antywirusowych, co sugeruje, że dimeryzacja z udziałem cynku nie jest istotna dla aktywności IFN-β.
PL 206 536 B1
Tabela 2
Al Id. Sekw. Nr: 7 BET-053 CCGGAGACGATGATGACAAGATGGCTTACGCC GCTCTTGGAGCCCTACAAGCTTCTAGCAATTTTC AGTGTCAGAAGCTCCTGTGGC
A2 Id. Sekw. Nr: 8 BET-039 GATCTAGCAATGCTGCCTGTGCTGCCCTCCTGG CTGCCTTGAATGGGAGGCTTGAATACT
Id. Sekw. Nr: 9 BET-041 GCCTCAAGGACAGGATGAACTTTGACATCCCTG AGGAGATTAAGCAGCTGCA
AB1 Id. Sekw. Nr: 10 BET-080 AATTGAATGGGAGGGCTGCAGCTTGCGCTGCAG ACAGGATGAACTTTGACATCCCTGAGGAGATTA AGCAGCTGCA
AB2 Id. Sekw. Nr: 11 BET-080 AATTGAATGGGAGGCTTGAATACTGCCTCAAGG ACAGGGCTGCATTTGCTATCCCTGCAGAGATTA AGCAGCTGCA
AB3 Id. Sekw. Nr: 12 BET-084 AATTGAATGGGAGGCTTGAATACTGCCTCAAGG ACAGGATGAACTTTGACA
Id. Sekw. Nr: 13 BET-086 TCCCTGAGGAGATTGCTGCAGCTGCAGCTTTCG CTGCAGCTGA
BI Id. Sekw. Nr: 14 BET-110 CGCCGCGTTGACCATCTATGAGATGCTCGCTAA CATCGCTAGCATTTTCAGACAAGATTCATCTAG CACTGGCTGGAA
B2 Id. Sekw. Nr: 15 BET-112 CGCCGCATTGACCATCTATGAGATGCTCCAGAA CATCTTTGCTATTTTCGCTGCAGCTTCATCTAGC ACTGGCTGGAA
Cl Id. Sekw. Nr: 16 BET-114 GGAATGCTTCACTTGTTGCTGCACTCCTGAGCA ATGTCTATCATCAGATAAACCATCTGAAGACAG TTCTAG
C2 Id. Sekw. Nr: 17 BET-092 GGAATGAGACCATTGTTGAGAACCTCCTGGCTA ATGTCACTCATCAGATAGCACATCTGGCTGCAG TTCTAG
CDI Id. Sekw. Nr: 18 BET-094 CTAGCTGCAAAACTGGCTGCAGCTGATTTCACC AGGGGAAAACT
CD2 Id. Sekw. Nr: 19 BET-096 CTAGAAGAAAAACTGGAGAAAGAAGCAGCTAC CGCTGGAAAAGCAATGAGCGCGCTGCACCTGA AAAGA
Id. Sekw. Nr: 20 BET-106 TATTATGGGAGGATTCTGCATTACCTGAAGGCC AAGGAGCACTCACACTGT
Dl Id. Sekw. Nr: 21 BET-108 CATGAGCAGTCTGCACCTGAAAAGATATTATGG GGCAATTGCTGCATACCTGGCAGCCAAGGAGTA CTCACACTGT
DE1 Id. Sekw. Nr: 22 BET-116 CATGAGCAGTCTGCACCTGAAAAGATATTATGG GAGGATTCTGCATTACCTGAAGGCCGCTGCATA CTCACACTGTGCCTGGACGAT
DE2 Id. Sekw. Nr: 23 BET-118 CATGAGCAGTCTGCACCTGAAAAGATATTATGG GAGGATCTTGCATTACCTGAAGGCAAAGGAGTA CGCTGCATGTGCCTGGACGAT
El Id. Sekw. Nr: 24 BET-14 CGTCAGAGCTGAAATCCTAGCAAACTTTGCATT CATTGCAAGACTTACAG
B. Konstrukcja plazmidów ekspresyjnych EBNA 293
Geny IFN-beta typu dzikiego i zmutowane, połączone z sekwencją sygnałową VCAM-1, znacznikiem histydynowym i miejscem cięcia enterokinazy oczyszczono z żelu jako fragmenty restrykcyjne 761
PL 206 536 B1 zasadowe par Notl i BamHI. Oczyszczone fragmenty sklonowano w przeciętym Notl i BamHI wektorze plazmidowym pDSW247, jak pokazano na schemacie. Plazmid pDSW247 jest wektorem ekspresyjnym do przejściowej ekspresji białek w komórkach ludzkiej nerki EBNA 293 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Zawiera on wczesny promotor genu cytomegalowirusa i elementy regulacyjne EBV, które są wymagane do uzyskiwania wysokiej ekspresji genów w tym systemie, jak również markery selekcyjne dla E. coli (oporność na ampicylinę) i komórek EBNA 293 (oporność na higromycynę) jak widać w schematycznej strategii klonowania (poniżej). Poddane ligacji plazmidy użyto do transformacji komórek E. coli JA221 lub XL1-Blue i kolonie oporne na ampicylinę pobrano i testowano pod kątem wstawki przez analizę mapy restrykcyjnej. Otrzymano preparaty DNA na dużą skalę i sekwencję wstawek weryfikowano przez sekwencjonowanie. Pozytywne klony zawierające żądane zmutagenizowane sekwencje zastosowano do transfekowania komórek ludzkiej nerki EBNA 293 jak opisano poniżej.
Schemat strategii klonowania jest przedstawiony poniżej:
Schematyczne przedstawienie strategii klonowania i plazmidów ekspresyjnych IFN-β
C. Ekspresja i oznaczenie ilościowe mutantów IFN-beta-1a z podstawieniami alaninowymi
Ludzkie komórki EBNA 293 (Invitrogen, Carlsbad, CA, Chittenden, T. (1989) J. Virol. 63: 3016-3025) utrzymywano jako prawie konfluentne hodowle w pożywce Dulbecco's Modified Eagle's uzupełnionej 10% płodową surowicą cielęcą, 2 mM glutaminą i 250 μg/ml Geneticin (Life Technologies, Gaithersburg, MD). Plazmidy ekspresyjne pDSW247 transfekowano przejściowo do komórek EBNA 293 przy zastosowaniu protokołu z lipofektaminą (Gibco/BRL, Life Technologies). Kondycjonowaną pożywkę zbierano 3-4 dni po transfekcji, usuwano komórki przez wirowanie, a stężenie his-IFN-beta oznaczano ilościowo przez ELISA.
Test ELISA przeprowadzono używając króliczych poliklonalnych przeciwciał (IgG oczyszczone na białku A, przeciwciała wytworzone przeciw oczyszczonemu ludzkiemu IFN-beta-1a) do opłaszczenia 96-studzienkowych płytek ELISA, a biotynylowaną postać tych samych poliklonalnych króliczych przeciwciał użyto jako odczynnik drugorzędowy do umożliwienia wykrywania interferonu przy zastosowaniu połączonej ze streptawidyną peroksydazy z chrzanu (HRP: Jackson ImmunoResearch,
PL 206 536 B1
W. Grove. PA). Serię rozcieńczeń interferonu-beta-1a użyto w celu sporządzenia standardowej krzywej rozcieńczeń. Kondycjonowane pożywki z transfektantów EBNA zawierające his-IFN-beta rozcieńczano tak, aby otrzymać próbki o stężeniach w zakresie od 10 ng/ml do 0,3 ng/ml w teście ELISA. W celu potwierdzenia stężeń IFN-beta w pożywce, określonej przez ELISA, przeprowadzono analizę Western. Zredukowane supernatanty z hodowli i standardy IFN-beta-1a poddano SDS-PAGE w 10-20% żelach gradientowych (Novex, San Diego, CA) i przeniesiono na filtry PDVF. Prążki wykazujące reakcję immunologiczną wykrywano przy zastosowaniu poliklonalnej antysurowicy anty-IFN-beta-1a (#447, Biogen, Inc., drugiej antysurowicy, którą uzyskano przeciw IFN-beta-1a), a następnie traktowanie połączoną z HRP anty-króliczą oślą IgG (Jackson ImmunoResearch).
D. Badanie mutantów interferonu-beta pod kątem wiązania się z receptorem Właściwości wiązania się z receptorem mutantów interferonu-beta opisanych w części C oceniano przy pomocy dwóch różnych testów wiązania. W jednym z nich mierzono wiązanie zmutowanego interferonu-beta z fuzją białkową, IFNAR2/Ig, składającą się z zewnątrzkomórkowej domeny łańcucha receptora ludzkiego IFNAR2 połączonej ze częścią regionu stałego ludzkiej IgG. IFNAR2-Fc została wyrażona w komórkach jajnika chomika chińskiego (CHO) i oczyszczona zgodnie z instrukcją producenta (Pierce Chem. Co., Rockford, IL, nr katalogowy #20334) metodą chromatografii powinowactwa do białka A-sepharose. Wiązanie mutantów interferonu-beta do IFNAR2-Fc zmierzono metodą ELISA. Płytki ELISA przygotowano przez opłaszczenie studzienek 96-studzienkowych płaskodennych płytek przez noc w temperaturze 4°C używając 50 nl/na studzienkę mysich przeciwciał monoklonalnych przeciw ludzkiej IgGl (CDG5-AA9, Biogen, Inc.) o stężeniu 10 μg/ml w buforze opłaszczającym (50 mM NaHCO3, 0,2 mM MgCl2, 0,2 mM CaCl2, pH 9,6). Płytki płukano dwukrotnie PBS zawierającym 0,05 % Tween-20 i blokowano 0,5% odtłuszczonym suchym mlekiem w PBS przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Po dodatkowym dwukrotnym płukaniu do każdej studzienki dodawano 50 μl roztworu 1 μg/ml IFNAR2Fc w 0,5% mleku w PBS zawierającym 0,05% Tween-20 i inkubowano jedną godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie płytki płukano dodatkowo jeszcze dwa razy. Wiązanie mutantów interferonu-beta z IFNAR2-Fc mierzono przez dodanie 50 ul/studzienkę interferonu-beta w kondycjonowanej pożywce, seryjnie rozcieńczono w pożywce Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), uzupełnionej 10% płodową surowicą wołową i inkubowano przez dwie godziny w 4°C. Rozcieńczenia zmutowanego interferonu-beta typowo były w zakresie od około 1 μM do 10 pM. Po przepłukaniu interferonbetazwiązany z płytkami wykrywano przez dodanie 50 μl/studzienkę mieszaniny składającej się z poliklonalnego króliczego przeciwciała anty-interferonowego (# 447, Biogen, Inc.) w rozcieńczeniu 1:1000 oraz oślego przeciwciała przeciw króliczej IgG wyznakowanego peroksydazą z chrzanu (HRP) (Jackson ImmunoResearch) i inkubowano 15 minut w 4°C. Po dwóch płukaniach dodawano substrat HRP, po czym płytkę inkubowano w 4°C przed odczytem w czytniku płytek ELISA przy długości fali 450 nm. Wyniki wykreślano jako absorbcję wobec stężenia zmutowanego interferonu-beta, a powinowactwo wiązania zmutowanego interferonu-beta z IFNAR2-Fc określano przez dostosowanie danych do prostego hiperbolicznego równania wiązań. Wyniki takich analiz przedstawiono na fig. 1, na której powinowactwo wiązań dla każdego mutanta, określone w minimum 3 niezależnych eksperymentach, wyrażono jako procent wartości uzyskanych dla His6-dzikiego typu interferonu-beta.
Drugą analizę wiązań z receptorem stosowano do pomiaru powinowactwa, z którym mutanty interferonu-beta wiążą się do komórek Daudi wyrażających oba łańcuchy receptora, IFNAR1 i IFNAR2, które razem składają się na receptor interferonu-beta. Taka analiza oparta na FACS korzysta z blokujących przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciw domenom zewnątrzkomórkowym IFNAR1, EA12 (Biogen Inc.), aby rozróżnić wolny receptor od receptora, z którym związany jest interferon-beta. Komórki Daudi (20 μl przy 2,5 x 107 komórek/ml) umieszczono w studzienkach 96-studzienkowych płytek o V-kształtnych dnach, a następnie inkubowano 1 godzinę w 4°C z różnymi stężeniami mutanta interferonu-beta (20 μl w buforze FACS, 5% FBS, 0,1% NaN3 w PBS). Żądane seryjne rozcieńczenia mutanta interferonu-beta wynoszą od 0,5 μM w dół do 0,5 pM. Do każdej studzienki dodawano 100 ng biotynylowanego mysiego lub szczurzego anty-IFNARl monoklonalnego przeciwciała EA12 (10 μθ, a następnie płytki inkubowano 2 minuty w temperaturze pokojowej przed dwukrotnym przemyciem buforem FACS (4°C). Następnie komórki inkubowano 30 minut w 4°C z 50 μl/studzienkę roztworu koniugatu R-Fikoerytrinostreptawidyny o rozcieńczeniu 1:200 (Jackson ImmunoResearch), przepłukano 2 razy buforem FACS, zawieszono w 300 μl buforu FACS zawierającego 0,5% paraformaldehydu, po czym przenoszono do polistyrenowych probówek 12x76 mm (Falcon 2052). Następnie próbki analizowano metodą cytometrii przepływowej na FACScan (Becton Dickinson). Wyniki wykreślano jako średnią intensywność fluorescencji kanałowej (MFCI) w funkcji stężenia mutanta interferonu-beta;
PL 206 536 B1 powinowactwo wiązań określano jako stężenie zmutowanego interferonu-beta dające 50% zahamowania barwienia przeciwciała. Każdy mutant badany był wiele razy. Figura 2 przedstawia powinowactwa wiązań receptora do każdego mutanta interferonu-beta, określone niniejszą metodą, wyrażone jako procent powinowactwa zmierzonego dla His6-dzikiego typu interferonu-beta-1a w każdym doświadczeniu.
E. Testowanie mutantów interferonu-beta pod kątem funkcji
Mutanty interferonu-beta badano również pod kątem aktywności funkcjonalnej stosując testy in vitro na aktywność antywirusową oraz pod kątem zdolności do hamowania proliferacji komórek przez interferon-beta. Dla każdego mutanta przeprowadzano minimum trzy badania antywirusowe, każde z trzema punktami zbierania danych. Do każ dego badania jako odniesienie włączono His6-interferonbeta-1a dzikiego typu. Testy antywirusowe przeprowadzono traktując przez noc komórki A549 ludzkiego raka płuc (ATCC CCL 185) serią dwukrotnych rozcieńczeń zmutowanego interferonu-beta przy stężeniach, które obejmowały zakres między pełną ochroną anty wirusową i brakiem ochrony przed zabijaniem komórek przez wirusa. Następnego dnia komórki prowokowano przez dwa dni wirusem zapalenia mózgu i mięśnia sercowego (ECMV) w rozcieńczeniu, które prowadziło do całkowitego zabicia komórek przy braku interferonu. Następnie płytki wywoływano przy zastosowaniu metabolicznego barwnika MTT (2,3-bis[2-metoksy-4-nitro-5-sulfo-fenylo]-2H-tetrazolo-5-karboksyanilid) (M-5655-Sigma-St. Louis, MO). Roztwór podstawowy MTT przygotowano jako 5 mg/ml w PBS i sterylizowano przez filtrowanie, po czym 50 μΐ tego roztworu rozcieńczano w hodowlach komórkowych (100 μl/studzienkę). Po inkubacji w temperaturze pokojowej przez 30-60 minut, roztwór MTT/pożywka odrzucano, komórki przepłukiwano 100 μl PBS i w końcu metabolizowany barwnik rozpuszczono w 100 μl 1,2 N kwasu solnego i 90% izopropanolu. Ilość komórek, które przeżyły (co wykrywano przez zabarwienie) oznaczano przez pomiar absorbancji przy 450 nm. Wyniki analizowano wykreślając absorpcję wobec stężenia zmutowanego interferonu-beta i aktywność każdego mutanta określono jako stężenie, przy którym 50% komórek uległo zabiciu. Na Figurze 5 przedstawiono aktywność każdego mutanta wyrażoną jako procent aktywności zmierzonej dla interferonu-beta-1a dzikiego typu ze znacznikiem histydynowym w każdym doświadczeniu.
Mutanty interferonu-beta badano również pod kątem działania w testach antyproliferacyjnych. Ludzkie komórki chłoniaka Daudi Burkitt'a (ATCC#CCL 213) posiano w ilości 2x105 komórek/ml RPMI 1620 uzupełnionej 10% zdefiniowaną płodową surowicą cielęcą (Hyclone, Logan, Utah) i 2 mM L-glutaminy. Każda studzienka zawierała również podane stężenie mutanta interferonu-beta w objętości końcowej 100 μl pożywki/studzienkę; stężenia używanego interferonu-beta wybrano tak, aby pokryć zakres od maksymalnej inhibicji proliferacji komórek Daudi do braku inhibicji (tj. pełnej proliferacji). Dla każdego stężenia badanego mutanta interferonu-beta zbierano dane eksperymentalne w dwóch powtórzeniach, a do wszystkich eksperymentów włączano dwa zestawy komórek nietraktowanych. Komórki inkubowano dwa dni w 30°C w inkubatorze z 5% CO2, po czym do każdej studzienki dodano 1 μ Ci trytowanej tymidyny ((metylo-3H tymidyna), Amersham TRK758) w 50 μl pożywki i inkubowano dalej przez 4 godziny. Komórki zebrano przy pomocy urządzenia do płytek LKB, a wbudowanie trytowanej tymidyny mierzono przy zastosowaniu beta-czytnika do płytek LKB. Wartości z powtórzonego eksperymentu uśredniono i wyliczono odchylenie standardowe. Wyniki przedstawiano jako średnie zliczenie/minutę wobec stężenia z mutanta interferonu-beta, a aktywność każdego mutanta zdefiniowano jako stężenie wymagane, aby uzyskać 50% zaobserwowanej maksymalnej inhibicji wzrostu. Przeprowadzono wielokrotne badania dla każdego mutanta. Fig. 4 przedstawia wyniki wyrażone jako procent aktywności stwierdzanej dla interferonu-beta-1a typu dzikiego ze znacznikiem his w każdym jego eksperymencie.
F. Właściwości mutantów interferonu-beta
Stwierdzono, że intrferon-beta-1a typu dzikiego ze znacznikiem histydynowym w testach antywirusowych i antyproliferacyjnych wykazuje aktywności, które były w obu przypadkach około 3 razy niższe niż odpowiadające aktywności znalezione dla interferonu-beta-1a typu dzikiego bez znacznika. Ponieważ wszystkie mutanty interferonu-beta A1-E zawierają identyczne sekwencje znacznika tag na końcu N, wpływ mutacji na właściwości cząsteczki określano przez porównanie aktywności tych mutantów w badaniach antywirusowych, antyproliferacyjnych i wiązania z aktywnością obserwowaną dla interferonu-beta-1a typu dzikiego ze znacznikiem histydynowym. Działając w ten sposób zakładamy, że różnice w aktywności mutantów A1-E w porównaniu z interferonem-beta-1a typu dzikiego ze znacznikiem histydynowym są ilościowo i jakościowo mniej więcej takie same, jak efekty, jakie te same mutacje mogą wywierać przy braku N-końcowego znacznika his. Równoznaczne założenie dla kon22
PL 206 536 B1 struktów ze znacznikiem albo fuzją innych rozpuszczalnych cytokin w wielu przypadkach okazało się prawdziwe przy stosowaniu przez badaczy techniki skaningowej mutagenezy alaninowej, szczególnie gdy aktywność funkcjonalna in vitro konstruktów zawierających znacznik albo fuzję jest zbliżona do tej dla cytokiny typu dzikiego, jak w przypadku tu przedstawionym. Patrz na przykład Pearce K.H. Jr, et al., J. Biol. Chem. 272:20595-20602 (1997) i Jones J.T., et al., J. Biol. Chem. 273:11667-11674(1998).
Dane przedstawione na figurach 1-4 sugerują trzy rodzaje efektów spowodowanych ukierunkowaną mutagenezą. W pewnych warunkach efekty te mogą być korzystne do rozwoju leków interferonowych. Trzy rodzaje efektów są następujące: (a) mutanty z aktywnością antywirusową wyższą niż w przypadku interferonu-beta-1a typu dzikiego (np. mutant C1); (b) mutanty, które okazują aktywność w obu testach, zarówno antywirusowych jak i antyproliferacyjnych, ale dla których aktywność antyproliferacyjna jest nieproporcjonalnie niska w stosunku do aktywności antywirusowej w porównaniu z interferonem-beta-1a typu dzikiego (np. mutanty C1, D i DE1); oraz (c) funkcjonalnie antagonistyczne (np. Al, B2, CD2 i DE1), które wykazują aktywności antywirusową i antyproliferacyjną nieproporcjonalnie niższe w stosunku do wiązania receptora w porównaniu z interferonem-beta-1a typu dzikiego. Można zauważyć, że niektóre mutanty należą do więcej niżej jednej klasę. Przegląd tych klas przedstawiono dalej. Jakkolwiek scharakteryzowaliśmy te klasy mutantów w odniesieniu do wymienionych przykładów, należy zdawać sobie sprawę, że inne mutacje w tych regionach mogą mieć podobny lub nawet większy wpływ na aktywność.
a) Mutant Cl ma aktywność anty wirusową około 6 razy wyższą niż interferon-beta-1a typu dzikiego ze znacznikiem his. Mutant ten i inne tego typu, zakłada się, że będą przydatne w zmniejszaniu ilości interferonu-beta, który należy podawać, aby osiągnąć żądany poziom działania antywirusowego. Obniżając ilości podawanego białka oczekuje się zmniejszenia jego immunogenności i również zmniejszenia działania ubocznego wynikającego z toksyczności niezwiązanej z mechanizmem działania. Mutacje w tej klasie przewiduje się jako korzystne w sytuacjach, gdy terapeutyczna korzyść przy podawaniu interferonu-beta wynika z jego działania antywirusowego, i gdzie efekty antyproliferacyjne przyczyniają się do toksyczności lub niepożądanych efektów ubocznych.
b) Względne aktywności (% dzikiego typu) mutantów z podstawieniami alaninowymi w testach antywirusowych i antyproliferacyjnych przedstawiono na fig. 5. U większości mutantów (położonych na liniach przekątnych) obserwuje się skoordynowaną zmianę aktywności (tj. aktywności antywirusowe i antyproliferacyjne różnią się o ten sam współczynnik od aktywności interferonu-beta-1a typu dzikiego ze znacznikiem histydynowym). Kilka mutantów, jednakże, wykazuje większe zróżnicowanie w aktywności w jednym teście w stosunku do drugiego, a w porównaniu do interferonu-beta-1a typu dzikiego ze znacznikiem histydynowym, co widać jako przesunięcie wobec linii przekątnej. Trzy takie mutanty przedstawiono w tabeli 3 poniżej. Mutant C1 wykazuje aktywność antywirusową około 6-krotnie wyższą niż interferon-beta-1a typu dzikiego ze znacznikiem histydynowym, ale jego aktywność w teście antyproliferacyjnym jest podobna jak u typu dzikiego. Mutant C1 wykazuje zatem aktywność antywirusową zwiększoną 5,2-krotnie ponad aktywność antyproliferacyjną w stosunku do interferonu-beta-1a typu dzikiego ze znacznikiem histydynowym. Podobnie mutant D wykazuje 65% aktywności typu dzikiego w teście antywirusowym, ale tylko o 20% aktywności typu dzikiego w teście antyproliferacyjnym, tak więc aktywność antywirusową ma podwyższoną 3,4-krotnie w stosunku do swej aktywności antyproliferacyjnej w porównaniu z typem dzikim. Mutant DE1 wykazuje 26% aktywności typu dzikiego w teście antywirusowym i tylko 8,5% w teście antyproliferacyjnym, a więc ma aktywność antywirusową zwiększoną 3,0-krotnie w stosunku do swojej aktywności antyproliferacyjnej w porównaniu z interferonem-beta-1a typu dzikiego ze znacznikiem histydynowym. Jeżeli białka tego mutanta podaje się w stężeniu wystarczającym, aby osiągnąć pożądany poziom aktywności antywirusowej, wykażą one istotnie niższy poziom aktywności antyproliferacyjnej niż białka typu dzikiego. Mutacje w tej klasie, podobnie jak mutanty w klasie (a) są przewidywane jako prawdopodobnie przydatne w sytuacjach, w których korzyść terapeutyczna przy podaniu interferonu-beta wynika z efektów antywirusowych i gdzie efekty antyproliferacyjne przyczyniają się do toksyczności i niepożądanych skutków ubocznych.
PL 206 536 B1
Mutant Aktywność antywirusowa (AV) (% typu dzikiego) Aktywność antyproliferacyjna (AP) (% typu dzikiego) AV/AP
C1 571 109 5,2
D 65 19 3,4
DE1 26 8,5 3,0
(c) Mutanty o aktywnościach antywirusowych i antyproliferacyjnych, które są niskie w stosunku do wiązania się z receptorem w porównaniu do interferonu-beta-1a typu dzikiego ze znacznikiem histydynowym (patrz tabela 4, poniżej). Mutant A1 wykazuje aktywności antywirusowe i antyproliferacyjne, które są 2-krotnie i 1,8-krotnie wyższe niż te, które stwierdza się dla interferonu-beta-1a typu dzikiego ze znacznikiem histydynowym, ale wiążą się z pokrewnym receptorem na komórkach Daudi z powinowactwem 29-krotnie wyższym niż typ dziki. Wiązanie mutanta do receptora IFN-beta jest zwiększone około 15 razy w porównaniu z antywirusową i antyproliferacyjną aktywnością białek. Podobnie, mutanty B2, CD2 i DE1 wykazują podwyższenie wiązania w stosunku do aktywności antywirusowej, odpowiednio 4,6-, 4,6- i 18-krotnie, a w stosunku do aktywności proliferacyjnej odpowiednio, 3,5-, 15- i 50-krotnie. Można przewidywać, że białka te będą przydatne jako funkcjonalnie antagonistyczne wobec aktywności endogennego IFN-beta i prawdopodobnie innych endogennych interferonów Typu I, ponieważ mają one zdolność do wiązania i zajmowania receptora, a zatem będą dawać jedynie małą część odpowiedzi funkcjonalnej w docelowych komórkach, obserwowanej dla IFN-beta typu dzikiego.
Mutant Aktywność antywirusowa (AV) (% typu dzikiego) Aktywność antyproliferacyjna (AP) (% typu dzikiego) Aktywność wiązania komórek (% typu dzikiego) Wiązanie/AV Wiązanie/ AP
A1 200 180 2900 15 16
B2 7,1 9,2 33 4,6 3,5
CD2 150 46 690 4,6 15
DE1 26 8,5 460 18 54
G. Powiązanie mutein z trójwymiarową strukturą interferonu.
Jakkolwiek opublikowane struktury krystaliczne nieglikozylowanych form mysiego/szczurzego interferonu beta (T. Senda, S. Saitoh and Y. Mitsui. Refined Crystal Structure of Recombinant Murine Interferon-β at 2.15 A Resolution. J. Mol. Biol 253: 187-207 (1995) i ludzkiego interferonu alfa-2b (R. Radhakrishnan, L.J. Walter, A. Hruza, P. Reichert, P.P Trotta, T.L. Nagabhushan and M.R. Walter. Zinc Mediated Dimer of Human Interferon-a2b Revealed by X-ray Crystallography. Structure. 4: 1453-1463 (1996) dostarczyły modeli dla szkieletu polipeptydowego ludzkiego interferonu-beta, ostatnio rozwiązaliśmy strukturę interferonu-beta-1a w postaci glikozylowanej (M. Karpusas, M. Nolte, C.B. Benton, W. Meier, W.N. Lipscomb, and S.E Goelz. The Crystal Structure of Human Interferon-β at 2.2 A resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 11813-11818 (1997)).
Wyniki naszych analiz można podsumować w odniesieniu do struktury trójwymiarowej interferonu-beta-1a (tu nie przedstawiona). Niektóre mutacje spowodowały obniżenie aktywności (2 do ponad 5-krotnego spadku). Mutowane regiony odpowiadają podstawieniom przedstawionym w tabelach 1 i 2.
Mutacje, które mają największy wpływ na funkcję prowadziły do dramatycznego spadku zarówno aktywności, jak i wiązania komórkowego receptora powierzchniowego. Mutacje w tym regionie (helisa A2, pętla AB i AB2 oraz helisa E) odpowiadają mutacjom w miejscu wiązania się z IFNAR2, ponieważ żaden z tych mutantów nie wiąże się z IFNAR/F w naszym teście. Reszty ważne dla aktywności antywirusowej i antyproliferacyjnej są umieszczone w niższej połowie cząsteczki IFN-beta (panel a i b). Mutacje w wyższej połowie cząsteczki, gdzie końce aminowy i karboksylowy są usytuowane, nie mają wpływu na aktywność biologiczną i wiązanie z receptorem.
Mutacje w helisie A2, AB, pętli AB2 i helisy E są najistotniejsze w swoim wpływie i funkcji i dają duże zmniejszenie w obu aktywnościach i wiązaniu z powierzchniowym receptorem komórki. Region ten (helisa A2, AB, pętla AB2 i helisa E) odpowiadają miejscu wiązania INFAR2 ponieważ żaden z tych mutantów nie wiązał INFAR/Fc w naszym oznaczeniu.
PL 206 536 B1
Jakkolwiek te mutacje, które były bardzo ważne dla wiązania IFNAR 2 wpływały również na wiązanie się z komórką, na właściwości wiązania się z powierzchnią komórki mają również wpływ reszty w innych regionach cząsteczki (helisa B1, helisa C2). Można zauważyć w modelu trójwymiarowym (nie przedstawionym) pokazującym wpływ podstawień alaninowych, że N-końcowe, C-końcowe i glikozylowane regiony helis C w cząsteczce IFN-beta-1a nie są położone w miejscu wiązania się z receptorem. Mutacje w tych regionach nie zmniejszają aktywności biologicznej ani nie zmniejszają wiązania się z powierzchniowym receptorem komórkowym.
P r z y k ł a d 2: Wytwarzanie i charakterystyka koniugatów interferonu-beta-1a.
A. Wytwarzanie PEGylowanego interferonu.
Surowy preparat interferonu-beta-1a (sprzedawany jako AVONEX® produkt pośredni w 250 μg/ml w 100 mM fosforanu sodu, pH 7,2, 200 mM NaCl) rozcieńczono w równej objętości 100 mM MES pH 5,0 i pH doprowadzono do 5,0 za pomocą HCl. Próbka była nakładana na SP-Sepharozę® w kolumnie FF (Pharmacia, Piscataway NJ) w ilości 6 mg interferonu-beta-1a/ml żywicy. Kolumnę przepłukano 5 mM fosforanu sodu o pH 5,5 i 75 mM NaCl, a następnie produkt eluowano 30 mM fosforanem sodu pH 6,0 i 600 mM NaCl, po czym analizowano wartości absorbcji frakcji eluatu przy 280 nm. Stężenie interferonu w próbce oznaczano z absorbcji przy użyciu współczynnika ekstynkcji o wartości 1,51 na 1 mg/ml roztworu.
Do roztworu o stężeniu 1 mg/lml interferonu-beta-1a z SP-eluatu dodano 0,5 M fosforanu sodu o pH 6,0 do uzyskania stężenia 50 mM, cjanoborowodorek sodu (Aldrich, Milwaukee, WI) dodano do 5 mM, a aldehyd PEG 20K (Shearwater Polymers, Huntsville, AL) dodano do 5 mg/ml. Próbkę inkubowano 20 godzin w temperaturze pokojowej. PEGylowany interferon został oczyszczony z produktów reakcji metodą chromatografii sekwencyjnej na kolumnie Superose® 6FPLC (Pharmacia) z 5 mM fosoranem sodu o pH 5,5, 150 mM NaCl jako faza ruchoma oraz SP-Sepharose® FF. Sączenie molekularne na kolumnie dało w efekcie ogólny rozdział na zmodyfikowany i niezmodyfikowany interferon-beta (chromatogram nie przedstawiony tutaj). Eluat z filtracji żelowej zawierający PEG-interferon-beta rozcieńczono wodą 1:1 i nałożono 2 mg interferonu-beta/ml żelu na kolumnę z SP- Sepharose®. Kolumnę przemyto 5 mM fosforanem sodu o pH 5,5 i 75 mM NaCl, a następnie PEG-interferon-beta eluowano z kolumny 5 mM fosforanem sodu o pH 5,5, 800 mM NaCl. Frakcje eluatu analizowano na zawartość białko przy absorbancji 280 nm. Stężenie pegylowanego interferonu jest przedstawione w formie równoważników interferonu, gdyż część PEG nie wpływa na absorbancję przy 280 nm.
B. Charakterystyka biochemiczna PEGylowanego interferonu.
Próbki przeanalizowano pod kątem zakresu modyfikacji metodą SDS-PAGE (żelu nie przedstawiono). Dodatek pojedynczego PGG dał w rezultacie przesunięcie masy interferonu z 20 kDa do 55 kDa, co było łatwo widoczne na podstawie analizy. W przypadku PEGylowanej próbki nie było dowodu braku zmiany interferonu-beta-1a ani zwiększenia masy wynikającego z obecności dodatkowych grup PEG. Obecność pojedynczego PEG sprawdzono metodą spektrometrii masowej MALDI. Specyficzność reakcji pegylowania oceniono za pomocą mapowania peptydowego. Próbki po 20 mg pegylowanego i niezmienionego interferonu-beta-1a jako kontroli w 240 μl z 200 mM Tris HC1 o pH 9, 1 mM EDTA trawiono za pomocą 1,5 μg lizyloendoproteinazy z Achromobacter (Wako Bioproducts, Richmond, VA) przez 3-4 godz. przy 27°C. 200 mg guanidyny HCl dodano do każdej z próbek, a produkty cięcia frakcjonowano na kolumnie Vydac C4 (46 x 25 cm) stosując przez 30 min gradient od 0 do70% acetonitrylu w 0,1% TFA przy szybkości przepływu 1,4 ml/min. Wypływ z kolumny monitorowano przez absorbancję przy 214 nm.
Wyniki z analizy przedstawiono na figurze 6. Wszystkie przewidywane peptydy z trawienia interferonu-beta-1a przez Lys-C endoproteinazę zidentyfikowano przez N-końcowe sekwencjonowanie i spektrometrię masową, a tylko peptydy, które zawierają koniec N interferonu (AP8) uległy zmianie przez modyfikację o czym świadczy ich zniknięcie z mapy. Mapowanie danych wskazuje zatem, że część PEG jest specyficznie przyłączona do peptydu. Dane wskazują ponadto, że miejscem modyfikacji PEG jest koniec N białka, ponieważ tylko modyfikacja końca N mogłaby wpłynąć na specyficzny ubytek tego peptydu.
Dodatkowy dowód dla takiej konkluzji uzyskano izolując PEGylowany koniec N peptydu po cięciu Lys-C-endoproteinazą, trawiąc dalej peptydy cyjankiem bromu (CNBr) i poddając te próbki analizie sekwencji przy zastosowaniu MALDI PSD. Trawienie końca N peptydu CNBr może dalej przecinać ten peptyd na dwa fragmenty, końcową metioninę (Ml) zawierają resztę PEG i SYNLLGFLQR (reszty 2-11 w dojrzałej sekwencji interferonu-beta). Analiza sekwencji pozwoliła zidentyfikować niezmieniony peptyd SYNLLGFLQR, który był przewidzianym wynikiem takiego działania.
PL 206 536 B1
Aktywność antywirusową interferonu-beta-1a testowano na ludzkich komórkach (A549) raka płuc, które eksponowano na wirusa zapalenia mózgu i mięśnia sercowego (encephalomyocarditis) (EMC) korzystając z opisanej wyżej procedury włączającej barwienie MTT. Pokrótce, komórki A549 traktowano wstępnie przez 24 godziny interferonem-beta-1a lub PEG-zmodyfikowanym iterferonembeta-1a (4000, 2000, 1000, 500, 250, 125, 75, 62,5, 31,25, 50, 33,3, 22,2, 14,8, 9,9, 6,6, 4,39 pg/ml) przed prowokacją wirusem. Test przeprowadzono stosując dwa punkty czasowe dla każdego stężenia interferonu-beta-1a. Odchylenie standardowe pokazano jako pionowe kreski na figurze 7. Stężenie interferonu-beta-1a ( w formulacji lub masie, które daje 50% zabijania wirusem (50% „efekt cytopatyczny) (50% maksimum OD450) wynosiło około 11 pg/ml, a 50% efekt cytopatyczny interferferonubeta-1 a modyfikowanego PEG wynosił około 11 pg/ml. Tak więc sprzężenie PEG nie wpływa na aktywność antywirusową interferonu-beta-1a. W tym teście stwierdzaliśmy rutynowo, że aktywność specyficzna interferonu-beta-1a jest około 10-krotnie wyższa niż aktywność specyficzna interferonu-beta-1b, a zatem PEGylowany interferon-beta-1a jest znacząco bardziej aktywny niż dowolny produkt interferonu-beta-1b.
Interferon-beta-1a był również PEGylowany za pomocą cząsteczek 5K PEG-aldehydu, które zakupiono w Fluka, Inc. (Nr kat. 75936, Ronkonkoma, NY), przy zastosowaniu tej samej procedury jaką opisano dla modyfikacji za pomocą 20K PEG-aldehydu z tą różnicą, że mieszanina reakcyjna zawierała 2 mg/ml 5K PGE. Modyfikacja z 5K PEG była również specyficzna dla końców N i nie zmieniała aktywności antywirusowej interferonu-beta-1a. Podobnie jak w przypadku połączenia z 20K, interferon-beta-1a z 5K PEG był nie do odróżnienia od niemodyfikowanego interferonu-beta-1a w testach antywirusowych.
P r z y k ł a d 3: PEGylacja chroni interferon-beta-1a przed agregacją wy wołaną stresem
Agregacja interferonu-beta ma szkodliwy wpływ na aktywność. Wcześniej wykazaliśmy, że glikozylacja ma dramatyczny wpływ na stabilność iterferonu-beta-1a w stosunku do nieglikozylowanych form interferonu-beta i wywnioskowano, że glikozylacja przyczynia się do wyższej aktywności specyficznej interferonu-beta-1a (Runkel L., et al., 1998, Pharm. Res. 15:641-649)). W celu zbadania, czy sprzężenie z polimerem polialkilenoglikolowym może dalej stabilizować interferon-beta, przeprowadziliśmy na PEGylowanym interferonie-beta-1a badania dotyczące stresu termicznego według następującego protokołu:
Denaturację termiczną przeprowadzono przy zastosowaniu spektrofotometru CARY 3 UV-widzialne, wyposażonego w kontrolowaną komputerowo termoelektrycznie ogrzewaną obsadę kuwety. Roztwory interferonu-beta-1a w 20 mM HEPES pH 7,5, 20 mM NaCl doprowadzono do temperatury 25°C w 1 ml kuwecie. Temperatura obsady kuwety została następnie podwyższona z 25°C do 80°C z szybkością 2°C/min, a denaturację białka śledzono przez ciągły pomiar absorbancji przy 280 nm. Punkt środkowy koperatywnego punktu rozfałdowania, Tm, otrzymano z krzywych topnienia przez określenie temperatury, przy której mierzona absorbancja miała wartości pośrednie między wartościami określonymi przez liniową ekstrapolację liniowych regionów po obydwu stronach kooperatywnego przejścia do rozfałdowania.
Wyniki tych analiz przedstawiono na Figurze 8. Jakkolwiek PEGylowany interferon-beta-1a denaturował i agregował w 50% punktem przejścia w 60°C, to nie było oznaki agregacji PEGylowanego interferonu nawet przy 80°C. W niezależnych analizach zwiększyliśmy stosowany stres termiczny do 95°C i nawet przy tej bardziej podwyższonej temperaturze nie stwierdziliśmy żadnych oznak agregacji. Tak wiec, sprzężenie z polimerem polietylenoglikolowym wywiera istotny i korzystny wpływ na stabilność białka. Podobną stabilizację zaobserwowano w przypadku interferonu-beta-1a zawierającego PEG 20K i 5K.
P r z y k ł a d 4: Pomiar aktywności antywirusowej interferonu-beta-1a w osoczu myszy traktowanej interferonem-beta-1a i PEGylowanym interferonem-beta-1a
Myszom (C57/B16) wstrzykiwano dożylnie do żyły ogonowej 50000 jednostek interferonu-beta-1a albo 50000 jednostek PEGylowanego interferonu-beta-1a zawierającego PEG 20K albo równą objętość buforu fosforanowego podawano jako kontrolę. Krew była pobierana od tych myszy przez skrwawianie pozaoczodołowe w różnych punktach czasowych po iniekcji (natychmiast, 0,25, 1, 4, 24 i 48 godzin). Dla każdego punktu czasowego skrwawiano co najmniej trzy myszy. Pełną krew zbierano do probówek zawierających antykoagulant, komórki usuwano, a uzyskane osocze zamrażano do czasu badania. Te próbki osocza badano następnie w testach antywirusowych.
Próbki osocza rozcieńczano 1:10 w pożywce testowej wolnej od surowicy i przepuszczono przez filtr strzykawkowy 0,2 μπ. Rozcieńczone próbki miareczkowano w oznaczonych studzienkach
PL 206 536 B1
96-studzienkowej płytki do hodowli tkankowych zawierających komórki A549. Na każdej płytce testowano rozcieńczenia standardu interferonu-beta-1a (10, 6,7, 4,4, 2,9, 1,3, 0,9 i 0,6 U/ml) oraz4 próbki osocza. Komórki A549 wstępnie potraktowano próbkami na 24 godzin przed prowokowaniem wirusem EMC. Po dwudniowej inkubacji z wirusem żyjące komórki wybarwiono przez 1 godzinę roztworem MTT (5 mg/ml w buforze fosforanowym), przepłukano buforem fosforanowym i solubilizowano za pomocą 1,2 N HCl w isopropanolu. Studzienki czytano przy 450 nm. Krzywe standardowe przygotowuje się dla każdej płytki i stosuje do określenia aktywności inerferonu-beta-1a w każdej testowanej probówce. Aktywności w próbkach od różnych myszy są wykreślone na figurze 9 wobec punktów czasowych.
Powolniejszy ubytek fuzji interferonu-beta-1a z krążenia w funkcji czasu wskazuje, że okres półtrwania próbki PEGylowanyego interferoneu-beta-1a jest znacznie dłuższy niż kontrolnego niezmodyfikowanego interferonu-beta-1a. Podczas gdy próbka kontrolna była w dużym stopniu usunięta po 4 godzinach, to po 48 godzinach wykryto jeszcze istotny poziom produktu PEGylowanego. W oparciu o wstępne poziomy aktywności w surowicy i te, który pozostały po 48 godzinach, dochodzimy do wniosku, że okres półtrwania PEGylowanego interferonu jest przedłużony w porównaniu do okres półtrwania niezmodyfikowanego interferonu-beta-1a. Drugi, bardzo istotny wniosek z badań jest taki, że bardzo mało PEGylowanego interferonu ubyło w fazie rozprowadzania, czego dowodzi podobnie wysoki poziom aktywności w punktach czasowych 0 i po 60 minutach. Dane te wskazują, że w przeciwieństwie do kontrolnego interferonu-beta-1a, dystrybucja PEGylowanego produktu jest ograniczona głównie do układu naczyniowego.
P r z y k ł a d 5: Farmakokinetyka i farmakodynamika porównawcza u zwierząt naczelnych (protokoły ogólne)
Badania porównawcze przeprowadzono na koniugatach polimer-interferon-beta-1a w natywnym interferonie-beta-1a (jako niesformułowany w masie interferon-beta-1a w fosforanie sodu i NaCl, pH 7,2) w celu określenia ich względnej trwałości i aktywności u zwierząt naczelnych. W niniejszych badaniach farmakokinetyka i farmakodynamika koniugatów białka fuzyjnego interferonu-beta-1a u naczelnych porównuje się z danymi dla natywnego interferonu-beta-1a, a racjonalne wnioski mogą byłą rozszerzone na ludzi.
Zwierzęta i metody
Plan badań
Jest to grupa równoległych badań z powtarzaniem dawki w celu oceny porównawczej farmakokinetyki i farmakodynamiki interferonu-beta-1a skoniugowanego i nieskoniugowanego.
Do badań wykorzystuje się zdrowe zwierzęta naczelne (najlepiej małpa rhesus). Przed dawkowaniem wszystkie zwierzęta będą ocenione pod względem stanu zdrowia przez Laboratorium Chorób Zwierząt dwa razy w ciągu 14 dni przed testem podania substancji; jedna ocena musi być przeprowadzona w ciągu 24 godzin przed pierwszym testem podania substancji. Tylko zdrowe zwierzęta mogą otrzymać testową substancję. Ocena obejmuje ogólne badanie fizyczne oraz pobranie krwi przed dawką do określenia wyjściowej patologii klinicznej i wyjściowego poziomu przeciwciał przeciw interferonowi-beta-1a. Wszystkie zwierzęta będą zważone oraz będzie zmierzona temperatura ciała w czasie 24 godzin przed testem podania substancji.
Wybiera się dwanaście obiektów i przypisuje do grup, w celu otrzymania interferonu-beta-1a w ilości 1 MU/kg albo jako koniugat albo jako nieskoniugowany, ale poza tym identyczny inerferonbeta-1a. Podanie dokonuje się drogą podskórną (SC) albo dożylną (IV). Wszystkie zwierzęta nie mogły mieć do tej pory kontaktu z interferonem-beta. Każde zwierzę otrzyma dawkę dwukrotnie; dawkowanie będzie w odstępach czterech tygodni. Objętość dawki wyniesie 1,0 ml/kg.
Krew pobierana jest do testów farmakokinetycznych w różnych przedziałach czasowych po każdej iniekcji. Próbki krwi do pomiarów biologicznego markera indukowanego interferonem, neopteryny w surowicy, są również pobierane po podaniu badanego leku.
Ocena w czasie trwania badań obejmuje obserwacje kliniczne prowadzone 30 minut i 1 godzinę po podaniu dawki w celu wykrycia objawów toksykologicznych. Codzienne obserwacje zwierząt przebywających w klatkach będą przeprowadzone w celu zaprotokołowania samopoczucia ogólnego, objawów toksycznych, dyskomfortu oraz zmian w zachowaniu. Ciężar ciała i temperatura ciała będą rejestrowane w regularnych odstępach czasu przez okres 21 dni po dawkowaniu.
Metody badań
Poziomy interferonu-beta w surowicy oznacza się ilościowo przy użyciu efektu cytopatycznego (CPE). Badania CPE mierzą poziomy aktywności antywirusowej, w której pośredniczy interferon. Poziom aktywności antywirusowej w próbce odzwierciedla ilość cząsteczek aktywnego interferonu zawartych
PL 206 536 B1 w próbce w czasie po pobraniu krwi. Takie podejście jest metodą standardową w celu oszacowania farmakokinetyki interferonu-beta. Oznaczanie CPE stosowane w obecnych badaniach wykrywa zdolność interferonu-beta do ochrony komórek ludzkiego raka płuc (A549, #CCL-185, ATCC, Rockville, MD) przed cytotoksycznością spowodowaną wirusem zapalenia mózgu i mięśnia sercowego (EMC). Komórki inkubuje się wstępnie przez 15 do 20 godzin z próbkami surowicy, aby umożliwić indukcję i syntezę białek indukowanych przez interferon, które następnie podnoszą odpowiedź antywirusową. Następnie dodaje się wirus EMC i inkubuje przez dalsze 30 godzin przed testowaniem cytotoksyczności przy zastosowaniu barwienia fioletem krystalicznym. Wewnętrzny standard interferonu-beta, jak również standard wewnętrzny koniugatu PEG są testowane równocześnie z próbkami na każdej płytce badawczej. Standard jest kalibrowany wobec referencyjnego standardu naturalnego interferonu z ludzkich fibroblastów (WHO Second International Standard for Interferon, Humań Fibroblast, Gb-23-902-53). Każda płytka testowa zawiera również studzienki dla kontroli wzrostu komórek nie zawierające ani żadnego rodzaju interferonu beta, ani EMC, oraz studzienki dla kontroli wirusów, zawierają komórki i EMC ale nie interferon-beta. Przygotowuje się również płytki kontrolne zawierające standardy i próbki w celu ustalania efektów, jeżeli takie są, dotyczących wzrostu komórek w próbkach. Płytki takie barwione są bez dodatku wirusów.
Próbki i standardy są testowane w dwóch powtórzeniach na każdej z dwóch kopi płytek badawczych co daje cztery wyniki na próbkę. Podawana jest średnia geometryczna stężenia w czterech powtórzeniach. Granica wykrywania w tym teście wynosi 10 jednostek (U)/ml.
Stężenia neopteryny w surowicy określa się w jednostkach farmakologii klinicznej przy użyciu dostępnych handlowo testów.
Farmakokinetyka i metody statystyczne
Do dopasowania danych do modeli farmakokinetycznych zastosowano oprogramowanie RstripTM (MicroMath, Inc., Salt Lake City, UT). Średnie geometryczne stężenia są wykreślane względem czasu dla każdej grupy. Ponieważ wyniki badań wyrażone są w rozcieńczeniach, średnie geometryczne są bardziej brane pod uwagę niż średnie arytmetyczne. Poziomy interferonu w surowicy są dopasowane do wyjściowych wartości, a stężenie niewykrywalne w surowicy ustalono na 5 U/ml, co odpowiada połowie najniższej granicy detekcji.
Dla danych infuzji IV dwu kompartmentowy model infuzji IV jest dopasowany do wykrywalnych stężeń surowicy dla każdego obiektu, a dane SC pasują do dwukompartmentowego modelu iniekcyjnego.
Wyliczane są następujące parametry farmakokinetyczne:
(i) obserwowane maksymalne stężenie Cmax (U/ml);
(ii) powierzchnia pod krzywą od 0 do 48 godzin., AUC stosując zasadę trapezoidalną;
(ii) eliminacja czasu półtrwania;
oraz, z danych infuzyjnych IV (jeżeli stosuje się IV):
(iv) rozkład półtrwania (h) (v) klirens (ml/h) (vi) widoczna objętość dystrybucji, Vd (1).
Oprogramowanie WinNonlin (Scientific Consulting Inc., Apex, NC) zastosowano do obliczenia eliminacji czasu półtrwania po iniekcjach SC i IM.
W przypadku neopteryny dla każdej grupy przedstawiana jest średnia arytmetyczna funkcji czasu. Obliczona jest Emax, to jest maksymalna zmiana od linii zerowej. Cmax, AUC i Emax poddane są jednokierunkowej analizie wariancji w celu porównania grup dawkowanych. Cmax i AUC są przekształcane logarytmicznie przed analizą; przedstawiane są średnie geometryczne.
P r z y k ł a d 6: Porównawcza ocena farmakokinetyk PEGylowanego interferonu-beta-1a i interferonu-beta-1a u małpy Rhesus.
Materiał i metody
Interferon-beta-1a lub PEGylowany IFN-beta-1a podawano małpom Rhesus pierwszego dnia i ponownie 29-go dnia drogą dożylną (IV) lub podskórną (SC), co opisano w przykładzie 5 ogólnego protokołu. W pierwszym dniu sześć małp otrzymało IFN-beta-1a (po trzy na poszczególne drogi pobrania), a następnie sześć małp otrzymało PEGylowany IFN-beta-1a (po trzy na poszczególne drogi pobrania). W 29 dniu dawki powtórzono. Dawkę IV podano jako powolną iniekcję do żyły głowowej lub odpiszczelowej.
Dawkę SC podano pod skórę na grzbiecie po ogoleniu miejsca iniekcji. Krew pobrano przez żyłę udową w określonym czasie, a następnie poddano krzepnięciu w celu uzyskania surowicy. Zatwierdzoną metodą antywirusową CPE analizowano w surowicy poziom aktywnych składników leków,
PL 206 536 B1 a farmakodynamiczną metodą pomiaru aktywności oznaczano w surowicy poziomy neopteryny i beta2-mikroglobuliny. Parametry farmakologiczne obliczono za pomocą Software WinNonlin wersja 2.0 (Scientific Consulting Inc., Apex, NC).
Dane dotyczące stężenia analizowano standardową metodą niezależną (analiza nieprzedziałowa) w celu uzyskania parametrów farmakokinetycznych. Obszar pod krzywą (AUC) obliczano przy wykorzystaniu zasad trapezoidalnych. Badania statystyczne, włączając średnią arytmetyczną i odchylenie standardowe, przeprowadzono przy wykorzystaniu Software Microsoft Excel wersja 5.0 (Microsoft Corp., Redmond WA). Uzyskane wartości stężeń poniżej poziomu określenia ilościowego (BLQ) nie były stosowane do analiz farmakokinetycznych. Ze względu na fakt, że różne komputery i różne programy komputerowe zaokrąglają lub ścinają liczby w różny sposób, wartości w niektórych tablicach (np. średnie, odchylenia standardowe lub wartości indywidualne) mogą nieco różnić się od wartości w innych tablicach lub od danych otrzymywanych obliczeniach indywidualnych lub od danych analiz statystycznych. Ani integralność, ani interpretacja danych nie ulegały wpływom tych zróżnicowań.
Wyniki i dyskusja
Przy każdym sposobie podawania, pegylowany IFN-beta-1a wykazywał wyższą dostępność biologiczną (jak wyliczano z obszaru pod krzywą wykresu stężenie-czas). Dodatkowo pegylowany IFN-beta-1a miał wyższą absolutną dostępność biologiczną w porównaniu z IFN-beta-1a podanym drogą SC. Parametry farmakokinetyczne podsumowujemy w tabeli 5. Podawanie pegylowanego IFN-beta-1a zarówno drogą IV, jak i drogą SC prowadzi do wzrostu okresu półtrwania jak, również w AUC dla IFN-beta-1a.
T a b e l a 5
Średnia (+/-odch.std.) BG9418 parametry farmakokinetyczne po podawaniu drogą IV lub SC (dawka pierwsza) podanie 1 MU/kd IFN-b-1a lub pegylowanego IFN B-1a małpom Rhesusa
Kompozycja (droga podawania leku) Cmax Tmax AUCU*godz/m L CL(ml/kg) Vss (ml/kg) T1/2
IFN B-1a (IV) 6400 0,083 4453 229 543 3,2
(±0) (±0) (±799) (±38) (±147) (±1,4)
Pegylowany IFN-b-1a (IV) 10800 0,083 34373 29 250 9,5
(±3811) (±0) (±3601) (±3) (±30) (±2,1)
IFN B-1a (SC) 277 (±75) 5,3 (±1,2) 4753 (±3170) N/A N/A 10,0 (±2,9)
pegylowany IFN B-1a (SC) 1080 3 3 42283 N/A N/A 22 0
(±381) (±1,2) (±5934) (±3,4)
an=3
W wyniku podania pierwszej dawki drogą typu IV, średnie (±odchyl. std.) maksymalne stężenie w surowicy (Cmax) IFN beta-1a i pegylowanego IFN beta-1a wynosiło odpowiednio 6400 (±0) i 10800 (±3.5) U/ml. Średnia (±odchyl.std.) wartości AUC wyniosła odpowiednio 4453 (±799) i 34373 (±3601) U*godz./mL. Po pierwszym podaniu drogą SC, średnie (±odchyl. std.) Cmax IFN beta1a i pegylowanego IFN beta-1a wyniosło odpowiednio 277 (±75) i 1080 (±381) U/ml. Średnie (±odchyl. std.) wartości AUC wyniosły odpowiednio 4753 (±3170) i 44952 (±1443) U*godz./ml.
Zarówno poziom neopteryny w surowicy, jak i poziom beta-2-mikroglobuliny były podwyższone po podaniu IFN-beta i pegylowanego IFN-beta, co wskazuje na działanie farmakologiczne produktów. Przy wysokich dawkach testowanych związków nie było żadnych różnic w aktywności farmakologicznej IFN beta-1a i pegylowanego IFN beta-1a niezależnie od drogi podawania (dane nie przedstawione).
P r z y k ł a d 7: Ocena porównawcza farmakokinetyk pegylowanego interferonu-beta-1a i interferonu beta-1a u szczurów w zależności od różnych metod podawania
Celem niniejszego badania było porównawcze określenie dostępności biologicznej interferonubeta-1a i pegylowanego interferonu beta-1a przy różnych metodach podawania.
Materiały i metody
Do analiz farmakokinetycznych wykorzystano samice szczurów Levis (o wadze 190 g każda), po dwie na różną drogę podawanego środka. Szczury były szyjnie kanulowane i albo ludzki interferonbeta-1a lub 5K pegylowanego ludzkiego interferonu-beta-1a lub 20K ludzkiego interferonu-beta-1a (w nośniku składającym się z 14 mg/ml HSA w 50 mM fosforanu sodu, 100 mM NaCl, pH 7,2) podaPL 206 536 B1 wano dożylnie, śródotrzewnowo, doustnie, podskórnie lub dotchawicznie. Krew pobierano kilka razy w czasie 72 godzin po 0,5 minutach, 15 minutach, 30 minutach, 75 minutach, 3godzinach, 24 godzinach, 48 godzinach i 72 godzinach. Protokół przedstawiono w tabeli 6. W celu wykrycia interferonubeta w surowicy przeprowadzono biotest efektu cytopatycznego (CPE) na próbkach surowicy. Wyniki uzyskane przy niezmodyfikowanym interferonie-beta-1a i pegylowanym interferonie-beta-1a z 20K PEG przedstawiono w tabeli 7. We wszystkich przypadkach, pegylowanie wpływało na istotny wzrost w t1/2 i AUC.
T a b e l a 6
T a b e l a 7
Parametry farmakokinetyczne po podawaniu IV, SC, IP lub IT iterferonu-beta-1a (IFN) i pegilowanego IFN beta-1a (IFN-PEG) u szczurów.
Określenie drogi podania próbki Cmax (U/mL) Tmax (godz.) AUC/dawka (U godz.) /(ml μg) T1/2 (godz.)
IFN (IV, 20 μ9 dawkę) 64000 0,25 3035 1,25
IFN-PEG (IV,3 μ9 dawkę) 23970 0,08 47728 8,44
IFN (SC, 20 μ9 dawkę) 2400 1,00 464,4 0,96
UFN-PEG (SC, 3 μ9 dawkę) 2400 7,00 14688 11,9
IFN (IP, 20 μ9 dawkę) 26000 1,25 4159 1,53
IFN-PEG (IP, 3 μ9 dawkę) 9700 1,25 52148 16,2
IFN (IT, 15 μ9 dawkę) 240 1,5 70,7 1,29
IFN-PEG (IT, 15 μ9 dawkę) 270 7,0 233,5 6,21
P r z y k ł a d 8: Efekty anty-angiogenne koniugatów interferon-Beta-1a-polimer: testowanie zdolności PEGylowanego interferonu-beta-1a do hamowania proliferacji komórek śródbłonkowych in vitro.
PL 206 536 B1
Ludzkie żylne komórki śródbłonkowe (Cell Systems, Cat. #2V0-P75) i ludzkie skórne mikronaczyniowe komórki śródbłonkowe (Cell Systems, Cat. #2M1-C25) utrzymywano w hodowli w pożywce CS-C Medium Kit (Cell Systems, Cat. #4Z0-500). Dwadzieścia cztery godziny przed badaniem komórki trypsynizowano i zawieszano w pożywce testowej 90% Ml 99 i 10% wołowej surowicy płodowej (FBS) i doprowadzano do żądanej gęstości komórek. Komórki następnie wysiewano w 24- lub 96-studzienkowych płytkach pokrytych żelatyną w ilościach 12500 komórek/studzienkę lub 2000 komórek/studzienkę, odpowiednio.
Po całonocnej inkubacji pożywkę testową zastąpiono świeżą pożywką zawierającą 20 ng/ml ludzkiego rekombinowanego podstawowego czynnika wzrostowego fibroblastów (Becton Dickinson, Cat. #40060) i różne stężenia białek interferonu-beta-1a skoniugowanych lub nie skoniugowanych lub dodatniej kontroli (jako dodatnia kontrola może być używana endostatyna, jak również przeciwciało do bFGF). Objętość końcową doprowadza się do 0,5 ml w 24-studzienkowej płytce lub do 0,2 ml w 96-studzienkowej płytce.
Po siedemdziesięciu dwóch godzinach komórki są trypsynizowane w celu policzenia metodą Coultera, zamrażane do analizy fluorescecyjnej CyQuant lub znakowane [3H] tymidyna. Inhibicja proliferacji komórek śródbłonkowych in vitro przez skoniugowany lub nieskoniugowany interferon-beta-1a są porównywalne, co wskazuje, że PEGylacja nie wpływa na możliwości działania interferonu w tym położeniu.
Omawiane testy in vitro badają cząsteczki ludzkiego interferonu-beta według wynalazku pod względem wpływu na proliferację komórek śródbłonkowych, co mogłoby wskazywać na efekty antyangiogenne in vivo. Patrz O'Reilly, M.S., T. Boehm, Y. Shing, N. Fukal, G. Vasios, W. Lane, E. Flynn, J. Birkhead, B. Olsen and J. Folkman. (1997). Endostatin: An Endogenenous Inhibitor of Angiogenesis and Tumor Growth. Cell 88, 277-285.
P r z y k ł ad 9: Model in vivo do testowania efektów anty-angiogennych i neowaskularyzacyjnych koniugatów interferonu-beta-1a
Opracowano różne modele do testowania efektów anty-angiopgennych i antyneowaskularyzacyjnych opisywanych tu cząsteczek. Niektóre z tych modeli opisano w patentach USA 5,733,876 (31 marca, 1998: „Method of inhibiting angiogenesis) i 5,135,919 (4 sierpnia, 1992: „Method and a pharmaceutical composition for the inhibition of angiogenesis). Inne badania obejmują test wolnej od osłony błony z komórek omoczniowych (CAM) S. Taylor and J. Folkman; Nature, 297, 307 (1982) oraz R. Crum, S. Szabo and J. Folkman; Science, 230, 1375 (1985); antyangiogenny model testu grzbietowego pęcherzyka płucnego myszy według Folkmana J. et al.; J. Exp. Med., 133, 275 (1971) oraz test mikrokieszonki rogówkowej według Gimbrone, M.A. Jr. et al., J. Natl. Cancer Inst. 52,413 (1974), w którym unaczynienie rogówki jest indukowane u dorosłych samców szczurów szczepu Sprague-Dawley (Charles River, Japan) przez implantowanie w każdej rogówce 500 ng podstawowego FGF (bydlęcego, R&D Systems Inc.) impregnowanego w osadzie EVA (kopolimer etyleno-winylo-octowy).
Inne metody testowania PEGylowanego mysiego interferonu-beta pod kątem efektów antyangiogennych w modelu zwierzęcym obejmują (nie ograniczając się do tego) protokoły dotyczące poszukiwań nowych środków potencjalnie antynowotworowych, jak opisano w oryginale Cancer Chemotherapy Reports, Part 3, Vol. 3, No.2 Wrzesień 1972 i w Suplemencie In Vivo Cancer Models, 1976-1982, NIH Publication No. 84-2635, Luty 1984.
Ze względu na bariery gatunkowe na interferony Typu I, aby zbadać anty-angiogenną aktywność polimerowych koniugatów interferonu-beta na modelach gryzoni, wytworzono preparaty polimerowych koniugatów interferonu-beta gryzoni. Takie metody poszukiwań są zilustrowane przez protokół do testowania efektów anty-angiogennych pegylowanego mysiego interferonu-beta na podskórnie implantowanego raka płuc Lewisa.
Pochodzenie linii nowotworowej
Powstał spontanicznie w 1951 r. jako rak płuc u myszy C57BL/6.
Podsumowanie przebiegu testu: Fragment nowotworu implantowano podskórnie w regionie pachowym myszy B6D2F1. Testowany środek (tzn. fuzja białkowa według wynalazku) został podany w różnych dawkach podskórnie (SC) lub śródotrzewnowo (IP) w różnych dniach po implantacji nowotworu. Mierzonym parametrem jest mediana czasu przeżycia. Wyniki wyrażono jako procent kontrolnego czasu przeżycia.
Zwierzęta:
Rozwój: Myszy C57BL/6
Testowanie: Myszy B6D2F1
PL 206 536 B1
Waga: Ciężar myszy powinien mieścić się w zakresie 3 g z minimalnym ciężarem 18 g dla samców i 17 g dla samic.
Płeć: Do jednego eksperymentu zarówno do testów jak i kontroli używa się zwierząt jednej płci.
Pochodzenie: Z jednego źródła, jeśli możliwe dla wszystkich zwierząt w danym eksperymencie.
Wielkość eksperymentu:
Dziesięć zwierząt w jednej grupie testowej.
Transfer nowotworu:
Rozwój:
Fragment: Przygotować 2-4 mm fragmenty z s.c. (podskórnego) nowotworu dawcy
Czas: 13-15 dni
Miejsce: Implantować fragment sc w rejon pachowy z punkcją w rejonie pachwinowym
Testowanie:
Fragment: Przygotować 2-4 mm fragmenty z sc nowotworu dawcy.
Czas: 13-15 dni.
Miejsce: Implantować fragment sc w rejon pachowy z punkcją w rejonie pachwinowym.
Plan testowania:
Dzień 0: Implantować nowotwór. Założyć hodowlę bakteryjną. Przetestować składniki dodatniej kontroli w każdym nieparzystym eksperymencie. Przygotować materiały.
Rejestrować codziennie śmierć zwierząt.
Dzień 1: Sprawdzić hodowle. Odrzucić eksperymenty o ile nastąpiła kontaminacja. Zwierzęta dobierać losowo. Traktować zgodnie z instrukcją (w dniu 1 i w dniach następnych).
Dzień 2: Sprawdzić ponownie hodowle. Odrzucić eksperyment jeżeli wystąpi kontaminacja.
Dzień 5: Porównać Dzień 2 z dniem początkowego testu oceny toksyczności czynnika.
Dzień 14: Kontrolować dzień wczesnych śmierci zwierząt.
Dzień 48: Kontrolować dzień bez przyjmowania.
Dzień 60: Zakończyć i ocenić eksperyment. Zbadać makroskopowo płuca pod kątem nowotworu.
Kontrola jakości:
Zaplanować podawanie związku będącego kontrolą pozytywną (NSC26271 (Cytoksan w dawce 100 mg/kg/iniekcję)) w każdym eksperymencie nieparzystym dotyczącym podania dootrzewnowego tylko w Dniu 1. Niższy limit testu/kontroli dla kontroli pozytywnej wynosi 140 %. Akceptowalna średnia przeżycia nie badanej kontroli wynosi 19-35,6 dni.
Mierzonym parametrem jest mediana czasu przeżycia, obliczona średnia ciężaru ciała zwierzęcia w Dniu 1 i Dniu 5 obliczona, wyliczony stosunek test/kontrola dla wszystkich testowanych prób. Obliczany jest średni ciężar ciała zwierzęcia w dniu rozpoczęcia i w ostatnim dniu eksperymentu. Stosunek test/kontrola obliczany jest dla wszystkich grup z przeżyciem > 65% w Dniu 5. Stosunek test/kontrola o wartości < 86% wskazuje na toksyczność. Zbyt duża różnica zmiany ciężaru ciała (test minus kontrola) może również być oceniana jako toksyczność.
Kryteria aktywności:
Jeżeli wyjściowy stosunek test/kontrola jest większy niż lub równy 140%, bierze się pod uwagę konieczność wskazania umiarkowanej aktywności. Powtarzalna wartość stosunku test/kontrola większa lub równa 150% wskazuje na znaczącą aktywność.
PL 206 536 B1
Lista sekwencji <110> Pepinsky, Blake Sunkel, Laura Brickelmaier, Margot Whitty, Adrian Kochman, Paula <120> Kompozycją, kompozycja farmaceutyczna glikozylowanego interferonu-beta, zastosowanie kompozycji glikozylowanego interferonu-beta -la, sposób mvitro przedłużania aktywności glikozylowanego interferonu-beta-! a
<130» BII-003-02
<140» 10/802,540
<141» 2004-03-16
<1SO> 03/832,658
<151» 2001-04-11
<150> PCT/US99/24201
<151» 1999-10-15
<150» 60/104,572
<151» 1998-10-16
<150» 60/120,161
<151» 1999-02-16
<210» 25 <211» 166 <212» PRT <213» Homo sapiens <400» 25
Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gin Arg Ser Ser Asn Phe Gin
1 5 10 15
Cys Gin Lye Leu 20 Leu Trp Gin Leu Asn 25 Gly Arg Leu Glu Tyr 30 Cys Leu
Lya Asp Arg 35 Met Asn Phe Asp Ile 40 Pro Glu Glu Ile Lys 45 Gin Leu Gin
Gin Phe 50 Gin Lys Glu Asp Ala 55 Ala Leu Thr Ile Tyr 60 Glu Met Leu Gin
Asn 65 Ile Phe Ala Ile Phe 70 Arg Gin Asp Ser Ser 75 Ser Thr Gly Trp Asn 80
Glu Thr Ile Val Glu 85 Asn Leu Leu Ala Asn 90 Val Tyr His Gin Ile 95 Asn
His Leu Lys Thr 100 Val Leu Glu Glu Lys 105 Leu Glu Lys Glu Asp 110 Phe Thr
Arg Gly'Lys -TCS’ ?Leu Met Ser Ser Leu 120 His Leu Lys Arg Tyr 125 Tyr Gly Arg
Ile Leu 130 His Tyr Leu Lys Ala 135 Lys Glu Tyr Ser His 140 Cys Ala Trp Thr
Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe 'ile Asn Arg Leu
145 150 155 160
Thr Gly Tyr Leu Arg Asn
165
PL 206 536 B1

Claims (19)

1. Kompozycja, znamienna tym, że zawiera glikozylowany interferon-beta-1a, obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w Sekw. Id. Nr: 25, połączoną z resztą glikolu polialkilenowego na N-końcu glikolizowanego interferonu beta-1a.
2. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że glikol polialkilenowy jest C1-C4.
3. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że reszta C1-C4 polialkilenowa jest połączona z interferonem-beta-1a za pośrednictwem grupy aldehydowej.
4. Kompozycja według zastrz. 2, znamienna tym, że glikol polialkilenowy jest glikolem polietylenowym (PEG).
5. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że interferon-beta-1a obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w Sekw. Id. Nr: 25 jest białkiem fuzyjnym interferonu-beta-1a.
6. Kompozycja według zastrz. 5, znamienna tym, że białko fuzyjne interferonu-beta-1a zawiera część cząsteczki immunoglobuliny.
7. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że glikozylowany interferon-beta-1a jest połączony z resztą glikolu polialkilenowego za pośrednictwem - cząsteczki-glikanowej interferonu-beta-1a.
8. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że glikol polialkilenowy ma ciężar cząsteczkowy od około 5 do około 40 kilodaltonów.
9. Kompozycja farmaceutyczna glikozylowanego interferonu-beta-1a, znamienna tym, że zawiera kompozycję interferonu-beta-1a określoną w zastrz. 8.
10. Zastosowanie kompozycji określonej w zastrz. 8 do wytwarzania leku do hamowania angiogenezy u pacjenta.
11. Zastosowanie kompozycji glikozylowanego interferonu-beta-1a obejmującego sekwencję aminokwasową przedstawioną w Sekw. Id. Nr: 25, połączonego z resztą glikolu polietylenowego na N-końcu tego glikolizowanego interferonu beta-1a do wytwarzania leku do leczenia raka lub nowotworu, stanów autoimmunologicznych, chorób wirusowych, chorób angiogennych.
12. Zastosowanie według zastrz. 11, znamienne tym, że interferon-beta-1a jest połączony z wymienioną resztą za pośrednictwem reszty glikanowej interferonu-beta-1a.
13. Zastosowanie według zastrz. 11, znamienne tym, że interferon-beta-1a jest białkiem fuzyjnym interferonu-beta-1a.
14. Zastosowanie według zastrz. 13, znamienne tym, że białko fuzyjne interferonu-beta-1a zawiera część cząsteczki immunoglobuliny.
15. Sposób in vitro przedłużania aktywności glikozylowanego interferonu-beta-1a obejmującego sekwencję aminokwasową przedstawioną w Sekw. Id. Nr: 25, znamienny tym, że obejmuje łączenie takiego interferonu-beta 1a z resztą glikolu polialkilenowego C1-C4 w miejscu, które znajduje się na N-końcu interferonu-beta-1a.
16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że interferon-beta-1a łączy się z resztą glikolu polialkilenowego za pośrednictwem reszty glikanowej interferonu-beta-1a.
17. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że interferon-beta-1a jest białkiem fuzyjnym interferonu-beta-1a.
18. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że białko fuzyjne interferonu-beta-1a zawiera część cząsteczki immunoglobuliny.
19. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że glikolem polialkilenowym jest glikol polietylenowy.
PL347968A 1998-10-16 1999-10-15 Kompozycja, kompozycja farmaceutyczna glikozylowanego interferonu-beta-1a, zastosowanie kompozycji glikozylowanego interferonu-beta-1a, sposób in vitro przedłużania aktywności glikozylowanego interferonu-beta-1a PL206536B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US10457298P 1998-10-16 1998-10-16
US12016199P 1999-02-16 1999-02-16

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL347968A1 PL347968A1 (en) 2002-04-22
PL206536B1 true PL206536B1 (pl) 2010-08-31

Family

ID=26801696

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL347968A PL206536B1 (pl) 1998-10-16 1999-10-15 Kompozycja, kompozycja farmaceutyczna glikozylowanego interferonu-beta-1a, zastosowanie kompozycji glikozylowanego interferonu-beta-1a, sposób in vitro przedłużania aktywności glikozylowanego interferonu-beta-1a

Country Status (30)

Country Link
US (5) US6962978B2 (pl)
EP (4) EP2260872B1 (pl)
JP (5) JP4616478B2 (pl)
KR (1) KR100630849B1 (pl)
CN (2) CN101062419B (pl)
AT (1) ATE318149T1 (pl)
AU (1) AU762616B2 (pl)
BR (1) BRPI9915542C1 (pl)
CA (1) CA2345138C (pl)
CY (2) CY1105022T1 (pl)
CZ (1) CZ299164B6 (pl)
DE (1) DE69930015T2 (pl)
DK (2) DK1656952T3 (pl)
EA (1) EA004789B9 (pl)
EE (2) EE04967B1 (pl)
ES (4) ES2257884T3 (pl)
HK (2) HK1042434B (pl)
HU (1) HU229888B1 (pl)
IL (2) IL142282A0 (pl)
IS (1) IS2926B (pl)
LT (2) LT2599503T (pl)
NO (1) NO20011860L (pl)
NZ (1) NZ510689A (pl)
PL (1) PL206536B1 (pl)
PT (2) PT1656952E (pl)
SG (2) SG2008070138A (pl)
SI (2) SI1656952T1 (pl)
SK (1) SK287918B6 (pl)
TR (1) TR200101086T2 (pl)
WO (1) WO2000023114A2 (pl)

Families Citing this family (103)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69931507T2 (de) * 1998-10-16 2007-01-11 Biogen Idec Ma Inc., Cambridge Interferon-beta fusionsproteine und deren verwendungen
EP2260872B1 (en) * 1998-10-16 2017-08-30 Biogen MA Inc. Polymer conjugates of interferon beta-1A and uses thereof
US7431921B2 (en) 2000-04-14 2008-10-07 Maxygen Aps Interferon beta-like molecules
US6531122B1 (en) 1999-08-27 2003-03-11 Maxygen Aps Interferon-β variants and conjugates
KR20020034181A (ko) * 1999-08-27 2002-05-08 맥시겐 에이피에스 새로운 인터페론 베타-유사 분자
US7144574B2 (en) 1999-08-27 2006-12-05 Maxygen Aps Interferon β variants and conjugates
US20030211094A1 (en) 2001-06-26 2003-11-13 Nelsestuen Gary L. High molecular weight derivatives of vitamin k-dependent polypeptides
WO2002036628A2 (en) * 2000-11-02 2002-05-10 Maxygen Aps New multimeric interferon beta polypeptides
EP2080771A3 (en) 2001-02-27 2010-01-06 Maxygen Aps New interferon beta-like molecules
US6887462B2 (en) * 2001-04-09 2005-05-03 Chiron Corporation HSA-free formulations of interferon-beta
US7214660B2 (en) 2001-10-10 2007-05-08 Neose Technologies, Inc. Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
US7173003B2 (en) 2001-10-10 2007-02-06 Neose Technologies, Inc. Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF
US7696163B2 (en) 2001-10-10 2010-04-13 Novo Nordisk A/S Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
US7157277B2 (en) 2001-11-28 2007-01-02 Neose Technologies, Inc. Factor VIII remodeling and glycoconjugation of Factor VIII
PT2279755E (pt) * 2001-10-10 2014-06-04 Ratiopharm Gmbh Remodelação e glicoconjugação do factor de crescimento de fibroblastos (fgf)
WO2003061577A2 (en) * 2002-01-18 2003-07-31 Biogen Idec Ma Inc. Polyalkylene glycol with moiety for conjugating biologically active compound
WO2004020468A2 (en) * 2002-08-28 2004-03-11 Maxygen Aps Interferon beta-like molecules for treatment of cancer
ATE466085T1 (de) * 2002-09-09 2010-05-15 Hanall Pharmaceutical Co Ltd Protease-resistente modifizierte interferon alpha polypeptide
NZ565990A (en) * 2002-09-27 2009-10-30 Biogen Idec Inc Therapies for chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy using interferon-beta
US8129330B2 (en) 2002-09-30 2012-03-06 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
US20040062748A1 (en) * 2002-09-30 2004-04-01 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
TWI406672B (zh) 2002-12-26 2013-09-01 Mountain View Pharmaceuticals 生物效力增進的β干擾素聚合物共軛體
BR0317752A (pt) * 2002-12-26 2005-11-22 Mountain View Pharmaceuticals Conjugados poliméricos de citocinas, quimiocinas, fatores do crescimento, hormÈnios polipeptìdicos e seus antagonistas com atividade de ligação a receptores conservada
JP2006523211A (ja) 2003-03-14 2006-10-12 ネオス テクノロジーズ インコーポレイテッド 分岐水溶性ポリマーとその複合物
US20050079155A1 (en) * 2003-03-20 2005-04-14 Xencor, Inc. Generating protein pro-drugs using reversible PPG linkages
CA2530725A1 (en) * 2003-03-28 2004-10-07 Biopolymed Inc. Biologically active material conjugated with biocompatible polymer with 1:1 complex, preparation method thereof and pharmaceutical composition comprising the same
US8791070B2 (en) 2003-04-09 2014-07-29 Novo Nordisk A/S Glycopegylated factor IX
EP1615945B1 (en) 2003-04-09 2011-09-28 BioGeneriX AG Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
US7691603B2 (en) 2003-04-09 2010-04-06 Novo Nordisk A/S Intracellular formation of peptide conjugates
CA2522989A1 (en) * 2003-05-21 2004-12-02 Ares Trading S.A. Method of chromatographic analysis of a protein solution
US9005625B2 (en) 2003-07-25 2015-04-14 Novo Nordisk A/S Antibody toxin conjugates
ES2452640T3 (es) 2003-08-25 2014-04-02 Toray Industries, Inc. Complejo de interferón beta
US20080305992A1 (en) 2003-11-24 2008-12-11 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin
US20060040856A1 (en) 2003-12-03 2006-02-23 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated factor IX
EP1765853B1 (en) 2004-01-08 2015-10-28 ratiopharm GmbH O-linked glycosylation of G-CSF peptides
GB2429207A (en) 2004-02-02 2007-02-21 Ambrx Inc Modified human interferon polypeptides and their uses
EP1734988A4 (en) * 2004-03-01 2009-08-05 Enzon Pharmaceuticals Inc INTERFERON BETA-polymer
WO2005112911A2 (en) * 2004-05-21 2005-12-01 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for treating myelin deficiency disorders
AU2005260664A1 (en) * 2004-06-30 2006-01-12 Egen Corporation Pegylated interferon alpha-1b
WO2006010143A2 (en) 2004-07-13 2006-01-26 Neose Technologies, Inc. Branched peg remodeling and glycosylation of glucagon-like peptide-1 [glp-1]
US8268967B2 (en) 2004-09-10 2012-09-18 Novo Nordisk A/S Glycopegylated interferon α
EP3061461A1 (en) 2004-10-29 2016-08-31 ratiopharm GmbH Remodeling and glycopegylation of fibroblast growth factor (fgf)
WO2006074467A2 (en) 2005-01-10 2006-07-13 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor
EP1871795A4 (en) 2005-04-08 2010-03-31 Biogenerix Ag COMPOSITIONS AND METHOD FOR PRODUCING GLYCOSYLATION MUTANTS OF A PROTEASE-RESISTANT HUMAN GROWTH HORMONE
EP1891231A4 (en) 2005-05-25 2011-06-22 Novo Nordisk As GLYCOPEGYLATED FACTOR IX
US20070105755A1 (en) 2005-10-26 2007-05-10 Neose Technologies, Inc. One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides
EP1937294A4 (en) * 2005-10-21 2009-11-04 Synageva Biopharma Corp GLYCOLIC AND GLYCOSYLATED THERAPEUTIC PROTEINS DERIVED FROM POULTRY
US20090048440A1 (en) 2005-11-03 2009-02-19 Neose Technologies, Inc. Nucleotide Sugar Purification Using Membranes
CA2626056A1 (en) * 2005-11-18 2007-05-24 Ares Trading S.A. Interferon in influenza
EP1971355B1 (en) 2005-12-20 2020-03-11 Duke University Methods and compositions for delivering active agents with enhanced pharmacological properties
CN100475270C (zh) * 2006-01-20 2009-04-08 清华大学 一种治疗肿瘤的药物及其应用
WO2007110231A2 (en) * 2006-03-28 2007-10-04 Nautilus Biotech, S.A. MODIFIED INTERFERON-β (IFN-β) POLYPEPTIDES
US7645860B2 (en) 2006-03-31 2010-01-12 Baxter Healthcare S.A. Factor VIII polymer conjugates
US7982010B2 (en) 2006-03-31 2011-07-19 Baxter International Inc. Factor VIII polymer conjugates
US7985839B2 (en) 2006-03-31 2011-07-26 Baxter International Inc. Factor VIII polymer conjugates
EP2010222A1 (en) 2006-03-31 2009-01-07 Baxter International Inc. Pegylated factor viii
US8637325B2 (en) * 2009-02-16 2014-01-28 University Of Wyoming Method and apparatus for pyrolysis-induced cleavage in peptides and proteins
CN101516388B (zh) 2006-07-21 2012-10-31 诺和诺德公司 通过o-联糖基化序列的肽的糖基化
JP5570809B2 (ja) 2006-09-01 2014-08-13 ノボ ノルディスク ヘルス ケア アーゲー 修飾タンパク質
AU2007296843C1 (en) * 2006-09-15 2012-08-16 Creabilis Therapeutics S.P.A. Polymer conjugates of Box-A of HMGB1 and Box-A variants of HMGB1
EP2054521A4 (en) 2006-10-03 2012-12-19 Novo Nordisk As METHODS OF PURIFYING CONJUGATES OF POLYPEPTIDES
WO2008074032A1 (en) 2006-12-15 2008-06-19 Baxter International Inc. Factor viia- (poly) sialic acid conjugate having prolonged in vivo half-life
EP2111230A4 (en) * 2006-12-19 2010-11-17 Merrimack Pharmaceuticals Inc COMMON ADMINISTRATION OF ALPHA-FETOPROTEIN AND AN IMMUNOMODULATING AGENT TO TREAT MULTIPLE SCLEROSE
CA2682897C (en) 2007-04-03 2016-11-22 Biogenerix Ag Methods of treatment using glycopegylated g-csf
EP2076533B1 (en) 2007-05-02 2014-10-08 Ambrx, Inc. Modified interferon beta polypeptides and their uses
WO2008154639A2 (en) 2007-06-12 2008-12-18 Neose Technologies, Inc. Improved process for the production of nucleotide sugars
JP5933923B2 (ja) * 2007-10-09 2016-06-22 ポリテリクス リミテッド 新規な複合タンパク質及びペプチド
PL2234645T3 (pl) 2007-12-20 2012-10-31 Merck Serono Sa Preparaty interferonu-beta modyfikowanego PEG
NZ586947A (en) 2008-02-08 2012-11-30 Ambrx Inc Modified leptin polypeptides and their uses
CN101965200B (zh) 2008-02-27 2013-06-19 诺沃-诺迪斯克有限公司 缀合的因子ⅷ分子
ES2525065T3 (es) 2008-04-11 2014-12-17 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Ligadores de seroalbúmina humana y sus conjugados
CA2721870C (en) 2008-04-21 2020-12-22 Tissue Regeneration Therapeutics, Inc. Genetically modified human umbilical cord perivascular cells for prophylaxis against or treatment of biological or chemical agents
US10138283B2 (en) 2008-07-23 2018-11-27 Ambrx, Inc. Modified bovine G-CSF polypeptides and their uses
KR20110112301A (ko) 2008-11-18 2011-10-12 메리맥 파마슈티컬즈, 인크. 인간 혈청 알부민 링커 및 그 콘쥬게이트
GB0912485D0 (en) * 2009-07-17 2009-08-26 Polytherics Ltd Improved conjugation method
US9266942B2 (en) 2009-04-30 2016-02-23 Children's Hospital & Research Center Oakland Chimeric factor H binding proteins (fHbp) and methods of use
BRPI1012951A2 (pt) * 2009-06-09 2016-07-26 Defyrus Inc "administração de interferon para profilaxia ou tratamento de infecção por patôgeno"
US8809501B2 (en) 2009-07-27 2014-08-19 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
DK2459224T3 (en) 2009-07-27 2016-07-25 Baxalta GmbH Blodstørkningsproteinkonjugater
AU2010277438B2 (en) 2009-07-27 2015-08-20 Baxalta GmbH Glycopolysialylation of non-blood coagulation proteins
US8642737B2 (en) 2010-07-26 2014-02-04 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
EP3093029A1 (en) 2009-07-27 2016-11-16 Baxalta GmbH Blood coagulation protein conjugates
WO2011087810A1 (en) 2009-12-21 2011-07-21 Ambrx, Inc. Modified porcine somatotropin polypeptides and their uses
MX349301B (es) 2009-12-21 2017-07-21 Ambrx Inc Polipéptidos de somatotropina bovina modificados y sus usos.
CN101906213B (zh) * 2010-07-23 2012-12-05 华南理工大学 一种新型的蛋白质糖基化接枝的方法
CN103068853B (zh) * 2010-08-19 2016-08-10 Peg生物制药公司 协同性生物分子-聚合物轭合物
TWI480288B (zh) 2010-09-23 2015-04-11 Lilly Co Eli 牛顆粒細胞群落刺激因子及其變體之調配物
NZ608630A (en) * 2010-10-01 2015-03-27 Biogen Idec Inc Interferon-beta for use as monotherapy or in combination with other cancer therapies
CA2822591C (en) 2010-12-22 2020-12-29 Baxter International Inc. Materials and methods for conjugating a water soluble fatty acid derivative to a protein
MY168902A (en) 2011-10-01 2018-12-04 Glytech Inc Glycosylated polypeptide and pharmaceutical composition containing same
CN104136038A (zh) 2012-02-29 2014-11-05 东丽株式会社 体腔积液抑制剂
WO2014036520A1 (en) 2012-08-30 2014-03-06 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Combination therapies comprising anti-erbb3 agents
CA2908211C (en) 2013-03-29 2022-07-19 Glytech, Inc. Polypeptide glycosylated with sialylated sugar chain
WO2016013911A1 (ko) 2014-07-24 2016-01-28 에이비온 주식회사 페길화된 인터페론 -베타 변이체
CA3023883A1 (en) 2016-05-13 2017-11-16 Orionis Biosciences Nv Targeted mutant interferon-beta and uses thereof
KR102642385B1 (ko) 2017-02-06 2024-03-04 오리오니스 바이오사이언시스 엔브이 표적화된 키메라 단백질 및 이의 용도
RU2661088C1 (ru) * 2017-05-24 2018-07-11 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр "Институт иммунологии" Федерального медико-биологического агентства России (ФГБУ "ГНЦ Институт иммунологии" ФМБА России) Способ очистки лекарственного средства пролонгированного действия на основе рекомбинантного аналога интерферона бета 1b для лечения рассеянного склероза
WO2019152979A1 (en) 2018-02-05 2019-08-08 Orionis Biosciences, Inc. Fibroblast binding agents and use thereof
RU2739261C1 (ru) * 2019-12-31 2020-12-22 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) Способ количественного определения антипролиферативной активности интерферона-бета человека
CA3207652A1 (en) 2021-03-26 2022-09-29 Stephanie Cornen Cytokine anchors for nkp46-binding nk cell engager proteins
WO2022258678A1 (en) 2021-06-09 2022-12-15 Innate Pharma Multispecific proteins binding to nkp30, a cytokine receptor, a tumour antigen and cd16a
EP4352098A1 (en) 2021-06-09 2024-04-17 Innate Pharma Multispecific proteins binding to nkp46, a cytokine receptor, a tumour antigen and cd16a
WO2022258691A1 (en) 2021-06-09 2022-12-15 Innate Pharma Multispecific proteins binding to nkg2d, a cytokine receptor, a tumour antigen and cd16a

Family Cites Families (94)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
DE2360794C2 (de) * 1973-12-06 1984-12-06 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Verfahren zur Herstellung von Peptiden
CH596313A5 (pl) * 1975-05-30 1978-03-15 Battelle Memorial Institute
IL47468A (en) 1975-06-12 1979-05-31 Rehovot Res Prod Process for the cross-linking of proteins using water soluble cross-linking agents
US4002531A (en) * 1976-01-22 1977-01-11 Pierce Chemical Company Modifying enzymes with polyethylene glycol and product produced thereby
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4456748A (en) 1981-02-23 1984-06-26 Genentech, Inc. Hybrid human leukocyte interferons
WO1982002715A1 (fr) 1981-02-04 1982-08-19 Sugano Haruo Gene d'interferon (beta)humain
US4414147A (en) * 1981-04-17 1983-11-08 Massachusetts Institute Of Technology Methods of decreasing the hydrophobicity of fibroblast and other interferons
IT1167610B (it) 1982-01-19 1987-05-13 Cetus Corp Interfreron ibrido multiclasse, composizione farmaceutica che lo contiene e procedimento di produzione
US5149636A (en) 1982-03-15 1992-09-22 Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method for introducing cloned, amplifiable genes into eucaryotic cells and for producing proteinaceous products
US4695543A (en) 1982-03-23 1987-09-22 Bristol-Myers Company Alpha Interferon GX-1
US6936694B1 (en) * 1982-05-06 2005-08-30 Intermune, Inc. Manufacture and expression of large structural genes
US4609546A (en) 1982-06-24 1986-09-02 Japan Chemical Research Co., Ltd. Long-acting composition
US4470461A (en) 1982-09-30 1984-09-11 Phillips Petroleum Company Organic nitro compounds as cosurfactants in enhanced oil recovery processes
US4588585A (en) * 1982-10-19 1986-05-13 Cetus Corporation Human recombinant cysteine depleted interferon-β muteins
GB8334102D0 (en) 1983-12-21 1984-02-01 Searle & Co Interferons with cysteine pattern
EP0154316B1 (en) 1984-03-06 1989-09-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified lymphokine and production thereof
GB8412564D0 (en) * 1984-05-17 1984-06-20 Searle & Co Structure and properties
CA1302320C (en) 1984-06-11 1992-06-02 Hideo Niwa Expression of human cromosomal interferon-_ in animal cells
US5231176A (en) 1984-08-27 1993-07-27 Genentech, Inc. Distinct family DNA encoding of human leukocyte interferons
FI90990C (fi) 1984-12-18 1994-04-25 Boehringer Ingelheim Int Rekombinantti-DNA-molekyyli, transformoitu isäntäorganismi ja menetelmä interferonin valmistamiseksi
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
EP0205404B1 (en) 1985-06-11 1992-07-15 Ciba-Geigy Ag Hybrid interferons
DE3676670D1 (de) * 1985-06-26 1991-02-07 Cetus Corp Solubilisierung von proteinen fuer pharmazeutische zusammensetzungen mittels polymerkonjugierung.
US4766106A (en) * 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4917888A (en) 1985-06-26 1990-04-17 Cetus Corporation Solubilization of immunotoxins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4935233A (en) 1985-12-02 1990-06-19 G. D. Searle And Company Covalently linked polypeptide cell modulators
JP2514950B2 (ja) 1986-03-10 1996-07-10 エフ・ホフマン―ラ ロシユ アーゲー 化学修飾蛋白質，その製造法および中間体
JPS63152393A (ja) 1986-07-03 1988-06-24 Takeda Chem Ind Ltd グリコシル誘導体
US5183746A (en) 1986-10-27 1993-02-02 Schering Aktiengesellschaft Formulation processes for pharmaceutical compositions of recombinant β-
US4894226A (en) 1986-11-14 1990-01-16 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polyproline conjugation
US5004605A (en) 1987-12-10 1991-04-02 Cetus Corporation Low pH pharmaceutical compositions of recombinant β-interferon
US4904584A (en) 1987-12-23 1990-02-27 Genetics Institute, Inc. Site-specific homogeneous modification of polypeptides
US5135919A (en) 1988-01-19 1992-08-04 Children's Medical Center Corporation Method and a pharmaceutical composition for the inhibition of angiogenesis
US4847325A (en) 1988-01-20 1989-07-11 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
US4847625A (en) * 1988-02-16 1989-07-11 Ford Aerospace Corporation Wideband, aperture-coupled microstrip antenna
CA1340810C (en) 1988-03-31 1999-11-02 Motoo Yamasaki Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor
GB8824591D0 (en) 1988-10-20 1988-11-23 Royal Free Hosp School Med Fractionation process
JPH04502011A (ja) 1988-11-23 1992-04-09 ジェネンテク，インコーポレイテッド ポリペプチド誘導体
CA2006596C (en) 1988-12-22 2000-09-05 Rika Ishikawa Chemically-modified g-csf
US5116964A (en) * 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US5166322A (en) * 1989-04-21 1992-11-24 Genetics Institute Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof
US5286637A (en) 1989-08-07 1994-02-15 Debiopharm, S.A. Biologically active drug polymer derivatives and method for preparing same
JPH04218000A (ja) 1990-02-13 1992-08-07 Kirin Amgen Inc 修飾ポリペプチド
US5252714A (en) 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
ES2199935T3 (es) 1991-03-15 2004-03-01 Amgen Inc. Pegilacion de polipeptidos.
US5595732A (en) 1991-03-25 1997-01-21 Hoffmann-La Roche Inc. Polyethylene-protein conjugates
WO1993000109A1 (en) 1991-06-28 1993-01-07 Genentech, Inc. Method of stimulating immune response using growth hormone
US5281698A (en) 1991-07-23 1994-01-25 Cetus Oncology Corporation Preparation of an activated polymer ester for protein conjugation
AU3423293A (en) * 1991-12-19 1993-07-19 Baylor College Of Medicine Pva or peg conjugates of peptides for epitope-specific immunosuppression
ZA933926B (en) * 1992-06-17 1994-01-03 Amgen Inc Polyoxymethylene-oxyethylene copolymers in conjuction with blomolecules
US5382657A (en) 1992-08-26 1995-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Peg-interferon conjugates
AU5098193A (en) 1992-09-01 1994-03-29 Berlex Laboratories, Inc. Glycolation of glycosylated macromolecules
US5306344A (en) * 1992-12-02 1994-04-26 Edward C. Levy Company Mixture of portland cement concrete materials for freeze/thaw resistance
US5298410A (en) 1993-02-25 1994-03-29 Sterling Winthrop Inc. Lyophilized formulation of polyethylene oxide modified proteins with increased shelf-life
US5359030A (en) 1993-05-10 1994-10-25 Protein Delivery, Inc. Conjugation-stabilized polypeptide compositions, therapeutic delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same
US5681811A (en) 1993-05-10 1997-10-28 Protein Delivery, Inc. Conjugation-stabilized therapeutic agent compositions, delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same
US5874075A (en) 1993-10-06 1999-02-23 Amgen Inc. Stable protein: phospholipid compositions and methods
US5641656A (en) 1993-10-22 1997-06-24 University Of Connecticut Nucleic acids encoding avian interferon (IFN) proteins and recombinant methods using them
US5605976A (en) 1995-05-15 1997-02-25 Enzon, Inc. Method of preparing polyalkylene oxide carboxylic acids
US5643575A (en) 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
AU691225B2 (en) 1993-11-10 1998-05-14 Schering Corporation Improved interferon polymer conjugates
US5951974A (en) 1993-11-10 1999-09-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates
DE69521880T2 (de) 1994-02-08 2002-01-03 Amgen Inc Orales verabreichungssystem von chemischmodifizierten proteinen g-csf
US5545723A (en) * 1994-03-15 1996-08-13 Biogen Inc. Muteins of IFN-β
US5639725A (en) 1994-04-26 1997-06-17 Children's Hospital Medical Center Corp. Angiostatin protein
GB9415379D0 (en) * 1994-07-29 1994-09-21 Smithkline Beecham Plc Novel compounds
US5824784A (en) 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
US5738846A (en) 1994-11-10 1998-04-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates and process for preparing the same
AU697440B2 (en) * 1994-12-07 1998-10-08 Novozymes A/S Polypeptide with reduced allergenicity
US5672662A (en) * 1995-07-07 1997-09-30 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications
US5702717A (en) 1995-10-25 1997-12-30 Macromed, Inc. Thermosensitive biodegradable polymers based on poly(ether-ester)block copolymers
US5908621A (en) 1995-11-02 1999-06-01 Schering Corporation Polyethylene glycol modified interferon therapy
US5723125A (en) * 1995-12-28 1998-03-03 Tanox Biosystems, Inc. Hybrid with interferon-alpha and an immunoglobulin Fc linked through a non-immunogenic peptide
US5747639A (en) * 1996-03-06 1998-05-05 Amgen Boulder Inc. Use of hydrophobic interaction chromatography to purify polyethylene glycols
DE69800640T2 (de) 1997-01-29 2001-07-05 Polymasc Pharmaceuticals Plc L Pegylationsverfahren
US5990237A (en) 1997-05-21 1999-11-23 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) aldehyde hydrates and related polymers and applications in modifying amines
WO1999003887A1 (en) 1997-07-14 1999-01-28 Bolder Biotechnology, Inc. Derivatives of growth hormone and related proteins
US6180095B1 (en) 1997-12-17 2001-01-30 Enzon, Inc. Polymeric prodrugs of amino- and hydroxyl-containing bioactive agents
US5985263A (en) 1997-12-19 1999-11-16 Enzon, Inc. Substantially pure histidine-linked protein polymer conjugates
US5981709A (en) 1997-12-19 1999-11-09 Enzon, Inc. α-interferon-polymer-conjugates having enhanced biological activity and methods of preparing the same
US5965119A (en) 1997-12-30 1999-10-12 Enzon, Inc. Trialkyl-lock-facilitated polymeric prodrugs of amino-containing bioactive agents
ATE268609T1 (de) 1998-03-12 2004-06-15 Nektar Therapeutics Al Corp Polyethylenglycolderivate mit benachbarten reaktiven gruppen
JP4574007B2 (ja) * 1998-04-28 2010-11-04 メルク・セローノ・ソシエテ・アノニム ポリオール−ｉｆｎ−ベータ複体
US6703381B1 (en) * 1998-08-14 2004-03-09 Nobex Corporation Methods for delivery therapeutic compounds across the blood-brain barrier
EP2260872B1 (en) * 1998-10-16 2017-08-30 Biogen MA Inc. Polymer conjugates of interferon beta-1A and uses thereof
DE69931507T2 (de) * 1998-10-16 2007-01-11 Biogen Idec Ma Inc., Cambridge Interferon-beta fusionsproteine und deren verwendungen
US6531122B1 (en) 1999-08-27 2003-03-11 Maxygen Aps Interferon-β variants and conjugates
KR20020034181A (ko) * 1999-08-27 2002-05-08 맥시겐 에이피에스 새로운 인터페론 베타-유사 분자
US7144574B2 (en) 1999-08-27 2006-12-05 Maxygen Aps Interferon β variants and conjugates
US6495659B2 (en) 1999-12-22 2002-12-17 Shearwater Corporation Sterically hindered poly(ethylene glycol) alkanoic acids and derivatives thereof
US9506008B2 (en) 2013-12-23 2016-11-29 Exxonmobil Research And Engineering Company Method for improving engine fuel efficiency

Also Published As

Publication number Publication date
AU1446500A (en) 2000-05-08
US20150011732A1 (en) 2015-01-08
WO2000023114A9 (en) 2001-07-05
US20090104150A1 (en) 2009-04-23
CY1105022T1 (el) 2010-03-03
CZ299164B6 (cs) 2008-05-07
CN101062419B (zh) 2016-06-29
SI1121156T1 (sl) 2006-08-31
US7446173B2 (en) 2008-11-04
EP2599503A3 (en) 2013-07-24
ES2630278T3 (es) 2017-08-21
SI1656952T1 (sl) 2014-04-30
ES2447772T3 (es) 2014-03-12
JP4616478B2 (ja) 2011-01-19
ES2653589T3 (es) 2018-02-07
EP2599503A2 (en) 2013-06-05
ES2257884T3 (es) 2006-08-01
EE05201B1 (et) 2009-08-17
EP2599503B1 (en) 2017-05-17
AU762616B2 (en) 2003-07-03
NO20011860D0 (no) 2001-04-11
CZ20011329A3 (cs) 2001-09-12
DK1656952T3 (da) 2014-01-20
EP2260872B1 (en) 2017-08-30
EA004789B1 (ru) 2004-08-26
EP2260872A3 (en) 2011-04-27
LTPA2017030I1 (lt) 2017-10-25
BRPI9915542C1 (pt) 2021-05-25
BR9915542A (pt) 2001-08-14
CA2345138C (en) 2009-12-15
DE69930015D1 (de) 2006-04-27
EE200700058A (et) 2008-02-15
CY1115125T1 (el) 2016-12-14
HK1042434B (zh) 2008-01-25
JP2011026329A (ja) 2011-02-10
BR9915542B8 (pt) 2017-10-31
LT2599503T (lt) 2017-06-26
IS2926B (is) 2015-09-15
TR200101086T2 (tr) 2001-08-21
WO2000023114A2 (en) 2000-04-27
IL142282A (en) 2007-03-08
NZ510689A (en) 2003-07-25
EP1121156B1 (en) 2006-02-22
HK1089393A1 (en) 2006-12-01
US20070098688A1 (en) 2007-05-03
KR100630849B1 (ko) 2006-10-04
US20030021765A1 (en) 2003-01-30
US9314534B2 (en) 2016-04-19
HU229888B1 (en) 2014-11-28
HUP0200444A2 (en) 2002-06-29
JP5863865B2 (ja) 2016-02-17
PT1121156E (pt) 2006-05-31
US6962978B2 (en) 2005-11-08
LTC2599503I2 (lt) 2019-06-25
JP2002527491A (ja) 2002-08-27
SG2008070138A (en) 2017-08-30
IS5913A (is) 2001-03-30
WO2000023114A3 (en) 2000-09-28
EE04967B1 (et) 2008-02-15
KR20010103605A (ko) 2001-11-23
US20160250340A1 (en) 2016-09-01
JP5396358B2 (ja) 2014-01-22
EP1656952A2 (en) 2006-05-17
EA004789B9 (ru) 2017-05-31
CN1323225A (zh) 2001-11-21
ATE318149T1 (de) 2006-03-15
EA200100446A1 (ru) 2001-10-22
EP2260872A2 (en) 2010-12-15
EP1121156A2 (en) 2001-08-08
JP2007063283A (ja) 2007-03-15
PL347968A1 (en) 2002-04-22
CA2345138A1 (en) 2000-04-27
PT1656952E (pt) 2014-02-21
SK287918B6 (sk) 2012-03-02
SG110047A1 (en) 2005-04-28
DK1121156T3 (da) 2006-06-06
JP2014129420A (ja) 2014-07-10
CN101062419A (zh) 2007-10-31
JP2011093937A (ja) 2011-05-12
IL142282A0 (en) 2002-03-10
EP1656952B1 (en) 2013-12-18
NO20011860L (no) 2001-06-15
DE69930015T2 (de) 2006-10-12
EP1656952A3 (en) 2006-11-29
SK5062001A3 (en) 2002-01-07
EE200100220A (et) 2002-06-17
BR9915542B1 (pt) 2016-06-07
HK1042434A1 (en) 2002-08-16
CN1329082C (zh) 2007-08-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL206536B1 (pl) Kompozycja, kompozycja farmaceutyczna glikozylowanego interferonu-beta-1a, zastosowanie kompozycji glikozylowanego interferonu-beta-1a, sposób in vitro przedłużania aktywności glikozylowanego interferonu-beta-1a
JP2002527491A5 (pl)
JP4761621B2 (ja) インターフェロン−β融合タンパク質および使用
JP2002527100A5 (pl)
MXPA01003791A (es) Conjugados polimericos de interferon beta - 1a y usos de los mismos

Legal Events

Date Code Title Description
RECP Rectifications of patent specification
VDSO Invalidation of derivated patent or utility model

Ref document number: 383216

Country of ref document: PL

Kind code of ref document: A1