CZ299164B6 - Farmaceutická kompozice obsahující glykosylovaný interferon-beta-1a navázaný na polymer - Google Patents

Farmaceutická kompozice obsahující glykosylovaný interferon-beta-1a navázaný na polymer Download PDF

Info

Publication number
CZ299164B6
CZ299164B6 CZ20011329A CZ20011329A CZ299164B6 CZ 299164 B6 CZ299164 B6 CZ 299164B6 CZ 20011329 A CZ20011329 A CZ 20011329A CZ 20011329 A CZ20011329 A CZ 20011329A CZ 299164 B6 CZ299164 B6 CZ 299164B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
beta
interferon
protein
polymer
activity
Prior art date
Application number
CZ20011329A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ20011329A3 (cs
Inventor
Pepinsky@Blake
Runkel@Laura
Brickelmaier@Margot
Whitty@Adrian
Hochman@Paula
Original Assignee
Biogen Idec Ma Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biogen Idec Ma Inc. filed Critical Biogen Idec Ma Inc.
Publication of CZ20011329A3 publication Critical patent/CZ20011329A3/cs
Publication of CZ299164B6 publication Critical patent/CZ299164B6/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A61K38/215—IFN-beta
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S930/00—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/01—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/14—Lymphokine; related peptides
    • Y10S930/142—Interferon

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

Farmaceutická kompozice a prípravek interferonu-beta obsahující interferon-beta-1a navázaný na polymer obsahující polyalkylenglykolovou cást, pricemžinterferon-beta-1a a polyalkylenglykolová cást jsou usporádány tak, že interferon-beta-1a má zvýšenou aktivitu vzhledem k jiným terapeutickým formám interferonu-beta (napr. interferonu-beta-1b) a neprojevuje žádné snížení aktivity ve srovnání s nekonjugovanou formou. Konjugáty podle vynálezu jsou užitecné jako léciva.

Description

Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká zejména přípravků interferonu-beta obsahujících interferon-beta-la navázaný na polymer obsahující polyalkylenglykolovou část, přičemž interferon-beta-la a polyalkylenglykolová část jsou uspořádány tak, že interferon-beta-la má zvýšenou aktivitu vzhledem k jiným terapeutickým formám interferonu-beta (např. interferon-beta-lb) a neprojevuje žádné snížení aktivity ve srovnání s nekonjugovanou formou. Konjugáty podle vynálezu jsou užitečné jako léčiva a jiné přípravky, např. pro diagnostické použití.
Dosavadní stav techniky
Použití polypeptidů a proteinů pro systémové léčení specifických nemocí je nyní běžně akceptováno v lékařské praxi. Role, jakou hrají látky tohoto typu v terapii je tak důležitá, že mnohé výzkumy jsou zaměřeny na syntézu velkého množství těchto látek technologií rekombinantní DNA.
Mnohé z těchto molekul jsou endogenní molekuly, které jsou velmi účinné a specifické ve svém biologickém účinku.
Hlavním faktorem, který omezuje užitečnost látek proteinového charakteru pro jejich zamýšlené aplikace je, že při parenterálním podávání jsou z těla za velmi krátký čas eliminovány. To je důsledkem toho, že jsou metabolizovány proteázami, nebo se na jejich eliminaci podílí běžná clearance metabolickými cestami eliminace proteinů, jako je např. filtrace v ledvinách. Perorální způsob podávání těchto látek je dokonce ještě problematičtější, protože kromě proteolýzy v žaludku, také vysoká acidita v žaludku ničí proteiny ještě před tím, než by mohly dosáhnout zamýšlené cílové tkáně. Problémy spojené s uvedenými způsoby podávání proteinů jsou ve far30 maceutickém průmyslu dobře známy, byly proto užity různé strategie, jak jim zabránit.
Byla publikována řada prací zabývajících se stabilizací proteinů. Jsou známy různé způsoby konjugace proteinů s polymemími materiály, včetně např. dextranu, póly viny lpyrrolidonu, glykopeptidů, polyethylenglykolu a polyaminokyselin. Výsledné konjugované polypeptidy si podle publikovaných výsledků uchovávají svou biologickou aktivitu a rozpustnost ve vodě, takže jsou použitelné pro parenterální aplikace. Peptidová rodina, která je cílem klinického výzkumu a mnohých snah o zlepšení podávání a bioasimilace, jsou interferony. Interferony byly testovány při mnoha nemocech. Použití humánního interferonu beta, jednoho členu této rodiny, je nejlépe zavedeno při léčení roztroušené sklerózy mozkomíšní (sclerosis multiplex). Dvě formy rekombi40 nantního interferonu beta byly nyní schváleny v Evropě a v USA pro léčení této nemoci. Jedna forma je interferon beta-la (ochranná známka a obchodní jméno AVONEX®, výrobce Biogen, lne., Cambridge, MA). Termíny „interferon-beta-la“ nebo „IFN-beta-la“ nebo „ΙΕΝ-β-la“ nebo „interferon-P-la“ jsou v popisu vynálezu užívány plně zaměnitelně. Jinou formou je „interferon-beta-lb“. Interferon beta-la je produkován v savčích buňkách pomocí přírodní sekvence lidského genu a je glykosylován, zatímco interferon beta-lb je produkován v buňkách E. coli pomocí modifikované sekvence lidského genu, který obsahuje substituci, cystein je nahrazen serinem, v pozici 17 a není glykosylován.
Již dříve byla přímým způsobem srovnána relativní in vitro aktivita interferonu beta-la a interferonu beta-lb ve funkčním testu a bylo ukázáno, že specifická aktivita interferonu betala je přibližně lOx vyšší než specifická aktivita interferonu beta-lb (Runkel et al., 1998, Pharm. Res. 15: 641-649). Ve studiích, jejíchž cílem bylo zjistit strukturní příčiny rozdílných aktivit, byla identifikována glykosylace jako jediný známý strukturní rozdíl mezi uvedenými dvěma produkty, který ovlivňuje specifickou aktivitu. Vliv sacharidů se projevoval zejména účinkem na stabilitu struktury. Stabilizující účinek sacharidů na strukturu byl evidentní při experimentech
- 1 CZ 299164 B6 s tepelnou denaturací a v analýze SEC. Nepřítomnost glykosylace také korelovala se zvýšenou agregací a zvýšenou citlivostí k tepelné denaturací. Enzymatické odstranění sacharidů z interferonu beta-la pomocí PNGázyF vedlo k extenzivní precipitaci deglykosylovaného produktu.
Tyto studie ukazují, že i přes konzervativní aminokyselinovou sekvenci interferonu beta-la a interferonu beta-lb se jedná o odlišné biochemické jednotky a většina znalostí o interferonu beta-lb nemůže být aplikována na interferon beta-la a naopak.
Podstata vynálezu
Vynález využívá výhod glykosylovaného interferonu-beta ve srovnání s neglykosylovanou formou. Zejména byl vyvinut přípravek obsahující interferon-beta-la se zvýšenou aktivitou vzhle15 dem k interferonu beta-lb, který má také prospěšné vlastnosti PEGylovaného (tj. PEG-modifikovaného) proteinu obecně, bez ztráty aktivity ve srovnání s formami interferonu beta-la, které nejsou konjugované. Takže byly provedeny takové modifikace, že produkty (tj. konjugáty polymer-interferon beta-la) si uchovávají většinu své biologické aktivity, a přitom bylo dosaženo následujících vlastností: změněná farmakokinetika a farmakodynamika vedoucí k delšímu biolo20 gickému poločasu a změnám tkáňové distribuce (např. schopnost zůstat delší dobu v cévách), zvýšená stabilita v roztoku, redukovaná imunogenicita, zlepšená ochrana před proteolytickým štěpením a následným rušením aktivity. Takový přípravek představuje podstatný pokrok v oboru medicíny, farmacie a byl by významným příspěvkem pro léčení nemocí, kde interferon prokázal svou užitečnost jako je např. sclerosis multiplex, fibróza a další zánětlivá a autoimunitní onemoc25 nění, různé druhy rakovin, hepatitida a další virové nemoci. Zejména schopnost zůstávat po delší dobu v cévním systému umožňuje, aby byl interferon-beta-1 a použit k inhibici angiogeneze a potenciálně také k přestoupení hematoencefalické bariéry. Kromě toho teplotní stabilita, získaná vytvořením konjugátů polymer-interferon-beta-laje výhodná pro podávání formou inhalace.
Bylo využito znalosti krystalografické struktury interferonu-beta a byl vyvinut takový konjugát polymer-interferon-beta-la, kde polymer je navázán na ta místa interferonu-beta, která dovolí, aby si konjugát uchoval plnou aktivitu interferonu-beta ve srovnání s interferonem-beta, který není konjugován.
Jeden aspekt předkládaného vynálezu se týká konjugovaných komplexů interferonu-beta-1 a, kde interferon-beta-la je kovalentně navázán na polymer, který obsahuje jako svou integrální část polyalkylenglykol.
Jeden konkrétní aspekt předkládaného vynálezu se týká přípravku fyziologicky aktivního inter40 feronu-beta-la, který obsahuje íyziologicky aktivní interferon-beta-la konjugovaný s polymerem obsahujícím polyalkylenglykolovou část, přičemž interferon-beta-la a polyalkylenglykolová část jsou uspořádány tak, že fyziologicky aktivní interferon-beta-la v přípravku má prodloužený biologický poločas vzhledem k samotnému interferonu-beta-1 a (tj. takovému interferonubeta, který není konjugován s polymerem).
Jiný aspekt předkládaného vynálezu představuje přípravek interferonu-beta-la, který obsahuje fyziologicky aktivní interferon-beta-la konjugovaný s polymerem, kde interferon-beta-la je fúzní protein, výhodně fúze s imunoglobulinem.V takovém komplexu těsná blízkost N-konce (místo konjugace s polymerem) s C-koncem (místo fúze s IgN)-konce (místo konjugace s poly50 merem) s C-koncem (místo fúze s imunoglobulinovou, Ig, částí) vede k předpokladu snížené imunogenicity takového fúzního proteinu.
Další aspekt předkládaného vynálezu se týká přípravku fyziologicky aktivního interferonu-betala, který obsahuje íyziologicky aktivní interferon-beta-la konjugovaný s polymerem obsahují55 cím polyalkylenglykolovou část, přičemž interferon-beta-la a polyalkylenglykolová část jsou
-2CZ 299164 B6 uspořádány tak, že fyziologicky aktivní interferon-beta-la v přípravku má zvýšenou aktivitu vzhledem k samotnému interferonu-beta-la (tj. takovému interferonu-beta, který není konjugován s polymerem).
Dalším provedením vynálezu je konjugovaný protein interferon-beta-la, kde interferonová část byla mutována, aby vznikly muteiny se selektivně zvýšenou antivirovou a/nebo antiproliferační aktivitou k nemutované formě interferonu-beta-1 a.
Ještě další aspekt vynálezu se týká stálého, ve vodě rozpustného konjugovaného komplexu interío feronu-beta-la, který obsahuje fyziologicky aktivní interferon-beta-la kovalentně navázaný na fyziologicky kompatibilní polyethylenglykolovou část labilními kovalentními vazbami volné aminoskupiny interferonu-beta-1 a, přičemž labilní kovalentní vazba je přerušena invivo biochemickou hydrolýzou a/nebo proteolýzou.
V jiném aspektu se předkládaný vynález týká dávkové formy obsahující farmaceuticky přijatelný nosič a stálý, ve vodě rozpustný komplex interferonu-beta-1 a obsahující interferon-beta konjugovaný s fyziologicky kompatibilním polyethylenglykolem.
V dalším aspektu předkládaného vynálezu přípravky s kovalentně navázaným interferonem20 beta-1 a, jak byly výše popsány, využívají interferon-beta-1 a zamýšlený pro diagnostické použití nebo pro použití in vitro, kde např. interferon-beta-la je diagnostické činidlo pro imunotest nebo jiné diagnostické použití, které se neprovádí in vivo. Při takovém jiném než léčebném použití komplex podle vynálezu je velmi užitečný jako stabilizovaný přípravek, který je formulován např. v kompatibilním rozpouštědle nebo jako jiný přípravek v podobě roztoku, který poskytuje přípravek v takové formě, že má zvýšenou rezistenci k degradaci.
Modifikace interferonu-beta-1 a netoxickými polymery nabízejí jisté výhody. Pokud jsou modifikace provedeny tak, že výsledné produkty (tj. konjugáty polymer-interferon-beta-la) si uchovávají většinu své biologické aktivity, mají následující vlastnosti: změněnou farmakokinetiku a farmakodynamiku vedoucí k prodlouženému poločasu a změnám tkáňové distribuce (např. schopnosti zůstávat déle v cévním systému), zvýšenou stabilitu v roztoku, sníženou imunogenicitu, lepší ochranu interferonu-beta-1 a před proteolytickou degradací a následnou ztrátou aktivity, zvýšenou teplotní stabilitu vedoucí k účinnější formulaci do práškových přípravků pro perorální nebo inhalační způsob podávání.
Interferon-beta-la s výše popsanými zlepšenými vlastnostmi je účinný při léčení po perorálním nebo parenterálním podání nebo po podání formou aerosolu. Další způsoby podávání jako např. nazální a transdermální, jsou také využitelné s modifikovaným interferonem-beta-la.
Další aspekt předkládaného vynálezu se týká způsobu inhibice angiogeneze a neovaskularizace, který spočívá v tom, že se pacientovi podává účinné množství přípravku podle vynálezu. PEGylovaný (tj. PEG-modifikovaný) produkt podle vynálezu by tedy měl být zejména účinný jakožto inhibitor angiogeneze v důsledku zvýšené hladiny interferonu a jejího prodlouženého trvání v cévním systému.
V jiném než terapeutickém použití (např. diagnostickém) se jedná o konjugáty diagnostických a/nebo reagenčních druhů interferonu-beta. Výsledná konjugovaná činidla jsou odolná proti degradačním faktorům prostředí, včetně degradačních procesů zprostředkovaných rozpouštědly nebo roztoky. V důsledku zvýšené odolnosti a zvýšené stability interferonu-beta-la je možné v přípravku zvýšit významně aktivitu účinné látky a současně s tím zvýšit spolehlivost přípravku obsahujícího interferon-beta-la pro specifického koncového uživatele.
Další aspekty, vlastnosti a modifikace předkládaného vynálezu budou podrobněji vysvětleny v následujícím podrobném popisu a vynález je definován v připojených patentových nárocích.
-3CZ 299164 B6
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1. Vazba mutanty interferonu-beta-la se substituovaným alaninem na dimemí fúzní protein obsahující extracelulární doménu receptoru interferonu typu I, IFNAR2/Ig (IFNAR2 ekto5 doména fúzovaná s konstantní doménou lidského IgGl)
Vazebné afinity alaninem substituované mutanty IFN (Al až E) pro receptor IFNAR2 byly stanoveny postupem jak je popsáno v příkladu 1 (část D). Histogram představuje vazebné afinity v testu ve srovnání s vazebnými afinitami divokého typu his-IFN-beta (v % d.t., divokého typu), ío Hodnoty % d.t. byly vypočteny následovně: (afinita divokého typu his-IFN-beta/afinita mutovaného IFN-beta) x 100. Jsou uvedeny hodnoty % d.t. (O) pro jednotlivé experimenty (n=3) a průměrné hodnoty % d.t. (x) pro experimentální soubor. Mutanty A2, AB1, AB2 a E neváží
IFNAR2/Fc v koncentraci 500 x vyšší než je EC50 divokého typu his-IFN-beta (*).
Obr. 2. Vazba mutanty interferon-beta-1 A se substituovaným alaninem na povrchový komplex receptoru interferonu typu I (IFNAR1/2 komplex) exprimovaný na Daudi buňkách Burkittova lymfomu
Receptorově vazebné vlastnosti mutanty se substituovaným alaninem (Al-E) byly stanoveny pomocí vazebného testu pro povrchový buněčný receptor založeného na analýze FACS, jak byl popsán v příkladu 1 (část D). Histogram představuje vazebné afinity v testu ve srovnání s vazebnými afinitami divokého typu his-IFN-beta (v % d.t., divokého typu). Hodnoty % d.t. pro každou mutantu byly vypočteny následovně: (afinita divokého typu his-IFN-beta/afinita mutovaného IFN-beta) x 100. Jsou uvedeny hodnoty % d.t. (O) pro jednotlivé experimenty a průměr25 né hodnoty % d.t. (x) pro experimentální soubor.
Obr. 3. Antivirová aktivita mutant interferon-beta-1 a se substituovaným alaninem
Antivirová aktivita mutant interferon-beta-1 a se substituovaným alaninem (Al-E) byla stanove30 na na lidských buňkách A549 infikovaných EMC virem jak bylo popsáno v příkladu 1 (část E). Histogram představuje aktivitu v testu ve srovnání s aktivitou divokého typu his-IFN-beta (v % d.t., divokého typu). Hodnoty % d.t. pro každou mutantu byly vypočteny následovně: (koncentrace divokého typu his-IFN-beta [50% cpe]/koncentrace mutovaného IFN-beta [50% cpe]) x 100. Jsou uvedeny hodnoty % d.t. (O) pro jednotlivé experimenty a průměrné hodnoty % d.t. (x) pro experimentální soubor.
Obr. 4. Antiproliferativní aktivita mutant interferonu-beta-la se substituovaným alaninem
Antiproliferativní aktivita mutant interferonu-beta-la se substituovaným alaninem (Al-E) byla stanovena na Daudi buňkách Burkittova lymfomu jak bylo popsáno v příkladu 1 (část E). Histogram představuje aktivitu v testu ve srovnání s aktivitou divokého typu his-IFN-beta (v % d.t., divokého typu). Hodnoty % d.t. pro každou mutantu byly vypočteny následovně: (koncentrace divokého typu his-IFN-beta [50% inhibice růstu]/koncentrace mutovaného IFN-beta [50% inhibice růstu]) x 100. Jsou uvedeny hodnoty % d.t. (O) pro jednotlivé experimenty a průměrné hod45 noty % d.t. (x) pro experimentální soubor.
Obr. 5. Relativní antivirové a antiproliferativní vlastnosti mutant interferon-beta-1 a se substituovaným alaninem
Relativní aktivity mutant interferonu-beta-la se substituovaným alaninem (Al-E) v testu antivirové (osa x) a antiproliferativní (osa y) aktivit byly srovnány. Pro toto srovnání byly užity hodnoty průměrného % divokého typu his-IFN-beta (% d.t., x) uvedené na obr. 3 a 4. Mutanty, které vykazují koordinované změny v obou aktivitách se objeví na vertikální čáře. Mutanty vykazující změnu antivirové aktivity, která není úměrná změně v antiproliferační aktivitě se objeví výrazně
-4CZ 299164 B6 pod diagonálu (DE1, D, Cl). Významnost byla stanovena na základě směrodatných odchylek příslušných použité průměrné hodnotě % d.t.
Obr. 6. Lokalizace místa PEGylace peptidovým mapováním. PEGylovaný a nemodifikovaný interferon-beta-la byly analyzovány peptidovým mapováním. Vzorky byly naštěpeny endoproteinázou Lys-C a pak analyzovány HPLC na koloně C4 s reverzní fází. Kolona byla vyvíjena gradientem 0 až 70 % acetonitrilu v 0,1% trifluoroctové kyselině. Efluent z kolony byl monitorován při 214 nm. Na panelu a je zobrazen nemodifikovaný interferon-beta-la, na panelu b je PEGylovaný interferon-beta-la. Šipky označují eluční pozici N-koncového peptidu interferonuío beta-la obsahujícího aminokyselinové zbytky 1 až 19, který byl odštěpen lysinovou endoproteinázou.
Obr. 7. Antivirová aktivita konjugovaného a nekonjugováného interferonu-beta-la
Aktivita interferonu-beta-la a PEGylovaného interferonu-beta-la v koncentracích uvedených na ose x byly vyhodnoceny v antivirovém testu užitím buněk lidského plicního karcinomu (A549) infikovaných virem encefalomyokarditidy. Po dvoudenní inkubaci za přítomnosti viru byly živé buňky obarveny MTT a misky byly vyhodnoceny na čtecím zařízení při 450 nm, absorbance, která je odrazem životnosti buněk. Směrodatné odchylky jsou uvedeny jako svislé úsečky.
Koncentrace interferonu-beta-la nebo PEGylovaného interferonu-beta-la, při které došlo k 50% usmrcení buněk virem (50% cytopatický účinek) (50 % maxima při 450 nm) byla 11 pg/ml a 50% cytopatický účinek pro PEGylovaný interferon-beta-la byl přibližně 11 pg/ml.
Obr. 8. Hodnocení stability konjugátů užitím tepelné denaturace
PEGylovaný interferon-beta-la a neošetřený interferon-beta-la jako kontrola v pufru 20mM HEPES, pH 7,5, 20mM NaCl, byly zahřívány konstantní rychlostí 1 stupeň za minutu. Denaturace byla sledována měřením změn absorbance v 280 nm. a) nemodifikovaný interferon-beta-la, b) PEGylovaný interferon-beta-la
Obr. 9. Měření antivirové aktivity interferonu-beta v plazmě myší ošetřených interferonembeta-la nebo PEGylovaným interferonem-beta-la
Myším bylo injikováno buďto 50 000 jednotek interferonu-beta-la, nebo PEGylovaného interfe35 ron-beta-la (obsahujícího 20K PEG). Krev z těchto zvířat byla získána retroorbitálním odběrem v různých časech po injekci, jak ukazuje osa x. Pro každý časový bod byla odebrána krev alespoň ze tří myší, byla připravena plazma a zamražena až do stanovení aktivity interferonu-beta v antivirovém testu s buňkami lidského plicního karcinomu (A549) po infekci virem encefalomyokarditidy. Živé buňky byly obarveny roztokem MTT, destičky byly pak změřeny ve 450 nm ke stanovení absorbance, která je odrazem životnosti buněk a aktivity interferonu-beta. Pro stanovení množství aktivity interferonu-beta-la ve vzorku byly na každé destičce také připraveny standardní (kalibrační) křivky s interferonem-beta-la. Graf ukazuje data z jednotlivých zvířat.
Obr. 10. Úplná DNA sekvence genu interferonu-beta s histidinovou značkou a odpovídající proteinový produkt
Na obrázku jsou uvedeny úplná DNA sekvence (sekvence id. č. 1) a proteinová sekvence (sekvence id. č. 2) histidinem označeného („His-tagg“) IFN-beta-la. Štěpená signální sekvence VCAM-1 zanechá 3 zbytky amino-konce (SerGlyGly) „upstream“ od histidinové značky (His6, pozice 4 až 9). Sekvence enterokinázové spojky (linkeru) (AspAspAspAspLys) je od histidinové značky oddělena oddělovací sekvencí (spacerem) (SerSerGly, pozice 10 až 12). Přírodní sekvence proteinu IFN-beta-la představuje sekvence Metl8 až Asnl83.
-5CZ 299164 B6
Definice
Termín „kovalentně navázaný“ užívaný v popisu znamená to, že specifické skupiny či části jsou buďto vzájemně přímo kovalentně vázány, nebojsou spojeny kovalentně prostřednictvím vmeze5 řené skupiny nebo části nebo skupiny či částí jako je např. můstek, oddělovací část (spacer) nebo spojovací část (linker).
„Interferon“ (zkráceně označovaná také jako IFN) je malý, druhově specifický, jednořetězcový polypeptid, tvořený v buňkách savců jako reakce na expozici různých induktorů jako jsou viry, polypeptidy, mitogeny apod. Nejvýhodnější interferon podle vynálezu je v glykosylované formě, lidský interferon-beta je glykosylován na 80. zbytku (Asn80) a výhodně je připraven technikami rekombinantní DNA. Výhodný glykosylovaný interferon je označován „interferon-beta-la“ nebo také „IFN-beta-la“, „ΙΡΝ-β-la“, „interferon beta la“ nebo „interferon-fVla“, přičemž všechny uvedené názvy jsou užívány zaměnitelně. Termín „interferon-beta-la“ podle vynálezu zahrnuje i mutované formy interferonu (viz např. příklad 1) za předpokladu, že tyto mutanty jsou glykosylované na 80. zbytku (Asn80). Metody přípravy proteinů technikami rekombinantní DNA jsou známy, včetně přípravy různých interferonů, a nijak neomezují předkládaný vynález, viz např. patenty US 4 399 216, US 5 149 636 a US 5 179 017 (Axel et al.) a US 4 470 461 (Kaufman).
Výhodné polynukleotidy pro interferon-beta-la, které lze užít podle předkládaného vynálezu, byly odvozeny ze sekvencí interferonu divokého typu různých obratlovců, výhodně savců, a byly získány metodami, které jsou odborníkovi známé a byly popsány, viz např. patent US 5 641 656 (udělený 24.6.1997, DNA kódující ptačí interferonový pro-protein typu I a zralý ptačí interferon typu I), patent US 5 605 688 (25. února 1997 - rekombinantní psí a koňské interferony typu I), patent US 5 231 176 (27. července 1993, DNA molekula kódující lidský leukocytární interferon), patent US 5 071 761 (10. 12. 1991, DNA sekvence kódující subsekvence lidských lymfoblastoidních interferonů LyIFN-alfa-2 a LyIFN-alfa-3), patent US 4 970 161 (13. listopadu 1990, DNA sekvence kódující lidský interferon gama), patent US 4 738 931 (19. dubna 1988, DNA sekvence obsahující gen lidského interferonu beta), patent US 4 695 543 (22. září 1987, lidský gen alfainterferonu Gx-1) a US 4 456 748 (26. června 1984, DNA sekvence kódující subsekvence různých přirozeně se vyskytujících leukocytových interferonů).
Ve vynálezu se mohou užít také mutanty interferonu-beta-1 a. Kromě toho vynález poskytuje funkčně ekvivalentní polynukleotidy interferonu-beta-1 a, které kódují funkčně ekvivalentní polypeptidy interferonu-beta-1 a.
První polynukleotid je „funkčně ekvivalentní“ ve srovnání s druhým polynukleotidem, pokud splňuje alespoň jednu z následujících podmínek:
a) „funkčně ekvivalentní“ je první polynukleotid, který hybridizuje s druhým polynukleotidem za standardních hybridizačních podmínek a/nebo je degenerovaný vzhledem k sekvenci druhého polynukleotidu, nejvýhodněji kóduje mutantu mající aktivitu interferonu-beta-1 a,
b) „funkčně ekvivalentní“ je první polynukleotid, který kóduje expresi aminokyselinové sekvence kódované druhým polynukleotidem.
Lze shrnout, že obecný termín „interferon“ zahrnuje, avšak není omezen pouze na ně, všechna činidla uvedená v předchozím textu a také jejich funkční ekvivalenty. Termín „funkční ekvivalent“ se týká jak interferonového proteinu, tak i polynukleotidu kódujícího interferonový protein, které mají stejný nebo lepší prospěšný účinek na savčího příjemce jako původní interferon, k němuž se funkční ekvivalent vztahuje. Odborníkovi je zřejmé, že funkčně ekvivalentní protein může být připraven rekombinantní technikou, tj. expresí „funkčně ekvivalentní“ DNA. Tudíž předmětem předkládaného vynálezu jsou také interferony kódované přirozeně se vyskytující DNA, a také kódované DNA, která se přirozeně nevyskytuje, ale kóduje stejný protein jako je kódován přirozeně se vyskytující DNA. Díky degeneraci nukleotidových kódujících sekvencí se
-6CZ 299164 B6 mohou užít jiné polynukleotidy pro kódování interferonů. K nim patří celé nebo části výše uvedených sekvencí, které byly změněny substitucí různých kodonů, které kódují stejný aminokyselinový zbytek v sekvenci, jde tedy o umlčenou záměnu. Takové zaměněné sekvence se považují za ekvivalenty těchto sekvencí. Tak např. Phe (F) je kódován dvěma kodony, a sice TTC nebo
TTT, Tyr (Y) je kódován TAC nebo TAT a His (H) je kódován CAC nebo CAT. Na druhé straně Trp (W) je kódován jediným kodonem TGG. Tudíž je jasné, že pro danou sekvenci DNA kódující konkrétní interferon existuje mnoho degenerovaných sekvencí, které ho kódují. Tyto degenerované sekvence jsou také předmětem předkládaného vynálezu.
„Fúze“ (také fúzní polypeptid nebo fúzní protein) označuje kolineámí spojení dvou nebo více proteinů nebo jejich fragmentů prostřednictvím peptidové kostry, a to tím, že se exprimuje polynukleotidová molekula kódující tyto proteiny. K výhodným fúzním proteinům patří interferonbeta-la nebo jeho fragment kovalentně spojený s druhou částí/skupinou, která není interferonem. Specificky fúzní protein nebo fúze „interferon-beta-la/Ig“ je protein obsahující molekulu inter15 feronu-beta-la podle vynálezu, nebo její fragment, navázanou na N-konec imunoglobulinového řetězce, přičemž ůsekN-konce imunoglobulinu je nahrazen interferonem-beta-la.
Termín „rekombinantní“ znamená v popisu vynálezu protein pocházející z rekombinantního savčího expresního systému. Protein exprimovaný ve většině bakteriálních kultur, jako je např. E.
coli, bude bez glykanů, a proto takový expresní systém není výhodný. Protein exprimovaný v kvasinkách může obsahovat oligosacharidové struktury, které jsou odlišné od struktur exprimovaných v savčích buňkách.
Termín „biologicky aktivní“ užívaný v předkládaném popisu jako charakteristika interferonu25 beta-la znamená, že příslušná molekula sdílí s provedeními vynálezu zde popsanými homologii v sekvenci aminokyselin dostatečnou k tomu, že vykazuje antivirovou aktivitu při měření in vitro antivirovým testem stejného typu, jaký je popsán v příkladu 1 (viz dále).
Termín „léčivý přípravek“ v popisu vynálezu označuje přípravky obsahující proteiny podle vyná30 lezu a další fyziologicky kompatibilní přísady. Léčivý přípravek dále obsahuje excipienty jako je např. voda, minerály a nosiče jako např. proteiny.
Termín „účinné množství“ činidla nebo přípravku označuje takové množství, které poskytuje požadovaný výsledek nebo projevuje vliv na určité onemocnění, které je léčeno.
„Aminokyselina“ je monomemí jednotka peptidu, polypeptidu nebo proteinu. Existuje dvacet aminokyselin, které se vyskytují v přirozeně se vyskytujících peptidech, polypeptidech nebo proteinech, a všechny jsou L-izomery. Patří sem také analogy aminokyselin a D-izomery aminokyselin tvořících proteiny a jejich analogy.
„Derivatizovaná“ aminokyselina je přírodní aminokyselina nebo aminokyselina nevyskytující se v přírodě, kde normálně se vyskytující postranní řetězce nebo koncové skupiny jsou chemicky modifikovány. K takovým modifikacím patří např. gama-karboxylace, beta-karboxylace, sulfatace, sulfonace, fosforylace, amidizace, esterifikace, N-acetylace, karbobenzylace, tosylace a další modifikace, které jsou odborníkům známy. Takže „derivatizovaný polypeptid“ je polypeptid obsahující jednu nebo více derivatizovaných aminokyselin.
„Protein“ je polymer složený v podstatě z kterýchkoliv z dvaceti proteinových aminokyselin. I když termín „polypeptid“ se často užívá k označení relativně velkých polypeptidů, použití těchto termínů v oboru se často překrývá a je odlišné. V tomto textu se užívá termín „protein“ k označení peptidů, proteinů i polypeptidů, pokud není výslovně uvedeno jinak.
Termín „mutace“ (případně „mutanta“) označuje jakoukoliv změnu v kvalitě nebo struktuře genetického materiálu organismu, konkrétně je to jakákoliv změna (tj. delece, substituce, adice
-7CZ 299164 B6 nebo alterace) v genu, tj. polynukleotidové sekvenci, interferonu divokého typu nebo jakákoliv změna v interferonovém proteinu divokého typu.
Termín „divoký typ“ označuje přirozeně se vyskytující polynukleotidovou sekvenci exonu pro5 teinu nebo její část, nebo aminokyselinovou sekvenci interferonového proteinu nebo její část, tak jak se normálně vyskytuje in vivo.
„Standardní hybridizační podmínky“ jsou podmínky definované koncentrací solí a teplotou v podstatě shodné s podmínkami 0,5xSSC až 5xSSC a 65 °C jak pro vlastní hybridizaci tak pro10 mývání. Termín „standardní hybridizační podmínky“ zde užívaný je proto operační definice zahrnující celou řadu různých hybridizačních podmínek. Podmínky s vysokou stringencí (přísností) znamenají např. hybridizaci v pufru pro screening plaků (0,2% polyvinylpyrrolidon, 0,2% Ficoll 400, 0,2% bovinní sérový albumin, 50mM Tris-HCl, pH 7,5, 1M NaCl, 0,1% hydrogenfosforečnan sodný, 1 % SDS) s 10% dextrasulfátem a 100 pg/ml denaturované sonikované DNA lososího spermatu při 65 °C po 12 až 20 hodin a promývání v 75mM NaCl/7,5mM citrát sodný (0,5xSSC)/l% SDS při 65 °C. Podmínky s nízkou stringencí mohou např. zahrnovat hybridizaci v pufru pro screening plaků s 10% dextransulfátem a 110 pg/ml denaturované sonikované DNA lososího spermatu při 55 °C po 12 až 20 hodin a promývání v 300mM NaCl/30mM citrát sodný (2xSSC)/l% SDS při 55 °C (viz Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, lne., New York, 6.3.1. - 6.3.6., 1989).
„Expresní kontrolní sekvence“ je polynukleotidová sekvence, která řídí a reguluje expresi genů, když je s těmito geny operativně spojena.
„Operativně spojena“ znamená v případě polynukleotidové sekvence (DNA, RNA), že je „operativně spojena“ s expresní kontrolní sekvencí, když expresní kontrolní sekvence řídí a reguluje transkripci a translaci této polynukleotidové sekvence. Termín „operativně spojena“ znamená, že před polynukleotidovou sekvencí, která má být exprimována, je vhodný startovací signál (např. ATG), a že sekvence je ve správném čtecím rámci, který dovoluje expresi polynukleotidové sek30 vence pod kontrolou expresní kontrolní sekvence, a tudíž produkci požadovaného polypeptidu kódovaného izolovanou polynukleotidovou sekvencí.
„Expresní vektor“ je polynukleotid, většinou DNA plazmid nebo fág (jako nejběžnější příklady z dalších), kteiý dovoluje expresi alespoň jednoho genu, když je vektor vnesen do hostitelské buňky. Vektor může ale nemusí být schopen replikace v hostitelské buňce.
Termín „izolovaný“ (užívaný v předkládané přihlášce zaměnitelně s termínem „v podstatě čistý“) znamená, pokud se týká polynukleotidových sekvencí genů, které kódují polypeptidy, RNA nebo DNA polynukleotid, část genomového polynukleotidu, cDNA nebo syntetický polynukleotid, který v důsledku svého původu nebo zacházení s ním:
I) není spojen se všemi polynukleotidy se kterými je spojen v přírodě (např. je přítomen v hostitelské buňce jako část expresního vektoru),
II) je spojen s nukleovou kyselinou nebo jinou chemickou skupinou, které se odlišují od těch, se kterými je spojen v přírodě, nebo
III) nevyskytuje se v přírodě.
Jako „izolovaná“ se dále označuje polynukleotidová sekvence:
I) amplifikovaná in vitro např. metodou polymerázové řetězové reakce (PCR),
II) syntetizované chemicky,
III) rekombinantně připravená klonováním nebo
IV) purifikovaná, např. štěpením a gelovou separací.
-8CZ 299164 B6
Takže „v podstatě čistá nukleová kyselina“ je nukleová kyselina, která není bezprostředně souvisle spojena s jednou nebo dvěma sekvencemi, se kterými je normálně souvisle spojena v přírodně se vyskytujícím genomu organismu, ze kterého je izolována. V podstatě čistá DNA je také rekombinantní DNA, která je částí hybridního genu kódujícího další sekvence.
Termín „izolovaný“ (užívaný v předkládané přihlášce zaměnitelně s termínem „v podstatě čistý“) znamená, pokud jde o polypeptidy, polypeptid nebo jeho část, který v důsledku svého původu nebo zacházení s ním:
I) je přítomen v hostitelské buňce jako expresní produkt úseku expresního vektoru, nebo ίο II) je spojen s jinými proteiny nebo chemickými skupinami, než se kterými je spojen v přírodě, nebo
III) nevyskytuje se v přírodě.
Jako „izolovaný“ se dále označuje polypeptid, který:
I) byl chemicky syntetizován,
II) byl exprimován v hostitelské buňce a purifikován od ostatních proteinů a nukleových kyselin hostitelské buňky, se kterými se v přírodním stavu vyskytuje.
Výhodně je izolovaný polypeptid purifikován také od dalších látek, jako jsou např. protilátky nebo gelová matrix (polyakrylamid), které se užívají k purifikaci.
Termín „heterologní promotor“ označuje promotor, který v přírodě není spojen s genem nebo purifikovanou nukleovou kyselinou.
Termín „homologní“ je zde užíván jako synonymum s „identický“ a týká se sekvenční podobnosti dvou polypeptidů nebo molekul nukleové kyseliny. Když je jedna určitá pozice ve dvou srovnávaných sekvencích obsazena stejnou bází nebo aminokyselinou (např. pozice ve dvou molekulách DNA je obsazena adeninem nebo pozice ve dvou polypeptidech je obsazena lysinem), pak dvě srovnávané molekuly jsou v této pozici homologní. Procento homologie mezi dvěma sekvencemi je funkcí počtu shodných nebo homologních pozic sdílených dvěma sekvencemi dělený celkovým počtem pozic a vynásobený 100. Tak např. jestliže 6 z 10 pozic je shodných nebo-li homologních, pak tyto sekvence jsou z 60 % homologní. Nebo např. DNA sekvence CTGACT a CAGGTT sdílejí 50% homologii (3 pozice ze 6 se shodují). Obecně se srovnání provádí, když jsou sekvence vzájemně přiřazeny tak, aby bylo dosaženo maximální homologie.
Takové přiřazení a srovnání lze provést metodou, kterou publikoval Needleman et al. (J. Mol. Biol. 48: 443-453, 1970), a která je standardně implementována v příslušných počítačových programech jako je např. program „Align“ (DNAstar, lne.). Homologní sekvence sdílejí shodné nebo podobné zbytky aminokyselin, kde podobné aminokyselinové zbytky jsou konzervativní substituce nebo „povolené bodové mutace“ odpovídajících aminokyselinových zbytků vzhledem k přiřazené referenční sekvenci. V tomto smyslu „konzervativní substituce“ aminokyselinového zbytku v referenční sekvenci znamená substituci aminokyselinou, která je fyzicky nebo funkčně podobná odpovídajícímu referenčnímu zbytku, tedy např. má podobnou velikost, tvar, elektrický náboj, chemické vlastnosti včetně schopnosti vytvářet kovalentní nebo vodíkové vazby apod. Zvláště výhodné jsou kovalentní substituce, které splňují kritéria definovaná jako „přijatelné bodové mutace“ v publikaci Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure 5, Suppl. 3, Chapter 22: 352-354, Nat. Biomed. Res. Foundation, Washington D.C., 1978.
Termíny „polynukleotidová sekvence“ a „nukleotidová sekvence“ jsou užívány v popisu zaměnitelně.
Termíny „angiogeneze“ a „neovaskularizace“ jsou užívány v nej širším významu a znamenají vytváření nových krevních cév. Zejména angiogeneze se týká také vytváření nových krevních cév v místě nádoru.
-9CZ 299164 B6
Termíny „IFNAR2“, „IFNARl“ a „IFNAR1/2“ označují proteiny, které tvoří interferonový receptor typu I na povrchu buněk. Extracelulámí úsek (ektodoména) receptorů IFNAR2 sama může vázat interferon beta nebo alfa.
Při realizaci předkládaného vynálezu byly použity standardní metody buněčné biologie, buněčných kultur, molekulární biologie, mikrobiologie, rekombinantní DNA, proteinové chemie a imunologie, které jsou odborníkům známy. Tyto metody byly publikovány v odborné literatuře. Viz např. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition. (Sambrook, Fritsch and
Maniatis, eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; DNA Cloning, Volumes I and II (D.N. Glover, ed), 1985; Oligonucleotide Synthesis, (M.J. Gait, ed.), 1984; Patent US 4 683 195 (Mullis et al.); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames and S.J. Higgins, eds.), 1984; Transcription and Translation (B.D. Hames and S.J. Higgins, eds.), 1984; Culture of Animal Cells (R.I. Freshney, ed.). Alan R. Liss, lne., 1987; Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press, 1986; A
Practical Guide to Molecular Cloning (B. Perbal), 1984; Methods in Enzymology, Volumes 154 and 155 (Wu et al., eds.), Academie Press, New York; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H. Miller and M.P. Calos, eds.), 1987, Cold Spring Harbor Laboratory; Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Mayer and Walker, eds.), Academie Press. London, 1987; Handbook of Experiment Immunology, Volumes I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.), 1986; Manipulating the Mouše Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986.
Interferon-beta
Interferon-beta-la je užitečný jako činidlo vhodné k léčení, remisi nebo zeslabení nemocí, fyziologických stavů, symptomů nebo etiologických faktorů, nebo ke stanovení takové diagnózy. Termín se týká i interferon-beta-la, který je součástí fúzního proteinu, jak je popsán v současně projednávané patentové přihlášce USA 60/104572 a 60/120161. Příprava fúzních proteinů v obecném smyslu je odborníkům známa.
Původci předkládaného vynálezu nalezli jedinečná místa pro navázání polymeru, při kterém se nenaruší funkce interferonu-beta-la. Kromě toho byla také užita místně cílená mutageneze k nezávislému výzkumu míst pro navázání polymeru (viz příklad 1). Stručně řečeno, byla provedena mutační analýza lidského interferonu-beta-la s cílem zmapovat aminokyselinové zbytky nezbytné pro aktivitu a vazbu na receptor. Dostupnost 3-D krystalové struktury lidského inter35 feronu-beta-1 a (viz příklad 1) dovolila identifikovat pomocí alaninových (nebo serinových) substitucí zbytky exponované rozpouštědlu, přístupné pro interakci interferonu-beta-la s receptorem, a uchovat aminokyseliny podílející se na intramolekulámích vazbách. Byl připraven panel patnácti mutací získaný „alaninovou skenovací mutagenezí“, kde bylo nahrazeno 2 až 8 aminokyselinových zbytků v určitém úseku šroubovic (A, B, C, D a E) a smyček (AB1, AB2, AB3,
CD1, CD2, DE1, DE2) molekulami interferonu—beta—1 a (viz příklad 1).
Histidinová značka („his-tag“) na amino-konci byla vnesena kvůli afinitní purifikaci expresních mutant ze savčích buněk (viz obr. 10 a sekvence id. č. 1 a 2, kde jsou cDNA sekvence a dedukovaná aminokyselinová sekvence). Funkční důsledky provedených mutací byly vyhodnoceny v antivirových a antiproliferaěních testech. Byl vyvinut neradioaktivní vazebný test pro analýzu mutant na jejich vazbu na povrchový receptor interferon-beta-la (IFNAR1/2 receptor na buněčném povrchu). Kromě toho byl použit ELIS A test užívající fúzní protein „ektodoména IFNAR2/Ig“ k navázání interferonu pro mapování povrchových interakcí mezi interferonembeta-la a receptorem IFNAR2 (viz příklad 1). Tyto mutační analýzy ukázaly, že N- a C-konce leží v úseku molekuly interferonu-beta-la, který není důležitý pro vazbu receptorů nebo biologickou funkci.
Mutanty jsou dalšími molekulami interferonu-beta-la vhodnými jako interferonová část v konjugátech podle vynálezu, které jsou zvláště užitečné, pokud mají nové vlastnosti, které se nevyskytují u interferonu-beta-la divokého typu (viz příklad 1). Byly identifikovány tři druhy
-10CZ 299164 B6 účinků, způsobené cílenou mutagenezí. Tyto účinky byly za jistých okolností výhodné pro vývoj interferonových léčiv.
Tyto tři účinky byly následující:
a) mutanty s vyšší antivirovou aktivitou než interferon-beta-la divokého typu s his-značkou (např. mutanta Cl),
b) mutanty aktivní jak v antivirovém, tak antiproliferativním testu, ale jejich antiproliferativní aktivita byla neúměrně nízká ve srovnání s antivirovou aktivitou, ve srovnání s interferonembeta-1 a divokého typu s his-značkou (např. mutanta Cl, D a DE1), ío c) funkční antagonisté (např. Al, B2, CD2 a DE1), kteří vykazují antivirovou i antiproliferativní aktivitu, avšak jejich antivirová i antiproliferativní aktivita byla neúměrně nízká ve srovnání s vazebnou aktivitou k receptoru, ve srovnání s interferonem-beta-1 a divokého typu.
Polymerová část
Podle vynálezu, v jeho nejširším smyslu, lze pro konjugaci s interferonem-beta-1 a užít jedinou molekulu polymeru, i když vynález zahrnuje použití více než jedné molekuly. Přípravky podle vynálezu obsahující konjugáty interferonu-beta-la jsou užitečné v aplikacích in vitro a in vivo. Navíc je známo, že konjugující polymer může využít jakékoliv jiné skupiny, části nebo jiné kon20 jugované molekuly v závislosti na konečné aplikaci. Pro příklad uveďme, že v některé aplikaci může být užitečné k polymeru kovalentně navázat funkční skupinu zajišťující rezistenci vůči degradaci UV zářením nebo oxidací, případně jiné výhodné vlastnosti polymeru. Jako další příklad uveďme, že v některých aplikacích může být výhodné funkcionalizovat polymer tak, aby byl reaktivní nebo zesíťovaný, aby se zesílily určité vlastnosti celkově konjugovaného materiálu.
Tudíž polymer obsahuje jakoukoliv funkční skupinu, opakující se skupiny, vazby, nebo jiné struktury, které nejsou na zábranu funkci a aktivitě konjugovaného interferonu-beta-la v přípravku s určitým cílem. Další výhody předkládaného vynálezu budou patrné z dalšího popisu a také patentových nároků.
Pro ilustraci jsou dále uvedeny příklady polymerů, které se mohou užít k dosažení těchto výhodných vlastností, jak je popsáno v reakčních schématech. Při aplikacích s kovalentně vázaným peptidem se polymer funkcionalizuje, a pak se naváže na volnou aminokyselinu (nebo více aminokyselin) peptidu, kde vytvoří labilní vazby.
Interferon-beta-la je nejvýhodněji konjugován prostřednictvím terminálních reaktivních skupin polymeru, i když konjugace mohou být také rozvětveny z jiných než koncových reaktivních skupin. Polymer s reaktivními skupinami je v popisu vynálezu označován termínem „aktivovaný polymer“. Reaktivní skupiny selektivně reagují s volnými aminokyselinami nebo jinými reaktivními skupinami proteinu. Aktivovaný polymer je zreagován tak, že k vazbě může dojít sjakou40 koli dostupnou aminoskupinou interferonu-beta-1 a, jako je např. alfa aminoskupina nebo epsilon aminoskupina lysinu. Volné karboxylové skupiny, vhodně aktivované karbonylové skupiny, hydroxylové a guanidylové skupiny, oxidované sacharidové skupiny a merkaptoskupiny interferonu-beta-1 a (pokud jsou dostupné) mohou být také užity jako místa navázání polymeru.
Ačkoliv polymer může být navázán v podstatě kdekoliv na molekule interferonu-beta-la, nejvýhodnější místo pro navázání polymeruje A-konec interferonu-beta-la. Sekundární místa jsou v blízkosti C-konce a na sacharidových skupinách. Takže nejvýhodnější provedení předkládaného vynálezu vypadá takto: I) N-koncově navázané konjugáty interferonu-beta-la, II) C-koncově navázané konjugáty interferonu-beta-la, III) cukrem navázané konjugáty polymemích konjugátů a IV) A-, C- a cukrem-vázané polymemí konjugáty fúzních proteinů interferonu-beta-1 a.
Obecně se užívá 1,0 až 10 mol aktivovaného polymeru najeden mol proteinu, v závislosti na koncentraci proteinu. Výsledné množství je kompromisem mezi maximalizací rozsahu reakce a minimalizací nespecifických modifikací produktu, a současně definováním takové chemie,
- 11 CZ 299164 B6 která uchová optimum aktivity a současně optimalizuje, je-li to možné, biologický poločas proteinu. Výhodně je zachováno alespoň 50 % aktivity proteinu, nejvýhodněji 100 %.
Reakce se může provést jakýmkoliv známým způsobem, užívaným pro reakci biologicky aktiv5 ního materiálu s inertním polymerem, výhodně při pH 5 až 7, pokud jsou reaktivní skupiny na alfa aminoskupinách A-konce. Obecně celý postup obsahuje přípravu aktivovaného polymeru (který má alespoň jednu koncovou hydroxylovou skupinu), a pak reakci proteinu s aktivovaným polymerem, čímž se připraví rozpustný protein, který je vhodný pro formulaci do přípravku. Výše uvedené modifikační reakce mohou být provedeny různými způsoby, které obsahují jeden ío či více kroků.
Jak již bylo uvedeno výše, nej výhodnějším provedením vynálezu je takové, která využívá N-konce interferonu-beta-1 a k navázání polymeru. Existují vhodné metody k získání interferonu-beta-la modifikovaného na N-konci. Jedním příkladem takových metod je reduktivní alkyla15 ce, která využívá různé reaktivity různých typů primárních aminoskupin (epsilon aminoskupiny na lysinu proti N-koncovým aminoskupinám methioninu) dostupných pro derivatizaci interferonu-beta-la. Za vhodných selekčních podmínek lze dosáhnout v podstatě selektivní derivatizace interferonu-beta-la na N-konci s polymerem obsahujícím karbonylovou skupinu. Reakce se provádí při pH, které umožňuje využít rozdílů mezi pak epsilon aminoskupin lysinových zbytků a alfa aminoskupin N-koncových zbytků interferonu-beta-la. Tyto chemické postupy jsou odborníkům dobře známy.
Původci vynálezu užili reakční schéma, ve kterém je selektivita udržována použitím nízkého pH (obecně 5 až 6) v podmínkách, kde polymemí PEG-aldehyd reaguje s interferonem-beta-la v přítomnosti kyanoborohydridu sodného. Tento postup po purifikaci PEG-interferonu-beta-la, jak ukázaly analýzy SDS-PAGE, MALDI hmotové spektrometrie a peptidového sekvencování/mapování, poskytuje interferon-beta-la, jehož N-konec je specificky zacílen PEG.
Krystalová struktura interferonu-beta-la je taková, že N- a C-konec jsou lokalizovány vzájemně do těsné blízkosti (viz Karpusas et al., 1997, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 94: 11813-11818). Takže modifikace C-konce interferonu-beta-la by měla mít minimální účinek na jeho aktivitu. Zatímco neexistuje žádná jednoduchá chemická strategie pro zacílení polyalkylenglykolového polymeru, jako je např. PEG, na C-konec, přímou metodou by mohlo být upravit metodami genového inženýrství požadované místo tak, aby se mohlo užít k zacílení polymerové části. Tak např. vložení Cys do místa v blízkosti C-konce by umožnilo specifickou modifikaci užitím polyalkylenglykolu (např. PEG) aktivovaného maleimidem, vinylsulfonem nebo haloacetátem. Tyto deriváty mohou být užity specificky k modifikaci vložených cysteinů vzhledem k vysoké selektivitě těchto činidel vůči cysteinu. K dalším strategiím, které by byly alternativou k modifikaci Ckonce interferonu-beta-la, patří např. inkorporace histidinové značky, na kterou může být zací40 len polymer (Fancy et al., 1996, Chem. and Biol. 3: 551) nebo inkorporace dalších glykosylačních míst.
Glykan na molekule interferonu-beta-la je v takové pozici, která dovoluje další modifikace, aniž by došlo ke změně aktivity. Metody zacílení cukrů jako míst pro chemické modifikace jsou odborníkům známy a tudíž polyalkylenglykolový polymer může být připojen přímo a specificky na cukry interferonu—beta—1 a, který byl aktivován oxidací. Např. může být připraven polyethylenglykolhydrazid, který vytváří relativně stálé hydrazonové vazby kondenzací s aldehydy a ketony. Tato vlastnost byla využita pro modifikaci proteinů prostřednictvím oxidovaných oligosacharidových vazeb (viz Andresz, H. et al., 1978, Macromol. Chem. 179: 301). Konkrétně působením nitritu na PEG-karboxymethylhydrazid vzniká PEG-karboxymethylhydrazid, který je elektrofilně aktivní skupinou vzhledem k aminoskupině. Tato reakce byla již použita pro přípravu proteinů modifikovaných polyalkylenglykolem (viz patenty US 4 101 380 a US 4 179 337.).
Původci již dříve objevili, že chemické postupy sthiolovými spojovacími členy (linkery) dále usnadňují zesítění (cross-linking) proteinů. Konkrétně byly připraveny homotypické multimery
- 12CZ 299164 B6
LFA-3 a CD4 užitím postupu, kde se vytvořily reaktivní aldehydy na sacharidových částech molekuly užitím jodistanu sodného, vytvořily se cystaminové konjugáty prostřednictvím těchto aldehydů a indukovalo se zesítění prostřednictvím thiolových skupin cystaminů (viz Pepinsky, B. et al., 1991, J. Biol. Chem. 266: 18244-18249, Chen, L.L. et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:
18237-18243). Tudíž se lze domnívat, že i tyto chemické postupy by byly vhodné pro modifikace s polyalkylenglykolovými polymery, kdy je linker vložen do sacharidové části a polyalkylenglykolový polymer je navázán na tento linker. Linkery obsahující aminothiolovou nebo hydrazinovou skupinu umožní navázat jedinou polymerovou skupinu, struktura těchto linkerů může být měněna tak, že mohou vázat více polymerů a/nebo se mění prostorová orientace polymeru vzhlei o dem k molekule interferonu-beta-1 a.
Při realizaci předkládaného vynálezu jsou výhodně vloženy do požadovaných polymemích systémů polyalkylenglykolové zbytky alkylpolyalkylenglykolů obsahujících alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, výhodně polyethylenglykol (PEG) nebo poly(oxy)alkylenglykolový zbytek takových glykolů. Takže polymery, ke kterým je protein připojen, jsou homopolymery polyethylenglykolu (PEG) neboje to polyoxyethylovaný polyol, vždy za předpokladu, že polymer je při teplotě místnosti rozpustný ve vodě. K příkladům takových polymerů, přičemž tento výčet není nikterak omezující, patří homopolymery polyalkylenoxidu jako jsou PEG nebo propylenglykoly, polyoxyethylenglykolenované glykoly, jejich kopolymery a blokové polymery, a to za předpokladu, že u blokových kopolymerů je zachována rozpustnost ve vodě. K příkladům polyoxyethylenovaných polyolů patří polyoxyethylenovaný glycerol, polyoxyethylenovaný sorbitol, polyoxyethylenovaná glukóza apod. Glycerolová kostra polyoxyethylenovaného glycerolu je shodná s kostrou vyskytující se v přírodě, např. v mono-, di- a triglyceridech živočichů a člověka. Tudíž takto rozvětvená kostra nebude v těle rozpoznána jako cizorodé činidlo.
Jako alternativa k polyalkylenoxidům se mohou užít dextran, polyvinylpyrrolidony, polyakrylamidy, polyvinylalkoholy, polymery založené na sacharidech a další. Odborníkovi je zřejmé, že výše uvedené výčty jsou pouze ilustrativní a že vynález zahrnuje jakékoliv polymemí materiály popsaných vlastností.
Polymer nemusí mít nutně konkrétní molekulovou hmotnost, ale je výhodné, když molekulová hmotnost leží v rozmezí 300 až 100 000, výhodněji 10 000 až 40 000. Zejména velikosti 20 000 a více jsou výhodné k zabránění ztrát proteinů při filtraci v ledvinách.
Derivatizace polyalkylenglykolu má řadu výhodných vlastností pro formulaci konjugátů interferonu-beta-1 a s polymerem (polymer-interferon-beta-la), spojené s následujícími vlastnostmi polyalkylenglykolových derivátů: zlepšení rozpustnosti ve vodě, a přitom zabránění antigenní nebo imunogenní reakci, vysoký stupeň biologické kompatibility, absence biologické degradace polyalkylenglykolových derivátů in vivo a snadné vylučování z živých organismů.
Navíc v jiném aspektu předkládaného vynálezu může být použit interferon-beta-la kovalentně navázaný na polymerovou složku, kde povaha spojení je taková, že obsahuje štěpitelné kovalentní chemické vazby. To pak umožňuje kontrolu časového průběhu odštěpení polymeru od interferonu-beta-1 a. Kovalentní vazba mezi léčivem, tj. interferonem-beta-la, a polymerem může být štěpena chemickou nebo enzymatickou reakcí. Produkt polymer-interferon-beta-la si přitom uchovává přijatelnou úroveň aktivity. Současně části polyethylenglykolu jsou přítomny v konjugovaném polymeru, které poskytnou produktu polymer-interferon-beta-la vysokou rozpustnost ve vodě a prodloužený biologický poločas v krevním oběhu. V důsledku těchto zlepšených vlastností lze podle vynálezu uvažovat při in vivo aplikacích o parenterálním, nazálním nebo perorálním podávání obou druhů aktivních molekul polymer-interferon-beta-la, a po hydrolytickém štěpení lze očekávat dobrou biologickou dostupnost interferonu-beta-1 a samotného.
Odborníkovi je jasné, že reakční schémata zde uvedená jsou pro ilustrativní účely a nejsou nijak omezující vzhledem k reakcím a strukturám, které se mohou použít pro modifikace interferonu55 beta-la, aby bylo dosaženo dobré rozpustnosti, stability a afinity k buněčné membráně při paren-13 CZ 299164 B6 terálním a perorálním podávání. Reakce polymeru s interferonem-beta-la pro získání nejvýhodnějšího N-koncového konjugátu se může okamžitě provést užitím celé řady reakčních schémat. Aktivita a stabilita konjugátů interferonu-beta-la podle předkládaného vynálezu může do jisté míry kolísat, když se použijí polymery s různou velikostí molekuly. Rozpustnost konjugátů se může měnit v závislosti na podílu a velikosti polyethylenglykolového fragmentu vloženého do polymemího přípravku.
Využití vynálezu
Jedinečnou vlastností polymerů odvozených z polyalkylenglykolu, která je cenná pro terapeutické aplikace, je jejich obecná biologická kompatibilita. Tyto polymery mají různé rozpustnosti ve vodě a nejsou toxické. Má se za to, že nejsou ani antigenní ani imunogenní a nijak nenarušují biologickou aktivitu interferonu-beta-la, když jsou s ním konjugovány za podmínek popsaných ve vynálezu, mají také dlouhý poločas v krevním oběhu a jsou snadno vylučovány z živých orga15 nismů.
Produkty podle vynálezu jsou užitečné pro zlepšení biologického poločasu interferonu-beta-la užívaného v terapii, a lze je připravit k terapeutickému využití snadno rozpuštěním ve vodě nebo jiném vhodném médiu. Podávání se děje parenterálním nebo perorálním způsobem nebo formou aerosolu. Pro perorální nebo parenterální podávání lze připravit jemné koloidní suspenze, aby bylo dosaženo depotního účinku, zatímco pro podávání formou aerosolu jsou vhodné kapalné formy nebo suché prášky. V suchém lyofilizovaném stavu nebo v tekutém přípravku mají konjugáty interferonu-beta-la podle předkládaného vynálezu dobrou stabilitu. Teplená stabilita konjugátů interferonu-beta-la podle vynálezu je zejména výhodná při formulaci prášků, kdy je nutný dehydratační krok (viz např. přihláška PCT/US/95/06008, Methods and Compositions for Dry Powder of Interferons).
Terapeutické polymerové konjugáty interferonu-beta-la podle předkládaného vynálezu lze užít k profylaxi i k léčení jakýchkoli nemocí, pro které je účinná složka interferon-beta-1 a. Kromě toho polymerové konjugáty podle vynálezu lze využít k diagnóze složek, podmínek nebo nemocí v biologických systémech nebo vzorcích, a také pro diagnostické účely v nefyziologických systémech.
Terapeutické využití předkládaného vynálezu zahrnuje léčení živočicha, který již má nebo je latentně vnímavý k takovým nemocem nebo poruchám, které vyžadují takové léčení, přičemž toto léčení spočívá v tom, že se takovému živočichovi podává účinné množství polymerového konjugátu podle vynálezu, které je účinné k léčení takové nemoci nebo poruchy. Polymerové konjugáty podle vynálezu jsou vhodné výhodně k léčení savců a nejvýhodněji k léčení člověka. V závislosti na konkrétní nemoci, kterou je třeba léčit, se pacientovi podávají konjugáty podle vynálezu v jakékoliv vhodné, terapeuticky účinné a bezpečné dávce, což odborník snadno stanoví bez nepřiměřeného experimentování. Vzhledem k mezidruhovým bariérám pro interferony typu I bude zřejmě nutné připravit konjugát polymer - interferon podle vynálezu vždy z příslušného biologického druhu.
Antiproliferativní buněčná aktivita interferonu-beta-la je dobře známa. Konkrétně některé polymerové konjugáty interferonu-beta-la popsané v předkládané přihlášce jsou užitečné k léčení nádorových a rakovinných onemocnění, jako je např. osteogenní sarkom, lymfom, aktivní lymfocytárni leukémie, karcinom prsu, melanom a nasofaryngeální karcinom, a také autoimunitních onemocnění jako je např. fibróza, lupus a roztroušená skleróza mozkomíšní. Také se dá oče50 kávat, že antivirová aktivita, kterou projevují proteinové konjugáty podle vynálezu, se využije k léčení virových onemocnění, jako je např. infekce ECM, chřipka a další infekce respiračního traktu, hepatitida a vzteklina. Také se dá očekávat, že imunomodulační aktivita, kterou projevují proteinové konjugáty podle vynálezu, se využije k léčení auto imunitních a zánětlivých onemocnění jako je např. fibróza a roztroušená skleróza mozkomíšní. Schopnost interferonu-beta-la inhibovat vytváření nových krevních cév (tj. inhibovat angiogenezi a neovaskularizaci) před- 14CZ 299164 B6 určuje konjugáty podle vynálezu k použití při léčení angiogenních nemocí jako je např. diabetická degenerace, odvržení štěpu rohovky, neovaskulámí glaukom, retrolentální fibroplázie, rubeóza a Osler-Weberův syndrom.
Kromě toho antiendoteliální aktivita interferonu je již nějakou dobu známa a jeden z možných mechanismů působení interferonu může být narušení aktivity endotelových buněk tím, že inhibuje produkci nebo aktivitu angiogenních faktorů produkovaných nádorovými buňkami. Některé cévní nádory, jako např. hemangiomy, jsou zvláště citlivé k léčení interferonem. Léčení interferonem alfa je zatím jediným doloženým způsobem léčení této nemoci. Lze očekávat, že léčení konjugáty interferonu-beta-la podle vynálezu poskytne značný farmaceutický prospěch ve smyslu zlepšené farmakokinetiky a farmakodynamiky, neboť konjugáty zůstávají v cévách po delší dobu než nekonjugované interferony, což umožňuje mnohem účinnější terapii při použití konjugátů jako antiangiogenního léčiva (viz příklad 8).
Konjugáty polymer-interferon-beta-la podle vynálezu mohou být podávány jako takové a nebo ve formě farmaceuticky přijatelných esterů, solí nebo jiných fyziologicky aktivních derivátů. Ve farmaceutických přípravcích je interferon-beta-la výhodně užíván společně s jedním nebo více farmaceuticky přijatelnými nosiči, a volitelně jakýmikoliv dalšími terapeutickými složkami. Nosič musí být farmaceuticky přijatelný v tom smyslu, že musí být kompatibilní s ostatními slož20 kami v přípravku a nesmí být nadměrně škodlivý pro příjemce. Přípravek interferonu-beta-la se podává v množství účinném pro dosažení požadovaného farmakologického účinku, jak již bylo popsáno výše, a v takových dílčích množstvích, aby bylo dosaženo požadované denní dávky.
K vhodným lékovým formám patří formy pro parenterální i jiné podávání, k vhodným specific25 kým způsobům podávání patří např. podávání perorální, rektální, bukální, topické, nazální, oftalmické, subkutánní, intramuskulámí, intravenózní, transdermální, intrahekální, intraartikulámí, intraarteriální, subarachnoidální, bronchiální, lymfatické, vaginální a intrauterinní. Výhodné jsou lékové formy pro perorální, nazální a parenterální podávání.
Pokud je interferon-beta-1 a užit v přípravku, který obsahuje tekutý roztok, přípravek se výhodně podává perorálně nebo parenterálně. Pokud je interferon-beta-la užit v přípravku, který je ve formě tekuté suspenze nebo suchého prášku formulován společně s biologicky kompatibilním nosičem, pak se může výhodně podávat perorálně, rektálně nebo bronchiálně.
Pokud je interferon-beta-la užit v přípravku přímo jako tuhá látka ve formě prášku, výhodně se může podávat perorálně. Alternativně se může podávat nazálně nebo bronchiálně, pomocí nebulizace prášku v nosičovém plynu, kdy se vytváří disperze prášku v plynu, kterou pacient vdechuje a sice užitím vhodného nebulizačního zařízení.
Přípravky obsahující polymerové konjugáty podle předkládaného vynálezu se výhodně formulují do jednotkových lékových forem, a sice jakýmikoliv metodami, které jsou odborníkům ve farmacii známy. Tyto metody obecně obsahují krok, kdy se účinná složka smísí s nosičem a případně dalšími pomocnými složkami. Typicky se přípravky připravují uniformním a dokonalým smísením účinné složky (či více účinných složek) s kapalným nosičem, jemně rozmělněným tuhým nosičem nebo oběma, a pak se produkt podle potřeby formuluje do požadovaných lékových forem.
Lékové formy vhodné pro perorální podávání jsou v podobě diskrétních jednotek jako jsou např. tobolky, oplatky, tablety nebo pastilky, kdy každá taková forma obsahuje předem stanovené množství účinné složky v podobě prášku nebo granulátu, nebo v tekuté formě, vodné nebo bezvodé, jako je např. sirup, elixír, emulze nebo pěna.
Tablety se připravují lisováním nebo odléváním, případně s jednou nebo více pomocnými složkami. Lisované tablety se připravují lisováním na vhodných zařízeních, kde se užívá účinná složka ve volně sypké formě jako je prášek nebo granulát, která se případně mísí s pojidly, roz- 15 CZ 299164 B6 volňujícími činidly, lubrikanty a inertními ředidly, povrchově aktivními činidly a uvolňovacími činidly. Odlévané tablety obsahují směs práškového polymerového konjugátu s vhodným nosičem a připravují se odléváním pomocí vhodného zařízení.
Sirup se připraví přidáním účinné látky do koncentrovaného vodného roztoku cukru, např. sacharózy, ke kterému se přidají ještě další pomocné přísady. K takovým přísadám patří příchutě, konzervační činidla, činidla zpomalující krystalizací cukru a činidla zvyšující rozpustnost ostatních složek jako jsou např. polyhydroxyalkoholy, jako je glycerol nebo sorbitol.
Lékové formy vhodné pro parenterální podávání výhodně obsahují sterilní vodné přípravky aktivního konjugátu, které jsou výhodně izotonické s krví příjemce (např. fyziologický solný roztok). Takové přípravky obsahují také suspendující činidla a zahušťovadla nebo jiné mikročásticové systémy, které jsou určeny k zacílení sloučeniny na krevní složky nebo do jednoho či více orgánů. Přípravky jsou buďto v jednodávkové, nebo vícedávkové lékové formě.
Přípravky ve formě nosního spreje obsahují purifikované vodné roztoky aktivního konjugátu s konzervačními a izotonickými činidly. Takové přípravky mají obvykle pH a tonicitu upravené tak, aby byly kompatibilní s nosní sliznicí.
Lékové formy pro rektální podávání jsou obvykle čípky, kde vhodným nosičem je kakaové máslo, hydrogenované tuky nebo hydrogenované mastné karboxylové kyseliny.
Oftalmické přípravky jako např. oční kapky jsou připraveny podobně jako nosní spreje, stím rozdílem, že pH a tonicita jsou nastaveny kompatibilně pro oko.
Topické přípravky obsahují konjugáty podle vynálezu rozpuštěné nebo suspendované vjednom nebo více médiích, jako je např. minerální olej, petroleum, polyhydroxyalkoholy nebo jiná farmaceutická báze pro topické přípravky.
Kromě výše uvedených složek mohou přípravky podle vynálezu ještě dále obsahovat jednu nebo více doplňkových složek jako jsou např. ředidla, pufry, příchutě, rozvolňující činidla, povrchově aktivní látky, zahušťovadla, lubrikanty, konzervační látky včetně antioxidantů a další.
Tudíž předkládaný vynález poskytuje polymery vhodné pro in vitro stabilizaci interferonu-beta35 la v roztoku, což je příklad výhodné, jiné než terapeutické aplikace vynálezu. Polymery se mohou využít také ke zvýšení teplené stability a odolnosti proti enzymatické degradaci interferonu-beta-la. Zvýšení tepelné stability interferonu-beta-la prostřednictvím konjugace podle předkládaného vynálezu poskytuje způsob, jak zvýšit dobu skladovatelnosti, stabilitu při teplotě místnosti a trvanlivost reagencií a souprav užívaných pro výzkum.
Následující příklady slouží k ilustraci vynálezu a nijak jeho předmět neomezují. Je zřejmé, že zejména experimenty se zvířaty zde popsané mohou být provedeny různými způsoby, takže jsou možné různé modifikace a variace základních metod zde popsaných. Tak např. v příkladu 5 může odborník užít jiný neopterinový test nebo může změnit druh či počet primátů v pokusu. Všechny takové modifikace a variace spadají do rozsahu předkládaného vynálezu.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Studie struktury/aktivity lidského interferonu-beta-la s použitím substitučních mutací alanin/serin: analýza vazebných míst receptoru a funkčních domén
- 16CZ 299164 B6
A. Přehled
Byla prováděna obsáhlá mutační analýza lidského interferonu-beta-1 a (IFN-beta-la) s cílem mapovat zbytky nutné pro aktivitu a vazbu receptoru. Dostupnost trojrozměrné (3-D) krystalové struktury lidského IFN-beta (Karpusas, M. et al., 1977, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 94, 1181311818) umožnila původcům identifikovat substituce alaninu (nebo šeřinu) zbytků vystavených rozpouštědlu dostupných pro receptorové interakce a ponechat aminokyseliny zapojené do substitucí, které nahradily 2 až 8 zbytků v průběhu rozdílných oblastí každého helixu (A, B, C, D) a smyček (AB, CD2, DE). Pro účely afinitní purifikace byla začleněna amino-koncová histidinová ío značka obsahující 6 histidinových zbytků, jakož i štěpné místo enterokinázy pro odstranění amino-koncové extenze. Výsledné interferony jsou nazývány jako „interferon(IFN)-beta se značkou his“ nebo „His-interferon-beta“ nebo „Hisf-interferon-beta“ apod.
Byly konstruovány různé mutace expresních plazmidů IFN-beta se značkou his s použitím geno15 vého konstruktu s divokým typem IFN-beta jako templátu pro mutagenezí. Strategie mutageneze vyžadovala nejdříve vnesení štěpného místa jedinečného restrikčního enzymu prostřednictvím genu IFN-beta se značkou his, a pak nahrazení přesných sekvencí DNA mezi vybranými restrikčními místy syntetickými oligonukleotidovými duplexy, které kódovaly alaninové (nebo serinové) substituční matrice. Nakonec byly mutované geny IFN subklonovány do plazmidu, který řídil expresi savčích buněk v buněčné linii 293 z lidských ledvin.
Funkční následky těchto mutací byly hodnoceny antivirovými a antiproliferačními testy. Byl vyvinut neradioaktivní vazebný test pro IFN, který analyzoval vazbu těchto mutant k povrchovému receptoru (IFNAR1/2 komplex) buněk Daudi lidského Burkittova lymfomu. Navíc byl vyvinut test pro mapování povrchů při interakcích mezi mutanty his-IFN-beta a IFNAR2, který používal fúzní protein IFNAR2/Ig, složený z extracelulární domény proteinu IFNAR2 receptoru pro IFN fúzované ke kloubové doméně, doménám CH2 a CH3 lidského IgGl.
1. Vytvoření genu interferonu-beta jako templátu pro mutagenezí
Při strategii původců pro tvoření mutant IFN-beta substituované alaninem (nebo serinem) nejdříve vznikl modifikovaný gen IFN-beta, který kódoval protein divokého typu, ale který nesl štěpná místa jedinečných restrikčních enzymů v genu. Jedinečná místa byla použita pro záměnu sekvencí divokého typu syntetickými oligonukleotidovými duplexy, které kódovaly mutované kodony. Aby se získala expresní kazeta lidského IFN-beta-la vhodná pro tvorbu mutovaných genů, byla cDNA IFN-beta (GenBank přístupové č. E00029) amplifikována pomocí PCR. Bylo nezbytné počáteční klonování genu IFN-beta do plazmidu pMJB107, derivátu pACYC184, (viz Rose, et al., 1988, Nucleic Acids Res., 16(1), 355), aby se mohla provádět místně cílená mutageneze genu v plazmidu, kterému chyběla specifická restrikční místa vytvářená během muta40 geneze.
Příměry pro PCR použité pro subklonování kódujících sekvencí genu lidského IFN-beta také umožnily původcům zavést štěpné místo enterokinázy v protisměru a v rámci s genem IFN-beta:
PCR primer:
-TTCTCCGGAGACGATGATGACAAGATGAGCTACAACTTGCTTGGATTCCTACAAAGAAGC-3 (sekvence id. č. 3: „BET-021), a 3 PCR primer:
-GCCGCTCGAGTTATCAGTTTCGGAGGTAACCTGTAAGTC-3 (sekvence id.
Č. 4: „BET-022»)
- 17CZ 299164 B6 a hraniční oblastí míst restrikčních enzymů (BspEI a Xhol) užitečné pro klonování do míst plazmidu pMJB107. Výsledná DNA byla nazvána PCR fragment A.
Výkonná signální frekvence z lidské adhezivní molekuly cévní buňky-1 (V CAM-1) a značka šesti histidinů byly zaneseny do konečného konstruktu z druhého fragmentu DNA vytvořeného z from pDSW247 (fragment B). Plazmid pDSW247 je derivát pCEP4 (Invitrogen, Carlsbad, CA), ze kterého byl odstraněn gen EBNA-1 a který nese signální sekvenci VCAM-1 (VCAMss) fúzovanou v protisměru a v rámci se značkou šesti histidinů. Primery PCR, které byly použity pro vytvoření kazetové skupiny VCAMss-l/histidinová značka byly KID-369 (5 PCR primer):
-AGCTTCCGGGGGCCATCATCATCATCATCATAGCT-3 (sekvence id. č.: 5) a KID-421 (3 PCR primer):
-CCGGAGCTATGATGATGATGATGATGGCCCCCGGA-3' (sekvence id. č.:6) začleňující hraniční štěpná místa restrikčních enzymů (Notl a BspEI), která umožnila excizi fragmentu B DNA.
Pro vytvoření plazmidového vektoru, který nesl signální sekvenci VCAM-1, značku his a gen interferon-beta, prováděli původci trojcestnou ligaci s použitím DNA fragmentů purifikovaných přes gel z plazmidového vektoru pMJB107 (štěpeného Notl a Xhol), PCR fragmentu A (štěpeného BspEI a Xhol), PCR fragmentu A (štěpeného BspEI a Xhol) a fragmentu B (štěpeného Notl a BspEI). Ligovaný plazmid byl použit pro transformaci buněk E. coli buď JA221, nebo XLl-Blue a byly vybírány kolonie rezistentní na ampicilin a testovány na výskyt inzertů analýzou restrikčních map. Byla izolována DNA pomocí Maxiprepu a sekvence inzertu byla ověřena sekvencováním DNA. Výsledný konstrukt byl nazván pCMG260.
2. Vznik mutant lidského interferonu-beta v pCMG260 substitucí alaninu
Plazmid pCMG260 byl použit jako templát pro několikrát opakovanou mutagenezi (U.S.E. Sítě Directed Mutagenesis Kit (Boehringer-Mannheim), která zavedla jedinečná restrikční štěpná místa do pozic v průběhu kódující sekvence proteinu IFN-beta, ale nezměnila výslednou sekvenci proteinu. Mutované plazmidy byly použity pro transformaci buď JA221, nebo XLl-Blue kmene E. coli a rekombinantní kolonie byly vybírány podle rezistence na chloramfenikol. Kolonie rezistentní na chloramfenikol byly dále testovány na výskyt požadovaného místo jedinečného restrikčního enzymu pomocí analýzy restrikčních map DNA. Výsledný plazmid IFNbeta, pCMG275.8, obsahoval úplnou sadu jedinečných štěpných míst restrikčních enzymů a DNA sekvence genu byla ověřena. Kompletní sekvence DNA (sekvence id. č. 1) modifikovaného genu interferon-beta se značkou his, společně s kódující sekvencí proteinu (sekvence id. č. 2), jsou uvedeny na obrázku 10.
Kompletní soubor alaninových substitučních mutací je uveden v tabulce 1 (níže). Názvy mutant specifikují strukturální oblasti (helixy a smyčky), do kterých byly vneseny mutace. Panel veške40 rých mutací alaninových (serinových) substitucí má za následek mutace 65 a 165 aminokyselin lidského IFN-beta.
Panel mutant byl vytvořen z pCMG275.8 nahrazením segmentů DNA mezi jedinečnými restrikčními místy syntetickými oligonukleotidovými duplexy, které nesly genetickou kódující informaci uvedenou v tabulce 2 (viz níže). Aby se vytvořily plazmidy s různými alaninovými substitučními mutantami, byly spolu ligovány vektor pCMG275.8 purifikovaný přes gel (štěpený příslušným restrikčním enzymem, jak uvedeno na seznamu dále v textu, pro každou strukturální oblast IFNbeta) a oligonukleotidové duplexy (kódující sekvence vláken jsou uvedeny v tabulce 2). Ligační směsi byly použity pro transformaci JA221 kmene E. coli a rekombinantní kolonie byly vybírány podle rezistence na ampicilin. Kolonie rezistentní na ampicilin byly testovány na výskyt inzertů s mutacemi prostřednictvím screeningu na příslušná místa restrikčních enzymů. Pro dvě mutanty
-18CZ 299164 B6 (A2 a CD2) strategie klonování vyžadovala použití dvou duplexů syntetických oligonukleotidů (uvedených v tabulce 2), které nesly komplementární přesahující konce, aby bylo možné ligovat je k sobě navzájem, a ke kostře vektoru IFN-beta v trojcestné ligaci. Následující seznam ukazuje místa, která byla použita ke klonování mutovaných oligonukleotidů z tabulky 2. Schéma klono5 vání (pododdíl B) ukazuje pozice těchto jedinečných míst v genu interferon-beta.
Tabulka 1
Pozice alaninových substitučních mutací ^IFN-P »
IFN-β
Al
A2 ftBl
AJ32
AB3 <0 50 . . . ......I ......I ...
MSYNLLGFLQRSSNF(3CQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKE -A-AA—A—A-----------------------------------------30
I
--------------AA-AA—AA--------------------------------------------------------AAA-AA------------------------------------------------------AA-A—A------------------------------------------------------AAAAA-AAA j_helix A_||_AB loop_j co »0 «0 100 » ... I.....« . . λ
IFN-β
Bl
B2
Cl
C2
CD1
IFN-β
CD2
D
DE1
DE2
E
ΟΑΑυΤΙΥΒΜΙιΟΝΧΡΑΙΡΚΟηΒδδΤΟΜΝΕΤίνΕΝΙ.ωΝνϊΗΟΙ^ιΚΤνί.ΕΕΚΙχΕΚΕ:
---------—a—AS----------------------------------------------------------AAA--------------------------------------------------------------AS—AA—S----------------------------------------------------------A---A—AA-----------------------------------------.---------------AA—AAA ,_helix B__j j_| pCD loop_
110 120 130 140 ISO 140
I.....I . t......it
DFTTLGKLMSSLHLKRYYGFÝliíYIjáKĚ^^
AA-A—A—A----------------------------------------------------------------a-aa—a---------------------------------------------------------AA---------------------------------------------------------AA----------------------------------------------------------------A—A—A—A-------CD loop_| | helix D_j | helix E_j
Řádek označený IFN-β ukazuje divoký typ sekvence lidského IFN-β. Alaninové nebo serinové substituce zbytků IFN-β jsou ukázány pro každou mutantu a čárky, pod relevantními oblastmi, označují sekvence divokého typu. Struktury helixů a smyček jsou uvedeny jako plné čáry pod mutantami. Smyčka DE překlenuje mezeru mezi helixy D a E. Byly vytvořeny dvě další alaninové substituční mutanty (H93A, H97A a H121A) a byly analyzovány v antivirových testech pro stanovení účinku mutací těchto histidinů, které tvoří cheláty se zinkem, v krystalové struktuře dimeru. Obě tyto mutanty si podržely plnou aktivitu divokého typu v antivirových testech, což svědčí pro to, že zinkem zprostředkovaná tvorba dimeru není důležitá pro aktivitu IFN-β.
- 19CZ 299164 B6
Tabulka 2
Al sekv. id. č.7
BET-O53
A2 sekv. id, č.8
BET-039 sekv. id č.9
BET-041
AB1 sekv. id č.10 BET-080
AB2 sekv. id č.ll BET-082
AB3 sekv. id č.12 BET-084 sekv. id č.13
BET -086
Bl sekv. id č.14 BET-110
B2 sekv. id č.15 BET-112
Cl sekv. id č.16 BET-114
C2 sekv. id č.17 BET-092
CD1 sekv. id č.18 BET-094
CCGGAGACGATGATGACAAGATGGCTTACGCCGCTCTTGGAGCCCTACAA
GCTTCTAGCAATTTTCAGTGTCAGAAGCTCCTGTGGC
GATCTAGCAATGCTGCCTGTGCTGCCCTCCTGGCTGCCTTGAATGGGAGG
CTTGAATACT
GCCTCAAGGACAGGATGAACTTTGACATCCCTGAGGAGATTAAGCAGCTG
CA
AATTGAATGGGAGGGCTGCAGCTTGCGCTGCAGACAGGATGAACTTTGAC
ATCCCTGAGGAGATTAAGCAGCTGCA
AATTGAATGGGAGGCTTGAATACTGCCTCAAGGACAGGGCTGCATTTGCT
ATCCCTGCAGAGATTAAGCAGCTGCA
AATTGAATGGGAGGCTTGAATACTGCCTCAAGGACAGGATGAACTTTGAC
A
TCCCTGAGGAGATTGCTGCAGCTGCAGCTTTCGCTGCAGCTGA
CGCCGCGTTGACCATCTATGAGATGCTCGCTAACATCGCTAGCATTTTCA
GACAAGATTCATCTAGCACTGGCTGGAA
CGCCGCATTGACCATCTATGAGATGCTCCAGAACATCTTTGCTATTTTCG
CT
GCAGCTTCATCTAGCACTGGCTGGAA
GGAATGCTTCAATTGTTGCTGCACTCCTGAGCAATGTCTATCATCAGATA
AA
CCATC TGAAGACAGTTCTAG
GGAATGAGACCATTGTTGAGAACCTCCTGGCTAATGTCGCTCATCAGATA
GC
ACATCTGGCTGCAGTTCTAG
CTAGCTGCAAAACTGGCTGCAGCTGATTTCACCAGGGGAAAACT
-20CZ 299164 B6
CD2 sekv. id. δ. 19 BET-096
CTAGAAGAAAAACTGGAGAAAGAAGCAGCTACCGCTGGAAAAGCAATGA
GCGCGCTGCACCTGAAAAGA
Dl sekv. id. č.20 BET-106
TATTATGGGAGGATTCTGCATTACCTGAAGGCCAAGGAGTACTCACAC
TGT sekv. id.
č.21
BET-108
CATGAGCAGTCTGCACCTGAAAAGATATTATGGGGCAATTGCTGCATAC
CTGGCAGCCAAGGAGTACTCACACTGT
DE1 sekv. id. č.22 BET-116
CATGAGCAGTCTGCACCTGAAAAGATATTATGGGAGGATTCTGCATTA
CCTGAAGGCCGCTGCATACTCACACTGTGCCTGGACGAT
DE2 sekv. id. č.23 BET-118
CATGAGCAGTCTGCACCTGAAAAGATATTATGGGAGGATTCTGCATTA
CCTGAAGGCAAAGGAGTACGCTGCATGTGCCTGGACGAT
El sekv. id. č.24 BET-104
CGTCAGAGCTGAAATCCTAGCAAACTTTGCATTCATTGCAAGACTTACAG
B. konstrukce expresních plazmidů EBNA 293
Gen divokého typu a mutovaný gen IFN-beta, fúzované se signální sekvencí VCAM-1, značkou his a štěpným místem enterokinázy, byly purifikovány přes gel jako restrikční fragmenty Notl a BamHI o velikosti 761 párů bází. Purifikované geny byly subklonovány do plazmidového vektoru pDSW247 štěpeného Notl a BamHI, jak je ukázáno ve schématu. Plazmid pDSW247 je ío expresní vektor pro přechodnou expresi proteinu v buňkách EBNA 293 z lidských ledvin (Invitrogen, Carlsbad, CA). Obsahuje cytomegalovirový promotor časného genu a EBV regulační prvky, které jsou nezbytné pro vysokou hladinu genové exprese v tomto systému, jakož i markéry selekce pro E. coli (rezistence na ampicilin) a pro buňky EBNA 293 (rezistence na hygromycin), jak lze vidět na schématu strategie klonování (níže). Ligované plazmidy byly použity pro trans15 formaci buď JA221, nebo XLl-Blue kmenů E. coli a kolonie rezistentní na ampicilin byly vybírány a testovány na výskyt inzertů analýzou restrikčních map. Byla izolována DNA pomocí Maxipresu a sekvence inzertů byly ověřeny sekvencováním DNA. Pozitivní klony projevující požadované mutované sekvence byly použity pro transfekci buněk EBNA 293 lidských ledvin tak, jak je popsáno níže.
Souhrn klonovací strategie je uveden v následujícím schématu.
Schématické znázornění klonovací strategie a IFN-P expresních plazmidů
-21 CZ 299164 B6
Vazba na Daudi buňky Antivirový test
Vazba na IFNAR2-Fc Antiproiiferativní test
C. Exprese a kvantifikace IFN-beta-1 a alaninových substitučních mutant
Lidské buňky EBNA 293 (Invirogen, Carlsbad, CA, Chittenden, T. 1989, J. Virol. 63, 30163025) byly udržovány jako subkonfluentní kultury v Eagleho médiu modifikovaném dle Dulbecca doplněném 10% fetálním sérem, lmM glutaminem a 250 g/ml geneticinu (Life Technologies, Gaithersburg, MD). Expresní plazmidy pDSW247 byly přechodně transfekovány do buněk EBNA 293 s použitím protokolu s lipofektaminem (Gibco/BRL, Life Technologies). Konío diciovaná média byla sklízena 3 až 4 dny po transfekci, buněčná debris byla odstraněna centrifugací a koncentrace his-IFN-beta byla kvantifikována testem ELISA.
ELISA byla prováděna s použitím polyklonálních králičích protilátek (metodou proteinu A puntíkované IgG, protilátky byly pěstovány proti purifikovanému lidskému IFN-beta-la) pro navá15 zání na 96-jamkové destičky pro testy ELISA a biotinylová forma téhož polyklonálního králičího IgG byla použita jako sekundární reagencie pro umožnění detekce interferonu s použitím křenové peroxidázy konjugované se streptavidinem (HRP: Jackson ImmunoResearch, W. Grove, PA). Pro vytvoření standardních křivek koncentrace byla použita řada ředění interferon-beta-la. Kondiciovaná média z EBNA transfektant obsahující his-interferon-beta byla naředěna tak, aby se zís20 kaly vzorky s koncentracemi v rozmezí od 10 ng/ml do 0,3 ng/ml v testu ELISA. Aby byly koncentrace IFN-beta v médiu zjištěné testem ELISA potvrzeny, byla provedena analýza westernovým přenosem. Redukované supematanty z tkáňových kultur a standardy IFN-beta-la byly podrobeny SDA-PAGE na gelech s gradientem 10 až 20% (Novex, San Diego, CA) a přeneseny na membrány PDVF. Imunoreaktivní pásy byly detekovány králičím polyklonálním antisérem ani-IFN-beta-la (č. 447, Biogen. Inc., druhé antisérum, které bylo pěstováno proti IFN-beta-22CZ 299164 B6 la), a pak následovalo ošetření oslím protikráličím IgG konjugovaném s HRP (Jackson ImmunoResearch).
D. Hodnocení mutant interferonu-beta na vazbu receptoru
Vlastnost vázat receptor mutant interferonu-beta popsaných v části C byla hodnocena s použitím dvou odlišných vazebných testů. Jeden test měřil vazbu mutant interferonu-beta k fúznímu proteinu, IFNAR2/Ig, zahrnujícímu extracelulární doménu lidského receptoru IFNAR2 fúzovanou k části konstantní oblasti lidského IgG. IFNAR2-Fc byl exprimován v buňkách ovarií čínského křečka (CHO) a purifikován prostřednictvím afinitní chromatografie s protein A Sepharose podle instrukcí výrobce (Pierce Chem. Co., Rockford, IL, kat. č. 20334). Vazba mutant interferonubeta k IFNAR2-Fc byla měřena v testu ELISA. Destičky pro test ELISA byly připraveny přes noc ve 4 °C navázáním 50 μΐ/jamku myší proti-lidské IgGl monoklonální protilátky (CDG5AA9, Eiogen, lne.) v koncentraci lOg/ml ve vazebném pufru 50mM NaHCO3, 0,2mM MgCl2, pH 9,6 na 96-jamkové destičky s plochým dnem. Destičky byly dvakrát promyty s PBS obsahujícím 0,05% Tween-20, a blokovány s 0,5% netučným sušeným mlékem v PBS 1 hodinu při teplotě místnosti. Po dvou dalších promytích bylo do každé jamky přidáno 50 μΐ 1 g/ml IFNAR2-Fc v 0,5% mléce v PBS obsahujícím 0,05% Tween-20 a inkubováno 1 hodinu při teplotě místnosti a destičky pak byly ještě dvakrát promyty. Vazba mutant interferonu-beta k IFNAR2-Fc byla měřena přidáním 50 μΐ/jamku mutanty interferonu-beta v kondiciovaném médiu, sériově ředěné Eagleho médiem modifikovaným dle Dulbecca (DMEM) doplněném 10% fetálním bovinním sérem, a inkubací 2 hodiny ve 4 °C. Ředění mutanty interferonu-beta se typicky pohybovalo od přibližně 1M dolů k lOpM. Po promytí byl interferon-beta navázaný na destičky detekován přidáním 50 μΐ/jamku koktejlu skládajícího se z 1:1000 ředěné králičí polyklonální anti-interfero25 nové protilátky (č. 447) plus oslího proti-králičího IgG značeného křenovou peroxidázou (HRP) (Jackson ImmunoResearch), a probíhala inkubace 15 minut ve 4 °C. Po dvou promytích byl přidán HRP substrát a destička byla inkubována ve 4 °C před odečtem na čtecím zařízení pro destičky ELISA při absorbanci 450 nm. Data byla vynesena jako absorbance proti koncentraci mutant interferonu-beta a afinita vazby mutanty interferonu-beta k IFNAR2-Fc byla určována vynesením dat do jednoduché hyperbolické vazebné rovnice. Výsledky z těchto analýz jsou ukázány na obrázku 1, na kterém je vazebná afinita každé mutanty, zjišťovaná alespoň ve třech nezávislých pokusech, vyjádřena jako procento afinity měřené pro His6-divoký typ interferonubeta-la.
Druhý test vazby receptoru byl použit pro měření afinity, se kterou se mutanty interferonu-beta vážou na buňky Daudi exprimující oba receptorové řetězce, IFNAR1 a IFNAR2, které dohromady obsahují receptor pro interferon-beta. Tento test založený na FACS používal blokující monoklonální protilátku namířenou proti extracelulární doméně IFNAR1, EA12 (Eiogen, lne.) pro odlišení neobsazeného (volného) receptoru od receptoru, na který byl navázán interferon-beta.
Buňky Daudi (20 μΐ při 2,5 x 107 buněk/ml) byly naneseny na 96-jamkové destičky pro test ELISA se dnem ve tvaru V a inkubovány 1 hodinu ve 4 °C s různými koncentracemi mutanty interferonu-beta (20 μΐ v pufru FACS, 5% FBS, 0,1% NaN3 v PBS). Žádoucí sériové ředění mutant interferonu-beta se pohybovalo v rozmezí od 0,5M do 0,5pM. Ke každé jamce bylo přidáno 100 ng na biotinylované myší anti-IFNARl monoklonální protilátky EA12 (10 μΐ) a destič45 ky byly inkubovány další dvě minuty při teplotě místnosti před dvojím promytím pufrem FACS (4 °C). Pak byly buňky inkubovány 30 minut ve 4 °C s 50 μΐ/jamku 1:200 naředěného streptavidinu konjugovaného s R-fykoerythrinem (Jackson ImmunoResearch), dvakrát promyty pufrem FACS, resuspendovány ve 300 μΐ pufru FACS obsahujícím 0,5% paraformaldehyd a přeneseny do polystyrénových zkumavek 12x75 (Falcon 2052). Pak byly vzorky analyzovány průtokovou cytometrií na přístroji FACScan (Becton Dickinson). Data byla vynesena do grafu jako průměrná intenzita fluorescence kanálu (MFCI) proti koncentraci mutanty interferonu-beta poskytující 50% inhibici barvení protilátky. Každá mutanta byla testována několikanásobně. Obrázek 2 ukazuje vazebnou afinitu k receptoru pro každou mutantu interferonu-beta, zjištěnou touto meto-23CZ 299164 B6 dou, vyjádřenou jako procento afinity měřené pro His6-divoký typ interferonu-beta-la v každém pokusu.
E. Vyhodnocení funkce mutant interferonu-beta
Mutanty interferonu-beta byly také testovány na funkční aktivitu s použitím in vitro testů pro antivirovou aktivitu a na schopnost interferonu-beta inhibovat buněčnou proliferací. Pro každou mutantu byly prováděny minimálně tři antivirové testy, každý v trojím opakování. His6-divoký typ interferonu-beta-la byl do každého pokusu zahrnut jako reference. Antivirové testy byly prováděny ošetřením buněk A549 z lidského plicního karcinomu (ATCC CCL 185) přes noc dvojkovým sériovým ředěním mutant interferonu-beta v koncentracích, které překlenovaly rozsah mezi plnou antivirovou ochranou a žádanou ochranou před usmrcením buněk virem. Následující den byly buňky stimulovány po dobu dvou dnů virem encefalomyokarditidy (ECMV) v ředění, které mělo za následek úplnou smrt buněk při chybění interferonu. Destičky pak byly vyvíjeny s metabolickým barvivém MTT (2,3-bis|2-methoxy-4-nitro-5-sulfo-phenyl|-2Htetrazolium-5-karboxyanilid) (M-5655, Sigma, St. Louis, MO). Zásobní roztok MTT byl připraven v koncentraci 5 mg/ml v PBS a sterilizován filtrací a 50 μΐ tohoto roztoku bylo naředěno do tkáňových kultur (100 μΐ na jamku). Po inkubaci při teplotě místnosti po dobu 30 až 60 minut byl roztok MTT/médium odstraněn, buňky byly promyty se 100 μΐ PBS a nakonec byla metabolizo20 váná barva solubilizována ve 100 μΐ 1,2N kyseliny chlorovodíkové v 90% izopropanolu. Životaschopné buňky (jak prokázáno přítomností barviva) byly kvantifikovány při absorbanci ve 450 nm. Data byla analyzována vynesením do grafu absorbance proti koncentraci mutanty interferonu-beta a aktivita každé mutanty byla definována jako koncentrace, ve které bylo usmrceno 50 % buněk. Obrázek 3 ukazuje aktivitu každé mutanty vyjádřenou jako procento aktivity měřené pro divoký typ interferonu-beta-la se značkou his v každém pokusu.
U mutant interferonu-beta byla také hodnocena funkce v antiproliferačním testu. Buňky Daudi lidského Burkittova lymfomu (ATCC č. CCL 213) byly vysety v koncentraci 2 x 105 buněk/ml in RPMI 1620 doplněném 10% definovaným fetálním telecím sérem (Hyclone, Logan Utah), a 2mM L-glutaminem. Každá jamka také obsahovala danou koncentraci mutanty interferonubeta v konečném celkovém objemu 100 μΐ média na jamku, použité koncentrace interferonu-beta byly vybrány tak, aby překlenuly rozsah od maximální inhibice proliferace Daudi buněk k žádné inhibici (tj. plná proliferace). Každá koncentrace testované mutanty interferonu-beta byla použita v duplikátech a ve všech pokusech byla zařazena série neošetřených buněk v duplikátech. Buňky byly inkubovány dva dny ve 37 °C, v inkubátorech s 5% CO2, a potom byl do každé jamky přidán 1 Ci thymidinu s tritiem ((methyI-3H)thymidin, Amersham TRK758) v 50 μΐ média a inkubován další 4 hodiny. Buňky byly sklízeny s použitím přístroje LKB pro sklízení buněk z destiček a byla měřena inkorporace thymidinu s tritiem při použití čtecího zařízení pro destičky LKB beta. Duplikáty experimentálních hodnot byly zprůměměny a určeny standardní odchylky.
Data byla vynesena do grafu jako průměrné počty za minutu proti koncentraci mutanty interferonu-beta a aktivita každé mutanty byla definována jako koncentrace požadovaná poskytnout 50 % maximální pozorované inhibice růstu. Pro každou mutantu byly prováděny několikanásobné testy. Obrázek 4 ukazuje výsledky vyjádřené jako procento aktivity nalezené pro divoký typ interferonu-beta-la se značkou his v každém pokusu.
F. Vlastnosti mutant interferonu-beta
Bylo zjištěno, že divoký typ interferonu-beta-la s histidinovou značkou měl v antivirových a antiproliferačních testech aktivitu, která byla přibližně 3 krát nižší než odpovídající aktivita nale50 zená u neznačeného divokého typu interferonu-beta-la. Protože ze všech mutant interferonubeta obsahovaly Al-E na svých N-koncích totožnou sekvenci značky his, byly účinky mutací na vlastnosti molekuly určovány srovnáním aktivit těchto mutant v antivirových, antiproliferačních a vazebných testech s aktivitou pozorovanou pro divoký typ interferonu-beta-la se značkou his. Při provádění tohoto srovnání původci předpokládali, že odchylky aktivit mutant Al-E, ve srov-24CZ 299164 B6 nání s divokým typem interferonu-beta-la se značkou his, jsou kvalitativně a kvantitativně přibližně stejné, jako účinek, který by téže mutanty měly v nepřítomnosti N-koncové značky his. Odpovídající předpoklad pro značené nebo fúzní konstrukty jiných rozpustných cytokinů je obecně pokládán za platný odborníky pracující s technikou alaninové skenovací mutageneze („alanine scanning mutagenesis“), zejména když in vitro funkční aktivita značeného nebo fúzního konstruktu je blízká aktivitě divokého typu cytokinů, jak je tomu v tomto případě (viz například Pearce, K.H. Jr, et al., J. Biol. Chem., 272, 20595-20602, 1997, a Jones, J.T., et al., J. Biol. Chem. 273, 11667-11674, 1998).
ío Data ukázaná na obrázcích 1 až 4 naznačují tři typy účinku, který byl vyvolán cílenou mutagenezí. Tento účinek může být výhodný pro vývoj interferonových léčiv za jistých okolností. Tyto tři typy účinku jsou: a) mutanty s vyšší antivirovou aktivitou než je aktivita divokého typu interferonu-beta-la (např. mutanta Cl), b) mutanty, které projevují aktivitu v obou testech, antivirovém a antiproliferačním, ale u kterých je antiproliferační aktivita disproporčně nízká vzhledem k anti15 virové aktivitě ve srovnání s divokým typem interferonu-beta-la (např. mutanty VI, D a DE1), a c) funkční antagonisté (např. Al, B2, CD2 a DE1), které vykazují antivirovou a antiproliferační aktivitu, která je disproporčně nízká vzhledem k vazbě receptoru ve srovnání s divokým typem interferonu-beta-la. Je možné pozorovat, že některé mutanty spadají do více než jedné skupiny. Tyto skupiny jsou uvedeny v přehledu níže. I když původci charakterizovali tyto skupiny mutant vzhledem k těmto příkladům uvedeným v seznamu, je nutné si uvědomit, že další mutace v těchto oblastech mohou mít za následek podobný nebo dokonce zvýšený vliv na aktivitu:
a) Mutanta Cl má antivirovou aktivitu, která je přibližně 6 krát větší než aktivita divokého typu interferonu-beta-la se značkou his. Předpovídá se, že tato mutanta s další stejného typu jsou užitečné pro snížení množství interferonu-beta, které musí být podáváno pro dosažení daného stupně antivirového účinku. Očekává se, že snížení množství podávaného proteinu zredukuje imunogeničnost proteinu a může také snížit vedlejší účinky toxicity, která není založena na mechanismu účinku. Je předpovídáno, že mutace v této skupině jsou výhodné v situacích, kdy terapeutický prospěch podávání interferonu-beta vyplývá z jeho antivirových účinků a kdy anti30 proliferaění účinky přispívají k toxicitě nebo nežádoucím vedlejším účinkům.
b) Relativní aktivity (% divokého typu) alaninových substitučních mutant v antivirovém a antiproliferačním testu jsou srovnány na obrázku 5. U většiny mutant (které jsou uvedeny na diagonální čáře) lze pozorovat koordinovaně změněné aktivity (tj. antivirové a antiproliferační aktivity, které se liší o stejný faktor od aktivit divokého typu interferonu-beta-la se značkou his). Ale několik mutant vykazuje větší odchylky v aktivitě v jednom testu relativně ke druhému, ve srovnání s divokým typem interferonu-beta-la se značkou his, jak je dokázáno posunem od diagonální linie. Tyto tři mutanty jsou uvedeny v tabulce 3 níže. Mutanta Cl vykazuje antivirovou aktivitu, která je ~ 6 krát větší, než je aktivita divokého typu interferonu-beta-la se značkou his, ale jeho aktivita v antiproliferačním testu je podobná aktivitě divokého typu. Mutanta Cl má tudíž antivirovou aktivitu, která je zvýšena faktorem 5,2 proti jeho antiproliferační aktivitě, relativně k divokému typu interferonu-beta-la se značkou his. Podobně mutanta D projevuje 65 % aktivity divokého typu v antivirovém testu, ale pouze 20 % aktivity divokého typu v antiproliferačním testu, a tudíž má antivirovou aktivitu, která je zvýšena 3,4-krát proti jeho antiproliferační aktivitě ve srovnání s divokým typem. Mutanta DE1 projevuje 26 °/o aktivity divokého typu v antivirovém testu, ale pouze 8,5 % v antiproliferačním testu, a má tedy antivirovou aktivitu, která je zvýšena 3,0 krát proti jeho antiproliferační aktivitě ve srovnání s divokým typem interferonu-beta-la se značkou his. Když jsou podávány v koncentraci postačující pro dosažení požadovaného stupně antivirové aktivity, ukazují tyto mutanty proteinů podstatně nižší úroveň antiproliferační aktivity než protein divokého typu. Předpovídá se, že mutace v této skupině, jako ty ve skupině a), jsou výhodné v situacích, kdy terapeutický prospěch podávání interferonu-beta vyplývá z jeho antivirových účinků a kdy antiproliferační účinky přispívají k toxicitě nebo nežádoucím vedlejším účinkům.
-25CZ 299164 B6
Tabulka 3
Mutanta Antivirová (Áv) aktivita (% divokého typu) Antiproliferační (AP) aktivita (% divokého typu) AV/AP
Cl 571 109 5,2
D 65 19 3,4
DE1 26 8,5 3,0
c) Mutanty s antivirovou a antiproliferační aktivitou, která je nízká vzhledem k vazbě receptoru, ve srovnání s divokým typem interferonu-beta-la se značkou his (viz tabulka 4 níže). Mutanta Al projevuje antivirovou a antiproliferační aktivity, které jsou 2,Okřát a O,8krát větší než aktivity pozorované u divokého typu interferonu-beta-la se značkou his, ale váže se na analogický receptor na buňkách Daudi s afinitou, která je 29 krát větší než u divokého typu. Vazba této ío mutanty na receptor IFN-beta je tudíž zvýšena přibližně 15 krát ve srovnání s antivirovou a antiproliferační aktivitou proteinu. Podobně mutanty B2, CD2 a DE1 vykazují zvýšení vazby proti antiproliferační aktivitě 3,5 krát, 15 krát a 54 krát. Předpovídá se, že tyto proteiny jsou užitečné jako funkční antagonisté aktivity endogenního IFN-beta, a možná dalších endogenních interferonů typu I, protože mají schopnost vázat a obsadit receptor a navíc vyvolat pouze malou část funkční odpovědi v cílových buňkách, jaká by byla pozorována u divokého typu IFN-beta.
Tabulka 4
Mutanta Antivirová aktivita (AV) (% wt) Antiproliferační aktivita (AP) {% wt) Vazebná Aktivita k buňkám (% hmot.) Vazba/AV Vazba/AP
Al 200 180 2900 15 16
B2 7,1 9,2 33 4,6 3,5
CD2 150 46 690 4,6 15
DE1 26 8,5 460 18 54
G. Vztah muteinu k trojrozměrné struktuře interferonu
Zatímco publikované krystalové struktury neglykosylované formy myšího interferonu-beta (T.
Senda, S. Saitoh a Y. Mitsui, Refind Crystal Structure of Recombinant Murine Interferon- at 2.15 Resolution, J. Mol. Biol., 253, 187-207, 1995) a lidského interferonu alfa-2b (R. Radhakrishnan, L.J. Walter, A. Hrůza, P. Reichert, P.P. Trotta, T.L. Nagabhusan a M.R. Walter, Zinc Mediated Dimer of Human Interferon- 2b Revealed by X-ray Crystallography, Structure, 4, 1453-1463, 1996) poskytly modely pro polypeptidovou kostru lidského interferonu-beta, původci nedávno dořešili strukturu interferonu-beta-la v jeho glykosylovaném stavu (M. Karpusas, M. Nolte, C.B. Benton, W. Meier, W.N. Lipscomb, a S.E. Goelz, The Crystal Structure of Human Interferon- at 2,2 Resolution, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 94, 1183-11818, 1997).
Výsledky mutačních analýz původců mohou být shrnuty vzhledem k trojrozměrné struktuře inter35 feronu-beta-la (zde neuvedeno). Některé mutace vyvolaly snížení aktivity (2 až 5 krát snížení). Mutované oblasti odpovídaly substitucím uvedeným v tabulkách 1 a 2. Zbytky důležité pro antivirovou a antiproliferační aktivitu jsou lokalizovány v nižší polovině molekuly IFN-beta-la
-26CZ 299164 B6 (panel a a b). Mutace v horní polovině molekuly, kde jsou umístěny amino- a karboxy-konce, neměly žádný vliv na biologické aktivity nebo vazbu receptoru.
Mutace v A2 helixu, AB, AB2 smyčkách a E helixu jsou nejvýznamnější, co se týče jejich účinku 5 na funkci a měly za následek dramatické snížení jak aktivity, tak vazby buněčného povrchového receptoru. Tato oblast (A2 helix, AB a AB2 smyčky a E helix) odpovídá vazebnému místu
IFNAR2, protože žádná z těchto mutant nevázala v testech původců IFNAR/Fc.
I když tyto mutace, které byly důležité pro vazbu IFNAR2, také ovlivnily buněčnou vazbu, 10 vazebné vlastnosti buněčného povrchu jsou také ovlivněny zbytky v dalších oblastech molekuly (B1 helix, C2 helix). Na trojrozměrných modelech (zde neuvedených), které zobrazují působení alaninových substitučních mutant, je možné pozorovat, že N-koncová oblast, C-koncová oblast a glykosylovaná oblast C helixu molekuly IFN-beta-1 a neleží ve vazebném místě receptoru. Mutace v těchto oblastech nesnížily biologickou aktivitu nebo vazbu buněčného povrchového recepto15 ru.
Příklad 2
Příprava a charakterizace konjugovaného interferonu-beta-1 a
A. Příprava PEGylovaného interferonu
Neformulovaný volný meziprodukt interferonu-beta-1 a (prodávaný jako AVONEX®) v koncentraci 250 g/ml ve lOOmM fosfátu sodném, pH 7,2, 200mM NaCl, byl naředěn stejným objemem lOOmM MES, pH 5,0 a pH bylo upraveno na 5,0 s HC1. Vzorek byl nanesen na kolonu SP-Sepharose® FF (Pharmacia, Piscataway, NJ) v množství 6 mg interferonu-beta-1 a/ml pryskyřice. Kolona byla promyta 5mM fosfátem sodným, pH 6,0, 600mM NaCl. Eluční frakce byly analyzovány pomocí absorbance ve 280 nm a koncentrace interferonu ve vzorcích byla určena z absorbance s použitím extinkěního koeficientu 1,51 na 1 mg/ml roztoku.
K roztoku 1 mg/ml interferonu-beta-1 a z SP eluátu byl přidán 0,5M fosfát sodný, pH 6,0, do koncentrace 50mM, byl přidán kyanoborohydrid sodný (Aldrich, Milwaukee, WI) do koncentrace 5mM, a 20K PEGaldehyd (Shearwater Polymers, Huntsville, AL) byl přidán do koncentrace
5 mg/ml. Vzorek byl inkubován při teplotě místnosti 20 hodin. PEGylovaný interferon byl puriflkován z reakčních produktů postupně prováděnou chromatografií na vylučovací koloně Superose® 6 FPLC (Pharmacia) a 5mM fosfátem sodným, pH 5,5, 150mM NaCl jako mobilní fází a SP-Sepharose® FF. Výsledkem použití vylučovací kolony byla výchozí separace modifikovaného a nemodifikovaného interferonu-beta (chromatogram zde neuveden). Eluční pool z gelové filtrace obsahující PEG-interferon-beta byl naředěn 1:1 vodou a nanesen v množství 2 mg interferonu-beta/ml pryskyřice na kolonu SP Sepharose®. Kolona byla promyta 5mM fosfátem sodným, pH 5,5, 75mM NaCl, a pak byl PEGylovaný interferon-beta eluován z kolony 5mM fosfátem sodným, pH 5,5, 80mM NaCl. Eluční frakce byly analyzovány na obsah proteinu pomocí absorbance ve 280 nm. Koncentrace PEGylovaného interferonu je udávána v ekvivalentech inter45 feronu, protože skupina PEG nepřispívala k absorbanci ve 280 nm.
B. Biochemická charakterizace PEGylovaného interferonu
Rozsah modifikace vzorků byl analyzován pomocí SDS-PAGE (gel zde neuveden). Přidání samotného PEG mělo za následek posun zjevné hmotnosti interferon z 20 kD na 55 kD, což bylo při analýze patrné ihned. V PEGylovaném vzorku nebyl žádný průkaz nemodifikovaného interferonu-beta-1 a ani forem o vyšší hmotnosti plynoucích z přítomnosti dalších skupin PEG. Výskyt samostatného PEG byl ověřen hmotnostní spektrometrií MALDI. Specifita PEGylační reakce byla hodnocena peptidovým mapováním, Alikvoty 20 mg PEGylovaného a nemodifikovaného
-27CZ 299164 B6 interferonu-beta-la jako kontroly, ve 240 μΐ 200mM Tris HCI, pH 9,0, lmM EDTA, byly štěpeny 1,5 g lysylendoproteinázy od firmy Achromobacter (Wako Bioproducts, Richmond, VA) po dobu 3 až 4 hodiny ve 27 °C. Ke každému vzorku bylo přidáno 200 mg guanidinu HCI a štěpné produkty byly rozděleny do frakcí na koloně Vydac C4 (0,46x25 cm) s použitím 30 minutového gradientu od 0 do 70% acetonitrilu, v 0,1% TFA při rychlosti průtoku 1,4 ml/minutu. U výtoku z kolony byla monitorována absorbance ve 214 nm.
Výsledky z analýzy jsou uvedeny na obrázku 6. Všechny z predikovaných peptidů ze štěpení endoproteinázou Fys-C interferonu-beta-la byly identifikovány N-koncovým sekvencováním a ío hmotnostní spektrometrií a z nich byl pouze peptid, který obsahoval N-konec interferonu (AP8) změněn modifikací, jak bylo zjevné díky tomu, že zmizel z mapy. Data z mapování tudíž ukazují, že skupina PEG je specificky připojena k tomuto peptidu. Data dále ukazují, že PEG modifikace je cílena na N-konec proteinu, protože pouze N-koncová modifikace měla za následek specifickou ztrátu tohoto peptidu.
Další důkaz pro tento závěr byl získán izolací PEGylovaného N-koncového peptidu ze štěpení endoproteinázou Fys-C tak, že se peptid dále štěpil s kyanobromidem (CNBr) a pak byl tento vzorek postoupen sekvenční analýze MALDI-PSD („matrix-assisted laser desorption ionization post source decay“). Štěpení CNBr N-koncového peptidu naštěpilo tento peptid na dva frag20 menty, terminální methionin (Ml) obsahující skupinu PEG a SYNFFGFFQR (zbytky 2-11 v sekvenci zralého interferonu-beta). Sekvenční analýza identifikovala nemodifikovaný peptid SYNLLGFLQR, který byl předpovídaný výsledek tohoto štěpení.
Antivirová aktivita vzorků interferon-beta-la byla testována na buňkách lidského plicního karci25 nomu (buňky A549), které byly vystaveny viru encefalomyokarditidy (EMC) s použitím postupů vyžadujících MTT barvení nastíněné výše. Krátce, buňky A549 byly ošetřeny předem po dobu 24 hodin interferonem-beta-la nebo interferonem-beta-la modifikovaným PEG (4000, 2000, 1000, 500, 250, 125, 75, 62,5, 31,25, 50, 33,3, 22,2, 14,8, 9,9, 6,6, 4,39 pg/ml) před stimulací virem. Test byl prováděn s použitím dat v duplikátech pro každou koncentraci interferonu-beta-la.
Standardní odchylky jsou ukázány jako svislé úsečky na obrázku 7. Koncentrace interferonubeta-la (formulovaného nebo volného neformulovaného), která zajistila 50% usmrcení viru (50% cytopatický účinek) (50% maximum OD45o) byla přibližně 11 pg/ml a 50% cytopatický účinek pro interferon-beta-la modifikovaný PEG byl přibližně 11 pg/ml. Konjugace s PEG tedy nezměnila antivirovou aktivitu interferonu-beta-la. V tomto testu původci rutinně nalézali, že specifická aktivita interferonu-beta-la je přibližně 10 krát větší než specifická aktivita interferonu-beta-lb, a proto PEGylovaný interferon-beta-la je významně aktivnější než jakýkoliv produkt interferonu-beta-lb.
Interferon-beta-la byl také PEGylován s 5K PEG-aldehydovou skupinou, která byla zakoupena od firmy Fluka, lne. (kat. č. 75936, Ronkonkoma, NY) při sledování stejného protokolu popsaného pro modifikaci s 20K PEG aldehydem s výjimkou, že reakce obsahovala 2 mg/ml 5K PEG. Modifikace s 5K PEG byla také vysoce specifická pro N-konec a nezměnila antivirovou aktivitu interferonu-beta-la. Jako adiční sloučenina 20K, byl 5K PEG interferon-beta-la nerozeznatelný od nemodifikovaného interferonu-beta-la v antivirovém testu.
Příklad 3
PEGylace chrání interferon-beta-la od agregace vyvolané stresem
Agregace interferonu-beta má škodlivý vliv na aktivitu. Původci již dříve ukázali, že glykosylace má dramatický účinek na stabilitu interferonu-beta-la oproti neglykosylovaným formám interferonu-beta (Runkel L., et al., Pharm. Res., 15, 641-649). Aby zkoumali, zda konjugace s polymerem polyalkylenglykolu může dále stabilizovat interferon-beta, podrobili původci PEGylova55 ný interferon-beta-la tepelnému stresu podle následujícího protokolu:
-28CZ 299164 B6
Tepelná denaturace byla prováděna s použitím spektrofotometru CARY 3 pro UV-viditelné světlo, vybaveného termoelektricky zahřívaným držákem kyvet, který byl řízen počítačem. Roztoky interferonu-beta-1 a ve 20mM HEPES, pH 7,5, 20mM NaCl byly ekvilibrovány ve 25 °C v 1 ml kyvetě. Teplota držáku kyvet pak byla zvyšována z 25 na 80 °C rychlostí 2 °C/minutu a denaturace proteinu byla sledována kontinuálním monitorováním absorbance ve 280 nm. Teplota „tání“, resp. rozpadu poloviny molekul, Tm, byla získána z křivek tání určením teploty, ve které měřená absorbance byla uprostřed mezi hodnotami definovanými liniemi extrapolovanými z lineárních oblastí na každé straně závislosti změny stavu na teplotě.
Výsledky z této analýzy jsou ukázány na obrázku 8. Zatímco nePEGylovaný interferon-beta-la denaturoval a agregoval s 50% bodem přechodného stádia v 60 °C, nebyl žádný průkaz agregace PEGylovaného interferonu dokonce při 80 °C. V nezávislé analýze zvětšili původci ošetření tepelným stresem na 95 °C a dokonce při této zvýšenější teplotě neviděli žádný důkaz agregace.
Tudíž konjugace s tímto polymerem polyethylenglykolu měla důkladný a prospěšný vliv na stabilitu proteinu. Podobná stabilizace byla pozorována s modifikovaným interferonem-beta-la obsahujícím 20K a 5K PEG.
Příklad 4
Měření antivirové aktivity interferonu-beta-1 a v plazmě myší ošetřených interferonem-beta-la a PEGylovaným interferonem-beta-la
Myším (C57B1/6) byla podána i.v. ocasní žílou injekce buď 50 000 jednotek interferonu-betala, nebo 50 000 jednotek PEGylovaného interferonu-beta-1 a obsahujícího 20K PEG nebo stejný objem fosfátového pufru jako kontrola. Myším se odebírala krev retroorbitálními krevními odběry v různých časových bodech po injekci (okamžitě, 0,25, 1, 4, 24 a 48 hodin). V každém časovém bodě byla odebrána krev alespoň třem myším. Plná krev byla odebírána do zkumavek obsa30 hujících antikoagulans, buňky byly odstraněny a zbylá plazma zmražena až do doby testování. Tyto vzorky plazmy pak byly testovány v antivirových testech.
Vzorky plazmy byly naředěny 1:10 médiem bez séra a ponechaly se protéci přes 0,2 m filtr ve stříkačce. Naředěné vzorky byly testovány v antivirových testech. Vzorky byly titrovány do urče35 ných jamek na 96-jamkové destičce pro tkáňové kultury obsahující buňky A549. Na každé destičce byla testována ředění standardů interferonu-beta-1 a (10, 6,7, 4,4, 2,9, 1,3, 0,9 a 0,6 U/ml) a čtyři vzorky plazmy. Buňky A549 byly předem ošetřeny naředěnými vzorky plazmy po 24 hodin před stimulací virem EMC. Po dvoudenní inkubaci s virem byly životaschopné buňky barveny roztokem MTT (5 mg/ml ve fosfátovém pufru) po dobu 1 hodiny, promyty fosfáto40 vým pufrem a solubilizovány s 1,2N HC1 v izopropanolu. Jamky pak byly odečítány ve 450 nm. Pro každou destičku byly vytvořeny standardní křivky a použity pro určení množství aktivity interferonu-beta-1 a v každém testovaném vzorku. Aktivita ve vzorcích od různých myší byla vynesena do grafu proti časovým bodům na obrázku 9.
Pomalejší ztráta PEGylovaného interferonu-beta-1 a z krevního oběhu jako funkce času ukazuje, že biologický poločas PEGylovaného vzorku je mnohem delší než poločas neošetřené kontroly interferonu-beta-1 a. Zatímco kontrola byla z velké části odstraněna po 4 hodinách, významná frakce PEGylovaného produktu byla detekována po 48 hodinách. Na základě výchozí hladiny aktivity v séru a aktivity zbylé po 48 hodinách, původci usuzují, že poločas PEGylovaného inter50 feronu je prodloužen ve srovnání s poločasem nemodifikovaného interferonu-beta-1 a. Druhé velmi významné zjištění z této studie bylo to, že velmi málo PEGylované formy bylo ztraceno v průběhu distribuční fáze, jak prokázáno podobnými vysokými hladinami aktivity v čase 0 a po 60 minutách. Data ukazují, že na rozdíl od kontrol interferonu-beta-1 a, je distribuce PEGylovaného produktu převážně omezena na cévní zásobení.
-29CZ 299164 B6
Příklad 5
Srovnávací farmakokinetické a farmakodynamické studie na primátech (obecný protokol)
Komparativní studie byly prováděny s konjugáty polymer-interferon-beta-la a nativním interferonem-beta-la (jako neformulovaný volný meziprodukt interferonu-beta-la ve fosfátu sodném, a NaCl, pH 7,2) pro zjištění jejich relativní stability a aktivity na primátech. V těchto studiích byla srovnávána farmakokinetika a farmakodynamika konjugátu polymer-interferon-beta-la ío u primátů s nativním interferonem-beta-la a racionální závěry mohou být rozšířeny na člověka.
Zvířata a metody
Návrh studie
Toto byla studie s paralelními skupinami a opakovanými dávkami pro vyhodnocení komparativní farmakokinetiky a farmakodynamiky konjugovaného a nekonjugovaného interferonu-beta-la.
Pro tuto studii byly použiti zdraví primáti (výhodně makak „rhesus“, Macaca mullata). Před podáváním dávek byly u všech zvířat vyšetřeny příznaky nemocí veterinářem při dvou příležitostech během 14 dnů před prvním podáním testované sloučeniny. Vyhodnocení zahrnovalo obecné fyzikální vyšetření základních klinických patologických ukazatelů a výchozí hladiny protilátek proti interferonu-beta-la. Všechna zvířata byla zvážena a během 24 hodin před podáním testované sloučeniny byla zaznamenávána tělesná teplota.
Bylo zaregistrováno dvanáct zvířat a rozděleno do skupin, které dostávaly 1 MU/kg interferonubeta-la buď jako konjugát PEG-interferon-beta-la, nebo nekonjugovaný, ale jinak identický interferon-beta-la. Podávání bylo prováděno buď subkutánně (SC), nebo intravenózně (IV). Všechna zvířata musela být nedotčena ošetřením interferonem-beta, čili tzv. naivní. Každému zvířeti byly podávány dávky ve dvou dobách, dávky byly odděleny čtyřmi týdny. Objem dávky byl 1,0 ml/kg.
Pro farmakokinetické testování byla odebírána krev v různých časových intervalech po každé injekci. Po podávání studovaného léčiva byly také odebírány vzorky krve pro měření markéru biologické reakce indukované interferonem, sériového neopterinu.
Hodnocení během období studie zahrnují klinická vyšetřování známek toxicity prováděná 30 minut a 1 hodinu po podání dávky. Byla prováděna denní pozorování přes klec a byl zaznamenáván celkový vzhled, příznaky toxicity, neklid a změny chování. Během 21 dnů po podání dávky byla zaznamenávána tělesná hmotnost a tělesná teplota.
Testovací metody
Hladiny interferonu-beta v séru byly kvantifikovány s použitím testu na hodnocení cytopatického účinku (CPE). Test CPE měřil stupeň antivirové aktivity zprostředkované interferonem. Stupeň antivirové aktivity ve vzorku odráží počet molekul aktivního interferonu obsažených ve vzorku v okamžiku, kdy je odebírána krev. Tento přístup byl standardní metodou pro stanovení farmakokinetiky interferonu-beta. Test CPE použitý v předkládané studii detekuje schopnost interferonu-beta chránit buňky lidského plicního karcinomu (A549, č. CCL-185, ATCC, Rockville, MD) před cytotoxicitou způsobenou virem encefalomyokarditidy (EMC). Buňky byly předem inkubovány 15 až 20 hodin se vzorky séra, aby se umožnila indukce a syntéza proteinů, které lze indukovat interferonem, a které pak zvyšují antivirovou reakci. Potom byl přidán virus EMC a inkubován dalších 30 hodin před tím, než se vyhodnotila cytotoxicita s použitím barvení krystalovou violetí. Na každé testované destičce byl současně se vzorky testován vnitřní standard interferonu55 beta, jakož i vnitřní standard PEG konjugátu. Tento standard byl kalibrován proti referenčnímu
-30CZ 299164 B6 standardu přirozeného interferonu lidských fibroblastů (WHO Second International Standard for Interferon, Human Fibroblast, Gb-23-902-53). Každá testovaná destička také zahrnovala jamky s kontrolou buněčného růstu, které neobsahovaly ani interferon-beta jakéhokoliv druhu, ani EMC, a jamky s virovou kontrolou, které obsahovaly buňky a EMC, ale neobsahovaly inter5 feron-beta. Pro zjišťování účinku, byl-li jaký, vzorků na buněčný růst byly také připraveny kontrolní destičky obsahující standardy a vzorky. Tyto destičky byly obarveny bez přidání viru.
Vzorky a standardy byly testovány v duplikátech na každé ze dvou opakujících se testovacích destiček, poskytující čtyři údaje o vzorku. Byl uváděn geometrický průměr hodnot koncentrace ze čtyř opakování. Limit detekce v tomto testu je 10 jednotek (U)/ml.
Sérové koncentrace neopterinu byly určovány na oddělení klinické farmakologie s použitím komerčně dostupných testů.
Farmakokinetické a statistické metody
Software Rstrip™ (MicroMath, lne., Salt Lake City, UT) byl použit pro prokládání (fitování) dat pomocí farmakokinetických modelů. Geometrické průměry hodnot koncentrace byly vyneseny do grafu proti času pro každou skupinu. Protože výsledky testu jsou vyjádřeny jako ředění, jsou geometrické průměry považovány za vhodnější, než aritmetické průměry. Hladiny sérového interferonu byly srovnány podle výchozích hodnot a nedetekovatelné koncentrace v séru byly stanoveny na 5 U/ml, což představovalo jednu polovinu spodního limitu detekce.
Pro data z IV infúzí byl fítován IV infúzní model se dvěma kompartmenty pro detekovatelné koncentrace v séru pro každý subjekt a SC data byla fítována podle injekčního modelu se dvěma kompartmenty.
Byly vypočítány následující farmakokinetické parametry: i) pozorovaná vrcholová koncentrace, cmax (U/ml) ii) oblast pod křivkou od 0 do 48 hodin, AUC se vypočetla pomocí lichoběžníkového pravidla, iii) poločas eliminace, a, z dat získaných při IV infúzi (když byl použit IV způsob podávání):
iv) poločas distribuce (hodiny, h),
v) clearance (ml/h), vi) zjevný distribuční objem, Vd (1).
Pro výpočet poločasu eliminace po SC a IM injekci byl použit software WinNonlin (Scientific Consulting lne., Apex, NC). Pro neopterin jsou uvedeny hodnoty aritmetického průměru v každé skupině. Emax, maximální hodnota změny proti základní hodnotě, byla také vypočtena. Cmax, AUC a Emax byly pak analyzovány jednosměrnou analýzou rozptylu pro srovnání skupin lišících se dávkami. Hodnoty cmax a AUC byly logaritmicky transformovány před analýzou, jsou uváděny geometrické průměry.
Příklad 6
Srovnání farmakokinetiky PEG-interferonu-beta-la a interferonu-beta-1 a u makaků
Interferon-beta-la nebo jeho PEGylovaná forma PEG-interferon-beta-la byly podány maka50 kům „rhesus“ 1. a 29. den studie buďto intravenózně (IV), nebo subkutánně (SC) jak bylo již popsáno v obecném protokolu v příkladu 5. 1. den dostalo 6 opic interferon-beta-la (vždy 3 pro každý způsob podání) a dalších 6 opic PEGylovaný interferon-beta-la. 29. den studie byly
-31 CZ 299164 B6 dávky opakovány. IV dávky byly podány jako pomalá bolusová injekce do mozkové arterie nebo véna saphena.
SC dávky byly podány pod kůží na hřbetě po předchozím vyholení místa pro injekci. Krev byla odebírána z femorální cévy v určených intervalech a ponechána zkoagulovat, aby se získalo sérum. Sérum bylo analyzováno na přítomnost funkčních látek léčiva užitím ověřeného antivirového testu CPE, a dále byla stanovena hladina neopterinu a beta-2-mikroglobulinu v séru jakožto farmakodynamická měřítka aktivity. Farmakologické parametry byly vypočteny užitím programu WinNonlin verze 2.0 (Scientific Consulting lne., Apex, NC).
Hodnoty koncentrací byly analyzovány standardními metodami nezávisle na modelu (nekompartmentová analýza) pro získání farmakokinetických parametrů. Plocha pod křivkou (AUC) závislosti byla vypočtena pomocí lichoběžníkového pravidla. Statistické analýzy včetně výpočtu aritmetického průměru a směrodatné odchylky byly provedeny pomocí Microsoft Excel verze 5 (Microsoft Corp., Redmond WA). Hodnoty koncentrace uváděné dále jako hodnoty pod limitem kvantifikace (BLQ) nebyly dále použity ve farmakokinetické analýze. Vzhledem k tomu, že pro výpočty byly užity různé programy, které různým způsobem čísla zaokrouhlují či zkracují, hodnoty (tj. průměry, směrodatné odchylky nebo i jednotlivé hodnoty) v některých tabulkách se mohou lišit od jiných tabulek, od individuálně vypočtených hodnot nebo od dat po statistické analýze. Ani integrita ani interpretace těchto dat však uvedenými rozdíly nebyly ovlivněny. Výsledky a diskuse
Při obou způsobech podávání PEGylovaný interferon-beta-1 a vykazoval vyšší biologickou dos25 tupnost (měřenou jako plocha pod křivkou závislosti koncentrace v séru na čase). Kromě toho PEGylovaný interferon-beta-la měl vyšší absolutní biologickou dostupnost než interferon-betala při SC podávání. Farmakokinetické parametry jsou shrnuty v příkladu 5. Podávání PEGylovaného interferonu-beta-1 a jak IV, tak SC způsobem vedlo ke zvýšení biologického poločasu i AUC interferonu-beta-1 a.
Po IV podání první dávky průměrná hodnota (± směrodatná odchylka) vrcholové koncentrace v séru (Cmax) interferonu-beta-1 a a PEG-interferonu-beta-la byla 6400 (±0) a 1080 (± 3,5) U/ml, v uvedeném pořadí. Průměrné hodnoty (± směrodatná odchylka) AUC byly 4453 (±799) a 34373 (±3601) U*h/ml. Po prvním SC podání průměrné hodnoty (± směrodatná odchylka) cmax interferonu-beta-la a PEG-interferonu-beta-la byly 277 (± 75) a 1080 (± 381). Průměrné hodnoty (± směrodatná odchylka) AUC byly 4753 (± 3170) a 44952 (± 1443) U*h/ml.
Tabulka 5
BG9418 průměrné hodnoty (průměr ± směrodatná odchylka) farmakokinetických parametrů po SC (dávka 1) nebo IV podání 1 MU/kg interferon-beta—1 a nebo PEG—interferon-beta—1 a makakům „rhesus“ (n = 3)
-32CZ 299164 B6
Přípravek (podání) Cmax tri *max AUC (U*hod/ml) CL (ml/kg) VS8 (ml/kg) 1*1/2
IFN-p-la 6400 0,083 4453 229 543 3,2
(IV) (±0) (±0) (±799) (±38) (±147) (±1,4)
PEG- 1080 0,083 34373 29 250 9,5
ΙΡΝ-β-la (IV) (±3,5) (±0) (±3601) (±3) (±30) (2,1)
IFN-p-la (SC) 277 (±75) 5,3 (±1,2) 4753 (±3170) neměř. neměř. 10,0 (±2,9)
PEG- ΙΡΝ-β-la (SC) 1080 (±381) 3,3 (±1,2) 42283 (±5934) neměř. neměř. 22,0 (±3,4)
Jak hladina neopterinu, tak i beta2mikroglobinu v séru byly zvýšeny po léčení interferonem-beta a PEGylovaným interferonem-beta, což dokazuje farmakologickou aktivitu produktů. Při vyso5 kých dávkách testovaných sloučenin nebyly rozdíly ve farmakologické aktivitě interferonu-betala a PEGylovaného interferonu-beta-la při obou způsobech podávání (data nejsou uvedena).
Příklad 7 ío Srovnání farmakokinetiky PEG-interferonu-beta-la a interferonu-beta-la u potkanů po různých způsobech podání léčiva.
Cílem této studie bylo stanovit komparativní biologickou dostupnost interferonu-beta-la a PEGylovaného interferonu-beta-la při různých způsobech podávání.
Materiál a metody
V pokusu byly použity samice laboratorního potkana Lewis (o hmotnosti 190 g) pro stanovení farmakokinetických parametrů, vždy 2 zvířata pro jeden způsob podávání. Potkanům byla do jugulámí cévy vložena kanyla a pak intravenózně podán lidský interferon-beta-la nebo 5K PEG—interferon—beta— 1 a a nebo 20K PEG—interferon—beta— 1 a (ve vehikulu obsahujícím 14 mg/ml HSA v 50mM fosforečnanu sodném, lOOmM NaCl, pH 7,2), a sice intravenózně, intraperitoneálně, perorálně, subkutánně nebo intratracheálně. Krev byla odebírána několikrát v průběhu 72 hodin, a sice v čase 0, 5 minut, 13, 30 a 75 minut, 3 hodiny, 24, 48 a 72 hodin.
Protokol je uveden v tabulce 6. Test cytopatického účinku (CPE) byl proveden se vzorky séra pro detekci interferonu-beta v séru. Výsledky, ke kterým vedlo podání nemodifikovaného interferonu-beta-la a interferonu-beta-la modifikovaného 20K PEG jsou uvedeny vtab. 7. Ve všech případech PEGylace vedla k významnému zvýšení tj/2 a AUC.
-33 CZ 299164 B6
Tabulka 6
-34CZ 299164 B6
Tabulka 7
Farmakokinetické parametry po IV, SC, IP a IT podání interferonu-beta-la (IFN) a PEGylova5 něho interferonu-beta-1 a (IFN-PEG) u laboratorních potkanů
Přípravek(podání)- Cmax (u/ral) fp Xffiax (hodiny) AUC ((U*hod)/*gg)) Ti/2 (hodiny)
IFN (IV dávka 20 gg) 64000 0,25 3035 1,25
IFN-PEG (IV dávka 3 gg) 23970 0,08 47728 8,44
IFN (SC dávka 20 gg) 2400 1, 00 464,4 0, 96
IFN-PEG (SC dávka 3 gg) 2400 7,00 14688 11,9
IFN (IP dávka 20 gg) 26000 1,25 4159 1,53
IFN-PEG (IP dávka 3 gg) 9700 1,25 52148 16,2
IFN (IT dávka 15 gg) 240 1,5 70,7 1,29
IFN-PEG (IT dávka 15 gg) 270 7,0 233,5 6,21
ío Příklad 8
Antiangiogenní účinky konjugátů interferonu-beta-la s polymerem: Hodnocení schopnosti PEGylovaného interferonu-beta-la inhibovat proliferaci endotelových buněk in vitro
Buňky z lidského cévního endotelu (Cell Systems, katalog, č. 2V0-P75) a buňky endotelu kožních kapilár (Cell Systems, katalog, č. 2M1-C25) byly udržovány v kultuře s médiem ze soupravy CS-C Medium Kit (Cell Systems, katalog, č. 4Z0-500). Čtyřiadvacet hodin před pokusem byly buňky ošetřeny trypsinem, resuspendovány v testovacím médiu, 90% Ml 99 a 10% fetální hovězí sérum (FBS), a upraveny na požadovanou hustotu. Pak byly buňky vysety na 24- nebo 9620 jamkové destičky potažené želatinou, s hustotou 12 500 buněk/jamka nebo 2000/buněk/jamka.
Po inkubaci přes noc bylo testovací médium nahrazeno čerstvým médiem obsahujícím 20 ng/ml lidského rekombinantního bazického fibroblastového růstového faktoru bFGF (Becton Dickinson, katalog, č. 400600) a různé koncentrace konjugovaných nebo nekonjugováných proteinů interferonu-beta-la nebo pozitivní kontrolu (jako pozitivní kontrolu lze užít endostatin nebo protilátku k bFGF). Celkový objem byl nastaven na 0,5 ml ve 24-jamkové destičce nebo 0,2 ml v 96-jamkové destičce.
Po dvaasedmdesáti hodinách byly buňky ošetřeny trypsinem pro počítání na Coulteru, zamraženy pro odečítání fluorescence CyQuant nebo značeny [3H]-thymidinem. inhibice proliferace endotelových buněk in vitro konjugovaným nebo nekonjugo váným interferonem-beta-la byla srovnatelná, což ukazuje na to, že PEGylace nijak nepoškozuje schopnost interferonu normálně v tomto uspořádání fungovat.
Tento test sloužil k hodnocení molekuly lidského interferonu-beta-la podle vynálezu z hlediska in vitro účinků na proliferaci endotelových buněk, která může být indikátorem antiangiogenních účinků in vivo. Viz např. 0’Reilly, M.S., T. Boehm, Y. Shing, N. Fukal, G. Vasios, W. Lané, E. Flynn, J. Birkhead, B. Olsen, J. Folkman, 1997, Endostatin: An Endogenous Inhibitor of Angiogenesis and Tumor Growth. Cell 88: 277-285.
-35CZ 299164 B6
Příklad 9
In vivo model pro testování antiangiogenního a antineovaskularizačního účinku konjugátů inter5 feronu-beta-la
Pro testování antiangiogenních a antineovaskularizačních účinků molekul podle vynálezu byly vyvinuty různé metody. Některé z těchto modelů byly popsány v patentech US 5 733 876 (31. března 1998, „Methods of inhibiting angiogenesis“) a US 5 135 9191 (4. srpen 1992, ío „Method and pharmaceutical composition for the inhibition of angiogenesis“). K dalším testům patří např. test s chorialantoidní membránou bez skořápky (CAM) podle S. Taylor a J. Folkman,
Nátuře 297, 307, 1982 a R. Crum, S. Szabo a J. Folkman, Science 230, 1375, 1985, model angiogeneze se vzdušným dorzálním vakem u myší podle J. Folkman, et al., J. Exp. Med. 133, 275, 1971, a test s mikrokapsou rohovky podle Gimbrone, M.A. Jr. et al., Nati. Cancer Inst. 52, 413,
1974, kde je vaskularizace rohovky indukována u dospělých samců laboratorních potkanů kmene
Sprague-Dawley (Charles River, Japonsko) implantací 500 ng bazického FGF (hovězí, R and D Systems, lne.) impregnovaného v EVA (kopolymer ethylen-vinylacetátu) peletech do každé rohovky.
K dalším metodám testování PEGylovaného myšího interferonu-beta-la na antiangiogenní účinky na zvířecím modelu patří, i když výčet tím není omezen, screeningové testy nových potenciálních protirakovinných léčiv, jak byly popsány v původní publikaci Cancer Chemotherapy Reports, part 3, Vol. 3, No. 2, září 1972 a v suplementu In vivo Cancer Models, 1976-1982, NIH Publ. No. 84-2635, únor 1984.
Vzhledem k mezidruhové bariéře pro interferony typu I, pro hodnocení antiangiogenní aktivity konjugátů interferonu-beta-la s polymerem na modelu hlodavců byly připraveny polymerové konjugáty interferonu-beta-la hlodavců. Screeningové metody jsou ukázány na příkladu protokolu pro testování antiangiogenního účinku PEGylovaného myšího interferonu-beta-la na sub30 kutánně implantovaný Lewisův plicní karcinom.
Původ nádorové linie
Vznikla spontánně v r. 1951 jako karcinom plic u myši C57BL/6.
Souhrn testovacích procedur
Fragment nádoru byl implantován subkutánně do axilámí oblasti myší B6D2F1. Testované činidlo (např. PEGylovaný interferon podle vynálezu) byl podáván v různých dávkách subkutánně (SC) nebo intraperitoneálně (IP) po několik dní po implantaci nádoru. Měřeným parametrem pak byl medián času přežití, výsledky jsou uvedeny jako procenta času přežití kontroly.
Zvířata
Propagace nádoru: C57BL/6 Testovací zvířata: B6D2F1
Hmotnost: myší by měly být hmotností s rozpětím 3 g s minimální hmotností u samců 18 g a samic 17 g
Pohlaví: zvířata jednoho pohlaví jsou užita pro test i kontrolu v jednom pokusu
Zdroj: jeden zdroj, pokud je to možné, pro všechna zvířata v jednom pokusu Rozsah experimentu:
zvířat v jedné testovací skupině
-36CZ 299164 B6
Přenos nádoru Propagace nádoru:
Fragment: připravit 2 až 4 mm fragment nádoru SC dárcovského nádoru Doba: 13. až 15. den
Místo: fragment implantován SC do axilámí oblasti punkcí ingvinální oblasti
Testování:
Fragment: příprava fragmentu o velikosti 2 až 4 mm ze s.c. dárcovského tumoru.
Čas: dny 13. až 15.
ío Místo: implantace fragmentu s.c. do axilámí oblasti s punkcí v ingvinální oblasti.
Testovací schéma:
Den 0: implantace tumoru. Založení bakteriálních kultur. Testování pozitivní kontrolní sloučeniny v každém experimentu s lichým číslem. Příprava materiálů. Denní záznam úmrtí.
Den 1: kontrola kultur. Odstranění kontaminovaného experimentu. Randomizace zvířat. Ošetřování dle instrukcí (v den 1 a následující dny).
Den 2: Opětná kontrola kultur. Odstranění kontaminovaného experimentu.
Den 5: Hodnocení dne 2 a den počátečního testu vyhodnocení toxicity přípravku.
Den 14: Kontrolní den časného úmrtí.
Den 48: Kontrolní den.
Den 60: Konec a vyhodnocení experimentu. Vyšetření tumoru plic pouhým okem.
Kontrola kvality:
Stanovení pozitivní kontrolní sloučeniny (NSC 26271 (Cytoxan v dávce lOOmg/kg injekce)) v každém experimentu s lichým číslem, jehož režim byl v den 1 pouze intraperitoneální. Spodní limit testu/kontroly pro pozitivní kontroluje 140 %. Přijatelný medián přežití u neošetřené kontroly byl 19 až 35,6 dnů.
Vyhodnocení:
Měřený parametr je medián přežití. Výpočet průměrné tělesné hmotnosti zvířat v den 1 a v den 5, výpočet poměru test/kontrola pro všechny testované skupiny. Jsou vypočítány průměrné tělesné hmotnosti zvířat ve dny odečítání a v den konečného vyhodnocení. Poměr test/kontrola je vypočítán pro všechny testované skupiny s>65% přeživších v den 5. Poměr test/kontrola < 86 % indikuje toxicitu. Pro hodnocení toxicity může být také použita nepřiměřená změna tělesné hmotnosti (test minus kontrola).
Měřítka aktivity:
Výchozí poměr test/kontrola větší než rovný 140 % je považován za nezbytný pro průkaz mírné aktivity. Reprodukovatelná hodnota poměru test/kontrola větší nebo rovná 150 % je považována za významnou aktivitu.
-37CZ 299164 B6
Seznam sekvencí <170» Patentln Ver. 2.0 <210» 1 <211» 549 <212» DNA <213» myš <400» 1 tccgggggcc atcatcatca tcatcatagc tccggagacg atgatgacaa gatgagctac 60 aacttgcttg gattcctaca aagaagcagc aattttcagt gtcagaagct cctgtggcaa 120 ttgaatggga ggcttgaata ctgcctcaag gacaggatga actttgacat ccctgaggag 180 attaagcagc tgcagcagtt ccagaaggag gacgccgcat tgaccatcta tgagatgctc 240 cagaacatct ttgctatttt cagacaagat tcatctagca ctggctggaa tgagactatt 300 gttgagaacc tcctggctaa tgtctatcat cagataaacc atctgaagac agtcctggaa 360 gaaaaactgg agaaagaaga tttcaccagg ggaaaactca tgagcagtct gcacctgaaa 420 agatattatg ggaggattct gcattacctg aaggccaagg agtacagtca ctgtgcctgg 480 accatagtca gagtggaaat cctaaggaac ttttacttca ttaacagact tacaggttac 540 ctccgaaac 549 <210» 2 <211» 183 <212» PRT <213» myš <400» 2
Ser Gly Gly His His His His His His Ser Ser Gly Asp Asp Asp Asp 15 10 15
Lys Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gin Arg Ser Ser Asn Phe
-38CZ 299164 B6
25 30
Gin Cys Gin Lys Leu Leu Trp Gin Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys
35 40 45
Leu Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gin Leu
50 55 60
Gin Gin Phe Gin Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu
65 70 75 80
Gin Asn Xle Phe Ala Ile Phe Arg Gin Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp
85 90 95
Asn Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gin Ile
100 105 110
Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe
115 120 125
Thr Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly
130 135 140
Arg Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp
145 150 155 160
Thr Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg
165 170 175
Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Asn
180 <210> 3 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 ttctccggag acgatgatga caagatgagc tacaacttgc ttggattcct acaaagaagc 60 <210> 4 <211> 39 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 gccgctcgag ttatcagttt cggaggtaac ctgtaagtc 39
-39CZ 299164 B6 <210> 5 <211> 35 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 agcttccggg ggccatcatc atcatcatca tagct 35 <210> 6 <211> 35 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 ccggagctat gatgatgatg atgatggccc ccgga 35 <210> 7 <211> 87 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 ccggagacga tgatgacaag atggcttacg ccgctcttgg agccctacaa gcttctagca 60 attttcagtg tcagaagctc ctgtggc 87 <210> 8 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 gatctagcaa tgctgcctgt gctgccctcc tggctgcctt gaatgggagg cttgaatact 60 <210> 9 <211> 52 <212> DNA <2X3> Homo sapiens <400> 9 gcctcaagga caggatgaac tttgacatcc ctgaggagat taagcagctg ca 52 <210> 10 <211> 76 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10
-40CZ 299164 B6
aattgaatgg agattaagca gagggctgca gctgca gcttgcgctg cagacaggat gap^tttgac atccctgagg 60 76
<210» 11 <211» 76 <212» DMA <213» Homo sapiens
<400» 11 aattgaatgg agattaagca gaggcttgaa gctgca tactgcctca aggacagggc tgcatttgct atccctgcag 60 76
<210> 12 <211» 51 <212> DNA <213» Homo sapiens
<400» 12 aattgaatgg gaggcttgaa tactgcctca aggacaggat gaactttgac a 51
<210» 13 <211» 43 <212> DNA <213> Homo sapiens
<400» 13 tccctgagga gattgctgca gctgcagctt tcgctgcagc tga 43
<210» 14 <211» 78 <212> DNA <213» Hano sapiens
<400» 14 cgccgcgttg atctagcact accatctatg ggctggaa agatgctcgc taacatcgct agcattttca gacaagattc 60 78
<210» 15 <211» 78 <212» DNA <213» Homo sapiens
<400» 15
cgccgcattg accatctatg agatgctcca gaacatcttt gctattttcg ctgcagcttc 60 atctagcact ggctggaa 78 <210» 16 <211» 72
-41 CZ 299164 B6 <',12> DNA <213> Homo sapiens
<400> 16
ggaatgcttc agacagttct aattgttgct gcactcctga ag
<210> 17 <211> 72 <212> DNA <213> Homo sapiens
<400> 17 ggaatgagac ctgcagttct cattgttgag ag aacctcctgg
<210> 18 <211> 44 <212> DNA <213> Homo sapiens
<400> 18 ctagctgcaa aactggctgc agctgatttc
<210> 19 <211> 69 <212> DNA <213> Homo sapiens
<400> 19 ctagaagaaa ctgaaaaga aactggagaa agaagcagct
gcaatgtcta tcatcagata aaccatctga 60 72 ctaatgtcgc tcatcagata gcacatctgg 60 72 accaggggaa aact 44 accgctggaa aagcaatgag cgcgctgcac 60 69 <210> 20 <211> 51 <212» DNA <213> Homo sapiens <400> 20 tattatggga ggattctgca ttacctgaag gccaaggagt actcacactg t 51 <210> 21 <211> 76 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 catgagcagt ctgcacctga aaagatatta tggggcaatt gctgcatacc tggcagccaa 60
-42CZ 299164 B6 ggagtactca cactgt <210» 22 <211» 87 <212> DNA <213» Horoo sapiens <400» 22 catgagcagt ctgcacctga aaagatatta tgggaggatt ctgcattacc tgaaggccgc 60 tgcatactca cactgtgcct ggacgat 87 <210» 23 <211» 87 <212» DNA <213» Horoo sapiens <400» 23 catgagcagt ctgcacctga aaagatatta tgggaggatt ctgcattacc tgaaggcaaa 60 ggagtacgct gcatgtgcct ggacgat 87 <210» 24 <211» 50 <212» DNA <213» Horoo sapiens <400» 24 cgtcagagct gaaatcctag caaactttgc attcattgca agacttacag 50 <210» 25 <211» 166 <212» PRT <213» Horoo sapiens <400» 25
Met 1 Ser Tyr Asn Leu 5 Leu Gly Phe Leu Gin 10 Arg Ser Ser Asn Phe 15 Gin
Cys Gin Lys Leu 20 Leu Trp Gin Leu Asn 25 Gly Arg Leu Glu Tyr 30 Cys Leu
Lys Asp Arg 35 Met Asn Phe Asp Ile 40 Pro Glu Glu Ile Lys 45 Gin Leu Gin
Gin Phe 50 Gin Lys Glu Asp Ala 55 Ala Leu Thr Ile Tyr 60 Glu Met Leu Gin
Asn 65 Ile Phe Ala Ile Phe 70 Arg Gin Asp Ser Ser 75 Ser Thr Gly Trp Asn 80
-43 CZ 299164 B6
Glu Thr Ile Val Glu 85 Asn Leu Leu Ala Asn 90 Val Tyr His Gin Ile Asn 95
His Leu Lys Thr 100 Val Leu Glu Glu Lys 105 Leu Glu Lys Glu Asp 110 Phe Thr
Arg Gly Ala 115 Leu Met Ser Ser Leu 120 His Leu Lys Arg Tyr 125 Tyr Gly Arg
Ile Leu 130 His Tyr Leu Lys Ala 135 Lys Glu Tyr Ser His 140 Cys Ala Trp Thr
Ile 145 Val Arg Val Glu Ile 150 Leu Arg Asn Phe Tyr 155 Arg Ile Asn Arg Leu 160
Thr Gly Tyr Leu Arg Asn
165 <210» 26 <211» 166 <212» PRT <213» Homo sapiens
<400» 26
Met Ala Tyr Ala Ala Leu Gly Ala Leu Gin Ala Ser Ser Asn Phe Gin
1 5 10 15
Cys Gin Lys Leu Leu Trp Gin Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu
20 25 30
Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gin Leu Gin
35 40 45
Gin Phe Gin Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Ala
50 55 60
Asn Ile Ala Ser Ile Phe Arg Gin Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn 65 70 75 80
Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gin Ile Asn 85 90 95
His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Ala Ala Thr 100 105 110
Ala Gly Ala Ala Met Ser Ala Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg
-44CZ 299164 B6
115 120 125
Zle Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His 140 Cys Ala Trp Thr
130 135
Ile Val Arg Val Glu ile Leu Arg Asn Phe Tyr Arg Ile Asn Arg Leu
145 150 155 160
Thr Gly Tyr Leu Arg Asn
165 <210> 27 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27
Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gin Arg Ser Ser Asn Ala Ala
1 5 10 15
Cys Ala Ala Leu 20 Leu Ala Ala Leu Asn 25 Gly Arg Leu Glu Tyr 30 Cys Leu
Lys Asp Arg 35 Met Asn Phe Asp Ile 40 Pro Glu Glu Ile Lys 45 Gin Leu Gin
Gin Phe 50 Gin Lys Glu Asp Ala 55 Ala Leu Thr Ile Tyr 60 Glu Met Leu Gin
Asn 65 Ile Phe Ala Ile Phe 70 Ala Ala Ala Ser Ser 75 Ser Thr Gly Trp Asn 80
Glu Thr Ile Val Glu 85 Asn Leu Leu Ala Asn 90 Val Tyr His Gin Ile 95 Asn
His Leu Lys Thr 100 Val Leu Glu Glu Lys 105 Leu Glu Lys Glu Asp 110 Phe Thr
Arg Gly Ala 115 Leu Met Ser Ser Leu 120 His Leu Lys Arg Tyr 125 Tyr Gly Ala
Ile Ala 130 Ala Tyr Leu Ala Ala 13S Lys Glu Tyr Ser His 140 Cys Ala Trp Thr
Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Arg Ile Asn Arg Leu
145 150 155 160
-45CZ 299164 B6
Thr Gly Tyr Leu Arg Asn 165 <210» 28 <211» 166 <212» PRT <213» Homo sapiens <400» 28
Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gin Arg Ser Ser Asn Phe Gin
1 5 10 15
Cys Gin Lys Leu Leu Trp Gin Leu Asn Gly Arg Ala Ala Ala Cys Ala
20 25 30
Ala Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gin Leu Gin
35 40 45
Gin Phe Gin Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gin
50 55 60
Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gin Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn
65 70 75 80
Ala Ser Ile Val Ala Ala Leu Leu Ser Asn Val Tyr His Gin Ile Asn
85 90 95
His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr
100 105 110
Arg Gly Ala Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg
115 120 125
Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Ala Ala Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr
130 135 140
Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Arg Ile Asn Leu
145 150 155 160
Thr Gly Tyr Leu Arg Asn
165 <210» 29 <211» 167 <212» PRT <213» Homo sapiens
-46CZ 299164 B6
<400> 29
Met Ser 1 Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gin Arg Ser Ser Asn Phe Gin 15
5 10
Cys Gin Lys Leu Leu Trp Gin Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu
20 25 30
Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Xle Pro Glu Glu ile Ala Ala Ala Ala
35 40 45
Ala Phe Ala Ala Ala Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gin
50 55 60
Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gin Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn
65 70 75 80
Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Ala Tyr His Gin Ala
85 90 95
Asn His Ala Lys Thr Ala Leu Ala Ala Lys Leu Ala Ala Ala Asp Phe
100 105 110
Thr Arg Gly Ala Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly
115 120 125
Arg Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp
130 135 140
Thr Ile Val Arg Ala Glu Ile Leu Ala Asn Phe Ala Arg Ile Ala Arg
145 150 155 160
Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Asn
165
-47CZ 299164 B6

Claims (38)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Farmaceutická kompozice, v y z n a č u j í c í se tí m , že obsahuje glykosylovaný interferon-beta-la, který má nativní sekvenci obsahující sekvenci aminokyselin 18 až 183 ze sekvence identifikačního čísla 2 nebo má substituovanou sekvenci, kde je 1 až 10 aminokyselin v jakékoliv poloze nativní sekvence substituováno alaninem a 1 až 2 aminokyseliny v jakékoliv ío poloze nativní sekvence jsou substituovány serinem, přičemž glykosylovaný interferon-beta-la je navázaný na polymer, který se nevyskytuje v přírodě, a tento polymer obsahuje polyalkylenglykolovou část.
  2. 2. Kompozice podle nároku 1,vyznačující se tím, že polyalkylenová část je navázá15 na na interferon-beta-la prostřednictvím skupiny vybrané z následujících skupin: aldehydová, maleimidová, vinylsulfonová, haloacetátová, skupina sestávající z několika histidinových zbytků, hydrazinová a aminothiolová skupina.
  3. 3. Kompozice podle nároku 1, vyznačující se tím, že glykosylovaný interferon20 beta-1 a je nativní humánní interferon-beta-la, který je případně substituován alaninem nebo serinem, jak je uvedeno v sekvenci id. č. 25 až sekvenci id. č. 40.
  4. 4. Kompozice podle nároku 3, vyznačující se tím, že glykosylovaný interferonbeta-la si uchovává aktivitu v hodnotě 0,5 až 1 násobku aktivity interferonu-beta-la bez přítom25 nosti polymeru, když je měřen v antivirovém testu.
  5. 5. Kompozice podle nároku 1,vyznačující se tím, že interferon-beta-la je fúzní protein interferonu-beta-la.
    30
  6. 6. Kompozice podle nároku 5, v y z n a č u j í c í se t í m , že fúzní protein interferonu-betala obsahuje část imunoglobulinové molekuly.
  7. 7. Kompozice podle nároku 1 nebo 5,vyznačuj ící se tím, že interferon-beta-1 a je mutanta interferonu-beta-la uvedená v sekvenci id. č. 25 až sekvenci id. č. 40 mající alespoň
    35 jednu z následujících vlastností:
    a) mutanta má vyšší antivirovou aktivitu než interferon-beta—1 a divokého typu, když se antivirová aktivita měří pomocí virem indukované lýze buňky,
    b) mutanta má, ve srovnání s interferonem-beta-la divokého typu, vyšší antivirovou aktivitu než antiproliferativní aktivitu,
    40 c) mutanta se váže na receptor interferonu, ale má, ve srovnání s interferonem-beta-la divokého typu, sníženou antivirovou a sníženou antiproliferativní aktivitu proti vazebné aktivitě k receptoru.
  8. 8. Kompozice podle nároku 1, vyznačující se tím, že polymer má molekulovou
    45 hmotnost 5 až 40 kilodaltonů.
  9. 9. Způsob prodloužení interferonu-beta-la, který je popsán v nároku 1 nebo 3, v in vitro systému, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky, kdy se interferon-beta-1 a naváže na polymerovou část, která se nevyskytuje v přírodě, čímž vznikne spojený přípravek polymer-inter50 feron-beta-la, a pak se přípravek vnese do in vitro systému.
  10. 10. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že interferon-beta-la se naváže na polymer v místě interferonu-beta-la, které je N-koncem.
    -48CZ 299164 B6
  11. 11. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že interferon-beta-1 a se naváže na polymer v místě interferonu-beta-la, které je na C-konci nebo v jeho blízkosti.
  12. 12. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že interferon-beta-1 a se naváže na
    5 polymer pomocí glykanové části interferonu-beta-la.
  13. 13. Způsob podle nároku 9, v y z n a č u j í c í se t í m , že interferon-beta-1 a je fúzní protein interferonu-beta-1 a.
    ío
  14. 14. Způsob podle nároku 13,vyznačující se tím, že fúzní protein interferonu-beta-1 a obsahuje část imunoglobulinové molekuly.
  15. 15. Způsob podle nároku 9 nebo 13, vyznačující se tím, že interferon-beta-1 a je mutanta interferonu-beta-la uvedená v sekvenci id. č. 25 až sekvenci id. č. 40, která má alespoň
    15 jednu z následujících vlastností:
    a) mutanta má vyšší antivirovou aktivitu než interferon-beta-1 a divokého typu, když se antivirová aktivita měří pomocí virem indukované lýze buňky,
    b) mutanta má, ve srovnání s interferonem-beta-la divokého typu, vyšší antivirovou aktivitu než antiproliferativní aktivitu,
    20 c) mutanta se váže na receptor interferonů, ale má, ve srovnání s interferonem-beta-la divokého typu, sníženou antivirovou a sníženou antiproliferativní aktivitu vzhledem k vazebné aktivitě k receptorů.
  16. 16. Způsob podle nároku 9, v y z n a č u j í c í se t í m , že polymer obsahuje polyalkylengly25 kol.
  17. 17. Protein obsahující nativní sekvenci aminokyselin 18 až 183 ze sekvence id. č. 2 nebo substituovanou sekvenci, kde je 1 až 10 aminokyselin v jakékoliv poloze nativní sekvence substituováno alaninem a 1 až 2 aminokyseliny v jakékoliv poloze nativní sekvence jsou substituo30 vány serinem, navázanou na polymer, který se nevyskytuje v přírodě, přičemž tento polymer obsahuje polyalkylenglykolovou část a je navázán na aminovou, karboxylovou, guanidylovou nebo glykanovou část proteinu.
  18. 18. Protein podle nároku 17, kde polymer je navázán k aminoskupině proteinu.
  19. 19. Protein podle nároku 18, kde polymer je navázán na N-konec proteinu.
  20. 20. Protein obsahující sekvenci aminokyselin, která je uvedena v tabulce 1, navázanou na polymer, který se nevyskytuje v přírodě, na N—konci nebo C—konci proteinu, přičemž polymer obsa40 huje polyalkylenglykolovou část.
  21. 21. Protein podle nároku 20, kde polymer je navázán na N-konec proteinu.
  22. 22. Protein podle kteréhokoliv z nároků 17 až 21, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci
    45 IFN-beta-1 a obsahující aminokyseliny 18 až 183 ze sekvence id. č. 2.
  23. 23. Protein podle kteréhokoliv z nároků 17 až 22, který je glykosylovaný.
  24. 24. Protein podle kteréhokoliv z nároků 17 až 23, který obsahuje polyethylenglykol.
  25. 25. Protein podle kteréhokoliv z nároků 17 až 23, kde polymer je polyethylenglykol.
  26. 26. Protein podle kteréhokoliv z nároků 17 až 23, kde polymer má molekulovou hmotnost
    10 000 až 40 000 daltonů.
    -49CZ 299164 B6
  27. 27. Protein podle nároku 21, který obsahuje sekvenci aminokyselin IFN-beta-la obsahující aminokyseliny 18 až 183 ze sekvence id. č. 2, přičemž protein je glykosylován, polymer obsahuje polyethylenglykol, polymer je navázán na aminoskupinu proteinu a polymer má molekulovou
    5 hmotnost 10 000 až 40 000 daltonů.
  28. 28. Farmaceutický přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje kompozici podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7.
    ío
  29. 29. Farmaceutický přípravek, vy zn ač u j í cí se tí m , že obsahuje protein podle kteréhokoliv z nároků 17 až 27.
  30. 30. Farmaceutický přípravek podle nároku 29, vyznačující se tím, že obsahuje protein podle nároku 27.
  31. 31. Použití kompozice podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7 pro výrobu farmaceutického přípravku.
  32. 32. Použití proteinu podle kteréhokoliv z nároků 17 až 27 pro výrobu farmaceutického příprav20 ku.
  33. 33. Použití podle nároku 32, kdy se užije protein podle nároku 21 pro výrobu farmaceutického přípravku.
    25
  34. 34. Použití podle nároku 32, kdy se užije protein podle nároku 27 pro výrobu farmaceutického přípravku.
  35. 35. Použití podle kteréhokoliv z nároků 31 až 34, kdy farmaceutický přípravek je určen pro léčení nádorů a rakoviny, autoimunitních poruch, virových onemocnění a angiogenních onemocnění.
  36. 36. Použití podle kteréhokoliv z nároků 31 až 34, kdy farmaceutický přípravek je určen pro léčení roztroušené sklerózy mozkomíšní.
  37. 37. Způsob přípravy proteinu podle nároku 19, vyznačující se tím, že zahrnuje krok, 35 kdy protein reaguje s polymerem, který se nevyskytuje v přírodě a který obsahuje terminální aldehydovou část, v podmínkách reduktivní alkylace.
  38. 38. Způsob podle nároku37, vy zn ač uj í cí se tí m , že protein obsahuje sekvenci aminokyselin IFN-beta-la uvedenou jako sekvence id. č. 2.
CZ20011329A 1998-10-16 1999-10-15 Farmaceutická kompozice obsahující glykosylovaný interferon-beta-1a navázaný na polymer CZ299164B6 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US10457298P 1998-10-16 1998-10-16
US12016199P 1999-02-16 1999-02-16

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ20011329A3 CZ20011329A3 (cs) 2001-09-12
CZ299164B6 true CZ299164B6 (cs) 2008-05-07

Family

ID=26801696

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20011329A CZ299164B6 (cs) 1998-10-16 1999-10-15 Farmaceutická kompozice obsahující glykosylovaný interferon-beta-1a navázaný na polymer

Country Status (30)

Country Link
US (5) US6962978B2 (cs)
EP (4) EP1121156B1 (cs)
JP (5) JP4616478B2 (cs)
KR (1) KR100630849B1 (cs)
CN (2) CN1329082C (cs)
AT (1) ATE318149T1 (cs)
AU (1) AU762616B2 (cs)
BR (1) BRPI9915542C1 (cs)
CA (1) CA2345138C (cs)
CY (2) CY1105022T1 (cs)
CZ (1) CZ299164B6 (cs)
DE (1) DE69930015T2 (cs)
DK (2) DK1656952T3 (cs)
EA (1) EA004789B9 (cs)
EE (2) EE05201B1 (cs)
ES (4) ES2630278T3 (cs)
HK (1) HK1042434B (cs)
HU (1) HU229888B1 (cs)
IL (2) IL142282A0 (cs)
IS (1) IS2926B (cs)
LT (2) LT2599503T (cs)
NO (1) NO20011860L (cs)
NZ (1) NZ510689A (cs)
PL (1) PL206536B1 (cs)
PT (2) PT1656952E (cs)
SG (2) SG2008070138A (cs)
SI (2) SI1121156T1 (cs)
SK (1) SK287918B6 (cs)
TR (1) TR200101086T2 (cs)
WO (1) WO2000023114A2 (cs)

Families Citing this family (104)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL142282A0 (en) * 1998-10-16 2002-03-10 Biogen Inc Compositions containing polymer conjugates of interferon-beta-1a
HK1042098B (zh) * 1998-10-16 2009-10-30 拜奥根Idec马萨诸塞公司 干扰素-β融合蛋白及用途
KR20020034181A (ko) * 1999-08-27 2002-05-08 맥시겐 에이피에스 새로운 인터페론 베타-유사 분자
US7144574B2 (en) 1999-08-27 2006-12-05 Maxygen Aps Interferon β variants and conjugates
US7431921B2 (en) 1999-08-27 2008-10-07 Maxygen Aps Interferon beta-like molecules
US6531122B1 (en) 1999-08-27 2003-03-11 Maxygen Aps Interferon-β variants and conjugates
US20030211094A1 (en) 2001-06-26 2003-11-13 Nelsestuen Gary L. High molecular weight derivatives of vitamin k-dependent polypeptides
AU2002212107A1 (en) * 2000-11-02 2002-05-15 Maxygen Aps New multimeric interferon beta polypeptides
WO2002074806A2 (en) 2001-02-27 2002-09-26 Maxygen Aps New interferon beta-like molecules
US6887462B2 (en) * 2001-04-09 2005-05-03 Chiron Corporation HSA-free formulations of interferon-beta
US7696163B2 (en) 2001-10-10 2010-04-13 Novo Nordisk A/S Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
EP2305314B1 (en) * 2001-10-10 2015-12-23 ratiopharm GmbH Remodelling and glycoconjugation of antibodies
US7157277B2 (en) 2001-11-28 2007-01-02 Neose Technologies, Inc. Factor VIII remodeling and glycoconjugation of Factor VIII
US7173003B2 (en) 2001-10-10 2007-02-06 Neose Technologies, Inc. Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF
US7214660B2 (en) 2001-10-10 2007-05-08 Neose Technologies, Inc. Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
JP2005526151A (ja) * 2002-01-18 2005-09-02 バイオゲン アイデック エムエー インク． 生物学的に活性な化合物の結合のための部分を有するポリアルキレングリコール
WO2004020468A2 (en) * 2002-08-28 2004-03-11 Maxygen Aps Interferon beta-like molecules for treatment of cancer
EP1539960B1 (en) 2002-09-09 2010-04-28 Hanall Pharmaceutical Co., Ltd. Protease-resistant modified interferon alpha polypeptides
CA2500189A1 (en) * 2002-09-27 2004-04-08 Biogen Idec Ma Inc. Therapies for chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy using interferon-.beta.
US20040062748A1 (en) * 2002-09-30 2004-04-01 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
US8129330B2 (en) 2002-09-30 2012-03-06 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
US9125880B2 (en) * 2002-12-26 2015-09-08 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates of interferon-beta with enhanced biological potency
NZ541122A (en) * 2002-12-26 2008-09-26 Mountain View Pharmaceuticals Polymer conjugates of cytokines, chemokines, growth factors, polypeptide hormones and antagonists thereof with preserved receptor-binding activity
WO2004083258A2 (en) 2003-03-14 2004-09-30 Neose Technologies Inc. Branched water-soluble polymers and their conjugates
US20050079155A1 (en) * 2003-03-20 2005-04-14 Xencor, Inc. Generating protein pro-drugs using reversible PPG linkages
CA2530725A1 (en) * 2003-03-28 2004-10-07 Biopolymed Inc. Biologically active material conjugated with biocompatible polymer with 1:1 complex, preparation method thereof and pharmaceutical composition comprising the same
US7691603B2 (en) 2003-04-09 2010-04-06 Novo Nordisk A/S Intracellular formation of peptide conjugates
SG155777A1 (en) 2003-04-09 2009-10-29 Neose Technologies Inc Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
US8791070B2 (en) 2003-04-09 2014-07-29 Novo Nordisk A/S Glycopegylated factor IX
US20070072303A1 (en) * 2003-05-21 2007-03-29 Ares Trading S.A. Method of chromatographic analysis of a protein solution
WO2005012484A2 (en) 2003-07-25 2005-02-10 Neose Technologies, Inc. Antibody-toxin conjugates
CA2536643C (en) * 2003-08-25 2013-11-12 Toray Industries, Inc. Interferon-.beta. complex
US20080305992A1 (en) 2003-11-24 2008-12-11 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin
US20060040856A1 (en) 2003-12-03 2006-02-23 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated factor IX
EP1765853B1 (en) 2004-01-08 2015-10-28 ratiopharm GmbH O-linked glycosylation of G-CSF peptides
GB2426521A (en) * 2004-02-02 2006-11-29 Ambrx Inc Modified human four helical bundle polypeptides and their uses
US20090214472A1 (en) * 2004-03-01 2009-08-27 Enzon Pharmaceuticals Inc. Interferon-beta polymer conjugates
WO2005112911A2 (en) * 2004-05-21 2005-12-01 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for treating myelin deficiency disorders
JP2008509889A (ja) * 2004-06-30 2008-04-03 イージェン コーポレーション ペグ化インターフェロンα−１ｂ
US20080300173A1 (en) 2004-07-13 2008-12-04 Defrees Shawn Branched Peg Remodeling and Glycosylation of Glucagon-Like Peptides-1 [Glp-1]
WO2009100255A2 (en) 2008-02-08 2009-08-13 Ambrx, Inc. Modified leptin polypeptides and their uses
US8268967B2 (en) 2004-09-10 2012-09-18 Novo Nordisk A/S Glycopegylated interferon α
PL2586456T3 (pl) 2004-10-29 2016-07-29 Ratiopharm Gmbh Remodeling i glikopegilacja czynnika wzrostu fibroblastów (FGF)
EP2514757A3 (en) 2005-01-10 2014-03-05 ratiopharm GmbH Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor
EP2386571B1 (en) 2005-04-08 2016-06-01 ratiopharm GmbH Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants
JP5216580B2 (ja) 2005-05-25 2013-06-19 ノヴォ ノルディスク アー／エス グリコペグ化第ｉｘ因子
US20070105755A1 (en) 2005-10-26 2007-05-10 Neose Technologies, Inc. One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides
US20070092486A1 (en) * 2005-10-21 2007-04-26 Avigenics, Inc. Glycolated and glycosylated poultry derived therapeutic proteins
US20090048440A1 (en) 2005-11-03 2009-02-19 Neose Technologies, Inc. Nucleotide Sugar Purification Using Membranes
WO2007057436A2 (en) * 2005-11-18 2007-05-24 Ares Trading S.A. Interferon in influenza
JP2009525946A (ja) 2005-12-20 2009-07-16 デューク・ユニヴァーシティ 増強された薬理学的性質を有する活性物質を送達するための方法および組成物
CN100475270C (zh) * 2006-01-20 2009-04-08 清华大学 一种治疗肿瘤的药物及其应用
US20080038224A1 (en) * 2006-03-28 2008-02-14 Thierry Guyon Modified interferon-beta (IFN-beta) polypeptides
US7985839B2 (en) 2006-03-31 2011-07-26 Baxter International Inc. Factor VIII polymer conjugates
US7645860B2 (en) 2006-03-31 2010-01-12 Baxter Healthcare S.A. Factor VIII polymer conjugates
US7982010B2 (en) 2006-03-31 2011-07-19 Baxter International Inc. Factor VIII polymer conjugates
WO2007126808A1 (en) 2006-03-31 2007-11-08 Baxter International Inc Pegylated factor viii
US8637325B2 (en) * 2009-02-16 2014-01-28 University Of Wyoming Method and apparatus for pyrolysis-induced cleavage in peptides and proteins
US20080274958A1 (en) 2006-07-21 2008-11-06 Neose Technologies, Inc. Glycosylation of peptides via o-linked glycosylation sequences
WO2008025856A2 (en) 2006-09-01 2008-03-06 Novo Nordisk Health Care Ag Modified glycoproteins
JP2010503630A (ja) 2006-09-15 2010-02-04 クレアビリス・セラピューティクス・エスピーエー ＨＭＧＢ１のＢｏｘ−ＡおよびＨＭＧＢ１のＢｏｘ−Ａ変異体のポリマー複合体
US8969532B2 (en) 2006-10-03 2015-03-03 Novo Nordisk A/S Methods for the purification of polypeptide conjugates comprising polyalkylene oxide using hydrophobic interaction chromatography
CA2670618C (en) 2006-12-15 2016-10-04 Baxter International Inc. Factor viia- (poly) sialic acid conjugate having prolonged in vivo half-life
WO2008079270A2 (en) * 2006-12-19 2008-07-03 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Coadministration of alpha-fetoprotein and an immunomodulatory agent to treat multiple sclerosis
US9050304B2 (en) 2007-04-03 2015-06-09 Ratiopharm Gmbh Methods of treatment using glycopegylated G-CSF
MX2009011870A (es) 2007-05-02 2009-11-12 Ambrx Inc Polipeptidos de interferon beta modificados y usos de los mismos.
MX2009013259A (es) 2007-06-12 2010-01-25 Novo Nordisk As Proceso mejorado para la produccion de azucares de nucleotidos.
CN101820920B (zh) * 2007-10-09 2014-08-06 宝力泰锐克斯有限公司 新的缀合蛋白质和肽
JP5563475B2 (ja) * 2007-12-20 2014-07-30 メルク セローノ ソシエテ アノニム Ｐｅｇインターフェロン−ベータ製剤
CN103497246B (zh) 2008-02-27 2016-08-10 诺沃—诺迪斯克有限公司 缀合的因子viii分子
ES2525065T3 (es) 2008-04-11 2014-12-17 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Ligadores de seroalbúmina humana y sus conjugados
WO2009129616A1 (en) 2008-04-21 2009-10-29 Tissue Regeneration Therapeutics, Inc. Genetically modified human umbilical cord perivascular cells for prophylaxis against or treatment of biological or chemical agents
JP5680534B2 (ja) 2008-07-23 2015-03-04 イーライ リリー アンド カンパニー 修飾されているウシｇ−ｃｓｆポリペプチドおよびそれらの使用
CN102282168A (zh) 2008-11-18 2011-12-14 梅里麦克制药股份有限公司 人血清白蛋白接头以及其结合物
GB0912485D0 (en) * 2009-07-17 2009-08-26 Polytherics Ltd Improved conjugation method
WO2010127172A2 (en) * 2009-04-30 2010-11-04 Children's Hospital & Research Center At Oakland Chimeric factor h binding proteins (fhbp) and methods of use
JP5908397B2 (ja) * 2009-06-09 2016-04-26 デフィルス、インコーポレイテッドＤｅｆｙｒｕｓ， Ｉｎｃ． 病原体感染を予防又は治療するためのインターフェロン投与
US8642737B2 (en) 2010-07-26 2014-02-04 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
EP2459226B1 (en) 2009-07-27 2016-06-29 Lipoxen Technologies Limited Glycopolysialylation of proteins other than blood coagulation proteins
SG10201401194VA (en) 2009-07-27 2014-07-30 Lipoxen Technologies Ltd Glycopolysialylation of non-blood coagulation proteins
AU2010281453C1 (en) 2009-07-27 2019-08-15 Takeda Pharmaceutical Company Limited Blood coagulation protein conjugates
US8809501B2 (en) 2009-07-27 2014-08-19 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
WO2011087808A1 (en) 2009-12-21 2011-07-21 Ambrx, Inc. Modified bovine somatotropin polypeptides and their uses
BR112012015597A2 (pt) 2009-12-21 2017-01-31 Ambrx Inc peptídeos de somatotropina suínos modificados e seus usos
CN101906213B (zh) * 2010-07-23 2012-12-05 华南理工大学 一种新型的蛋白质糖基化接枝的方法
US20130195799A1 (en) * 2010-08-19 2013-08-01 Peg Biosciences, Inc. Synergistic biomolecule-polymer conjugates
TWI480288B (zh) 2010-09-23 2015-04-11 Lilly Co Eli 牛顆粒細胞群落刺激因子及其變體之調配物
WO2012044684A2 (en) * 2010-10-01 2012-04-05 Biogen Idec Ma Inc. Interferon-beta for use as monotherapy or in combination with other cancer therapies
ES2800983T3 (es) 2010-12-22 2021-01-07 Baxalta GmbH Materiales y métodos para conjugar un derivado de ácido graso soluble en agua con una proteína
PH12014500694B1 (en) 2011-10-01 2020-01-31 Glytech Inc Glycosylated polypeptide and pharmaceutical composition containing same
AU2013226944B2 (en) 2012-02-29 2017-03-23 Toray Industries, Inc. Inhibitory agent for body cavity fluid accumulation
US9345766B2 (en) 2012-08-30 2016-05-24 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Combination therapies comprising anti-ERBB3 agents
JP6368706B2 (ja) 2013-03-29 2018-08-01 株式会社糖鎖工学研究所 シアリル化糖鎖が付加されたポリペプチド
US11759500B2 (en) 2014-07-24 2023-09-19 Abion Inc. PEGylated interferon-beta variant
CN109689087B (zh) 2016-05-13 2023-04-04 奥里尼斯生物科学私人有限公司 靶向性突变干扰素-β及其用途
CA3052523A1 (en) 2017-02-06 2018-08-09 Orionis Biosciences Nv Targeted chimeric proteins and uses thereof
RU2661088C1 (ru) * 2017-05-24 2018-07-11 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр "Институт иммунологии" Федерального медико-биологического агентства России (ФГБУ "ГНЦ Институт иммунологии" ФМБА России) Способ очистки лекарственного средства пролонгированного действия на основе рекомбинантного аналога интерферона бета 1b для лечения рассеянного склероза
KR20200128533A (ko) 2018-02-05 2020-11-13 오리오니스 바이오사이언시즈 인코포레이티드 섬유아세포 결합제 및 이의 용도
RU2739261C1 (ru) * 2019-12-31 2020-12-22 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) Способ количественного определения антипролиферативной активности интерферона-бета человека
US20240199750A1 (en) 2021-03-26 2024-06-20 Innate Pharma Multispecific proteins comprising an nkp46-binding site, a cancer antgienge binding site fused to a cytokine for nk cell engaging
JP2024521405A (ja) 2021-06-09 2024-05-31 イナート・ファルマ・ソシエテ・アノニム Ｎｋｐ４６、サイトカイン受容体、腫瘍抗原およびｃｄ１６ａに結合する多特異性タンパク質
WO2022258691A1 (en) 2021-06-09 2022-12-15 Innate Pharma Multispecific proteins binding to nkg2d, a cytokine receptor, a tumour antigen and cd16a
WO2022258678A1 (en) 2021-06-09 2022-12-15 Innate Pharma Multispecific proteins binding to nkp30, a cytokine receptor, a tumour antigen and cd16a
CN118027176B (zh) * 2024-03-27 2024-12-24 郑春杨 人β2-微球蛋白突变体

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3960830A (en) * 1973-12-06 1976-06-01 Hoechst Aktiengesellschaft Polyalkylene glycols used for the preparation of peptides
US4088538A (en) * 1975-05-30 1978-05-09 Battelle Memorial Institute Reversibly precipitable immobilized enzyme complex and a method for its use
WO1987000056A1 (en) * 1985-06-26 1987-01-15 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation

Family Cites Families (91)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
IL47468A (en) 1975-06-12 1979-05-31 Rehovot Res Prod Process for the cross-linking of proteins using water soluble cross-linking agents
US4002531A (en) 1976-01-22 1977-01-11 Pierce Chemical Company Modifying enzymes with polyethylene glycol and product produced thereby
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4456748A (en) 1981-02-23 1984-06-26 Genentech, Inc. Hybrid human leukocyte interferons
WO1982002715A1 (fr) 1981-02-04 1982-08-19 Sugano Haruo Gene d'interferon (beta)humain
US4414147A (en) 1981-04-17 1983-11-08 Massachusetts Institute Of Technology Methods of decreasing the hydrophobicity of fibroblast and other interferons
EP0098876A1 (en) 1982-01-19 1984-01-25 Cetus Corporation Multiclass hybrid interferons
US5149636A (en) 1982-03-15 1992-09-22 Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method for introducing cloned, amplifiable genes into eucaryotic cells and for producing proteinaceous products
US4695543A (en) 1982-03-23 1987-09-22 Bristol-Myers Company Alpha Interferon GX-1
US6936694B1 (en) 1982-05-06 2005-08-30 Intermune, Inc. Manufacture and expression of large structural genes
US4609546A (en) 1982-06-24 1986-09-02 Japan Chemical Research Co., Ltd. Long-acting composition
US4470461A (en) 1982-09-30 1984-09-11 Phillips Petroleum Company Organic nitro compounds as cosurfactants in enhanced oil recovery processes
US4588585A (en) * 1982-10-19 1986-05-13 Cetus Corporation Human recombinant cysteine depleted interferon-β muteins
GB8334102D0 (en) 1983-12-21 1984-02-01 Searle & Co Interferons with cysteine pattern
DE3572982D1 (en) 1984-03-06 1989-10-19 Takeda Chemical Industries Ltd Chemically modified lymphokine and production thereof
GB8412564D0 (en) 1984-05-17 1984-06-20 Searle & Co Structure and properties
CA1302320C (en) 1984-06-11 1992-06-02 Hideo Niwa Expression of human cromosomal interferon-_ in animal cells
US5231176A (en) 1984-08-27 1993-07-27 Genentech, Inc. Distinct family DNA encoding of human leukocyte interferons
FI90990C (fi) 1984-12-18 1994-04-25 Boehringer Ingelheim Int Rekombinantti-DNA-molekyyli, transformoitu isäntäorganismi ja menetelmä interferonin valmistamiseksi
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4885166A (en) 1985-06-11 1989-12-05 Ciba-Geigy Corporation Hybrid interferons
US4766106A (en) 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4917888A (en) 1985-06-26 1990-04-17 Cetus Corporation Solubilization of immunotoxins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4935233A (en) 1985-12-02 1990-06-19 G. D. Searle And Company Covalently linked polypeptide cell modulators
JP2514950B2 (ja) 1986-03-10 1996-07-10 エフ・ホフマン―ラ ロシユ アーゲー 化学修飾蛋白質，その製造法および中間体
JPS63152393A (ja) 1986-07-03 1988-06-24 Takeda Chem Ind Ltd グリコシル誘導体
US5183746A (en) 1986-10-27 1993-02-02 Schering Aktiengesellschaft Formulation processes for pharmaceutical compositions of recombinant β-
US4894226A (en) 1986-11-14 1990-01-16 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polyproline conjugation
US5004605A (en) 1987-12-10 1991-04-02 Cetus Corporation Low pH pharmaceutical compositions of recombinant β-interferon
US4904584A (en) 1987-12-23 1990-02-27 Genetics Institute, Inc. Site-specific homogeneous modification of polypeptides
US5135919A (en) 1988-01-19 1992-08-04 Children's Medical Center Corporation Method and a pharmaceutical composition for the inhibition of angiogenesis
US4847325A (en) 1988-01-20 1989-07-11 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
US4847625A (en) * 1988-02-16 1989-07-11 Ford Aerospace Corporation Wideband, aperture-coupled microstrip antenna
CA1340810C (en) 1988-03-31 1999-11-02 Motoo Yamasaki Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor
GB8824591D0 (en) 1988-10-20 1988-11-23 Royal Free Hosp School Med Fractionation process
JPH04502011A (ja) 1988-11-23 1992-04-09 ジェネンテク，インコーポレイテッド ポリペプチド誘導体
CA2006596C (en) 1988-12-22 2000-09-05 Rika Ishikawa Chemically-modified g-csf
US5116964A (en) * 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US5166322A (en) * 1989-04-21 1992-11-24 Genetics Institute Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof
US5286637A (en) 1989-08-07 1994-02-15 Debiopharm, S.A. Biologically active drug polymer derivatives and method for preparing same
JPH04218000A (ja) 1990-02-13 1992-08-07 Kirin Amgen Inc 修飾ポリペプチド
US5252714A (en) 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
DE69233069T2 (de) 1991-03-15 2003-11-27 Amgen Inc., Thousand Oaks Pegylation von polypeptiden
US5595732A (en) 1991-03-25 1997-01-21 Hoffmann-La Roche Inc. Polyethylene-protein conjugates
AU2147192A (en) 1991-06-28 1993-01-25 Genentech Inc. Method of stimulating immune response using growth hormone
US5281698A (en) 1991-07-23 1994-01-25 Cetus Oncology Corporation Preparation of an activated polymer ester for protein conjugation
AU3423293A (en) 1991-12-19 1993-07-19 Baylor College Of Medicine Pva or peg conjugates of peptides for epitope-specific immunosuppression
ZA933926B (en) 1992-06-17 1994-01-03 Amgen Inc Polyoxymethylene-oxyethylene copolymers in conjuction with blomolecules
US5382657A (en) 1992-08-26 1995-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Peg-interferon conjugates
WO1994005332A2 (en) 1992-09-01 1994-03-17 Berlex Laboratories, Inc. Glycolation of glycosylated macromolecules
US5306344A (en) * 1992-12-02 1994-04-26 Edward C. Levy Company Mixture of portland cement concrete materials for freeze/thaw resistance
US5298410A (en) 1993-02-25 1994-03-29 Sterling Winthrop Inc. Lyophilized formulation of polyethylene oxide modified proteins with increased shelf-life
US5359030A (en) 1993-05-10 1994-10-25 Protein Delivery, Inc. Conjugation-stabilized polypeptide compositions, therapeutic delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same
US5681811A (en) 1993-05-10 1997-10-28 Protein Delivery, Inc. Conjugation-stabilized therapeutic agent compositions, delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same
US5874075A (en) 1993-10-06 1999-02-23 Amgen Inc. Stable protein: phospholipid compositions and methods
US5641656A (en) 1993-10-22 1997-06-24 University Of Connecticut Nucleic acids encoding avian interferon (IFN) proteins and recombinant methods using them
US5605976A (en) 1995-05-15 1997-02-25 Enzon, Inc. Method of preparing polyalkylene oxide carboxylic acids
US5643575A (en) 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
DK0730470T3 (da) 1993-11-10 2002-06-03 Enzon Inc Forbedrede interferonpolymerkonjugater
US5951974A (en) 1993-11-10 1999-09-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates
DE69534676T2 (de) 1994-02-08 2006-08-17 Amgen Inc., Thousand Oaks Orale Verabreichung von chemisch modifizierten Proteinen
US5545723A (en) 1994-03-15 1996-08-13 Biogen Inc. Muteins of IFN-β
US5639725A (en) 1994-04-26 1997-06-17 Children's Hospital Medical Center Corp. Angiostatin protein
GB9415379D0 (en) 1994-07-29 1994-09-21 Smithkline Beecham Plc Novel compounds
US5824784A (en) 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
US5738846A (en) 1994-11-10 1998-04-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates and process for preparing the same
MX9704137A (es) 1994-12-07 1997-09-30 Novo Nordisk As Polipeptidos de alergenicidad reducida.
US5672662A (en) 1995-07-07 1997-09-30 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications
US5702717A (en) 1995-10-25 1997-12-30 Macromed, Inc. Thermosensitive biodegradable polymers based on poly(ether-ester)block copolymers
US5908621A (en) 1995-11-02 1999-06-01 Schering Corporation Polyethylene glycol modified interferon therapy
US5723125A (en) 1995-12-28 1998-03-03 Tanox Biosystems, Inc. Hybrid with interferon-alpha and an immunoglobulin Fc linked through a non-immunogenic peptide
US5747639A (en) 1996-03-06 1998-05-05 Amgen Boulder Inc. Use of hydrophobic interaction chromatography to purify polyethylene glycols
EP0921817B1 (en) 1997-01-29 2001-03-28 PolyMASC Pharmaceuticals plc Pegylation process
US5990237A (en) 1997-05-21 1999-11-23 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) aldehyde hydrates and related polymers and applications in modifying amines
NZ502375A (en) 1997-07-14 2001-11-30 Bolder Biotechnology Inc The addition of non-natural cysteine derivatives to cause the protein to act as antagonists of the GH family
US6180095B1 (en) 1997-12-17 2001-01-30 Enzon, Inc. Polymeric prodrugs of amino- and hydroxyl-containing bioactive agents
US5981709A (en) 1997-12-19 1999-11-09 Enzon, Inc. α-interferon-polymer-conjugates having enhanced biological activity and methods of preparing the same
US5985263A (en) 1997-12-19 1999-11-16 Enzon, Inc. Substantially pure histidine-linked protein polymer conjugates
US5965119A (en) 1997-12-30 1999-10-12 Enzon, Inc. Trialkyl-lock-facilitated polymeric prodrugs of amino-containing bioactive agents
ATE268609T1 (de) 1998-03-12 2004-06-15 Nektar Therapeutics Al Corp Polyethylenglycolderivate mit benachbarten reaktiven gruppen
ATE275422T1 (de) * 1998-04-28 2004-09-15 Applied Research Systems Konjugate aus polyole und beta-interferon
US6703381B1 (en) 1998-08-14 2004-03-09 Nobex Corporation Methods for delivery therapeutic compounds across the blood-brain barrier
HK1042098B (zh) 1998-10-16 2009-10-30 拜奥根Idec马萨诸塞公司 干扰素-β融合蛋白及用途
IL142282A0 (en) * 1998-10-16 2002-03-10 Biogen Inc Compositions containing polymer conjugates of interferon-beta-1a
US7144574B2 (en) 1999-08-27 2006-12-05 Maxygen Aps Interferon β variants and conjugates
US6531122B1 (en) 1999-08-27 2003-03-11 Maxygen Aps Interferon-β variants and conjugates
KR20020034181A (ko) * 1999-08-27 2002-05-08 맥시겐 에이피에스 새로운 인터페론 베타-유사 분자
ATE317868T1 (de) 1999-12-22 2006-03-15 Nektar Therapeutics Al Corp Sterisch gehinderte derivate von wasserlöslichen polymeren
US9506008B2 (en) 2013-12-23 2016-11-29 Exxonmobil Research And Engineering Company Method for improving engine fuel efficiency

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3960830A (en) * 1973-12-06 1976-06-01 Hoechst Aktiengesellschaft Polyalkylene glycols used for the preparation of peptides
US4088538A (en) * 1975-05-30 1978-05-09 Battelle Memorial Institute Reversibly precipitable immobilized enzyme complex and a method for its use
WO1987000056A1 (en) * 1985-06-26 1987-01-15 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation

Also Published As

Publication number Publication date
EP2260872A3 (en) 2011-04-27
EA200100446A1 (ru) 2001-10-22
EP2599503A2 (en) 2013-06-05
WO2000023114A2 (en) 2000-04-27
CN1329082C (zh) 2007-08-01
SI1121156T1 (sl) 2006-08-31
PT1121156E (pt) 2006-05-31
PL347968A1 (en) 2002-04-22
EA004789B9 (ru) 2017-05-31
JP2002527491A (ja) 2002-08-27
EP1121156A2 (en) 2001-08-08
AU762616B2 (en) 2003-07-03
BR9915542B1 (pt) 2016-06-07
JP2011093937A (ja) 2011-05-12
US20030021765A1 (en) 2003-01-30
NO20011860D0 (no) 2001-04-11
EP2260872A2 (en) 2010-12-15
CA2345138A1 (en) 2000-04-27
DK1121156T3 (da) 2006-06-06
AU1446500A (en) 2000-05-08
HK1089393A1 (en) 2006-12-01
HK1042434B (zh) 2008-01-25
ATE318149T1 (de) 2006-03-15
CY1105022T1 (el) 2010-03-03
JP2007063283A (ja) 2007-03-15
CA2345138C (en) 2009-12-15
ES2630278T3 (es) 2017-08-21
CN1323225A (zh) 2001-11-21
SG2008070138A (en) 2017-08-30
SK287918B6 (sk) 2012-03-02
WO2000023114A3 (en) 2000-09-28
EE200700058A (et) 2008-02-15
EE04967B1 (et) 2008-02-15
IS2926B (is) 2015-09-15
CZ20011329A3 (cs) 2001-09-12
JP4616478B2 (ja) 2011-01-19
EP1656952A3 (en) 2006-11-29
DE69930015T2 (de) 2006-10-12
JP2011026329A (ja) 2011-02-10
US20090104150A1 (en) 2009-04-23
BRPI9915542C1 (pt) 2021-05-25
EP2260872B1 (en) 2017-08-30
DE69930015D1 (de) 2006-04-27
JP5863865B2 (ja) 2016-02-17
LTC2599503I2 (lt) 2019-06-25
IS5913A (is) 2001-03-30
LT2599503T (lt) 2017-06-26
US20070098688A1 (en) 2007-05-03
SI1656952T1 (sl) 2014-04-30
EP2599503A3 (en) 2013-07-24
EP1656952A2 (en) 2006-05-17
NO20011860L (no) 2001-06-15
HK1042434A1 (en) 2002-08-16
CN101062419B (zh) 2016-06-29
DK1656952T3 (da) 2014-01-20
NZ510689A (en) 2003-07-25
SK5062001A3 (en) 2002-01-07
JP2014129420A (ja) 2014-07-10
CY1115125T1 (el) 2016-12-14
EA004789B1 (ru) 2004-08-26
IL142282A (en) 2007-03-08
US20160250340A1 (en) 2016-09-01
US20150011732A1 (en) 2015-01-08
HUP0200444A2 (en) 2002-06-29
ES2257884T3 (es) 2006-08-01
JP5396358B2 (ja) 2014-01-22
WO2000023114A9 (en) 2001-07-05
LTPA2017030I1 (lt) 2017-10-25
BR9915542B8 (pt) 2017-10-31
US9314534B2 (en) 2016-04-19
ES2653589T3 (es) 2018-02-07
EE05201B1 (et) 2009-08-17
EP2599503B1 (en) 2017-05-17
KR20010103605A (ko) 2001-11-23
SG110047A1 (en) 2005-04-28
EP1121156B1 (en) 2006-02-22
KR100630849B1 (ko) 2006-10-04
US6962978B2 (en) 2005-11-08
HU229888B1 (en) 2014-11-28
PL206536B1 (pl) 2010-08-31
CN101062419A (zh) 2007-10-31
EE200100220A (et) 2002-06-17
EP1656952B1 (en) 2013-12-18
BR9915542A (pt) 2001-08-14
ES2447772T3 (es) 2014-03-12
TR200101086T2 (tr) 2001-08-21
US7446173B2 (en) 2008-11-04
PT1656952E (pt) 2014-02-21
IL142282A0 (en) 2002-03-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5863865B2 (ja) インターフェロン−β−１ａのポリマー結合体および使用
JP2002527491A5 (cs)
CZ300762B6 (cs) Fúzní proteiny interferonu-beta-1a a jejich použití
MXPA01003791A (es) Conjugados polimericos de interferon beta - 1a y usos de los mismos
HK1089393B (en) Polyalkylene glycol conjugates of interferon beta-1a and uses thereof
HK1181645A (en) Polymer conjugates of interferon beta-1a and uses thereof
HK1150963A (en) Polymer conjugates of interferon beta-1a and uses thereof
HK1181645B (en) Polymer conjugates of interferon beta-1a and uses thereof
HK1150963B (en) Polymer conjugates of interferon beta-1a and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
MK4A Patent expired

Effective date: 20191015