CZ300762B6 - Fúzní proteiny interferonu-beta-1a a jejich použití - Google Patents
Fúzní proteiny interferonu-beta-1a a jejich použití Download PDFInfo
- Publication number
- CZ300762B6 CZ300762B6 CZ20011330A CZ20011330A CZ300762B6 CZ 300762 B6 CZ300762 B6 CZ 300762B6 CZ 20011330 A CZ20011330 A CZ 20011330A CZ 20011330 A CZ20011330 A CZ 20011330A CZ 300762 B6 CZ300762 B6 CZ 300762B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- beta
- interferon
- ifn
- sequence
- polypeptide
- Prior art date
Links
- 108010005716 Interferon beta-1a Proteins 0.000 title claims abstract description 128
- 229960004461 interferon beta-1a Drugs 0.000 title claims abstract description 119
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title description 86
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 title description 85
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims abstract description 96
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 84
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 75
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 72
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 32
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims abstract description 27
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims abstract description 27
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 24
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 21
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 20
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 claims abstract description 5
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 claims abstract description 5
- 206010038933 Retinopathy of prematurity Diseases 0.000 claims abstract description 5
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 claims abstract description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 5
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 claims abstract description 4
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 claims abstract description 4
- 208000024893 Acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 claims abstract description 3
- 208000014697 Acute lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 claims abstract description 3
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims abstract description 3
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 3
- 206010011017 Corneal graft rejection Diseases 0.000 claims abstract description 3
- 206010012689 Diabetic retinopathy Diseases 0.000 claims abstract description 3
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 claims abstract description 3
- 208000002454 Nasopharyngeal Carcinoma Diseases 0.000 claims abstract description 3
- 206010061306 Nasopharyngeal cancer Diseases 0.000 claims abstract description 3
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 claims abstract description 3
- 206010037742 Rabies Diseases 0.000 claims abstract description 3
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 claims abstract description 3
- 201000011066 hemangioma Diseases 0.000 claims abstract description 3
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 claims abstract description 3
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 claims abstract description 3
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 claims abstract description 3
- 208000002780 macular degeneration Diseases 0.000 claims abstract description 3
- 201000011216 nasopharynx carcinoma Diseases 0.000 claims abstract description 3
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 claims abstract description 3
- 208000010412 Glaucoma Diseases 0.000 claims abstract 2
- 201000003142 neovascular glaucoma Diseases 0.000 claims abstract 2
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 claims description 164
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 claims description 116
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 47
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 38
- 102100026720 Interferon beta Human genes 0.000 claims description 35
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 31
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 24
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 7
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 7
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 6
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 6
- -1 alkyl glycol Chemical compound 0.000 claims description 5
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 208000013058 Weber syndrome Diseases 0.000 claims description 2
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 claims description 2
- 201000007293 brain stem infarction Diseases 0.000 claims description 2
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 claims description 2
- 208000005107 Premature Birth Diseases 0.000 claims 1
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol Natural products OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 abstract description 49
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 17
- 201000010893 malignant breast melanoma Diseases 0.000 abstract description 2
- 208000020029 respiratory tract infectious disease Diseases 0.000 abstract description 2
- 201000008275 breast carcinoma Diseases 0.000 abstract 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 abstract 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 117
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 100
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 90
- 229960001388 interferon-beta Drugs 0.000 description 90
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 88
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 81
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 79
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 68
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 50
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 49
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 46
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 42
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 41
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 40
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 39
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 37
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 36
- 230000001028 anti-proliverative effect Effects 0.000 description 35
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 35
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 31
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 30
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 30
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 30
- 101001054334 Homo sapiens Interferon beta Proteins 0.000 description 28
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 28
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 28
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 28
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 28
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 28
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 27
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 27
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 27
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 26
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 25
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 25
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 25
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 24
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 24
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 24
- MGSVBZIBCCKGCY-ZLUOBGJFSA-N Asp-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O MGSVBZIBCCKGCY-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 23
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 23
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 23
- PURRNJBBXDDWLX-ZDLURKLDSA-N Ser-Thr-Gly Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)NCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N)O PURRNJBBXDDWLX-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 22
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 22
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 21
- AJHCSUXXECOXOY-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)CN)C(O)=O)=CNC2=C1 AJHCSUXXECOXOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- AUTNXSQEVVHSJK-YVNDNENWSA-N Glu-Glu-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O AUTNXSQEVVHSJK-YVNDNENWSA-N 0.000 description 20
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- MEFILNJXAVSUTO-JXUBOQSCSA-N Ala-Leu-Thr Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O MEFILNJXAVSUTO-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 19
- FRBAHXABMQXSJQ-FXQIFTODSA-N Arg-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FRBAHXABMQXSJQ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 19
- 108010071324 Livagen Proteins 0.000 description 19
- BQVUABVGYYSDCJ-UHFFFAOYSA-N Nalpha-L-Leucyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(N)CC(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 BQVUABVGYYSDCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 19
- QCTFKEJEIMPOLW-JURCDPSOSA-N Ala-Ile-Phe Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 QCTFKEJEIMPOLW-JURCDPSOSA-N 0.000 description 18
- XLZCLJRGGMBKLR-PCBIJLKTSA-N Asn-Ile-Phe Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XLZCLJRGGMBKLR-PCBIJLKTSA-N 0.000 description 18
- RNMNYMDTESKEAJ-KKUMJFAQSA-N His-Leu-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 RNMNYMDTESKEAJ-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 18
- HDHQQEDVWQGBEE-DCAQKATOSA-N Leu-Met-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O HDHQQEDVWQGBEE-DCAQKATOSA-N 0.000 description 18
- ZQOOYCZQENFIMC-STQMWFEESA-N Tyr-His Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZQOOYCZQENFIMC-STQMWFEESA-N 0.000 description 18
- 108010044348 lysyl-glutamyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 18
- 108010018625 phenylalanylarginine Proteins 0.000 description 18
- PHHRSPBBQUFULD-UWVGGRQHSA-N Arg-Gly-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N PHHRSPBBQUFULD-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 17
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 17
- CZCSUZMIRKFFFA-CIUDSAMLSA-N Leu-Ala-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O CZCSUZMIRKFFFA-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 17
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- MFFOYNGMOYFPBD-DCAQKATOSA-N Asn-Arg-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O MFFOYNGMOYFPBD-DCAQKATOSA-N 0.000 description 16
- RGJKYNUINKGPJN-RWRJDSDZSA-N Glu-Thr-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N RGJKYNUINKGPJN-RWRJDSDZSA-N 0.000 description 16
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 16
- WIDZHJTYKYBLSR-DCAQKATOSA-N Leu-Glu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O WIDZHJTYKYBLSR-DCAQKATOSA-N 0.000 description 16
- SKRGVGLIRUGANF-AVGNSLFASA-N Lys-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O SKRGVGLIRUGANF-AVGNSLFASA-N 0.000 description 16
- JQAWYCUUFIMTHE-WLTAIBSBSA-N Thr-Gly-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O JQAWYCUUFIMTHE-WLTAIBSBSA-N 0.000 description 16
- AEMBWNDIEFEPTH-UHFFFAOYSA-N n-tert-butyl-n-ethylnitrous amide Chemical compound CCN(N=O)C(C)(C)C AEMBWNDIEFEPTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- QXDXIXFSFHUYAX-MNXVOIDGSA-N Glu-Ile-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O QXDXIXFSFHUYAX-MNXVOIDGSA-N 0.000 description 15
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 15
- LLSUNJYOSCOOEB-GUBZILKMSA-N Lys-Glu-Asp Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O LLSUNJYOSCOOEB-GUBZILKMSA-N 0.000 description 15
- AIRZWUMAHCDDHR-KKUMJFAQSA-N Lys-Leu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O AIRZWUMAHCDDHR-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 15
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 15
- OJQJUQUBJGTCRY-WFBYXXMGSA-N Cys-Ala-Trp Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N OJQJUQUBJGTCRY-WFBYXXMGSA-N 0.000 description 14
- ZOXBSICWUDAOHX-GUBZILKMSA-N Glu-Asn-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O ZOXBSICWUDAOHX-GUBZILKMSA-N 0.000 description 14
- 101000852865 Homo sapiens Interferon alpha/beta receptor 2 Proteins 0.000 description 14
- HZYHBDVRCBDJJV-HAFWLYHUSA-N Ile-Asn Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O HZYHBDVRCBDJJV-HAFWLYHUSA-N 0.000 description 14
- RMJWFINHACYKJI-SIUGBPQLSA-N Ile-Tyr-Glu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N RMJWFINHACYKJI-SIUGBPQLSA-N 0.000 description 14
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 14
- 108010079547 glutamylmethionine Proteins 0.000 description 14
- 108010025306 histidylleucine Proteins 0.000 description 14
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 14
- 108010051673 leucyl-glycyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 14
- KWTVWJPNHAOREN-IHRRRGAJSA-N Arg-Asn-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O KWTVWJPNHAOREN-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 13
- GLWFAWNYGWBMOC-SRVKXCTJSA-N Asn-Leu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O GLWFAWNYGWBMOC-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 13
- 102100036718 Interferon alpha/beta receptor 2 Human genes 0.000 description 13
- HBJZFCIVFIBNSV-DCAQKATOSA-N Leu-Arg-Asn Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O HBJZFCIVFIBNSV-DCAQKATOSA-N 0.000 description 13
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 13
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 13
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 13
- FSXRLASFHBWESK-UHFFFAOYSA-N dipeptide phenylalanyl-tyrosine Natural products C=1C=C(O)C=CC=1CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 FSXRLASFHBWESK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 13
- 101000959820 Homo sapiens Interferon alpha-1/13 Proteins 0.000 description 12
- 108010005714 Interferon beta-1b Proteins 0.000 description 12
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 12
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 12
- OVZLLFONXILPDZ-VOAKCMCISA-N Leu-Lys-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O OVZLLFONXILPDZ-VOAKCMCISA-N 0.000 description 12
- UAPZLLPGGOOCRO-IHRRRGAJSA-N Met-Asn-Phe Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)N UAPZLLPGGOOCRO-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 12
- 108010047562 NGR peptide Proteins 0.000 description 12
- FASACHWGQBNSRO-ZEWNOJEFSA-N Tyr-Phe-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)NC(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)N FASACHWGQBNSRO-ZEWNOJEFSA-N 0.000 description 12
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 12
- 241000710188 Encephalomyocarditis virus Species 0.000 description 11
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 description 11
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 description 11
- JPVGHHQGKPQYIL-KBPBESRZSA-N Gly-Phe-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CC=CC=C1 JPVGHHQGKPQYIL-KBPBESRZSA-N 0.000 description 11
- 102100040019 Interferon alpha-1/13 Human genes 0.000 description 11
- JLWZLIQRYCTYBD-IHRRRGAJSA-N Leu-Lys-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O JLWZLIQRYCTYBD-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 11
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 11
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 11
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 11
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 11
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 11
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 11
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 11
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 11
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 11
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 11
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 11
- OTZMRMHZCMZOJZ-SRVKXCTJSA-N Arg-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O OTZMRMHZCMZOJZ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 10
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 10
- OVSKVOOUFAKODB-UWVGGRQHSA-N Gly-Arg-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CCCN=C(N)N OVSKVOOUFAKODB-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 10
- OIARJGNVARWKFP-YUMQZZPRSA-N Leu-Asn-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O OIARJGNVARWKFP-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 10
- ODUQLUADRKMHOZ-JYJNAYRXSA-N Lys-Glu-Tyr Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N)O ODUQLUADRKMHOZ-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 10
- SOAYQFDWEIWPPR-IHRRRGAJSA-N Met-Ser-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O SOAYQFDWEIWPPR-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 10
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- PRONOHBTMLNXCZ-BZSNNMDCSA-N Tyr-Leu-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 PRONOHBTMLNXCZ-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 10
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 10
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 10
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 10
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 10
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 229960003161 interferon beta-1b Drugs 0.000 description 10
- 108010048818 seryl-histidine Proteins 0.000 description 10
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 9
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 9
- FLCMXEFCTLXBTL-DCAQKATOSA-N Lys-Asp-Arg Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N FLCMXEFCTLXBTL-DCAQKATOSA-N 0.000 description 9
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 9
- 238000002832 anti-viral assay Methods 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 9
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 9
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 9
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 9
- 230000006870 function Effects 0.000 description 9
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 9
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 9
- MFMDKJIPHSWSBM-GUBZILKMSA-N Ala-Lys-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O MFMDKJIPHSWSBM-GUBZILKMSA-N 0.000 description 8
- UVTGNSWSRSCPLP-UHFFFAOYSA-N Arg-Tyr Natural products NC(CCNC(=N)N)C(=O)NC(Cc1ccc(O)cc1)C(=O)O UVTGNSWSRSCPLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- LSJQOMAZIKQMTJ-SRVKXCTJSA-N Asn-Phe-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O LSJQOMAZIKQMTJ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 8
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 8
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 8
- MLTRLIITQPXHBJ-BQBZGAKWSA-N Leu-Asn Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O MLTRLIITQPXHBJ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 8
- ATIPDCIQTUXABX-UWVGGRQHSA-N Lys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN ATIPDCIQTUXABX-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 8
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 230000008859 change Effects 0.000 description 8
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 8
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 8
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 8
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 8
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 8
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 7
- 101000852870 Homo sapiens Interferon alpha/beta receptor 1 Proteins 0.000 description 7
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 7
- 102100036714 Interferon alpha/beta receptor 1 Human genes 0.000 description 7
- BQVUABVGYYSDCJ-ZFWWWQNUSA-N Leu-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 BQVUABVGYYSDCJ-ZFWWWQNUSA-N 0.000 description 7
- IUXGJEIKJBYKOO-SRVKXCTJSA-N Ser-Leu-His Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N IUXGJEIKJBYKOO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 7
- AYHSJESDFKREAR-KKUMJFAQSA-N Tyr-Asn-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 AYHSJESDFKREAR-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 7
- FMOSEWZYZPMJAL-KKUMJFAQSA-N Tyr-Glu-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)N FMOSEWZYZPMJAL-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 7
- PMDWYLVWHRTJIW-STQMWFEESA-N Tyr-Gly-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 PMDWYLVWHRTJIW-STQMWFEESA-N 0.000 description 7
- BCOBSVIZMQXKFY-KKUMJFAQSA-N Tyr-Ser-His Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O)N)O BCOBSVIZMQXKFY-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 7
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 7
- 230000001772 anti-angiogenic effect Effects 0.000 description 7
- 229940003504 avonex Drugs 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 7
- 108010055341 glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 7
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 7
- 108010044374 isoleucyl-tyrosine Proteins 0.000 description 7
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 7
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- PNQWAUXQDBIJDY-GUBZILKMSA-N Arg-Glu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O PNQWAUXQDBIJDY-GUBZILKMSA-N 0.000 description 6
- CNBIWSCSSCAINS-UFYCRDLUSA-N Arg-Tyr-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O CNBIWSCSSCAINS-UFYCRDLUSA-N 0.000 description 6
- CNKAZIGBGQIHLL-GUBZILKMSA-N Asp-Arg-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N CNKAZIGBGQIHLL-GUBZILKMSA-N 0.000 description 6
- UCSXXFRXHGUXCQ-SRVKXCTJSA-N Cys-Leu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N UCSXXFRXHGUXCQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 6
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 6
- 108091006020 Fc-tagged proteins Proteins 0.000 description 6
- DAKSMIWQZPHRIB-BZSNNMDCSA-N His-Tyr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O DAKSMIWQZPHRIB-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 6
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 6
- LRKCBIUDWAXNEG-CSMHCCOUSA-N Leu-Thr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O LRKCBIUDWAXNEG-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 6
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 6
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 6
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 6
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 6
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 6
- YLRLHDFMMWDYTK-KKUMJFAQSA-N Tyr-Cys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 YLRLHDFMMWDYTK-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 6
- WYOBRXPIZVKNMF-IRXDYDNUSA-N Tyr-Tyr-Gly Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)NCC(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 WYOBRXPIZVKNMF-IRXDYDNUSA-N 0.000 description 6
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 6
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 6
- 230000002155 anti-virotic effect Effects 0.000 description 6
- 108010052670 arginyl-glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 6
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 6
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 6
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 6
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 6
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 6
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 6
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 6
- AWNAEZICPNGAJK-FXQIFTODSA-N Ala-Met-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O AWNAEZICPNGAJK-FXQIFTODSA-N 0.000 description 5
- SNDBKTFJWVEVPO-WHFBIAKZSA-N Asp-Gly-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SNDBKTFJWVEVPO-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 5
- DONWIPDSZZJHHK-HJGDQZAQSA-N Asp-Lys-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N)O DONWIPDSZZJHHK-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 5
- MWMJCGBSIORNCD-AVGNSLFASA-N Glu-Leu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O MWMJCGBSIORNCD-AVGNSLFASA-N 0.000 description 5
- OCQUNKSFDYDXBG-QXEWZRGKSA-N Gly-Arg-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CCCN=C(N)N OCQUNKSFDYDXBG-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 5
- YKRIXHPEIZUDDY-GMOBBJLQSA-N Ile-Asn-Arg Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N YKRIXHPEIZUDDY-GMOBBJLQSA-N 0.000 description 5
- IIXDMJNYALIKGP-DJFWLOJKSA-N Ile-Asn-His Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N IIXDMJNYALIKGP-DJFWLOJKSA-N 0.000 description 5
- DBXXASNNDTXOLU-MXAVVETBSA-N Ile-Leu-His Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N DBXXASNNDTXOLU-MXAVVETBSA-N 0.000 description 5
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 5
- XWOBNBRUDDUEEY-UWVGGRQHSA-N Leu-His Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CNC=N1 XWOBNBRUDDUEEY-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 5
- HMDDEJADNKQTBR-BZSNNMDCSA-N Leu-His-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O HMDDEJADNKQTBR-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 5
- PBLLTSKBTAHDNA-KBPBESRZSA-N Lys-Gly-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O PBLLTSKBTAHDNA-KBPBESRZSA-N 0.000 description 5
- ODTZHNZPINULEU-KKUMJFAQSA-N Lys-Phe-Asn Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N ODTZHNZPINULEU-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 5
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 5
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 5
- MSHZERMPZKCODG-ACRUOGEOSA-N Phe-Leu-Phe Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 MSHZERMPZKCODG-ACRUOGEOSA-N 0.000 description 5
- JDMKQHSHKJHAHR-UHFFFAOYSA-N Phe-Phe-Leu-Tyr Natural products C=1C=C(O)C=CC=1CC(C(O)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)CC1=CC=CC=C1 JDMKQHSHKJHAHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- FRMKIPSIZSFTTE-HJOGWXRNSA-N Phe-Tyr-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O FRMKIPSIZSFTTE-HJOGWXRNSA-N 0.000 description 5
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 5
- BQBCIBCLXBKYHW-CSMHCCOUSA-N Thr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]([NH3+])[C@@H](C)O BQBCIBCLXBKYHW-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 5
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 5
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 5
- 108010003700 lysyl aspartic acid Proteins 0.000 description 5
- 108010064235 lysylglycine Proteins 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- YYSWCHMLFJLLBJ-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ala-Ser Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YYSWCHMLFJLLBJ-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 4
- CCUAQNUWXLYFRA-IMJSIDKUSA-N Ala-Asn Chemical compound C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC(N)=O CCUAQNUWXLYFRA-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 4
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 4
- OLVIPTLKNSAYRJ-YUMQZZPRSA-N Asn-Gly-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(=O)N)N OLVIPTLKNSAYRJ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 4
- YUELDQUPTAYEGM-XIRDDKMYSA-N Asp-Trp-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N YUELDQUPTAYEGM-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 4
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000011691 Burkitt lymphomas Diseases 0.000 description 4
- UGPCUUWZXRMCIJ-KKUMJFAQSA-N Cys-Tyr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)NC(=O)[C@H](CS)N UGPCUUWZXRMCIJ-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- NJCALAAIGREHDR-WDCWCFNPSA-N Glu-Leu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O NJCALAAIGREHDR-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 4
- QOOFKCCZZWTCEP-AVGNSLFASA-N Glu-Tyr-Cys Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)O QOOFKCCZZWTCEP-AVGNSLFASA-N 0.000 description 4
- VXEFAWJTFAUDJK-AVGNSLFASA-N Glu-Tyr-Ser Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)O VXEFAWJTFAUDJK-AVGNSLFASA-N 0.000 description 4
- IKAIKUBBJHFNBZ-LURJTMIESA-N Gly-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN IKAIKUBBJHFNBZ-LURJTMIESA-N 0.000 description 4
- PCPOYRCAHPJXII-UWVGGRQHSA-N Gly-Lys-Met Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O PCPOYRCAHPJXII-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 4
- WMKXFMUJRCEGRP-SRVKXCTJSA-N His-Asn-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O)N WMKXFMUJRCEGRP-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 4
- QNILDNVBIARMRK-XVYDVKMFSA-N His-Cys-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)N QNILDNVBIARMRK-XVYDVKMFSA-N 0.000 description 4
- DNKDIDZHXZAGRY-HJWJTTGWSA-N Ile-Met-Phe Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)N DNKDIDZHXZAGRY-HJWJTTGWSA-N 0.000 description 4
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 4
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 4
- TYYLDKGBCJGJGW-UHFFFAOYSA-N L-tryptophan-L-tyrosine Natural products C=1NC2=CC=CC=C2C=1CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 TYYLDKGBCJGJGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PVMPDMIKUVNOBD-CIUDSAMLSA-N Leu-Asp-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O PVMPDMIKUVNOBD-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 4
- HQUXQAMSWFIRET-AVGNSLFASA-N Leu-Glu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN HQUXQAMSWFIRET-AVGNSLFASA-N 0.000 description 4
- ZRHDPZAAWLXXIR-SRVKXCTJSA-N Leu-Lys-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O ZRHDPZAAWLXXIR-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 4
- RZXLZBIUTDQHJQ-SRVKXCTJSA-N Leu-Lys-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O RZXLZBIUTDQHJQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 4
- LJBVRCDPWOJOEK-PPCPHDFISA-N Leu-Thr-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O LJBVRCDPWOJOEK-PPCPHDFISA-N 0.000 description 4
- IOQWIOPSKJOEKI-SRVKXCTJSA-N Lys-Ser-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O IOQWIOPSKJOEKI-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 4
- ZOKVLMBYDSIDKG-CSMHCCOUSA-N Lys-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN ZOKVLMBYDSIDKG-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 4
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 4
- WUGMRIBZSVSJNP-UHFFFAOYSA-N N-L-alanyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(N)C)C(O)=O)=CNC2=C1 WUGMRIBZSVSJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010029113 Neovascularisation Diseases 0.000 description 4
- 101100205189 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) leu-5 gene Proteins 0.000 description 4
- QEDMOZUJTGEIBF-FXQIFTODSA-N Ser-Arg-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O QEDMOZUJTGEIBF-FXQIFTODSA-N 0.000 description 4
- VGNYHOBZJKWRGI-CIUDSAMLSA-N Ser-Asn-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO VGNYHOBZJKWRGI-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 4
- VBKBDLMWICBSCY-IMJSIDKUSA-N Ser-Asp Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O VBKBDLMWICBSCY-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 4
- LOKXAXAESFYFAX-CIUDSAMLSA-N Ser-His-Cys Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O)CC1=CN=CN1 LOKXAXAESFYFAX-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 4
- YUJLIIRMIAGMCQ-CIUDSAMLSA-N Ser-Leu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YUJLIIRMIAGMCQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 4
- PQEQXWRVHQAAKS-SRVKXCTJSA-N Ser-Tyr-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CO)N)CC1=CC=C(O)C=C1 PQEQXWRVHQAAKS-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- CUTPSEKWUPZFLV-WISUUJSJSA-N Thr-Cys Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O CUTPSEKWUPZFLV-WISUUJSJSA-N 0.000 description 4
- BMQYVXCPAOLZOK-UHFFFAOYSA-N Trihydroxypropylpterisin Natural products OCC(O)C(O)C1=CN=C2NC(N)=NC(=O)C2=N1 BMQYVXCPAOLZOK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IXEGQBJZDIRRIV-QEJZJMRPSA-N Trp-Asn-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O IXEGQBJZDIRRIV-QEJZJMRPSA-N 0.000 description 4
- WBZOZLNLXVBCNW-LTHWPDAASA-N Trp-Thr-Ile Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O)[C@@H](C)O)=CNC2=C1 WBZOZLNLXVBCNW-LTHWPDAASA-N 0.000 description 4
- SCCKSNREWHMKOJ-SRVKXCTJSA-N Tyr-Asn-Ser Chemical compound N[C@@H](Cc1ccc(O)cc1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SCCKSNREWHMKOJ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 4
- LYERIXUFCYVFFX-GVXVVHGQSA-N Val-Leu-Glu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N LYERIXUFCYVFFX-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010038633 aspartylglutamate Proteins 0.000 description 4
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 4
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 4
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 4
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 108010063718 gamma-glutamylaspartic acid Proteins 0.000 description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 108010078274 isoleucylvaline Proteins 0.000 description 4
- 108010044311 leucyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 201000005296 lung carcinoma Diseases 0.000 description 4
- 108010009298 lysylglutamic acid Proteins 0.000 description 4
- BMQYVXCPAOLZOK-XINAWCOVSA-N neopterin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)C1=CN=C2NC(N)=NC(=O)C2=N1 BMQYVXCPAOLZOK-XINAWCOVSA-N 0.000 description 4
- 108010024607 phenylalanylalanine Proteins 0.000 description 4
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 4
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 4
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 108010060175 trypsinogen activation peptide Proteins 0.000 description 4
- 108010044292 tryptophyltyrosine Proteins 0.000 description 4
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- KLALXKYLOMZDQT-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ser-Asn Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O KLALXKYLOMZDQT-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 3
- SFPRJVVDZNLUTG-OWLDWWDNSA-N Ala-Trp-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O SFPRJVVDZNLUTG-OWLDWWDNSA-N 0.000 description 3
- SLKLLQWZQHXYSV-CIUDSAMLSA-N Asn-Ala-Lys Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O SLKLLQWZQHXYSV-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 3
- OMSMPWHEGLNQOD-UWVGGRQHSA-N Asn-Phe Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 OMSMPWHEGLNQOD-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 3
- RBOBTTLFPRSXKZ-BZSNNMDCSA-N Asn-Phe-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O RBOBTTLFPRSXKZ-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 3
- QNNBHTFDFFFHGC-KKUMJFAQSA-N Asn-Tyr-Lys Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N)O QNNBHTFDFFFHGC-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 3
- OAMLVOVXNKILLQ-BQBZGAKWSA-N Asp-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O OAMLVOVXNKILLQ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 3
- USNJAPJZSGTTPX-XVSYOHENSA-N Asp-Phe-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O USNJAPJZSGTTPX-XVSYOHENSA-N 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 3
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 3
- WXOFKRKAHJQKLT-BQBZGAKWSA-N Cys-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CS WXOFKRKAHJQKLT-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 3
- 108010031111 EBV-encoded nuclear antigen 1 Proteins 0.000 description 3
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 3
- ITYRYNUZHPNCIK-GUBZILKMSA-N Glu-Ala-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O ITYRYNUZHPNCIK-GUBZILKMSA-N 0.000 description 3
- GLWXKFRTOHKGIT-ACZMJKKPSA-N Glu-Asn-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O GLWXKFRTOHKGIT-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 3
- RDPOETHPAQEGDP-ACZMJKKPSA-N Glu-Asp-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O RDPOETHPAQEGDP-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 3
- PAQUJCSYVIBPLC-AVGNSLFASA-N Glu-Asp-Phe Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 PAQUJCSYVIBPLC-AVGNSLFASA-N 0.000 description 3
- KOSRFJWDECSPRO-WDSKDSINSA-N Glu-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-WDSKDSINSA-N 0.000 description 3
- CBEUFCJRFNZMCU-SRVKXCTJSA-N Glu-Met-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O CBEUFCJRFNZMCU-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 3
- MFYLRRCYBBJYPI-JYJNAYRXSA-N Glu-Tyr-Lys Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)O MFYLRRCYBBJYPI-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- MAABHGXCIBEYQR-XVYDVKMFSA-N His-Asn-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)N MAABHGXCIBEYQR-XVYDVKMFSA-N 0.000 description 3
- MMFKFJORZBJVNF-UWVGGRQHSA-N His-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 MMFKFJORZBJVNF-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 3
- HZWWOGWOBQBETJ-CUJWVEQBSA-N His-Thr-Cys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)N)O HZWWOGWOBQBETJ-CUJWVEQBSA-N 0.000 description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DFJJAVZIHDFOGQ-MNXVOIDGSA-N Ile-Glu-Lys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N DFJJAVZIHDFOGQ-MNXVOIDGSA-N 0.000 description 3
- JWBXCSQZLLIOCI-GUBZILKMSA-N Ile-Leu Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C JWBXCSQZLLIOCI-GUBZILKMSA-N 0.000 description 3
- HQEPKOFULQTSFV-JURCDPSOSA-N Ile-Phe-Ala Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)O)N HQEPKOFULQTSFV-JURCDPSOSA-N 0.000 description 3
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 3
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 3
- 102000002227 Interferon Type I Human genes 0.000 description 3
- 108010014726 Interferon Type I Proteins 0.000 description 3
- 108010086140 Interferon alpha-beta Receptor Proteins 0.000 description 3
- 102000007438 Interferon alpha-beta Receptor Human genes 0.000 description 3
- HFKJBCPRWWGPEY-BQBZGAKWSA-N L-arginyl-L-glutamic acid Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O HFKJBCPRWWGPEY-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HGNRJCINZYHNOU-LURJTMIESA-N Lys-Gly Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O HGNRJCINZYHNOU-LURJTMIESA-N 0.000 description 3
- ORVFEGYUJITPGI-IHRRRGAJSA-N Lys-Leu-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN ORVFEGYUJITPGI-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- WKTSCAXSYITIJJ-PCBIJLKTSA-N Phe-Ile-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O WKTSCAXSYITIJJ-PCBIJLKTSA-N 0.000 description 3
- RFCVXVPWSPOMFJ-STQMWFEESA-N Phe-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 RFCVXVPWSPOMFJ-STQMWFEESA-N 0.000 description 3
- IIEOLPMQYRBZCN-SRVKXCTJSA-N Phe-Ser-Cys Chemical compound N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O IIEOLPMQYRBZCN-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 3
- LTAWNJXSRUCFAN-UNQGMJICSA-N Phe-Thr-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O LTAWNJXSRUCFAN-UNQGMJICSA-N 0.000 description 3
- MUJQWSAWLLRJCE-KATARQTJSA-N Ser-Leu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O MUJQWSAWLLRJCE-KATARQTJSA-N 0.000 description 3
- GZSZPKSBVAOGIE-CIUDSAMLSA-N Ser-Lys-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O GZSZPKSBVAOGIE-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 3
- BMKNXTJLHFIAAH-CIUDSAMLSA-N Ser-Ser-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O BMKNXTJLHFIAAH-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 3
- FQPDRTDDEZXCEC-SVSWQMSJSA-N Thr-Ile-Ser Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FQPDRTDDEZXCEC-SVSWQMSJSA-N 0.000 description 3
- BEZTUFWTPVOROW-KJEVXHAQSA-N Thr-Tyr-Arg Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N)O BEZTUFWTPVOROW-KJEVXHAQSA-N 0.000 description 3
- BKVICMPZWRNWOC-RHYQMDGZSA-N Thr-Val-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O BKVICMPZWRNWOC-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 3
- CVIXTAITYJQMPE-LAEOZQHASA-N Val-Glu-Asn Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O CVIXTAITYJQMPE-LAEOZQHASA-N 0.000 description 3
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 108010050025 alpha-glutamyltryptophan Proteins 0.000 description 3
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108010013835 arginine glutamate Proteins 0.000 description 3
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 3
- 108010092854 aspartyllysine Proteins 0.000 description 3
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 3
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 3
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 3
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Natural products O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 3
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 3
- 108010080575 glutamyl-aspartyl-alanine Proteins 0.000 description 3
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 3
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 3
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 3
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 3
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 3
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010073101 phenylalanylleucine Proteins 0.000 description 3
- 108010051242 phenylalanylserine Proteins 0.000 description 3
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 3
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 3
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 3
- JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-(pyridin-2-yldisulfanyl)propanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCSSC1=CC=CC=N1 JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GKSPIZSKQWTXQG-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 4-[1-(pyridin-2-yldisulfanyl)ethyl]benzoate Chemical compound C=1C=C(C(=O)ON2C(CCC2=O)=O)C=CC=1C(C)SSC1=CC=CC=N1 GKSPIZSKQWTXQG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LSLXWOCIIFUZCQ-SRVKXCTJSA-N (2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-3-methyl-1-oxobutyl]amino]-3-methyl-1-oxobutyl]amino]-3-methylbutanoic acid Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O LSLXWOCIIFUZCQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- HKZAAJSTFUZYTO-LURJTMIESA-N (2s)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-aminoacetyl)amino]acetyl]amino]acetyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoic acid Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O HKZAAJSTFUZYTO-LURJTMIESA-N 0.000 description 2
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Substances CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UFBJCMHMOXMLKC-UHFFFAOYSA-N 2,4-dinitrophenol Chemical group OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O UFBJCMHMOXMLKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JUEUYDRZJNQZGR-UHFFFAOYSA-N 2-[[2-[[2-[(2-amino-4-methylpentanoyl)amino]-4-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]-3-phenylpropanoic acid Chemical compound CC(C)CC(N)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JUEUYDRZJNQZGR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DKJPOZOEBONHFS-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ala-Asp Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O DKJPOZOEBONHFS-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 2
- GGNHBHYDMUDXQB-KBIXCLLPSA-N Ala-Glu-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)N GGNHBHYDMUDXQB-KBIXCLLPSA-N 0.000 description 2
- 108010011667 Ala-Phe-Ala Proteins 0.000 description 2
- XRUJOVRWNMBAAA-NHCYSSNCSA-N Ala-Phe-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C)CC1=CC=CC=C1 XRUJOVRWNMBAAA-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 2
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- OZNSCVPYWZRQPY-CIUDSAMLSA-N Arg-Asp-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O OZNSCVPYWZRQPY-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- OOIMKQRCPJBGPD-XUXIUFHCSA-N Arg-Ile-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O OOIMKQRCPJBGPD-XUXIUFHCSA-N 0.000 description 2
- JEOCWTUOMKEEMF-RHYQMDGZSA-N Arg-Leu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O JEOCWTUOMKEEMF-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 2
- 101710115247 Arylsulfatase B Proteins 0.000 description 2
- GFFRWIJAFFMQGM-NUMRIWBASA-N Asn-Glu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O GFFRWIJAFFMQGM-NUMRIWBASA-N 0.000 description 2
- IKLAUGBIDCDFOY-SRVKXCTJSA-N Asn-His-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O IKLAUGBIDCDFOY-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- HNXWVVHIGTZTBO-LKXGYXEUSA-N Asn-Ser-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O HNXWVVHIGTZTBO-LKXGYXEUSA-N 0.000 description 2
- CELPEWWLSXMVPH-CIUDSAMLSA-N Asp-Asp-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CELPEWWLSXMVPH-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- JHFNSBBHKSZXKB-VKHMYHEASA-N Asp-Gly Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O JHFNSBBHKSZXKB-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- JSNWZMFSLIWAHS-HJGDQZAQSA-N Asp-Thr-Leu Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N)O JSNWZMFSLIWAHS-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 2
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 2
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 2
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 2
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 2
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NXTYATMDWQYLGJ-BQBZGAKWSA-N Cys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CS NXTYATMDWQYLGJ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- YXQDRIRSAHTJKM-IMJSIDKUSA-N Cys-Ser Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YXQDRIRSAHTJKM-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 2
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 2
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 2
- TUTIHHSZKFBMHM-WHFBIAKZSA-N Glu-Asn Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O TUTIHHSZKFBMHM-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- FYYSIASRLDJUNP-WHFBIAKZSA-N Glu-Asp Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O FYYSIASRLDJUNP-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- LGYZYFFDELZWRS-DCAQKATOSA-N Glu-Glu-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O LGYZYFFDELZWRS-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- ILWHFUZZCFYSKT-AVGNSLFASA-N Glu-Lys-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O ILWHFUZZCFYSKT-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- ALMBZBOCGSVSAI-ACZMJKKPSA-N Glu-Ser-Asn Chemical compound C(CC(=O)O)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N ALMBZBOCGSVSAI-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 2
- LLEUXCDZPQOJMY-AAEUAGOBSA-N Glu-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)N)C(O)=O)=CNC2=C1 LLEUXCDZPQOJMY-AAEUAGOBSA-N 0.000 description 2
- BPCLDCNZBUYGOD-BPUTZDHNSA-N Glu-Trp-Glu Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)=CNC2=C1 BPCLDCNZBUYGOD-BPUTZDHNSA-N 0.000 description 2
- FUESBOMYALLFNI-VKHMYHEASA-N Gly-Asn Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O FUESBOMYALLFNI-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- GMTXWRIDLGTVFC-IUCAKERBSA-N Gly-Lys-Glu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O GMTXWRIDLGTVFC-IUCAKERBSA-N 0.000 description 2
- MHXKHKWHPNETGG-QWRGUYRKSA-N Gly-Lys-Leu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O MHXKHKWHPNETGG-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- FZWVCYCYWCLQDH-NHCYSSNCSA-N Ile-Leu-Gly Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)O)N FZWVCYCYWCLQDH-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 2
- RQQCJTLBSJMVCR-DSYPUSFNSA-N Ile-Leu-Trp Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)O)N RQQCJTLBSJMVCR-DSYPUSFNSA-N 0.000 description 2
- UYNXBNHVWFNVIN-HJWJTTGWSA-N Ile-Phe-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)CC)CC1=CC=CC=C1 UYNXBNHVWFNVIN-HJWJTTGWSA-N 0.000 description 2
- IPFKIGNDTUOFAF-CYDGBPFRSA-N Ile-Val-Arg Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N IPFKIGNDTUOFAF-CYDGBPFRSA-N 0.000 description 2
- 102000009786 Immunoglobulin Constant Regions Human genes 0.000 description 2
- 108010009817 Immunoglobulin Constant Regions Proteins 0.000 description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 2
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 2
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 2
- RCFDOSNHHZGBOY-UHFFFAOYSA-N L-isoleucyl-L-alanine Natural products CCC(C)C(N)C(=O)NC(C)C(O)=O RCFDOSNHHZGBOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- LLBQJYDYOLIQAI-JYJNAYRXSA-N Leu-Glu-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O LLBQJYDYOLIQAI-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 2
- AUNMOHYWTAPQLA-XUXIUFHCSA-N Leu-Met-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O AUNMOHYWTAPQLA-XUXIUFHCSA-N 0.000 description 2
- XOWMDXHFSBCAKQ-SRVKXCTJSA-N Leu-Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C XOWMDXHFSBCAKQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- AIQWYVFNBNNOLU-RHYQMDGZSA-N Leu-Thr-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O AIQWYVFNBNNOLU-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 2
- CIOWSLJGLSUOME-BQBZGAKWSA-N Lys-Asp Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O CIOWSLJGLSUOME-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- KWUKZRFFKPLUPE-HJGDQZAQSA-N Lys-Asp-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O KWUKZRFFKPLUPE-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 2
- OIQSIMFSVLLWBX-VOAKCMCISA-N Lys-Leu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O OIQSIMFSVLLWBX-VOAKCMCISA-N 0.000 description 2
- JYVCOTWSRGFABJ-DCAQKATOSA-N Lys-Met-Ser Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N JYVCOTWSRGFABJ-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- YSZNURNVYFUEHC-BQBZGAKWSA-N Lys-Ser Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YSZNURNVYFUEHC-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- RKIIYGUHIQJCBW-SRVKXCTJSA-N Met-His-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O RKIIYGUHIQJCBW-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- FWAHLGXNBLWIKB-NAKRPEOUSA-N Met-Ile-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H](N)CCSC FWAHLGXNBLWIKB-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 2
- WEDDFMCSUNNZJR-WDSKDSINSA-N Met-Ser Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WEDDFMCSUNNZJR-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- MIXPUVSPPOWTCR-FXQIFTODSA-N Met-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O MIXPUVSPPOWTCR-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- 101001054328 Mus musculus Interferon beta Proteins 0.000 description 2
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OZILORBBPKKGRI-RYUDHWBXSA-N Phe-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 OZILORBBPKKGRI-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 2
- ROHDXJUFQVRDAV-UWVGGRQHSA-N Phe-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 ROHDXJUFQVRDAV-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- OYEDZGNMSBZCIM-XGEHTFHBSA-N Ser-Arg-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O OYEDZGNMSBZCIM-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 2
- HZWAHWQZPSXNCB-BPUTZDHNSA-N Ser-Arg-Trp Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O HZWAHWQZPSXNCB-BPUTZDHNSA-N 0.000 description 2
- QPFJSHSJFIYDJZ-GHCJXIJMSA-N Ser-Asp-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO QPFJSHSJFIYDJZ-GHCJXIJMSA-N 0.000 description 2
- MUARUIBTKQJKFY-WHFBIAKZSA-N Ser-Gly-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O MUARUIBTKQJKFY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- YMTLKLXDFCSCNX-BYPYZUCNSA-N Ser-Gly-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O YMTLKLXDFCSCNX-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 101150006914 TRP1 gene Proteins 0.000 description 2
- TWLMXDWFVNEFFK-FJXKBIBVSA-N Thr-Arg-Gly Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O TWLMXDWFVNEFFK-FJXKBIBVSA-N 0.000 description 2
- ASJDFGOPDCVXTG-KATARQTJSA-N Thr-Cys-Leu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O ASJDFGOPDCVXTG-KATARQTJSA-N 0.000 description 2
- KWQBJOUOSNJDRR-XAVMHZPKSA-N Thr-Cys-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N)O KWQBJOUOSNJDRR-XAVMHZPKSA-N 0.000 description 2
- VEWZSFGRQDUAJM-YJRXYDGGSA-N Thr-Cys-Tyr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)O)N)O VEWZSFGRQDUAJM-YJRXYDGGSA-N 0.000 description 2
- FIFDDJFLNVAVMS-RHYQMDGZSA-N Thr-Leu-Met Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O FIFDDJFLNVAVMS-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 2
- YKRQRPFODDJQTC-CSMHCCOUSA-N Thr-Lys Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN YKRQRPFODDJQTC-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 2
- DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N Thr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N 0.000 description 2
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 2
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 2
- YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N Tritium Chemical compound [3H] YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 2
- UDCHKDYNMRJYMI-QEJZJMRPSA-N Trp-Glu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O UDCHKDYNMRJYMI-QEJZJMRPSA-N 0.000 description 2
- XGFGVFMXDXALEV-XIRDDKMYSA-N Trp-Leu-Asn Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)N XGFGVFMXDXALEV-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 2
- SINRIKQYQJRGDQ-MEYUZBJRSA-N Tyr-Lys-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 SINRIKQYQJRGDQ-MEYUZBJRSA-N 0.000 description 2
- NHOVZGFNTGMYMI-KKUMJFAQSA-N Tyr-Ser-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 NHOVZGFNTGMYMI-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010000134 Vascular Cell Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 2
- 150000001294 alanine derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 230000001064 anti-interferon Effects 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 108010040443 aspartyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 2
- 108010047857 aspartylglycine Proteins 0.000 description 2
- 239000012911 assay medium Substances 0.000 description 2
- 235000015241 bacon Nutrition 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N beta-alanine Chemical compound NCCC(O)=O UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 2
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 2
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 2
- 210000003711 chorioallantoic membrane Anatomy 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 229960002086 dextran Drugs 0.000 description 2
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 239000005038 ethylene vinyl acetate Substances 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 2
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 2
- YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N glycylglycine Chemical compound [NH3+]CC(=O)NCC([O-])=O YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 2
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 239000007922 nasal spray Substances 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 108010079892 phosphoglycerol kinase Proteins 0.000 description 2
- OXNIZHLAWKMVMX-UHFFFAOYSA-N picric acid Chemical compound OC1=C([N+]([O-])=O)C=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O OXNIZHLAWKMVMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001200 poly(ethylene-vinyl acetate) Polymers 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 2
- 108010048397 seryl-lysyl-leucine Proteins 0.000 description 2
- 231100000161 signs of toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 2
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 2
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 2
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 2
- 239000012049 topical pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- 229950002929 trinitrophenol Drugs 0.000 description 2
- 229910052722 tritium Inorganic materials 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010003137 tyrosyltyrosine Proteins 0.000 description 2
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- 108010021199 valyl-valyl-valine Proteins 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- IGXNPQWXIRIGBF-KEOOTSPTSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-amino-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoic acid Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(O)=O)C1=CN=CN1 IGXNPQWXIRIGBF-KEOOTSPTSA-N 0.000 description 1
- VILFTWLXLYIEMV-UHFFFAOYSA-N 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzene Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC([N+]([O-])=O)=C(F)C=C1F VILFTWLXLYIEMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound NCC(O)=O.OCC(N)(CO)CO AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OZDAOHVKBFBBMZ-UHFFFAOYSA-N 2-aminopentanedioic acid;hydrate Chemical compound O.OC(=O)C(N)CCC(O)=O OZDAOHVKBFBBMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CFBVWCHTNQHZLT-UHFFFAOYSA-N 4-methoxy-5-[3-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-(phenylcarbamoyl)tetrazol-3-ium-2-yl]-2-nitrobenzenesulfonate Chemical compound COC1=CC([N+]([O-])=O)=C(S([O-])(=O)=O)C=C1N1[N+](C=2C(=CC(=C(C=2)S(O)(=O)=O)[N+]([O-])=O)OC)=NC(C(=O)NC=2C=CC=CC=2)=N1 CFBVWCHTNQHZLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CQXXYOLFJXSRMT-UHFFFAOYSA-N 5-diazocyclohexa-1,3-diene Chemical class [N-]=[N+]=C1CC=CC=C1 CQXXYOLFJXSRMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RXGJTUSBYWCRBK-UHFFFAOYSA-M 5-methylphenazinium methyl sulfate Chemical compound COS([O-])(=O)=O.C1=CC=C2[N+](C)=C(C=CC=C3)C3=NC2=C1 RXGJTUSBYWCRBK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- UWQJHXKARZWDIJ-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ala-Cys Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O UWQJHXKARZWDIJ-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- FJVAQLJNTSUQPY-CIUDSAMLSA-N Ala-Ala-Lys Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN FJVAQLJNTSUQPY-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- PBAMJJXWDQXOJA-FXQIFTODSA-N Ala-Asp-Arg Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N PBAMJJXWDQXOJA-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- XZWXFWBHYRFLEF-FSPLSTOPSA-N Ala-His Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 XZWXFWBHYRFLEF-FSPLSTOPSA-N 0.000 description 1
- RDIKFPRVLJLMER-BQBZGAKWSA-N Ala-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)N RDIKFPRVLJLMER-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- HHRAXZAYZFFRAM-CIUDSAMLSA-N Ala-Leu-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O HHRAXZAYZFFRAM-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- MNZHHDPWDWQJCQ-YUMQZZPRSA-N Ala-Leu-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O MNZHHDPWDWQJCQ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- DPNZTBKGAUAZQU-DLOVCJGASA-N Ala-Leu-His Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N DPNZTBKGAUAZQU-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- ZKEHTYWGPMMGBC-XUXIUFHCSA-N Ala-Leu-Leu-Ser Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O ZKEHTYWGPMMGBC-XUXIUFHCSA-N 0.000 description 1
- DYXOFPBJBAHWFY-JBDRJPRFSA-N Ala-Ser-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](C)N DYXOFPBJBAHWFY-JBDRJPRFSA-N 0.000 description 1
- NCQMBSJGJMYKCK-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O NCQMBSJGJMYKCK-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- OEVCHROQUIVQFZ-YTLHQDLWSA-N Ala-Thr-Ala Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O OEVCHROQUIVQFZ-YTLHQDLWSA-N 0.000 description 1
- ZJLORAAXDAJLDC-CQDKDKBSSA-N Ala-Tyr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O ZJLORAAXDAJLDC-CQDKDKBSSA-N 0.000 description 1
- YJHKTAMKPGFJCT-NRPADANISA-N Ala-Val-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O YJHKTAMKPGFJCT-NRPADANISA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- OHYQKYUTLIPFOX-ZPFDUUQYSA-N Arg-Glu-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O OHYQKYUTLIPFOX-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 1
- PYZPXCZNQSEHDT-GUBZILKMSA-N Arg-Met-Asn Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N PYZPXCZNQSEHDT-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- XNSKSTRGQIPTSE-ACZMJKKPSA-N Arg-Thr Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)O XNSKSTRGQIPTSE-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- QADCERNTBWTXFV-JSGCOSHPSA-N Arg-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)N)C(O)=O)=CNC2=C1 QADCERNTBWTXFV-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 1
- YNDLOUMBVDVALC-ZLUOBGJFSA-N Asn-Ala-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N YNDLOUMBVDVALC-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- NPDLYUOYAGBHFB-WDSKDSINSA-N Asn-Arg Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N NPDLYUOYAGBHFB-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- XVVOVPFMILMHPX-ZLUOBGJFSA-N Asn-Asp-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O XVVOVPFMILMHPX-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- KLKHFFMNGWULBN-VKHMYHEASA-N Asn-Gly Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O KLKHFFMNGWULBN-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- DDPXDCKYWDGZAL-BQBZGAKWSA-N Asn-Gly-Arg Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N DDPXDCKYWDGZAL-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- WQLJRNRLHWJIRW-KKUMJFAQSA-N Asn-His-Tyr Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N)O WQLJRNRLHWJIRW-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- NKLRWRRVYGQNIH-GHCJXIJMSA-N Asn-Ile-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O NKLRWRRVYGQNIH-GHCJXIJMSA-N 0.000 description 1
- HXWUJJADFMXNKA-BQBZGAKWSA-N Asn-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O HXWUJJADFMXNKA-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- RCFGLXMZDYNRSC-CIUDSAMLSA-N Asn-Lys-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O RCFGLXMZDYNRSC-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- OERMIMJQPQUIPK-FXQIFTODSA-N Asp-Arg-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O OERMIMJQPQUIPK-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- VIRHEUMYXXLCBF-WDSKDSINSA-N Asp-Gly-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O VIRHEUMYXXLCBF-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- DPNWSMBUYCLEDG-CIUDSAMLSA-N Asp-Lys-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DPNWSMBUYCLEDG-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- DWBZEJHQQIURML-IMJSIDKUSA-N Asp-Ser Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DWBZEJHQQIURML-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- NBKLEMWHDLAUEM-CIUDSAMLSA-N Asp-Ser-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N NBKLEMWHDLAUEM-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- QOJJMJKTMKNFEF-ZKWXMUAHSA-N Asp-Val-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O QOJJMJKTMKNFEF-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N Aspartic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002237 B-cell of pancreatic islet Anatomy 0.000 description 1
- 208000023514 Barrett esophagus Diseases 0.000 description 1
- 102100021277 Beta-secretase 2 Human genes 0.000 description 1
- 101000782236 Bothrops leucurus Thrombin-like enzyme leucurobin Proteins 0.000 description 1
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 1
- 101100505161 Caenorhabditis elegans mel-32 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- CCPHAMSKHBDMDS-UHFFFAOYSA-N Chetoseminudin B Natural products C=1NC2=CC=CC=C2C=1CC1(SC)NC(=O)C(CO)(SC)N(C)C1=O CCPHAMSKHBDMDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710138848 Chymotrypsin-like elastase family member 1 Proteins 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 102100031162 Collagen alpha-1(XVIII) chain Human genes 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- FKLJPTJMIBLJAV-UHFFFAOYSA-N Compound IV Chemical compound O1N=C(C)C=C1CCCCCCCOC1=CC=C(C=2OCCN=2)C=C1 FKLJPTJMIBLJAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVYMKYUSZSVOAG-ZLUOBGJFSA-N Cys-Ala-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O TVYMKYUSZSVOAG-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- VCPHQVQGVSKDHY-FXQIFTODSA-N Cys-Ser-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O VCPHQVQGVSKDHY-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UWTATZPHSA-N D-Cysteine Chemical compound SC[C@@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N D-alanine Chemical compound C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-SCSAIBSYSA-N D-arginine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-SCSAIBSYSA-N 0.000 description 1
- 229930028154 D-arginine Natural products 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N D-lysine Chemical compound NCCCC[C@@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-SCSAIBSYSA-N D-methionine Chemical compound CSCC[C@@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-SCSAIBSYSA-N 0.000 description 1
- 229930182818 D-methionine Natural products 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 230000007023 DNA restriction-modification system Effects 0.000 description 1
- 238000007900 DNA-DNA hybridization Methods 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 229930195710 D‐cysteine Natural products 0.000 description 1
- 102220480827 E3 ubiquitin-protein ligase DCST1_H121A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 101710099240 Elastase-1 Proteins 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 108010079505 Endostatins Proteins 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N FLAG peptide Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N 0.000 description 1
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- 108010001515 Galectin 4 Proteins 0.000 description 1
- 102100039556 Galectin-4 Human genes 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- RQNYYRHRKSVKAB-GUBZILKMSA-N Glu-Cys-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O RQNYYRHRKSVKAB-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- SNFUTDLOCQQRQD-ZKWXMUAHSA-N Glu-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O SNFUTDLOCQQRQD-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- BCYGDJXHAGZNPQ-DCAQKATOSA-N Glu-Lys-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O BCYGDJXHAGZNPQ-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- QDMVXRNLOPTPIE-WDCWCFNPSA-N Glu-Lys-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O QDMVXRNLOPTPIE-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 1
- JSIQVRIXMINMTA-ZDLURKLDSA-N Glu-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O JSIQVRIXMINMTA-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 1
- YSWHPLCDIMUKFE-QWRGUYRKSA-N Glu-Tyr Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 YSWHPLCDIMUKFE-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- WGYHAAXZWPEBDQ-IFFSRLJSSA-N Glu-Val-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O WGYHAAXZWPEBDQ-IFFSRLJSSA-N 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical class O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GRIRDMVMJJDZKV-RCOVLWMOSA-N Gly-Asn-Val Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O GRIRDMVMJJDZKV-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 1
- JUBDONGMHASUCN-IUCAKERBSA-N Gly-Glu-His Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(O)=O JUBDONGMHASUCN-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- YWAQATDNEKZFFK-BYPYZUCNSA-N Gly-Gly-Ser Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YWAQATDNEKZFFK-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- NSTUFLGQJCOCDL-UWVGGRQHSA-N Gly-Leu-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N NSTUFLGQJCOCDL-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- YXTFLTJYLIAZQG-FJXKBIBVSA-N Gly-Thr-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N YXTFLTJYLIAZQG-FJXKBIBVSA-N 0.000 description 1
- JKSMZVCGQWVTBW-STQMWFEESA-N Gly-Trp-Asn Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O JKSMZVCGQWVTBW-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- RIYIFUFFFBIOEU-KBPBESRZSA-N Gly-Tyr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CC=C(O)C=C1 RIYIFUFFFBIOEU-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- HIAHVKLTHNOENC-HGNGGELXSA-N His-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O HIAHVKLTHNOENC-HGNGGELXSA-N 0.000 description 1
- STOOMQFEJUVAKR-KKUMJFAQSA-N His-His-His Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(O)=O)C1=CNC=N1 STOOMQFEJUVAKR-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- BZKDJRSZWLPJNI-SRVKXCTJSA-N His-His-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BZKDJRSZWLPJNI-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- KRBMQYPTDYSENE-BQBZGAKWSA-N His-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CNC=N1 KRBMQYPTDYSENE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- CSTDQOOBZBAJKE-BWAGICSOSA-N His-Tyr-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)NC(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)N)O CSTDQOOBZBAJKE-BWAGICSOSA-N 0.000 description 1
- 101000923070 Homo sapiens Arylsulfatase B Proteins 0.000 description 1
- 101000840258 Homo sapiens Immunoglobulin J chain Proteins 0.000 description 1
- 101000599940 Homo sapiens Interferon gamma Proteins 0.000 description 1
- 101000619708 Homo sapiens Peroxiredoxin-6 Proteins 0.000 description 1
- RCFDOSNHHZGBOY-ACZMJKKPSA-N Ile-Ala Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O RCFDOSNHHZGBOY-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- JXUGDUWBMKIJDC-NAKRPEOUSA-N Ile-Ala-Arg Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O JXUGDUWBMKIJDC-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 1
- JRHFQUPIZOYKQP-KBIXCLLPSA-N Ile-Ala-Glu Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O JRHFQUPIZOYKQP-KBIXCLLPSA-N 0.000 description 1
- MKWSZEHGHSLNPF-NAKRPEOUSA-N Ile-Ala-Val Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O)N MKWSZEHGHSLNPF-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 1
- KTGFOCFYOZQVRJ-ZKWXMUAHSA-N Ile-Glu Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O KTGFOCFYOZQVRJ-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- PKGGWLOLRLOPGK-XUXIUFHCSA-N Ile-Leu-Arg Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N PKGGWLOLRLOPGK-XUXIUFHCSA-N 0.000 description 1
- YWCJXQKATPNPOE-UKJIMTQDSA-N Ile-Val-Glu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N YWCJXQKATPNPOE-UKJIMTQDSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102100029571 Immunoglobulin J chain Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 108010054267 Interferon Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000001617 Interferon Receptors Human genes 0.000 description 1
- 102100040018 Interferon alpha-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010079944 Interferon-alpha2b Proteins 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- QUOGESRFPZDMMT-UHFFFAOYSA-N L-Homoarginine Natural products OC(=O)C(N)CCCCNC(N)=N QUOGESRFPZDMMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QLROSWPKSBORFJ-BQBZGAKWSA-N L-Prolyl-L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 QLROSWPKSBORFJ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- 239000004201 L-cysteine Substances 0.000 description 1
- 235000013878 L-cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- QUOGESRFPZDMMT-YFKPBYRVSA-N L-homoarginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCCNC(N)=N QUOGESRFPZDMMT-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 241000880493 Leptailurus serval Species 0.000 description 1
- UCOCBWDBHCUPQP-DCAQKATOSA-N Leu-Arg-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O UCOCBWDBHCUPQP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- NFNVDJGXRFEYTK-YUMQZZPRSA-N Leu-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O NFNVDJGXRFEYTK-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- OXRLYTYUXAQTHP-YUMQZZPRSA-N Leu-Gly-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O OXRLYTYUXAQTHP-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- KEVYYIMVELOXCT-KBPBESRZSA-N Leu-Gly-Phe Chemical compound CC(C)C[C@H]([NH3+])C(=O)NCC(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC1=CC=CC=C1 KEVYYIMVELOXCT-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- BTNXKBVLWJBTNR-SRVKXCTJSA-N Leu-His-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O BTNXKBVLWJBTNR-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- OTXBNHIUIHNGAO-UWVGGRQHSA-N Leu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN OTXBNHIUIHNGAO-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- ICYRCNICGBJLGM-HJGDQZAQSA-N Leu-Thr-Asp Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O ICYRCNICGBJLGM-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- LINKCQUOMUDLKN-KATARQTJSA-N Leu-Thr-Cys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N)O LINKCQUOMUDLKN-KATARQTJSA-N 0.000 description 1
- VDIARPPNADFEAV-WEDXCCLWSA-N Leu-Thr-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O VDIARPPNADFEAV-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 1
- VUBIPAHVHMZHCM-KKUMJFAQSA-N Leu-Tyr-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 VUBIPAHVHMZHCM-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- 208000006552 Lewis Lung Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- WSXTWLJHTLRFLW-SRVKXCTJSA-N Lys-Ala-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O WSXTWLJHTLRFLW-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- JPNRPAJITHRXRH-BQBZGAKWSA-N Lys-Asn Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O JPNRPAJITHRXRH-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- MWVUEPNEPWMFBD-SRVKXCTJSA-N Lys-Cys-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN MWVUEPNEPWMFBD-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- UGTZHPSKYRIGRJ-YUMQZZPRSA-N Lys-Glu Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O UGTZHPSKYRIGRJ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- LUTDBHBIHHREDC-IHRRRGAJSA-N Lys-Pro-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O LUTDBHBIHHREDC-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- WQDKIVRHTQYJSN-DCAQKATOSA-N Lys-Ser-Arg Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N WQDKIVRHTQYJSN-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- IEVXCWPVBYCJRZ-IXOXFDKPSA-N Lys-Thr-His Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 IEVXCWPVBYCJRZ-IXOXFDKPSA-N 0.000 description 1
- 102220514560 Lysophospholipid acyltransferase 5_H97A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241000282553 Macaca Species 0.000 description 1
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 1
- BVXXDMUMHMXFER-BPNCWPANSA-N Met-Ala-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O BVXXDMUMHMXFER-BPNCWPANSA-N 0.000 description 1
- AFFKUNVPPLQUGA-DCAQKATOSA-N Met-Leu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O AFFKUNVPPLQUGA-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 description 1
- 101710107068 Myelin basic protein Proteins 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 102000000447 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Human genes 0.000 description 1
- 108010055817 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 102100022239 Peroxiredoxin-6 Human genes 0.000 description 1
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 1
- 239000004264 Petrolatum Substances 0.000 description 1
- DFEVBOYEUQJGER-JURCDPSOSA-N Phe-Ala-Ile Chemical compound N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)O DFEVBOYEUQJGER-JURCDPSOSA-N 0.000 description 1
- LBSARGIQACMGDF-WBAXXEDZSA-N Phe-Ala-Phe Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 LBSARGIQACMGDF-WBAXXEDZSA-N 0.000 description 1
- IUVYJBMTHARMIP-PCBIJLKTSA-N Phe-Asp-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O IUVYJBMTHARMIP-PCBIJLKTSA-N 0.000 description 1
- JWBLQDDHSDGEGR-DRZSPHRISA-N Phe-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 JWBLQDDHSDGEGR-DRZSPHRISA-N 0.000 description 1
- FENSZYFJQOFSQR-FIRPJDEBSA-N Phe-Phe-Ile Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FENSZYFJQOFSQR-FIRPJDEBSA-N 0.000 description 1
- 102220479637 Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate 3-phosphatase and dual-specificity protein phosphatase PTEN_H93A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- TUYWCHPXKQTISF-LPEHRKFASA-N Pro-Cys-Pro Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)O TUYWCHPXKQTISF-LPEHRKFASA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 208000001431 Psychomotor Agitation Diseases 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 230000010799 Receptor Interactions Effects 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010038743 Restlessness Diseases 0.000 description 1
- 108010003581 Ribulose-bisphosphate carboxylase Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 101100221606 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) COS7 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- RZEQTVHJZCIUBT-WDSKDSINSA-N Ser-Arg Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N RZEQTVHJZCIUBT-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- LTFSLKWFMWZEBD-IMJSIDKUSA-N Ser-Asn Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O LTFSLKWFMWZEBD-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- VAUMZJHYZQXZBQ-WHFBIAKZSA-N Ser-Asn-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O VAUMZJHYZQXZBQ-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- YMEXHZTVKDAKIY-GHCJXIJMSA-N Ser-Asn-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO)C(O)=O YMEXHZTVKDAKIY-GHCJXIJMSA-N 0.000 description 1
- BNFVPSRLHHPQKS-WHFBIAKZSA-N Ser-Asp-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O BNFVPSRLHHPQKS-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- WOUIMBGNEUWXQG-VKHMYHEASA-N Ser-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O WOUIMBGNEUWXQG-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- WSTIOCFMWXNOCX-YUMQZZPRSA-N Ser-Gly-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)N WSTIOCFMWXNOCX-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- YZMPDHTZJJCGEI-BQBZGAKWSA-N Ser-His Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CNC=N1 YZMPDHTZJJCGEI-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- HMRAQFJFTOLDKW-GUBZILKMSA-N Ser-His-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O HMRAQFJFTOLDKW-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- NFDYGNFETJVMSE-BQBZGAKWSA-N Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO NFDYGNFETJVMSE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- FOOZNBRFRWGBNU-DCAQKATOSA-N Ser-Met-His Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N FOOZNBRFRWGBNU-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- RRVFEDGUXSYWOW-BZSNNMDCSA-N Ser-Phe-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O RRVFEDGUXSYWOW-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- WLJPJRGQRNCIQS-ZLUOBGJFSA-N Ser-Ser-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O WLJPJRGQRNCIQS-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- SRSPTFBENMJHMR-WHFBIAKZSA-N Ser-Ser-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O SRSPTFBENMJHMR-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- PYTKULIABVRXSC-BWBBJGPYSA-N Ser-Ser-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O PYTKULIABVRXSC-BWBBJGPYSA-N 0.000 description 1
- RCOUFINCYASMDN-GUBZILKMSA-N Ser-Val-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O RCOUFINCYASMDN-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 101000857870 Squalus acanthias Gonadoliberin Proteins 0.000 description 1
- 108010057517 Strep-avidin conjugated horseradish peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 244000297179 Syringa vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000004338 Syringa vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- BIYXEUAFGLTAEM-WUJLRWPWSA-N Thr-Gly Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O BIYXEUAFGLTAEM-WUJLRWPWSA-N 0.000 description 1
- SXAGUVRFGJSFKC-ZEILLAHLSA-N Thr-His-Thr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O SXAGUVRFGJSFKC-ZEILLAHLSA-N 0.000 description 1
- LUMXICQAOKVQOB-YWIQKCBGSA-N Thr-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O LUMXICQAOKVQOB-YWIQKCBGSA-N 0.000 description 1
- XYFISNXATOERFZ-OSUNSFLBSA-N Thr-Ile-Val Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)N XYFISNXATOERFZ-OSUNSFLBSA-N 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- LYMVXFSTACVOLP-ZFWWWQNUSA-N Trp-Leu Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C([O-])=O)=CNC2=C1 LYMVXFSTACVOLP-ZFWWWQNUSA-N 0.000 description 1
- YBRHKUNWEYBZGT-WLTAIBSBSA-N Trp-Thr Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(O)=O)=CNC2=C1 YBRHKUNWEYBZGT-WLTAIBSBSA-N 0.000 description 1
- FHHYVSCGOMPLLO-IHPCNDPISA-N Trp-Tyr-Asp Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 FHHYVSCGOMPLLO-IHPCNDPISA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VCXWRWYFJLXITF-AUTRQRHGSA-N Tyr-Ala-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 VCXWRWYFJLXITF-AUTRQRHGSA-N 0.000 description 1
- CNLKDWSAORJEMW-KWQFWETISA-N Tyr-Gly-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O CNLKDWSAORJEMW-KWQFWETISA-N 0.000 description 1
- GZUIDWDVMWZSMI-KKUMJFAQSA-N Tyr-Lys-Cys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 GZUIDWDVMWZSMI-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- KKHRWGYHBZORMQ-NHCYSSNCSA-N Val-Arg-Glu Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N KKHRWGYHBZORMQ-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- BMGOFDMKDVVGJG-NHCYSSNCSA-N Val-Asp-Lys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N BMGOFDMKDVVGJG-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- ROLGIBMFNMZANA-GVXVVHGQSA-N Val-Glu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N ROLGIBMFNMZANA-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 1
- VHIZXDZMTDVFGX-DCAQKATOSA-N Val-Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](C(C)C)N VHIZXDZMTDVFGX-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- BZDGLJPROOOUOZ-XGEHTFHBSA-N Val-Thr-Cys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O BZDGLJPROOOUOZ-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- VEYJKJORLPYVLO-RYUDHWBXSA-N Val-Tyr Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 VEYJKJORLPYVLO-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- BGTDGENDNWGMDQ-KJEVXHAQSA-N Val-Tyr-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O BGTDGENDNWGMDQ-KJEVXHAQSA-N 0.000 description 1
- KRNYOVHEKOBTEF-YUMQZZPRSA-N Val-Val Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O KRNYOVHEKOBTEF-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- NLNCNKIVJPEFBC-DLOVCJGASA-N Val-Val-Glu Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O NLNCNKIVJPEFBC-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- WBPFYNYTYASCQP-CYDGBPFRSA-N Val-Val-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)N WBPFYNYTYASCQP-CYDGBPFRSA-N 0.000 description 1
- AOILQMZPNLUXCM-AVGNSLFASA-N Val-Val-Lys Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN AOILQMZPNLUXCM-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- STTYIMSDIYISRG-UHFFFAOYSA-N Valyl-Serine Chemical compound CC(C)C(N)C(=O)NC(CO)C(O)=O STTYIMSDIYISRG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000008043 acidic salts Chemical class 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002299 affinity electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 238000012867 alanine scanning Methods 0.000 description 1
- 108010045350 alanyl-tyrosyl-alanine Proteins 0.000 description 1
- 108010047495 alanylglycine Proteins 0.000 description 1
- 108010070944 alanylhistidine Proteins 0.000 description 1
- 150000001447 alkali salts Chemical class 0.000 description 1
- 108010050122 alpha 1-Antitrypsin Proteins 0.000 description 1
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000002870 angiogenesis inducing agent Substances 0.000 description 1
- 239000004037 angiogenesis inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000002482 anti-endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 108010062796 arginyllysine Proteins 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 239000013602 bacteriophage vector Substances 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 1
- 229940000635 beta-alanine Drugs 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 229940021459 betaseron Drugs 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000008512 biological response Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 1
- 239000012503 blood component Substances 0.000 description 1
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 210000001043 capillary endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 238000006473 carboxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000012159 carrier gas Substances 0.000 description 1
- 238000005266 casting Methods 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000015861 cell surface binding Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 229940110456 cocoa butter Drugs 0.000 description 1
- 235000019868 cocoa butter Nutrition 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000306 component Substances 0.000 description 1
- 239000007891 compressed tablet Substances 0.000 description 1
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 1
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 description 1
- 238000003235 crystal violet staining Methods 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000005860 defense response to virus Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 229940000986 dextran 110 Drugs 0.000 description 1
- 150000004985 diamines Chemical class 0.000 description 1
- 108010009297 diglycyl-histidine Proteins 0.000 description 1
- 125000005442 diisocyanate group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- ZLFRJHOBQVVTOJ-UHFFFAOYSA-N dimethyl hexanediimidate Chemical compound COC(=N)CCCCC(=N)OC ZLFRJHOBQVVTOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 1
- 230000005584 early death Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 230000032050 esterification Effects 0.000 description 1
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000003889 eye drop Substances 0.000 description 1
- 229940012356 eye drops Drugs 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 235000013861 fat-free Nutrition 0.000 description 1
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 150000002222 fluorine compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 238000002825 functional assay Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 108700010758 gag-pro Proteins 0.000 description 1
- 101150081889 gag-pro gene Proteins 0.000 description 1
- 230000006251 gamma-carboxylation Effects 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 101150089730 gly-10 gene Proteins 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 125000003147 glycosyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001279 glycosylating effect Effects 0.000 description 1
- XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N glycyl-L-tyrosine hemihydrate Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010090037 glycyl-alanyl-isoleucine Proteins 0.000 description 1
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 150000002411 histidines Chemical class 0.000 description 1
- 108010018006 histidylserine Proteins 0.000 description 1
- 102000052179 human IFNAR2 Human genes 0.000 description 1
- 102000043557 human IFNG Human genes 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 210000003016 hypothalamus Anatomy 0.000 description 1
- 150000002463 imidates Chemical class 0.000 description 1
- 210000001822 immobilized cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000003701 inert diluent Substances 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 1
- 230000002687 intercalation Effects 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 108010053037 kyotorphin Proteins 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000012669 liquid formulation Substances 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 239000006194 liquid suspension Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000007937 lozenge Substances 0.000 description 1
- 208000037841 lung tumor Diseases 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 1
- 239000007932 molded tablet Substances 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 238000000465 moulding Methods 0.000 description 1
- 231100000150 mutagenicity / genotoxicity testing Toxicity 0.000 description 1
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002850 nasal mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 229940097496 nasal spray Drugs 0.000 description 1
- 239000006199 nebulizer Substances 0.000 description 1
- 230000014399 negative regulation of angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229940066842 petrolatum Drugs 0.000 description 1
- 235000019271 petrolatum Nutrition 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000243 photosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920001515 polyalkylene glycol Chemical group 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000001525 receptor binding assay Methods 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000010242 retro-orbital bleeding Methods 0.000 description 1
- 238000011808 rodent model Methods 0.000 description 1
- 238000007423 screening assay Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008137 solubility enhancer Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- VIDRYROWYFWGSY-UHFFFAOYSA-N sotalol hydrochloride Chemical compound Cl.CC(C)NCC(O)C1=CC=C(NS(C)(=O)=O)C=C1 VIDRYROWYFWGSY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N succinimide Chemical class O=C1CCC(=O)N1 KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 230000019635 sulfation Effects 0.000 description 1
- 238000005670 sulfation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006277 sulfonation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 150000007970 thio esters Chemical class 0.000 description 1
- RUELTTOHQODFPA-UHFFFAOYSA-N toluene 2,6-diisocyanate Chemical compound CC1=C(N=C=O)C=CC=C1N=C=O RUELTTOHQODFPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 238000007070 tosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 108010080629 tryptophan-leucine Proteins 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 108010051110 tyrosyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- IBIDRSSEHFLGSD-UHFFFAOYSA-N valinyl-arginine Natural products CC(C)C(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCN=C(N)N IBIDRSSEHFLGSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010009962 valyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 108010021889 valylvaline Proteins 0.000 description 1
- 201000011531 vascular cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 206010055031 vascular neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 108010027345 wheylin-1 peptide Proteins 0.000 description 1
- 238000002424 x-ray crystallography Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/565—IFN-beta
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
- A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
Abstract
Fúzní polypeptid, který obsahuje (a) mutantu interferonu-beta-1a (IFN-.beta.) vybranou ze skupiny sestávající z mutant IFN-.beta., které mají aminokyselinové sekvence uvedené v tabulce 1 jako A1, B1, C1, CD1, CD2 a DE1, a (b) kloubovou oblast a domény CH2 a CH3 imunoglobulinu, pricemž výhodne je IFN-.beta. lidský interferon-beta-1a. Polypeptid podle vynálezu je užitecný pri lécení virových onemocnení, jako je infekce ECM, chripka, infekce respiracního traktu, vzteklina nebo hepatitida, autoimunitních onemocnení, jako je lupus nebo sclerosis multiplex, zánetlivých onemocnení, jako je fibróza, angiogenních onemocnení, jako je diabetická retinopatie, retinopatie predcasne narozených, makulární degenerace, odvržení štepu rohovky, neovaskulární glaukom, retrolentální fibroplázie, rubeóza a Osler-Weberuv syndrom, a také nádorových onemocnení, jako je osteogenní sarkom, lymfom, akutní lymfocytární leukémie, karcinom prsu, melanom, nasofaryngeální karcinom nebo hemangiom.
Description
Fúzní proteiny interferonu-beta-la a jejich použiti
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká fúzního polypeptidu, který má aminokyselinovou sekvenci X-Y-Z nebo alespoň její část, přičemž tato sekvence obsahuje aminokyselinovou sekvenci, glykosylovaného interferonu-beta (X), přičemž Y je volitelná spojovací část a Z je polypeptid obsahující alespoň část polypeptidu jiného než je glykosylovaný interferon-beta. Výhodné je X lidský interio feron-beta-la. Vynález se také týká mutant interferonu-beta-la.
Dosavadní stav techniky
Použití polypeptidů a proteinů pro systémové léčení specifických nemocí je nyní běžně přijímanou lékařskou praxí. Role, jakou hrají látky tohoto typu v terapii je tak důležitá, že mnohé výzkumy jsou zaměřeny na syntézu velkého množství těchto látek technologií rekombinantní DNA. Mnohé z těchto molekul jsou endogenní molekuly, které jsou velmi účinné a specifické ve svém biologickém účinku.
Hlavním faktorem, který omezuje užitečnost látek proteinového charakteru pro jejich zamýšlené aplikace, je to, že při parenterálním podávání jsou z těla za velmi krátký čas eliminovány. Ř tomu dochází proto, že jsou metabolizovány proteázami, nebo se na jejich eliminaci podílí běžná clearance metabolickými cestami eliminace proteinů, jako je např. filtrace v ledvinách. Problémy spojené s uvedenými způsoby podávání proteinů jsou ve farmaceutickém průmyslu dobře známy a byly proto užity různé strategie, jak je řešit.
Peptidová rodina, která je cílem klinického výzkumu a mnohých snah o zlepšení podávání a bioasimilace, je rodina interferonu. Interferony byly testovány při mnoha nemocech. Použití humán30 ního interferonu beta, jednoho členu této rodiny, je již zavedeno při léčení roztroušené sklerózy mozkomíšní (sclerosis multiplex). Dvě formy rekombinantního interferonu beta byly povoleny v Evropě a v USA pro léčení této nemoci. Jedna forma je interferon beta la (ochranná známka AVONEX®, výrobce Biogen, lne,, Cambridge, MA). Termíny „interferon-beta-la“ nebo „IFNbeta-la“ nebo IFN-p-la“ nebo „interferon-fkla“ jsou v popisu vynálezu užívány zcela zamě35 nitelně. Jinou formou je interferon-beta-lb (ochranná známka BETASERON®, Berlex, Richmond, CA), dále označovaný jako „interferon-beta-lb“. Interferon beta-la je produkován v savčích buňkách pomocí přirozené sekvence lidského genu a je glykosylován, zatímco interferon beta-lb je produkován v buňkách E. coli pomocí modifikované sekvence lidského genu, který obsahuje substituci, kde cystein je nahrazen serinem v pozici 17, a není glykosylován.
Již dříve byla přímým způsobem srovnána relativní aktivita in vitro interferonu beta-la a interferonu beta-lb ve funkčním testu a bylo ukázáno, že specifická aktivita interferonu beta-la je přibližně lOx vyšší než specifická aktivita interferonu beta-lb (Runkel etal., 1998, Pharm. Res. 15: 641-649). Ve studiích, jejíchž cílem bylo zjistit strukturní příčiny rozdílných aktivit, byla identifikována glykosylace jako jediný známý strukturní rozdíl mezi uvedeným dvěma produkty, který ovlivňuje specifickou aktivitu. Vliv sacharidů se projevoval zejména účinkem na stabilizaci struktury. Stabilizující účinek sacharidů na strukturu byl evidentní při experimentech s tepelnou denaturací a v analýze SEC. Nepřítomnost glykosylace také korelovala se zvýšenou agregací a zvýšenou citlivostí k tepelné denaturací. Enzymatické odstranění sacharidů z inter50 feronu beta-la pomocí PNGázy F vedlo k extenzivní precipitaci deglykosylovaného produktu.
Tyto studie ukazují, že i přes konzervativní aminokyselinovou sekvenci interferonu beta-la a interferonu beta-lb se jedná o odlišné biochemické jednotky a většina znalostí o interferonu beta-lb nemůže být aplikována na interferon beta-la a naopak.
-1 Podstata vynálezu
Vynález využívá výhod glykosylovaného interferonu-beta ve srovnání s neglykosylovanou for5 mou. Zejména byl vyvinut přípravek obsahující interferon-beta-la se zvýšenou aktivitou vzhledem k interferonu beta-lb, který má také prospěšné vlastnosti fúzního proteinu obecně, aniž by došlo ke ztrátě aktivity ve srovnání s formami interferonu beta-la, které nejsou ve formě fúzního proteinu. Tudíž byly provedeny takové modifikace, že produkty (tj. fúzní proteiny interferonu beta-la) si uchovávají celou nebo většinu své biologické aktivity, a přitom bylo dosaženo násle10 dujících vlastností: změněná farmakokinetika a farmakodynamika vedoucí k delšímu biologickému poločasu a změnám tkáňové distribuce (např. schopnost zůstat delší dobu v cévách). Takový přípravek představuje podstatný pokrok v oboru medicíny a farmacie a byl by významným příspěvkem pro léčení nemocí, kde interferon prokázal svou užitečnost jako je např. sclerosis multiplex, fibróza a další zánětlivá a autoimunitní onemocnění, různé druhy rakovin, hepatitida a další virové nemoci a nemoci charakterizované neovaskularizací. Zejména schopnost zůstávat po delší dobu v cévním systému umožňuje, aby byl interferon-beta la použit k inhibici angiogeneze a potenciálně také k přestoupení hematoencefalické bariéry.
Předkládaný vynález se zejména týká izolovaného polypeptidu, který má aminokyselinovou sekvenci X-Y-Z, kde X je polypeptid mající aminokyselinovou sekvenci, nebo alespoň její část, odpovídající aminokyselinové sekvenci interferonu-beta, Y je volitelná spojovací Část a Zje polypeptid obsahující alespoň část polypeptidu jiného než je interferon-beta. Volitelná část (skupina) Y a nutná část z jsou navázány buďto na N- nebo C-konec interferonu-beta (X). Výhodně je X lidský interferon-beta-la.
Ve výhodných provedeních Z je alespoň část konstantního úseku imunoglobulinu a může pocházet z imunoglobulinu vybraného ze třídy IgM, IgG, IgD, IgA a IgE. Pokud je imunoglobulin ze třídy IgG, pak jde o jeden z IgGl, IgG2, IgG3 a IgG4. Konstantní úsek lidského IgM a IgE obsahuje 4 konstantní úseky, a sice CH1 (kloub), CH2, CH3 a CH4, zatímco konstantní úsek lidského
IgG, IgA a IgD obsahuje jen 3 konstantní úseky, a sice CH1 (kloub) CH2 a CH3. V nejvýhodnějším fúzním proteinu podle vynálezu obsahuje konstantní úsek alespoň úsek kloubu a domény CH2aCH3.
V jiném provedení je část Z alespoň část polypeptidu, který obsahuje domény podobné imuno35 globulinu. K příkladům takových polypeptidů patří CD1, CD2, CD4 a členy hlavních histokompatibilních antigenů 1. a II. třídy.
Dalším provedením vynálezu je fúzní protein mající amino-koncový úsek, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci interferonu-beta nebo její část, a karboxy-koncový úsek, který obsahuje alespoň část proteinu jiného než je interferon-beta. Karboxy-koncový úsek je výhodně alespoň část konstantního úseku imunoglobulinu pocházejícího ze třídy imunoglobulinů IgM, IgG, IgD, IgA nebo IgE. V nej výhodnějším fúzním proteinu konstantní úsek obsahuje alespoň kloubový úsek a domény CH2 a CH3.
Dalším provedením vynálezu je fúzní protein, jehož interferon-beta část (tj. X ve vzorci uvedeném výše) byla mutována, čímž vznikly muteiny se selektivně zvýšenou antivirovou a/nebo antiproliferační aktivitou nebo s jinými výhodnými vlastnostmi ve srovnání s nemutovanými formami interferonu-beta-1 a.
Ještě dalším provedením předkládaného vynálezu je izolovaná DNA kódující fúzní protein popsaný výše. Vynález se týká také rekombinantní DNA, která obsahuje izolovanou DNA kódující výše popsaný fúzní protein a expresní kontrolní sekvenci (tj. sekvenci řídící expresi), kde expresní kontrolní sekvence je operativně spojena s DNA. Vynález zahrnuje také hostitelské buňky transformované rekombinantní DNA podle vynálezu.
-2Předkládaný vynález se dále týká způsobu přípravy rekombinantního polypeptidu, který spočívá v tom, že se poskytne populace hostitelských buněk podle vynálezu, tato populace hostitelských buněk se kultivuje v podmínkách, kde je exprimován polypeptid kódovaný rekombinantní DNA, a nakonec se tento rekombinantní polypeptid izoluje.
Další aspekt vynálezu se týká fůzního proteinu interferonu-beta-la, který obsahuje interferonbeta-la a další polypeptid, se kterým není v přírodě asociován, v podstatě čisté formě, přičemž fůzní protein (zkráceně fuze) má antivirovou aktivitu, která je přibližně s antivirovou aktivitou interferonu-beta-la postrádajícího další polypeptid.
Dalším aspektem předkládaného vynálezu je farmaceutický přípravek obsahující terapeuticky účinné množství fůzního proteinu interferonu-beta-la.
Ještě další aspekt vynálezu se týká inhibice angiogeneze a neovaskularizace užitím polypeptidů 15 podle vynálezu.
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1. cDNA sekvence a dedukovaná aminokyselinová sekvence fuze interferonu-beta s histidinovou značkou (také označ. Jako „his IFN-beta“ nebo „His6-znaČený“)
Na obrázku jsou uvedeny úplná DNA sekvence (sekvence id. č. 3) a proteinová sekvence (sekvence id. č. 4) histidinem značeného IFN-beta-1 a. Štěpená signální sekvence VCAM-1 zanechá 3 zbytky amino-konce (SerGlyGly) „upstream“ od hístidinové značky (His6, sekvence id. č. 63, pozice 4 až 9). Sekvence enterokinázové spojky (linkeru) (AspAspAspAspLys) (sekvence id. č. 62) je od histidinové značky oddělena oddělovací sekvencí (spacerem) (SerSerGly, pozice 10 až 12). Přírodní sekvence proteinu IFN-beta-la představuje sekvence Metl8 až Asnl83.
Obr. 2. cDNA sekvence a dedukovaná aminokyselinová sekvence fuze interferonu-beta-la/Fc
Na obrázku jsou uvedeny úplná DNA sekvence (sekvence id. Č. 1) a proteinová sekvence (sekvence id. č. 2) fuze „lidský IFN-beta-la/myší Fc“. Sekvence lidského IFN-beta-la proteinu představuje zbytky 1 až 166 (pozice DNA sekvence 1 až 498). Sekvence enterokinázové spojky (linkeru) (AspAspAspAspLys) zaujímá aminokyselinové zbytky 167 až 171 (pozice DNA sekvence 499 až 513). Sekvence těžkého řetězce myšího IgG2a zaujímá aminokyselinové zbytky 172 až 399 (pozice DNA sekvence 514 až 437).
Obr, 3. Vazba mutanty interferonu-beta se substituovaným alaninem na dimemí fúzní protein obsahující extracelulámí doménu receptoru interferonu typu I, IFNAR2/Fc
Vazebné afinity alaninem substituované mutanty IFN (AI až E) pro receptor IFNAR2 byly stanoveny postupem jak je popsáno v příkladu 1 (část D). Histogram představuje vazebné afinity v testu ve srovnání s vazebnými afinitami divokého typu his-IFN-beta (v % d.t„ divokého typu). Hodnoty % d.t. byly vypočteny následovně: (afinita divokého typu his-IFN-beta/afmita mutovaného IFN-beta) x 100. Jsou uvedeny hodnoty % d.t. (O) pro jednotlivé experimenty (n=3) a průměrné hodnoty % d.t. (x) pro experimentální soubor. Mutanty A2, AB1, AB2 a E neváží IFNAR2/Fc v koncentraci 500 x vyšší než je EC50 divokého typu (d.t.) his-IFN-beta (*).
-3CZ 300762 B6
Obr. 4. Vazba mutanty interferonu-beta-1 se substituovaným alaninem na povrchový komplex receptoru interferonu typu I {komplex IFNAR1/2) exprimovaný na buňkách Daudi z Burkittova lymfomu
Receptorově vazebné vlastnosti mutanty se substituovaným alaninem (Al-E) byly stanoveny pomocí vazebného testu pro povrchový buněčný receptor založeného na analýze FACS, jak byl popsán v příkladu 1 (část D). Histogram představuje vazebné afinity v testu ve srovnání s vazebnými afinitami divokého typu his-IFN-beta (v % d.t., divokého typu). Hodnoty % d.t, pro každou mutantu byly vypočteny následovně: (afinita divokého typu his-IFN-beta/ afinita mutoio váného IFN-beta) x 100. Jsou uvedeny hodnoty % d.t. (O) pro jednotlivé experimenty a průměrné hodnoty % d.t. (x) pro experimentální soubor.
Obr. 5. Antivirová aktivita mutant interferonu-beta se substituovaným alaninem
Antivirová aktivita mutant se substituovaným alaninem (Al-E) byla stanovena na lidských buňkách A549 infikovaných EMC virem jak bylo popsáno v příkladu 1 (část E). Histogram představuje aktivitu v testu ve srovnání s aktivitou divokého typu his-IFN-beta (v % d.t., divokého typu). Hodnoty % d.t. pro každou mutantu byly vypočteny následovně: (koncentrace divokého typu his-IFN-beta(50%cpe)/koncentrace mutovaného IFN-beta(50%cpe) x 100. Jsou uvedeny hodnoty % d.t. (O) pro vícenásobné pokusy a průměrné hodnoty z pokusného souboru (x).
Obr. 6. Antiproliferační aktivita mutant interferonu-beta se substituovaným alaninem
Antiprolíferaění aktivita mutant se substituovaným alaninem (Al-E) byla stanovena na Daudi buňkách Burkittova lymfomu jak bylo popsáno v příkladu 1 (část E). Histogram představuje aktivity v testu ve srovnání s aktivitou divokého typu his-IFN-beta (v % d.t., divokého typu). Hodnoty % d.t. pro každou mutantu byly vypočteny následovně: (koncentrace divokého typu his-IFN-beta (50% inhibice růstu)/koncentrace mutovaného IFN-beta (50% inhibice růstu) x 100. Jsou uvedeny hodnoty % d.t. (O) pro víceěetné experimenty a průměrné hodnoty % d.t.
(x) pro experimentální soubor.
Obr. 7. Relativní antivirové a antiproliferační aktivity mutant interferonu-beta se substituovaným alaninem
Relativní aktivity mutant se substituovaným alaninem (Al-E) v testu antivirové (osa x) a antiproliferační (osa y) aktivity byly srovnány. Pro toto srovnání byly užity hodnoty průměrného % divokého typu his-IFN-beta (% d.t., x) uvedené na obr. 5 a 6. Mutanty, které vykazují koordinované změny v obou aktivitách se objeví přímo na vertikální linii nebo v její blízkosti. Mutanty vykazující ztrátu/přírůstek antivirové aktivity, která není úměrná změně v antiproliferační aktivi40 tě, se objeví výrazně mimo diagonálu (DE1, D, Cl). Významnost byla stanovena na základě směrodatných odchylek příslušných použité průměrné hodnotě % d.t.
Obr. 8. Antivirová aktivita fúze interferon-beta-la/Ig
Aktivita interferonu-beta-1 a (byl použit AVONEX®) nebo fúze interferon-beta-la/myší Ig2a v koncentracích uvedených na ose x byly hodnoceny v antivirovém testu užitím buněk lidského plicního karcinomu (A549) infikovaných virem EMC. Po dvoudenní inkubaci za přítomnosti viru byly živé buňky obarveny MTT a misky byly vyhodnoceny na čtecím zařízení při 450 nm, a absorbance, která je odrazem životnosti buněk, Je uvedena na ose y. Směrodatné odchylky jsou uvedeny jako svislé úsečky. Koncentrace interferonu-beta-1 a (byl použit jako surový meziprodukt AVONEX®), která poskytla 50 % maxima při 450 nm a tudíž při které došlo k 50% usmrcení buněk virem („50% cytopatický účinek“) byla 0,4 pM a 50% cytopatický účinek pro fúzovaný interferon-beta-la byl přibližně 0,15 pM.
-4Obr. 9. Měření antivirové aktivity interferonu-beta v plazmě myší ošetřených ťuzí interferonubeta-la/Fc nebo interferonem-beta-la
Myším bylo injikováno buďto 50 000jednotek interferonu-beta-la (surový meziprodukt
AVONEX®), nebo 50 000 jednotek fůze interferonu-beta-la/Fc. Krev z těchto zvířat byla získána retroorbitálním odběrem v různých časech po injekci, jak ukazuje osa x. Pro každý časový bod byla odebrána krev alespoň ze třech myší, byla připravena plazma a zamražena až do stanovení aktivity interferonu-beta v antivirovém testu s buňkami lidského plicního karcinomu (A549) po infekci virem encefalomyokarditidy. Živé buňky byly obarveny roztokem MTT, io destičky byly pak změřeny ve 450 nm ke stanovení absorbance, která je odrazem životnosti buněk a aktivity interferonu-beta. Na každé destičce byly také připraveny standardní (kalibrační) křivky užitím interferonu-beta-1 a jako AVONEX* a byly použity ke kvantitativnímu stanovení aktivity interferonu-beta v každém vzorku. Na grafu jsou ukázána data z jednotlivých zvířat is Obr. 10. Úplná DNA sekvence a proteinová sekvence otevřených Čtecích rámců přímé fuze lidského IFN-beta a lidského IgGIFc (ZL5107),
Obr. 11. Úplná DNA sekvence a proteinová sekvence otevřeného čtecího rámce Iuzního proteinu „lidský IFN-beta/G4S linker/lidský IgGIFc (ZL6206).
Obr. 12. Schématické znázornění celkové strategie klonování a exprese.
Všechna odborná literatura citovaná v popisu je formou odkazu zahrnuta do popisu, pokud není uvedeno jinak. V popisu vynálezu jsou užívány následující termíny:
I. Definice „Interferon (zkráceně označovaná také jako IFN) je malý, druhově specifický, jednořetězcový polypeptid, kteiý se tvoří v buňkách savců jako reakce na expozici různých induktorúm jako jsou např. viry, polypeptidy, mitogeny apod. Nejvýhodnější interferon podle vynálezu je glykosylovaný lidský interferon-beta, který je glykosylován na 80. zbytku (Asn80) a výhodně je připraven technikami rekombinantní DNA. Výhodný glykosylovaný interferon je označován „interferonbeta-1 a“ (nebo také „IFN-beta-1 a“, „IFN-fJ-la“, „interferon beta la“ nebo „interferon-fMa“ přičemž všechny uvedené názvy jsou užívány zaměnitelně). Termín „interferon-beta-1 a“ podle vynálezu zahrnuje i mutované formy interferonu (viz příklad l) za předpokladu, že i tyto mutanty jsou glykosylované na 80. zbytku (Asn80). Metody přípravy proteinů technikami rekombinantní DNA jsou známy, včetně přípravy různých interferonů, víz např. patenty US 4 399 216, US 5 149 636 a US 5 179 017 (Axel et al.) a US 4 470 461 (Kaufman).
Výhodné interferon-beta-la polynukleotidy, které lze užít podle předkládaného vynálezu, byly odvozeny ze sekvencí interferonu divokého typu různých obratlovců, výhodně savců, a byly získány metodami, které jsou odborníkovi známé a byly popsány, viz např. patent US 5 641 656 (udělený 24. 6.1997, DNA kódující ptačí interferonový pro-protein typu I a zralý ptačí interferon typul), patent US 5 605 688 (25, února 1997-rekombinantní psí a koňské interferony typul), patent US 5 231 176 (27. července 1993, DNA molekula kódující lidský leukocytární interferon), patent US 5 071 761 (10.12.1991, DNA sekvence kódující subsekvence lidských lymfoblastoidních interferonů LyIFN-alfa-2 a LyIFN-alfa-3), patent US 4 970 161 (13. listopadu 1990, DNA sekvence kódující lidský interferon gama), patent US 4 738 931 (19. dubna 1988, DNA sekvence obsahující gen lidského interferonu beta), patent US 4 695 543 (22. září 1987, lidský gen alfa-interferonu Gx-1) a US 4 456 748 (26. června 1984, DNA sekvence kódující subsekvence různých přirozeně se vyskytujících leukocytových interferonů).
Ve vynálezu se mohou užít také mutanty interferonu-beta-la. Mutace se připravují v oboru známými metodami cílené mutageneze. Kromě toho vynález poskytuje funkčně ekvivalentní
-5CZ 300762 B6 polynukleotidy interferonu-beta-1 a. které kódují funkčně ekvivalentní polypeptidy interferonubeta-1 a.
První polynukleotid interferonu-beta-1 a je „funkčně ekvivalentní“ ve srovnání s druhým poly5 nukleotidem interferonu-beta-1 a, pokud splňuje alespoň jednu z následuj ících podmínek:
a) „funkčně ekvivalentní“ je první polynukleotid, který hybridízuje s druhým polynukleotidem za standardních hybridizačních podmínek a/nebo je degenerovanou sekvencí vzhledem k sekvenci druhého polynukleotidu, nejvýhodněji kóduje mutantu ínterferonu mající (teraio peuti ckou) aktivitu interferonu-beta-1 a,
b) „funkčně ekvivalentní“ je první polynukleotid, kóduje expresi aminokyselinové sekvence kódované polynukleotidem.
Lze shrnout, že obecný termín „interferon“ zahrnuje, který druhým avšak není omezen pouze na ně, všechna agens uvedená v předchozím textu, a také jejich funkční ekvivalenty. Termín „funkční ekvivalent“ v popisu vynálezu se týká proteinu interferonu-beta-1 a nebo polynukleotidu kódujícího interferon-beta-la, který má stejný nebo lepší prospěšný účinek na savčího příjemce jako původní interferon, k němuž se funkční ekvivalent vztahuje. Odborníkovi je zřejmé, že funkčně ekvivalentní protein může být připraven rekombinantní technikou, tj. expresí „funkčně ekvivalentní“ DNA. Tudíž předmětem předkládaného vynálezu jsou také interferony kódované přirozeně se vyskytující DNA, a také kódované DNA, která se přirozeně nevyskytuje, ale kóduje stejný protein jako je kódován přirozeně se vyskytující DNA. Díky degeneraci nukleotidových kódujících sekvencí se mohou užít jiné polynukleotidy pro kódování interferonů. K nim patří celé nebo části výše uvedených sekvencí, které byly změněny substitucí různých kodonů, které kódují stejný aminokyselinový zbytek v sekvenci, jde tedy o umlčenou záměnu. Takové změněné sekvence se považují za ekvivalenty těchto sekvencí. Tak např. Phe (F) je kódován dvěma kodony, a sice TTC nebo TTT, Tyr (Y) je kódován TAC nebo TAT a His (H) je kódován CAC nebo CAT. Na druhé straně Trp (W) je kódován jediným kodonem TGG. Tudíž je jasné, že pro danou jo sekvenci DNA kódující konkrétní interferon existuje mnoho degenerovaných DNA sekvencí, které ho kódují. Tyto degenerované sekvence jsou také předmětem předkládaného vynálezu.
„Fúze“ (také fúzní polypeptid nebo fúzní protein) označuje koíineámí spojení dvou nebo více proteinů nebo jejich fragmentů prostřednictvím peptidové kostry, a to výhodně tak, že se expri35 muje polynukleotidová molekula kódující tyto proteiny. K výhodným fúzním proteinům patři interferon-beta-la nebo jeho fragment kovalentně spojený s druhou částí, která je odlišná od interferonů. Specificky fuzní protein nebo fůze „interferon~beta/Ig“ je protein obsahující molekulu interferonu-beta podle předkládaného vynálezu (tj. interferonu-beta-1 a), nebo její fragment, jejíž N-konec nebo C-konec je navázán naN-konec imunoglobulínového řetězce, přičemž část N-konce imunoglobulinu je nahrazena interferonem-beta-la. Druhým interferon-beta/Ig fúzního proteinu je fúzní protein „interferon-beta/Fc“, což je protein obsahující molekulu interferonu-beta podle předkládaného vynálezu (tj. interferon-beta-la) spojenou s alespoň částí konstantní domény imunoglobulinu. Výhodná Fc fúze obsahuje molekulu interferonu-beta podle vynálezu spojenou s fragmentem protilátky obsahujícím C-koncovou doménu těžkého imuno45 globulinového řetězce.
Termín „fúzní protein“ znamená také protein interferonu-beta chemicky vázaný prostřednictvím mono- nebo heterofunkční molekuly ke druhé části, která je odlišná od proteinu interferonu-beta, a je připravena de novo z puntíkovaného proteinu, jak bude dáte popsáno.
Termín „rekombinantní“ znamená v popisu vynálezu protein pocházející z rekombinantních savčích expresních systémů. Protein exprtmovaný ve většině bakteriálních kultur, jako je např. £. coli, bude bez glykanů, a proto takový expresní systém není výhodný. Protein exprimovaný v kvasinkách může obsahovat otigosacharidové struktury, které jsou odlišné od struktur expri55 movaných v savčích buňkách.
-ΛJUU/DA DU
Termín „biologicky aktivní“ užívaný v předkládaném popisu jako charakteristika interferonubeta-la znamená, že příslušná molekula sdílí s provedeními vynálezu zde popsanými homologii v sekvenci aminokyselin dostatečnou k tomu, že vykazuje antivirovou aktivitu při měření in vitro antivirovým testem stejného typu, jaký je v příkladu 1 (viz popis dále).
Termín „léčivý přípravek“ nebo „farmaceutický přípravek“ v popisu vynálezu označuje přípravky obsahující proteiny podle vynálezu a další fyziologicky kompatibilní přísady. Léčívý/farmaceutický přípravek dále obsahuje excipienty jako je např. voda, minerály a nosiče jako např. pro10 teiny.
Termín „účinné množství“ činidla nebo přípravku označuje takové množství, které poskytuje požadovaný výsledek nebo projevuje vliv na určité onemocnění, které je léčeno.
„Aminokyselina“ je monomemf jednotka peptidu, polypeptidu nebo proteinu. Existuje dvacet aminokyselin, které se nacházejí v přirozeně se vyskytujících peptidech, polypeptidech nebo proteinech, a všechny jsou L-izomery, Vynález zahrnuje také analogy aminokyselin a D-izomery aminokyselin tvořících proteiny a jejich analogy.
„Derivatizovaná“ aminokyselina je přírodní aminokyselina nebo aminokyselina nevyskytující se v přírodě, kde normálně se vyskytující postranní řetězce nebo koncové skupiny (nebo cukerná část v případě interferonu-beta-la) jsou modifikovány chemickou reakcí. K takovým modifikacím patří např. gama-karboxylace, beta-karboxylace, PEGylace, sulfatace, sulfonace, fosforylace, amidizace, esterifikace, N-acetylace, karbobenzylace, tosylace a další modifikace, které jsou odborníkům známy. Takže „derivatízovaný polypeptid“ je polypeptid obsahující jednu nebo více derivatizovaných aminokyselin a/nebo jeden nebo více derivatizovaných cukrů, pokud jde o glykosyiovaný polypeptid.
„Protein“ je polymer složený v podstatě z kterýchkoliv z dvaceti proteinových aminokyselin.
1 když termín „polypeptid“ se často užívá k označení relativně velkých polypeptidů a termín „peptid“ se často užívá k označení relativně malých polypeptidů, použití těchto termínů v oboru se často překrývá a je proměnné. V tomto textu se užívá termín „protein“ k označení peptidů, proteinů i polypeptidů, pokud není výslovně uvedeno jinak, „Funkční ekvivalent“ aminokyselinového zbytku je aminokyselina, která má podobné fyzikálněchemické vlastnosti, jako aminokyselinový zbytek, který byl nahrazen funkčním ekvivalentem.
Termín „mutanta“ (případně „mutace“) označuje jakoukoliv změnu v genetickém materiálu organismu, konkrétně je to jakákoliv změna (tj. delece, substituce, adice nebo alterace) v polynukleo40 tidové sekvenci divokého typu nebo jakákoliv změna v proteinu divokého typu. Termín „mutein“ se užívá zaměnitelně s termínem mutanta.
Termín „divoký typ“ označuje přirozeně se vyskytující polynukleotidovou sekvenci exonu proteinu nebo její část, nebo aminokyselinovou sekvenci proteinu nebo její část, tak jak se normálně vyskytuje in vivo.
„Standardní hybridizační podmínky“ jsou podmínky definované koncentrací solí a teplotou v podstatě shodné s podmínkami 0,5 x SSC až 5 x SSC a 65 °C, a to jak pro vlastní hybridizaci, tak i promývání. Termín „standardní hybridizační podmínky“ zde užívaný je proto operační defi50 nice zahrnující celou řadu různých hybridizačních podmínek. Podmínky s vysokou stringencí (přísností) znamenají např. hybridizaciv pufru pro screening plaků polyvínylpyrrolidon, 0,2% Ficoll 400, 0,2% hovězí sérový albumin (BSA), 50mM Tris-HCI (pH 7,5), sodný, 1% SDS) s lMNaCl, 0,1% hydrogenfosforečnan 10% dextransulfátem a 100 μg/ml denaturované sonikované DNA lososího spermatu při 65 °C po 12 až 20 hodin a promývání v 75mM NaCl/7,5mM citrát sodný (0,5 x SSC)/1% SDS při 65 °C. Podmínky s nízkou stringencí jsou např. hybridizace
-7v pufru pro screening plaků s 10% dextransulfátem a 110 pg/ml denaturované sonikované DNA lososího spermatu při 55 °C po 12 až 20 hodin a promývání v 300mM NaCl/30mM citrát sodný (2,0 x SSC) /1% SDS při 55 °C (viz Current Protocols in Molecular Biology, John Willey and Sons, lne., New York, 6.3.1. - 6.3.6., 1989).
„Expresní kontrolní sekvence“ je polynukleotidová genů, když je sekvence, která řídí a reguluje expresi s těmito geny operativně spojena.
„Operativně spojena“ znamená v případě polynukleotidová sekvence (DNA, RNA), že je „operaío tivně spojena“ s expresní kontrolní sekvencí, když expresní kontrolní sekvence řídí a reguluje transkripci a translaci této polynukleotidové sekvence. Termín „operativně spojena“ znamená, že před polynukleotidovou sekvencí, která má být exprimována, je vhodný startovací signál (např.
ATG), a že sekvence jeve správném čtecím rámci, který dovoluje expresi polynukleotidové sekvence pod kontrolou expresní kontrolní sekvence, a tudíž produkci požadovaného polypeptidů kódovaného izolovanou polynukleotidovou sekvencí.
„Expresní vektor“ je poiynukleotid, většinou DNA plazmid nebo fág (jako nejběžnější příklady z dalších), který dovoluje expresi alespoň jednoho genu, když je vektor vnesen do hostitelské buňky. Vektor může ale nemusí být schopen replikace v hostitelské buňce.
Termín „izolovaný“ (užívaný v předkládané přihlášce zaměnitelně s termínem „v podstatě čistý“), pokud se týká nukleových kyselin, tj. polynukleotidových sekvencí, které kódují polypeptidy, znamená RNA nebo DNA poiynukleotid, část genomového polynukleotidu, cDNA nebo syntetický poiynukleotid, který v důsledku svého původu nebo zacházení s ním: I) není spojen se všemi polynukleotidy se kterými je spojen v přírodě (např. je přítomen v hostitelské buňce jako expresní vektor nebo jeho část), II) je spojen s nukleovou kyselinou nebo jinou chemickou skupinou, které se odlišují od těch, se kterými je spojen v přírodě, nebo III) nevyskytuje se v přírodě. Jako „izolovaná“ se dále označuje polynukleotidová sekvence, která je: I) amplifikovaná in vitro např. metodou polymerázové řetězové reakce (PCR), II) syntetizovaná chemicky,
III) rekombinantně připravená klonováním nebo IV) purifikovaná, např. štěpením agelovou separací.
Takže „v podstatě čistá nukleová kyselina“ je nukleová kyselina která není bezprostředně souvisle spojena s jednou nebo oběma sekvencemi, se kterými je normálně souvisle spojena v přírodně se vyskytujícím genomu organismu, ze kterého je izolována. V podstatě čistá DNA je také rekombinantní DNA, která je částí hybridního genu kódujícího další sekvence.
Termín „izolovaný“ (užívaný v předkládané přihlášce zaměnitelně s termínem „v podstatě čistý“), pokud jde o polypeptidy, znamená polypeptid nebo jeho část, který v důsledku svého původu nebo zacházení sním: I)je přítomen v hostitelské buňce jako expresní produkt úseku expresního vektoru, nebo II)je spojen sjinými proteiny nebo chemickými skupinami, než se kterými je spojen v přírodě, nebo III) nevyskytuje se v přírodě. Jako „izolovaný“ se dále označuje polypeptid, který I) byl chemicky syntetizován, II) byl exprimován v hostitelské buňce a purifikován od asociovaných proteinů. Výhodně je izolovaný polypeptid purifíkován také od dalších látek, jako jsou např. protilátky nebo gelová matrix (polyakrylamíd), které se užívají k purifikaci.
„Heterologní promotor“ je promotor, který v přírodě není spojen s genem nebo purifikovanou nukleovou kyselinou.
Termín „homologní“ je zde užíván jako synonymum pro „identický“ a týká se sekvenční podobnosti dvou polypeptidů nebo molekul nebo dvou nukleových kyselin. Když je jedna určitá pozice ve dvou srovnávaných sekvencích obsazena stejnou bází nebo aminokyselinou (např. pozice ve dvou molekulách DNA je obsazena adeninem nebo pozice ve dvou polypeptidech je obsazena lysinem), pak dvě srovnávané molekuly jsou v této pozici homologní. Procento homologie mezi dvěma sekvencemi je funkcí počtu shodných nebo homologních pozic sdílených dvěma sekven-8cemi dělený celkovým počtem pozic a vynásobený 100. Tak např. jestliže 6 z 10 pozic je shodných nebo-li homotogních, pak tyto sekvence jsou z 60 % homologní. Nebo např. DNA sekvence CTGACT a CAGGTT sdílejí 50% homologíi (3 pozice ze 6 jsou shodné). Obecně se srovnání provádí, když jsou sekvence vzájemně přiřazeny tak, aby bylo dosaženo maximální homologie.
Takové přiřazení a srovnání lze provést metodou, kterou publikoval Needleman et al., (J. Mol. Biol. 48: 443-453, 1970), a která je standardně implementována v příslušných počítačových programech jako je např. program „Align“ (DNAstar, lne.). Homologní sekvence sdílejí shodné nebo podobné zbytky aminokyselin, kde podobné aminokyselinové zbytky jsou konzervativní substituce nebo tzv. „povolené“ bodové mutace odpovídajících aminokyselinových zbytků vzhleio dem k odpovídající přirazené referenční sekvenci. V tomto smyslu „konzervativní substituce“ aminokyselinového zbytku v referenční sekvenci znamená substituci aminokyselinou, která je fyzikálně nebo funkčně podobná odpovídajícímu zbytku v referenční sekvenci, tedy např. má podobnou velikost, tvar, elektrický náboj, chemické vlastnosti včetně schopnosti vytvářet kovalentní nebo vodíkové vazby apod. Zvláště výhodné jsou kovalentní substituce, které splňují krité15 ria definovaná jako „přijatelné bodové mutace“ v publikaci Dayhoff etal., Atlas of protein Sequence and Structure 5, Suppl. 3, Chapter 22: 352-354, Nat. Biomed. Res. Foundation, Washington D.C., 1978.
Termíny „polynukleotidová sekvence“ a „nukleotidová sekvence“ jsou užívány v popisu zaměni20 tělně.
Termíny „angiogeneze“ a „neovaskularizace“ jsou užívány v nejširším významu a znamenají vytváření nových krevních cév. Zejména angiogeneze se týká také vytváření nových krevních cév v místě nádoru.
Termíny „IFNAR2“, „IFNAR1“ a „1FNAR1/2“ označují proteiny, které tvoří interferonový receptor typu I na povrchu buněk. Extracelulámí část (ektodoména) receptoru IFNAR2 sama může vázat ínterferon beta nebo alfa.
Při provádění předkládaného vynálezu byly použity standardní metody buněčné biologie, buněčných kultur, molekulární biologie, mikrobiologie, rekombinantní DNA, proteinové chemie a imunologie, které jsou odborníkům známy. Tyto metody byly publikovány v odborné literatuře. Viz např. Molecular Cloning: ALaboratory Manual, 2ndedition. (Sambrook, Fritsch and Maniatís, eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; DNA Cloning, Volumes I and II (D.N. Glover, ed.), 1985; Oligonucleotide Synthesis, (M.J. Gait, ed.), 1984; Patent US 4 683 195 (Mullis etal.,); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames and S.J. Higgins, eds.), 1984; Transcription and Translation (B.D. Hames and S.J. Higgins, eds.), 1984; Culture of Animal Cells (R.L Freshney, ed). Alan R. Liss, lne., 1987; Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press, 1986; A Practical Guide to Molecular Cloning (B. Perbal), 1984; Methods in Enzymology, Volu40 mes 154 and 155 (Wu et al„ eds), Academie Press, New York; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H. Miller and M.P. Calos, eds.), 1987, Cold Spring Harbor Laboratory; ímmunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Mayer and Walker, eds.), Academie Press. London, 1987; Handbook of Experiment Immunology, Volumes I—IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.), 1986; Manipulating the Mouše Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press,
1986.
II. Produkce a exprese fůzních proteinů
Předkládaný vynález se týká systému pro vytváření fůzních proteinů interferonu-beta-la. Vyná50 lez se zejména týká těchto proteinů a také molekul rekombinantní DNA používaných pro jejich produkci.
Polypeptidy podle vynálezu lze produkovat různými metodami, které jsou odborníkům známy. Tak např. ínterferon-beta-la úplné délky nebo zkrácený interferon-beta-la mohou být připra55 vény známými metodami rekombinantní DNA užitím cDNA (viz dále).
-9CZ, JUU/OZ tJO
Gen kódující požadovaný polypeptid interferonu-beta-la může být konstruován na základě aminokyselinové sekvence požadovaného polypeptidu. Pro syntézu genu se pak užijí standardní metody. Tak např. aminokyselinové sekvence se užije pro konstrukci „zpětně přeloženého“ genu.
Oligomer DNA obsahující nukleotidovou sekvenci kódující interferon-beta-la může být syntetizován v jediném kroku. Alternativně může být připraveno několik menších oligonukleotidů kódujících Části požadovaného interferonu-beta-la a ty se pak ligací spojí dohromady. Výhodně se DNA sekvence kódující interferon-beta-la připraví jako několik samostatných oligonukleotidů, které se následně navzájem pospojují (viz příklad 2). Jednotlivé nukleotidy typicky obsahují io 5'- nebo 3'-přesahy (přesahující úseky), které umožňují spojení na základě komplementarity.
Po sestavení výhodné geny budou charakteristické tím, že budou rozpoznávány restrikčními endonukleázami (včetně jedinečných restrikčních míst pro přímé vkládání do klonovacího nebo expresního vektoru), preferovaným využitím kodonů vzhledem k hostitelskému expresnímu orga15 nismu, který se bude užívat (výhodně savčí buňky), a tím, že po transkripci produkují stabilní a účinně translatovanou RNA. Správné sestavení lze ověřit sekvenováním, restrikčním mapováním a nebo expresí biologicky aktivního polypeptidu ve vhodném hostiteli.
Savčí cDNA pro interferon-beta může být izolována pomocí vhodné DNA sekvence lidského
2o interferonu-beta-la jakožto sondy pro screening konkrétní savčí cDNA knihovny mezidruhovou hybridizací. V předkládaném vynálezu byl užit interferon-beta ze savců jako jsou např. primáti, člověk, myš, pes, kočka, kráva, kůň a prase. Savčí interferon-beta lze získat mezidruhovou hybridizací, a sice užitím jednořetězcové cDNA pocházející DNA lidského interferonu-beta jakožto hybridizační sondy k izolaci cDNA pro interferon-beta ze savčích cDNA knihoven.
K metodám, které mohou být použity pro izolaci a klonování sekvencí interferonového genu, patří metody popsané ve výše citovaných patentech USA. Relevantní je zejména patent US 4 738 931 (19. Duben 1988), popisující DNA obsahující gen lidského interferonu-beta.
Předkládaný vynález se také týká molekul rekombinantní DNA, které obsahují výše uvedené sekvence DNA.
Molekuly rekombinantní DNA podle vynálezu jsou schopné řídit expresi polypeptidu podle vynálezu v hostiteli, který je jimi transformován. Aby bylo dosaženo exprese, musí sekvence DNA kódující fúzní polypeptid podle vynálezu být operativně spojena s expresní kontrolní sekvencí. Aby bylo dosaženo odpovídající transkripce rekombinantního konstruktu podle vynálezu, do rekombinantního vektoru se výhodně vloží vhodná sekvence promotor/enhanceru, za předpokladu, že sekvence promotor/enhancer je schopna řídit transkripci sekvence nukleové kyseliny kódující glykosylovaný interferon-beta. K promotorům, které se mohou užít k řízení exprese fúzních proteinů založených na imunoglobulinu patří, aniž by tento výčet byl omezující, časný promotor SV40 (Benoist a Chambon, 1981, Nátuře 290: 304-310), promotor obsažený v3koncové dlouhé terminální repetici (LTR) viru Rousova sarkomu (Yamamoto, etal., 1980, Celt 22: 787-797), thymidinkinázový promotor z herpes viru (Wagner etal., 1981, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 78: 144-1445), regulační sekvence metallothioninového genu (Brinster etal., 1982, Nátuře 296: 39-42), rostlinné expresní vektory obsahující promotor nopalinsyntetázy (Herrera-Estrella et al., Nátuře 303: 209-213) nebo 35S RNA promotor z viru mozaiky květáku (Gardner, etal., 1981, Nucl. Acids Res. 9: 2871), a také promotor fotosyntetického enzymu ribulózabisfofátkarboxylázy (Herrera-Estrella et al., 1984, Nátuře 310: 115-120); promotorové elementy z kvasinek nebo jiných hub jako je např. Gal4 promotor, promotor ADC (alkoholdehydrogenázy), promotor PGK (fosfoglycerolkinázy), promotor alkalické fosfatázy, a také následující zvířecí transkripční kontrolní úseky, které vykazují tkáňovou specifítu a byly užity u transgenních zvířat: kontrolní úsek genu elastázy 1, který je aktivní v buňkách pankreatu (Swift etal., 1984, Cell 38: 639-646; Omitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399-409; MacDonald, 1987, Hematology 7: 425515); zesilovače (enhancery) nebo promotory genu pro insulin, které jsou aktivní v beta-buňkách pankreatu (Hanahan, 1985, Nátuře 315: 115—
122); enhancery nebo promotory imunoglobulinových genů, které jsou aktivní v lymfatických
-10buňkách (Grossched, etaL, 1984, Cell 38: 647-658; Adames etal., 1985, Nátuře 318: 533-538; Alexander etal., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1 436-1 444); úsek promotoru aenhanceru časných genů cytomegaioviru (Boshart et al., 1985, Cell 41: 521530); kontrolní úsek myšího viru nádoru prsní žlázy, který je aktivní v buňkách varlat a prsu, a lymfatických a žírných buňkách (Leder etal., 1986, Cell 45: 485—495); kontrolní úsek albuminového genu, který je aktivní v játrech (Pinkert etal., 1987, Genes and Devel. 1: 268-276); kontrolní úsek genu pro alfafetoprotein, který je aktivní v játrech (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cello Biol. 5: 1 639-1 648; Hammer et al., 1987, Science 235: 53-58); kontrolní úsek genu alfa 1-antitrypsinu, který je aktivní v játrech (Kelsey etal, 1987, Genes and Devel. 1: 161-171); kontrolní úsek beta-globinového genu, který io je aktivní vmyeloidních buňkách (Mogram etal., 1985, Nátuře315: 338-340; Kollias etal., 1986, Cell 46: 89-94); kontrolní úsek genu pro myelinový bazický protein, který je aktivní voligodendrocytech mozku (Readhead etal., 1987, Cell48: 703-712); kontrolní úsek lehkého řetězce 2myosinu, který je aktivní v kosterním svalstvu (Sani, 1985, Nátuře 314:283-286); a kontrolní úsek genu hormonu uvolňujícího gonadotropiny, který je aktivní v hypothalamu (Mason et al., 1986, Science 234: 1 372-1 378). Prokaryotické expresní systémy, jako např. LAC promotor nebo betar-laktamázový promotor (Villa-Kamaroff, etal., 1978, Proč. Nati. Acad, Sci. U.S.A, 75: 3 727-3 731) nejsou výhodné pro předkládaný vynález, neboť takto exprimovaný interferon-beta by nebyl glykosylovaný. Nicméně prokaryotické expresní systémy, které umožní glykosylaci interferonu-beta buďto v prokaryotickém, nebo eukaryotickém hostiteli, jsou také předmětem předkládaného vynálezu.
Expresní vektory, které mohou být použity, jsou například, aniž by však tento výčet byl omezující, následující vektory nebo jejich deriváty: lidské nebo zvířecí viry jako je virus vakcínie, vektory založené na adenovirech nebo retrovirech, hmyzí viry jako bakuloviry, kvasinkové vektory, bakteriofágové vektory (např. lambda) a plazmidové a kosmidové DNA vektory, abychom jmenovali alespoň některé. Specificky k užitečným expresním vektorům pro výhodné eukaryotické hostitele patří vektory obsahující expresní kontrolní sekvence z SV40, hovězího papillomavíru a cytomegaioviru. Uvnitř každého specifického vektoru se vyberou různá místa pro vložení požadované DNA sekvence. Tato místa jsou většinou definována restrikčními endo30 nukleázami, které v těchto místech štěpí DNA. Odborníkovi je toto dobře známo. Je také jasné, že daný expresní vektor užitečný pro vynález nemusí mít restrikční endonukleázová místa pro inzerci vybraného fragmentu DNA. Místo toho se vektor spojí s fragmentem alternativním způsobem.
Expresní vektor, místo vybrané pro inzerci vybraného fragmentu DNA a operativní spojení k expresní kontrolní sekvenci jsou určeny mnoha různými faktory jako je např. počet míst štěpitelných konkrétním restrikčním enzymem, velikost polypeptidu, citlivost polypeptidu k proteolytické degradaci apod. Výběr vektoru a inzerčních míst pro danou DNA je pak dán balancí těchto faktorů.
Rekombinantní konstrukty podle vynálezu se vnesou do buněk, které jsou schopné exprimovat fúzní protein, metodami, které jsou odborníkům známy. K těmto metodám patří transformace (např. metodou s DEAE-dextranem nebo kalciumfosfátem), transfekce, mikroinjekce, infekce, vstřelování do buňky a elektroporace buňky. Může být užita jakákoliv hostitelská buňka, za před45 pokladu, že sekvence rekombinantní nukleové kyseliny bude adekvátně transkribována do RNA v buňkách tohoto typu a že tyto buňky jsou schopny glykosylovat protein. Kromě toho jakékoliv konstrukty rekombinantní nukleové kyseliny podle vynálezu mohou být užity k vytvoření transgenních zvířat, s výjimkou člověka, schopných produkovat fúzní proteiny založené na imunoglobulinu. Ve výhodném provedení vynálezu jsou hostitelské buňky savčí buňky jako jsou např.
buňky COS nebo CHO.
Úspěšnou inkorporaci těchto polynukleotídových konstruktů do daného expresního vektoru je možno identifikovat obecně třemi možnými postupy: (a) DNA-DNA hybridizací, (b) přítomností či absencí funkcí „markerových“ genů, a (c) expresí vložené sekvence. V prvním z uvedených případů se přítomnost genu interferonu-beta-1 a v expresním vektoru detekuje hybridizací DNA-11CZ 300762 B6
DNA užitím sondy, která obsahuje sekvence homologní s vloženým genem fúzního proteinu. Ve druhém případě se rekombinantní systém vektor/hostitel identifikuje a selektuje na základě přítomnosti nebo nepřítomnosti určité markerové funkce (např. thymidinkinázová aktivita, resistence k antibiotikům jak např. G418, transformovaný fenotyp, vytváření okluzních tělísek u bakuloviru apod.) způsobené vložením cizorodého genu do vektoru. Tak např. když je polynukleotid vložen do vektoru tak, že přerušuje sekvenci markerového genu, rekombinanty obsahující inzert jsou identifikovány na základě absence funkce markerového genu. Ve třetím případě je rekombinantní expresní vektor identifikován testováním exprese cizorodého genového produktu z rekombinantního vektoru. Takové testy jsou např. založeny na fyzikálních nebo funkčních vlastnostech genového produktu v biologických testovacích systémech.
Je třeba mít na paměti, že ne všechny kombinace hostitel/expresní vektor fungují se stejnou účinností při expresi DNA kódující polypeptid podle vynálezu. Avšak odborník může provést konkrétní výběr kombinace hostitel/expresní vektor při uvážení principů stanovených v předkládané15 ho vynálezu aniž by se odchýlil od vynálezecké myšlenky předkládaného vynálezu.
Výhodné provedení předkládaného vynálezu zahrnuje fúzní proteiny a sekvence DNA, které tyto proteiny kódují. Tyto fúzní proteiny mají amino-koncový úsek charakterizovaný aminokyselinovou sekvencí interferonu-beta-la a karboxy-koncový úsek obsahující doménu proteinu jiného než je interferon-beta-la. Generický vzorec výhodného fúzního proteinu je protein mající aminokyselinovou sekvenci X-Y-Z, kde X je polypeptid mající aminokyselinovou sekvenci, nebo alespoň její část, odpovídající aminokyselinové sekvenci lidského interferonu-beta, Y je volitelná spojovací Část (linker) a Z je polypeptid obsahující alespoň část polypeptidu jiného než je lidský interferon-beta. V jednom provedení část Z je část polypeptidu, který obsahuje imuno25 globulinu podobnou doménu. K příkladům takových polypeptidu patří CD1, CD2, CD4 a členy I. a II. třídy antigenů hlavního histokompatibilního systému (pro příklady těchto polypeptidu viz také přihlášku US 5 565 335, Capon et al.).
Část Z obsahuje např. několik histidinových zbytků, nebo výhodné Fc úsek imunoglobulinu, přičemž „Fc“ je definován jako fragment protilátky obsahující C-koncovou doménu těžkého řetězce imunoglobulinu.
V nej výhodnějším provedení íuzního proteinu podle vynálezu je polypeptid interferonu-beta-la fúzován prostřednictvím svého C-konce s alespoň částí Fc úseku imunoglobulinu. Interferon35 beta-la tak vytváří amino-koncovou část a Fc vytváří karboxy-koncovou část fúzního proteinu.
V těchto fúzních proteinech je výhodně omezen na kloubový úsek konstantní domény a domény CH2 a CH3. Fc fragment těchto íuzních proteinů může být také omezen na část kloubového úseku, která je schopna tvořit intermolekulámí disulfidické můstky, a domény CH2 a CH3, nebo odpovídající funkční ekvivalent. Takové konstantní úseky mohou pocházet z jakéhokoliv savce (výhodně člověka) a mohou být získány zjakékoliv třídy a/nebo izotypu protilátky včetně IgA, IgD, IgM, IgE and IgGl, IgG2, IgG3 a IgG4.
Molekuly rekombinantní nukleové kyseliny kódující Ig fúze lze připravit jakoukoliv metodou v oboru známou (viz Maniatis etak, 1982, Molecular Cloning; A Laboratory to Manual, Cold
Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.) nebo užitím veřejně dostupných klonů. Metody přípravy genů, které kódují konstantní úseky těžkých a lehkých řetězců imunoglobulinu, byly popsány např. v Robinson, R. etal., mezinárodní patentová přihláška PCT publikovaná jako WO87/02671. Sekvence cDNA kódující molekulu interferonu nebo její fragment může být přímo spojena s DNA sekvencí kódující konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu nebo může být spojena prostřednictvím spojovací sekvence (linkeru). V jiném provedení vynálezu je rekombinantní expresní systém vytvořen tak, že obsahuje sekvenci kódující interferon-beta ve správném čtecím rámci se syntetickým úsekem pro kloubovou oblast protilátky. Kromě toho může být potřebné vložit, jako část rekombinantního vektorového systému, nukleové kyseliny odpovídající 3-koncový úsek lemující imunoglobulinový gen obsahující místa pro Štěpení a polyadenylaci
RNA a „downstream“ sekvence. A dále může být potřebné vložit signální sekvenci do polohy
-12„upstream“ od kódující sekvence imunoglobulinového fuzního proteinu, aby se umožnila sekrece fuzní molekuly z buněk trans formovaných rekombinantním vektorem.
Předkládaný vynález poskytuje dimemí fuzní molekuly a také monomemí nebo multimemí mole5 kuly obsahující fuzní proteiny. Takové multimemí molekuly mohou být připraveny užitím takových Fc úseků Ig molekul, nebo jejich Částí, které jsou obvykle multivalentní jako jsou např. pentamery IgM nebo dimery IgA. Je zřejmé, že polypeptid J řetězce je potřebný pro vytvoření a stabilizaci pentamerů IgM a dimerů IgA. Alternativně multímery fuzních proteinů interferonubeta-la mohou být připraveny užitím proteinu s afinitou k Fc úseku Ig molekul, jako je např.
protein A. Tak např. mnohé fuzní proteiny interferon-beta-la/imunoglobulin mohou být navázány na agarózové perličky s proteinem A.
Tyto polyvalentní formy jsou užitečné, neboť mají mnoho vazebných míst pro receptor interferonu-beta-la. Např. bivalentní rozpustný interferon-beta-la je složen ze dvou tandemově se opakujících sekvencí aminokyselin 1 až 166 v sekvenci id. ě. 2 (nebo kódovaných úsekem 1 až 498 sekvence id. č. 1) (ěástX v generickém vzorci) oddělených spojovacím úsekem (část Y), a tato repetice je spojena s alespoň částí konstantní domény imunoglobulinu (část Z). Pozměněné polyvalentní formy mohou být zkonstruovány, např. chemickým navázáním fůze interferonbeta-la/Ig na klinicky přijatelnou nosičovou molekulu, polymer vybraný ze skupiny obsahující
Ficoll, polyethylenglykol nebo dextran, a sice obvyklými metodami konjugace. Alternativně může být interferon-beta-la chemicky konjugován sbiotinem, a tento konjugát biotin-interferon-beta-Fc se pak naváže na avidin, čímž vznikne tetravalentní molekula avidin/biotin/interferon-beta. Fúze interferon-beta-la/Ig může být také kovalentně navázána na dinitrofenol (DNP) nebo trinitrofenol (TNP), a výsledný konjugát pak precipitován pomocí anti-DNP nebo anti-TNPIgM, čímž se vytvoří dekamemí konjugáty s valencí 10 pro vazebná místa k receptoru interferonu-beta.
Proteiny interferonu-beta-1 a a jejich fragmenty a fuzní proteiny podle vynálezu mohou být izolovány a purifikovány obvyklými metodami, jako je např. extrakce, precipitace, chromatografie, afinitní chromatografie, elektroforéza apod. Např. interferonové proteiny a jejich fragmenty se mohou purifikovat tak, že se jejich roztok nanese na kolonu obsahující imobilizovaní receptory interferonu (viz např. patent US 4 725 669). Navázané molekuly interferonu se pak eluují užitím chaotropní soli nebo užitím vodného roztoku kyseliny octové. Imunoglobulinové fuzní proteiny mohou být purifikovány tak, že procházejí přes obsahující mobilizovaný protein A nebo pro35 tein G, které selektivně váží úsek Fc fuzního proteinu (viz např. Reis, K. J., et al., J. Immunol. 132: 30983102 (1984); PCT přihláška publikovaná jako W087/00329). Chimérická protilátka se pak eluuje užitím chaotropní soli nebo užitím vodného roztoku kyseliny octové.
Alternativně se molekuly fúzního proteinu interferonu a imunoglobulinu pro získání v podstatě
Čistého proteinu purifikují na koloně s anti-interferonovou protilátkou nebo na koloně s antiimunoglobulinovou protilátkou.
Termínem „v podstatě čistý“ je míněn protein zbavený nečistot, které jsou s ním v přirozeném stavu spojeny. V podstatě čistý stav je možné dokázat výskytem jediného pásu při elektroforéze.
Příkladem užitečného fúzního proteinu interferon-beta-la/Ig podle vynálezu je protein sekvence id. č. 2, který je secemován v buněčné kultuře eukaryotických buněk obsahujících expresní plazmid pCMG261 (viz příklad 2). Tento protein se skládá ze zralého lidského interferonu-betala fúzovaného s částí kloubového úseku a konstantními doménami CH2 a CH3 myšího Ig.
Přitom obsahuje úsek myšího imunoglobulinu dostatečný k tomu, aby byl rozpoznán Fc vazebným proteinem, a sice proteinem A.
Další fuzní proteiny podle vynálezu obsahující lidský interferon-beta-1 jsou uvedeny: (a)jako sekvence id. č, 3 a 4, ukazující cDNA a dedukovanou aminokyselinovou sekvenci his-označené
- 13JVV/Vi DU fúze interferonu-beta-1 a (také ukázána na obr. 1), a (b) sekvence id, č. 1 pro cDNA kódující fúzní protein interferon-beta-la/Ig se sekvencí id. č. 2 (ukázán také na obr. 2).
Výhodné proteiny interferonu-beta-la podle vynálezu obsahující novou „spojovací“ sekvenci
DNA id. č. 5 a aminokyselinovou sekvenci id. č. 6 představující kodony 11 tripletů na obou stranách spoje mezi DNA lidského interferonu-beta a DNA kódující konstantní úsek lidského imunoglobulinu (viz příklad 5: sekvence id. č. 41 a 42). Specificky, sekvence id. č. 5 kódující lidský interferon-beta-la končí nukleotidovým tripletem 568-570 (AAC) a DNA kódující konstantní úsek lidského IgGl začíná tripletem (GAC) počínaje nukleotidem č. 574 v sekvenio ciid. č. 41, Odpovídající dedukovaná aminokyselinová „spojovací“ sekvence je uvedena jako sekvence id. č. 6 a je založena na sekvenci id. č. 42. Byla definována i další jedinečná „spojovací“ sekvence, která zahrnuje linkerovou sekvenci ve výsledném DNA konstruktu (viz příklad 5: sekvence id. č. 43 a 44). Tato sekvence „spojovací“ DNA a příslušná aminokyselinová sekvence jsou uvedeny jako sekvence id. č, 7 a 8, které ukazují kodony 11 tripletů na obou stranách spoje přímo mezi koncem sekvence interferonu-beta-la (nukleotid č. 570 v sekvenci id. č. 43) a sekvencí linkeru (nukleotidy 571 až 585 v sekvenci id. č. 43, GGGGS (sekvence id. č. 64) v sekvenci id. č. 8).
„Spojovací“ DNA sekvence mohou být užity jako DNA sondy a jsou to minimální DNA potřebné pro hybridizaci za standardních podmínek s jakoukoliv DNA sekvencí kódující fúzní protein interferon-beta-la/Ig. Nicméně za předpokladu, že celá sonda hybridizuje s oběma stranami spojovací sekvence a obě strany spoje interferon-beta/konstantní úsek se podílejí na hybridizaci, mohou existovat i menší sekvence. Navíc odborníkovi je zřejmé, že DNA sekvence větší než sekvence id. č. 7 jsou také vhodné pro hybridizaci. Odborník může snadno otestovat, zda konkrétní sonda, jak např. sekvence id. č. 5 nebo 7, je schopna hybridízace na obou stranách spojení, a to tak, že označí 5'-konec buďto jednořetězcového „sense“ oligonukleotidu, nebo jednořetězcového „anti-sense“ oligonukleotidu vhodně značeným fosfátem z ATP užitím polynukleotidkinázy. Sekvence podle vynálezu musí hybridizovat s oběma, a tudíž být označena oběma oligonukleotidovými sondami. Odborníkovi je také zřejmé, že vynález zahrnuje také plně degenerované sekvence kódující spojovací sekvenci id. č. 5 nebo 7.
III. Další varianty interferonových fúzních polypeptidů
K derivátům proteinů podle vynálezu patří také různé strukturní formy primárních proteinů, které si uchovávají biologickou aktivitu. Díky přítomnosti ionizovatelné aminoskupiny a karboxylové skupiny mohou být fúzní proteiny interferonu-beta např. ve formě kyselých nebo bazických solí, nebo mohou být v neutrální formě. Jednotlivé aminokyselinové zbytky mohou být modifikované oxidací nebo redukcí. A dále primární aminokyselinová struktura (včetně N- a/nebo C-koncových úseků) nebo glykanová část interferonu-beta mohou být modifikovány (derivatizovány) vytvářením kovalentních nebo agregovaných konjugátů sjinými chemickými skupinami, jako jsou např. glykosylové skupiny, polyalkylenglykolové polymery jako např. polyethylenglykol (PEG: viz současně projednávané přihlášky stejného přihlašovatele č. 60/104,491 a 60/120,237), lipidy, fosfáty, acetylové skupiny apod., a nebo vytvářením mutací aminokyselinových sekvencí.
K dalším derivátům interferonu-beta/Ig patří kovalentní nebo agregované konjugáty interferonubeta nebo jeho fragmentů sjinými proteiny nebo polypeptidy, které jsou připojeny syntézou v rekombinantní kultuře jako dodatečné C- nebo N-konce. Tak např. konjugovaný peptid může být signální (nebo tzv. vedoucí) polypeptidová sekvence v N-koncovém úseku proteinu, která při translaci (kotranslačně) nebo po translaci (posttranslačně) směruje přenos proteinu z místa jeho syntézy do místa jeho působení uvnitř buňky nebo vně buněčné membrány nebo buněčné stěny (např. vedoucí sekvence alfa-faktoru kvasinek). Receptorové proteiny interferonu-beta mohou obsahovat peptidy přidané pro usnadnění purifikace nebo identifikace interferonu-beta (např. fúze histidin/interferon-beta-la). Aminokyselinová sekvence interferonu-beta může být také spojena s peptidem Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYK.DDDDK) (sekvence id. č. 61) (Hopp et al., Bio/Technology 6: 1 204,1988.) Tato sekvence Je silně antigenní a poskytuje epitop
- 14reverzibilně vázaný specifickou monoklonální protilátkou, což umožňuje rychlé testování a snadné Čištění exprimovaného rekombinantního proteinu. Tato sekvence je také specificky štěpena enterokinázou z hovězí sliznice v místě zbytku bezprostředně následujícím po dvojici Asp-Lys.
K dalším analogům patří fuzní proteiny interferonu-beta s Fc nebo jejich biologicky aktivní fragmenty, jejichž sekvence interferonu-beta se liší od sekvencí uvedených jako sekvence id, ě. 2,4, 6 nebo 8 jednou nebo více konzervativními záměnami aminokyselin nebo jednou či více nekonzervativními záměnami, a nebo delecemi nebo inzercemi, které nenarušují biologickou aktivitu izolovaného proteinu. Ke konzervativním substitucím typicky patří substituce jedné aminokyseío líny druhou aminokyselinou s podobnými vlastnostmi, jako jsou např. substituce v rámci následujících skupin: valin, alanin a glycin; leucin a isoleucin; kyselina asparagová a glutamová, asparagin; a glutamin; serin a threonin; lysin a arginin; a fenylalanin a tyrosin. K nepolárním hydrofobním aminokyselinám patří alanin, leucin, isoleucin, valin, prolin, fenylalanin, tryptofan a methionín. K polárním neutrálním aminokyselinám patří glycin, serin, threonin, cystein, tyrosin, aspara15 gin a glutamin. K pozitivně nabitým (bazickým) aminokyselinám patří arginin, lysin a histidin. K negativně nabitým (kyselým) aminokyselinám patří kyselina asparagová a kyselina glutamová. Další konzervativní substituce jsou odborníkovi jasné. Tak např. pro konzervativní substituci aminokyseliny alaninu je možné vybrat kteroukoliv z aminokyselin jako je D-alanin, glycin, beta-alanin, L-cystein a D-cystein. Pro lysin lze vybrat jako náhradu kteroukoliv z aminokyselin
D-lysin, arginin, D-arginin, homo-arginin, methionin, D-methionin, omitin a D-omitin. Obecně substituce, u kterých se dá očekávat, že způsobí změny ve funkčních vlastnostech izolovaných polypeptidů, jsou případy, kdy: (i) polární zbytek, např. serin nebo threonin, je nahrazen (nebo se užije k nahrazení) hydrofobním zbytkem, např. leucinem, isoleucinem, fenylalaninem nebo alaninem (ii) cysteinový zbytek je nahrazen (nebo se užije k nahrazení) jiným zbytkem a nebo (iii) zbytek mající elektropozitivní vedlejší řetězec např. lysin, arginin nebo histidin, je nahrazen (nebo se užije k nahrazení) zbytkem majícím elektronegativní vedlejší řetězec, jako je např. kyselina glutamová nebo asparagová, nebo (iv) zbytek mající objemný vedlejší řetězec, jako je např. fenylalan, je nahrazen (nebo se užije k nahrazení) zbytkem, který nemá takový vedlejší řetězec, např. glycinem. Vynález také zahrnuje izolované molekuly, které jsou alelickými variantami, přirozenými mutantami, indukovanými mutantami nebo proteiny, které jsou kódovány DNA hybridizující za podmínek vysoké či nízké stringence s nukleovými kyselinami kódujícími polypeptid se sekvencemi id. č. 2,4,6 nebo 8.
Původci připravili další mutanty interferonu-beta-la, které jsou dalšími variantami části inter35 feronu-beta-la v proteinu podle vynálezu. Tyto interferon-beta-la části mohou být zvláště užitečné, pokud projevují nové vlastností, které nemá interferon-beta-la divokého typu (viz příklad 1). Stručně shrnuto, byla provedena mutační analýza lidského interferonu-beta-la s cílem mapovat aminokyselinové zbytky nutné pro aktivitu a vazbu receptoru. Dostupnost trojrozměrné krystalové struktury lidského interferonu-beta-la (viz Karpusas etal., 1997, Proč.
Nati. Acad. Sci. 94: 11 813-11818) umožnila identifikovat, pro alaninové (nebo serinové) substituce zbytky, které jsou vystaveny rozpouštědlu a jsou dostupné pro interakce s receptorem interferonu-beta, a přitom zachovat aminokyselinové zbytky podílející se na vytváření intramolekulámích vazeb. Byl připraven panel 15 alaninových „skenovacích“ mutant, kde bylo nahrazeno 2 až 8 zbytků v určitých oblastech šroubovic (A, B, C, D, E) a smyček (AB1, AB2, AB3,
CD1, CD2, DE1, DE2) interferonu-beta-1 a (viz příklad 1).
Amino-koncová histidinová značka („his“ tag) byla vložena pro afinitní purifikaci mutant exprimovaných v savčích buňkách (sekvence id. č. 2, obr. 1). Funkční důsledky těchto mutací byly vyhodnoceny pomocí antivirových a antiproliferačních testů. Byl také vyvinut neradioaktivní so vazebný test pro analýzu schopnosti mutant vázat se na receptor interferonu-beta na povrchu buněk (buněčný povrchový receptor IFNAR1/2). Navíc byl užit test založený na EUSA-testu užívající fúzní protein „ektodoméma IFNAR2/Fc“ k navázání interferonu pro mapování povrchových interakcí mezi interferonem-beta-la a IFNAR2 (viz příklad 2). Tyto mutační analýzy ukázaly, že N- a C-konce leží v části molekuly interferonu-beta, která není důležitá pro vazbu receptoru nebo pro biologickou funkci.
-15LZ. JUU7<tí Bft
Byly identifikovány tři druhy účinků, které byly způsobeny cílenou mutagenezí. Tyto účinky mohou být za určitých okolností výhodné při vývoji interferonových léčiv. Tyto tři účinky byly následující: (a) mutanty s vyšší antivirovou aktivitou než interferon-beta-la divokého typu s his-značkou (např. mutanta Cl), (b) mutanty aktivní jak v antivirovém, tak antiproliferačním testu, ale jejich antiproliferační aktivita byla neúměrně nízká ve srovnání s antivirovou aktivitou, vzhledem k interferonu-beta-1 a divokého typu s his-značkou (např. mutanty Cl, D a DE1), a(c)funkčně antagonistické mutanty (např. AI, B2, CD2 a DE1), které vykazují antivirovou i antiproliferační aktivitu, která byla neúměrně nízká ve srovnání s vazebnou aktivitou k recep10 toru, vzhledem k interferonu-beta-1 a divokého typu.
Kromě toho i spojení mezi interferonovou částí (X) a druhou částí (Z), která je odlišná od interferonu-beta-1 a (např. Fc fragment imunogiobulinu) může být způsobeno chemickou reakcí, která bude vázat obě molekuly tak dlouho, dokud si imunoglobulin a interferon-beta-la zacho15 vají své aktivity. K takovým chemickým spojením patří např. kovalentní vazba, afinitní vazba, interkalace, koordinační vazba a vytvoření komplexu. Příkladem spojovacích činidel (tj. linkeru Y v generickém vzorci), která vytvoří kovalentní vazby mezí interferonovou a imunoglobulinovou částí patří organické sloučeniny jako např. thioestery, karbodiimidy, sukcinimidestery, diisokyanáty jako je tolylen-2,6-diisokyanát, glutaraldehydy, diazobenzeny a hexamethylen20 diaminy jako je např. bis-(p-díazoniumbenzoyl)-ethylendiamin, bifunkční deriváty imidoesterů jako je dimethyladipimidát, a biaktivní sloučeniny fluoru jako je l,5-difluoro-2,4-ďinitrobenzen. Tento výčet není samozřejmě vyčerpávajícím seznamem různých tříd chemických vazebných činidel v oboru známých. Mnohá z nich jsou také komerčně dostupná jako např. N-sukcinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionát (SPDP), hydrochlorid l-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)25 karbodiimidu (EDC); 4-sukcinimidyloxykarbonyl-alfa-methyl-alfa-(2-pyridyldithio)-toluen (SMPT: Pierce Chem. Co., katalog, č. 21558G).
IV. Využití vynálezu
Fúzní proteiny podle vynálezu se mohou využít ve farmaceutických přípravcích tam, kde je potřeba užit léčení interferonem. Tyto molekuly mají výhody fúzních proteinů, zejména fůzních proteinů s Ig, jde zejména o změněnou farmakokinetiku a farmakodynamiku, která vede k prodlouženému biologickému poločasu a prodloužené době setrvání v cévním systému. Kromě toho zvláště výhodné proteiny glykosylovaného interferonu-beta-1 a, ačkoliv jsou strukturně podobné interferonu-beta-lb, mají mnohonásobně vyšší biologickou aktivitu než neglykosylovaný interferon-beta-lb (viz Runkel et al., 1998, Pharm. Res. 15: 641-649).
Produkty podle vynálezu byly shledány užitečnými pro udržení biologického poločasu terapeutického interferonu-beta-1 a, a mohou být pro terapeutické podávání upraveny např. rozpuštěním ve vodě nebo v jiném vhodném kapalném médiu, podávání se provádí parenterálním nebo perorálním způsobem nebo ve formě aerosolu. Pro perorální podávání mohou být připraveny jemné koloidní suspenze pro dosažení depotního účinku pří parenterálním podávání, nebo při perorálním podávání, zatímco aerosolové přípravky jsou povahou kapalné přípravky nebo ve formě suchého prášku. Fúze interferonu-beta-1 a podle předkládaného vynálezu by měly mít dobrou stabilitu při skladování v suchém lyofilizovaném stavu nebo jako kapalné přípravky.
Terapeutické proteiny mohou být užity k profylaxi podle předkládaného vynálezu nebo k léčení jakékoliv nemoci nebo poruchy, pro které je účinnou složkou interferon-beta-la. Kromě toho fúzní proteiny podle vynálezu se mohou užít pro diagnózu složek, stavů nebo nemocí v biologic50 kých systémech nebo vzorcích, stejně tak jako pro diagnostiku v jiných než fyziologických systémech.
Při terapeutickém využití předkládaný vynález předpokládá využití k léčení zvířete, která buďto již trpí, nebo je latentně náchylné k onemocnění a vyžaduje tudíž takové léčení, které spočívá v tom, že se zvířeti podává účinné množství fúzního proteinu podle vynálezu, které je terapeutic-16ky účinné pro danou nemoc nebo poruchu. K subjektům, které budou léčeny fuzními proteiny podle vynálezu patří zvířata a především člověk. V závislosti na nemoci nebo stavu, které mají být léčeny, zvířeti se podává fuzní protein interferonu-beta-la podle vynálezu v jakékoliv terapeuticky účinné a bezpečné dávce, kterou odborník snadno stanoví bez nutnosti nadměrného experimentování. Vzhledem k mezidruhové bariéře pro interferony typu I je nezbytné připravit fuzní proteiny interferonu-beta-la podle vynálezu vždy s interferony zodpovídajícího biologického druhu.
Antiproliferační buněčná aktivita interferonu-beta-la je dobře známa. Konkrétně některé fuze io interferonu-beta-la popsané v předkládané přihlášce jsou užitečné k léčení nádorových a rakovinných onemocnění, jako je např. osteogenní sarkom, lymfom, akutní lymfocytámí leukémie, karcinom prsu, melanom a nasofaryngeální karcinom, a také autoimunitních onemocnění jako je např. fibróza, lupus a roztroušená skleróza mozkomíšní. Také se dá očekávat, že antivirová aktivita, kterou projevují fuzní proteiny podle vynálezu, se využije k léčení virových onemocnění, jak je např. infekce ECM, chřipka a další infekce respiračního traktu, hepatitida a rabies. Také se dá očekávat, že imunomodulační aktivita, kterou projevují fuzní proteiny podle vynálezu, se využije k léčení autoimunitních a zánčtlivých onemocnění jako je např. fibróza a roztroušená skleróza mozkomíšní. Schopnost interferonu-beta-la inhibovat vytváření nových krevních cév (tj. inhibovat angiogenezi a neovaskularizaci) předurčuje fuzní proteiny podle vynálezu k použití při léčení angiogenních nemocí jako je např. diabetická retinopatie, retinopatie předčasně narozených, makulámí degenerace, odvržení štěpu rohovky, neovaskulámí glaukom, retrolentální fibroplázie, rubeóza a Osler-Weberův syndrom. Kromě toho antiendoteliální aktivita interferonu je již nějakou dobu známa a jeden z možných mechanismů působení interferonu může být narušení aktivity endotelových buněk tím, že inhibuje produkci nebo aktivitu angiogenních faktorů produkovaných nádorovými buňkami. Některé cévní nádory, jako např. hemangiomy, jsou zvláště citlivé k léčení interferonem. Léčení interferonem alfa je zatím jediným doloženým způsobem léčení této nemoci. Lze očekávat, že léčení fuzními proteiny interferonu-beta-la podle vynálezu poskytne značný farmaceutický prospěch ve smyslu zlepšené farmakokinetiky a farmakodynamiky, neboť konjugáty zůstávají v cévách po delší dobu než nekonjugované inter30 ferony, což umožňuje mnohem účinnější terapii při použití konjugátů jako antiangiogenního léčiva (viz příklad 9).
Fúze polymer-ínterferon-beta-la podle vynálezu mohou být podávány jako takové a nebo ve formě farmaceuticky přijatelných esterů, solí nebo jiných fyziologicky aktivních derivátů.
V těchto farmaceutických přípravcích je interferon-beta-la výhodně užíván společně s jedním nebo více farmaceuticky přijatelnými nosiči, a volitelně jakýmikoliv dalšími terapeutickými složkami. Nosič musí být farmaceuticky přijatelný v tom smyslu, že musí být kompatibilní s ostatními složkami v přípravku a nesmí být nadměrně škodlivý pro příjemce. Přípravek interferonubeta-la se podává v množství účinném pro dosažení požadovaného farmakologického účinku, jak již bylo popsáno výše, a v takových dílčích množstvích, aby bylo dosaženo požadované denní dávky.
K vhodným lékovým formám patří formy pro parenterální i jiné podávání, k vhodným specifickým způsobům podávání patří např. podávání perorální, rektální, bukální, topické, nazální, oftal45 mické, subkutánní, intramuskulámí, intravenózní, transdermální, intrathekální, intraartikulámí, intraarteriální, subarachnoidální, bronchiální, lymfatické, vaginální a intrauterinní. Výhodné jsou lékové formy pro perorální, nazální a parenterální podávání.
Pokud je interferon-beta-la užit v přípravku, který obsahuje tekutý roztok, přípravek se výhodně podává perorálně nebo parenterálně. Pokud je interferon-beta-la užit v přípravku, který je ve formě tekuté suspenze nebo suchého prášku formulován společně s biologicky kompatibilním nosičem, pak se může výhodně podávat perorálně, rektálně nebo bronchiálně.
Pokud je interferon-beta-la užit v přípravku přímo jako tuhá látka ve formě prášku, výhodně se může podávat perorálně. Alternativně se může podávat nazálně nebo bronchiálně, pomocí nebu- 17lizace prášku v nosičovém plynu, kdy se vytváří disperze prášku v plynu, kterou pacient vdechuje, a sice užitím vhodného nebulizačního zařízení.
Přípravky obsahující fúzní proteiny podle předkládaného vynálezu se výhodně formulují do jednotkových lékových forem, a sice jakýmikoliv metodami, které jsou odborníkům ve farmacii známy. Tyto metody obecně obsahují krok, kdy se účinná složka smísí s nosičem a případně dalšími pomocnými složkami. Typicky se přípravky připravují uniformním a dokonalým smísením účinné složky (čí více účinných složek) s kapalným nosičem, jemně rozmělněným tuhým nosičem nebo oběma, a pak se produkt podle potřeby formuluje do požadovaných lékových forem.
Přípravky podle vynálezu vhodné pro perorální podávání jsou v podobě diskrétních jednotek jako jsou např, tobolky, oplatky, tablety nebo pastilky, kdy každá taková forma obsahuje předem stanovené množství účinné složky v podobě prášku nebo granulátu, nebo v tekuté formě, vodné nebo bezvodé,jako je např. sirup, elixír, emulze nebo pěna.
Tablety se připravují lisováním nebo odléváním, případě s jednou nebo více pomocnými složkami. Lisované tablety se připravují lisováním na vhodných zařízeních, kde se užívá účinná složka ve volně sypké formě jako je prášek nebo granulát, která se případně mísí s pojidly, rozvoíňující20 mi činidly, lubrikanty a inertními ředidly, povrchově aktivními činidly a uvolňovacími činidly, odlévané tablety obsahují směs práškového polymerového konjugátu s vhodným nosičem a připravují se odléváním pomocí vhodného zařízení.
Sirup se připraví přidáním účinné látky do koncentrovaného vodného roztoku cukru, např. sacha25 rózy, ke kterému se přidají ještě další pomocné přísady. K takovým přísadám patří příchutě, konzervační činidla, činidla zpomalující rozpustnost krystalízaci cukru a činidla zvyšující rozpustnost ostatních složek jako jsou např. polyhydroxyalkoholy, jako je glycerol nebo sorbitol.
Lékové formy vhodné pro parenterální podávání výhodně obsahují sterilní vodné přípravky aktivního proteinu, které jsou výhodně isotonické s krví příjemce (např. fyziologický solný roztok). Takové přípravky obsahují také suspendující činidla a zahušťovadla nebo jiné mikročásticové systémy, které jsou určeny k zacílení sloučeniny na krevní složky nebo do jednoho či více orgánů. Přípravky jsou buďto vjednodávkové, nebo vícedávkové lékové formě.
Přípravky ve formě nosního spreje obsahují puntíkované vodné roztoky aktivního konjugátu s konzervačními a isotonickými činidly. Tyto přípravky mají obvykle pH a tonicítu upravené tak, aby byly kompatibilní s nosní slíznicí.
Lékové formy pro rektální podávání jsou obvykle čípky, kde vhodným nosičem je kakaové más40 lo, hydrogenované tuky nebo hydrogenované mastné karboxylové kyseliny.
Oftalmické přípravky jako např. oční kapky jsou připraveny podobně jako nosní spreje, s tím rozdílem že pH a tonicita jsou nastaveny kompatibilně pro oko.
Topické přípravky obsahují konjugáty podle vynálezu rozpuštěné nebo suspendované v jednom nebo více médiích, jako je např. minerální olej, vazelína, polyhydroxyalkoholy nebo jiná farmaceutická báze pro topické přípravky.
Kromě výše uvedených složek mohou přípravky podle vynálezu ještě dále obsahovat jednu nebo více doplňkových složek jako jsou např. ředidla, pufry, příchutě, rozvolňující činidla, povrchově aktivní látky, zahušťovadla, lubrikanty, konzervační látky (včetně antíoxidantů) a další.
Tudíž předkládaný vynález poskytuje fuzní proteiny vhodné pro /n vitro stabilizaci interferonubeta-la v roztoku, což je příklad výhodné, jiné než terapeutické aplikace vynálezu. Fúzní protei55 ny mohou být také využity ke zvýšení tepelné stability a odolnosti proti enzymatické degradaci
-18interferonu-beta-la a poskytují tak způsob, jak zvýšit dobu skladovatelnosti, stabilitu při teplotě místnosti a trvanlivost reagencií a souprav užívaných pro výzkum.
Následující příklady slouží k ilustraci vynálezu a nijak jeho předmět neomezují. Je zřejmé, že 5 zejména in vivo experimenty se zvířaty zde popsané mohou být provedeny různými způsoby, takže jsou možné různé modifikace a variace základních metod zde popsaných. Tak např. v příkladu 7 může odborník užít jiný neopterinový test nebo může změnit druh či počet primátů v pokusu. Všechny takové modifikace a variace spadají do rozsahu předkládaného vynálezu.
Příklady provedení vynálezu
Příklad l
Studie struktury/aktivity lidského interferonu-beta-la s použitím substitučních mutací alanin/serin: analýza vazebných míst receptoru a funkčních domén
Přehled
Byla prováděna obsáhlá mutační analýza lidského interferonu-beta-la (IFN-beta-la) s cílem mapovat zbytky nutné pro aktivitu a vazbu receptoru. Dostupnost trojrozměrné (3-D) krystalové struktury lidského IFN-beta (Karpusas, M. etal., 1977, Proč. Nati. Acad. Sci. USA,94, 11 813-11 818) umožnila původcům identifikovat substituce alaninu (nebo šeřinu) zbytků vysta25 vených rozpouštědlu dostupných pro receptorové interakce a ponechat aminokyseliny zapojené do intramolekulámích vazeb. Byl navržen panel 15 slaninových substitucí, které nahradily 2 až 8 zbytků v průběhu rozdílných oblastí každého helixu (A, B, C, D) a smyček (AB, CD2, DE). Pro účely afinitní purifíkace byla začleněna amino-koncová histidinová značka obsahující 6 histidinových zbytků, jakož i enterokinázová spojovací sekvence (linker) pro odstranění amino30 koncové extenze. Výsledné interferony jsou nazývány jako „interferon(IFN)-beta se značkou his“ nebo „His-interferon-beta“ nebo „His6-interferon-beta“ apod.
Byly konstruovány různé mutace expresních plazmidů IFN-beta se značkou his s použitím genového konstruktu s divokým typem IFN-beta jako templátem pro mutagenezi. Strategie muta35 geneze vyžadovala nejdříve vnesení štěpného místa jedinečného restrikčního enzymu prostřednictvím genu IFN -beta se značkou his, a pak nahrazení přesných sekvencí DNA mezi vybranými restrikčními místy syntetickými oligonukleotidovými duplexy, které kódovaly slaninové (nebo serinové) substituční mutace. Nakonec byly mutované geny IFN subklonovány do plazmidu, který řídil expresi savčích buněk v buněčné linii 293 z lidských ledvin.
Funkční následky těchto mutací byly hodnoceny antivirovými a antiproliferačními testy. Byl vyvinut neradioaktivní vazebný test pro IFN, který analyzoval vazbu těchto mutant k povrchovému receptoru („IFNAR1/2 komplex) buněk Daudi lidského Burkittova lymfomu. Navíc byl vyvinut test pro mapování povrchů při interakcích mezi mutanty his-IFN-beta a IFNAR2, který používal fúzní protein IFNAR2/Fc, složený z extracelulámí domény proteinu IFNAR2 receptoru IFN fúzované ke kloubové doméně, doménám CH2 a CH3 lidského IgGl.
1. Vytvoření genu interferonu-beta jako templátu pro mutagenezi so Při strategii původců pro tvoření mutant IFN-beta substituované alaninem (nebo serinem) nejdříve vznikl modifikovaný gen IFN-beta, který kódoval protein divokého typu, ale který nesl štěpná místa jedinečných restrikčních enzymů v genu. Jedinečná místa byla použita pro záměnu sekvencí divokého typu syntetickými oligonukleotidovými duplexy, které kódovaly mutované kodony. Aby se získala expresní kazeta lidského IFN-beta-la vhodná pro tvorbu mutovaných genů, byla cDNA IFN-beta (GenBank přístupové č. E00029) amplifikována pomocí PCR. Bylo
-19DO nezbytné počáteční klonování genu IFN-beta do plazmidu pMJB107, derivátu pACYC184, (viz Rose, et. al., 1988, Nucleic Acids Res., 16(1), 355), aby se mohla provádět místně cílená mutageneze genu v plazmidu, kterému chyběla specifická restrikční místa vytvářená během mutageneze.
Primery pro PCR použité pro subklonování kódujících sekvencí genu lidského IFN-beta také umožnily původcům zavést enterokinázovou spojovací sekvenci v protisměru a v rámci s genem IFN-beta:
5' PCR primer:
5' - TTCTCCGGAGACGATGATGACAAGATGAGCTACAACTTGCTTGGATTCCTACAAAGAAGC - 3' (sekvence id, č. 9: „ΒΕΓ-021), a 3* PCR primer:
5'-GCCGCTCGAGTTATCAGTTTCGGAGGTAACCTGTAAGTC-3' io (sekvence id. č. 10 : „BET - 022“) a hraniční oblasti míst restrikčních enzymů (BspEI a Xhol) užitečné pro klonování do míst plazmidu pMJB107. Výsledná DNA byla nazvána PCR fragment A.
Výkonná signální sekvence z lidské adhezivní molekuly cévní buňky-1 (VCAM-1) a značka („tag“) šesti histidinů byly vneseny do konečného konstruktu z druhého fragmentu DNA vytvořeného z pDSW247 (fragment B). Plazmid pDSW247 je derivát pCEP4 (Invitrogen, Carlsbad, CA), ze kterého byl odstraněn gen EBNA-1 a který nese signální sekvenci VCAM-1 (VCAMss) fúzovanou v protisměru a v rámci se značkou šesti histidinů. Primery PCR, které byly použity pro vytvoření kazetové skupiny VCAMss-1/histidinová značka, byly K.1D-369 (5 1 PCR primer):
5‘-AGCTTCCGGGGGCCATCATCATCATCATCATAGCT-31 (sekvence id. S.: 11) a KID-421 (31 PCR primer);
5'-CCGGAGCTATGATGATGATGATGATGGCCCCCGGA-3' (sekvence id. č.: 12) začleňující hraniční štěpná místa restrikčních enzymů (Notl a BspEI), která umožnila excizi fragmentu B DNA.
Pro vytvoření plazmidového vektoru, který nesl signální sekvenci VCAM-1, značku his a gen interferon-beta, prováděli původci trojcestnou ligaci s použitím DNA fragmentů purifikovaných přes gel z plazmidového vektoru pMJB107 (štěpeného Notl a Xhol), PCR fragmentu A (štěpeného BspEI a Xhol) a fragmentu B (štěpeného Notl a BspEI). Ligovaný plazmid byl použit pro transformaci buněk E. coli buď JA221, nebo XLl-Blue a byly vybírány kolonie rezistentní na ampicilin a testovány na výskyt inzertů analýzou restrikčních map. Byla izolována DNA pomocí Maxiprepu a sekvence inzertu byla ověřena sekvenováním DNA. Výsledný konstrukt byl nazván pCMG260.
2. Příprava mutant lidského interferonu-beta v pCMG260 substitucí alaninu
Plazmid pCMG260 byl použit jako templát pro několikrát opakovanou mutagenezi (U.S.E. Sítě
Dírected Mutagenesis Kit (Boehringer-Mannheim), která zavedla jedinečná restrikční štěpná místa do pozic v průběhu kódující sekvence proteinu IFN-beta, ale nezměnila výslednou sekvenci proteinu. Mutované plazmidy byly použity pro transformaci buď JA221, nebo XLl-Blue kmene E. coli a rekombinantní kolonie byly vybírány podle rezistence na chloramfenikol. Kolo-20nie rezistentní na chloramfenikol byly dále testovány na výskyt požadovaného místa jedinečného restrikčního enzymu pomocí analýzy restrikčních map DNA. Výsledný plazmid IFN-beta, pCMG275.8, obsahoval úplnou sadu jedinečných štěpných míst restrikčních enzymů a DNA sekvence genu byla ověřena. Kompletní sekvence DNA modifikovaného genu interferon-beta se značkou his, společně s kódující sekvencí proteinu divokého typu, jsou uvedeny na obrázku 1.
Kompletní soubor alaninových substitučních mutací je uveden v tabulce I (další stránka). Názvy mutant specifikují strukturální oblasti (helixy a smyčky), do kterých byly vneseny mutace. Panel veškerých mutací alaninových (serinových) substitucí má za následek mutace 65 až 165 aminoio kyselin lidského IFN-beta.
Panel mutant byl vytvořen z pCMG275.8 nahrazením segmentů DNA mezi jedinečnými restrikčními místy syntetickými oligonukleotidovými duplexy, které nesly genetickou kódující informaci uvedenou v tabulce 2 (viz níže). Aby se vytvořily plazmidy s různými alaninovými substi15 tučními mutantami, byly spolu ligovány vektor pCMG275.8 purifikovaný přes gel (štěpený příslušným restrikčním enzymem, jak uvedeno na seznamu dále v textu, pro každou strukturální oblast IFN-beta) a oligonukleotidové duplexy (kódující sekvence vláken jsou uvedeny v tabulce 2). Ligační směsi byly použity pro transformaci JA221 kmene £. coli a rekombinantní kolonie byly vybírány podle rezistence na arapicilin. Kolonie rezistentní na ampicilin byly testovány na výskyt inzertů s mutacemi prostřednictvím screeningu na příslušná místa restrikčních enzymů. Pro dvě mutanty (A2 a CD2) strategie klonování vyžadovala použití dvou duplexů syntetických oligonukleotidů (uvedených v tabulce 2), které nesly komplementární přesahující konce, aby bylo možné ligovat je k sobě navzájem, a ke kostře vektoru IFN-beta v trojcestné ligaci. Následující seznam ukazuje místa, která byla použita ke klonování mutovaných oligonukleotidů z tabulky 2.
Schéma klonování (pododdíl B) ukazuje pozice těchto jedinečných míst v genu interferonu beta.
A helix Smyčka AB
B helix C helix
Smyčka CD2 D helix Smyčka DE E helix
BspEI až MunI nebo BglII až Pstl MunI až Pstl nebo MunI až BsaHI BspHI až Bsal nebo BsaHI až Bsal Bsal až Xbal
Xbal až BspHI nebo Xbal až DralII BspHI až DralII
BspHI až Pvuí Pvul až BstEII
-21CZ JUU/OZ »0
Tabulka 1
Pozice alaninových substitučních mutací HUIFN-p
10 20 10 40 S0
IFN-S MSYJILLGFLQRSSNFQCQKLLWQIJSGRLBYCIiKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKE
Al -A-AA--A--A-----------------------------------------A2 --------------AA-AA--AA-----------------------------AB1 ---------------------------AAA-AA-------------------AB2 ..................................-AA-A--A---........
AB3 -----------------------.-------------------- -AAAAA-AAA |__Jwlix A_) j__AB loop_
Í0 70 to oo 100
IFN-β DAALTIYEMWNlFAiraQDSSSTGWNETTVENLLANVYHQINlíLKTVLBEKLEKB
B1 ..........A--AS----------------------------------------B2 -........-......-AAA.............-......................
Cl ...........................AS--AA--S....................
C2 --------------------------------------A---A--AA--------CDl -- — ---------------------------------------------AA--AAA |_helix B_| |_( j_CD loop
110 110 130 140 150 100
IFN-S DFTRGKLMSSUiLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVElLRNFYFXiniLTQYLRN
CD2 AA-A--A--A----------------------------------------------D ------------------A-AA--A-------------------------------DS1 ......-................—-AA.............................
DE2 -----------------------------AA..........................
B .....................................A--A--A--A-------CD loop_| |._helix D I |_helix B_[
K tab. 1: Řádek označený IFN-β ukazuje divoký typ sekvence lidského lFN-β. Alaninové nebo serinové substituce zbytků IFN-β jsou ukázány pro každou mutantu a čárky, pod relevantními oblastmi, označují sekvence divokého typu. Struktury helixů a smyček jsou uvedeny jako plné čáry pod mutantami. Smyčka DE překlenuje mezeru mezi helixy D a E. Byly vytvořeny dvě další alaninové substituční mutanty (H93A, H97A a H121A) a byly analyzovány v antivirových io testech pro stanovení účinku mutací těchto histidinů, které tvoří cheláty se zinkem v krystalové struktuře dimeru. Obě tyto mutanty si podržely plnou aktivitu divokého typu v antivirových testech, což svědčí pro to, že zinkem zprostředkovaná tvorba dimeru není důležitá pro aktivitu IFNp.
-22Tabulka 2
AI sekv. id,
Č.13
BET-053
CCGGAGACGATGATGACAAGATGGCTTACGCCGCTCTTGGAGCCCTACAA
GCTTCTAGCAATTTTCAGTGTCAGAAGCTCCTGTGGC
A2 sekv. id.
e.i4
BET-039
GATCTAGCAATGCTGCCTGTGCTGCCCTCCTGGCTGCCTTGAATGGGAGG
CTTGAATACT
AB1
AB2
AB3
Bl
B2
Cl
C2
CD1 sekv. id. Ě .15 BET-041 sekv. id
Č.16
BET-080 sekv. id. č.17 BET-082 sekv. id.
e.i8
BET-084
GCCTCAAGGACAGGATGAACTTTGACATCCCTGAGGAGATTAAGCAGCTG
CA
AATTGAATGGGAGGGCTGO«3CTTGCGCTGCAGACAGGATGAACTTTGAC
ATCCCTGAGGAGATTAAGCAGCTGCA
AATTGAATGGGAGGCTTGAATACTGCCTCAAGGACAGGGCTGCATTTGCT
ATCCCTGCAGAGATTAAGCAGCTGCA
AATTGAATGGGAGGCTTGAATACTGCCTCAAGGACAGGATGAACTTTGAC
A sekv. id. TCCCTGAGGAGATTGCTGCAGCTGCAGCTTTCGCTGCAGCTGA fi.19
BET -08fi sekv. id
e.2o
BET-110 sekv. id. fi.2l BET-112 sekv. id. £.22 BET-114 sekv. id. δ.23 BET-092
CGCCGCGTTGACCATCTATGAGATGCTCGCTAACATCGCTAGCATTTTCA
GACAAGATTCATCTAGCACTGGCTGGAA
CGCCGCATTGACCATCTATGAGATGCTCCAGAACATCTTTGCTATTTTCG
CTGCAGCTTCATCTAGCACTGGCTGGAA
GGAATGCTTCAATTGTTGCTGCACTCCTGAGCAATGTCTATCATCAGATA AACCATC TGAAGACAGTTCTAG
GGAATGAGACCATTGTTGAGAACCTCCTGGCTAATGTCGCTCATCAGATA
GCACATCTGGCTGCAGTTCTAG sekv. id. CTAGCTGCAAAACTGGCTGCAGCTGATTTCACCAGGGGAAAACT fi.24
BET-094
-23CZ. JUV/OZ tJO
| CD2 | sekv. id. č.25 BET-096 | CTAGAAGAAAAACTGGAGAAAGAAGCAGCTACCGCTGGAAAAGCAATGA GCGCGCTGCACCTGAAAAGA |
| sekv, id. Č.26 BET-106 | tattatgggaggattctgcattacctgaaggccaaggagtactcacac TGT | |
| Dl | sekv. id. e.27 BET-108 | CATGAGCAGTCTGCACCTGAAAAGATATTATGGGGCAATTGCTGCATAC ctggcagccaaggagtactcacactgt |
| DE1 | sekv. id. č.28 BET-116 | catgagcagtctgcacctgaaaagatattatgggaggattctgcatta cctgaaggccgctgcatactcacactgtgcctggacgat |
| DE2 | sekv. id. č.29 BET-11B | catgagcagtctgcacctgaaaagatattatgggaggattctgcatta cctgaaggcaaaggagtacgctgcatgtgcctggacgat |
| El | sekv. id. č.30 BET-104 | CGTCAGAGCTGAAATCCTAGCAAACTTTGCATTCATTGCAAGACTTACAG |
B. Konstrukce expresních plazmidů EBNA 293
Gen divokého typu a mutovaný gen IFN-beta, fúzované se signální sekvencí VCAM-1, značkou his a enterokinázovou spojovací sekvencí, byly puntíkovány přes gel jako restrikční fragmenty Notl a BamHI o velikosti 761 párů bází. Puntíkované geny byly subklonovány do plazmidového vektoru pDSW247, což je derivát pCEP4 (Invitrogen, Carlsbad, CA), štěpeného Notl a BamHI, jak je ukázáno ve schématu. Plazmid pDSW247 je expresní vektor pro přechodnou expresi proteinu v buňkách EBNA 293 z lidských ledvin (Invitrogen, Carlsbad, CA). Obsahuje cytoio megalovirový promotor časného genu a EBV regulační prvky, které jsou nezbytné pro vysokou hladinu genové exprese v tomto systému, jakož i markéry selekce pro £. coli (rezistence na ampicilin) a pro buňky EBNA 293 (rezistence na hygromycin). Ligované plazmidy byly použity pro transformaci buď JA221, nebo XLl-Blue kmenů E. coli a kolonie rezistentní na ampicilin byly vybírány a testovány na výskyt inzertů analýzou restrikčních map. Byla izolována DNA pomocí maxiprepu a sekvence inzertů byly ověřeny sekvenováním DNA. Pozitivní klony projevující požadované mutované sekvence byly použity pro transfekcí buněk EBNA 293 lidských ledvin takt jak je popsáno níže.
Obecné klonovací a expresní strategie jsou uvedeny na obrázku 12.
C. Exprese a kvantifikace IFN-beta-la alaninových substitučních mutant
Lidské buňky EBNA 293 (Invitrogent Carlsbad, CA, Chittenden, T. 1989, J. Virol, 63, 3016— 3025) byly udržovány jako subkonfluentní kultury v Eagleho médiu modifikovaném dle Dulbec25 ca doplněném 10%fetáIním bovinním sérem, 2mM glutaminem a 250g/ml geneticinu (Life Technologies, Gaithersburg, MD). Expresní plazmidy pDSW247 byly přechodně transfekovány do buněk EBNA 293 s použitím protokolu s lipofektaminem (Gibco/BRL, Life Technologies). Kondicionovaná média byla sklízena 3 až 4 dny po transfekcí, buněčná debris byla odstraněna centrifugací a koncentrace his-IFN-beta byla kvantifikována testem ELISA.
ELISA byla prováděna s použitím polyklonálních králičích protilátek (metodou proteinu A puntíkované IgG, protilátky byly pěstovány proti puntíkovanému lidskému IFN-beta-1 a) pro navázání na 96-jamkové destičky pro testy ELISA a biotinylovaná forma téhož polyklonálního králi-24čího IgG byla použita jako sekundární reagencíe pro umožnění detekce interferonu s použitím křenové peroxidázy konjugované se streptavidinem (HRP: Jackson ImmunoResearch, W. Grove, PA). Pro vytvoření standardních křivek koncentrace byla použita řada ředění interferonu-betala, Kondicionovaná média z EBNA transfektant obsahující his-IFN-beta byla naředěna tak, aby se získaly vzorky s koncentracemi v rozmezí od 10 do 0,3 ng/ml v testu ELISA. Aby byly koncentrace IFN-beta v médiu zjištěné testem ELISA potvrzeny, byla provedena analýza westernovým přenosem. Redukované supematanty z tkáňových kultur a standardy IFN-beta-la byly podrobeny SDA-PAGE na gelech s gradientem 10 až 20% (Novex, San Diego, CA) a přeneseny na membrány PDVF. Imunoreaktivní pásy byly detekovány králičím polyklonálním antisérem io anti-IFN-beta-la (č. 447, Biogen. Inc., druhé antisérum, které bylo pěstováno proti IFN-betala), a pak následovalo ošetření oslím protikráličím IgG konjugovaném s HRP (Jackson ImmunoResearch, W. Grove, PA).
D. Hodnocení mutant interferonu-beta na vazbu k receptorů
Vlastnost vázat receptor mutant interferonu-beta popsaných v části C byla hodnocena s použitím dvou odlišných vazebných testů. Jeden test měřil vazbu mutant interferonu-beta k fúzní mu proteinu, IFNAR2/Fc, zahrnujícímu extracelulámí doménu lidského receptorů IFNAR2 fúzovanou k částí konstantní oblasti lidského IgG. IFNAR2-Fc byl exprimován v buňkách ovarií čínského křečka (CHO) a purifikován prostřednictvím afmitní chromatografíe s protein A Sepharose podle instrukcí výrobce (Pierce Chem. Co., Rockford, IL, kat. č. 20334). Vazba mutant interferonubeta k IFNAR2-Fc byla měřena v testu ELISA. Destičky pro test ELISA byly připraveny přes noc ve 4 °C navázáním 50 μΐ/jamku myší proti—lidské IgGl monoklonální protilátky (CDG5AA9, Biogen, Inc.) v koncentraci 10 g/ml ve vazebném pufru (50mM NaHCOj, 0,2mM MgCl2,
0,2mM CaCL, pH 9,6) na 96-jamkové destičky s plochým dnem. Destičky byly dvakrát promyty sPBS obsahujícím 0,05% Tween-20, a blokovány s0,5% netučným sušeným mlékem v PBS 1 hodinu při teplotě místnosti. Po dvou dalších promytích bylo do každé jamky přidáno 50 μΐ 1 g/ml IFNAR2-Fc v 0,5% mléce v PBS obsahujícím 0,05% Tween-20 a inkubováno 1 hodinu při teplotě místnosti a destičky pak byly ještě dvakrát promyty. Vazba mutant interferonu-beta k IFNAR2-Fc byla měřena přidáním 50 μΐ/jamku mutanty interferonu-beta v kondicionovaném médiu, sériově ředěné Eagleho médiem modifikovaným dle Dulbecca (DMEM) doplněném 10% fetálním bovinním sérem, a inkubací 2 hodiny ve 4 °C. Ředění mutanty interferonu-beta se typicky pohybovalo od přibližně 1 M dolů k 10 pM. Po promytí byl interferon-beta navázaný na destičky detekován přidáním 50 μΐ/jamku koktejlu skládajícího se z 1:1 000 ředěné králičí poly35 klonální anti-interferonové protilátky (č.447) plus oslího proti—králičího IgG značeného křenovou peroxidázou (HRP) (Jackson ImmunoResearch), a probíhala inkubace 15 minut ve 4 °C. Po dvou promytích byl přidán HRP substrát a destička byla inkubována ve 4 °C před odečtem na čtecím zařízení pro destičky ELISA při absorbanci 450 nm. Data byla vynesena jako absorbance proti koncentraci mutant interferonu-beta a afinita vazby mutanty interferonu-beta k IFNAR240 Fc byla určována vynesením dat do jednoduché hyperbolické vazebné rovnice. Výsledky z těchto analýz jsou ukázány na obrázku 3, na kterém je vazebná afinita každé mutanty, zjišťovaná alespoň ve třech nezávislých pokusech, vyjádřena jako procento afinity měřené pro His<}-divoký typ Interferonu-beta-1 a. Druhý test vazby receptorů byl použit pro měření afinity, se kterou se mutanty interferonu-beta vážou na buňky Daudi exprimující oba receptorové řetězce, IFNAR1 a IFNAR2, které dohromady obsahují receptor pro interferon-beta. Tento test založený na FACS používal blokující monoklonální protilátku namířenou proti extracelulámí doméně IFNAR1, EA12 (Biogen, Inc.) pro odlišení neobsazeného (volného receptorů od receptorů, na který byl navázán interferon-beta. Buňky Daudi (20 μΐ při 2,5 x 107 buněk/ml) byly naneseny na 96jamkové destičky pro test ELISA se dnem ve tvaru v a inkubovány 1 hodinu ve 4 °C s různými kon50 centracemi mutanty interferonu-beta (20 μΐ v pufru FACS, 5% FBS, 0,1% NaN3 v PBS). Žádoucí sériová ředění mutant interferonu-beta se pohybovala v rozmezí od 0,5 M do 0,5 pM. Ke každé jamce bylo přidáno 100 ng biotinylované myší antí-IFNARl monoklonální protilátky EA12 (10 μΐ) a destičky byly inkubovány další dvě minuty při teplotě místnosti před dvojím promytím pufrem FACS (4 °C). Pak byly buňky inkubovány 30 minut ve 4 °C s 50 μΙ/jamku 1:200 naředě-25CZ 300762 B6 ného streptavidinu konjugovaného s R-fykoerythrinem (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA), dvakrát promyty pufrem FACS, resuspendovány ve 300 μΙ pufru FACS obsahujícím 0,5% paraformaldehyd a přeneseny do polystyrénových zkumavek 12x75 (Falcon 2052). Pak byly vzorky analyzovány průtokovou cytometrií na přístroji FACScan (Becton Dickinson). Data byla s vynesena do grafu jako průměrná intenzita fluorescence kanálu (MFCI) proti koncentraci mutanty interferonu-beta, vazebné afinity byly definovány jako koncentrace mutanty interferonu-beta poskytující 50% inhibici barvení protilátky. Každá mutanta byla testována několikanásobně.
Obrázek 2 ukazuje vazebnou afinitu k receptoru pro každou mutantu interferonu-beta, zjištěnou touto metodou, vyjádřenou jako procento afinity měřené pro His6-divoký typ Interferonu-betaio 1 a v každém pokusu.
E. Hodnocení funkce mutant interferonu-beta
Mutanty interferonu-beta byly také testovány na funkční aktivitu s použitím in vitro testů pro ís antivirovou aktivitu a na schopnost interferonu-beta inhibovat buněčnou proliferaci. Pro každou mutantu byly prováděny minimálně tři antivirové testy, každý v trojím opakování. His6-divoký typ Interferonu-beta-la byl do každého pokusu zahrnut jako reference. Antivirové testy byly prováděny ošetřením buněk A549 z lidského plicního karcinomu (ATCC CCL 185) přes noc dvojkovým sériovým ředěním mutant interferonu-beta v koncentracích, které překlenovaly roz20 sah mezi plnou antivirovou ochranou a žádnou ochranou před usmrcením buněk virem. Následující den byly buňky stimulovány pod dobu dvou dnů virem encefalomyokarditidy (ECMV) v ředění, které mělo za následek úplnou smrt buněk při chybění interferonu. Destičky pak byly vyvíjeny s metabolickým barvivém MTT (2,3-bis[2-methoxy-4-nitro-5-sulfo-fenyl]-2H-tetrazolium-5-karboxyanilid) (M-56551 Sigma, St. Louis, MO). Zásobní roztok MTT byl připraven v koncentraci 5 mg/ml v PBS a sterilizován filtrací a 50 μΐ tohoto roztoku bylo naředěno do tkáňových kultur (100 μΐ na jamku). Po inkubaci při teplotě místnosti po dobu 30 až 60 minut byl roztok MTT/médium odstraněn, buňky byly promyty se 100 μΐ PBS a nakonec byla metabolizovaná barva solubilizována ve 100 μΐ 1,2N kyseliny chlorovodíkové v 90% isopropanolu. Životaschopné buňky (jak prokázáno přítomností barviva) byly kvantifikovány při absorbanci ve
450 nm. Data byla analyzována vynesením do grafu absorbance proti koncentraci mutanty interferonu-beta a aktivita každé mutanty byla definována jako koncentrace, ve které bylo usmrceno 50 % buněk. Obrázek 5 ukazuje aktivitu každé mutanty vyjádřenou jako procento aktivity měřené pro divoký typ Interferonu-beta-la se značkou his v každém pokusu.
U mutant interferonu-beta byla také hodnocena funkce v antiproliferačním testu. Buňky Daudi lidského Burkittova lymfomu (ATCC ě. CCL 213) byly vysety v koncentraci 2 x 105 buněk/ml in RPMI 1620 doplněném 10% definovaným fetálním telecím sérem (Hyclone, Logan, Utah), a 2mM L-glutaminem. Každá jamka také obsahovala danou koncentraci mutanty interferonubeta v konečném celkovém objemu 100 μΐ média na jamku, použité koncentrace interferonu-beta byly vybrány tak, aby překlenuly rozsah od maximální inhibice proliferace Daudi buněk k žádné inhibici (tj. plná proliferace). Každá koncentrace testované mutanty interferonu-beta byla použita v duplikátech a ve všech pokusech byla zařazena série neošetřených buněk v duplikátech. Buňky byly inkubovány dva dny ve 37 °C, v inkubátorech s 5% CO2, a potom byl do každé jamky přidán 1 Ci thymidinu s tritiem ((methyl-3H)thymidin, Amersham TRK758) v 50 μΐ média a inku45 bován další 4 hodiny. Buňky byly sklízeny s použitím přístroje LKB pro sklízení buněk z destiček a byla měřena inkorporace thymidinu s tritiem při použití čtecího zařízení pro destičky LKB beta. Duplikáty experimentálních hodnot byly zprůměměny a určeny standardní odchylky. Data byla vynesena do grafu jako průměrné počty za minutu proti koncentraci mutanty interferonubeta a aktivita každé mutanty byla definována jako koncentrace požadovaná poskytnout 50 % maximální pozorované inhibice růstu. Pro každou mutantu byly prováděny několikanásobné testy. Obrázek 6 ukazuje výsledky vyjádřené jako procento aktivity nalezené pro divoký typ Interferonu-beta-la se značkou his v každém pokusu.
-26VXw ťVVíV£ DU
F. Vlastnosti mutant interferonu-beta
Bylo zjištěno, že divoký typ interferonu-beta-la s histidinovou značkou měl v antivirových a antiproliferaěních testech aktivitu, která byla přibližně 3krát nižší než odpovídající aktivita nalezená u neznačeného divokého typu Interferonu-beta-la. Protože ze všech mutant interferonu-beta obsahovaly Al-E na svých N-koncích totožnou sekvenci značky his, byla účinky mutací na vlastnosti molekuly určovány srovnáním aktivit těchto mutant v antivirových, antiproliferaěních a vazebných testech s aktivitou pozorovanou pro divoký typ Interferonu-beta-la se značkou his. Při provádění tohoto srovnávání původci předpokládali, že odchylky aktivit mutant Al-E, ve ío srovnání s divokým typem interferonu-beta-la se značkou his, jsou kvalitativně a kvantitativně přibližně stejné, jako účinek, ktety by téže mutanty měly v nepřítomnosti N-koncové značky his. Odpovídající předpoklad pro značené nebo fiúzní konstrukty jiných rozpustných cytokinů je obecně pokládán za platný odborníky pracující s technikou alaninové skenovací mutageneze („alanine scanning mutagenesis“), zejména když in vitro funkční aktivita značeného nebo fuzního kon15 struktu je blízká aktivitě divokého typu cytokinů, jak je tomu v tomto případě (viz například Pearce, K.H. Jr, etal., J. Biol. Chem., 272, 20 595-20 602, 1997, aJones, J.T., etal., J. Biol. Chem. 273,11 667-11 674, 1998).
Data ukázaná na obrázcích 3-6 naznačují tři typy účinku, který byl vyvolán cílenou mutagenezí.
Tento účinek může být výhodný pro vývoj interferonových léčiv za jistých okolností. Tyto tři typy účinku jsou: a) mutanty s vyšší antivirovou aktivitou než je aktivita divokého typu Interferonu-beta-la (např. mutanta Cl), b) mutanty, které projevují aktivitu v obou testech, antivirovém a antiproliferačním, ale u kterých je antiproliferační aktivita disproporčnč nízká vzhledem kantivirové aktivitě ve srovnání sdivokým typem interferonu-beta-la (např. mutanty Cl, D a DE1), a c) funkční antagonisté (např. AI, B2, CD2 a DE1), které vykazují antivirovou aantiproliferační aktivitu, která je disproporčně nízká vzhledem k vazbě receptorů ve srovnání s divokým typem interferonu-beta-la. Je možné pozorovat, že některé mutanty spadají do více než jedné skupiny. Tyto skupiny jsou uvedeny v přehledu níže. I když původci charakterizovali tyto skupiny mutant vzhledem k těmto příkladům uvedeným v seznamu, je nutné si uvědomit, že další mutace v těchto oblastech mohou mít za následek podobný nebo dokonce zvýšený vliv na aktivitu:
a) Mutanta Cl má antivirovou aktivitu, která je přibližně 6 krát větší než aktivita divokého typu Interferonu-beta-la se značkou his. Předpovídá sel že tato mutanta a další stejného typu jsou užitečné pro snížení množství interferonu-beta, které musí být podáváno pro dosažení daného stupně antivirového účinku. Očekává se, že snížení množství podávaného proteinu zredukuje imunogeničnost proteinu a může také snížit vedlejší účinky toxicity, která není založena na mechanismu účinku. Je předpovídáno, že mutace v této skupině jsou výhodné v situacích, kdy terapeutický prospěch podávání interferonu-beta vyplývá z jeho antivirových účinků a kdy anti40 proliferační účinky přispívají k toxicitě nebo nežádoucím vedlejším účinkům.
b) Relativní aktivity (% divokého typu) alaninových substitučních mutant v antivirovém a antiproliferačním testu jsou srovnány na obrázku 7. U většiny mutant (které jsou uvedeny na diagonální čáře) lze pozorovat koordinovaně změněné aktivity (tj. antivirové a antiproliferační aktivity, které se liší o stejný faktor od aktivit divokého typu Interferonu-beta-la se značkou his). Ale několik mutant vykazuje větší odchylky v aktivitě v jednom testu relativně ke druhému, ve srovnání s divokým typem interferonu-beta-la se značkou his, jak je dokázáno posunem od diagonální linie. Tyto tři mutanty jsou uvedeny v tabulce níže. Mutanta Cl vykazuje antivirovou aktivitu, která je ~6 krát větší, než je aktivita divokého typu Interferonu-beta-la se značkou his, ale jeho aktivita v antiproliferačním testu je podobná aktivitě divokého typu. Mutanta C1 má tudíž antivirovou aktivitu, která je zvýšena faktorem 5,2 proti jeho antiproliferační aktivitě, relativně k divokému typu interferonu-beta-la se značkou his. Podobně mutanta D projevuje 65% aktivity divokého typu v antivirovém testu, ale pouze 20 % aktivity divokého typu v antiproliferačním testu, a tudíž má antivirovou aktivitu, která je zvýšena 3,4 krát proti jeho antiproliferační aktivitě ve srovnání s divokým typem. Mutanta DE1 projevuje 26% aktivity divokého typu
-27CZ JIHI76Z B6 v antivirovém testu, ale pouze 8,5 % v antiproliferačním testu, a má tedy antivirovou aktivitu, která je zvýšena 3,0 krát proti jeho antiproliferační aktivitě ve srovnání s divokým typem interferonu-beta-la se značkou his. Když jsou podávány v koncentraci postačující pro dosažení požadovaného stupně antivirové aktivity, ukazují tyto mutanty proteinů podstatně nižší úroveň anti5 proliferační aktivity než protein divokého typu. Předpovídá se, že mutace v této skupině, jako ty ve skupině a), jsou výhodné v situacích, kdy terapeutický prospěch podávání interferonu-beta vyplývá zjeho antivirových účinků a kdy antiproliferační účinky přispívají k toxicitě nebo nežádoucím vedlejším účinkům.
| Mutanta | Antivirová (AV) aktivita (% divokého typu) | Ant iproliferační aktivita (% divokého typu) | (AP) | AV/AP |
| Cl | 571 | 109 | 5,2 | |
| D | 65 | 19 | Í,4 | |
| DE1 | 26 | 8,5 | 3,0 |
io c) Mutanty s antivirovou a antiproliferační aktivitou, která je nízká vzhledem k vazbě receptoru, ve srovnání s divokým typem interferonu-beta-la se značkou his (viz tabulka níže). Mutanta Al projevuje antivirovou a antiproliferační aktivity, které jsou 2,0 krát a 1,8 krát větší než aktivity pozorované u divokého typu Interferonu-beta-la se značkou his, ale váže se na analogický receptor na buňkách Daudi s afinitou, která je 29 krát větší než u divokého typu. Vazba této is mutanty na receptor IFN-beta je tudíž zvýšena přibližně 15 krát ve srovnání s antivirovou a antiproliferační aktivitou proteinu. Podobně mutanty B21 CD2 a DE1 vykazují zvýšení vazby proti antivirové aktivitě 4,6krát, 4,6krát a 18krát, podle pořadí, a proti antiproliferační aktivitě 3,5krát, 15krát a 54krát. Předpovídá se, že tyto proteiny jsou užitečné jako funkční antagonisté aktivity endogenního IFN-beta, a možná dalších endogenních interferonu typu I, protože mají schopnost vázat a obsadit receptor a navíc vyvolat pouze malou část funkční odpovědi v cílových buňkách, jaká by byla pozorována u divokého typu IFN-beta.
| Mutanta | Antivirová aktivita (AV) (% wt) | Antiproliferační aktivita (AP) (* wt) | Vazebná aktivita k buňkám (% hmot.) | Vazba/AV | Vazba/AP |
| Al | 200 | 180 | 2900 | 15 | 16 |
| B2 | 7,1 | 9,2 | 33 | 4,6 | 3,5 |
| CD2 | 150 | 46 | 690 | 4,6 | 15 |
| DE1 | 26 | 8,5 | 460 | 18 | 54 |
G. Vztah muteinu k trojrozměrné struktuře interferonu
Zatímco publikované krystalové struktury neglykosylované formy myšího interferonu-beta (T. Senda, S. Saitoh a Y. Mitsumi„Refined Crystal Structure of Recombinant Murine Interferonat 2,15 Resolution, J. Mol. Biol,, 253, 187-207, 1995) a lidského interferonu alfa—2b (R. Radhakrishnan, L.J. Walter, A. Hrůza, P. Reichert, P.P. Trotta, T.L. Nagabhushan a M.R. Walter, Zinc Mediated Dimer of Human Interferon- 2b Revealed by X-ray Crystallography, Structure, 4,
1 453-1463,1996) poskytly modely pro polypeptidovou kostru lidského interferonu-beta, původci nedávno dořešili strukturu interferonu-beta-la v jeho glykosylovaném stavu (M. Karpusas,
-28M. Nolte, C.B. Benton, W. Meier, W.N. Lipscomb, a S.E Goelz, The Crystal Structure of Human Interferon- at 2,2 Resolution, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 94,11 813-11 818,1997).
Výsledky mutačních analýz původců mohou být shrnuty vzhledem k trojrozměrné struktuře ínter5 feronu-beta-la (zde neuvedeno). Některé mutace vyvolaly snížení aktivity (2 až 5 krát snížení). Mutované oblasti odpovídaly substitucím uvedeným v tabulkách 1 a 2.
Mutace, které jsou nejvýznamnější, co se týče jejich účinku na funkci, měly za následek dramatické snížení jak aktivity, tak vazby buněčného povrchového receptoru. Mutace v této oblasti (A2 io helix, AB a AB2 smyčky a E helix) odpovídají mutacím ve vazebném místu IFNAR2, protože žádná z těchto mutant nevázala v testech původců IFNAR/Fc.
I když tyto mutace, které byly důležité pro vazbu 1FNAR2, také ovlivnily buněčnou vazbu, vazebné vlastnosti buněčného povrchu jsou také ovlivněny zbytky v dalších oblastech molekuly (Bl helix, C2 helix). Na trojrozměrných modelech (zde neuvedených), které zobrazují působení alaninových substitučních mutant, je možné pozorovat, že N-koncová oblast, C-koncová oblast a glykosylovaná oblast C helixu molekuly IFN-beta-la neleží ve vazebném místě receptoru. Mutace v těchto oblastech nesnížily biologickou aktivitu nebo vazbu buněčného povrchového receptoru.
Příklad 2
Konstrukce plazmidů pro expresi fůzního proteinu interferon-beta-la (IFN-beta/Fc)
Pro vytvoření expresního plazmidu byla použita technologie PCR kódujícího DNA sekvenci lidského IFN-beta fúzovanou kFc části molekuly těžkého řetězce myšího IgG2a. Plazmidový vektor pDSW247 (viz příklad 1) je derivát pCEP4 (Invitrogen, Carlsbad, CA), ze kterého byl odstraněn gen EBNA-1. Tento plazmid byl použit pro konstrukci expresního vektoru použitelné30 ho pro přechodnou expresi proteinu v buňkách EBNA 293 z lidských ledvin (Invitrogen, Carlsbad, CA, Shen, E.S., et al., 1995, Gene, 156,235-239). Byl navržen tak, aby obsahoval signální sekvenci lidské adhezivní molekuly cévní buňky, (VCAM-1) v rámci a v protisměru od sekvence interferonu beta a sekvencí Ig.
Expresní kazeta fůzního proteinu byla sestavena z několika fragmentů DNA. Aby se získal fragment DNA kódující lidský gen IFN-beta, byl použit cDNA subklon lidského IFN-beta (GenBank přístupové č. E00029) jako templát pro PCR s použitím primerů:
1 -GGTGGTCTCACATGAGCTACAACTTGCTTGGATTCCTACAAAGAAGC (sekvence id. fi. 31: BET-025) a
5' -GCCCTCGAGTCGACCTTGTCATCATCGTCGTTTCGGAGGTAACCTGTAAG (sekvence id. č. 32: BET -026), které také obsahovaly Štěpné místo restríkěního enzymu (Bsal) v protisměru od prvního kodonu IFN-beta. 3' PCR primer (sekvence id. Č. 32 BET-026) pro gen IFN-beta eliminoval terminační kodon IFN-beta a inkorporoval jak do rámce enterokinázovou spojovací sekvenci (DDDDK) (sekvence id. č. 62), tak terminální místo restrikčního enzymu (Xhol), použitelné pro subklonování do expresního vektoru. Místo Bsal zavedené v protisměru od kódující sekvence IFN-beta umožnilo původcům ligovat signální sekvenci VCAM-1 do protisměru a v rámci škodující sekvencí genu IFN-beta. Tato signální sekvence VCAM-1 byla také vytvářena pomocí PCR s použitím páru primerů:
-29CZ JUU762 Bb
5'-CAAGCTTGCTAGCGGCCGCGG-3' ](sekvence id. č. 33: BET-023 a 5 '-GGTGGTCTCACATGGCTTGAGAAGCTGC-3'](sekvence id. č. 34:
„BET-024“), které obsahovaly 5' štěpné místo restrikčního enzymu (Notl, pro ligaci do klonovacího místa Notl v pDSW247) a 3' štěpné místo restrikčního enzymu (Bsal, pro ligaci do 5' PCR fragmentu interferonu-beta-1 a). Templát pro PCR byla cDNA lidské adheztvní molekuly cévní buňky, (VCAM-1) (GenBank přístupové číslo XS3051).
Aby byl vytvořen fúzní gen IFN-beta-la/Fc, byly prováděny následující postupy. Fragment myšího IgG2a byl odstraněn zpEAG293 gelovou purifikací DNA fragmentu po štěpení SalI+BamHI. Plazmid pEAG293 je subklon kloubové domény, domén CH2 a CH3 myšího IgG2a io (GenBank přístupové číslo V00798) vBluescrípt IISK+ (Stratagene, LaJolla CA, katalog.
č. 212205). Následující páry příměrů pro PCR:
5'-AGGTSMARCTGCAGSAGTCW-3' (sekvence id. č. 35), kde S=C nebo G, M=A nebo C, R=A nebo G, W=A nebo T, a
5'-CTGAGCTCATtTACCCGGAGTCCGGGAGAAGCTCTT-3' (sekvence id. č. 36) vytvořily hraniční místa Sáli a Notl na 5' a 3' koncích kazety, v příslušném pořadí. Kazeta myší domény IgG2a Fc se liší od sekvence z GenBank v jedné bázi (kodon V369), vytvářející umlčenou mutaci. Z této IgG2a Fc kazety je tudíž exprimován divoký typ proteinu Fc.
DNA fragment obsahující signální sekvenci VCAM-1 fúzovanou ke genu huIFN-beta sC20 koncovou enterokinázovou spojovací sekvencí byl vystřižen z pCMG258 štěpením s Notl až BamHI a purifikován na gelu. Místo Sáli se vyskytovalo na původním plazmidů pDSW247 a je lokalizováno ihned po směru a v rámci s kódující sekvencí IFN-beta. Plazmídový vektor pDSW247 byl připraven purifikací na gelu fragmentu Notl + BamHI (viz příklad 1). Aby se sestavil konečný expresní vektor kódující fůzi IFN-beta-l/IgG2, byla prováděna trojcestná liga25 ce s použitím výše uvedených fragmentů. Tento expresní plazmid byl nazván pCMG261 a obsahoval signální sekvenci VCAM-1 ve fúzi s genem pro zralý lidský IFN-beta, enterokinázovou spojovací sekvenci a Fc doménu myšího IgG2a. Kompletní DNA (sekvence id. č. 1) a proteinová (sekvence id. č. 2) sekvence fúzního proteinu jsou uvedeny na obrázku 2.
Příklad 3
Produkce fúzního proteinu interferonu-beta-1 a v savčích buňkách
Expresní vektor rekombinantního IFN-beta/Fc, pCMG261, byl přechodně transfekován do buněk
EBNA293 z lidských ledvin, aby byla dosažena exprese fúzního proteinu ÍFN-beta-la podle vynálezu. Tento rekombinantní expresní plazmid byl transfekován podle lipofektaminového protokolu (katalog, č. 18324-020, Life Techonologies) do buněk EBNA283 z lidských ledvin podle protokolu výrobce (Life Technologies, Gaithersburg, MD, Hawley-Nelson, P., Ciccarone,
V., Gebeyehu, G. Jessee, J., Felgner, P.L., 1993, Focus 15.73) s použitím 1 až 3 g plazmidové
DNA pro lOOmm misky pro tkáňové kultury pro buňky EBNA293. Den po lipofektaminové transfekci buněk byla média nahrazena růstovým médiem (Eagleho médium modifikované dle Dulbecca, 10% fetální bovinní sérum, 4mM glutamin, 250 g Gentecinu/ml (Life Technologies, Gaithersburg, MD)). Kondicionovaná média byla sklízena 3 až 4 dny později a byla určována koncentrace IFN-beta-l-Fc tak, jak je popsáno níže.
Produkce fúzního proteinu IFN-beta/Fc v jiných savčích buňkách a expresních systémech pro prokaryotické buňky může být také prováděna po přenesení proteinové kódující oblasti pro fúzní protein do příslušných expresních vektorů pro tyto systémy. Alternativní expresní systémy zahr50 nují savčí buněčné jako jsou například buňky ovarií čínského křečka (CHO) (Barsoum, J., 1995,
-30Methods v Mol. Biol. 48, kapitola 18, 225-237) a myší buňky NS-0 (Rossman, C. et al., 1996, protein Expression and Pur,, 7, 335-342), a buňky ledvin opice COS7 (Ettinger, R. et. al., 1996, Proč. NatL Acad. Sci. USA, 93: 23,13 102-13 107). Další eukaiyotické expresní systémy, které by mohly být použitelné, jsou kvasinky Pichia pastoris (Eldin, P.E. et al., 1997, I. Immun. s Methods, 201, 67-75) a Saccharomyces cerevisiae (Horwitz, A.H., 1988, Proč. Nati. Acad. Sci.
USA, 85, 8678-8682).
Kvantifikace stupně exprese proteinu IFN-beta-la-Fc ve tkáňových supematantech ztransfekovaných buněk EBNA 293 byla prováděna pomocí testu ELISA s použitím IgG frakce ío králičích polyklonálních protilátek anti-IFN-beta-la purifikované metodou proteinu A (antigen byl purifikovaný IFN-beta-la, Biogen, lne.) pro navázání na 96-jamkové destičky. Protilátka detekuje standardy IFN-beta-la a tkáňové supematanty v rozmezí koncentrace interferonu mezi ng/ml a 0,3 ng/ml, Pro detekci navázaných interferonu byly použity biotinylovaný králičí polyklonální anti-IFN-beta-la (stejné protilátky jako uvedeny výše) a křenová peroxidáza konjugovaná se streptavidinem. Pro potvrzení hodnot získaných z testu ELISA byla prováděna analýza westernovým přenosem, kdy redukované tkáňové supematanty a standardy IFN-beta-1 byly separovány na 5 až 20% Tris-glycinových gelech (Novex, San Diego, CA), přeneseny na membrány PVDF (Amersham Life Science, lne., Cleveland, OH) a detekovány odlišným králičím polyklonálním sérem (pěstovaným proti IFN-beta-la), a pak následovaly oslí proti—králičí
IgG protilátky konjugované s křenovou peroxidázou (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA).
Příklad 4
Antivirová aktivita fúzního proteinu IFN-beta-la/myší IgG2a
Buňky lidského plicního karcinomu (A549) byly předem ošetřovány 24 hodin s IFN-beta-la nebo IFN-beta-myší IgG2a(61,41,27,18, 12, 8,2, 5,5,3,7,2,5,1,6 pg/ml) před stimulací virem encefalomyokarditidy virus (EMCV). Po dvoudenní inkubaci s virem byly živé buňky barveny roztokem XTT: PMS (2,3-bis(2-methoxy-4—nitro-5-sulfofenyl)-2H-tetrazolium-5-karboxanilid, vnitřní sůl: fenazinmethosulfát, v koncentraci 333 g/ml a 2ng/ml, v daném pořadí, v pufrovaném solném roztoku) a detekovány spektroskopií v 450nM. Test byl prováděn ve trojím opakování pro každou koncentrací IFN.
Na obrázku 8 jsou ukázány standardní odchylky jako svislé úsečky. Bylo zjištěno, že 50% cytopatický účinek pro IFN-beta-la byl přibližně 0,4 pM. Pro IFN-beta-myší IgG2a byl 50% cytopatický účinek 0,15 pM.
Příklad 5
Konstrukce a produkce fúzního proteinu „lidský interferon beta-la/lidský IgGl Fc“
A. Konstrukce fúzního proteinu lidský interferon beta-la/lidský IgGl Fc
PCR technologie byla použita pro vytvoření expresního plazmidu kódujícího DNA sekvenci lidského IFN beta fúzovanou s částí Fc (kloubová doména, domény CH2 a CH3) molekuly těžkého řetězce lidského IgGl.
EBNA konstrukt:
Plazmidový vektor pCH269 je derivát pCEP4 (Invitrogen, Carlsbad, CA), ze kterého byl odstraněn gen EBNA-1. Plazmid byl použit pro konstrukci expresního vektoru použitelného pro pře-31 CZ 300762 Bó chodnou expresi proteinu v buňkách EBNA 293 z lidských ledvin (Invitrogen, Carlsbad, CA, Shen, E.S., et, al„ 1995, Gene, 156,235 - 239).
Expresní kazeta fúzního proteinu byla sestavena ze tří fragmentů DNA: fragment Notl/Sall kódující signální sekvenci VCAM-1 v rámci a fúzovanou se sekvencí kódující lidský IFN beta, fragment Sall/Notl kódující kloubovou doménu, domény CH2 a CH3 lidského IgGl a fragment Notl EBNA expresního vektoru pCH269.
Dva nezávislé fragmenty Notl/Sall kódující zralou signální sekvenci VCAM-1 v rámci a fúzoio vanou ke genu lidského IFN beta byly vytvořeny technologií PCR. PCR templát byl plazmid pCMG258 (viz příklad 2 výše), který kóduje zralou signální sekvenci VCAM-1 v rámci a fúzovanou ke genu lidského IFN beta, který sám také v rámci a fúzovaný k enterokinázové spojovací sekvenci. Byly použity dvě sady primerů pro PCR. Jedna sada primerů:
5'-AGCTTGCTAGCGGCCGCGGCCTCACTGGCTTCA-3' (sekvence id. č. 37) a 5'- ATACGCGTCGACGTTTCGGAGGTAACATGTAAGTCTG-3' (sekvence id. 38) vnesla změnu aminokyselin od G do C v pozici 162. Tento fragment byl nazván lidský IFN beta-C 162. Druhá sada primerů:
5’-AGCTTGCTAGCGGCCGCGGCCTCACTGGCTTCA-3'{ sekvence id. č. 39) a 5’-TACACGTCGACGCTGCCACCACCGCCGTTTCGGAGGTAACATGTAAGTCTG-3 F (sekvence id. č. 40) také zavedla substituci aminokyselin G162 až Cl62 a změnila enterokinázovou spojovací sekvenci (DDDDK) (sekvence id. č. 62) na spojovací sekvenci GGGGS (sekvence id, ě. 64) v rámci a fúzovanou k lidskému genu IFN beta. Tento fragment byl nazván lidský IFN beta-C 162/G4S. Obě sady primerů obsahovaly 5' Notl místo pro umožnění ligace do pCH269, a 3' Sáli štěpné místo pro umožnění ligace s fragmentem Sall/Notl lidského IgGl.
Lidský fragment IgGl, kteiý kóduje kloubovou doménu a domény CH2 a CH3 lidského IgGl, byl připraven pomocí štěpení restrikčními enzymy (Sall/Notl) plazmidů pEAG409, derivátu plazmidu SABI44 (popsaného v patentu Spojených Států US 5 547 853). Fragment byl vyříznut a purifikován přes gel. EBNA expresní vektorový plazmid pCH269 byl štěpen Notl a purifikován přes gel.
Dva fúzní konstrukty lidského IFN beta-lidského IgGl Fc byly vytvořeny dvěma trojcestnými ligacemi. Jeden konstrukt, nazvaný ZL6206, obsahoval spojovací sekvenci G4S, druhý konstrukt, nazvaný ZL5107, je přímá fúze. Kompletní sekvence DNA a proteinu otevřeného Čtecího rámce přímé fuze (viz obrázek 10) jsou uvedeny v sekvenci id. č. 41 a v sekvenci id. č. 42, podle pořadí. Kompletní sekvence DNA a proteinu otevřeného čtecího rámce fuze spojovací sekvence (viz obrázek 11) jsou uvedeny v sekvenci id, č. 43 a v sekvenci id. č. 44, podle pořadí.
CHO konstrukt:
Byl vytvořen konstrukt v buňkách CHO s trvalou expresí fúze „lidský IFN beta-lidský IgGl Fc“, který obsahoval lidský IFN beta přímo spojený s lidským IgGl Fc. Fragment lidský IFN betalidský IgGl Fc byl vystřižen z plazmidů ZL5I07 sNotl a purifikován pres gel, byl ligován do místa Notl v pEAG347 (expresní vektor obsahující tandem časného promotoru SV40 a hlavního pozdního adenovirového promotoru [pocházejícího z plazmidů pAD2beta], jedinečné klonovací místo Notl následované signály pro pozdní ukončení transkripce SV40 a polyA [pocházející z plazmidů pCMVbeta]. pEAG347 obsahuje plazmidovou kostru pocházející z pUC 19 a dhfr pro MTX selekci a amplifikaci v transfekovaných buňkách CHO), .3? .
LZ, OUV/OA OO
B. Produkce fúzního proteinu lidský interferon-beta-la/lidský IgGl Fc
Přechodná transfekce fúzních konstruktů lidského IFN beta do buněk EBNA293:
Rekombinantní expresní vektory IFN-beta/lidský IgGl Fc popsané výše byly přechodně transfekovány do buněk EBNA 293 z lidských ledvin pro dosažení exprese fúzního proteinu IFNbeta-la podle vynálezu. Tyto rekombinantní expresní plazmidy byly transfekovány podle lipofektaminového protokolu (katalog, č. 18324-020, Life Technologies) do buněk z lidských ledvin EBNA 293 podle protokolu popsaného v příkladu 3 výše.
Stabilní transfekce dhfr- CHO buněk fúzním konstruktem „lidský IFN-beta-la/lidsky IgGl Fc“ (bez spojovací sekvence):
Expresní vektor dhfr obsahující rekombinantní IFN-beta/lidský IgGl Fc (bez spojovací sekven15 ce) popsaný výše byl trvale transfekován do buněk, aby bylo dosaženo exprese fuzního proteinu IFN-beta-la podle vynálezu. Tento rekombinantní expresní plazmid byl transfekován elektroporaci a selekce pozitivních klonů byla prováděna podle následujícího protokolu:
Plazmidová DNA (20 g) Štěpena s BglII byla precipitována, resuspendována v 800 μΐ pufru
HEPES a přidána k 10x107 buněk/ml CHO. Po elektroporaci byly buňky pěstovány 2 dny v kompletním médiu DMEM. Pak byly buňky rozděleny na 20 až 40 lOcm misek s kompletním DMEM/dialyzovaným 10% FBS a pěstovány 5 dnů před přenesením buněk na selekční média se stoupající koncentrací (50 až 200 ng/ml) MTX v DMEM po dobu dvou týdnů. Na konci dvou týdnů byly selektovány jednotlivé kolonie buněk a namnoženy. Supematanty pocházející z 22 klonů CHO byly testovány v antivirových testech.
Aktivita:
Antivirová aktivita fuzních proteinů byla zjišťována v testech CPE, jak popsáno v příkladu 4.
Na základě specifické aktivity 60 MU/mg standardu interferonu-beta-1 a použitého v tomto testu, byla aktivita přechodně (EBNA) exprimovaného fuzního proteinu lidský interferon-beta-la/lidský IgGl Fc se spojovací sekvencí 900 U/ml a aktivita bez spojovací sekvence byla 440 U/ml. Aktivita fúzního proteinu exprimovaného v buňkách CHO lidský interferon-beta-la/lidský IgGl Fc byla 50 U/ml.
Příklad 6
Měření antivirové aktivity interferonu-beta-la v plazmě myší ošetřených interferonem-beta-la a fúzním proteinem interferon-beta-la/myší IgG2a
Myším (C57/B16) byla podána do žíly v ocasu i.v. injekce 50 000 jednotek interferonu-beta-la (volného) nebo 5000 jednotek fúzního proteinu interferon-beta-la-myší IgG2a. Jako kontrola byl podáván stejný objem fosfátového pufru.
Krev byla odebírána retroorbitálními krevními odběry v různým časových bodech (okamžitě, 0,25, 1, 4, 24 a 48 hodin) po injekci interferonu beta. V každém časovém bodě byly alespoň tři myši. Plná krev byla odebírána do zkumavek obsahujících antikoagulant, buňky byly odstraněny a zbylá plazma zmražena až do doby testování. Vzorky plazmy byly naředěny 1:10 médiem bez so séra a ponechaly se protéci přes 0,2 m filtr ve stříkačce.
Naředěné vzorky pak byly titrovány do určených jamek na 96-jamkové destičce pro tkáňové kultury obsahující buňky A549. Na každé destičce byla testována ředění standardů interferonubeta-la (10,6,7, 4,4,2,9, 1,3, 0,9 a 0,6 U/ml AVONEX) a čtyři vzorky plazmy. Buňky byly pře55 dem ošetřeny se vzorky po 24 hodin před stimulací virem EMC. Po dvoudenní inkubaci s virem
-33CZ 300762 B6 byly životaschopné buňky barveny roztokem MTT (5 mg/ml ve fosfátovém pufru) po dobu 1 hodiny, promyty fosfátovým pufrem a solubilizovány s 1,2N HCI v isopropanolu. Jamky pak byly odečítány ve 450 nm. Pro každou destičku byly vytvořeny standardní křivky a použity pro určení množství aktivity interferonu-beta-1 a v každém testovaném vzorku. Aktivita ve vzorcích od různých myší byla vynesena do grafu proti časovým bodům na obrázku 9.
Pomalejší ztráta fúze interferonu-beta-1 a z krevního oběhu jako funkce času ukazuje, že biologický poločas vzorku fúzního proteinu je mnohem delší než poločas nemodifikovaného kontrolního interferonu-beta-la. Druhé velmi významné zjištění z této studie bylo to, že velmi málo ío fúzního proteinu bylo ztraceno v průběhu distribuční fáze, jak prokázáno podobnými vysokými hladinami aktivity v 15 a 60 minutách. Data ukazují, že na rozdíl od kontrol interferonu-beta-la, je distribuce fuzního proteinu interferonu-beta-la převážně omezena na cévní zásobení.
Příklad 7
Srovnávací farmakokinetické a farmakodynamické studie na primátech
Komparativní studie byly prováděny s fúzí interferonu-beta-la a nativním interferonem-beta-la (jako neformulovaný volný meziprodukt AVONEX® interferonu-beta-la ve lOOmM fosfátu sodném, 200mMNaCl, pH7,2) pro zjištění jejich relativní stability a aktivity na primátech. V těchto studiích byla srovnávána farmakokinetika a farmakodynamika fuze interferonu-beta-la u primátů s nativním interferonem-beta-la a racionální závěry mohou být rozšířeny na člověka.
Zvířata a metody
Návrh studie
Toto byla studie s paralelními skupinami a opakovanými dávkami pro vyhodnocení komparativní farmakokinetíky a farmakodynamiky fúzního proteinu interferonu-beta-la a nefúzovaného interferonu-beta-la.
Pro tuto studii byly použiti zdraví primáti (výhodně makak „rhesus“, Macaca mullata). Před podáváním dávek byly u všech zvířat vyšetřeny příznaky nemocí veterinářem při dvou příleži35 tostech během 14 dnů před prvním podáním testované sloučeniny, jedno vyšetření muselo být v průběhu 24 hodin před prvním podáním testované sloučeniny. Pouze zdravá zvířata dostala testovanou sloučeninu. Vyhodnocení zahrnovalo obecné fyzikální vyšetření a krevní odběry před podáním dávky pro vyšetření základních klinických patologických ukazatelů a výchozí hladiny protilátek proti interferonu-beta-la. Všechna zvířata byla zvážena a během 24 hodin před podá40 ním testované sloučeniny byla zaznamenávána tělesná teplota.
Bylo zaregistrováno dvanáct zvířat a rozděleno do skupin po třech, které dostávaly 1 MU/kg interferonu-beta-la buď jako fúzovaný, nebo nefúzovaný, ale jinak identický interferon-betala. Podávání bylo prováděno buď subkutánně (SC), nebo intravenózně (IV). Šest samců dostalo testovanou sloučeninu IV způsobem (3/ošetření) a dalších 6 samců dostalo testovanou sloučeninu SC způsobem (3/ošetření), Všechna zvířata musela být nedotčena ošetřením interferonem-beta, Čili tzv. naivní. Každému zvířeti byly podávány dávky ve dvou dobách, dávky byly odděleny čtyřmi týdny. Objem dávky byl 1,0 ml/kg.
Pro farmakokinetické testování byla odebírána krev v 0, 0,083, 0,25, 0,5, 1, 1,5, 2,4, 6, 8, 12, 24, 48, 72 a 96 hodin po každé injekci. V 0, 24, 48, 72, 96, 168, 336, 504 hodin po podávání studovaného léčiva byly také odebírány vzorky krve pro měření markéru biologické reakce indukované interferonem, sérového neopterinu.
- 34VZ, JUU/OÍ DO
Hodnocení během období studie zahrnují klinická vyšetřování známek toxicity prováděná 30 minut a l hodinu po podání dávky. Byla prováděna denní pozorování přes klec a byl zaznamenáván celkový vzhled, příznaky toxicity, neklid a změny chování. Během 21 dnů po podání dávky byla zaznamenávána tělesná hmotnost a tělesná teplota.
Testovací metody
Hladiny interferonu-beta v séru byly kvantifikovány s použitím testu na hodnocení cytopatického účinku (CPE). Test CPE měřil stupeň antivirové aktivity zprostředkované interferonem. Stupeň io antivirové aktivity ve vzorku odráží poěet molekul aktivního interferonu obsažených ve vzorku v okamžiku, kdy je odebírána krev. Tento přístup byl standardní metodou pro stanovení farmakokinetiky interferonu-beta. Test CPE použitý v předkládané studii detekuje schopnost interferonubeta chránit buňky lidského plicního karcinomu (A549, č. CCL-185, ATCC, Rockville, MD) před cytotoxicitou způsobenou virem encefalomyokarditidy (EMC). Buňky byly předem inkubo15 vány 15 až 20 hodin se vzorky séra, aby se umožnila indukce a syntéza proteinů, které lze indukovat interferonem, a které pak zvyšují antivirovou reakci. Potom byl přidán virus EMC a inkubován dalších 30 hodin před tím, než se vyhodnotila cytotoxicita s použitím barveni krystalovou violetí. Na každé testované destičce byl současně se vzorky testován vnitřní standard interferonubeta, jakož i vnitřní standard interferonu-beta-Ig. Tento standard byl kalibrován proti referenč20 nímu standardu přirozeného interferonu lidských fibroblastů (WHO Second International Standard for Interferon, Human Fibroblast, Gb23-902-53). Každá testovaná destička také zahrnovala jamky s kontrolou buněčného růstu, které neobsahovaly ani interferon-beta jakéhokoliv druhu, ani EMC, a jamky s virovou kontrolou, které obsahovaly buňky a EMC, ale neobsahovaly interferon-beta. Pro zjišťování účinku, byl-li jaký, vzorků na buněčný růst byly také připraveny kont25 rolní destičky obsahující standardy a vzorky. Tyto destičky byly obarveny bez přidání viru.
Vzorky a standardy byly testovány v duplikátech na každé ze dvou opakujících se testovacích destiček, poskytující čtyři údaje o vzorku. Byl uváděn geometrický průměr hodnot koncentrace ze čtyřech opakovaní. Limit detekce v tomto testuje 10 jednotek (U)/ml.
Sérové koncentrace neopterinu byly určovány na oddělení klinické farmakologie s použitím komerčně dostupných testů.
Farmakokinetické a statistické metody
Software RstripTM (MicroMath, lne., Salt Lake City, UT) byl použit pro prokládání (fitování) dat pomocí farmakokinetických modelů. Geometrické průměry hodnot koncentrace byly vyneseny do grafu proti času pro každou skupinu. Protože výsledky testu jsou vyjádřeny jako ředění, jsou geometrické průměry považovány za vhodnější, než aritmetické průměry. Hladiny sérového interferonu byly srovnány podle výchozích hodnot a nedetekovatelné koncentrace v séru byly stanoveny na 5 U/ml, což představovalo jednu polovinu spodního limitu detekce.
Pro data z IV infuzí byl fitován IV infuzní model se dvěma kompartmenty pro detekovatelné koncentrace v séru pro každý subjekt a SC data byla filtrována podle injekčního modelu se dvě45 ma kompartmenty.
Byly vypočítány následující farmakokinetické parametry:
i) pozorovaná vrcholová koncentrace, Cmax (U/ml) ii) oblast pod křivkou od 0 do 48 hodin, AUC se vypočetla pomocí lichoběžníkového pravidla, iii) poločas eliminace, a, z dat získaných při IV infuzi (když byl použit IV způsob podávání):
-35CZ 300762 B6 iv) poločas distribuce (hodiny, h),
v) clearance (ml/h), vi) zjevný distribuční objem, Vd (I).
Pro výpočet poločasu eliminace po SC a IM injekci byl použit software WinNonlin (verze 1.0,
Scientific Consulting lne., Apex, NC).
Pro neopterin jsou uvedeny hodnoty aritmetického průměru v každé skupině. Byla vypočtena
Ema*, maximální hodnota změny proti základní hodnotě. CmM, AUC a EmiX byla pak analyzovány io jednosměrnou analýzou rozptylu pro srovnání skupin lišících se dávkami. Hodnoty Cmax a AUC byly logaritmicky transformovány před analýzou, jsou uváděny geometrické průměry.
Příklad 8 15
Antiangiogenní účinky fúze interferonu-beta-la: Hodnocení schopnosti fúze interferonu-betala inhibovat proliferaci endotelových buněk in vitro
Buňky z lidského cévního endotelu (Cell Systems, katalog, č. 2V0-P75) a buňky endotelu kož20 nich kapilár (Cell Systems, katalog, č. 2M1-C25) byly udržovány v kultuře s médiem ze soupravy CS-C Medium Kit (Cell Systems, katalog, č. 4Z0-50O). Čtyřiadvacet hodin před pokusem byly buňky ošetřeny trypsinem, resuspendovány v testovacím médiu, 90% Ml99 a 10%fetální hovězí sérum (FBS), a upraveny na požadovanou hustotu. Pak byly buňky vysety na 24 nebo
96jamkové destičky potažené želatinou, s hustotou 12 500 buněk/jamka nebo 2000 buněk/jamka. 25
Po inkubaci přes noc bylo testovací médium nahrazeno čerstvým médiem obsahujícím 20 ng/ml lidského rekombinantního bazického fibroblastového růstového faktoru bFGF (Becton Dickinson, katalog, č. 400600) a různé koncentrace fúzovaných nebo nefúzovaných proteinů interferonu-beta-la nebo pozitivní kontroly (jako pozitivní kontrola lze užít endostatin nebo proti30 látka k bFGF). Celkový objem byl nastaven na 0,5 ml ve 24jamkové destičce nebo 0,2 ml v 96jamkové destičce.
Po dvaasedmdesáti hodinách byly buňky ošetřeny trypsinem pro počítání na Coulteru, zamraženy pro odečítání fluorescence CyQuant nebo značeny [JH] thymidinem.
Tento in vitro test sloužil k hodnocení molekul lidského interferonu-beta podle vynálezu z hlediska účinků na proliferaci endotelových buněk, která může být indikátorem antiangiogenních účinků in vivo. Viz např. 0'Reilly, M.S., T. Boehm., Y. Shing, N. Fukal, G. Vasios, W. Lané, E. Flynn, J. Birkhead, B. Olsen, J. Folkman, 1997, Endostatin: An Endogenous Inhibitor of
Angiogenesis and Tumor Growth, Cell, 88,277-285.
Příklad 9
In vivo model pro testováni antiangiogenního a antineovaskularizačního účinku fúze interferonubeta- la/Ig
Pro testováni antiangiogenních a antineovaskularizaěních účinků molekul podle vynálezu byla vyvinuta celá řada modelů. Některé z těchto modelů byly popsány v patentech US 5 733 876 (31. března 1998, „Method of inhibiting angiogenesis“) aUS5 135919 (4, srpen 1992, „Method and pharmaceutical composition for the inhibition of angogenesis“). K dalším testům patří např. test s chorioalantoidní membránou bez skořápky (CAM) podle S. Taylor a J. Folkman, Nátuře, 297, 307, 1982 a R. Crum, S. Szabo a J. Folkman, Science, 230, 1 375, 1985, model angiogeneze se vzdušným dorzálním vakem u myší podle J. Folkman, etal., J. Exp. Med., 133, 275,
-3A1971, a test s mikrokapsou rohovky podle Gimbrone, M.A.Jr. et al., Nati. Cancer Inst., 52, 413,
1974, kde je vaskularizace rohovky indukována u dospělých samců laboratorních potkanů kmene
Sprague-Dawley (Charles River, Japonsko) implantací 500 ng bazického FGF (hovězí, R and D systems, lne.) impregnovaného v EVA (kopolymer ethylen-vinylacetátu) peletech do každé rohovky.
K dalším metodám testování fúzí interferonu-beta/Ig na antiangiogenní účinky na zvířecím modelu patří (i když výčet tím není omezen) screeningové testy nových potenciálních protírakovinných léčiv, jak byly popsány v původní publikaci Cancer Chemotherapy Reports, Part 3, ío Vol. 3, No. 2, září 1972 a v suplementu In vivo Cancer Models, 1 976-1 982, NIH Publ. No. 842635, únor 1984. Vzhledem kmezidruhové bariéře pro interferony typul, pro hodnocení antiangiogenní aktivity fúzí interferonu-beta na modelech hlodavců, byly připraveny přípravky fúzí interferonu-beta/Ig hlodavců. Screeningové metody jsou ukázány na příkladu protokolu pro testování antiangiogenního účinku fúzí myšího interferonu-beta/Ig na subkutánně implantovaný t5 Lewisův plicní karcinom.
Původ nádorové linie
Vznikla spontánně v r. 1951 jako karcinom plic u myši C57BL/6.
Souhrn testovacích procedur
Fragment nádoru byl implantován do subkutánně do axilámí oblasti myší B6D2F1. Testované činidlo (např. fuzní protein podle vynálezu) byl podáván v různých dávkách subkutánně (SC) nebo intraperitoneálně (IP) po několik dní po implantaci nádoru. Měřeným parametrem pak byl medián času přežití. Výsledky jsou uvedeny jako procenta času přežití kontroly.
Zvířata
Propagace nádoru: myši C57BL/6
Testovací zvířata: myši B6D2F1
Hmotnost: myši by měly mít hmotnost s rozpětím 3 g s minimální hmotností u samců 18 g a samic 17 g
Pohlaví: zvířata jednoho pohlaví jsou užita pro test i kontrolu v jednom pokusu 35 Zdroj: jeden zdroj, pokud je to možné, pro všechna zvířata v jednom pokusu
Rozsah experimentu zvířat v jedné testovací skupině 40
Přenos nádoru
Propagace nádoru:
Fragment: připravit 2 až 4 mm fragment nádoru SC dárcovského nádoru 45 Doba: 13. až 15, den
Místo: fragment implantován SC do axilámí oblasti vpichem v ingvinální oblasti
Testování:
Fragment: příprava fragmentu o velikosti 2 až 4 mm ze s.c. dárcovského tumoru.
Doba: 13. až 15. den
Místo: implantace fragmentu s.c. do axilámí oblasti vpichem v ingvinální oblasti.
-37Cl 300762 B6
Testovací schéma:
Den 0: implantace tumoru. Založení bakteriálních kultur. Testování pozitivní kontrolní slouče5 niny v každém experimentu s lichým číslem. Příprava materiálů. Denní záznam úmrtí.
Den 1: kontrola kultur. Odstranění kontaminovaného experimentu. Randomizace zvířat. Ošetřování dle instrukcí (v den 1 a následující dny).
ío Den 2: Opětná kontrola kultur. Odstranění kontaminovaného experimentu.
Den 5: Hodnocení dne 2 a den počátečního testu vyhodnocení toxicity přípravku.
Den 14: Kontrolní den časného úmrtí.
Den 48: Kontrolní den.
Den 60: Konec a vyhodnocení experimentu. Vyšetření tumoru plic pouhým okem.
Kontrola kvality:
Stanovení pozitivní kontrolní sloučeniny (NSC 26271 (Cytoxan v dávce 100 mg/kg/injekce)) v každém experimentu s lichým číslem, jehož režim byl v den 1 pouze intraperitoneální. Spodní limit testu/kontroly pro pozitivní kontroluje 140 %. Přijatelný medián přežití u neošetřené kont25 roly byl 19 až 35,6 dnů.
Vyhodnocení:
Měřený parametr je medián přežití. Výpočet průměrné tělesné hmotnosti zvířat v den 1 a v den 5, výpočet poměru test/kontrola pro všechny testované skupiny. Jsou vypočítány průměrné tělesné hmotnosti zvířat ve dny odečítání a v den konečného vyhodnocení. Poměr test/kontrola je vypočítán pro všechny testované skupiny s > 65 % přeživších v den 5. Poměr test/kontrola < 86% indikuje toxicitu. Pro hodnocení toxicity může být také použita nepřiměřená změna tělesné hmotnosti (test minus kontrola).
Měřítka aktivity:
Výchozí poměr test/kontrola větší nebo rovný 140 % považován za nezbytný pro průkaz mírné aktivity. Reprodukovatelná hodnota poměru test/kontrola větší nebo rovná 150 % je považována za významnou aktivitu.
SEZNAM SEKVENCÍ <110> WHITTY, ADRIAN
RUNKEL, LAURA BRICKELMAIER, MARGOT HOCHMAN, PAULA <120> INTERFERON-BETA FUSION PROTEINS AND USES <130> A064CONUS <140>
<141>
-38<150> 09/832,659 <151> 2001-04-11 <150> PCT/US99/24200 <15I> 1999-10-15 <150> 60/120,237 <151> 1999-02-16 io <150> 60/104,491 <151> 1998-10-16 <160> 64 < 170> Patentln Ver. 3,3 <210> 1 <211> 1197 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct 25 <220>
<221>CDS <222> (1)..(1197) <400> 1
| atg agc tac | aac Asn | ttg ctt | gga ttc cta caa Gly Phe Leu Gin 10 | aga agc agc | aat Asn | ttt Phe 15 | cag Gl n | 48 | ||||||||
| Met ser 1 | Tyr | Leu 5 | Leu | Arg | Ser | ser | ||||||||||
| tgt | cag | aag | ctc | ctg | tgg | caa | ttg | aat | ggg Gly | agg | ctt | gaa | tac | tgc | ctc | 96 |
| cys | Gin | Lys | Leu 20 | Leu | Trp | Gin | Leu | Asn 25 | Arg | Leu | Glu | Tyr 30 | Cys | Leu | ||
| aag | gac | agg | atg | aac | ttt | gac | atc | cct | gag | att | aag | cag | ctg | cag | 144 | |
| Lys | Asp | Arg 35 | Met | Asn | Phe | Asp | Ile 40 | Pro | Glu | Glu | ile | Lys 45 | Gin | Leu | Gin | |
| cag | ttc | cag | aag | gag | gac | gcc | gca | ttg | acc | atc | tat | gag | atg | ctc | cag | 192 |
| Gin | Phe | Gin | Lys | Glu | ASp | Ala | Ala | Leu | Thr | Ile | Tyr | Glu | Met | Leu | Gin | |
| 50 | 55 | 60 | ||||||||||||||
| aac | atc | ttt | gct | att | ttc | aga | caa | gat | tca | tet | agc | act | ggc | tgg | aat | 240 |
| Asn | Ile | Phe | Ala | ile | Phe | Arg Gin | Asp | ser | Ser | Ser | Thr | Gly Trp | Asn | |||
| 65 | 70 | 75 | 80 |
| gag act att | gtt gag aac ctc | ctg get aat Leu Ala Asn 90 | gtc tat val Tyr | cat HÍS | cag ata aac | 288 | ||||||||||
| Glu | Thr | Ile | val | Glu 85 | Asn Leu | Gin | ile 95 | Asn | ||||||||
| cat | ctg | aag | aca | gtc | ctg | gaa | gaa | aaa | ctg | gag | aaa | gaa | gat | ttc | acc | 336 |
| His | Leu | Lys | Thr | Val | Leu | Glu | Glu | Lys | Leu | Glu | Lys | Glu | Asp | Phe Thr | ||
| 100 | 105 | 110 | ||||||||||||||
| agg | gga | aaa | ctc | atg | age | agt | ctg | cac | ctg | aaa | aga | tat | tat | ggg Gly | agg | 384 |
| Arg | Gly | Lys 115 | Leu | Met | ser | ser | Leu 120 | His | Leu | Lys | Arg | & | Tyr | Arg | ||
| att | ctg | cat | tac | ctg | aag | gcc | aag | gag | tac | agt | cac | tgt | gcc | tgg | acc | 432 |
| ile | Leu 130 | His | Tyr | Leu | Lys | Ala 135 | Lys | Glu | Tyr | Ser | His 140 | cys | Al a | Trp | Thr | |
| ata | gtc | aga | «3 | gaa | atc | cta | agg | aac | ttt | tac | ttc | att | aac | aga | ctt | 480 |
| ile | val | Arg | Glu | ile | Leu | Arg | Asn | Phe | Tyr | Phe | ile | Asn | Arg | Leu | ||
| 145 | 150 | 155 | 160 | |||||||||||||
| aca | ggt | tac | ctc | ega | aac | gac | gat gat | gac | aag | gtc | gac | aaa | act | cac | 528 | |
| Thr | Gly | Tyr | Leu | Arg | Asn | Asp Asp ASD | Asp | Lys | Val | ASp | Lys | Thr | His | |||
| 165 | 170 | 175 | ||||||||||||||
| aca | tgc | cca | ccg | tgc | cca | gca | cct | gaa | ctc | ctg | ggg gga Gly Gly | ccg | tea | gtc | 576 | |
| Thr | Cys | Pro | Pro | Cys | pro | Ala | pro | Glu | Leu | Leu | Pro | Ser | Val | |||
| 180 | 185 | 190 | ||||||||||||||
| ttc | ctc | ttc | CCC | cca | aaa | ccc | aag | gac | acc | ctc | atg | atc | tcc | cgg | acc | 624 |
| Phe | Leu | Phe | pro | Pro | Lys | Pro | Lys | ASp | Thr | Leu | Met | Ile | ser | Arg | Thr | |
| 195 | 200 | 205 | ||||||||||||||
| cct pro | gag Glu | gtc val | aca Thr | tgc cys | gtg gta gtg val val val | gac Asp | ?3 | age ser | cac HÍS | gaa gac Glu ASp | cct pro | gag Glu | 672 | |||
| 210 | 215 | 220 | ||||||||||||||
| gtc | aag | ttc | aac | tgg | tac | gtg val | gac | ggc | ?3 | gag | gtg val | cat | aat | gcc | aag | 720 |
| val | Lys | phe | Asn | Trp | Tyr 230 | Asp Gly | Glu | His | Asn | Ala | Lys | |||||
| 225 | 235 | 240 | ||||||||||||||
| aca | aag | ccg | cgg | gag | gag | cag | tac | aac | age | acg | tac | cgt | ?3 | gtc | age | 768 |
| Thr | Lys | pro | Arg | Glu | Glu | Gin | Tyr | Asn | ser | Thr | Tyr | Arg | val | ser | ||
| 245 | 250 | 255 | ||||||||||||||
| gtc | ctc | acc | gtc | ctg | cac | cag | gac | tgg | ctg | aat | ggc | aag | gag | tac | aag | 816 |
| Val | Leu | Thr | Val | Leu | His | Gin | Asp | Trp | Leu | Asn | Gly | Lys | Glu | Tyr | Lys | |
| 260 | 265 | 270 | ||||||||||||||
| tgc | aag | gtc | tcc | aac | aaa | gcc | ctc | cca | gcc | ccc | atc | gag | aaa | acc | atc | 864 |
| cys | Lys | Val | Ser | Asn | Lys | Ala | Leu | Pro | Ala | Pro | Ile | Glu | Lys | Thr | Ile | |
| 275 | 280 | 285 | ||||||||||||||
| tcc | aaa | gcc | aaa | ggg Giy | cag | ccc | ega | gaa | cca | cag | 53 | tac | acc | ctg | ccc | 912 |
| ser | Lys | Ala | Lys | Gin | pro | Arg | Glu | pro | Gin | Tyr | Thr | Leu | pro | |||
| 290 | 295 | 300 | ||||||||||||||
| cca | tcc | cgg | gat | gag | ctg | acc | aag | aac | cag | gtc | age | ctg | acc | tgc | ctg | 960 |
| Pro | ser | Arg | Asp | GlU | Leu | Thr | Lys | Asn | Gin | val | Ser | Leu | Thr | cys | Leu | |
| 305 | 310 | 315 | 320 | |||||||||||||
| gtc | aaa | ggc | ttc | tat | CCC | age | gac | atc | gcc | gtg | gag | tgg | gag | age | aat | 1008 |
| val | Lys | Gly | Phe | Tyr | Pro | Ser | ASp | Ile | Ala | val | Glu | Trp | Glu | Ser | Asn | |
| 325 | 330 | 335 |
| gqg cag Gly Gin | ccg gag Pro Glu 340 | aac Asn | aac tac aag acc | acg cct | ccc gtg ttg gac tcc | 1056 | ||||||||||
| Asn | Tyr | Lys | Thr 345 | Thr | pro | pro | val | Leu 350 | Asp | ser | ||||||
| gac | ggc | tcc | ttc | ttc | ctc | tac | agc aag | ctc | acc | «3 | gac aag | agc | agg | 1104 | ||
| Asp | Gly | ser 355 | Phe | Phe | Leu | Tyr | ser 360 | Lys | Leu | Thr | & | Lys | Ser | Arg | ||
| tgg | cag | cag | 909 Gly | aac | gtc | ttc | tca | tgc | tcc | gtg val | atg | cat | gag | gct | ctg | 1152 |
| Trp | Gin | Gin | Asn | val | Phe | ser | Cys | ser | Met | His | Glu | Ala | Leu | |||
| 370 | 375 | 380 | ||||||||||||||
| cac | aac | cac | tac | acg | cag | aag | agc | ctc | tcc | ctg | tct | ccc | 999 Gly | aaa | 1197 | |
| HIS | Asn | His | Typ | Thr | Gin | Lys | ser | Leu | ser | Leu | ser | pro | Lys | |||
| 385 | 390 | 395 |
<210> 2 <211> 399 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>
<223> Description of Artificial sequence: Synthetic construct o <400 > 2
| wet Ser 1 | Tyr Asn Leu 5 | Leu | Gly Rhe Leu Gin Arg 10 | Ser | Ser Asn | Phe 15 | Gin | ||||||||
| cys | Gin | Lys | Leu 20 | Leu | Trp | Gin | Leu | Asn 25 | Gly Arg | Leu | Glu | T5 | cys | Leu | |
| Lys | Asp Arg | Met | Asn | Phe | Asp | Ile | pro | Glu Glu | ile | Lys | Gin ueu | Gin | |||
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Gin | Phe | Gin | Lys | Glu | Asp | Ala Ala | Leu | Thr Ile Tyr Glu | Met | Leu | Gin | ||||
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Asn 65 | ile | phe | Ala | Ile | Phe 70 | Arg Gin | Asp | ser | ser 75 | Ser | Thr | Gly Trp | Asn 80 | ||
| Glu | Thr | Ile Val | Glu | Asn | Leu | Leu | Ala | Asn | Val | Tyr | His | Gin | Ile | Α5Π | |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| HÍS | Leu | Lys | Thr | val | Leu | Glu Glu | Lys | Leu | Glu | Lys | Glu | Asp | Phe | Thr | |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| Arg | Gly | Lys | Leu | Met | ser | ser | Leu | His | Leu | Lys Arg | Tyr | Tyr | Gly Arg | ||
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| ile | Leu 130 | His | Tyr | Leu | Lys | Ala 135 | Lys | Glu | Tyr | ser | His 140 | cys | Ala | Trp | Thr |
| Ile | val | Arg | val | Glu | Ile | Leu | Arg | Asn | Phe | Tyr | Phe | ile | Asn | Arg | Leu |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| Thr | Gly Tyr | Leu | Arg | Asn | Asp Asp | Asp Asp | Lys | val | Asp | Lys | Thr | His | |||
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| Thr | cys | Pro | Pro | Cys | Pro | Ala | Pro | Glu | Leu | Leu | Gly Gly | pro | Ser | Val | |
| 180 | 185 | 190 | |||||||||||||
| Phe | Leu | Phe | pro | Pro | Lys | Pro Lys | Asp | Thr | Leu | Met ile | ser | Arg | Thr |
-41 CZ 300762 B6
195 200 205
| Pro | Glu 210 | val Thr | Cys | Val val val 215 | Asp | val | ser | His 220 | Glu | Asp | Pro | Glu | |||
| val | Lys | Phe | Asn | Trp | Tyr | val | Asp Gly | val | Glu | Val | His | Asn | Ala | Lys | |
| 225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
| Thr | Lys | pro | Arg | Glu | Glu | Gin | Tyr Asn | Ser | Thr | Tyr Arg | val | val | Ser | ||
| 245 | 250 | 255 | |||||||||||||
| val | Leu | Thr Val | Leu | HÍS | Gin | Asp Trp | Leu | Asn | Gly | Lys | Glu | Tyr | Lys | ||
| 260 | 265 | 270 | |||||||||||||
| cys | Lys | val | Ser | Asn | tys | Ala | Leu | pro | Ala | Pro | lle | Glu | Lys | Thr | lle |
| 275 | 280 | 285 | |||||||||||||
| ser | Lys | Ala | Lys | Gly | Gin | Pro | Arg | Glu | pro | Gin val | Tyr | Thr | Leu | Pro | |
| 290 | 295 | 300 | |||||||||||||
| pro | Ser | Arg Asp | Glu | Leu | Thr | Lys | Asn | Gin Val | ser | Leu | Thr | Cys | Leu | ||
| 305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
| val | Lys | Gly | Rhe | Tyr | pro | Ser | ASp | lle Ala val | Glu | Trp | Glu | ser | Asn | ||
| 325 | 330 | 335 | |||||||||||||
| Gly | Gin | Pro | Glu | Asn | Asn | Tyr | Lys | Thr Thr | Pro | Pro | Val | Leu | ASp | ser | |
| 340 | 345 | 350 | |||||||||||||
| Asp | Gly | ser | Phe | phe | Leu | Tyr | ser | Lys | Leu | Thr | val | Asp | Lys | Ser | Arg |
| 355 | 360 | 365 | |||||||||||||
| Trp | Gin | Gin | Gly | Asn | val | Phe | Ser | Cys | ser | Val | Met | His | Glu | Ala | Leu |
| 370 | 375 | 380 | |||||||||||||
| His | Asn | His | Tyr | Thr | Gin | Lys | Ser | Leu | ser | Leu | ser | Pro | Gly | Lys |
<2103 <211> 549 <212>DNA <213> Artificial Sequence <220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct io <220>
<221>CDS <222> (1)..(549) <400>3
| tec ggg Ser Gly 1 | ggc cat Gly His | cat cat cat | cat HÍS | cat His | age tcc gga gac gat gat gac | ||||||||||
| HIS 5 | Hns | HIS | Ser 10 | Ser | Gly Asp | ASp | Asp 15 | Asp | |||||||
| aag | atg | age | tac | aac | ttg | ctt | gga | ttc | cta | caa | aga | age | age | aat | ttt |
| Lys | Met | Ser | Tyr | Asn | Leu | Leu | Gly | Phe | Leu | Gin | Arg | ser | Ser | Asn | Phe |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| cag | tgt | cag | aag | ctc | ctg | tgg | caa | ttg | aat | 999 | agg | ctt | gaa | tac | tgc |
| Gin | cys | Glr> | Lys | Leu | Leu | Trp | Gin | Leu | Asn | Gly | Arg | Leu | Glu | Tyr | cys |
.47.
\jL· juu/uí UU
| ctc aag gac Leu Lys Asp | agg atg aac | ttt Phe 55 | gac atc cct | gag gag att aag cag ctg | ||||||||||
| Arg | Met Asn | Asp lle | Pro | Glu | Glu 60 | lle Lys Gin Leu | ||||||||
| 50 | ||||||||||||||
| cag | cag | ttc cag | aag | gag gac | gcc | gca | ttg | acc | atc | tat | gag atg | ctc | ||
| Gin | Gin | Phe Gin | Lys | Glu | Asp | Ala | Ala | Leu | Thr | lle | Tyr | Glu Met | Leu | |
| 65 | 70 | 75 | 80 | |||||||||||
| cag | aac | atc | ttt | get | att | ttc | aga | caa | gat | tea | tet | age | act ggc Thr Gly | tgg |
| Gin | Asn | lle | Phe Ala | lle | Phe | Arg | Gin | Asp | ser | ser | ser | Trp | ||
| 85 | 90 | 95 | ||||||||||||
| aat | gag | act | att gtt | gag | aac | ctc | ctg | get | aat | gtc | tat | cat cag | ata | |
| Asn | Glu | Thr | ile val | Glu | Asn | Leu | Leu | Ala | Asn | Val | iyr | His Gin | lle | |
| 100 | 105 | 110 | ||||||||||||
| aac | cat | ctg | aag | aca | gtc ctg gaa | gaa | aaa | ctg | gag | aaa | gaa gat | ttc | ||
| Asn | His | Leu | Lys | Thr | Val | Leu | Glu | Glu | Lys | Leu | Glu | Lys | Glu Asp | Phe |
| 115 | 120 | 125 | ||||||||||||
| acc | agg | gga Gly | aaa | ctc | atg | age | agt | ctg | cac | ctg | aaa | aga | tat tat | ggg Gly |
| Thr | Arg | Lys | Leu | Met | ser | Ser | Leu | His | Leu | Lys | Arg Tyr Tyr | |||
| 130 | 135 | 140 | ||||||||||||
| agg | att | ctg | cat | tac | ctg | aag | gcc | aag | gag | tac | agt | cac | tgt gcc | tgg |
| Ϊ8 | lle | Leu | His | Tyr | Leu 150 | Lys | Ala | Lys | Glu | Tyr 155 | ser | HÍS | Cys Ala | Trp 160 |
| acc | ata | gtc | aga | gtg val | gaa | atc | cta | agg | aac | ttt | tac | ttc | att aac | aga |
| Thr | lle | val | Arg | Glu | He | Leu | Arg | Asn | Phe | Tyr | phe | XIe Asn Arg | ||
| 165 | 170 | 175 |
192
240
288
336
384
432
480
528 ctt aca ggt tac Leu Thr Gly Tyr
180 ctc ega aac Leu Arg Asn
549 <210> 4 <211> 183 <212>PRT <213> Artificial Sequence <220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct o <400> 4
| Ser | Gly | Gly | His | His | His | HÍS | His | His | ser | ser | Gly | Asp | Asp | ASp | Asp |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| Lys | Met | Ser | Tyr | Asn | Leu | Leu | Gly | Phe | Leu | Gin | Arg | ser | Ser | Asn | phe |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Gin | cys | Gin | Lys | Leu | Leu | Trp | Gin | Leu | Asn | Gly | Arg | Leu | Glu | Tyr | cys |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Leu | Lys 50 | ASp | Arg | Met | Asn | Phe 55 | ASp | lle | pro | Glu | GlU 60 | lle | Lys | Gin | Leu |
| Gin | Gin | Phe | Gin | Lys | Glu | Asp | Ala | Ala | Leu | Thr | lle | Tyr | Glu | Met | Leu |
| 65 | 70 | 75 | 80 |
-43Cl 300762 B6
| Gin | Asn | Ile | Phe | Ala | ile | Phe | Arg | Gin | Asp | ser | ser | Ser | Thr | Gly | Trp |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| Asn | Glu | Thr | Ile | Val | Glu | Asn | Leu | Leu | Ala | Asn | val | Tyr | His | Gin | ile |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| Asn | His | Leu 115 | Lys | Thr | val | Leu | Glu 120 | Glu | Lys | Leu | Glu | $ | Glu | ASp | phe |
| Thr | Arg | Gly | Lys | Leu | Met | Ser | ser | Leu | His | Leu | Lys | Arg | Tyr | Tyr | Gly |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| Arg | Ile | Leu | MÍ 5 | Tyr | Leu | Lys | Ala | Lys | Glu | Tyr | Ser | His | cys | Ala | Trp |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| Thr | ile | val | Arg | val 165 | Glu | ile | Leu | Arg | Asn 170 | Phe | Tyr | Phe | ile | Asn 175 | Arg |
| Leu | Thr | Gly | Leu | Arg | Asn |
180 <210>5 <211> 69
J <212>DNA <213> Artificial Sequence <220 <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <220>
<221>CDS <222> (1)..(69) <400> 5 ttc att aac aga ctt aca tgt tac ctc ega aac gtc gac aaa act cac 48
Pne ile Asn Arg Leu Tbr cys Tyr Leu Arg Asn Val Asp Lys Thr His
5 10 15 aca tgc cca ccg tgc cca gca 69
Thr Cys Pro Pro Cys pro Ala <210>6 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial sequence <220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 6
Phe ile Asn Arg Leu Thr Cys Tyr Leu Arg Asn val Asp Lys Thr His 15 10 15
Thr Cys Pro Pro Cys pro Ala 20 . ΔΑ .
<210> 7 <211>81 <212>DNA <213> Artifícial Sequence
V Z- rfVV f V* urv <220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <220>
io <221>COS <222> (1)..(81) <400> 7
| ttc | att | aac | aga | ctt | aca | tgt | tac | ctc | ega | aac | ggc | ggt | ggt | ggc age | 48 |
| Phe 1 | zle | Asn | Arg | Leu 5 | Thr | cys | Tyr | Leu | Aa | Asn | Giy | Gly | Gly | Gi^ Ser | |
| gtc | gac | aaa | act | cac | aca | tgc | cca | ccg | tgc | cca | 81 | ||||
| val | Asp | Lys | Thr | His | Thr | Cys | pro | pro | cys | Pro | |||||
| 20 | 25 |
<210> 8 <211> 27 <212>PRT <213> Artificial Sequence <220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400>8
Phe Ile Asn Arg Leu Thr Cys Tyr Leu Arg Asn Gly Gly Gly Gl£ Ser val Asp Lys Thr His Thr Cys Pro pro Cys Pro <210> 9 <211> 60 <212>DNA <213> Artific ial Sequence <220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 9 ttctccggag acgatgatga caagatgagc tacaacttgc ttggattcct acaaagaagc 60
-45CZ 300762 B6 <2Ι0> 10 <211> 39 <212>DNA <213> Artifícial Sequence <220>
<223> Description of Artifícial Sequence: Synthetic primer <400> 10 gccgctxgag ttatcagttt cggaggtaac ctgtaagtc 39 <21011 <211> 35 <212>DNA <213> Artifícial sequence <220>
<223> Description of Artifícial Sequence: Synthetic primer <400> 11 agcttccggg ggccatcatc atcatcatca tagct 35 <210> 12 <211> 35 <212>DNA <213> Artifícial sequence <220>
<223> Description of Artifícial Sequence: Synthetic primer <400> 12 ccggagctat gatgatgatg atgatggccc ccgga 35 <210> 13 35 <211>87 <212> DNA <213> Artifícial sequence <220>
<223> Description of Artifícial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 13 ccggagacga tgatgacaag atggcttacg ccgctcttgg agccctacaa gcttctagca 60 attttcagtg tcagaagctc ctgtggc 87
Λ £
CZ JUU/OZ BO <210> 14 <211> <50 <212>DNA <213> Artificial Sequence <220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetíc oligonucleotide <400> 14 gatctagcaa tgctgcctgt gctgccctcc tggctgcctt gaatgggagg cttgaatact 60 <210> 15 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 15 gcctcaagga caggatgaac tttgacatcc ctgaggagat taagcagctg ca 52 <210> 16 <211> 76 <212>DNA <213> Artificial sequence <220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide 30 <400 16 aattgaatgg gagggctgca gcttgcgctg cagacaggat gaactrtgac atccctgagg 60 agattaagca gctgca 76 <210> 17 35 <211>76 <212>DNA <213> Artificial Sequence <220>
<223> Description of Artificial sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 17 aattgaatgg gaggcttgaa tactgcctca aggacagggc tgcatttgct atccctgcag 60 agattaagca gctgca 76
-47CZ 300762 B6 <210> 18 <211> 51 <212>DNA <213> Artificial sequence <220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetíc oligonucleotide <400> 18 aattgaatgg gaggcttgaa tactgcctca aggacaggat gaactttgac a 51 <21O> 19 <211> 43 <212>DNA <213> Artificial Sequence <220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 19 tccctgagga gattgctgca gctgcagctt tcgctgcagc tga 43 <210> 20 <211> 78 <212>DNA <213> Artificial sequence <220>
<223> Description of Artificial sequence: Synthetic oligonucleotide 30 <400> 20 cgccgcgttg accatctatg agatgctcgc taacatcgct agcattttca gacaagattc 60 atctagcact ggctggaa 78 <210» 21 35 <211» 78 <2I2>DNA <213> Artificial sequence <220>
<223> Description of Artificial sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 21 cgccgcattg accatctatg agatgctcca gaacatcttt gctattttcg ctgcagcttc 60 atctagcact ggctggaa 78 . AU .
JUV/ΟΛ DO <210> 22 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence 5 <220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 22 ggaatgcttc aattgttgct gcactcctga gcaatgtcta tcatcagata aaccatctga 60 io agacagttct ag 72 <210> 23 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 23 ggaatgagac cattgttgag aacctcctgg ctaatgtcgc tcatcagata gcacatctgg 60 ctgcagttct ag 72 <210> 24 <211> 44 <212>DNA <213> Artificial Sequence <220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide 30 <400> 24 ctagctgcaa aactggctgc agctgatttc accaggggaa aact 44 <210> 25 35 <211>69 <212>DNA <213> Artificial sequence <220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 25 ctagaagaaa aactggagaa agaagcagct accgctggaa aagcaatgag cgcgctgcac 60 ctgaaaaga 69
-49vz. uvu/oí no <210> 26 <211> 51 <212> DNA <213> Artiflcial Sequence <220>
<223> Description of Artiflcial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 26 tattatggga ggattctgca ttacctgaag gccaaggagt actcacactg t 51 <210> 27 <211> 76 <212>DNA <213> Artiflcial Sequence <220>
<223> Description of Artiflcial sequence: Synthetic oligonucleotide <400 27 catgagcagt ctgcacctga aaagatatta tggggcaatt gctgcatacc tggcagccaa 60 ggagtactca cactgt 76 <210> 28 <211> 87 <212>DNA <213> Artiflcial Sequence <220>
<223> Description of Artiflcial sequence: Synthetic oligonucleotide 30 <400> 28 catgagcagt ctgcacctga aaagatatta tgggaggatt ctgcattacc tgaaggccgc 60 tgcatactca cactgtgcct ggacgat 87 <2I0> 29 35 <211>87 <212>DNA <213> Artiflcial sequence <220>
<223> Description of Artiflcial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 29 catgagcagt ctgcacctga aaagatatta tgggaggatt ctgcattacc tgaaggcaaa 60 ggagtacgct gcatgtgcct ggacgat 87
-50<210> 30 <211> 50 <212>DNA <213> Artificial sequence <220>
<223> Description of Artificial sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 30 cgtcagagct gaaatcctag caaactttgc attcattgca agacttacag 50 <210> 31 <211> 47 <212>DNA <213> Artificial sequence <220>
<223> Description of Artificial sequence: Synthetic primer <400> 31 ggtggtctca catgagctac aacttgcttg gattcctaca aagaagc 47 <210> 32 <211> 50 <212>DNA <213> Artificial Sequence <220>
<223> Description of Artificial sequence: Synthetic primer 30 <400> 32 gccctcgagt cgaccttgtc atcatcgtcg tttcggaggt aacctgtaag 50 <210> 33 35 <211>21 <212>DNA <213> Artificial Sequence <220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400>33 caagcttgct agcggccgcg g 21
-51 CZ 300762 B6 <210> 34 <211> 28 <212>DNA <213> Artificiaí sequence <220>
<223> Description of Artificiaí Sequence: Synthetic primer <400> 34 ggtggtctca catggcttga gaagctgc 28 <210> 35 <211> 20 <212>DNA <213> Artificiaí sequence <220>
<223> Description of Artificiaí sequence: Synthetic primer <400> 35 aggtsmarct gcagsagtcw 20 <210> 36 <211> 36 <212>DNA <213> Artificiaí sequence <220>
<223> Description of Artificiaí sequence: Synthetic primer 30 <400> 36 ctgagctcat ttacccggag tccgggagaa gctctt 36 <210> 37 35 <21l>33 <212>DNA <213> Artificiaí sequence <220>
<223> Description of Artificiaí Sequence: Synthetic primer <400>37 agcttgctag cggccgcggc ctcactggct tca 33
LZ 3UU/0A no <210> 38 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>
<223> Description of Artificial sequence: Synthetic primer <400> 38 atacgcgtcg acgtttcgga ggtaacatgt aagtctg 37 <2I0> 39 <211> 33 <212>DNA <213> Artificial Sequence <220>
<223> Description of Artificial sequence: Synthetic primer <400> 39 agcttgctag cggccgcggc ctcactggct tca 33 <210>40 <211> 51 <212>DNA <213> Artificial sequence <220>
<223> Description of Artificial sequence: Synthetic primer 30 <400> 40 tacacgtcga cgctgccacc accgccgttt cggaggtaac atgtaagtct g 51
-53CZ 300762 B6 <210 41 <211> 1257 <212>DNA <213> Artificial Sequence <220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <220>
io <221>CDS <222> (1)..(1254) <400 41
| atg cct | ggg aag atg | gtc val | 33 | atc Ile | ctt Leu | gga Gly 10 | gcc tca aat | ata ile | ctt Leu 15 | tgg Trp | 48 | |||||
| Met 1 | Pro | Gly | Lys | Met 5 | Ala | Ser | Asn | |||||||||
| ata | atg | ttt | gca | gct | tct | caa gcc | atg | agc | tac | aac | ttg | ctt | gga | ttc | 96 | |
| ile | Met | Phe Ala | Ala | ser | Gin Ala | Met | ser | Tyr | Asn | Leu | Leu | Gly | Phe | |||
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||||||
| cta | caa | aga | agc | agc | aat | ttt | cag tgt | cag | aag | ctc | ctg | tgg | caa | ttg | 144 | |
| Leu | Gin | Arg | Ser | Ser | Asn | phe | Gin | cys | Gin | Lys | Leu | Leu | Trp | Gin | Leu | |
| 35 | 40 | 45 | ||||||||||||||
| aat | 999 | agg | ctt | gaa | tac | tgc | ctc | aag | gac | agg | atg | aac | ttt | gac | atc | 192 |
| Asn | Gly | Arg | Leu | Glu | Tyr | cys | Leu | Lys Asp | Arg | Met | Asn | phe | Asp | Ile | ||
| 50 | 55 | 60 | ||||||||||||||
| cct | gag | gag | att | aag | cag | ctg | cag | cag | ttc | cag | aag | gag | gac | g« | gca | 240 |
| Pro | Glu | Glu | ile | tys | Gin | Leu | Gin | Gin | Phe | Gin | Lys | Glu | ASp | Ala | Ala | |
| 65 | 70 | 75 | 80 | |||||||||||||
| ttg | acc | atc | tat | gag | atg | ctc | cag | aac | atc | ttt | gct | att | ttc | aga | caa | 288 |
| Leu | Thr | Ile | Tyr | Glu | Met | Leu | Gin | Asn | ile | Phe | Ala | ile | phe | Arg | Gin | |
| 85 | 90 | 95 | ||||||||||||||
| gat | tca | tct | agc | act | ggc | tgg | aat | gag | act | att | gtt | gag | aac | ctc | ctg | 336 |
| Asp | Ser | Ser | Ser | Thr | Gly | Trp | Asn | Glu Thr | Ile | Val | Glu | Asn | Leu | Leu | ||
| 100 | 105 | 110 | ||||||||||||||
| gct | aat | gtc | tat | cat | cag | ata | aac | cat ctg | aag | aca | gtc | ctg | gaa | gaa | 384 | |
| Ala | Asn | Val | Tyr | HIS | Gin | ile | Asn | His | Leu | Lys | Thr | val | Leu | Glu | Glu |
C£ auu/oz bo
115
120
125
| aaa | ctg | gag | aaa | gaa | gat | ttc | acc | agg | gga | aaa | ctc | atg | age | agt | ctg |
| tys | Leu | Glu | Lys | Glu | Asp | Phe | Thr | Arg | Gly | Lys | Leu | Met | Ser | Ser | Leu |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| cac | ctg | aaa | aga | tat | tat | ggg | agg | att | ctg | cat | tac | ctg | aag | gcc | aag |
| His | Leu | uys | Arg | Tyr | Tyr | Gly | Arg | lle | Leu | HÍS | Tyr | Leu | Lys | Ala | Lys |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| gag | tac | agt | cac | tgt | gcc | tgg | acc | ata | gtc | aga | gtg | gaa | atc | cta | agg |
| Glu | Tyr | ser | His | cys | Ala | trp | Thr | lle | val | Arg | val | GlU | lle | Leu | Arg |
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| aac | ttt | tac | ttc | att | aac | aga | ctt | aca | tgt | tac | ctc | ega | aac | gtc | gac |
| Asn | Phe | Tyr | Phe | zle | Asn | Arg | Leu | Thr | cys | Tyr | Leu | Arg | Asn | val | Asp |
| 180 | 185 | 190 | |||||||||||||
| aaa | act | cac | aca | tgc | cca | ccg | tgc | cca | gca | cct | gaa | ctc | ctg | ggg | gga |
| Lys | Thr | His | Thr | Cys | pro | Pro | cys | Pro | Ala | pro | Glu | Leu | Leu | Gly | Gly |
| 195 | 200 | 205 | |||||||||||||
| ccg | tea | gtc | ttc | ctc | ttc | ccc | cca | aaa | ccc | aag | gac | acc | ctc | atg | atc |
| pro | Ser 210 | val | Phe | Leu | Phe | Pro 215 | Pro | Lys | pro | Lys | a | Thr | Leu | Met | Zle |
| tec ser | cgg Arg | acc Thr | cct Pro | gag Glu | gtc val | aca Thr | tgc Cys | gtg val | «3 | gtg val | gac Asp | gtg val | age ser | cac HÍ5 | gaa Glu |
| 225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
| gac Asp | cct pro | gag Glu | gtc val | aag Lys 245 | ttc Phe | aac Asn | tgg Trp | tac Tyr | 250 | gac ASp | ggc Gly | gtg val | gag Glu | gtg val 255 | cat HÍS |
| aat | gcc | aag | aca | aag | ccg | cgg | gag | g?g | cag | tac | aac | age | acg | tac | cgt |
| Asn | Ala | Lys | Thr | Lys | Pro | Arg | Glu | Glu | Gin | Tyr | Asn | Ser | Thr | Tyr | Arg |
| 260 | 265 | 270 | |||||||||||||
| gtg | gtc | age | gtc | ctc | acc | gtc | ctg | cac | cag | gac | tgg | ctg | aat | ggc | aag |
| val | val | ser | val | Leu | Thr | val | Leu | His | Gin | Asp | Trp | Leu | Asn | Gly | Lys |
| 275 | 280 | 285 | |||||||||||||
| gag | tac | aag | tgc | aag | gtc | tcc | aac | aaa | gcc | ctc | cca | gcc | ccc | atc | gag |
| Glu | Tyr | Lys | cys | Lys | val | Ser | Asn | Lys | Ala | Leu | pro | Ala | Pro | lle | Glu |
| 290 | 295 | 300 | |||||||||||||
| aaa | acc | atc | tcc | aaa | gcc | aaa | ggg | cag | ccc | ega | gaa | cca | cag | gtg | tac |
| Lys | Thr | lle | Ser | Lys | Ala | Lys | Gly | Gin | pro | Arg | Glu | Pro | Gin | Val | Tyr |
| 305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
| acc | ctg | ccc | cca | tcc | cgg | gat | gag | ctg | acc | aag | aac | cag | gtc | age | ctg |
| Thr | Leu | Pro | Pro | ser | Arg | Asp | Glu | Leu | Thr | Lys | Asn | Gin | val | Ser | Leu |
| 32S | 330 | 335 | |||||||||||||
| acc | tgc | ctg | gtc | aaa | ggc | ttc | tat | ccc | age | gac | atc | gcc | gt? | gag | tgg |
| Thr | cys | Leu | Val | Lys | Gly | Phe | Tyr | Pro | Ser | ASp | lle | Ala | val | Glu | Trp |
| 340 | 345 | 350 | |||||||||||||
| gag | age | aat | ggg | cag | ccg | gag | aac | aac | tac | aag | acc | acg | cct | ccc | gtg |
| Glu | ser | Asn | Gly | Gin | Pro | Glu | Asn | Asn | Tyr | Lys | Thr | Thr | Pro | pro | val |
| 355 | 360 | 365 | |||||||||||||
| ttg | gac | tcc | gac | ggc | tcc | ttc | ttc | ctc | tac | age | aag | ctc | acc | gtg | gac |
| Leu | Asp | ser | Asp | Gly | Ser | Phe | Phe | Leu | Tyr | ser | Lys | Leu | Thr | val | Asp |
432
480
528
576
672
720
768
864
912
960
1008
1056
1104
1152
624
816
370 375 380
| aag Lys 385 | agc ser | agg tgg cag | cag Gin 390 | ggg Gly | aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atq car | 1200 | ||||||||||
| Arg Trp | Gin | Asn | Val | Phe | ser cys 395 | Ser Val | Met | His 400 | ||||||||
| gag | ?ct | ctg | cac | aac | cac | tac | acg | cag | aag | agc | ctc | tcc | ctg | tet | CCC | 1248 |
| Glu | Ala | Leu | His | Asn | His | Tyr | Thr | Gin | Lys | ser | Leu | Ser | Leu | ser | Pro | |
| 405 | 410 | 415 |
ggg aaa tga 1257
Gly Lys <210> 42 <211> 418 <212>PRT <213> Artificial Sequence <220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct o <400> 42
| Met 1 | Pro | Gly | Lys | Met val val Ile Leu Gly | Ala | ser Asn | Ile | Leu 15 | Trp | ||||||
| 5 | 10 | ||||||||||||||
| ile | Met | Phe Ala Ala | Ser | Gin | Ala | Met | Ser | Tyr | Asn | Leu | Leu | Gly | Phe | ||
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Leu | Gin | Arg | Ser | ser | Asn | Phe | Gin | cys | Gin | Lys | Leu | Leu | Trp | Gin | Leu |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Asn | Gly 50 | Arg | Leu | Glu | Tyr | cg | Leu | Lys Asp Arg | Met 60 | Asn | Phe | ASP | ile | ||
| Pro | Glu | Glu | ile | Lys | Gin | Leu | Gin | Gin | Phe | Gin | Lys | Glu | Asp | Ala Ala | |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Leu | Thr | Ile | Tyr | Glu | Met | Leu | Gin | Asn | ile | Phe | Ala | Ile | Phe | Arg | Gin |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| Asp | Ser | Ser | Ser | Thr | Gly | Trp | Asn | Glu | Thr | ile | val | Glu | Asn | Leu | Leu |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| Ala | Asn | Val | Tyr | His | Gin | ile | Asn | His | Leu | Lys | Thr | val | Leu | Glu | Glu |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| Lys | Leu | Glu | Lys | Glu | Asp | Phe Thr | Arg | Gly | Lys | Leu | Met | Ser | Ser | Leu | |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| His | Leu | Lys | Arg | Tyr | Tyr | Gly Arg | Ile | Leu | His | Tyr | Leu | Lys | Ala | Lys | |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| Glu | Tyr | ser | His | Cys | Ala | Trp | Thr | Ile | Val | Arg | val | Glu | ile | Leu | Arg |
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| Asn | Phe | Tyr | phe 180 | Ile | ASn | Arg | Leu | Thr 185 | cys | Tyr | Leu | Arg | Asn 190 | val | Asp |
| Lys | Thr | HIS | Thr | Cys | pro | Pro | Cys | Pro | Ala | Pro | Glu | Leu | Leu | Gly Gly | |
| 195 | 200 | 205 | |||||||||||||
| Pro | Ser | Val | phe | Leu | Phe | Pro | Pro | Lys | Pro | Lys | Asp | Thr | Leu | Met | ile |
C£ tc JUU/OA DO
| 210 | 215 | 220 | |||||||||||||
| Ser | Arg | Thr | Pro | Glu | val | Thr | cys | Val | Val | val | Asp val | ser | His Glu | ||
| 225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
| Asp | Pro | Glu | val | Lys | Phe | Asn | Trp | Tyr | val | ASp | Gly | Val | GlU | val | His |
| 245 | 250 | 255 | |||||||||||||
| Asn | Ala | Lys | Thr | Lys | Pro | Arg | Glu | Glu Gin | Tyr | Asn | Ser | Thr | iyr Arg | ||
| 260 | 265 | 270 | |||||||||||||
| val | Val | Ser | val | Leu | Thr | Val | Leu | His | Gin | Asp | Trp | Leu | Asn | Gly Lys | |
| 275 | 280 | 285 | |||||||||||||
| Glu | Tyr | tys | cys | Lys | val | ser | Asn | Lys | Ala | Leu | pro | Ala | Pro | Ile Glu | |
| 290 | 295 | 300 | |||||||||||||
| Lys 305 | Thr | Ile | Ser | Lys | Ala 310 | Lys | Gly | Gin | pro | Arg 315 | Glu | Pro | Gin Val | Tyr 320 | |
| Thr | Leu | Pro | Pro | Ser | Arg | ASP | Glu | Leu | Thr | Lys | Asn | Gin Val | Ser | Leu | |
| 325 | 330 | 335 | |||||||||||||
| Thr | cys | Leu | val | Lys Gly phe Tyr | pro | Ser | Asp | Ile Ala | val | Glu | Trp | ||||
| 340 | 345 | 350 | |||||||||||||
| Glu | ser | Asn 355 | Gly Gin | Pro | Glu Asn 360 | Asn | Tyr Lys | Thr Thr 365 | pro | pro | val | ||||
| Leu | Asp 370 | Ser | Asp Gly | ser | Phe Phe 375 | Leu | Tyr | Ser | Lys 380 | Leu | Thr val | ASP | |||
| & | ser | Arg | Trp | Gin | Gin 390 | Gly Asn Val | Phe | ser 395 | Cys | Ser | val | Met | HÍS 400 | ||
| Glu Ala | Leu | His | Asn | His | Tyr Thr Gin | Lys | ser | Leu | ser | Leu | Ser | pro | |||
| 405 | 410 | 415 |
Gly Lys <210> 43 <21 í> 1272 <212>DNA <213> Artifícial sequence <220>
<223> Description of Artifícial sequence: Synthetic construct io <220>
<221>COS <222> (1)..(1269) <400> 43
| atg | cct | ggg aag | atg | gtc | gtg | atc | ctt | gga | gcc | tea | aat | ata | ctt | tgg | 48 |
| Met | Pro | Gly Lys | Met | Val | Val | ile | Leu | Gly | Ala | Ser | Asn | ile | Leu | Trp | |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| ata | atg | ttt gca | gct | tet | caa | gcc | atg | age | tac | aac | ttg | ctt | gga | ttc | 96 |
| ile | Met | Phe Ala | Ala | Ser | Gin | Ala | Met | Ser | Tyr | Asn | Leu | Leu | Gly | Phe | |
| 20 | 25 | 30 |
-57CZ 300762 B6
| cta caa aga | age Ser | age ser | aat ttt cag tgt cag aag ctc ctg tgg | caa Gin | ttg Leu | 144 | ||||||||||
| Leu Gin | Arg 35 | Asn | Phe | Gin cys Gin 40 | Lys Leu | Leu 45 | Trp | |||||||||
| aat | ggg | agg | ctt | gaa | tac | tgc | ctc | aag | gac | agg | atg | aac | ttt | gac | atc | 192 |
| Asn | Arg | Leu | Glu | Tyr | Cys 55 | Leu | Lys Asp Arg | Met 60 | Asn | Phe | Asp | ile | ||||
| cct | gag | gag | att | aag | cag | ctg | cag | cag | ttc | cag | aag | gag | gac | 9« | gca | 240 |
| Pro | Glu | Glu | Ile | Lys | Gin | Leu | Gin | Gin | Phe | Gin | Lys | Glu | ASp | Ala | Ala | |
| 65 | 70 | 75 | 80 | |||||||||||||
| ttg | acc | atc | tat | gag | atg | ctc | cag | aac | atc | ttt | gct | att | ttc | aga | caa | 288 |
| Leu | Thr xl e | Tyr | Glu | Met | Leu | Gin | Asn | Ile | Phe Ala | Ile | Phe | Arg | Gin | |||
| 85 | 90 | 95 | ||||||||||||||
| gat | tca | tet | age | act | ggc | tgg | aat | gag | act | att | gtt | gag | aac | ctc | ctg | 336 |
| Asp | Ser | Ser | ser | Thr | Gly | Trp | Asn | Glu | Thr | Ile | Val | Glu | Asn | Leu | Leu | |
| 100 | 105 | 110 | ||||||||||||||
| gct | aat | gtc | tat | cat | cag | ata | aac | cat | ctg | aag | aca | gtc | ctg | gaa | gaa | 384 |
| Ala | Asn | Val | Tyr | HÍS | Gin | ile | Asn | His | Leu | Lys | Thr val | Leu | Glu | Glu | ||
| 115 | 120 | 125 | ||||||||||||||
| aaa | ctg | gag | aaa | gaa | gat | ttc | acc | agg | gga | aaa | ctc | atg | age | agt | ctg | 432 |
| Lys | Leu | Glu | Lys | Glu | Asp | Phe Thr | Arg Gly | Lys | Leu | Met | ser | Ser | Leu | |||
| 130 | 135 | 140 | ||||||||||||||
| cac | ctg | aaa | aga | tat | tat | ggg agg | att | ctg | cat | tac | ctg | aag | gcc | aag | 480 | |
| His 145 | Leu | tys Arg Tyr | KS | Gly Arg | Ile | Leu | His 155 | Tyr | Leu | Lys | Ala | Lys 160 | ||||
| gag | tac | agt | cac | tgt | gcc | tgg | acc | ata | gtc | aga | gtg val | gaa | atc | cta | agg | 528 |
| Glu | Tyr | Ser | His | Cys | Ala | Trp | Thr | Ile val | Arg | Glu | ile | Leu | Arg | |||
| 165 | 170 | 175 | ||||||||||||||
| aac | ttt | tac | ttc | att | aac | aga | ctt | aca | tgt | tac | ctc | ega | aac | ggc | ggt | 576 |
| Asn | phe | Tyr | Phe 180 | Ile | Asn | Arg | Leu | Thr 185 | cys | Tyr | Leu | Arg | Asn 190 | Gly Gly | ||
| ggt | ggc | age | gtc | gac | aaa | act | cac | aca | tgc | cca | ccg | tgc | cca | gca | cct | 624 |
| Gly | Gly | Ser | Val | Asp | Lys | Thr | HiS | Thr | cys | pro | pro | Cys | Pro | Ala | Pro | |
| 195 | 200 | 205 | ||||||||||||||
| gaa Glu | ctc Leu | ctg Leu | ggg gga Gly Gly | ccg pro | tca Ser | gtc val | ttc Phe | ctc Leu | ttc Phe | ccc Pro | cca Pro | aaa Lys | ccc Pro | aag Lys | 672 | |
| 210 | 215 | 220 | ||||||||||||||
| gac | acc | ctc | atg | atc | tcc | cgg | acc | cct | gag gtc | aca | tgc | gtg gtg val val | 33 | 720 | ||
| Asp | Thr | Leu | Met | Ile | Ser | Arg | Thr | Pro | Glu val | Thr | Cys | |||||
| 225 | 230 | 235 | 240 | |||||||||||||
| gac | gtg vaT | age | cac | gaa | gac | cct | gag | gtc | aag | ttc | aac | tgg | tac | gtg val | gac | 768 |
| ASP | ser | His | Glu | Asp | Pro | Glu | val | Lys | Phe | Asn | Trp Tyr | Asp | ||||
| 245 | 250 | 255 | ||||||||||||||
| ggc | «3 | gag | gtg val | cat | aat | gcc | aag | aca | aag | ccg | cgg | gag | gag | cag | tac | 816 |
| Gly | Glu | His | Asn | Ala | Lys | Thr | Lys | Pro | Arg | Glu | Glu | Gin | Tyr | |||
| 260 | 265 | 270 | ||||||||||||||
| aac | age | acg | tac | cgt | gtg val | gtc | age | gtc | ctc | acc | gtc | ctg | cac | cag | gac | 864 |
| Asn | ser | Thr | Tyr Arg | val | Ser | Val | Leu | Thr | Val | Leu | His | Gin | ASp | |||
| 275 | 280 | 285 |
- SR-
| tgg ctg | aat Asn | ggc aag | gag tac aag tgc aag gtc tcc | aac aaa gcc ctc | 912 | |||||||||||
| Trp | Leu 290 | Gly | Lys | GlU | iyr Lys 295 | cys | Lys | val | ser 300 | Asn | Lys | Ala | Leu | |||
| cca | gcc | ccc | atc | gag | aaa | acc | atc | tcc | aaa | gcc | aaa | ggg | cag | ccc | ega | 960 |
| pro 305 | Ala | pro | Ile | Glu | Lys 310 | Thr | ile | ser | Lys | Ala 315 | Lys | eiy | Gin | Pro | Arg 320 | |
| gaa | cca | cag | gtg val | tac | acc | ctg | ccc | cca | tcc | cgg | gat | gag | ctg | acc | aag | 1008 |
| Glu | Pro | Gin | Tyr 325 | Thr | Leu | pro | Pro | Ser 330 | Arg | Asp | Glu | Leu | Thr 335 | Lys | ||
| aac | cag | gtc | age | ctg | acc | tgc ctg | gtc | aaa | ggc | ttc | tat | ccc | age | gac | 1056 | |
| Asn | Gin | val | ser | Leu | Thr | cys | Leu | val | Lys | Gly | Phe | Tyr | ΡΓΟ | ser | Asp | |
| 340 | 345 | 350 | ||||||||||||||
| atc | gcc | sa 355 | gag | tgg | gag | age | aat | a? | cag | ccg | gag | aac | aac | tac | aag | 1104 |
| Ile | Ala | Glu | Trp | Glu | ser | Asn 360 | Gin | Pro | Glu | Asn 365 | Asn | Tyr | Lys | |||
| acc | acg | cct | ccc | gtg val | ttg | gac | tcc | gac ggc | tcc | ttc | ttc | ctc | tac | age | 1152 | |
| Thr Thr | Pro | Pro | Leu | Asp | ser | Asp Gly | ser | Phe | Phe | Leu | Tyr | Ser | ||||
| 370 | 375 | 380 | ||||||||||||||
| aag | ctc | acc | S3 | gac | aag | age | agg | tgg cag cag | ggg Gly | aac | gtc | ttc | tea | 1200 | ||
| Lys 385 | Leu | Thr | Asp | ser | Arg | Trp Gin Gin 395 | Asn | val | Phe | ser 400 | ||||||
| tgc | tcc | gtg val | atg | cat | gag | get | ctg | cac | aac | cac | tac | acg | cag | aag | age | 1248 |
| cys | ser | Met | His | Glu | Ala | Leu | His | Asn His Tyr | Thr | Gin | Lys | Ser | ||||
| 405 | 410 | 415 |
ctc tcc ctg tet ccc ggg aaa tga 1272
Leu ser Leu Ser pro Gly Lys
420 <210> 44 <211> 423 <212>PRT <213> Artificial Sequence <220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct o
<400> 44
| Met | Pro | Gly | Lys | Met | Val | Val | ile | Leu | Gly | Ala | ser | Asn | ile | Leu | Trp |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| ile | Met | phe | Ala | Ala | ser | Gin | Ala | Met | Ser | tyr | Asn | Leu | Leu | Gly | phe |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Leu | Gin | Arg 35 | Ser | Ser | Asn | Phe | Gin 40 | Cys | Gin | Lys | Leu | Leu 45 | Trp | Gin | Leu |
| Asn | Gly 50 | Arg | Leu | Glu | Tyr | cys 55 | Leu | Lys | Asp | Arg | Met 60 | Asn | Phe | Asp | ile |
| pro | Glu | Glu | Ile | Lys | Gin | Leu | Gin | Gin | phe | Gin | Lys | Glu | ASp | Ala | Ala |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Leu | Thr | ile | Tyr | Glu | Met | Leu | Gin | Asn | Ile | Phe | Ala | Ile | Phe | Arg | Gin |
-59Cl 300762 B6
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| Asp | Ser | Ser | Ser | Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile val Glu | Asn | Leu | Leu | ||||||||
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| Ala | Asn | val | iyr | His Gin | ile | Asn | His | Leu Lys | Thr val | Leu | Glu | Glu | |||
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| Lys | Leu | Glu | Lys Glu Asp | Phe Thr | Arg Gly Lys | Leu | Met | Ser | ser | Leu | |||||
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| His 145 | Leu | Lys Arg Tyr | Tyr 150 | Gly Arg | ile Leu | His 155 | Tyr | Leu | Lys | Ala | Lys 160 | ||||
| Glu | Tyr | ser | His cys Ala | Trp | Thr | Ile val | Arg | Val | Glu | Ile | Leu | Arg | |||
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| Asn | Phe | Tyr | Phe Ile 180 | Asn | Arg | Leu | Thr 185 | cys | Tyr | Leu | Arg | Asn 190 | Gly | Gly | |
| Gly Gly | ser | Val Asp | Lys | Thr | His Thr | cys | Pro | Pro | Cys | pro | Ala | Pro | |||
| 195 | 200 | 205 | |||||||||||||
| Glu | Leu | Leu | Gly Gly | Pro | Ser | val | Phe | Leu | Phe | Pro | Pro | Lys | Pro | Lys | |
| 210 | 215 | 220 | |||||||||||||
| ASp 225 | Thr | Leu | Met | Ile | ser 230 | Arg Thr | Pro | Glu | Val 235 | Thr | cys | val | val | Val 240 | |
| ASp | val | ser | HiS | Glu | Asp | Pro | Glu | val | Lys | Phe | Asn | Trp Tyr | Val | Asp | |
| 245 | 250 | 255 | |||||||||||||
| Gly | val | Glu | Val | HIS | Asn | Ala | Lys | Thr | tys | pro | Arg | Glu Glu | Gin | Tyr | |
| 260 | 265 | 270 | |||||||||||||
| Asn | ser | Thr | Tyr Arg | Val | val | Ser | Val | Leu | Thr | val | Leu | His | Gin | Asp | |
| 275 | 280 | 285 | |||||||||||||
| Trp | Leu | Asn | Gly | Lys | Glu | Tyr | Lys | cys | Lys | val | Ser | Asn | Lys | Ala | Leu |
| 290 | 295 | 300 | |||||||||||||
| pro 305 | Ala | pro | ile | Glu | Lys 310 | Thr | Ile | Ser | Lys | Ala 315 | Lys | Gly | Gin | pro | Arg 320 |
| GlU | Pro | Gin | val | & | Thr | Leu | Pro | Pro | ser 330 | Arg | Asp | Glu | Leu | Thr 335 | Lys |
| Asn | Gin | val | Ser | Leu | Thr | cys | teu | Val | Lys | Gly | Phe | Tyr | pro | Ser | Asp |
| 340 | 345 | 350 | |||||||||||||
| Ile | Ala val | Glu | Trp | Glu | Ser | Asn | Gly | Gin | Pro | Glu | Asn | Asn | Tyr | Lys | |
| 355 | 360 | 365 | |||||||||||||
| Thr | Thr | pro | Pro | val | Leu | Asp | Ser | Asp | Gly | ser | Phe | Phe | Leu | Tyr | Ser |
| 370 | 375 | 380 | |||||||||||||
| Lys | Leu | Thr | val | Asp | Lys | ser | Arg Trp | Gin | Gin | Gly | Asn | val | Phe | Ser | |
| 385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
| Cys | Ser | Val | Met | His | Glu | Ala | Leu | His | Asn | His | Tyr | Thr | Gin | Lys | Ser |
| 405 | 410 | 415 |
Leu Ser Leu ser Pro Gly Lys 420
JUUSCM DO <210> 45 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>45
| Met | Ala | Tyr | Ala | Ala | Leu | Gly | Ala | Leu | Gin | Ala | ser | ser | Asn | Phe | Gin |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| cys | Gin | Lys | Leu | Leu | Trp | Gin | Leu | Asn | Gly | Arg | Leu | Glu | Tyr | cys | Leu |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Lys | Asp | ΑΓ? | Met | Asn | Phe | Asp | Ile 40 | Pro | Glu | Glu | ile | Lys 45 | Gin | Leu | Gin |
| Gin | Phe 50 | Gin | Lys | Glu | Asp | Ala 55 | Ala | Leu | Thr | ile | Tyr 60 | Glu | Met | Leu | Gin |
| Asn | Ile | phe | Ala | ile | Phe | Arg | Gin | Asp | ser | Ser | Ser | Thr | Gly | Trp | Asn |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Glu | Thr | ile | val | Glu | Α5Π | Leu | Leu | Ala | Asn | val | Tyr | His | Gin | Ile | Asn |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| HÍS | Leu | Lys | Thr | val | Leu | Glu | Glu | Lys | Leu | Glu | Lys | Glu | Asp | Phe | Thr |
| 100 | 105 | no | |||||||||||||
| Arg | Gly | Lys 115 | Leu | Met | Ser | Ser | Leu 120 | His | Leu | Lys | Arg | Tyr 125 | Tyr | Gly | Arg |
| ile | Leu 130 | His | Tyr | Leu | Lys | Ala 135 | Lys | Glu | Tyr | Ser | His 140 | cys | Ala | Trp | Thr |
| ile | val | Arg | val | Glu | Ile | Leu | Arg | Asn | Phe | Tyr | Phe | ile | Asn | Arg | Leu |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| Thr | Gly | Tyr | Leu | Arg 165 | ASíl |
| <210> | 46 | |||||||||||||||
| <211> | 166 | |||||||||||||||
| <212> | PRT | |||||||||||||||
| <213> | Homo | sapie | ns | |||||||||||||
| <400> | 46 | |||||||||||||||
| Met | ser | Tyr | Asn | Leu | Leu | Gly | Phe | Leu | Gin | Arg | Ser | ser | Asn | Ala | Ala | |
| 1 | 5 | 10 | 15 | |||||||||||||
| cys | Ala | Ala | Leu | Leu | Ala | Ala | Leu | Asn | Gly | Arg | Leu | Glu | Tyr | cys | Leu | |
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||||||
| Lys | Asp | Arg | Met | Asn | Phe | Asp | ile | pro | Glu | Glu | Ile | Lys | Gin | Leu | Gin | |
| 35 | 40 | 45 | ||||||||||||||
| Gin | Phe | Gin | Lys | Glu | Asp | Ala | Ala | Leu | Thr | Ile | Tyr | Glu | Met | Leu | Gin | |
| 50 | 55 | 60 | ||||||||||||||
| Asn | ile | Phe | Ala | ile | Phe | Arg | Gin | Asp | Ser | ser | ser | Thr | Gly | Trp | Asn | |
| 65 | 70 | 75 | 80 |
-61 CZ 300762 B6
| Glu | Thr | ile | val | Glu | Asn | Leu | Leu | Ala | Asn | val | Tyr | His | Gin | Ile | Asn |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| HÍS | Leu | Lys | Thr | val | Leu | Glu | Glu | Lys | Leu | Glu | Lys | Glu | Asp | Phe | Thr |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| Arg | Gly | Lys | Leu | Met | Ser | Ser | Leu | His | Leu | Lys | Arg | Tyr | Tyr | Gly | Arg |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| Ile | Leu | His | Tyr | Leu | Lys | Ala | Lys | Glu | Tyr | ser | His | Cys | Ala | Trp | Thr |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| ile | val | Arg | Val | Glu | Ile | Leu | Arg | Asn | Phe | Tyr | phe | ile | Asn | Arg | Leu |
| 145 | 150 | 155 | 160 |
Leu ΑΓ| Asn
Thr Gly Tyr <210> 47 <211> 166 <212>PRT <213> Homo sapiens <400> 47
| Met 1 | Ser | Tyr | Asn Leu 5 | Leu Gly Phe | Leu Gin Arg Ser ser Asn Phe Gin | ||||||||||
| 10 | 15 | ||||||||||||||
| cys | Gin | Lys | Leu | Leu | Trp | Gin | Leu | Asn | Gly Arg | Ala | Ala | Ala | cys | Ala | |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Ala | Asp | Arg | Met | Asn | Phe | Asp | Ile | Pro | Glu | Glu | Ile | Lys | Gin | Leu | Gin |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Gin | phe | Gin | Lys | Glu | ASp | Ala Ala | Leu | Thr | ile | Tyr | Glu | Met | Leu | Gin | |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Asn | Ile | Phe | Ala | Ile | Phe | Arg | Gin | Asp | Ser | ser | ser | Thr | Gly Trn | Asn | |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Glu | Thr | Ile | val | Glu | Asn | Leu | Leu | Ala | Asn | Val | Tyr | His | Gin | Ile | Asn |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| His | Leu | Lys | Thr Val | Leu | Glu | Glu | Lys | Leu | Glu | Lys | Glu | Asp | Phe | Thr | |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| Arg Gly | Lys 115 | Leu | Met | Ser | ser | Leu 120 | HlS | Leu | Lys | Arg | Tyr 125 | Tyr | Gly | Arg | |
| ile | Leu 130 | His | Tyr | Leu | Lys | Ala 135 | Lys | Glu | Tyr | ser | His 140 | cys | Ala | Trp | Thr |
| ile | val | Arg | val | Glu | ile | Leu | Arg | Asn | Phe | Tyr | Phe | ile | Asn | Arg | Leu |
| 145 | 150 | 155 | 160 |
Thr Gly Tyr Leu Arg Asn
JUU/UA OU <210 48 <211> 166 <212>PRT <213> Homo sapiens <400 48
| Met | Ser | Tyr | Α5Π | Leu | Leu | Gly | Phe | Leu | Gin | Arg | Ser | Ser | Asn | Phe | Gin |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| cys | Gin | Lys | Leu 20 | Leu | Trp | Gin | Leu | Asn 25 | Gly | Arg | Leu | Glu | Tyr 30 | Cys | Leu |
| Lys | Asp | Arg | Ala | Ala | phe | Ala | ile | pro | Ala | Glu | ile | Lys | Gin | Leu | Gin |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Gin | Phe | Gin | Lys | Glu | Asp | Ala | Ala | Leu | Thr | Ile | Tyr | Glu | Met | Leu | Gin |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Asn | Ile | Phe | Ala | Ile | phe | Arg | Gin | Asp | Ser | Ser | Ser | Thr | Gly | Trp | Asn |
| 65 | 70 | 75 | SO | ||||||||||||
| Glu | Thr | Ile | Val | Glu | Asn | Leu | Leu | Ala | Asn | val | Tyr | His | Gin | ile | Asn |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| His | Leu | Lys | Thr | val | Leu | Glu | Glu | Lys | Leu | Glu | Lys | Glu | Asp | phe | Thr |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| Arg | Gly | Lys 115 | Leu | Met | Ser | Ser | Leu 120 | HiS | Leu | Lys | Arg | Tyr 125 | Tyr | Gly | Arg |
| ile | Leu | His | Tyr | Leu | Lys | Ala | Lys | Glu | Tyr | Ser | His | cys | Ala | Trp | Thr |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| ile | val | Arg | val | Glu | ile | Leu | Arg | Asn | phe | Tyr | Phe | ile | Asn | Arg | Leu |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| Tbr | Gly | Tyr | Leu | Arg | Asn | ||||||||||
| 165 |
<210>49
| <211> | 166 | |||||||||||||||
| <212> | PRT | |||||||||||||||
| <213> | Homo! | sapíe | ns | |||||||||||||
| <400> | 49 | |||||||||||||||
| Met | Ser | Tyr | Asn | Leu | Leu | Gly | Phe | Leu | Gin | Arg | ser | ser | Asn | Phe | Gin | |
| 1 | 5 | 10 | 15 | |||||||||||||
| cys | Gin | Lys | Leu | Leu | Trp | Gin | Leu | Α5Π | Gly | Arg | Leu | Glu | Tyr | cys | Leu | |
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||||||
| Lys | ASp | Arg | Met | Asn | phe | Asp | Ile | Pro | GlU | Glu | Ile | Ala | Ala | Ala | Ala | |
| 35 | 40 | 45 | ||||||||||||||
| Ala | phe | Ala | Ala | Ala | Asp | Ala | Ala | Leu | Thr | Ile | Tyr | Glu | Met | Leu | Gin | |
| 50 | 55 | 60 | ||||||||||||||
| Asn | Ile | Phe | Ala | ile | Phe | Arg | Gin | Asp | Ser | Ser | Ser | Thr | Gly | Trp | Asn | |
| 65 | 70 | 75 | 80 | |||||||||||||
| Glu | Thr | ile | Val | Glu | Asn | Leu | Leu | Ala | Asn | Val | Tyr | His | Gin | ile | Asn | |
| 85 | 90 | 95 | ||||||||||||||
| HÍS | Leu | Lys | Thr | val | Leu | Glu | Glu | Lys | Leu | GlU | Lys | Glu | Asp | Phe | Thr | |
| 100 | 105 | 110 | ||||||||||||||
| Arg | Gly | Lys | Leu | Met | Ser | ser | Leu | HiS | Leu | Lys | Arg | Tyr | Tyr | Gly | Arg | |
| 115 | 120 | 125 |
-63 CZ 300762 B6
| Ile | Leu | His | Tyr | Leu | Lys | Ala Lys | Glu | Tyr | Ser | His | cys | Ala Trp Thr |
| 130 | 135 | 140 | ||||||||||
| Ile | Val | Arg | Val | Glu | Ile | Leu Arg | Asn | Phe | Tyr | phe | ile | Asn Arg Leu |
| 145 | 150 | 155 | 160 | |||||||||
| Thr | Gly | Tyr | Leu | Arg | Asn |
165 <210 50 <211> 166 <212>PRT <213> Homo sapiens <400> 50
| Met Ser 1 Cys Gin | Tyr Asn Leu Leu | Gly Gin | Phe Leu Gin Arg Ser ser 10 | Asn Phe Gin 15 | |||||||||||
| Lys Leu 20 | Leu Trp | Leu Asn 25 | Gly | Arg Leu | Glu | Tyr 30 | Cys | Leu | |||||||
| Lys | Asp | Arg | Met | Asn | Phe | Asp | ile | Pro | Glu | Glu | Ile | Lys | Gin | Leu | Gin |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Gin | Phe | Gin | tys | Glu | Asp | Ala Ala | Leu | Thr | ile | Tyr | Glu | Met | Leu | Ala | |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Asn | Ile | Ala | Ser | Ile | Phe | Arg | Gin | Asp | Ser | ser | Ser | Thr | Gly | Trp | Asn |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Glu | Thr | ile | val | Glu | Asn | Leu | Leu | Ala | Asn | val | Tyr | His | Gin | ile | Asn |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| His | Leu | Lys | Thr | val | Leu | Glu | Glu | Lys | Leu | Glu | Lys | Glu | Asp | Phe | Thr |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| Arg | Gly | Lys 115 | Leu | Met | Ser | Ser | Leu 120 | His | Leu | Lys | Arg | Tyr 125 | Tyr | Gly | Arg |
| ile | Leu | His | Tyr | Leu | Lys | Ala | Lys | Glu | Tyr | Ser | His | cys | Ala | Trp | Thr |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| Ile | Val | Arg | Val | Glu | Ile | Leu | Arg | Asn | Phe | ίϊξ | phe | Ile | Asn | Arg | Leu |
| 145 | 150 | 160 |
Thr Gly Tyr Leu Arg Asn 165 <210 51 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <400 51
| Met | ser | Tyr | Asn | Leu | Leu | Gly | Phe | Leu | Gin | Arg | ser | ser | Asn | Phe | Gin |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| cys | Gin | Lys | Leu | Leu | Trp | Gin | Leu | Asn | Gly | Arg | Leu | Glu | Tyr | cys | Leu |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Lys | Asp | Arg | Met | Asn | Phe | Asp | Ile | Pro | Glu | Glu | ile | Lys | Gin | Leu | Gin |
CZ JUU76Z BĎ
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Gin | Phe | Gin | Lys Glu | ASD Ala | Ala | Leu | Thr | Ile | Tyr | Glu | Met | Leu | Gin | ||
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Asn | Ile | Phe Ala Ile | phe Ala Ala Ala | ser | ser | ser | Thr | Gly Trp | Asn | ||||||
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Glu | Thr | Ile | val | Glu | Asn | Leu | Leu | Ala | Asn | val | Tyr | HÍS | Gin | Ile | Asn |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| HÍS | Leu | Lys | Thr val | Leu | Glu | Glu | Lys | Leu | Glu | Lys | Glu | ASp | Phe Thr | ||
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| Arg Gly | Lys | Leu | Met | ser | Ser | Leu | His | Leu | Lys Arg | Tr | Tyr | Gly Arg | |||
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| xl e | ueu 130 | His | Tyr | Leu | Lys | Ala 135 | Lys | Glu | Tyr | ser | His cys Ala Trp Thr 140 | ||||
| il e | val | Arg | val | Glu | Ile | Leu | Arg | Asn | Phe | Tyr | phe ile Asn Arg | Leu | |||
| 145 | ISO | 155 | 160 | ||||||||||||
| Thr | Gly Tyr | Leu | Arg 165 | Asn |
<210> 52 <211>166 <212>PRT <213> Homo sapiens <400> 52
| Met | Ser | Tyr | Asn | Leu | Leu | cly | Phe | Leu | Gin | Arg | ser | ser | Asn | Phe | Gin |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| Cys | Gin | Lys | Leu | Leu | Trp | Gin | Leu | Asn | Gly | Arg | Leu | GlU | Tyr | cys | Leu |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Lys | ASp | Arg 35 | Met | Asn | Phe | Asp | ile 40 | Pro | Glu | Glu | Ile | Lys 45 | Gin | Leu | Glri |
| Gin | Phe | Gin | Lys | Glu | Asp | Ala | Ala | Leu | Thr | Ile | Tyr | Glu | Met | Leu | Gin |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Asn | Ile | Phe | Ala | Ile | Phe | Arg | Gin | Asp | Ser | Ser | Ser | Thr | Gly | Trp | Asn |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Ala | ser | Ile | val | Ala | Ala | Leu | Leu | Ser | Asn | Val | Tyr | His | Gin | ile | Asn |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| His | Leu | Lys | Thr | val | Leu | GlU | Glu | Lys | Leu | Glu | Lys | Glu | Asp | Phe | Thr |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| Arg | Gly | Lys | Leu | Met | Ser | ser | Leu | HIS | Leu | Lys | Arg | Tyr | Tyr | Gly | Arg |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| ile | Leu 130 | HÍS | Tyr | Leu | Lys | Ala 135 | Lys | Glu | Tyr | ser | His 140 | Cys | Ala | Trp | Thr |
| ile | val | Arg | val | Glu | ile | Leu | Arg | Asn | Phe | Tyr | Phe | ile | Asn | Arg | Leu |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| Thr | Gly | Tyr | Leu | Arg | Asn | ||||||||||
| 165 |
-65CZ 300762 B6 <210 53 <211> 166 <212>PRT <213> Homo sapiens <400 53
| Met | Ser | Tyr | Asn | Leu | Leu | Gly | Phe | Leu | Gin | Arg | Ser | Ser | Asn | Phe | Gin |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| cys | Gin | Lys | Leu 20 | Leu | Trp | Gin | Leu | Asn 25 | Gly | Arg | Leu | Glu | Tyr 30 | cys | Leu |
| tys | Asp | A5? | Met | Asn | Phe | Asp | Ile 40 | pro | Glu | Glu | Ile | Lys 45 | Gin | Leu | Gin |
| Gin | Phe 50 | Gin | Lys | GlU | Asp | Ala 55 | Ala | Leu | Thr | ile | Tyr 60 | Glu | Met | Leu | Gin |
| Asn | Ile | Phe | Ala | ile | Phe | Arg | Gin | ASp | Ser | ser | Ser | Thr | Gly | Trp | Asn |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Glu | Thr | Ile | Val | GlU | Asn | Leu | Leu | Ala | Asn | val | Ala | His | Gin | ile | Ala |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| «15 | Leu | Ala | Ala 100 | val | Leu | GlU | Glu | aí | Leu | Glu | Lys | Glu | Asp 110 | Phe | Thr |
| Arg | Gly | uys 115 | Leu | Met | ser | Ser | Leu 120 | HÍS | Leu | Lys | Arg | Tyr 125 | Tyr | Gly | Arg |
| Ile | Leu | His | Tyr | Leu | Lys | Ala | Lys | Glu | Tyr | ser | His | cys | Ala | Trp | Thr |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| Ile | Val | Arg | val | Glu | Ile | teu | Arg | Asn | Phe | Tyr | Phe | Ile | Asn | Arg | Leu |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| Thr | Gly | Tyr | Leu | Arg 165 | Asn |
| <210> | 54 | |||||||||||||||
| <211> | 166 | |||||||||||||||
| <212> | PRT | |||||||||||||||
| <213> | Homo | sapii | ens | |||||||||||||
| <400> | 54 | |||||||||||||||
| Met | Ser | Tyr | Asn | Leu | Leu | Gly | Phe | Leu | Gin | Arg | Ser | Ser | Asn | Phe | Gin | |
| 1 | 5 | 10 | 15 | |||||||||||||
| cys | Gin | Lys | Leu 20 | Leu | Trp | Gin | Leu | Asn 25 | Gly | Arg | Leu | Glu | 35 | cys | Leu | |
| Lys | Asp | Arg | Met | Asn | Phe | Asp | Ile | Pro | Glu | Glu | ile | Lys | Gin | Leu | Gin | |
| 35 | 40 | 45 | ||||||||||||||
| Gin | Phe | Gin | Lys | Glu | Asp | Ala | Ala | Leu | Thr | ile | Tyr | Glu | Met | Leu | Gin | |
| 50 | 55 | 60 | ||||||||||||||
| Asn | ile | Phe | Ala | Ile | Phe | Arg | Gin | Asp | Ser | Ser | ser | Thr | Gly | Trp | Asn | |
| 65 | 70 | 75 | 80 |
LZ, JVV/O4 DO
Glu Thr lle Val Glu Asn 85
His Leu Lys Thr val Leu 100
Arg Gly Lys Leu Met ser lle Leu His Tyr Leu Lys 130 lle Val Arg val Glu lle 145 150
Thr Gly Tyr Leu Ar| Asn
| Leu | Leu | Ala | Asn | Val | Tyr His | Gin | ile | Asn |
| 90 | 95 | |||||||
| Ala | Ala | Lys | Leu | Ala | Ala Ala | Asp | Phe | Thr |
| 105 | 110 | |||||||
| ser | Leu | His | Leu | Lys | Arg Tyr | Tyr | Gly | Arg |
| 120 | 125 | |||||||
| Ala | Lys | Glu | Tyr | Ser | His cys | Ala | Trp | Thr |
| 135 | 140 | |||||||
| Leu | Arg | Asn | Phe | Tyr | phe ile | Asn | Arg | Leu |
| 155 | 160 |
<210> 55 <211> 166 <212>PRT <213> Homo sapiens <400> 55
| Met 1 | Ser | Tyr | Asn | Leu 5 | Leu Gly Phe | Leu Gin Arg Ser Ser 10 | Asn | Phe 15 | Gin | |||||
| cys | Gin | Lys | Leu 20 | Leu | Trp | Gin | Leu | Asn 25 | Gly Arg | Leu | Glu | Tyr cys 30 | Leu | |
| Lys | ASP | *3? | Met | Asn | Phe | Asp | Ile 40 | pro | Glu Glu Zle | Lys 45 | Gin Leu | Gin | ||
| Gin | Phe 50 | Gin | Lys | Glu | Asp | Ala Ala 55 | Leu | Thr ile Tyr 60 | Glu | Met | Leu | Glrt | ||
| Asn 65 | Ile | Phe | Ala | Ile | Phe 70 | Arg | Gin | Asp | Ser ser 75 | ser | Thr | Gly Trp | Asn 80 | |
| Glu | Thr | ile | val | Glu 85 | Asn | Leu | Leu | Ala | Asn 90 | val | Tyr | His | Gin ile 95 | Asn |
| His | Leu | Lys | Thr Val 100 | Leu | Glu | Glu | Lys 105 | Leu | Glu | Lys | Glu | Ala 110 | Ala Thr | |
| Ala Gly | Lys 115 | Ala | Met | Ser | Ala | Leu 120 | HÍS | Leu | Lys | Arg Tyr 125 | Tyr | cly Arg | ||
| ile | Leu 130 | His | Tyr | Leu | Lys | Ala 135 | Lys | Glu | Tyr | ser | His Cys Ala 140 | Trp Thr | ||
| ile Val 145 | Arg | val | Glu | lle 150 | Leu | Arg | Asn | Phe | Tyr 155 | phe Ile asπ | Arg | Leu 160 | ||
| Thr Gly | Tyr | Leu | Arg 165 | Asn |
-67CZ 300762 B6 <210> 56 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 56
| Met 1 | ser | Tyr | Asn Leu 5 | Leu cly Phe | Leu Gin Arg Ser ser Asn Phe Gin | ||||||||||
| 10 | 15 | ||||||||||||||
| cys | Gin | Lys | Leu | Leu | Trp | Gin | Leu | Asn | Gly Arg | Leu | Glu | Tyr | cys | Leu | |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Lys | Asp | Arg 35 | Met | Asn | Phe | Asp | Ile 40 | Pro | Glu | Glu | ile | Lys 45 | Gin | Leu | Gin |
| Gin | Phe | Gin | Lys | Glu | Asp | Ala Ala | Leu | Thr | Ile | Tyr | Glu | Met | Leu | Gin | |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Asn | Ile | Phe | Ala | Ile | Phe | Arg | Gin | Asp | ser | ser | Ser | Thr | Gly Trp | Asn | |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Glu | Thr | ile | val | Glu | Asn | Leu | Leu | Ala | Asn | val | Tyr | His | Gin | ile | Asn |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| HlS | Leu | Lys | Thr | val | Leu | Glu Glu | Lys | Leu | Glu | Lys | Glu | Asp | phe Thr | ||
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| Arg | Gly | Lys 115 | Leu | Met | Ser | Ser | Leu 120 | His | Leu | Lys | Arg | Tyr 125 | Tyr Gly Ala | ||
| Ile | Ala 130 | Ala | Tyr | Leu | Ala | Ala 135 | Lys | Glu | Tyr | Ser | His 140 | cys | Ala Trp Thr | ||
| Ile Val | Arg | val | GlU | Ile | Leu | Arg | ASH | Phe | Phe | Ile | Asn Arg | Leu | |||
| 145 | 150 | 160 | |||||||||||||
| Thr Gly | Tyr | Leu | ÍS | Asn |
<210 57 10 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 57
| Met | ser | Tyr | Asn | Leu | Leu | Gly | phe | Leu | Gin | Arg | ser | ser | Asn | phe | Gin |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| cys | Gin | Lys | Leu 20 | Leu | Trp | Gin | Leu | Asn 25 | Gly | Arg | Leu | Glu | Tyr 30 | cys | Leu |
| Lys | Asp | Arg | Met | Asn | Phe | Asp | ile | Pro | Glu | Glu | Ile | Lys | Gin | Leu | Gin |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Gin | Phe | Gin | Lys | Glu | Asp | Ala | Ala | Leu | Thr | ile | Tyr | Glu | Met | Leu | Gin |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Α5Π | ile | phe | Ala | Ile | Phe | Arg | Gin | Asp | Ser | Ser | Ser | Thr | Gly | Trp | Asn |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Glu | Thr | ile | val | Glu | Asn | Leu | Leu | Ala | Asn | Val | Tyr | His | Gin | ile | Asn |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| His | Leu | Lys | Thr | Val | Leu | Glu | Glu | Lys | Leu | Glu | Lys | Glu | Asp | Phe | Thr |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| Arg | Gly | Lys | Leu | Met | ser | Ser | Leu | His | Leu | Lys | Arg | Tyr | Tyr | Gly | Arg |
| 115 | 120 | 125 |
k/ώ jwíví ον ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Ala Ala Tyr ser His Cys Ala Trp Thr 130 135 140
Ile Val Arg Val Glu ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe ile Asn Arg Leu 145 150 155 160
Thr Gly Tyr Leu Arg Asn 165 <210> 58 <211> 166 <212>PRT <213> Homo sapiens <400> 58
| Met | ser | Tyr | Asn | Leu | Leu | Gly | Phe | Leu | Gin | Arg | Ser | Ser | Asn | Phe | Gin |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| cys | Gin | Lys | Leu | Leu | Trp | Gin | Leu | Asn | Gly | Arg | Leu | Glu | Tyr | cys | Leu |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Lys | Asp | Arg | Met | Asn | Phe | Asp | Ile | Pro | Glu | Glu | ile | Lys | Gin | Leu | Gin |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Gin | Phe | Gin | Lys | Glu | Asp | Ala | Ala | Leu | Thr | Ile | Tyr | Glu | Met | Leu | Gin |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Asn | ile | Phe | Ala | ile | phe | Arg | Gin | Asp | Ser | Ser | ser | Thr | Gly | Trp | Asn |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Glu | Thr | Ile | Val | Glu. | Asn | Leu | Leu | Ala | Α5Π | Val | Tyr | His | Gin | Ile | Asn |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| HÍS | Leu | Lys | Thr | val | Leu | Glu | Glu | Lys | Leu | Glu | Lys | Glu | ASp | Phe | Thr |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| Arg | Gly | Lys 115 | Leu | Met | Ser | Ser | Leu 120 | His | Leu | Lys | Arg | X | Tyr | Gly | Arg |
| ile | Leu | HÍ5 | Tyr | Leu | Lys | Ala | Lys | Glu | Tyr | Ala | Ala | Cys | Ala | Trp | Thr |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| ile | val | Arg | val | Glu | Ile | Leu | Arg | Asn | phe | Tyr | phe | Ile | Asn | Arg | Leu |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| Thr | Gly | Tyr | Leu | Arg | Asn |
165
| <210> | 59 | |||||||||||||||
| <211> | 166 | |||||||||||||||
| <212> | PRT | |||||||||||||||
| <213> | Homo | sapk | :ns | |||||||||||||
| <400> | 59 | |||||||||||||||
| Met | Ser | Tyr | Asn | Leu | Leu | Gly | Phe | Leu | Gin | Arg | ser | Ser | Asn | Phe | Gin | |
| 1 | 5 | 10 | 15 | |||||||||||||
| cys | Gin | Lys | Leu | Leu | Trp | Gin | Leu | Asn | Gly | Arg | Leu | Glu | Tyr | Cys | Leu | |
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||||||
| Lys | Asp | Arg | Met | Asn | Phe | Asp | Ile | Pro | Glu | Glu | ile | tys | Gin | Leu | Gin |
-69CZ 300762 B6
40 45
| Gin Phe 50 | Gin Lys Glu | ASP | Ala Ala Leu Thr ile Tyr Glu Met Leu Gin | |||||||||
| 55 | 60 | |||||||||||
| Asn ile | Phe Ala | Ile | Phe | Arg | Gin | Asp | Ser | ser | ser | Thr Gly Trp | Asn | |
| 65 | 70 | 75 | 80 | |||||||||
| Glu Thr | ile Val | Glu | Asn | Leu | Leu | Ala | Asn | Val | Tyr | His Gin ile | Asn | |
| 85 | 90 | 95 | ||||||||||
| His Leu | Lys | Thr val | Leu | Glu | Glu | Lys | Leu | Glu | Lys | Glu Asp Phe | Thr | |
| 100 | 105 | 110 | ||||||||||
| Arg Gly | Lys 115 | Leu | Met | ser | ser | Leu 120 | His | Leu | Lys | Arg | Tyr Tyr Gly Arg | |
| Ile Leu | HiS | Tyr | Leu | Lys | Ala | Lys | Glu | Tyr | ser | His | cys Ala Trp | Thr |
| 130 | 135 | 140 | ||||||||||
| Ile Val | Arg | Ala | Glu | Ile | Leu | Ala | Asn | Phe Ala | phe | Ile Ala Arg | Leu | |
| 145 | 150 | 155 | 160 | |||||||||
| Thr Gly Tyr | Leu | Arg 165 | Asn |
<210> 60 <211> 166 <212>PRT <213> Homo sapiens <400> 60
| Met 1 | ser | Tyr | Asn | Leu 5 | Leu | Gly Phe Leu Gin 10 | Arg | ser | ser | Asn | Phe 15 | Gin | |||
| cys | Gin | Lys | Leu 20 | Leu | Trp | Gin | Leu | Asn 25 | Gly | Arg | Leu | GlU | cys | Leu | |
| Lys | Asp | Arg | Met | Asn | Phe | Asp | Ile | Pro | Glu | Glu | Ile | Lys | Gin | Leu | Gin |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Gin | Phe | Gin | Lys | Glu | Asp | Ala | Ala | Leu | Thr | ile | Tyr | Glu | Met | Leu | Gin |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Asn | Ile | Phe | Ala | ile | Phe | Arg | Gin | Asp | ser | ser | Ser | Thr | Gly | Trp | Asn |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Glu | Thr | ile | val | Glu | Asn | Leu | Leu | Ala | Asn | Val | Tyr | His | Gin | ile | Asn |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| His | Leu | Lys | Thr | Val | Leu | Glu GlU | Lys | Leu | Glu | Lys | GlU | Asp | Phe | Thr | |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| Arg | Gly | Lys 115 | Leu | Met | ser | ser | Leu 120 | HiS | Leu | Lys Arg Tyr Tyr 125 | Gly Arg | ||||
| ile | Leu | His | Tyr | Leu | Lys | Ala | Lys | Glu | Tyr | ser | His | Cys | Ala | Trp Thr | |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| ile | val | Arg | val | Glu | Ile | Leu | Arg | Asn | Phe | Tyr | Phe | ile | Asn | Arg | Leu |
| 145 | 150 | 155 | 160 |
| Thr Gly Tyr | Leu Arg Asn | ||
| 165 |
-70<210> 61 <211> 8 <212>PRT <213> Artificial Sequence <220 <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400 61
Asp iyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys <210> 62 <211>5 <212>PRT ís <213> Artificial sequence <220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 62
Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 63 <211>6 <212>PRT <213> Artificial Sequence <220>
<223> Description of Artificial sequence: Synthetic 6x His tag 30 <400> 63
His His His His His HÍS 1 5 <210> 64 35 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 64
Gly Gly Gly Gly ser 1 5
-71 CZ 300762 B6
Claims (18)
- PATENTOVÉ NÁROKYI. Polypeptid obsahující:s (a) mutantu interferonu-beta-la (IFN-β) vybranou ze skupiny sestávající z mutant IFN-β, které mají aminokyselinové sekvence uvedené v tabulce 1 jako AI, Bl, Cl, CD1, CD
- 2 a DE1, a (b) kloubovou oblast a domény CH2 a CH3 imunoglobulinu.io 2. Polypeptid podle nároku 1, kde imunoglobulin je lidský imunoglobulin.
- 3. Polypeptid podle nároku 1 nebo 2, kde imunoglobulin je imunoglobulin IgG.
- 4. Polypeptid podle nároku 3, kde imunoglobulin IgG je imunoglobulin IgGl.
- 5. Polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, kde mutanta interferonu-beta-la (IFN-β) je glykosylovaná na aminokyselině v sekvenci aminokyselin.
- 6. Polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, kde mutanta interferonu-beta-la (IFN-β) je 20 derivatizovaná na aminokyselině v sekvenci aminokyselin.
- 7. Polypeptid podle nároku 5, kde mutanta interferonu-beta-1 a (IFN-β) je dále derivatizovaná.
- 8. Polypeptid podle nároku 6 nebo 7, kde mutanta interferonu-beta-la je derivatizovaná poly25 alkylglykolovým polymerem.
- 9. Polypeptid podle nároku 8, kde polyalkylglykolový polymer je kondenzován na N-konec aminokyselinové sekvence mutanty interferonu-beta-la (IFN-β).30 10, Sekvence DNA kódující polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4.II. Rekombinantní DNA obsahující sekvenci DNA podle nároku 10 a sekvenci řídící expresi, kde sekvence řídící expresi je operativně spojena se sekvencí DNA.35 12. Hostitelská buňka obsahující molekulu rekombinantní DNA podle nároku 11.
- 13. Způsob přípravy polypeptidů podle kteréhokoliv z nároků laž4, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky, kdy40 a) se poskytne populace hostitelských buněk podle nároku 12,b) buňky se kultivují v podmínkách, kdy je exprimován polypeptid kódovaný molekulou rekombinantní DNA, a45 c) exprimovaný polypeptid se izoluje.
- 14. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje terapeuticky účinné množství polypeptidů podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9 a farmaceuticky přijatelný nosič.50
- 15. Použití polypeptidů podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9 pro výrobu léku.
- 16. Použití podle nároku 15, kdy lék je k léčení nebo prevenci zánčtlivých, autoimunitních, angiogenních, nádorových nebo virových onemocnění.- 77 .LZ. OUU/04 DO
- 17. Použití podle nároku 16, kdy virové onemocnění je infekce ECM, chřipka, infekce respiračního traktu, vzteklina nebo hepatitida.
- 18. Použití podle nároku 16, kdy autoimunitní onemocnění je lupus nebo sclerosis multiplex.
- 19. Použití podle nároku 16, kdy zánětlivé onemocnění je fíbróza.
- 20. Použití podle nároku 16, kdy angiogenní onemocnění je diabetická retinopatie, retinopatie předčasně narozených, makulámí degenerace, odvržení štěpu rohovky, neovaskulámí glaukom, io retrolentální fibroplázie, rubeóza nebo Osler-Weberův syndrom.
- 21. Použití podle nároku 16, kdy nádorové onemocnění je osteogenní sarkom, lymfom, akutní lymfocytámí leukémie, karcinom prsu, melanom, nasofaryngeální karcinom nebo hemangiom.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US10449198P | 1998-10-16 | 1998-10-16 | |
| US12023799P | 1999-02-16 | 1999-02-16 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20011330A3 CZ20011330A3 (cs) | 2001-09-12 |
| CZ300762B6 true CZ300762B6 (cs) | 2009-08-05 |
Family
ID=26801613
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20011330A CZ300762B6 (cs) | 1998-10-16 | 1999-10-15 | Fúzní proteiny interferonu-beta-1a a jejich použití |
Country Status (28)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US6800735B2 (cs) |
| EP (1) | EP1121382B9 (cs) |
| JP (2) | JP4761621B2 (cs) |
| KR (1) | KR100767649B1 (cs) |
| CN (1) | CN100480266C (cs) |
| AT (1) | ATE327254T1 (cs) |
| AU (1) | AU766190B2 (cs) |
| BR (1) | BR9915548A (cs) |
| CA (1) | CA2343094A1 (cs) |
| CY (1) | CY1105173T1 (cs) |
| CZ (1) | CZ300762B6 (cs) |
| DE (1) | DE69931507T2 (cs) |
| DK (1) | DK1121382T3 (cs) |
| EA (1) | EA005005B1 (cs) |
| EE (1) | EE05111B1 (cs) |
| ES (1) | ES2265693T3 (cs) |
| HK (1) | HK1042098B (cs) |
| HU (1) | HUP0200414A2 (cs) |
| IL (2) | IL142350A0 (cs) |
| IS (1) | IS5887A (cs) |
| MX (1) | MXPA01003790A (cs) |
| NO (1) | NO20011861L (cs) |
| NZ (1) | NZ510559A (cs) |
| PL (1) | PL200586B1 (cs) |
| PT (1) | PT1121382E (cs) |
| SK (1) | SK287491B6 (cs) |
| TR (1) | TR200101087T2 (cs) |
| WO (1) | WO2000023472A2 (cs) |
Families Citing this family (91)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK1039931T3 (da) * | 1997-12-01 | 2005-08-08 | Fang Fang | Multivalente rekombinante antistoffer til at behandle HRV infektioner |
| ES2265693T3 (es) * | 1998-10-16 | 2007-02-16 | Biogen Idec Ma Inc. | Proteinas de fusion con interferon-beta y usos. |
| ES2630278T3 (es) * | 1998-10-16 | 2017-08-21 | Biogen Ma Inc. | Conjugados poliméricos de interferón beta-1a y usos de los mismos |
| US20030035798A1 (en) * | 2000-08-16 | 2003-02-20 | Fang Fang | Humanized antibodies |
| US7144574B2 (en) | 1999-08-27 | 2006-12-05 | Maxygen Aps | Interferon β variants and conjugates |
| US7431921B2 (en) | 2000-04-14 | 2008-10-07 | Maxygen Aps | Interferon beta-like molecules |
| US6531122B1 (en) | 1999-08-27 | 2003-03-11 | Maxygen Aps | Interferon-β variants and conjugates |
| US6697363B1 (en) | 2000-06-28 | 2004-02-24 | Alcatel Canada Inc. | Method and apparatus for longest matching prefix determination in a communication network |
| WO2002036628A2 (en) * | 2000-11-02 | 2002-05-10 | Maxygen Aps | New multimeric interferon beta polypeptides |
| KR100804885B1 (ko) * | 2000-12-06 | 2008-02-20 | 라보라토리스 세로노 에스.에이. | 경피증의 치료 또는 예방을 위한 ｓａｒｐ-1의 용도 |
| DE50204952D1 (de) * | 2001-02-01 | 2005-12-22 | Roche Diagnostics Gmbh | Verfahren zur herstellung von rekombinantem trypsin |
| YU48703A (sh) | 2001-02-27 | 2006-05-25 | Maxygen Aps | Novi interferonu beta-slični molekuli |
| CA2441095A1 (en) * | 2001-03-15 | 2002-09-26 | Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung | Modified interferon beta with reduced immunogenicity |
| JP2005522192A (ja) * | 2001-07-19 | 2005-07-28 | パーラン セラピューティクス， インコーポレイテッド | マルチマータンパク質およびマルチマータンパク質を作製および使用する方法 |
| AU2003209755B2 (en) * | 2002-02-06 | 2007-11-22 | Ares Trading S.A. | Tumor necrosis factor combined with interferon in demyelinating diseases |
| MXPA05000658A (es) * | 2002-07-17 | 2005-08-19 | Biogen Idec Inc | Terapias para la insuficiencia renal utilizando interferon-beta. |
| AU2003254641A1 (en) * | 2002-08-28 | 2004-03-19 | Maxygen Aps | Interferon beta-like molecules for treatment of cancer |
| CA2498319A1 (en) * | 2002-09-09 | 2004-03-18 | Nautilus Biotech | Rational evolution of cytokines for higher stability, the cytokines and encoding nucleic acid molecules |
| NZ565990A (en) * | 2002-09-27 | 2009-10-30 | Biogen Idec Inc | Therapies for chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy using interferon-beta |
| US20040137581A1 (en) * | 2002-10-01 | 2004-07-15 | Xencor | Interferon variants with improved properties |
| EP2204190A1 (en) * | 2003-07-15 | 2010-07-07 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | IgM production by transformed cells and methods for quantifying said IgM production |
| JP2007503838A (ja) | 2003-09-05 | 2007-03-01 | ジーティーシー バイオセラピューティクス， インコーポレイティド | トランスジェニック動物の乳汁中での融合タンパク質の産生方法 |
| US20070212346A1 (en) | 2003-10-09 | 2007-09-13 | Tomoyuki Igawa | Highly Concentrated Stabilized Igm Solution |
| EP1682584B1 (en) | 2003-11-13 | 2013-04-17 | Hanmi Science Co., Ltd. | A pharmaceutical composition comprising an immunoglobulin fc region as a carrier |
| US8110665B2 (en) | 2003-11-13 | 2012-02-07 | Hanmi Holdings Co., Ltd. | Pharmaceutical composition comprising an immunoglobulin FC region as a carrier |
| AU2005211362B2 (en) | 2004-02-02 | 2008-03-13 | Ambrx, Inc. | Modified human interferon polypeptides and their uses |
| JP2007526317A (ja) * | 2004-03-01 | 2007-09-13 | エンゾン ファーマスーティカルズ インコーポレイテッド | インターフェロン−ベータ・ポリマー結合体 |
| US20050276785A1 (en) * | 2004-06-09 | 2005-12-15 | Schering Aktiengesellschaft | Treatment of cardiomyopathy and of endothelial dysfunction |
| US7670595B2 (en) * | 2004-06-28 | 2010-03-02 | Merck Patent Gmbh | Fc-interferon-beta fusion proteins |
| LT1845925T (lt) * | 2005-01-12 | 2016-09-26 | Biogen Ma Inc. | Interferono-beta pateikimo būdas |
| JP2009507003A (ja) | 2005-09-01 | 2009-02-19 | アレス トレーディング ソシエテ アノニム | 視神経炎の治療 |
| US8450269B2 (en) | 2006-02-03 | 2013-05-28 | Prolor Biotech Ltd. | Long-acting growth hormone and methods of producing same |
| US7553940B2 (en) | 2006-02-03 | 2009-06-30 | Modigene Inc | Long-acting EPO polypeptides and derivatives thereof and methods thereof |
| US8048849B2 (en) | 2006-02-03 | 2011-11-01 | Modigene, Inc. | Long-acting polypeptides and methods of producing same |
| US20140113860A1 (en) | 2006-02-03 | 2014-04-24 | Prolor Biotech Ltd. | Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same |
| US8759292B2 (en) | 2006-02-03 | 2014-06-24 | Prolor Biotech, Llc | Long-acting coagulation factors and methods of producing same |
| US10351615B2 (en) | 2006-02-03 | 2019-07-16 | Opko Biologics Ltd. | Methods of treatment with long-acting growth hormone |
| US8946155B2 (en) | 2006-02-03 | 2015-02-03 | Opko Biologics Ltd. | Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same |
| US10221228B2 (en) | 2006-02-03 | 2019-03-05 | Opko Biologics Ltd. | Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same |
| US8476234B2 (en) | 2006-02-03 | 2013-07-02 | Prolor Biotech Inc. | Long-acting coagulation factors and methods of producing same |
| US20150038413A1 (en) | 2006-02-03 | 2015-02-05 | Opko Biologics Ltd. | Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same |
| US9249407B2 (en) | 2006-02-03 | 2016-02-02 | Opko Biologics Ltd. | Long-acting coagulation factors and methods of producing same |
| US9458444B2 (en) | 2006-02-03 | 2016-10-04 | Opko Biologics Ltd. | Long-acting coagulation factors and methods of producing same |
| WO2007110231A2 (en) * | 2006-03-28 | 2007-10-04 | Nautilus Biotech, S.A. | MODIFIED INTERFERON-β (IFN-β) POLYPEPTIDES |
| JO3324B1 (ar) | 2006-04-21 | 2019-03-13 | Amgen Inc | مركبات علاجية مجففة بالتبريد تتعلق بالعصارة الهضمية |
| MX2008014971A (es) | 2006-05-24 | 2008-12-05 | Serono Lab | Regimen de cladribine para tratar esclerosis multiple. |
| US8414897B1 (en) * | 2006-10-02 | 2013-04-09 | The Uab Research Foundation | Pathway for Th-17 cell development and methods utilizing same |
| FR2907454B1 (fr) * | 2006-10-18 | 2009-01-23 | Biomethodes Sa | Variants ameliores de l'interferon beta humain |
| WO2008137471A2 (en) | 2007-05-02 | 2008-11-13 | Ambrx, Inc. | Modified interferon beta polypeptides and their uses |
| US20090304719A1 (en) | 2007-08-22 | 2009-12-10 | Patrick Daugherty | Activatable binding polypeptides and methods of identification and use thereof |
| BRPI0817108B8 (pt) | 2007-09-21 | 2021-05-25 | Univ California | composição compreendendo uma proteína de fusão, kit compreendendo a referida composição e uso da mesma. |
| US20100203009A1 (en) * | 2007-10-02 | 2010-08-12 | The Uab Research Foundation | Pathway for Th-17 Cell Development and Methods Utilizing Same |
| AU2008314697B2 (en) * | 2007-10-22 | 2013-08-29 | Merck Serono S.A. | Single IFN-beta fused to a mutated lgG Fc fragment |
| SG188143A1 (en) | 2008-02-08 | 2013-03-28 | Ambrx Inc | Modified leptin polypeptides and their uses |
| US10138283B2 (en) | 2008-07-23 | 2018-11-27 | Ambrx, Inc. | Modified bovine G-CSF polypeptides and their uses |
| MX2011000861A (es) | 2008-07-23 | 2011-06-21 | Hanmi Holdings Co Ltd | Un complejo polipeptidico que consiste en un polimero no-peptidil que posee tres terminaciones funcionales. |
| RU2636046C2 (ru) | 2009-01-12 | 2017-11-17 | Сайтомкс Терапьютикс, Инк | Композиции модифицированных антител, способы их получения и применения |
| BRPI1011384A2 (pt) | 2009-02-23 | 2016-03-15 | Cytomx Therapeutics Inc | pro-proteinas e seus metodos de uso |
| CA2759333A1 (en) | 2009-04-22 | 2010-10-28 | Merck Patent Gmbh | Antibody fusion proteins with modified fcrn binding sites |
| US9663778B2 (en) | 2009-07-09 | 2017-05-30 | OPKO Biologies Ltd. | Long-acting coagulation factors and methods of producing same |
| BR112012015597A2 (pt) | 2009-12-21 | 2017-01-31 | Ambrx Inc | peptídeos de somatotropina suínos modificados e seus usos |
| MX349301B (es) | 2009-12-21 | 2017-07-21 | Ambrx Inc | Polipéptidos de somatotropina bovina modificados y sus usos. |
| HUE025878T2 (en) * | 2010-02-12 | 2016-05-30 | Biogen Ma Inc | Neuroprotection in demyelinating diseases |
| US9308277B2 (en) | 2010-02-25 | 2016-04-12 | Mesoblast International Sàrl | Protease-resistant mutants of stromal cell derived factor-1 in the repair of tissue damage |
| AR080993A1 (es) | 2010-04-02 | 2012-05-30 | Hanmi Holdings Co Ltd | Formulacion de accion prolongada de interferon beta donde se usa un fragmento de inmunoglobulina |
| AR083006A1 (es) | 2010-09-23 | 2013-01-23 | Lilly Co Eli | Formulaciones para el factor estimulante de colonias de granulocitos (g-csf) bovino y variantes de las mismas |
| CN103747795A (zh) * | 2011-06-07 | 2014-04-23 | 美索布拉斯特国际有限公司 | 使用基质细胞衍生因子-1的蛋白酶抵抗突变体修复组织损伤的方法 |
| SG10201602076QA (en) | 2011-10-01 | 2016-04-28 | Glytech Inc | Glycosylated polypeptide and pharmaceutical composition containing same |
| EP3559049A4 (en) | 2011-10-28 | 2019-12-04 | Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd | POLYPEPTIDE CONSTRUCTS AND APPLICATIONS THEREOF |
| MY167814A (en) | 2012-04-19 | 2018-09-26 | Opko Biologics Ltd | Long-acting oxyntomodulin variants and methods of producing same |
| US9783589B2 (en) * | 2012-08-13 | 2017-10-10 | Immungene Inc | Engineered antibody-interferon fusion molecules for treatment of autoimmune diseases |
| CA2891393A1 (en) | 2012-11-20 | 2014-05-30 | Opko Biologics Ltd. | Method of increasing the hydrodynamic volume of polypeptides by attaching to gonadotrophin carboxy terminal peptides |
| US9803021B2 (en) | 2012-12-07 | 2017-10-31 | The Regents Of The University Of California | CD138-targeted interferon demonstrates potent apoptotic and anti-tumor activities |
| KR102073748B1 (ko) | 2013-01-31 | 2020-02-05 | 한미약품 주식회사 | 재조합 효모 형질전환체 및 이를 이용하여 면역글로불린 단편을 생산하는 방법 |
| CN104334574B (zh) | 2013-03-29 | 2020-01-14 | 株式会社糖锁工学研究所 | 附加唾液酸化糖链的多肽 |
| US11117975B2 (en) | 2013-04-29 | 2021-09-14 | Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd | Anti-CD38 antibodies and fusions to attenuated interferon alpha-2B |
| EP2992013B1 (en) | 2013-04-29 | 2019-12-04 | Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd | Anti-cd38 antibodies and fusions to attenuated interferon alpha-2b |
| CN106967175A (zh) * | 2013-05-15 | 2017-07-21 | 复旦大学 | 长效干扰素及其制备方法和用途 |
| US10093745B2 (en) | 2013-05-29 | 2018-10-09 | The Regents Of The University Of California | Anti-CSPG4 fusions with interferon for the treatment of malignancy |
| AR096891A1 (es) | 2013-07-12 | 2016-02-03 | Hanmi Pharm Ind Co Ltd | Conjugado de monómero polipéptido biológicamente activo y conjugado de fragmento fc de inmunoglobulina, que muestra aclaramiento mediado por receptor reducido, y el método para la preparación del mismo |
| US20150158926A1 (en) | 2013-10-21 | 2015-06-11 | Opko Biologics, Ltd. | Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same |
| EP3083977B1 (en) | 2013-12-20 | 2018-02-28 | F. Hoffmann-La Roche AG | Improved recombinant polypeptide production methods |
| UA119352C2 (uk) | 2014-05-01 | 2019-06-10 | Тева Фармасьютикалз Острейліа Пті Лтд | Комбінація леналідоміду або помалідоміду і конструкції анти-cd38 антитіло-атенуйований інтерферон альфа-2b та спосіб лікування суб'єкта, який має cd38-експресуючу пухлину |
| AU2015337858B2 (en) | 2014-10-29 | 2020-09-24 | Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd. | Interferon alpha2b variants |
| CN108289851B (zh) | 2015-06-19 | 2021-06-01 | Opko生物科学有限公司 | 长效凝固因子及其产生方法 |
| DK3313879T3 (da) | 2015-06-24 | 2022-03-14 | Hoffmann La Roche | Anti-transferrinreceptor-antistoffer med tilpasset affinitet |
| AR106189A1 (es) | 2015-10-02 | 2017-12-20 | Hoffmann La Roche | ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS CONTRA EL A-b HUMANO Y EL RECEPTOR DE TRANSFERRINA HUMANO Y MÉTODOS DE USO |
| CN114014936A (zh) | 2015-10-02 | 2022-02-08 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 双特异性抗人cd20/人转铁蛋白受体抗体及使用方法 |
| US11236141B2 (en) * | 2016-05-13 | 2022-02-01 | Orionis Biosciences BV | Targeted mutant interferon-beta and uses thereof |
| KR102506179B1 (ko) * | 2020-01-23 | 2023-03-06 | 주식회사 제넥신 | Pd-l1 단백질이 포함된 융합 단백질 및 이의 용도 |
| JP2023520468A (ja) * | 2020-04-03 | 2023-05-17 | ザ ユニバーシティ オブ ノース カロライナ アット チャペル ヒル | Ａｃｅ２標的化ウイルスに対して有用な結合タンパク質 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1983002461A1 (en) * | 1982-01-19 | 1983-07-21 | Cetus Corp | Multiclass hybrid interferons |
| WO1997024137A1 (en) * | 1995-12-28 | 1997-07-10 | Tanox Biosystems, Inc. | HYBRID WITH INTERFERON-α AND AN IMMUNOGLOBULIN Fc LINKED THROUGH A NON-IMMUNOGENIC PEPTIDE |
| EP1121382A2 (en) * | 1998-10-16 | 2001-08-08 | Biogen, Inc. | Interferon-beta fusion proteins and uses |
Family Cites Families (67)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3359030A (en) * | 1966-12-16 | 1967-12-19 | Newman George | Bumper guard assembly |
| US4179337A (en) | 1973-07-20 | 1979-12-18 | Davis Frank F | Non-immunogenic polypeptides |
| US4002531A (en) | 1976-01-22 | 1977-01-11 | Pierce Chemical Company | Modifying enzymes with polyethylene glycol and product produced thereby |
| US4414147A (en) | 1981-04-17 | 1983-11-08 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods of decreasing the hydrophobicity of fibroblast and other interferons |
| US6936694B1 (en) | 1982-05-06 | 2005-08-30 | Intermune, Inc. | Manufacture and expression of large structural genes |
| DE3380726D1 (en) | 1982-06-24 | 1989-11-23 | Japan Chem Res | Long-acting composition |
| GB8334102D0 (en) | 1983-12-21 | 1984-02-01 | Searle & Co | Interferons with cysteine pattern |
| EP0154316B1 (en) | 1984-03-06 | 1989-09-13 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Chemically modified lymphokine and production thereof |
| GB8412564D0 (en) * | 1984-05-17 | 1984-06-20 | Searle & Co | Structure and properties |
| US4917888A (en) | 1985-06-26 | 1990-04-17 | Cetus Corporation | Solubilization of immunotoxins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation |
| JP2524586B2 (ja) * | 1985-06-26 | 1996-08-14 | シタス コーポレイション | ポリマ−接合を利用する医薬組成物用蛋白質の可溶化 |
| US4766106A (en) * | 1985-06-26 | 1988-08-23 | Cetus Corporation | Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation |
| US4935233A (en) * | 1985-12-02 | 1990-06-19 | G. D. Searle And Company | Covalently linked polypeptide cell modulators |
| JP2514950B2 (ja) | 1986-03-10 | 1996-07-10 | エフ・ホフマン―ラ ロシユ アーゲー | 化学修飾蛋白質，その製造法および中間体 |
| JPS63152393A (ja) | 1986-07-03 | 1988-06-24 | Takeda Chem Ind Ltd | グリコシル誘導体 |
| US4868802A (en) * | 1986-07-28 | 1989-09-19 | Kabushiki Kaisha Toshiba | Magnetooptic recording and erasing head which performs biasing, tracking and focusing |
| US4894226A (en) | 1986-11-14 | 1990-01-16 | Cetus Corporation | Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polyproline conjugation |
| US4904584A (en) | 1987-12-23 | 1990-02-27 | Genetics Institute, Inc. | Site-specific homogeneous modification of polypeptides |
| US4847325A (en) | 1988-01-20 | 1989-07-11 | Cetus Corporation | Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1 |
| CA1340810C (en) | 1988-03-31 | 1999-11-02 | Motoo Yamasaki | Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor |
| JPH04502011A (ja) | 1988-11-23 | 1992-04-09 | ジェネンテク，インコーポレイテッド | ポリペプチド誘導体 |
| DE68925966T2 (de) | 1988-12-22 | 1996-08-29 | Kirin Amgen Inc | Chemisch modifizierte granulocytenkolonie erregender faktor |
| US5116964A (en) * | 1989-02-23 | 1992-05-26 | Genentech, Inc. | Hybrid immunoglobulins |
| US5286637A (en) | 1989-08-07 | 1994-02-15 | Debiopharm, S.A. | Biologically active drug polymer derivatives and method for preparing same |
| JPH04218000A (ja) | 1990-02-13 | 1992-08-07 | Kirin Amgen Inc | 修飾ポリペプチド |
| US5252714A (en) | 1990-11-28 | 1993-10-12 | The University Of Alabama In Huntsville | Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde |
| SG47099A1 (en) | 1991-03-15 | 1998-03-20 | Amgen Boulder Inc | Pegylation of polypeptides |
| US5595732A (en) | 1991-03-25 | 1997-01-21 | Hoffmann-La Roche Inc. | Polyethylene-protein conjugates |
| WO1993000109A1 (en) | 1991-06-28 | 1993-01-07 | Genentech, Inc. | Method of stimulating immune response using growth hormone |
| US5281698A (en) | 1991-07-23 | 1994-01-25 | Cetus Oncology Corporation | Preparation of an activated polymer ester for protein conjugation |
| WO1993012145A1 (en) | 1991-12-19 | 1993-06-24 | Baylor College Of Medicine | Pva or peg conjugates of peptides for epitope-specific immunosuppression |
| ZA933926B (en) | 1992-06-17 | 1994-01-03 | Amgen Inc | Polyoxymethylene-oxyethylene copolymers in conjuction with blomolecules |
| US5255519A (en) | 1992-08-14 | 1993-10-26 | Millennium Technologies, Inc. | Method and apparatus for increasing efficiency and productivity in a power generation cycle |
| US5382657A (en) | 1992-08-26 | 1995-01-17 | Hoffmann-La Roche Inc. | Peg-interferon conjugates |
| AU5098193A (en) | 1992-09-01 | 1994-03-29 | Berlex Laboratories, Inc. | Glycolation of glycosylated macromolecules |
| US5298410A (en) | 1993-02-25 | 1994-03-29 | Sterling Winthrop Inc. | Lyophilized formulation of polyethylene oxide modified proteins with increased shelf-life |
| US5359030A (en) | 1993-05-10 | 1994-10-25 | Protein Delivery, Inc. | Conjugation-stabilized polypeptide compositions, therapeutic delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same |
| US5681811A (en) | 1993-05-10 | 1997-10-28 | Protein Delivery, Inc. | Conjugation-stabilized therapeutic agent compositions, delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same |
| US5874075A (en) | 1993-10-06 | 1999-02-23 | Amgen Inc. | Stable protein: phospholipid compositions and methods |
| US5643575A (en) | 1993-10-27 | 1997-07-01 | Enzon, Inc. | Non-antigenic branched polymer conjugates |
| US5951974A (en) | 1993-11-10 | 1999-09-14 | Enzon, Inc. | Interferon polymer conjugates |
| PT730470E (pt) | 1993-11-10 | 2002-08-30 | Enzon Inc | Conjugados melhorados de interferao-polimero |
| DE69534676T2 (de) | 1994-02-08 | 2006-08-17 | Amgen Inc., Thousand Oaks | Orale Verabreichung von chemisch modifizierten Proteinen |
| US5545723A (en) | 1994-03-15 | 1996-08-13 | Biogen Inc. | Muteins of IFN-β |
| GB9415379D0 (en) * | 1994-07-29 | 1994-09-21 | Smithkline Beecham Plc | Novel compounds |
| US5824784A (en) | 1994-10-12 | 1998-10-20 | Amgen Inc. | N-terminally chemically modified protein compositions and methods |
| US5738846A (en) | 1994-11-10 | 1998-04-14 | Enzon, Inc. | Interferon polymer conjugates and process for preparing the same |
| CA2206852A1 (en) | 1994-12-07 | 1996-06-13 | Novo Nordisk A/S | Polypeptide with reduced allergenicity |
| US5672662A (en) | 1995-07-07 | 1997-09-30 | Shearwater Polymers, Inc. | Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications |
| KR0154850B1 (ko) * | 1995-10-09 | 1998-10-15 | 김광호 | 바이씨모스 및 그의 제조방법 |
| US5702717A (en) | 1995-10-25 | 1997-12-30 | Macromed, Inc. | Thermosensitive biodegradable polymers based on poly(ether-ester)block copolymers |
| US5908621A (en) | 1995-11-02 | 1999-06-01 | Schering Corporation | Polyethylene glycol modified interferon therapy |
| US5747639A (en) | 1996-03-06 | 1998-05-05 | Amgen Boulder Inc. | Use of hydrophobic interaction chromatography to purify polyethylene glycols |
| ATE200030T1 (de) | 1997-01-29 | 2001-04-15 | Polymasc Pharmaceuticals Plc | Pegylationsverfahren |
| US5990237A (en) | 1997-05-21 | 1999-11-23 | Shearwater Polymers, Inc. | Poly(ethylene glycol) aldehyde hydrates and related polymers and applications in modifying amines |
| NZ502375A (en) | 1997-07-14 | 2001-11-30 | Bolder Biotechnology Inc | The addition of non-natural cysteine derivatives to cause the protein to act as antagonists of the GH family |
| US6180095B1 (en) | 1997-12-17 | 2001-01-30 | Enzon, Inc. | Polymeric prodrugs of amino- and hydroxyl-containing bioactive agents |
| US5981709A (en) | 1997-12-19 | 1999-11-09 | Enzon, Inc. | α-interferon-polymer-conjugates having enhanced biological activity and methods of preparing the same |
| US5985263A (en) | 1997-12-19 | 1999-11-16 | Enzon, Inc. | Substantially pure histidine-linked protein polymer conjugates |
| US5965119A (en) | 1997-12-30 | 1999-10-12 | Enzon, Inc. | Trialkyl-lock-facilitated polymeric prodrugs of amino-containing bioactive agents |
| ES2307865T3 (es) | 1998-03-12 | 2008-12-01 | Nektar Therapeutics Al, Corporation | Metodo para preparar conjugados polimericos. |
| CA2330451A1 (en) | 1998-04-28 | 1999-11-04 | Applied Research Systems Ars Holding N.V. | Polyol-ifn-beta conjugates |
| US6703381B1 (en) | 1998-08-14 | 2004-03-09 | Nobex Corporation | Methods for delivery therapeutic compounds across the blood-brain barrier |
| ES2630278T3 (es) | 1998-10-16 | 2017-08-21 | Biogen Ma Inc. | Conjugados poliméricos de interferón beta-1a y usos de los mismos |
| BR0013638A (pt) | 1999-08-27 | 2002-05-14 | Maxygen Aps | Novas moléculas semelhantes a interferon beta |
| MXPA02006216A (es) | 1999-12-22 | 2004-02-26 | Nektar Therapeutics Al Corp | Derivados estericamente impedidos de polimeros solubles en agua. |
| US20080033818A1 (en) | 2005-03-17 | 2008-02-07 | Inc2 Webcom Ltd. | Real time interactive response system and methods |
-
1999
- 1999-10-15 ES ES99956574T patent/ES2265693T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-10-15 EA EA200100447A patent/EA005005B1/ru not_active IP Right Cessation
- 1999-10-15 AU AU13158/00A patent/AU766190B2/en not_active Ceased
- 1999-10-15 CN CNB998122130A patent/CN100480266C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1999-10-15 HU HU0200414A patent/HUP0200414A2/hu unknown
- 1999-10-15 DK DK99956574T patent/DK1121382T3/da active
- 1999-10-15 WO PCT/US1999/024200 patent/WO2000023472A2/en active IP Right Grant
- 1999-10-15 TR TR2001/01087T patent/TR200101087T2/xx unknown
- 1999-10-15 EP EP99956574A patent/EP1121382B9/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-10-15 AT AT99956574T patent/ATE327254T1/de active
- 1999-10-15 KR KR1020017004797A patent/KR100767649B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1999-10-15 NZ NZ510559A patent/NZ510559A/en not_active IP Right Cessation
- 1999-10-15 EE EEP200100223A patent/EE05111B1/xx not_active IP Right Cessation
- 1999-10-15 IL IL14235099A patent/IL142350A0/xx active IP Right Grant
- 1999-10-15 CA CA002343094A patent/CA2343094A1/en not_active Abandoned
- 1999-10-15 MX MXPA01003790A patent/MXPA01003790A/es not_active IP Right Cessation
- 1999-10-15 JP JP2000577197A patent/JP4761621B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1999-10-15 PL PL347932A patent/PL200586B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1999-10-15 PT PT99956574T patent/PT1121382E/pt unknown
- 1999-10-15 SK SK510-2001A patent/SK287491B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1999-10-15 BR BR9915548-6A patent/BR9915548A/pt not_active Application Discontinuation
- 1999-10-15 CZ CZ20011330A patent/CZ300762B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1999-10-15 DE DE69931507T patent/DE69931507T2/de not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-03-14 IS IS5887A patent/IS5887A/is unknown
- 2001-04-01 IL IL142350A patent/IL142350A/en not_active IP Right Cessation
- 2001-04-11 US US09/832,659 patent/US6800735B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2001-04-11 NO NO20011861A patent/NO20011861L/no unknown
-
2002
- 2002-05-24 HK HK02103895.8A patent/HK1042098B/zh not_active IP Right Cessation
-
2004
- 2004-06-15 US US10/868,673 patent/US7527946B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2006
- 2006-08-24 CY CY20061101194T patent/CY1105173T1/el unknown
-
2009
- 2009-03-18 US US12/406,387 patent/US20090286958A1/en not_active Abandoned
-
2010
- 2010-07-22 JP JP2010165349A patent/JP2010268810A/ja not_active Withdrawn
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1983002461A1 (en) * | 1982-01-19 | 1983-07-21 | Cetus Corp | Multiclass hybrid interferons |
| WO1997024137A1 (en) * | 1995-12-28 | 1997-07-10 | Tanox Biosystems, Inc. | HYBRID WITH INTERFERON-α AND AN IMMUNOGLOBULIN Fc LINKED THROUGH A NON-IMMUNOGENIC PEPTIDE |
| EP1121382A2 (en) * | 1998-10-16 | 2001-08-08 | Biogen, Inc. | Interferon-beta fusion proteins and uses |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ300762B6 (cs) | Fúzní proteiny interferonu-beta-1a a jejich použití | |
| JP5396358B2 (ja) | インターフェロン−β−１ａのポリマー結合体および使用 | |
| JP2002527100A5 (cs) | ||
| JP2002527491A5 (cs) | ||
| EP1739090A2 (en) | Interferon-beta fusion proteins and uses | |
| MXPA01003791A (es) | Conjugados polimericos de interferon beta - 1a y usos de los mismos |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20121015 |