JP2002527100A - インターフェロン−β融合タンパク質および使用 - Google Patents
インターフェロン−β融合タンパク質および使用Info
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Abstract
Description
や、医学診療において十分に受け入れられている。これらの物質が治療において
果たす役割は非常に重要であるので、多くの研究活動が、組換えDNA技術によ
る大量合成に指向している。これらのポリペプチドの多くは、内因性分子であり
、これは、それらの生物学的作用を誘発することにおいて、非常に強力かつ特異
的である。
る主要な因子は、非経口で与えられる場合、これらが短時間以内に体内から排出
されることである。これは、プロテアーゼによる代謝の結果として、またはタン
パク質排出についての正常な経路(例えば、腎臓における濾過による)を使用す
る、クリアランスによって生じ得る。タンパク質の投与のこれらの経路に関連す
る問題は、製薬産業において周知であり、そして種々のストラテジーが、それら
を解決するための試みにおいて使用されている。
lation)を改善するための試みの焦点となっているペプチドファミリーは
、インターフェロンである。インターフェロンは、種々の臨床的疾患状態におい
て試験されている。ヒトインターフェロン−β(そのファミリーの1つのメンバ
ー)の使用は、多発性硬化症の処置において最も良好に確立されている。組換え
インターフェロン−βの2つの形態は、近年、この疾患の処置について、欧州お
よび米国において認可されてきた。1つの形態は、インターフェロン−β−1a
(登録商標され、AVONEX(登録商標)として販売されている、mfg.B
iogen,Inc.,Cambridge、MA)であり、本明細書中で以後
、「インターフェロン−β−1a」または「IFN−β−1a」または「IFN
−β−1a」または「インターフェロン−β−1a」が、交換可能に使用される
。他方の形態は、インターフェロン−β−1b(登録商標され、BETASER
ON(登録商標)として販売されている、Berlex,Richmond C
A)であり、本明細書中で以後、「インターフェロン−β−1b」である。イン
ターフェロン−β−1aは、天然のヒト遺伝子配列を使用して哺乳動物細胞にお
いて産生され、そしてグリコシル化されるが、インターフェロン−β−1bは、
アミノ酸17位で遺伝子操作されたシステインからセリンへの置換を含む改変ヒ
ト遺伝子配列を使用してE.coli細菌において産生され、そしてグリコシル
化されない。
−1aおよびインターフェロン−β−1bの相対的なインビトロ潜在能を直接比
較し、そしてインターフェロン−β−1aの比活性が、インターフェロン−β−
1bの比活性よりも約10倍高いことを示した(Runkelら、1998、P
harm.Res.15:641〜649)。これらの活性の差異についての構
造的基礎を同定するために設計された研究から、本発明者らは、比活性に影響を
及ぼす産物間の既知の構造的差異のただ1つとして、グリコシル化を同定した。
炭水化物の効果は、構造に対するその安定化の役割を通じて非常に著しかった。
炭水化物の安定化効果は、熱変性実験およびSEC分析において明らかであった
。グリコシル化の欠如はまた、凝集における増加、および熱変性に対する増加し
た感受性と相関した。PNGase Fを用いるインターフェロン−β−1aか
らの炭水化物の酵素的除去は、脱グリコシル化産物の過剰な沈殿を生じた。
との間の配列における保存に関わらず、これらが別個の生化学的実体であり、そ
れゆえに、インターフェロン−β−1bについて公知のものの多くがインターフ
ェロン−β−1aに適用され得ないこと(逆もまた同じ)ことを示す。
ロン−βの利点を開発した。特に、本発明者らは、インターフェロン−β−1b
に対して増加した活性を有するインターフェロン−β−1a組成物を開発し、そ
してこれはまた、融合タンパク質でないインターフェロン−β−1aと比較して
、一般に活性において有効な損失を有さない融合タンパク質の有益な(salu
tory)特性を有する。従って、改変が、産物(インターフェロン−β−1a
融合タンパク質)がそれらの生物学的活性の全てまたはほとんどを保持するよう
な方法においてなされる場合、以下の特性が、生じ得る:増加された半減期およ
び組織分布における変更(例えば、より長期間の間、血管系において留まる能力
)を導く変更された薬物速度論および薬力学。このような処方は、薬学的および
医学の分野において実質的な進歩であり、そしてインターフェロンがいくらかの
有用性を有する種々の疾患(例えば、多発性硬化症、線維症、および他の炎症性
疾患または自己免疫疾患、肝炎および他のウイルス性疾患ならびに新生血管形成
によって特徴付けられる疾患)の管理において有意な寄与をなす。特に、血管系
においてより長い期間残存する能力は、インターフェロン−β−1aが新脈管形
成を阻害するため、および潜在的に血液脳関門を横切るために使用されることを
可能にする。
関し、ここで、Xは、インターフェロン−βのアミノ酸配列からなるアミノ酸配
列またはその一部を有するポリペプチドであり;Yは、必要に応じたリンカー部
分であり;そしてZは、インターフェロン−β以外のポリペプチドの少なくとも
一部を含むポリペプチドである。必要に応じた部分Yおよび必要とされる部分Z
は、インターフェロン−β(X)のN末端またはC末端のいずれかに連結され得
る。好ましくは、Xは、ヒトインターフェロン−β−1aである。好ましい実施
形態において、Zは、免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部であり、そし
てIgM、IgG、IgD、IgAおよびIgEから選択されるクラスの免疫グ
ロブリン由来であり得る。このクラスがIgGである場合、これは、IgG1、
IgG2、IgG3およびIgG4から選択される。ヒトIgMおよびIgEの
定常領域は、4つの定常領域(CH1、(ヒンジ)、CH2、CH3およびCH
4)を含むが、ヒトIgG、IgAおよびIgDの定常領域は、3つの定常領域
(CH1、(ヒンジ)、CH2およびCH3)を含む。本発明の最も好ましい融
合タンパク質において、この定常領域は、少なくともヒンジ、CH2およびCH
3ドメインを含む。他の実施形態において、部分Zは、免疫グロブリン様ドメイ
ンを含むポリペプチドの少なくとも一部である。このような他のポリペプチドの
例としては、CD1、CD2、CD4、ならびにクラスI主要組織適合抗原およ
びクラスII主要組織適合抗原のメンバーが挙げられる。
列からなるアミノ末端領域を有し、そしてインターフェロン−β以外のタンパク
質の少なくとも一部を含むカルボキシ末端領域を有する、融合タンパク質である
。このカルボキシ部分は、好ましくは、IgM、IgG、IgD,IgAおよび
IgEから選択されるクラスの免疫グロブリン由来の免疫グロブリンの定常領域
の少なくとも一部である。最も好ましい融合タンパク質において、この定常領域
は少なくともヒンジ、CH2およびCH3ドメインを含む。
るX)が、インターフェロン−β−1aの非変異形態に対して選択的に増強され
た抗ウイルス活性および/もしくは抗増殖活性または他の利点を有するムテイン
を提供するように変異されている。
DNAである。本発明はまた、上記の融合タンパク質をコードする単離されたD
NAおよび発現制御配列を含む組換えDNAに関し、ここで、この発現制御配列
は、このDNAに作動可能に連結されている。本発明の範囲はまた、本発明の組
換えDNA配列を用いて形質転換された宿主細胞を含む。
DNAによってコードされるポリペプチドが発現される条件下で細胞の集団を増
殖させる工程;およびこの発現されたポリペプチドを単離する工程、を包含する
、組換えポリペプチドを産生する方法に関する。
ィブでは付随しないさらなるポリペプチドを含む実質的に精製された形態のイン
ターフェロン−β−1aの融合タンパク質であり、この融合物は、さらなるポリ
ペプチドを欠如するインターフェロン−β−1aの抗ウイルス活性にほぼ等しい
抗ウイルス活性を有する。
的有効量を含む薬学的組成物である。
新生血管形成を阻害する方法である。
明細書中に参考として援用される。以下の用語が本明細書中で使用される。
イルス、ポリペプチド、マイトジェンなどのような種々のインデューサーへの曝
露に応答して、哺乳動物細胞によって産生される、小さな種特異的一本鎖ポリペ
プチドである。本発明で使用される最も好ましいインターフェロンは、グリコシ
ル化されたヒトインターフェロン−βであり、これは残基80(Asn80)で
グリコシル化され、そして好ましくは、組換えDNA技術を介して誘導される。
この好ましいグリコシル化されたインターフェロン−βは、「インターフェロン
−ベータ−1a」または「INF−ベータ−1a」または「IFN−β−1a」
または「インターフェロンベータ1a」または「インターフェロン−β−1a」
または「インターフェロン−β−1a」と呼ばれ、これらは全て、交換可能に使
用される。用語「INF−ベータ−1a」はまた、その変異体もまた、Asn8
0残基でグリコシル化されるならば全ての変異形態を包含することを意味する(
すなわち、実施例1)。
、公知である。例えば、米国特許第4,399,216号、同第5,149,6
36号、同第5,179,017号(Axelら)および同第4,470,46
1号(Kaufman)を参照のこと。
ヌクレオチドは、様々な脊椎動物(好ましくは、哺乳動物)の野生型インターフ
ェロンβ遺伝子配列に由来し、そして以下の米国特許において記載される方法の
ような、当業者に周知の方法を使用して得られる:米国特許第5,641,65
6(1997年6月24日発行:DNA encoding avian ty
pe I interferon proprotein and matur
e avian type I interferon)、米国特許第5,60
5,688号(1997年2月25日:recombinant dog an
d horse type I interferons);米国特許第5,2
31,176号(1993年7月27日、DNA molecule enco
ding a human leukocyte interferon);米
国特許第5,071,761号(1991年12月10日、DNA seque
nce coding for sub−sequences of huma
n lymphoblastoid interferons LyIFN−a
lpha−2 and LyIFN−alpha−3);米国特許第4,970
,161号(1990年11月13日、DNA sequence codin
g for human interferon−gamma);米国特許第4
,738,931号(1988年4月19日、DNA containing
a human interferon beta gene);米国特許第4
,695,543号(1987年9月22日、human alpha−int
erferon Gx−1 gene)および米国特許第4,456,748号
(1984年6月26日、DNA encoding sub−sequenc
es of different, naturally, occurrin
g leukocyte interferons)。
体は、当業者に公知の、特異的変異誘発の従来の方法を使用して開発される。さ
らに、本発明は、機能的に等価なインターフェロン−β−1aポリペプチドをコ
ードする機能的に等価なインターフェロン−β−1aポリヌクレオチドを提供す
る。
、以下の条件の少なくとも1つを満たす場合、インターフェロン−β−1aをコ
ードする第2のポリヌクレオチドと比較して、「機能的に等価」である: (a)「機能的等価物」が、標準的なハイブリダイゼーション条件下で第2の
ポリヌクレオチドにハイブリダイズし、そして/または第1のポリヌクレオチド
配列へと縮重される、第1のポリヌクレオチドである。より好ましくは、それは
、インターフェロン−β−1aの[治療的]活性を有する変異体インターフェロ
ンをコードする; (b)「機能的等価物」が、第2のポリヌクレオチドによってコードされるア
ミノ酸配列についての発現をコードする第1のポリヌクレオチドである。
れらの機能的等価物を含むが、これらに限定されない。それゆえ、本明細書中で
使用される場合、用語「機能的等価物」とは、機能的等価物とみなされているイ
ンターフェロンと、哺乳動物レシピエントに対して同じかもしくは改良された有
益な効果を有するインターフェロン−β−1aタンパク質、またはそのインター
フェロン−β−1aタンパク質をコードするポリヌクレオチドをいう。当業者に
明らかなように、機能的に等価なタンパク質は、組換え技術によって、例えば、
「機能的に等価なDNA」を発現することによって、産生され得る。従って、本
発明は、天然に存在するDNAによってコードされるインターフェロン−β−1
aタンパク質、ならびに天然に存在するDNAによってコードされるのと同じタ
ンパク質をコードする天然には存在しないDNAによってコードされるインター
フェロン−β−1aを包含する。配列をコードするヌクレオチドの縮重に起因し
て、他のポリヌクレオチドは、インターフェロン−β−1aをコードするために
使用され得る。これらは、配列内の同じアミノ酸残基をコードする異なるコドン
の置換によって変更され、従ってサイレント変化が産生される、上記の配列の全
てまたは部分を含む。このような変更された配列は、これらの配列の等価物とみ
なす。例えば、Phe(F)は、2つのコドン(TTCまたはTTT)によって
コードされ、Tyr(Y)は、TACまたはTATによってコードされ、そして
His(H)は、CACまたはCATによってコードされる。反対に、Trp(
W)は、単一のコドンTGGによってコードされる。従って、特定のインターフ
ェロンをコードする所定のDNA配列について、それをコードする多くのDNA
縮重配列が存在することが理解される。これらの縮重DNA配列は、本発明の範
囲内であると考えられる。
らのタンパク質をコードするポリヌクレオチド分子の遺伝子発現を通じての、2
つ以上のタンパク質またはそのフラグメントの共線状(co−lnnear)の
共有結合をいう。タンパク質またはそのフラグメントが異なる供給源に由来する
ことが好ましい。従って、好ましい融合タンパク質は、インターフェロンではな
い第2の部分に共有結合されたインターフェロン−β−1aのタンパク質または
フラグメントを含む。詳細には、「インターフェロン−β/Ig融合物」は、N
末端またはC末端が、免疫グロブリン鎖のN末端に連結された本発明のインター
フェロン−β分子(すなわち、インターフェロン−β−1a)またはそのフラグ
メントを含むタンパク質であり、ここで免疫グロブリンのN末端の部分は、イン
ターフェロン−βと置換される。インターフェロン−β/Ig融合物の種は、免
疫グロブリンの定常ドメインの少なくとも一部に連結した、本発明のインターフ
ェロンβ分子(すなわち、インターフェロン−β−1a)を含むタンパク質であ
る「インターフェロン−β/Ig融合物」である。好ましいFc融合物は、免疫
グロブリン重鎖のC末端ドメインを含む抗体のフラグメントに連結された、本発
明のインターフェロンβ分子を含む。
かつ以下に記載のように精製タンパク質から新規に作製される第2の部分に、モ
ノ官能化分子またはヘテロ官能化分子を介して化学的に連結されるインターフェ
ロンβタンパク質を意味する。
物発現系から誘導されることを意味する。ほとんどの細菌培養(例えば、E.c
oli)において発現されるタンパク質は、グリカンを含まないので、これらの
発現系は好ましくない。酵母において発現されるタンパク質は、哺乳動物細胞に
おいて発現されるものとは異なるオリゴサッカリド構造を有し得る。
を通じて使用される場合、特定の分子が、実施例1(以下を参照こと)に示され
る型のインビトロ抗ウイルスアッセイにおいて測定されるような抗ウイルス活性
を可能にするに十分な、本明細書中に開示される本発明の形態とのアミノ酸配列
相同性を共有することを意味する。
よび他の生理学的に適合可能な成分を含む、として規定される。治療用組成物は
、賦形剤(例えば、水、ミネラル、およびタンパク質のようなキャリア)を含み
得る。
天然に存在するペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質に見出される20のア
ミノ酸が存在し、それらの全ては、L型異性体である。この用語はまた、これら
のアミノ酸のアナログならびにこれらのタンパク質アミノ酸のD型異性体および
そのアナログを含む。
存在する側鎖または末端基(インターフェロン−β−1aの場合では糖部分)が
、化学反応によって改変される。このような改変としては、例えば、以下が挙げ
られる:γ−カルボキシル化、β−カルボキシル化、PEG化、硫酸化、スルホ
ン化、リン酸化、アミド化、エステル化、N−アセチル化、カルボベンジル化(
carbobenzylation)、トシル化、および当該分野で公知の他の
改変。「誘導体化ポリペプチド」は、1つ以上の誘導体化アミノ酸および/また
は1つ以上の誘導体化糖部分(このポリペプチドがグリコシル化されている場合
)を含むポリペプチドである。
。「ポリペプチド」は、しばしば、比較的大きいポリペプチドに関して使用され
るが、「ペプチド」は、しばしば小ポリペプチドに関して使用され、当該分野に
おけるこれらの用語の使用頻度は重複し、そして変動する。用語「タンパク質」
とは、本明細書中で使用される場合、他に注記されなければ、ペプチド、タンパ
ク質およびポリペプチドをいう。
酸残基と類似の物理化学的特性を有するアミノ酸である。
チド配列における任意の変化(すなわち、欠失、置換、付加または改変)または
野生型タンパク質における任意の変化。用語「ムテイン」は、「変異体」と交換
可能に使用される。
、タンパク質のエキソンのポリヌクレオチド配列もしくはその部分、またはタン
パク質配列もしくはその部分。
浄ぼ両方に関して、0.5×SSC〜約5×SSCおよび65℃に実質的に等価
な塩および温度条件。従って、本明細書中で使用される場合、用語「標準的なハ
イブリダイゼーション条件」は、操作の規定であり、そしてハイブリダイゼーシ
ョン条件の一定範囲を包含する。より高いストリンジェンシー条件としては、例
えば、プラークスクリーン緩衝液(0.2% ポリビニルピロリドン、0.2%
Ficoll 400;0.2%ウシ血清アルブミン、50mM Tris−
HCl(pH7.5);1M NaCl;0.1% ピロリン酸ナトリウム;1
% SDS);10% 硫酸デキストラン、および100μg/mlの変性超音
波処理サケ精子DNAを用いた65℃で12〜20時間のハイブリダイゼーショ
ン工程、ならびに75mM NaCl/7.5mM クエン酸ナトリウム(0.
5×SSC)/1% SDSを用いた65℃での洗浄工程が挙げられ得る。より
低いストリンジェンシー条件としては、例えば、プラークスクリーン緩衝液、1
0% 硫酸デキストランおよび110μg/mlの変性超音波処理サケ精子DN
Aを用いた55℃で12〜20時間のハイブリダイゼーション工程、ならびに3
00mM NaCl/30mM クエン酸ナトリウム(2×SSC)/1% S
DSを用いた55℃での洗浄工程が挙げられ得る。Current Proto
cols in Molecular Biology,John Wiley
&Sons,Inc.New York,第6.3.1〜6.3.6節(198
9)もまた参照のこと。
現を制御および調節するポリヌクレオチド配列。
は、発現制御配列がポリヌクレオチド配列の転写および翻訳を制御および調節す
る場合に、発現制御配列に作動可能に連結される。用語「作動可能に連結される
(た)」は、発現されるポリヌクレオチド配列の前に適切な開始シグナル(例え
ば、ATG)を有し、発現制御配列の制御下でのこのポリヌクレオチド配列の発
現、およびこのポリヌクレオチド配列によってコードされる所望のポリペプチド
の生成を可能にするように正しいリーディングフレームを維持することを含む。
も1つの遺伝子の発現を可能にする(他の一般的例の中でも)ポリヌクレオチド
(例えば、DNAプラスミドまたはファージ)。このベクターは、細胞中で複製
され得てもよいし、複製され得なくてもよい。
プチドをコードする核酸(すなわち、ポリヌクレオチド配列)に適用される場合
には、RNAまたはDNAのポリヌクレオチド、ゲノムポリヌクレオチドの一部
、cDNAまたは合成ポリヌクレオチドを意味する。これらは、その起源または
操作により:(i)天然に関連している全てのポリヌクレオチドと関連していな
い(例えば、発現ベクターとして宿主細胞に存在するポリヌクレオチドまたはそ
の一部);あるいは(ii)天然に連結しているのではなく、核酸または他の化
学的部分に連結している;あるいは(iii)天然に存在しない。「単離される
(た)」によって、(i)例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によりイン
ビトロで増幅される;(ii)化学合成される;(iii)クローニングにより
組換え生成される;または(iv)切断およびゲル分離により精製される、ポリ
ヌクレオチド配列がさらに意味される。
るゲノムにおいて通常は連続しているコード配列の一方または両方とはすぐに連
続していない核酸である。実質的に純粋なDNAはまた、さらなる配列をコード
するハイブリッド遺伝子の一部である組換えDNAを含む。
プチドに対して適用される場合には、ポリペプチドまたはその一部を意味し、こ
れらは、その起源または操作により:(i)発現ベクターの一部の発現産物とし
て宿主細胞に存在する;または(ii)天然に連結しているのではなく、タンパ
ク質または他の化学的部分と連結している;または(iii)天然に存在しない
。「単離される(た)」によって、(i)化学合成される;または(ii)宿主
細胞において発現され、そして関連するタンパク質から精製される、タンパク質
がさらに意味される。この用語は、一般には、他のタンパク質から分離している
ポリペプチドおよび天然に存在する核酸を意味する。好ましくは、このポリペプ
チドはまた、精製するために使用される抗体またはゲルマトリクス(ポリアクリ
ルアミド)のような物質から分離される。
れた核酸と天然には関連しないプロモーターである。
、そして2つのポリペプチド分子間または2つの核酸間の配列類似性をいう。2
つの比較される配列の両方の位置が同じ塩基またはアミノ酸モノマーサブユニッ
トにより占有される場合(例えば、2つのDNA分子の各々における位置がアデ
ニンにより占有されるか、または2つのポリペプチドの各々における位置がリジ
ンにより占有される場合)、それぞれの分子は、その位置で相同である。2つの
配列間の相同性パーセントは、2つの配列により共有される適合位置または相同
な位置の数を比較された位置の数で割って100をかけた関数である。例えば、
2つの配列間で10個の位置のうち6個が適合または相同である場合、2つの配
列は60%相同である。例を挙げると、DNA配列CTGACTおよびCAGG
TTは、50%の相同性を共有する(計6個の位置のうち3個が適合している)
。一般に、2つの配列が整列されて、最大の相同性が与えられた場合、比較が行
われる。このような整列は、例えば、Needlmanら、J.Mol.Bio
l.48:443−453(1970)の方法を用いて提供され得、Align
プログラム(DNAstar,Inc.)のようなコンピュータープログラムに
より、簡便に実行され得る。相同な配列は、同一または類似のアミノ酸残基を共
有し、ここで、類似の残基は、整列された参照配列における対応するアミノ酸残
基の保存的置換または「許容された点変異」である。これに関して、参照配列に
おける残基の「保存的置換」は、共有結合または水素結合を形成する能力などを
含む、対応する参照残基に物理的または機能的に類似する(例えば、類似のサイ
ズ、形状、電荷、化学的特性を有する)それらの置換である。特に好ましい保存
的置換は、Dayhoffら、5:Atlas of Protein Seq
uence and Structure,5:補遺3,第22章:354−3
52,Nat.Biomed.Res.Foundation,Washing
ton,D.C.(1978)における「受容される点変異」について規定され
る基準を満たす物である。
中で交換可能に使用される。
て、新たな血管の増加を意味する。特に、「新脈管形成」はまた、腫瘍部位での
新たな血管の増加をいう。
I型インターフェロンレセプターを含むことが公知のタンパク質をいう。IFN
AR2鎖の細胞外部分(外部ドメイン)は、単独で、インターフェロンαまたは
インターフェロンβを結合し得る。
微生物学、組換えDNA、タンパク質化学、および免疫学の従来技術を利用する
。これらの技術は、当業者の技術範囲内である。このような技術は、文献に記載
されている。例えば、Molecular Cloning:A Labora
tory Manual,第2版(Sambrook,FritschおよびM
aniatis編),Cold Spring Harbor Laborat
ory Press,1989;DNA Cloning,第I巻および第II
巻(D.N.Glover編),1985;Oligonucleotide
Synthesis,(M.J.Gait編),1984;米国特許第4,68
3,195号(Mullisら);Nucleic Acid Hybridi
zation(B.D.HamesおよびS.J.Higgins編),198
4;Transcription and Translation(B.D.
HamesおよびS.J.Higgins編),1984;Culture o
f Animal Cells(R.I.Freshney編),Alan R
.Liss,Inc.,1987;Immobilized Cell and
Enzymes,IRL Press,1986;A Practical
Guide to Molecular Cloning(B.Perbal)
,1984;Methods In Enzymology,第154巻および
155巻(Wuら編),Academic Press,New York;G
ene Transfer Vectors for Mammalian C
ells(J.H.MillerおよびM.P.Calos編),1987,C
old Spring Harbor Laboratory;Immunoc
hemical Methods in Cell and Molecula
r Biology(MayerおよびWalker編), Academic
Press,London,1987;Handbook of Experi
ment Immunology,第I巻〜IV巻(D.M.WeirおよびC
.C.Blackwell編),1986;Manipulating the
Mouse Embryo,Cold Spring Harbor Lab
oratory Press,1986。
ムに関する。特に、本発明は、これらのタンパク質ならびにこれらの産生におい
て用いられる組換えDNA分子に関する。
達成され得る。例えば、全長インターフェロンβ−1aまたはインターフェロン
β−1aの短縮形態が、cDNAを使用する公知の組換えDNA技法によって産
生され得る(以下を参照のこと)。
ポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて設計され得る。標準の方法が、次いで、
この遺伝子を合成するために適用され得る。例えば、このアミノ酸配列は、逆翻
訳された(back−translated)遺伝子を構築するために使用され
得る。インターフェロンβ−1aについてコードし得るヌクレオチド配列を含む
DNAオリゴマーは、単一工程で作製され得る。あるいは、所望のインターフェ
ロンβ−1aの一部をコードするいくつかのより小さなオリゴヌクレオチドが、
合成され得、次いで、ともに連結される。好ましくは、インターフェロンβ−1
a部分をコードするDNA配列が、いくつかの個々のオリゴヌクレオチドとして
作製され、これらは、引き続いてともに連結される。実施例2を参照のこと。個
々のオリゴヌクレオチドは、典型的に、相補性構築のための5’突出または3’
突出を含む。
される配列(クローニングベクターまたは発現ベクターへの直接的構築のための
固有の制限部位を含む)、使用される宿主発現系(好ましくは哺乳動物細胞)を
考慮に入れる好ましいコドン、および転写される場合に、安定的に、効率的に転
写されるRNAを産生する配列によって特徴付けられる。適切な構築は、ヌクレ
オチド配列決定、制限マッピング、および適切な宿主における生物学的に活性な
ポリペプチドの発現によって確認され得る。
es)ハイブリダイゼーションにより特定の哺乳動物cDNAライブラリーをス
クリーニングするために適切なプローブとして、適切なヒトインターフェロンβ
DNA配列を使用することによって単離され得る。本発明において使用される
哺乳動物インターフェロンβには、例として、霊長類、ヒト、マウス、イヌ、ネ
コ、ウシ、ウマおよびブタのインターフェロンβが挙げられる。哺乳動物インタ
ーフェロンβは、ヒトインターフェロンβ DNA配列から誘導される一本鎖c
DNAを、哺乳動物cDNAライブラリーからインターフェロンβ cDNAを
単離するためのハイブリダイゼーションプローブとして使用して、交雑種ハイブ
リダイゼーションによって得られ得る。インターフェロン遺伝子配列を単離およ
びクローニングするために使用され得る方法の中でも、とりわけ、上記で要約さ
れる米国特許において見られる方法である。しかし、ヒトインターフェロンβ遺
伝子を含むDNAを記載する米国特許第4、738,931号(1988年4月
19日)の教示が、特定の関連性がある。
組換えDNA分子は、それで形質転換された宿主において、本発明のポリペプチ
ドの発現を指向し得る。本発明の融合ポリペプチドをコードするDNA配列は、
このような発現についての発現制御配列へ作動可能に連結されなければならない
。本発明の組換え構築物の適切な転写を提供するために、プロモーター/発現制
御配列が、グリコシル化インターフェロンβをコードするヌクレオチド配列の転
写を駆動し得るならば、適切なプロモーター/エンハンサー配列が、好ましくは
、組換えベクターへ組み込まれ得る。免疫グロブリンベースの融合タンパク質の
発現を制御するために使用され得るプロモーターには、以下が挙げられるが、こ
れらに制限されない:SV40初期プロモーター領域(BenoistおよびC
hambon、1981、Nature 290:304−310)、ラウス肉
腫ウイルスの3’長末端反復に含まれるプロモーター(Yamoamotoら、
1980、Cell 22:787−797)、ヘルペスチミジンキナーゼプロ
モーター(Wagnerら、1981、Proc.Natl.Acad.Sci
.U.S.A.78:144−1445)、メタロチオネイン遺伝子の調節配列
(Brinsterら、1982、Nature 296:39−42);ノパ
リンシンターゼプロモーター領域を含む植物発現ベクター(Heerrera−
Estrellaら、Nature 303:209−213)またはカリフラ
ワーモザイクウイルス35S RNAプロモーター(Gardnerら、198
1、Nucl.Acids Res.9:2871)、および光合成酵素リブロ
ースビスリン酸(ribulose biphosphate)カルボキシラー
ゼについてのプロモーター(Herrera−Estrellaら、1984、
Nature 310:115−120);酵母または他の真菌由来のプロモー
タエレメント(例えば、Gal4プロモーター、ADC(アルコールデヒドロゲ
ナーゼ)プロモーター、PGK(ホスホグセロールキナーゼ)プロモーター、ア
ルカリホスファターゼ(phophatase)プロモーター)、および以下の
動物の転写制御領域(これらは、組織特異性を示し、そして形質転換動物におい
て利用されている):エラスターゼI遺伝子制御領域(これは、膵臓細胞で活性
である)(Swiftら、1984、Cell 38:639−646;Orn
itzら、1986、Cold Spring Harbor Symp.Qu
ant.Biol.50:399−409;MacDonald、1987、H
epatology 7:425−515);インスリン遺伝子エンハンサーま
たはプロモーター(これは、膵臓β細胞で活性である)(Hanahanm 1
985、Nature 315:115−122);免疫グロブリン遺伝子エン
ハンサーまたはプロモーター(これは、リンパ系細胞で活性である)(Gros
schedlら、1984、Cell 38:647−658;Adamesら
、1985、Nature 318:533−538;Alexanderら、
1987、Mol.Cell.Biol.7:1436−1444);サイトメ
ガロウイルス初期プロモーター領域およびエンハンサー領域(Boshartら
、1985、Cell 41:521−530);マウス乳腺癌ウイルス制御領
域(これは、精巣細胞、乳房細胞、リンパ系細胞およびマスト細胞で活性である
)(Lederら、1986、Cell 45:485−495);アルブミン
遺伝子制御領域(これは肝臓で活性である)(Pinkertら、1987、G
enesおよびDevel 1:268−276);αフェトプロテイン遺伝子
制御領域(これは肝臓で活性である)(Krumlaufら、1985、Mol
.Cell.Biol.5:1639−1648;Hammerら、1987、
Science 235:53−58);α1−アンチトリプシン遺伝子制御領
域(これは肝臓で活性である)(Kelseyら、1987、Genesおよび
Devel.1:161−171);βグロブリン遺伝子制御領域(これは、骨
髄性細胞で活性である)(Mogramら、1985、Nature 315:
338−340;Kolliasら、1986、Cell 46:89−94)
;ミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域(これは、脳内の稀突起神経膠細胞
で活性である)(Readheadら、1987、Cell 48:703−7
12);ミオシン軽鎖−2遺伝子制御領域(これは、骨格筋で活性である)(S
ani、1985、Nature 314:283−286);ならびに性腺刺
激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域(これは、視床下部で活性である)(M
asonら、1986、Science 234:1372−1378)。LA
Cまたはβラクタマーゼプロモーターのような原核生物の発現系(Villa−
Kamaroffら、1978、Proc,Natl.Acad.Sci.U.
S.A.75:3727−3731)は、発現されるインターフェロンβがグリ
コシル化されないので、現在は、好ましくない。にもかかわらず、原核生物宿主
または真核生物宿主のいずれかにおけるインターフェロンβのグリコシル化を可
能にする原核生物の発現系は、本発明の範囲内に含まれる。
はそれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない:ワクシニアウイルス
、アデノウイルスまたはレトロウイルスベースのベクターのような、ヒトまたは
動物のウイルス;バキュロウイルスのような昆虫ウイルス;酵母ベクター;バク
テリオファージベクター(例えば、λ)、ならびにプラスミドおよびコスミドの
DNAベクター。具体的には、好ましい真核生物宿主に有用な発現ベクターには
、SV40、ウシパピローマウイルス属、サイトメガロウイルス由来の制御配列
を含むベクターが挙げられる。さらに、各特定の発現ベクター内で、種々の部位
が、これらのDNA配列の挿入について選択され得る。これらの部位は、通常、
それらを切断する制限エンドヌクレアーゼによって命名される。これらは、当業
者に、よく認識されている。本発明に有用な所定の発現ベクターが、選択される
DNAフラグメントの挿入のための制限エンドヌクレアーゼ部位を有する必要が
ないことが理解される。代わりに、ベクターは、代替の手段によってフラグント
によって結合され得る。
作動可能な連結のために選択される部位は、種々の因子(例えば、特定の制御酵
素に感受性の部位の数、ポリペプチドのサイズ、ポリペプチドがどれだけ容易に
タンパク質分解的に分解されるかなど)によって決定される。所定のDNAにつ
いてのベクターおよび挿入部位の選択は、これらの因子のバランスによって決定
される。
はリン酸カルシウム技法を使用する)、トランスフェクション、マイクロインジ
ェクション、感染、細胞銃(cell gun)、およびエレクトロポレーショ
ンを含む当該分野で公知の任意の方法を使用して、融合タンパク質を発現し得る
宿主細胞へ導入され得る。この融合タンパク質組換え核酸配列が、その細胞型に
おいてmRNAに適切に転写され、そしてその細胞がタンパク質をグリコシル化
し得る限り、任意の宿主細胞型が利用され得る。さらに、本発明の組換え核酸構
築物は、免疫グロブリンベースの融合タンパク質を産生し得る非ヒトトランスジ
ェニック動物を作製するために使用され得る。本発明の好ましい実施態様におい
て、宿主細胞は、COS細胞またはCHO細胞のような哺乳動物細胞である。
3つの一般的なアプローチによって同定され得る:(a)DNA‐DNAハイブ
リダイゼーション、(b)「マーカー」遺伝子機能の存在または非存在、および
(c)挿入される配列の発現。第1のアプローチにおいて、発現ベクターに挿入
されるインターフェロンβ−1a遺伝子の存在は、挿入される融合タンパク質遺
伝子に対して相同性である配列を含むプローブを使用する、DNA−DNAハイ
ブリダイゼーションによって検出され得る。第2のアプローチにおいて、組換え
ベクター/宿主系は、ベクターの外来遺伝子の挿入によって引き起こされる特定
の「マーカー」遺伝子機能(例えば、チミジンキナーゼ活性、G418のような
抗生物質に対する耐性、形質転換表現型、バキュロウイルスにおける閉塞体形成
)の存在または非存在に基づいて、同定および選択され得る。例えば、ポリヌク
レオチドが、ベクターのマーカー遺伝子配列を中断するように挿入される場合、
この挿入物を含む組換え体は、マーカー遺伝子機能の非存在によって同定され得
る。第3のアプローチにおいて、組換え発現ベクターは、この組換えベクターに
よって発現される外来遺伝子産物をアッセイすることによって同定され得る。こ
のようなアッセイは、例えば、バイオアッセイ系におけるこの遺伝子産物の物理
的特性または機能的特性に基づき得る。
るDNA配列を発現する際に等しい効率で機能するわけではないことが理解され
る。しかし、宿主−発現ベクター組み合わせの特定の選択が、本発明の範囲から
逸脱することなしに、本明細書に記載される原理を十分に考慮した後、当業者に
よって実施され得る。
A配列を意図する。これらの融合タンパク質は、インターフェロンβ−1aのア
ミノ酸配列によって特徴付けられるアミノ末端領域およびインターフェロンβ−
1a以外のタンパク質のドメインを有するカルボキシ末端領域を有する。このよ
うなタンパク質について好ましい一般式は、一次アミノ酸配列X−Y−Zを有す
るタンパク質であり、ここで、Xは、ヒトインターフェロンβのアミノ酸配列か
らなるアミノ酸配列、もしくはその部分を有するポリペプチドであり;Yは、任
意のリンカー部分であり;そしてZは、ヒトインターフェロンβ以外のポリペプ
チドの少なくとも一部分を含むポリペプチドである。1つの実施態様において、
部分Zは、免疫グロブリン様ドメインを含むポリペプチドの一部であり得る。こ
のような他のポリペプチドの例は、CD1、CD2、CD4、ならびにクラスI
およびクラスII主要組織適合性抗原のメンバーを含む。このようなポリペプチ
ドの例については米国特許第5,565,335号(Caponら)を参照のこ
と。
Fc領域が挙げられ得、「Fc」は、免疫グロブリン重鎖のC末端ドメインを含
む抗体のフラグメントとして本明細書で定義される。
ドは、免疫グロブリンのFc領域の少なくとも一部分へ、そのC末端を介して融
合される。インターフェロンβ−1aは、アミノ末端部分を形成し、そしてFc
領域は、カルボキシ末端部分を形成する。これらの融合タンパク質において、F
c領域は、好ましくは、定常ドメインヒンジ領域ならびにCH2およびCH3ド
メインに限定される。これらの融合体におけるFc領域はまた、ヒンジ領域の一
部分(この部分は、分子間ジスルフィド結合を形成し得る)、ならびにCH2お
よびCH3ドメイン、またはそれらの機能的等価物へ限定され得る。これらの定
常領域は、任意の哺乳動物供給源(好ましくは、ヒト)から誘導され得、そして
任意の適切なクラスおよび/またはアイソタイプ(IgA、IgD、IgM、I
gEならびにIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4を含む)から誘導さ
れ得る。
って得られるか(Maniatisら、1982、Molcular Clon
ing;A Laboratory Manual,Cold Spring
Habor,N.Y.)、または公共的に入手可能なクローンから得られ得る。
免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の定常領域をコードする遺伝子の調製のための
方法が、例えば、Robinson,R.ら、PCT出願公開番号WO87−0
2671によって教示される。インターフェロン分子またはフラグメントをコー
ドするcDNA配列は、重鎖Ig定常領域をコードするcDNAへ直接連結され
得るか、またはリンカー配列を介して連結され得る。本発明のさらなる実施態様
において、組換えベクター系が、合成ヒンジ領域を有する正しい読み枠において
インターフェロンβをコードする配列を収容するに作製される。さらに、組換え
ベクター系の一部として、RNA切断部位/ポリアデニル化部位ならびに下流配
列を含む、免疫グロブリン遺伝子の3’隣接領域に対応する核酸を含むことが、
所望され得る。さらに、組換えベクターで形質転換された細胞からの融合分子の
分泌を促進するように、免疫グロブリン融合タンパク質をコードする配列の上流
にシグナル配列を操作することが所望であり得る。
量体分子を提供する。このような多量体は、例えばIgM五量体またはIgA二
量体のような通常は多量体であるIg分子のFc領域もしくはその一部を使用し
て産生され得る。J鎖ポリペプチドが、IgM五量体およびIgA二量体を形成
し、そして安定化するために必要とされ得ることが理解される。あるいは、イン
ターフェロンβ−1a融合タンパク質の多量体が、Ig分子のFc領域について
の親和性を有するタンパク質(例えば、プロテインA)を使用して、形成され得
る。例えば、複数のインターフェロンβ−1a/免疫グロブリン融合タンパク質
が、プロテインA−アガロースビーズへ結合され得る。
を有するので、有用である。例えば、2価可溶性インターフェロンβ−1aは、
リンカー領域(部分Y)によって分離される、配列番号2のアミノ酸1〜166
の2つの縦列反復(または、配列番号1の1〜498で番号付けられる核酸によ
ってコードされるもの)(一般式におけるX部分)からなり得、これらの反復は
、免疫グロブリン定常ドメイン(部分Z)の少なくとも一部分に結合される。代
替の多価形態はまた、例えば、インターフェロンβ−1a/Ig融合体を、従来
の結合技法を使用して、臨床的に受容可能なキャリア分子、Ficoll、ポリ
エチレングリコールまたはデキストランからなる群から選択されるポリマーへ化
学的に結合することによって構築され得る。あるいは、インターフェロンβ−1
aは、ビオチンへ化学的に結合され得、そしてこのビオチンインターフェロンβ
Fc結合体は、次いで、アビジンへ結合され、4価のアビジン/ビオチン/イ
ンターフェロンβ分子を生じる。インターフェロンβ−1a/Ig融合体がまた
、ジニトロフェノール(DNP)またはトリニトロフェノール(TNP)へ共有
結合され得、そして得られた結合体は抗−DNPまたは抗−TNP−IgMで沈
殿され、インターフェロンβレセプター結合部位について10個の価数を有する
十量体結合体を形成する。
ンパク質が、従来の条件(例えば、抽出、沈殿、クロマトグラフィー、アフィニ
ティークロマトグラフィー、電気泳動など)に従って、単離され、そして精製さ
れ得る。例えば、インターフェロンタンパク質およびフラグメントは、その上に
固定されたインターフェロンレセプターを有するカラムを通してその溶液を通過
させることによって精製され得る(米国特許第4,725,669号を参照のこ
と)。結合されたインターフェロン分子は、次いで、カオトロピック塩での処理
によってまたは酢酸水溶液での溶出によって溶出され得る。免疫グロブリン融合
タンパク質は、融合タンパク質を含む溶液を、固定されたプロテインAまたはプ
ロテインG(これは、融合タンパク質のFc部分を選択的に結合する)を含むカ
ラムを通過させることによって精製され得る。例えば、Reis,K.J.ら、
Immunol.132:3098−3102(1984);PCT出願公開W
O87/00329を参照のこと。次いで、キメラ抗体が、カオトロピック塩で
の処理または酢酸水溶液での溶出によって溶出され得る。
ンターフェロン抗体カラムで、または抗免疫グロブリン抗体カラム上で精製され
、実質的に純粋なタンパク質が得られ得る。用語「実質的に純粋な」によって、
タンパク質が、それと天然で結合する不純物を含まないことが意図される。実質
的純度は、電気泳動による単一バンドによって実証され得る。
番号2のものであり、これは、発現プラスミド中CMGp261を含む真核生物
細胞によって細胞培養物中へ分泌される(実施例2を参照のこと)。このタンパ
ク質は、マウスIgのヒンジ領域ならびにCH2およびCH3定常ドメインの部
分へ融合した成熟ヒトインターフェロンβ−1aから構成される。これは、Fc
結合タンパク質であるプロテインAによって認識されるに十分なマウス免疫グロ
ブリンの部分を含む。
下に示される:(a)hisタグ化インターフェロンβ−1a融合体のcDNA
および推定アミノ酸配列それぞれについての、配列番号3および4(図1にも示
される)ならびに;(b)配列番号2のインターフェロンβ−1a/Ig融合タ
ンパク質をコードするcDNAについての配列番号1(図2にも示される)。
DNA配列 配列番号5およびアミノ酸 配列番号6を含む。配列番号5は、ヒ
トインターフェロンβDNAとヒト免疫グロブリン定常領域との間の接合部のい
ずれかの側上の11個のトリプレットコドンを示す(例えば、実施例5:配列番
号41および42)。詳細には、配列番号5において、ヒトインターフェロンβ
−1aをコードするDNAは、ヌクレオチドトリプレット568−570(AA
C)で終結し、そしてヒトIgG1定常領域をコードするDNAは、配列番号4
1のヌクレオチド番号574で始まるトリプレット(GAC)で開始する。対応
する推定アミノ酸「接合部」配列は、配列番号6に示され、そして配列番号42
に基づく。最終DNA構築物内にリンカー配列を含む別の固有の「接合部」配列
が、規定される(例えば、実施例5:配列番号43および44を参照のこと)。
この「接合部」DNAおよびアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号7および8に
示され、これは、インターフェロンβ−1a配列の末端(配列番号43内のヌク
レオチド番号570)とリンカー配列(配列番号43内のヌクレオチド571〜
581;配列番号8内のGGGGS)との間の直接的接合部のいずれかの側上の
11個のトリプレットコドンを示す。
ンターフェロンβ−1a/Ig融合タンパク質をコードする任意のDNA配列に
対する標準的条件下でのハイブリダイゼーションのために必要とされる最小のD
NAであり得る。にもかかわらず、プローブ全体が、接合部の両方の側にハイブ
リダイズし、そしてインターフェロンβ/定常領域接合部の両方の側が、ハイブ
リダイゼーションに関与する場合、より小さな配列が存在し得る。さらに、当業
者は、配列番号5または7よりも長いDNA配列も同様にハイブリダイゼーショ
ンに適切であることを理解する。当業者は、配列番号5または7のような特定の
プローブが、ポリヌクレオチドキナーゼを使用して適切に標識されたATPのリ
ン酸を用いて、一本鎖センスオリゴヌクレオチドまたは一本鎖アンチセンスオリ
ゴヌクレオチドのいずれかの5’末端を標識することによって、接合部の両側で
ハイブリダイズし得るかどうかを試験し得る。本発明の配列は、両方のオリゴヌ
クレオチドプローブへハイブリダイズしなければならず、従って両方のオリゴヌ
クレオチドプローブによって標識されなければならない。本発明が、接合部 配
列番号5または7をコードする配列を完全に変性することを包含することがさら
に理解される。
質の種々の構造形態を含む。イオン化可能なアミノ基およびイオン化可能なカル
ボキシル基の存在に起因して、例えば、インターフェロンβ融合タンパク質は、
酸性塩もしくは塩基性塩の形態であり得るか、または中性形態であり得る。個々
のアミノ酸残基はまた、酸化または還元により改変され得る。さらに、1次アミ
ノ酸構造(N末端および/またはC末端を含む)またはインターフェロン−β−
1aのグリカンは、他の化学的部分、例えばグリコシル基、ポリアルキレングリ
コールポリマー(例えば、ポリエチレングリコール(PEG:同時係属中でかつ
同一人に譲渡された出願連続番号60/104,491および60/720,2
37を参照のこと)、脂質、ホスフェート、アセチル基などともに共有結合体も
しくは凝集結合体を形成することによるか、またはアミノ酸配列変異体を作製す
ることにより改変(誘導体化)され得る。
のような組換え培養による合成によって、インターフェロンβまたはそのフラグ
メントと他のタンパク質またはポリペプチドとの共有結合体または凝集結合体を
含む。例えば、この結合体化ペプチドは、細胞膜または細胞壁の内側または外側
のその合成部位からその機能部位へのこのタンパク質の移動を翻訳と同時か、ま
たは翻訳後に方向付ける(例えば、酵母α因子リーダー)タンパク質のN末端領
域のシグナル(またはリーダー)ポリペプチド配列であり得る。インターフェロ
ンβレセプタータンパク質は、インターフェロンβ(例えば、ヒスチジン/イン
ターフェロンβ−1a融合体)の精製または同定を容易にするため付加されるペ
プチドを含み得る。インターフェロンβのアミノ酸配列はまた、ペプチドAsp
−Tyr−Lys−Asp−Asp−Asp−Asp−Lys(DYKDDDD
K)と連結され得る(Hoppら、Bio/Technology 6:120
4、1988)。後者の配列は、高度に抗原性であり、そして特異的モノクロー
ナル抗体により可逆的に結合されるエピトープを提供し、発現される組換えタン
パク質の迅速なアッセイおよび容易な精製を可能にする。この配列はまた、ウシ
粘膜エンテロキナーゼにより、Asp−Lys対の直後の残基において特異的に
切断される。
以上の保存的アミノ酸置換または1つ以上の非保存的アミノ酸置換、もしくは欠
失または挿入によって、配列番号2、4、6または8に示される配列とはインタ
ーフェロンβの配列が異なるインターフェロンβ融合Fcタンパク質またはその
生物学的に活性なフラグメントを含む。代表的に、保存的置換は、類似する特徴
を有する別のアミノ酸に対する1つのアミノ酸の置換を含み、例えば、以下の群
の中での置換である:バリン、アラニン、およびグリシン;ロイシンおよびイソ
ロイシン;アスパラギン酸およびグルタミン酸;アスパラギンおよびグルタミン
;セリンおよびトレオニン;リジンおよびアルギニン;ならびにフェニルアラニ
ンおよびチロシン。非極性疎水性アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシ
ン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンを
含む。極性中性アミノ酸は、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロ
シン、アスパラギンおよびグルタミンを含む。正に荷電した(塩基性)アミノ酸
は、アルギニン、リジンおよびヒスチジンを含む。負に荷電した(酸性)アミノ
酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含む。他の保存的置換は、当業者に
容易に知られ得る。例えば、アミノ酸であるアラニンに対して、保存的置換は、
D−アラニン、グリシン、β−アラニン、L−システイン、およびD−システイ
ンのいずれか1つから選択され得る。リジンに対して、置換は、D−リジン、ア
ルギニン、D−アルギニン、ホモアルギニン、メチオニン、D−メチオニン、オ
ルニチンまたはD−オルニチンのいずれか1つであり得る。一般的に、単離され
たポリペプチドの機能的特性における変化を誘導することが予期され得る置換は
、以下の置換である:(i)極性残基(例えば、セリンまたはトレオニン)が、
疎水性残基(例えば、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニンまたはアラニ
ン)に対して(または、によって)置換される置換;(ii)システイン残基が
、任意の他の残基に対して(または、によって)置換される置換;(iii)正
に帯電した側鎖を有する残基(例えば、リジン、アルギニンまたはヒスチジン)
が、負に帯電した側鎖を有する残基(例えば、グルタミン酸またはアスパラギン
酸)に対して(または、によって)置換される置換;または(iv)かさばる側
鎖を有する残基(例えば、フェニルアラニン)が、そのような側鎖を有しない残
基(例えば、グリシン)に対して(または、によって)置換される置換。対立遺
伝子改変体、天然の変異体、誘導された変異体、高または低ストリンジェンシー
な条件下において配列番号2、4、6または8のようなポリペプチドをコードす
る核酸にハイブリダイズするDNAによりコードされるタンパク質である、単離
された分子は、本発明に含まれる。
あるインターフェロン−β−1a変異体を開発した。これらのインターフェロン
−β−1a部分は、野生型インターフェロン−β−1aにおいては見受けられな
い新規の特性を示すので特に有用であり得る(実施例1を参照のこと)。手短に
言うと、本発明者らは、活性およびレセプター結合のために必要とされる残基を
マッピングする目的でヒトインターフェロン−β−1aの変異分析を行った。ヒ
トインターフェロン−β−1aの3−D結晶構造(Karpusasら、199
7、Proc.Natl.Acad.Sci.94:11813−11818を
参照のこと)の入手可能性は、本発明者らが、アラニン(またはセリン)置換に
対して、インターフェロンβレセプター相互作用のために利用可能な溶媒に曝露
された残基を同定することを可能とし、そして分子内結合に関与するアミノ酸を
保持することを可能にする。15個のアラニンスキャニング変異のパネルを設計
した。このパネルでは、インターフェロン−β−1aのヘリックス(A、B、C
、D、E)およびループ(AB1、AB2、AB3、CD1、CD2、DE1、
DE2)の各々の異なる領域に沿って2と8との間の残基を置換した。実施例1
を参照のこと。
細胞のアフィニティー精製のために包含された(配列番号2:図1)。これらの
変異の機能的重要性を、抗ウイルスアッセイおよび抗増殖アッセイにおいて評価
した。非放射性結合アッセイを、インターフェロンβ細胞表面レセプター(IF
NAR1/2細胞表面レセプター)に対する変異体の結合についてこれらの変異
体を分析するために開発した。さらに、インターフェロンを結合させるためにI
FNAR2−外部ドメイン(ectodomain)/Fc融合タンパク質を使
用するELISEベースのアッセイを使用して、インターフェロン−β−1aと
IFNAR2との間の表面の相互作用をマッピングした(実施例1を参照のこと
)。これらの変異分析は、N末端およびC末端が、インターフェロン−β分子の
、レセプター結合または生物学的機能に重要ではない部分に存在することを実証
した。
した。これらの効果は、特定の状況下において、インターフェロン薬物開発のた
めに有利であり得る。3つの型の効果は、以下の通りである:(a)his野生
型インターフェロン−β−1aの抗ウイルス活性よりも高い抗ウイルス活性を有
する変異体(例えば、変異体C1);(b)抗ウイルスアッセイおよび抗増殖ア
ッセイの両方において活性を示す変異体であるが、これについての抗増殖活性が
、his野生型インターフェロン−β−1aと比較して、抗ウイルス活性に関し
て不釣合いに低い、変異体(例えば、変異体C1、DおよびDE1);および(
C)機能的アンタゴニスト(例えば、A1、B2、CD2およびDE1)、これ
は、his野生型インターフェロン−β−1aと比較して、レセプター結合に関
して不釣合いに低い、抗ウイルス活性および抗増殖活性を示す。
−β−1a部分Z(例えば、免疫グロブリンのFc領域)との間のカップリング
はまた、免疫グロブリンおよびインターフェロン−β−1aがそれぞれその活性
を保持する限り、この2つの分子を一緒に結合する任意の化学反応によりもたら
され得る。この化学的連結は、多くの化学機構(例えば、共有結合、親和性結合
、インターカレーション、配位結合(coordinate binding)
および錯体形成)を含み得る。インターフェロン−β−1a部分と免疫グロブリ
ン部分との間の共有結合を発達させるための代表的なカップリング剤(すなわち
、一般式におけるリンカー「Y」)は、例えば、チオエステル、カルボジイミド
、スクシンイミドエステル、ジイソシアネート(例えば、トリレン(tolyl
ene)−2,6−ジイソシアネート)、グルテルアルデヒド(glutera
ldehyde)、ジアゾベンゼンおよびヘキサメチレンジアミン(例えば、ビ
ス−(p−ジアゾニウム−ベンゾイル)−エチレンジアミン、イミドエステルの
二官能性誘導体(例えば、ジメチルアジピンイミデート(dimethyl a
dipimidate))およびビス活性フッ素化合物(例えば1,5−ジフル
オロ−2,4−ジニトロベンゼン)のような有機化合物を含み得る。このリスト
は、当該分野において公知の種々のクラスの化学カップリング剤を網羅している
ことを意図しない。これらの多く、例えば、N−スクシニミジル−3−(2−ピ
リジルジチオ)プローブピオネート(SPDP)、1−エチル−3−(3−ジメ
チルアミノ−プロピル)カルボイミドヒドロクロリド(EDC);4−スクシニ
ミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−(2−ピリジル−ジチオ)−トルエ
ン(SMPT:Pierce Chem.Co.,Cat.#21558G)は
、市販されている。
でも、治療的組成物において使用され得る。これらの分子は、融合タンパク質、
特にIg融合体と関連する通常の利点(すなわち、変更された薬物動力学および
薬力学)を有し、増加した半減期および血管系における増加した残留時間を導く
。さらに、特に好ましいグリコシル化インターフェロン−β−1aタンパク質は
、インターフェロンβ1bと構造が類似しているが、非グリコシル化インターフ
ェロンβ1bよりも何倍も生物学的活性が大きい。Runkelら、1998、
Pharm.Res.15:641−649を参照のこと。
用であることが見出されており、そして例えば、水または受容可能な液体媒体に
希釈することにより、治療的投与のために調製され得る。投与は、非経口経路、
エアロゾル経路または経口経路のいずれかによってである。微細コロイド性懸濁
液は、蓄積(depot)効果を産生するために非経口投与のために調製され得
るか、または他方、経口経路によっては、エアロゾル処方物は、事実上、液体ま
たは乾燥粉末であり得る。乾燥した凍結乾燥状態において、または溶液処方物に
おいて、本発明のインターフェロン−β−1a融合体は、良好な貯蔵安定性を有
するはずである。
る任意の状態もしくは疾患状態の予防もしくは処置のために利用され得る。さら
に、本発明の融合タンパク質は、生物学的系または検体における構成成分、状態
または疾患状態の診断において利用され得、ならびに非生理学系における診断目
的のために、利用され得る。
もしくは潜在的に感受性であり、かつそのような処置を必要としている動物被験
体を処置する方法を意図し、この方法は、そのような動物に、上記状態または疾
患状態に治療的に有効である本発明の有効量の融合タンパク質を投与する工程を
包含する。本発明の融合体により処置されるべき被験体は、哺乳動物被験体を含
み、そして最も好ましくはヒト被験体を含む。闘われるべき特定の状態または疾
患状態に依存して、当該分野の技術範囲内で容易に決定され得るように、過度の
実験を伴わずに、動物被験体は、治療的に有効かつ安全な任意の適切な投薬量に
おいて本発明のインターフェロン−β−1a融合タンパク質を投与され得る。イ
ンターフェロンI型の種障壁という理由により、適切な種由来のインターフェロ
ンを用いて本明細書中に記載されるようなインターフェロン融合タンパク質を産
生することが必要であり得る。
明細書中に記載される特定のインターフェロン−β−1a融合体は、腫瘍および
癌(例えば、骨原性肉腫、リンパ腫、急性リンパ性白血病、乳癌、黒色腫および
鼻咽頭癌)ならびに線維症、狼瘡、および多発性硬化症のような自己免疫状態を
処置するために有用である。融合タンパク質、特に、本明細書中に記載される特
定のインターフェロンβ−1aムテインよって示される抗ウイルス活性は、ウイ
ルス疾患(例えば、ECM感染、インフルエンザ、および他の気道感染、狂犬病
、および肝炎)の処置において使用され得ることがさらに予想される。本明細書
中に記載されるタンパク質によって示されるインターフェロン−β−1aの免疫
調節活性が、自己免疫疾患おおび炎症性疾患(例えば、線維症、多発性硬化症)
の処置において使用され得ることもまた予想される。新規の血管形成(新脈管形
成または新生血管形成)を阻害するインターフェロンの能力は、本発明のタンパ
ク質を使用して、例えば、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性、角膜移植
片拒絶、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖症、皮膚潮紅、オースラーウェーバ
ー(Osler−Webber)症候群のような脈管形成疾患を処置することを
可能とする。さらに、インターフェロンの抗内皮細胞性活性が、かなり長い間、
知られており、そしてインターフェロン作用の1つの潜在的な機構が、腫瘍細胞
により産生される脈管形成因子の産生または効力を阻害することにより内皮細胞
活性を妨害し得る。いくつかの血管腫瘍(例えば、血管腫)はインターフェロン
を用いる処置に対して特に敏感である。インターフェロンαを用いる処置は、こ
の疾患について実証された唯一の処置である。本発明のインターフェロン−1a
融合タンパク質を用いる処置は、この結合体は、非結合体化インターフェロンよ
りも長期間、血管系に残存することが予期されるので、薬物動力学および薬力学
という点においてかなりの薬学的利益を提供すると予想され、従って、抗脈管形
成剤として使用するためにより効率的かつ効果的な治療を導く。実施例9を参照
のこと。
に薬学的に受容可能なエステル、塩および他の生理学的に機能的なその誘導体の
形態において投与され得る。このような薬学的処方物および医薬処方物において
、好ましくは、インターフェロン−β−1aは、1つ以上の薬学的に受容可能な
キャリアおよび必要に応じて任意の他の治療成分とともに利用される。このキャ
リアは、処方物の他の成分と適合性であるという意味において薬学的に受容可能
でなければならず、なおかつそのレシピエントに対して過度に有害であってはな
らない。インターフェロン−β−1aは、上記のような所望される薬理学的効果
を達成するに有効な量において、かつ所望される1日量を達成するに適切な量に
おいて提供される。
て特定の投与様式としては、経口、直腸、頬、局所的、鼻、眼、皮下、筋肉内、
静脈内、経皮、骨髄腔内、関節内、動脈内、クモ膜下、気管支、リンパ、腟およ
び子宮内の投与が挙げられる。経口、鼻および非経口の投与に適切な処方物が、
好ましい。
合、この処方物は、経口的または非経口的に有利に投与され得る。インターフェ
ロン−β−1aが、液体懸濁処方物または生体適合性のキャリア処方物における
粉末として使用される場合、この処方物は、経口、直腸または気管支に有利に投
与され得る。
場合、インターフェロンβ−1aは、経口的に有利に投与され得る。あるいは、
インターフェロンβ−1aは、適切なネブライザーデバイスを含む呼吸回路から
患者により吸気される粉末のガス状分散物を形成するために、キャリアガス中の
粉末の噴霧を介して、鼻腔的または気管支的に投与され得る。
得、そして薬学の分野において周知の任意の方法によって調製され得る。このよ
うな方法は、一般的に、1つ以上の補助成分を構成するキャリアに活性成分を会
合させる工程を含む。代表的に、この処方物は、この活性成分を液体キャリア、
細かく分割された固体キャリアもしくはその両方に均一かつ親密に会合させ、次
いで、必要な場合、この産物を所望の処方物の投与量形態に成形することにより
調製される。
、カシュ剤(cachet)、錠剤、またはロゼンジ)、(この単位の各々は、
予め決定された量の活性成分を、粉末または顆粒として含む)として、または水
溶液または非水性液体における懸濁液(例えば、シロップ剤、エリキシル剤、乳
剤、または一回分(draught))として提示され得る。
製され得る。圧縮錠剤は、必要に応じて、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、不活性希釈
剤、界面活性剤または排泄剤と混合される自由流動(free−flowing
)形態(例えば、粉末または顆粒)である活性化合物とともに適切な機械におけ
る圧縮によって調製され得る。粉末状ポリマー結合体と適切なキャリアとの混合
物を含む成形錠剤は、適切な機械における成形によって作製され得る。
ことにより作製され得、この溶液にはまた、任意の補助成分が添加され得る。こ
のような補助成分としては、矯味矯臭剤、適切な保存剤、糖の結晶化を遅延させ
るための薬剤、および任意の他の成分の溶解度を増加させるための薬剤(例えば
、ポリヒドロキシアルコール、例えば、グリセロールまたはソルビトール)が挙
げられ得る。
含み、これは好ましくはレシピエントの血液と等張である(例えば、生理的食塩
水溶液)。このような処方物は、血液成分または1つ以上の器官に対してその化
合物を標的化するために設計される懸濁化剤および濃稠化剤または他の微小粒子
系を含み得る。この処方物は、単一用量形態または多用量形態において示され得
る。
液を含む。このような処方物は、好ましくは鼻粘膜と適合するpHおよび等張状
態に調整される。
たは硬化脂肪カルボン酸)を伴う坐剤として示され得る。
よび等張因子と適合するように調節されること以外は、鼻噴霧に類似する方法に
よって調製される。
コール、または局所的な薬学的処方物のために使用される他の基剤)に溶解、ま
たは懸濁される本発明の結合体を含む。
剤、界面活性剤、濃稠化剤(thickener)、滑沢剤、保存剤(抗酸化剤
を含む)などから選択されるさらに1つ以上の補助成分を含み得る。
ンターフェロン−β 1aのインビトロ安定化のための適切な融合タンパク質の
提供を意図する。例えば、この融合タンパク質は、インターフェロン−β 1a
の酵素分解に対する耐性を増加させるために使用され得、貯蔵寿命、室温安定性
および研究試薬およびキットの頑健性を改善する手段を提供する。
とは解釈されるべきではない。詳細には、インビボにおいて、本明細書中に記載
される動物実験は、変更され得、故に基本的方法論の他の改変およびバリエーシ
ョンが可能であることが理解される。例えば、実施例7において、当業者は、他
のネオプテリンアッセイを使用し得るか、または使用した霊長類の数および種類
を変更し得る。実施例に対するこれらの改変およびバリエーションは、本発明の
趣旨および範囲内にあると見なされるべきである。
−1aの構造/活性研究:レセプター結合部位および機能的ドメインの分析) (A.概観) ヒトインターフェロン−β−1a(IFN−β−1a)の広範な変異分析を、
活性およびレセプター結合に必要である残基のマッピングの目的で行った。ヒト
IFN−βの3−D結晶構造(Karpusas,M.ら、1997,Proc
.Natl.Acad.Sci.94:11813−11818)の利用可能性
は、本発明者らに、レセプター相互作用のために利用可能な、溶媒にさらされて
いる残基である、アラニン(またはセリン)置換を同定することおよび分子内結
合に関与するアミノ酸を保持することを可能にした。各ヘリックス(A、B、C
、D、E)およびループ(AB、CD、DE)の別個の領域に沿って2残基〜8
残基を置換する、15アラニン置換変異のパネルを設計した。アフィニティー精
製のための6ヒスチジン残基からなるアミノ末端タグ、ならびにアミノ末端伸長
の除去のためのエンテロキナーゼリンカー配列を含めた。得られるインターフェ
ロンは、「hisタグ化インターフェロン(IFN)−β」または「His−イ
ンターフェロン−β」または「His6−インターフェロン−β」などと交換可
能に呼ばれる。
伝子構築物を変異誘発のための鋳型として使用して構築した。変異誘発ストラテ
ジーは、野生型hisタグ化IFNβ遺伝子を通して独特な制限酵素切断部位を
最初に導入する工程、次いでアラニン(またはセリン)置換変異をコードする合
成オリゴヌクレオチド二重鎖を用いて選択された制限酵素間で別個のDNA配列
を置き換える工程、を包含した。最後に、変異体IFN遺伝子を、ヒト293腎
臓細胞株中での哺乳動物細胞発現を指向するプラスミドにサブクローニングした
。
おいて評価した。非放射活性IFN結合アッセイを開発して、ヒトDaudiバ
ーキットリンパ腫細胞の表面レセプター(「IFNAR1/2複合体」)へのそ
れらの結合においてこれらの変異体を分析した。さらに、his−IFN−β変
異体とIFNAR2との間の相互作用表面をマッピングするためのアッセイを開
発した。これは、ヒトIgG1のヒンジドメイン、CH2ドメイン、およびCH
3ドメインに融合したIFNレセプタータンパク質IFNAR2細胞外ドメイン
からなるIFNAR2/Fc融合タンパク質を利用する。
らのストラテジーは、最初に、改変IFN−β遺伝子を作製することであった。
この遺伝子は、野生型タンパク質をコードするが、遺伝子にわたり散在する独特
な制限酵素切断部位を有した。その独特な部位は、変異コドンをコードする合成
オリゴヌクレオチド二重鎖についての野生型配列を交換するために使用された。
変異遺伝子の作製のために適切なヒトIFN−β−1a発現カセットを得るため
に、IFN−β cDNA(GenBank登録番号#E00029)を、PC
Rによって増幅した。IFN−β遺伝子のプラスミドpMJB107(pACY
C184の誘導体、Roseら、1988、Nucleic Acids Re
s.16(1)355を参照のこと)への最初のクローニングは、変異誘発を通
して生成される特定の制限部位を欠くプラスミド中での遺伝子の部位特異的変異
誘発を実行するために必要であった。
PCRプライマーはまた、本発明者らに、そのIFN−β遺伝子の上流かつイン
フレームでエンテロキナーゼリンカー配列を導入することを可能にした(5’P
CRプライマー 5’TTCTCCGGAGACGATGATGACAAGAT
GAGCTACAACTTGCTTGGATTCCTACAAAGAAGC−3
’(配列番号9:「BET−021」)および3’PCRプライマー 5’−G
CCGCTCGAGTTATCAGTTTCGGAGGTAACCTGTAAG
TC−3’(配列番号10:「BET−022」)ならびにプラスミドpMJB
107部位へのクローニングのために有用な隣接する制限酵素部位(BspEI
およびXhoI))。得られるDNAは、PCRフラグメントAといわれる。
ナル配列および6ヒスチジンタグを、pDSW247から生成された第2のDN
Aフラグメント(フラグメントB)からの最終構築物に導入した。プラスミドp
DSW247は、pCEP4(Invitrogen,Carlsbad,CA
)の誘導体であり、ここからEBNA−1遺伝子が欠失され、そしてこの誘導体
は、6ヒスチジンタグの上流にかつこれとインフレームに融合されたVCAM−
1シグナル配列(VCAMss)を有する。VCAMss−1/ヒスチジンタグ
カセット部分を生成するために使用されたPCRプライマーは、フラグメントB
DNAの切除を可能にする、隣接する制限酵素切断部位(NotIおよびBs
pEI)を組み込んでいるKID369(5’PCRプライマー 5’−AGC
TTCCGGGGGCCATCATCATCATCATCATAGCT−3’:
配列番号11)およびKID−421(3’プライマー 5’CCGGAGCT
ATGATGATGATGATGATGGCCCCCGGA−3’:配列番号1
2)であった。
有するプラスミドベクターを作製するために、本発明者らは、プラスミドベクタ
ーpMJB107(NotIおよびXhoI切断された)、PCRフラグメント
A(BspEIおよびXhoI切断された)、およびフラグメントB(NotI
およびBspEI切断された)からゲル精製されたDNAフラグメントを使用し
て、3方向連結(three−way ligation)を行った。連結され
たプラスミドを使用して、JA221 E.coli細胞またはXL1−Blu
e E.coli細胞のいずれかを形質転換し、そしてアンピシリン耐性コロニ
ーを拾い上げ、そして制限地図分析によってインサートについて試験した。ミニ
プレップDNAを作製し、そしてインサートの配列を、DNA配列決定によって
確認した。得られた構築物を、pCMG260と名付けた。
体の作製) プラスミドpCMG260を、多数回の変異誘発のための鋳型として使用した
(U.S.E.部位特異的変異誘発キット(Boehringer−Mannh
eim))。これは、独特な制限切断部位を、IFN−βタンパク質コード配列
に沿った位置に導入するが、タンパク質の得られる配列を変化させなかった。変
異誘発されたプラスミドを使用して、E.coliのJA221またはXL1−
Blue株のいずれかを形質転換し、そして組換えコロニーをクロラムフェニコ
ール耐性について選択した。クロラムフェニコール耐性コロニーを、さらに、D
NA制限マッピング分析によって、所望の独特な制限酵素部位の存在について試
験した。得られるIFN−βプラスミドである、pCMG275.8は、独特な
制限酵素切断部位の全セットを含み、そしてその遺伝子のDNA配列を確認した
。改変された、hisタグ化インターフェロン−β遺伝子の全DNA配列は、そ
の野生型タンパク質コード配列とともに、図1に提供される。
が導入された構造的領域(ヘリックスおよびループ)を特定する。アラニン(セ
リン)置換の全体のパネルは、ヒトIFN−βの165アミノ酸のうちの65の
変異を生じる。
グメントを表2(以下を参照のこと)に示される遺伝子コード情報を有する合成
オリゴヌクレオチド二重鎖と置換することによって作製した。種々のアラニン置
換変異体プラスミドを作製するために、ゲル精製したpCMG275.8ベクタ
ー(各IFN−β構造領域について以下のリストに示されるように、適切な制限
酵素を用いて切断した)およびオリゴヌクレオチド二重鎖(コード鎖配列は、表
2において示される)を一緒に連結した。連結混合物を使用して、E.coli
のJA221株を形質転換し、そして組換えコロニーを、アンピシリン耐性につ
いて選択した。アンピシリン耐性コロニーを、適切な制限酵素部位についてスク
リーニングすることによって変異の挿入の存在について試験した。2つの変異体
(A2およびCD2)について、クローニングストラテジーは、合成ヌクレオチ
ドの2つの二重鎖(表2に示す)を使用することを伴った。この二重鎖は相補的
な突出末端を有し、互いにおよびベクターIFN−β骨格を3工程連結で連結す
ることを可能にする。以下のリストは、表2からの変異したオリゴヌクレオチド
をクローニングするために使用された部位を例証する。このクローニングスキー
ム(サブセクションB)は、インターフェロン−β遺伝子上のこれらの独特な部
位の位置を示す。
のアラニン置換またはセリン置換を各々の変異体について示し、そして関連する
領域の下のダッシュは、野生型配列を示す。ヘリックス構造およびループ構造を
、変異体の下に実線として示す。DEループは、DヘリックスとEヘリックスと
の間のギャップにわたる。2つのさらなるアラニン置換変異体(H93A、H9
7A、およびH121A)を生成し、そして抗ウイルスアッセイにおいて分析し
て、結晶構造二量体において亜鉛をキレートするこれらのヒスチジンを変異させ
る効果を評価した。これらの変異体の両方は、抗ウイルスアッセイにおいて完全
な野生型活性を保持しており、このことは、亜鉛媒介二量体形成が、IFN−β
活性に重要ではないことを示唆する。
配列に融合された野生型遺伝子および変異体IFN−β遺伝子を、761塩基対
のNotIおよびBamHI制限フラグメントとしてゲル精製した。精製した遺
伝子を、NotIおよびBamHI切断したプラスミドベクターpDSW247
にサブクローニングした。プラスミドpDSW247は、pCEP4(Invi
trogen,Carlsbad,CA)の誘導体である。プラスミドpDSW
247は、ヒトEBNA293腎臓細胞(Invitrogen,Carlsb
ad,CA)におけるタンパク質の一過性発現のための発現ベクターである。こ
のベクターは、サイトメガロウイルス初期遺伝子プロモーターおよびこの系にお
ける高いレベルの遺伝子発現のために必要とされるEBV調節エレメント、なら
びにE.coli(アンピシリン耐性)およびEBNA293細胞(ハイグロマ
イシン耐性)についての選択マーカーを含む。連結したプラスミドを使用して、
JA221 E.coli細胞またはXL1−Blue E.coli細胞のい
ずれかを形質転換し、そしてアンピシリン耐性コロニーを拾い上げて、制限地図
分析によってインサートについて試験した。マルチプレップDNAを作製し、そ
してインサートの配列をDNA配列決定によって確認した。所望の変異した配列
を示すポジティブクローンを使用して、ヒトEBNA293腎臓細胞をトランス
フェクトした。
Chittenden,T.(1989)J.Virol.63:3016−3
025)を、10%胎仔ウシ血清、2mM グルタミン、および250μg/m
l Geneticin(Life Technologies,Gaithe
rsburg,MD)を補充したダルベッコ改変イーグル培地中のサブコンフル
エント培養物として維持した。pDSW247発現プラスミドを、リポフェクタ
ミンプロトコル(Gibco/BRL,Life Technologies)
を使用してEBNA 293細胞中に一過性にトランスフェクトした。馴化培地
を、トランスフェクションの3〜4日後に収集し、細胞細片を遠心分離によって
取り除き、そしてhis−IFN−β濃度をELISAによって定量した。
gG、抗体は精製したヒトIFN−β−1aに対して惹起された)を用いて96
ウェルELISAプレートをコーティングして実施し、そして同じポリクローナ
ルウサギIgGのビオチン化形態を、ストレプトアビジン結合西洋ワサビペルオ
キシダーゼ(HRP:Jackson ImmunoResearch,W.G
rove,PA)を用いてインターフェロン検出を可能にする二次試薬として使
用した。インターフェロン−β−1aの系列希釈(Biogen,Inc.より
購入されたAVONEX(登録商標)として)を使用して、標準濃度曲線を作成
した。EBNAトランスフェクト体からのhis−IFN−β含有馴化培地を、
希釈して、ELISAアッセイにおける10ng/mlと0.3ng/mlとの
間の範囲の濃度を有するサンプルを得た。ELISAによって決定された培地中
のIFN−βの濃度を確認するために、ウェスタンブロット分析を実行した。還
元した培養上清およびIFN−β−1a標準を、10〜20%勾配ゲル(Nov
ex,San Diego,CA)上のSDS−PAGEに供し、そしてPDV
F膜上にブロットした。免疫反応性バンドを、ウサギポリクローナル抗IFN−
β−1a抗血清(#447,Biogen,Inc.、二次抗血清はIFN−β
−1aに対して惹起された)、続いてHRR結合ロバ抗ウサギIgG(Jack
son ImmunoResearch、W.Grove、PA)を用いる処理
で検出した。
2つの異なる結合アッセイを使用して評価した。1つのアッセイは、融合タンパ
ク質IFNAR2/Fcに対するインターフェロン−β変異体の結合を測定した
。この融合タンパク質は、ヒトIgGの定常領域の部分に融合したヒトIFNA
R2レセプター鎖の細胞外ドメインを含む。IFNAR2−Fcを、チャイニー
ズハムスター卵巣(CHO)細胞中で発現し、そして製造業者の指示書(Pie
rce Chem.Co.,Rockford,IL,カタログ番号#2033
4)に従ってプロテインAセファロースアフィニティークロマトグラフィーによ
って精製した。インターフェロン−β変異体のIFNAR2−Fcへの結合を、
ELISA形式アッセイにおいて測定した。ELISAプレートを、コーティン
グ緩衝液(50mM NaHCO3、0.2mM MgCl2、0.2mM Ca
Cl2、pH 9.6)中10μg/mlのマウス抗ヒトIgG1モノクローナ
ル抗体(CDG5−AA9、Biogen,Inc.)の50μl/ウェルで、
4℃で一晩、平底96ウェルプレートをコートすることによって調製した。プレ
ートを、0.05% Tween−20を含むPBSで2回洗浄し、そしてPB
S中0.5%脱脂粉乳で、室温で1時間ブロックした。さらなる2回の洗浄後、
0.05% Tween−20を含むPBS中の0.5%ミルク(milk)中
の1μg/ml IFNAR2−Fcの50μlを各ウェルに添加し、そして室
温で1時間インキュベートし、次いでプレートをさらに2回洗浄した。インター
フェロン−β変異体のIFNAR2−Fcへの結合を、50μl/ウェルの変異
体インターフェロン−βを馴化培地(10%ウシ胎仔血清を補充したダルベッコ
改変イーグル培地(DMEM)で段階希釈した)中に添加すること、および4℃
で2時間インキュベートすることによって測定した。インターフェロン−β変異
体の希釈は、代表的には、約1μMから下方に10pMまでの範囲であった。洗
浄後、プレートに結合したインターフェロン−βを、ウサギポリクローナル抗イ
ンターフェロン抗体(#447、Biogen,Inc.)および西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ(HRP)標識化ロバ抗ウサギIgG(Jackson Imm
unoResearch)の1:1000希釈からなるカクテルの50μl/ウ
ェルを添加すること、および4℃で15分間インキュベートすることによって検
出した。2回の洗浄の後、HRP基質を添加し、そしてプレートを4℃でインキ
ュベートし、その後ELISAプレートリーダー上で450nmの吸光度を読み
とった。データを、吸光度対変異体インターフェロン−βの濃度としてプロット
し、そして変異体インターフェロン−βのIFNAR2−Fcへの結合について
の親和性を単純な双曲線式にデータを適合させることによって決定した。これら
の分析からの結果を図3に示し、ここでは、3つの実験から決定された各変異体
についての結合親和性が、His6−野生型インターフェロン−β−1aについ
て測定された親和性の割合として表される。
方のレセプター鎖(IFNAR1およびIFNAR2、これらは、ともにインタ
ーフェロン−βについてのレセプターを含む)を発現するDaudi細胞に結合
する親和性を測定した。このFACSに基づくアッセイは、インターフェロン−
βが結合したレセプターから、占有されていない(遊離の)レセプターを区別す
るために、IFNAR1、EA12(Biogen,Inc.)の細胞外ドメイ
ンに対するモノクローナル抗体をブロックすることを使用した。Dauri細胞
(2.5×107細胞/mlで20μl)を、96ウェルV底ELISAプレー
トに配置し、そして種々の濃度のインターフェロン−β変異体(20μlのFA
CS緩衝液中;5% FBS、PBS中の0.1% NaN3)とともに4℃で
1時間インキュベートした。インターフェロン−β変異体の所望の段階希釈は、
0.5μMから下方に0.5pMまでの範囲であった。各ウェルに100ngの
ビオチン化マウス抗IFNAR1モノクローナル抗体EA12(10μl)を添
加し、そしてプレートを室温で2分間インキュベートし、その後FACS緩衝液
で2回洗浄した(4℃)。次いで、細胞を、R−フィコエリトリン結合体化スト
レプトアビジン(Jackson ImmunoResearch、West
Grove,PA)の1:200希釈の50μl/ウェルとともに4℃で30分
間インキュベートし、FACS緩衝液で2回洗浄し、0.5%パラホルムアルデ
ヒドを含む300μlのFACS緩衝液に再懸濁し、そして12×75mmポリ
スチレンチューブ(Falcon 2052)に移した。次いで、サンプルをF
ACScan(Becton Dickinson)上のフローサイトメトリー
によって分析した。データを、平均チャネル蛍光強度(MFCI)対インターフ
ェロン−β変異体の濃度としてプロットし;結合親和性を、抗体染色の50%阻
害を与えるインターフェロン−βの濃度として規定した。各変異体を、複数回試
験した。図4は、本発明の方法によって決定され、各実験においてHis6−野
生型インターフェロン−β−1aについて測定された親和性の割合として表現さ
れた、各インターフェロン−βについてのレセプター結合親和性を示す。
セイを用いて機能的な活性について、そして細胞増殖を阻害するインターフェロ
ン−βの能力について試験した。各々三つ組のデータ点を伴う、最低三回の抗ウ
イルスアッセイを、各々の変異体において実施した。His6−野生型インター
フェロン−β−1aを、すべての実験において基準として含めた。この抗ウイル
スアッセイは、変異インターフェロン−βの2倍階段希釈を用いて、ウイルスに
よる細胞殺傷からの完全な抗ウイルス防御と無防御との間の範囲にわたる濃度で
、A549ヒト肺癌細胞(ATCC CCL 185)を一晩処理することによ
って実施した。次の日、この細胞を、脳心筋炎ウイルス(ECMV)を用いて、
インターフェロンの非存在下で完全な細胞の殺傷を生じる希釈度で、2日間チャ
レンジした。次いで、プレートを、代謝性色素であるMTT(2,3−ビス[2
−メトキシ−4−ニトロ−5−スルホ−フェニル]−2H−テトラゾリウム−5
−カルボキシアニリド)(M−5655、Sigma、St.Louis、MO
)を用いて発色させた。MTTのストック溶液を、PBS中に5mg/mlで調
製し、濾過滅菌し、そしてこの溶液50μlを、細胞培養液中に希釈した(10
0μl/ウェル)。室温で30〜60分間のインキュベーションに続いて、MT
T/培地溶液を捨て、細胞を、100μlのPBSを用いて洗浄し、そして最終
的に代謝された色素を、90%イソプロパノール中の1.2N塩酸100μl中
に可溶化した。生存細胞(色素の存在によって証明されるような)を、450n
mの吸光度によって定量した。データを、インターフェロン−β変異体の濃度に
対する吸光度をプロットすることによって解析し、各々の変異体の活性を、50
%の細胞が死滅する濃度として規定した。図5は、各々の実験におけるヒスタグ
化野生型インターフェロン−β−1aについて測定された活性の百分率として表
された、各変異体の活性を示す。
価した。ヒトDaudiバーキットリンパ腫細胞(ATCC#CCL 213)
を、10%の規定されたウシ胎仔血清(Hyclone、Logan Utah
)および2mMのL−グルタミンを補充したRPMI1620中に、2×105
細胞/mlで播種した。各々のウェルはまた、最終総容量100μl/ウェルの
培地中に、インターフェロン−β変異体の所定の濃度を含む;用いられたインタ
ーフェロン−β濃度を、Daudi細胞増殖の最大阻害から無阻害(すなわち、
完全な増殖)までの間の範囲にわたって選んだ。二つ組の実験点を、試験された
インターフェロン−β変異体の各々の濃度について用い、そして二つ組のセット
の未処理細胞を、すべての実験に含めた。細胞を、37℃で2日間、5%のCO 2 インキュベーター内でインキュベートし、その後50μl培地中に1μCi/
ウェルのトリチウムチミジン((メチル−3H)チミジン、Amersham
TRK758)を、各々のウェルに添加し、そしてさらに4時間インキュベート
した。細胞を、LKBプレートハーベスターを用いて回収した。そして、トリチ
ウムチミジンの取りこみをLKBβプレートリーダーを用いて測定した。二つ組
の実験値を平均化し、そして標準偏差を決定した。データを、1分あたりの平均
数 対 インターフェロン−β変異体の濃度としてプロットし、各々の変異体の
活性を、観察される増殖阻害の最大値の50%を与えるのに必要な濃度として規
定した。各々の変異体についての複数のアッセイを実施した。図6は、各実験に
おけるhisタグ化野生型インターフェロン−β−1aについて見出された活性
の百分率として表された結果を示す。
および抗増殖アッセイにおいて、タグのない野生型インターフェロン−β−1a
について見出される対応する活性の各々約3分の1の活性を有することが見出さ
れた。インターフェロン−β変異体A1−Eのすべてが同一のhisタグ配列を
そのN末端に含むので、この分子の特性に対する変異体の効果は、抗ウイルスア
ッセイ、抗増殖アッセイおよび結合アッセイにおけるこれらの変異体の活性を、
ヒスタグ化野生型インターフェロン−β−1aについて観察される活性と比較す
ることによって決定した。そうすることにおいて、本発明者らは、hisタグ化
野生型インターフェロン−β−1aと比較した変異体A1−Eの活性における変
動が、これら同一の変異体がN末端のhisタグの非存在下で有する効果と、質
的におよび量的にほぼ同一であると想定する。他の可溶性サイトカインのタグ化
または融合構築物についての等価な想定は、特に、タグ化または融合構築物のイ
ンビトロでの機能的な活性が、本明細書中の場合のように野生型サイトカインの
活性と近接する場合、アラニンスキャンニング変異誘発の技術の実施者は一般に
正しいと考える。例えば、Pearce K.H.Jrら、J.Biol.Ch
em.272:20595−20602(1997)およびJones J.T
.ら、J.Biol.Chem.273:11667−11674(1998)
を参照のこと。
型を示唆する。これらの効果は、特定の環境下でのインターフェロン薬物の開発
のために有利であり得る。この効果の3つの型は、以下である:(a)野生型イ
ンターフェロン−β−1aの活性よりも高い抗ウイルス活性を伴う変異体(例え
ば、C1変異体);(b)抗ウイルスアッセイおよび抗増殖アッセイの両方にお
いて活性を示すが、野生型インターフェロン−β−1aと比較して、抗ウイルス
活性と比較して抗増殖活性が不釣合いに低い変異体(例えば、C1、DおよびD
E1変異体);および(c)野生型インターフェロン−β−1aと比較して、レ
セプター結合と比較して不釣合いに低い抗ウイルス活性および抗増殖活性を示す
、機能的アンタゴニスト(例えば、A1、B2、CD2およびDE1)。いくつ
かの変異体が、一つを超えるクラスに分類されることが理解され得る。これらの
クラスを、以下に総説する。列挙されたこれらの例に関して、これらのクラスの
変異体を特徴付ける一方、これらの領域の他の変異体が活性に対して類似の、ま
たはさらに増強された効果を生じ得ることが理解されるべきである。
比べて約6倍高い抗ウイルス活性を有する。この変異体およびこの型の他の変異
体は、抗ウイルス効果の所定のレベルを達成するために投与されなければならな
いインターフェロン−βの量を減少するのに有用であることが予想される。投与
されるタンパク質の量を低下させることは、このタンパク質の免疫原性を減少す
ると予測され、そしてまた、メカニズムに基づかない毒性からの副作用をまた減
少し得る。このクラスの変異体は、インターフェロン−β投与の治療的利点がそ
の抗ウイルス効果から生じ、そして抗増殖効果が毒性または望まれない副作用に
寄与するといった状況において有利であると予想される。
の相対的な活性(%野生型)を、図7において比較する。同等に変化した活性(
すなわち、野生型hisタグ化インターフェロン−β−1aの活性とは、同一因
子によって異なる抗ウイルス活性および抗増殖活性)は、ほとんどの変異体にお
いて見られる(対角線上にある)。しかし、いくつかの変異体は、対角線からの
ずれによって証明されるように、野生型hisタグ化インターフェロン−β−1
aと比較して、その他と比較して一つのアッセイにおける活性により大きな変更
を示す。3つのこのような変異体を、以下の表に示す。変異体C1は、野生型ヒ
スタグ化インターフェロン−β−1aの活性よりも約6倍高い抗ウイルス活性を
示すが、抗増殖アッセイにおける活性は、野生型のそれと類似する。従って、変
異体C1は、野生型hisタグ化インターフェロン−β−1aに対して、その抗
増殖活性を5.2倍増強された抗ウイルス活性を有する。同様に、変異体Dは、
抗ウイルスアッセイにおいて野生型の活性の65%を示すが、抗増殖アッセイに
おいては野生型の活性のたった20%を示し、従って、野生型に比べてその抗増
殖活性の3.4倍増強された抗ウイルス活性を有する。変異体DE1は、抗ウイ
ルスアッセイにおいて野生型の活性の26%を示すが、抗増殖アッセイにおいて
はたった8.5%を示し、従って、野生型hisタグ化インターフェロン−β−
1aに比べてその抗増殖活性の3.0倍増強された抗ウイルス活性を有する。所
望の抗ウイルス活性のレベルに達するのに十分な濃度において投与される場合、
これらの変異体タンパク質は、野生型タンパク質より実質的に低いレベルの抗増
殖活性を示す。クラス(a)中のものと同様に、このクラスの変異体は、インタ
ーフェロン−β投与の治療的利点がその抗ウイルス効果から生じ、そして抗増殖
効果が毒性または望まれない副作用に寄与するといった状況において有利である
と予想される。
合が低い抗ウイルス活性および抗増殖活性を伴う変異体(下の表を参照のこと)
。変異体A1は、野生型hisタグ化インターフェロン−β−1aに関して観察
される活性より2.0倍および1.8倍高い抗ウイルス活性および抗増殖活性を
示すが、Daudi細胞上の同族のレセプターに野生型より29倍高い親和性で
結合する。従って、この変異体のIFN−βレセプターへの結合は、このタンパ
ク質の抗ウイルス活性および抗増殖活性に比べて約15倍増強される。同様に、
変異体B2、CD2およびDE1は、それぞれに、4.6倍、4.6倍および1
8倍の抗ウイルス活性を越える、そして3.5倍、15倍および54倍の抗増殖
活性を越える結合の増強性を示す。これらのタンパク質は、内因性IFN−β、
およびおそらく他の内因性I型インターフェロンの活性の機能的なアンタゴニス
トとして有用であることが予想される。なぜなら、これらが、レセプターに結合
する能力およびレセプターを占有する能力を有し、そしてなお野生型IFN−β
に関してみられる標的細胞における機能的な応答の単なる小さな画分を生じるか
らである。
itohおよびY.Mitsui.Rifined Crystal Stru
cture of Recombinant Murine Interfer
on−β at 2.15 Å Resolution.J.Mol.Biol
.253:187〜207(1995))およびヒトインターフェロンα−2b
(R.Radhakrishnan,L.J.Walter,A.Hruza,
P.Reichert,P.P Trotta,T.L.Nagabhusha
nおよびM.R.Walter.Zinc Mediated Dimer o
f Human Interferon−α2b Revealed by X
−ray Crystallography.Structure.4:145
3−1463(1996))に関する公表された結晶構造が、ヒトインターフェ
ロン−βのペプチド骨格のモデルを提供したが、本発明者らは、グリコシル化状
態のインターフェロン−β−1aの構造を最近解明した(M.Karpusas
,M.Nolte,C.B.Benton,W.Meier,W.N.Lips
comb,およびS.E Goelz.The Crystal Struct
ure of Human Interferon−β at 2.2 Å r
esolution.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:
11813〜11818(1997))。
関して要約され得る(本明細書中には示さず)。特定の変異残基は、活性におい
て減少を生じた(2分の1〜5分の1未満に減少した)。この変異された領域は
、表1および2に与えられた置換に対応する。
面レセプター結合の両方の劇的な減少を生じた。本発明者らのアッセイにおいて
これらの変異体のいずれもIFNAR/Fcを結合しなかったので、この領域(
A2へリックス、AB & AB2ループおよびEへリックス)は、IFNAR
2結合部位における変異に対応する。
が、細胞表面結合特性もまた、この分子の他の領域(B1へリックス、C2へリ
ックス)の残基によって影響される。IFN−β−1a分子のN末端、C末端お
よびグリコシル化Cへリックス領域がレセプター結合部位内に存在しないことが
、アラニン置換変異体の効果を示す3Dモデル(示さず)において見られ得る。
これらの領域における変異は、生物学的活性を低減せず、細胞表面レセプター結
合も低減しない。
質の発現のためのプラスミドの構築) PCR技術を使用して、マウスIgG2a重鎖分子のFc部分に融合されたヒ
トIFN−β DNA配列をコードする発現プラスミドを作製した。プラスミド
ベクターpDSW247(実施例1を参照のこと)は、EBNA−1遺伝子が欠
失されている、pCEP4(Invitrogen,Carlsbad,CA)
の誘導体である。このプラスミドを、EBNA 293ヒト腎臓細胞(Invi
trogen,Carlsbad,CA.,Shen.E.S.ら、1995、
Gene 156、235〜239)における一過性タンパク質発現のために有
用な発現ベクターの構築のために使用した。このプラスミドは、インターフェロ
ンβ配列の上流にインフレームでヒト血管細胞接着分子−I(VCAM−1)シ
グナル配列、そしてインターフェロンβおよびIg配列の接合部にエンテロキナ
ーゼリンカー配列を含むように設計された。
リされた。ヒトIFN−β遺伝子をコードするDNAフラグメントを得るために
、ヒトIFN−βのcDNAサブクローン(GenBank登録番号E0002
9)を、IFN−βの最初のコドンの上流に制限酵素切断部位(BsaI)をも
また組み込んだ、以下のプライマーを使用するPCRのための鋳型として使用し
た:
26)は、IFN−β終止コドンを除去し、そして発現ベクターへのサブクロー
ニングのために有用な、インフレームエンテロキナーゼリンカー配列(DDDD
K)およびターミナル制限酵素部位(XhoI)の両方を組み込んだ。IFN−
βコード配列の上流に導入されたBsaI部位によって、本発明者らは、IFN
−β遺伝子コード配列と上流かつインフレームでVCAM−1シグナル配列を連
結することが可能であった。このVCAM−1シグナル配列はまた、5’制限酵
素切断部位(pDSW247 NotIクローニング部位への連結のために、N
otI)および3’制限酵素切断部位(IFN−β−1a 5’PCRフラグメ
ントへの連結のために、BsaI)を含む以下のプライマー対を使用するPCR
によって生成された:
nBank登録番号X53051)であった。
マウスIgG2aフラグメントを、SalI+BamHI消化DNAフラグメン
トのゲル精製によってpEAG293から取り出した。プラスミドpEAG29
3は、マウスIgG2aのヒンジドメイン、CH2ドメインおよびCH3ドメイ
ンのBluescript IISK+(Stratagene,LaJoll
a CA,カタログ番号212205)サブクローンである(GenBank登
録番号V00798)。PCRプライマー対5’−AGGTSMARCTGCA
GSAGTCW−3’(配列番号35)、ここでS=CまたはG、M=Aまたは
C、R=AまたはG、W=AまたはT、および5’−CTGAGCTCATTT
ACCCGGAGTCCGGGAGAAGCTCTT−3’(配列番号36)は
、カセットの5’末端および3’末端にそれぞれ隣接するSalI部位およびN
otI部位を作製した。マウスIgG2a Fcドメインカセットは、単一塩基
(コドンV369)でGenBank配列とは異なり、これはサイレント変異を
生じる。従って、野生型Fcタンパク質は、このIgG2a Fcカセットから
発現される。
されたVCAM−1シグナル配列を含むDNAフラグメントを、NotI〜Ba
mHI消化によってpCMG258から切り出し、そしてゲル精製した。Sal
I部位は、元々のpDSW247プラスミド上に存在し、そしてIFN−β遺伝
子コード配列のすぐ下流にインフレームで配置される。プラスミドベクターpD
SW247を、ゲル精製NotI+BamHIフラグメントとして調製した(実
施例1を参照のこと)。上述のフラグメントを用いて3方向連結を行い、IFN
−β−1a/IgG2a融合物をコードする最終的な発現ベクターをアセンブリ
した。この発現プラスミドを、pCMG261と命名した。このプラスミドは、
成熟ヒトIFN−β、エンテロキナーゼリンカー配列およびマウスIgG2a
Fcドメインについての遺伝子と融合したVCAM−1シグナル配列を含む。融
合タンパク質の全長DNA(配列番号1)およびタンパク質配列(配列番号2)
を図2に示す。
質の生成) 組換えIFN−β/Fc発現ベクターpCMG261を、ヒトEBNA 29
3腎臓細胞に一過性にトランスフェクトし、本発明のIFN−β−1a融合タン
パク質の発現を達成した。この組換え発現プラスミドを、EBNA 293細胞
の100mm培養ディッシュについて1〜3マイクログラムのプラスミドDNA
を使用して、製造業者のプロトコル(Life Technologies,G
aithersburg,MD,Hawley−Nelson,P.,Cicc
arone,V.,Gebeyehu,G.Jessee,J.,Felgne
r,P.L.(1993)Focus 15.73)に従って、EBNA 28
3ヒト腎臓細胞において、リポフェクタミンプロトコル(カタログ番号1832
4−020,Life Technologies)によってトランスフェクト
する。細胞のリポフェクタミントランスフェクションの後の日に、培地を増殖培
地(ダルベッコ改変イーグル培地、10%ウシ胎仔血清、4mMグルタミン、2
50マイクログラムGentecin/ml(Life Technologi
es,Gaithersburg,MD))で置き換える。3〜4日後に馴化培
地を収集する。IFN−β−1a−Fcの濃度を下記の通りに決定した。
ンパク質の生成もまた、それらの系についての適切な発現ベクターへの、融合タ
ンパク質についてのタンパク質コード領域の移入の際に実施し得た。代替の発現
系としては、以下のような哺乳動物細胞発現系が挙げられる:チャイニーズハム
スター卵巣(CHO)細胞(Barsoum,J.(1995、Methods
in Mol.Biol.48、第18章、225〜237)およびNS−0
マウス細胞(Rossman,C.ら、1996、Protein Expre
ssion and Pur.7,335〜342)、ならびにCOSミドリザ
ル腎臓細胞(Ettinger,R.ら、1996、Proc.Natil.A
cad.Sci.USA,93:23,13102〜13107)。適切である
他の真核生物発現系は、酵母Pichia pastoris(Eldin,P
.E.ら、1997、J.Immun.Methods,201,67〜75)
およびSaccharomyces cerevisiae(Horwitz,
A.H.、1988、Proc.Natil.Acad.Sci.USA,85
,8678〜8682)である。
−β−1a−Fcタンパク質発現レベルの定量を、ウサギ抗IFN−β−1aポ
リクローナル抗体(抗原は、精製されたIFN−β−1aであった、Bioge
n,Inc.)のプロテインA精製IgG画分を使用して96ウェルプレートを
コートするELISAによって行った。この抗体は、10ng/mL〜0.3n
g/mLのインターフェロン濃度範囲で、IFN−β−1a標準および培養上清
を検出する。ビオチン化ウサギポリクローナル抗IFN−β−1a(上記と同じ
抗体)およびストレプトアビジン連結西洋ワサビペルオキシダーゼを使用して、
結合したインターフェロンを検出した。ELISA値を確認するために、ウェス
タンブロット分析を行った。ここで、減少させた培養上清およびIFN−β−1
a標準を、5〜20%のTris−グリシンゲル(Novex,San Die
go,CA)で泳動し、PVDF膜(Amersham Life Scien
ce,Inc.,Cleveland,OH)に移し、そして異なるウサギポリ
クローナル血清(IFN−β−1aに対して惹起される)、続いて西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ連結ロバ抗ウサギIgG(Jackson ImmunoRes
earch,West Grove,PA)抗体を用いて検出した。
ス活性) ヒト肺癌細胞(A549)を、脳心筋炎ウイルス(EMCV)でのチャレンジ
前に、IFN−β−1aまたはIFN−β−マウスIgG2a(61、41、2
7、18、12、8.2、5.5、3.7、2.5、1.6pg/mL)で24
時間、前処理した。ウイルスとの2日間のインキュベーションの後に、生存細胞
を、XTT:PMS(リン酸緩衝化生理食塩水中、それぞれ333μg/mLお
よび2ng/mLの2,3−ビス(2−メトキシ−4−ニトロ−5−スルホフェ
ニル)−2H−テトラゾリウム−5−カルボキシアニリド(carboxani
lide)内部塩:Penazineメトスルフェート(methosulfa
te))の溶液で染色し、そして450nMにて分光法によって検出した。各I
FN濃度についての三連のデータ点を用いてアッセイを行った。
50%細胞変性効果は、約0.4pMであると決定された。IFN−β−マウス
IgG2aについての50%細胞変性効果は、0.15pMであることが見出さ
れた。
パク質の構築および生成) (A.ヒトインターフェロン−β−1a/ヒトIgG1 Fc融合タンパク質
の構築) PCR技術を使用して、ヒトIgG1重鎖分子のFc部分(ヒンジドメイン、
CH2ドメインおよびCH3ドメイン)に融合されたヒトIFN−β DNA配
列をコードする発現プラスミドを作製した。
失されている、pCEP4(Invitrogen,Carlsbad,CA)
の誘導体である。このプラスミドを、EBNA 293ヒト腎臓細胞(Invi
trogen,Carlsbad,CA.,Shen.E.S.ら、1995、
Gene 156、235〜239)における一過性タンパク質発現のために有
用な発現ベクターの構築のために使用した。
ブリした:ヒトIFNβをコードする配列にインフレームでかつ融合されたVC
AM−1シグナル配列をコードするNotI/SalIフラグメント、ヒトIg
G1のヒンジドメイン、CH2ドメインおよびCH3ドメインをコードするSa
lI/NotIフラグメント、ならびにEBNA発現ベクターpCH269のN
otIフラグメント。
ナル配列をコードする2つの異なるNotI/SalIフラグメントを、PCR
技術によって作製した。PCR鋳型は、ヒトIFN β遺伝子(これ自体、エン
テロキナーゼリンカー配列にインフレームでかつ融合されている)にインフレー
ムでかつ融合された成熟VCAM−1シグナル配列をコードするプラスミドpC
MG258(上記の実施例2を参照のこと)であった。2つのセットのPCRプ
ライマーを使用した。以下のプライマーの1セットは、162位でのGからCへ
のアミノ酸変化を導入した:
換を導入し、そしてエンテロキナーゼリンカー配列(DDDDK)を、ヒトIF
N β遺伝子にインフレームで3’側に融合されたGGGGSリンカー配列に変
更した:
の両方のセットは、pCH269への連結を可能にする5’NotI部位、およ
びヒトIgG1のSalI/NotIフラグメントとの連結を可能にする3’S
alI切断部位を含む。
ドするヒトIgG1フラグメントを、プラスミドpEAG409(プラスミドS
AB144の誘導体(米国特許第5,547,853号に記載される))の制限
酵素(SalI/NotI)消化によって調製した。このDNAフラグメントを
切り出し、そしてゲル精製した。EBNA発現ベクタープラスミドpCH269
を、NotIで消化し、そしてゲル精製した。
によって作製した。ZL6206と呼ばれる1つの構築物は、G4Sリンカーを
含む;ZL5107と呼ばれるもう1つの構築物は、直接融合物である。この直
接融合物のオープンリーディングフレームの全長DNAおよびタンパク質配列(
図10を参照のこと)をそれぞれ、配列番号41および配列番号42に示す。リ
ンカー融合物のオープンリーディングフレームの全長DNAおよびタンパク質配
列(図11を参照のこと)をそれぞれ、配列番号43および配列番号44に示す
。
ヒトIgG1 Fc融合CHOの安定な発現構築物を作製した。ヒトIFNβ−
ヒトIgG1 Fcフラグメントを、NotIを用いてプラスミドZL5107
から切り出し、そしてゲル精製した;このフラグメントを、pEAG347のN
otI部位に連結した。pEAG347は、タンデムなSV40初期プロモータ
ーおよびアデノウイルス主要後期プロモーター[pAD2βプラスミドに由来す
る]、唯一のNotIクローニング部位、続いて、SV40後期転写終結シグナ
ルおよびポリAシグナル[pCMVβプラスミドに由来する]を含む発現ベクタ
ーである。pEAG347は、pUC19由来のプラスミド骨格およびpSV2
dhfr由来dhfrを、トランスフェクトされたCHO細胞におけるMTX選
択および増幅のために含む。
の哺乳動物細胞における生成) (ヒトIFNβ融合構築物のEBNA293細胞への一過性トランスフェクシ
ョン): 上記の組換えIFN−β/ヒトIgG1 Fc発現ベクターを、ヒトEBNA
293腎臓細胞中に一過性でトランスフェクトして、本発明のIFN−β−1a
融合タンパク質の発現を達成した。これらの組換え発現プラスミドを、リポフェ
クタミンプロトコル(カタログ番号18324−020、Life Techn
ologies)によって、上記の実施例3に記載のプロトコルに従ってEBN
A293ヒト腎臓細胞中にトランスフェクトした。
hfr− CHO細胞への安定なトランスフェクション): 上記の組換えIFN−β/ヒトIgG1 Fc(リンカーなし)dhfr含有
発現ベクターを、dhfr− CHO細胞中に安定にトランスフェクトして、本
発明のIFN−β−1a融合タンパク質の発現を達成した。この組換え発現プラ
スミドを、エレクトロポレーションによってトランスフェクトし、そしてポジテ
ィブクローンの選択を、以下のプロトコルに従って達成した: BglIIを用いて消化したプラスミドDNA(20mcg)を沈澱させ、8
00mclのHEPES緩衝液中に再懸濁し、そして10×107 CHO細胞
/mlになるように添加した。エレクトロポレーションの後、細胞を、DMEM
完全培地にて2日間培養した。次いで細胞を、完全DMEM/透析した10%
FBSを有する20〜40個の10cmディッシュに分け、そして5日間培養し
た後に、細胞を、漸増する(50〜200ng)濃度のMTXをDMEM中に含
む選択培地に2週間にわたって移した。2週間の終わりに、細胞の単コロニーを
選択し、そして増殖させた。22個のCHOクローンに由来する上清を、抗ウイ
ルスアッセイにおいて試験した。
セイにおいて決定した。このアッセイにおいて用いられる60MU/mgの比活
性のインターフェロン−ベータ−1a標準に基づいて、一過的に(EBNA)発
現された、リンカーを有するヒトインターフェロン−β−1a/ヒトIgG1
Fc融合タンパク質の活性は900U/mlであり、そしてリンカーを有さない
ものの活性は440U/mlであった。CHO発現ヒトインターフェロン−β−
1a/ヒトIgG1 Fc融合タンパク質の活性は50U/mlであった。
/マウスIgG2a融合タンパク質を用いて処置したマウスの血漿における、イ
ンターフェロン−β−1a抗ウイルス活性の測定) マウス(C57/B16)に、尾静脈を通して50,000単位のインターフ
ェロン−β−1a(バルク)または5,000単位のインターフェロン−β−1
a−マウスIgG2a融合タンパク質をi.v.注射する。等しい容量のリン酸
緩衝液をコントロールとして与える。
(すぐ、0.25時間、1時間、4時間、24時間および48時間)でサンプリ
ングする。1つの時点あたり少なくとも3つのマウスが存在する。全血を、抗凝
固剤を含むチューブに収集し、細胞を除去し、そして得られる血漿をアッセイの
ときまで凍結する。血漿サンプルを、無血清アッセイ媒体中に1:10希釈し、
そして0.2μmシリンジフィルターを通過させる。
トの指定したウェル中に力価測定する。標準のインターフェロン−β−1a(1
0、6.7、4.4、2.9、1.3、0.9および0.6U/ml AVON
OX)および4つのサンプルを、全てのプレートで行った。細胞を、EMCウイ
ルスを用いるチャレンジの前に、サンプルを用いて24時間にわたって前処理す
る。ウイルスを用いた2日間のインキュベーションに続いて、生存細胞を、MT
Tの溶液(リン酸緩衝液中5mg/ml)を用いて1時間染色し、リン酸緩衝液
を用いて洗浄し、そしてイソプロパノール中の1.2N HClを用いて可溶化
する。細胞を、450nmで読み取った。標準曲線を各プレートについて作成し
、そしてこれを用いて各サンプル中のインターフェロン−β−1a活性の量を決
定する。異なるマウスからのサンプルにおける活性を、図9において、時点に対
するグラフにする。
慢な損失は、融合タンパク質サンプルの半減期が、改変していないインターフェ
ロン−β−1aコントロールの半減期よりもずっと長いことを示す。この研究か
らの第2の非常に重要な知見は、15分および60分の時点での類似の高レベル
の活性によって証明されるように、ごくわずかな融合タンパク質が、分布相の間
に失わることを示した。このデータは、コントロールのインターフェロン−β−
1aとは異なり、インターフェロン−β−1a融合タンパク質の分布が脈管構造
に主に制限されることを示す。
フェロン−β−1a(100mMリン酸ナトリウム、200mM NaCl、p
H7.2中の処方されていないバルクの中間体AVONEX(登録商標)インタ
ーフェロン−β−1aとして)を用いて行い、霊長類におけるそれらの相対安定
性および活性を決定する。これらの研究では、霊長類におけるこのインターフェ
ロン−β−1a融合物の薬物動態学および薬力学を、ネイティブなインターフェ
ロン−β−1aの薬物動態学および薬力学と比較し、そして合理的な推測がヒト
にまで広げられ得る。
ン−β−1aとの比較薬物動態学および薬力学を評価するための並行群の反復用
量研究である。
の動物を、試験物品の投与前14日以内に2回、Lab Animal Vet
erinaryによって不健康の徴候について評価する;1回の評価は、最初の
試験物品の投与24時間以内でなければならない。健常な動物のみが、試験物品
を受ける。評価は、一般的な身体検査、ならびに基準線臨床病理およびインター
フェロン−β−1aに対する基準線抗体レベルについての投与前採血を含む。全
ての動物を計量し、そして体温を、試験物品投与の前24時間以内に記録する。
を融合物または非融合物のいずれかであるが他の点では同一のインターフェロン
−β−1aとして受けるように3体ずつの群に割り当てられる。投与は、皮下(
SC)経路または静脈内(IV)経路いずれかによる。6体の雄性動物は、試験
物品をIV経路によって受け(3/処置)、そして別の6体の雄性動物は、試験
物品をSC経路によって受ける(3/処置)。全ての動物は、インターフェロン
−β処置に対して未処置(naive)でなければならない。各動物は、2回投
与される:用量は、4週間間隔をあける。用量の容量は1.0mL/kgである
。
.5、1、1.5、2、4、6、8、12、24、48、72および96時間後
に採血する。インターフェロン誘導性生物学的応答マーカーである血清ネオプテ
リン(neopterin)の測定のための血清サンプルを、試験薬物の投与の
0、24、48、72、96、168、336、504時間後に採血する。
れる臨床観察を含む。毎日、ケージ横(cageside)で観察を行い、全体
的外観、毒性の徴候、不快、および行動の変化を記録する。体重および体温を、
定期的な間隔で投与後21日を通して記録する。
セイを用いて定量する。CPEアッセイは、インターフェロン媒介抗ウイルス活
性のレベルを測定する。サンプル中の抗ウイルス活性のレベルは、血液を採血し
た時点でそのサンプル中に含まれる活性なインターフェロンの分子数を反映する
。このアプローチは、インターフェロンβの薬物動態学を評価する標準方法であ
る。現在の研究において用いられるCPEアッセイは、インターフェロンβが、
ヒト肺癌細胞(A549,#CCL−185,ATCC,Rockville,
MD)を脳心筋炎(EMC)ウイルスに起因した細胞傷害性から保護する能力を
検出する。この細胞を、血清サンプルを用いて15〜20時間にわたってプレイ
ンキュベーションして、インターフェロン誘導性タンパク質の誘導および合成を
可能にし、その後、このタンパク質は抗ウイルス応答を開始させる。その後、E
MCウイルスを添加し、そしてさらに30時間インキュベートした後、細胞傷害
性の評価をクリスタルバイオレット染色を用いて行う。内部インターフェロンβ
標準ならびにインターフェロン−β−Ig内部標準を、各アッセイプレート上で
サンプルを用いて同時に試験する。この標準は、天然のヒト線維芽細胞インター
フェロン参照標準(WHO Second International St
andard for Interferon,Human Fibrobla
st,Gb−23−902−53)に対して較正される。各アッセイプレートは
また、いずれの種類のインターフェロンβもEMCも含まない細胞増殖コントロ
ールウェルを含み、そしてウイルスコントロールウェルは、細胞およびEMCを
含むがインターフェロンβを含まない。標準およびサンプルを含むコントロール
プレートもまた調製して、細胞増殖に対するサンプルの効果(ある場合)を決定
する。これらのプレートを、ウイルスの添加を行わずに染色する。
験して、1サンプルあたり4つのデータ点を得る。4つの複製についての相乗平
均濃度を記録する。このアッセイにおける検出限界は、10ユニット(U)/m
lである。
する。
Lake City,UT)を用いて、データを薬物動態学的モデルに適合させ
る。相乗平均濃度を、各群について時間によってプロットする。アッセイ結果は
希釈で表されるので、相乗平均は、相加平均よりも適切であると考えられる。血
清インターフェロンレベルを基準線値に調整し、そして検出可能でない血清濃度
を5U/mlに設定する。これは、検出の下限の2分の1を表す。
能な血清濃度に適合させ、そしてSCデータを2区画注射モデルに適合させる。
nsulting Inc.,Apex,NC)ソフトウェアを用いて、SC注
射およびIM注射後の排出半減期を算出する。
らの最大変化であるEmaxを算出する。Cmax、AUCおよびEmaxを、一元(o
ne−way)分散分析に供して提示して、投与群を比較する。CmaxおよびA
UCを、分析前に対数変換する;相乗平均を記録する。
る能力の評価) ヒト静脈内皮細胞(Cell Systems,カタログ#2V0−P75)
およびヒト皮膚微小血管内皮細胞(Cell Systems,カタログ#2M
1−C25)を、CS−C培地キット(Cell Systems,カタログ#
4Z0−500)を用いる培養中で維持する。実験24時間前に、細胞をトリプ
シン処理し、そしてアッセイ培地(90% M199および10%ウシ胎児血清
(FBS))中に再懸濁し、そして所望の細胞密度に調整する。次いで、細胞を
、ゼラチンでコーティングした24ウェルプレートまたは96ウェルプレートに
、12,500細胞/ウェルまたは2,000細胞/ウェルのいずれかで、それ
ぞれプレートする。
塩基性線維芽細胞増殖因子(Becton Dickinson,カタログ#4
0060)および種々の濃度の、融合インターフェロン−β−1aタンパク質お
よび非融合のインターフェロン−β−1aタンパク質またはポジティブコントロ
ール(エンドスタチンは、bFGFに対する抗体がポジティブコントロールとし
て用いられ得るように、ポジティブコントロールとして用いられ得る)を含有す
る、新鮮な培地で置換する。最終容量を、24ウェルプレートで0.5mlに、
または96ウェルプレート中で0.2mlに調整する。
Quant蛍光読み取りのために凍結するか、または[3H]チミジンで標識す
る。
ビボで抗脈管形成効果を示し得る、内皮細胞増殖に対する効果について試験する
。O’Reilly,M.S.,T.Boehm,Y.Shing,N.Fuk
al,G.Vasios,W.Lane,E.Flynn,J.Birkhea
d,B.Olsen,およびJ.Folkman,(1997),Endost
atin:An Endogenous Inhibitor of Angi
ogensis and Tumor Growth.Cell 88,277
−285を参照のこと。
び抗新生脈管形成効果を試験するためのインビボモデル) 種々のモデルを、本明細書中に記載の分子の抗脈管形成効果および抗新生脈管
形成効果を試験するために開発した。これらの分子のいくつかは、米国特許第5
,733,876号(1998年3月31日:「Method of inhi
biting angiogenesis」)および同第5,135,919号
(1992年8月4日:「Method and pharmaceutica
l composition for the inhibition of
angiogenesis」)に記載されている。他のアッセイとしては、以下
が挙げられる:S.TaylorおよびJ.Folkman;Nature,2
97,307(1982)およびR.Crum.S.SzaboおよびJ.Fo
lkman;Science.230.1375(1985)の外皮のない絨毛
尿膜(CAM)アッセイ;Folkman,J.ら;J.Exp.Med.,1
33,275(1971)のマウス背側(dorsal)肺胞嚢法の抗脈管形成
(antigiogenesis)モデルおよびGimbrone,M.A.J
r.ら,J.Natl.Cancer Inst.52,413(1974)の
ラット角膜微小ポケットアッセイ。このラット角膜微小ポケットアッセイでは、
EVA(エチレン−ビニルアセテートコポリマー)ペレット中に含浸した500
ngの塩基性FGF(ウシ、R & D Systems,Inc.)を各角膜
に移植することによって、Sprague−Dawley系統(Charles
,River,Japan)の成体雄性ラットにおいて角膜の血管新生が誘導さ
れる。
ついて試験するための他の方法としては、オリジナルのCancer Chem
otherapy Reports,第3部,第3巻,第2号,1971年9月
および増補のIn Vivo Cancer Models,1976−198
2,NIH刊行物番号84−2635,1984年2月に記載されるような、新
規の潜在的な抗癌剤をスクリーニングするためのプロトコルが挙げられる(が、
これらに限定されない)。げっ歯類モデルにおけるインターフェロンβ誘導物の
抗脈管形成活性を評価するためには、I型インターフェロンの種障壁があるので
、げっ歯類インターフェロン−β/:Ig融合物調製物を作製する。このような
スクリーニング方法は、皮下に移植したLewis Lung Carcino
maに対するマウスインターフェロン−β/Ig融合物の抗脈管形成効果につい
て試験するためのプロトコルによって例示される。
に移植する。試験薬剤(すなわち、本発明の融合タンパク質)を、腫瘍移植後、
複数日、種々の用量で皮下(SC)または腹腔内(IP)に投与する。測定する
パラメーターは、中間生存時間である。結果を、コントロール生存時間の百分率
として表す。
少体重として、3gの体重範囲内にあるべきである 性別:1つの性別を全ての試験について用い、そしてコントロール動物を1つ
の実験において用いる 供給源:可能であれば、1つの実験における全ての動物について1つの供給源
。
ントロール化合物を試験する。材料を調製する。死亡を毎日記録する。 1日目:培養物をチェックする。汚染されていた場合、実験物を捨てる。動物を
ランダム化する。指示されたように処理する(1日目および翌日)。 2日目:培養物を再度チェックする。汚染されていた場合、実験物を捨てる。 5日目:2日目および日の最初の試験薬物毒性評価を検量する。 14日目:初期死亡日を調節する。 48日目:採取なしの日を調節する。 60日目:実験を終了し、そして評価する。肺を肉眼で(grossly)腫瘍
に関して検査する。
射の用量のCytoxan))を全ての奇数番号の実験物において予定し、その
レジメンは、1日目のみが腹腔内である。ポジティブコントロールに関する、よ
り低い試験/コントロール限界は140%である。受け入れ可能な未処理のコン
トロール中間生存時間は、19〜35.6日である。
ての平均動物体重を計算し、全ての試験群について試験/コントロール比を算出
する。開始(staging)日および最終評価日についての平均動物体重を計
算する。試験/コントロール比を、5日目に65%を越える生存動物(surv
ivor)を有する全ての試験群について計算する。86%未満の試験/コント
ロール比の値は、毒性を示す。過度の体重変化の相違(試験−コントロール)も
また、毒性の評価の際に用いられ得る。
必要であるとみなされる。150%以上の再現性のある試験/コントロール比の
値は、有意に活性であるとみなされる。
は「His6−タグ化」とも呼ばれる)のcDNAおよび推定アミノ酸配列。h
is IFN−β−1aの全長DNAおよびタンパク質配列が、示される。切断
されたVCAM−1シグナル配列は、ヒスチジンタグ(His6、4〜9位)の
上流に3つアミノ末端残基(SerGlyGly)を残す。エンテロキナーゼリ
ンカー配列(AspAspAspAspLys)は、スペーサー(10〜12位
、SerSerGly)によってヒスチジンから離れる。天然のIFN−β−1
aタンパク質部分は、位置(Met18〜Asn183)に及ぶ。
。ヒトIFN−β−1aタンパク質配列は、アミノ酸残基1〜166(DNA配
列1〜498)に及ぶ。エンテロキナーゼリンカー配列は、アミノ酸残基167
〜171(DNA配列499〜513)に及ぶ。マウスIgG2a重鎖タンパク
質配列は、残基172〜399(DNA配列514〜437)に及ぶ。
ター鎖の細胞外ドメインから構成されるダイマー融合タンパク質(IFNAR2
/Fc)への結合。アラニン置換型IFN変異体(A1−E)のIFNAR2レ
セプター鎖に対する結合親和性を、実施例1に記載される通りに決定した(小節
D)。このヒストグラムは、野生型his−IFN−βに対するこのアッセイに
おけるこれらの結合親和性を示す(%w.t.)。この%w.t.値を、(野生
型his−IFN−βの親和性)/(変異体IFN−βの親和性)×100とし
て計算した。複数のアッセイ(n=3)についての%w.t.(x)および実験
セットについての平均%w.t.(x)を、示す。変異体A2、AB1、AB2
およびEは、野生型his−IFN−β EC50(*)よりも500倍高い濃
度でIFNAR2/Fcを結合しなかった。
リンパ腫細胞上に発現されるI型インターフェロン細胞表面レセプター複合体(
「IFNAR1/2」複合体)への結合。アラニン置換型変異体(A1−E)の
レセプター結合特性を、FACSに基づく、実施例1に記載されるような細胞表
面レセプター結合アッセイを使用して決定した(小節D)。このヒストグラムは
、野生型his−IFN−βに対するこのアッセイにおけるこれらのレセプター
結合親和性を示す(%w.t.)。各変異体についての%w.t.を、(野生型
his−IFN−βの親和性)/(変異体IFN−βの親和性)×100として
計算した。このヒストグラムの下での複数のアッセイからの%w.t.値(白丸
)および実験セットについての平均%w.t.値(x)を、示す。
型変異体(A1−E)の抗ウイルス活性を、実施例1に記載されるようにEMC
ウイルスを用いてチャレンジされたヒトA549細胞上で決定した(小節E)。
このヒストグラムは、野生型his−IFN−βに対するこのアッセイにおける
これらの活性を示す(%w.t.)。この%w.t.を、変異体IFN−βの濃
度(50%cpe)/野生型his−IFN−βの濃度(50%cpe)×10
0の逆関数(inverse)として計算した。複数のアッセイについての%w
.t.(白丸)および実験データセットについての平均(x)を、示す。
異体(A1−E)の抗増殖活性を、実施例1に記載されるようにDaudi B
urkittリンパ腫細胞上で決定した(小節E)。このヒストグラムは、野生
型his−IFN−βに対するこのアッセイにおけるこれらの活性を示す(%w
.t.)。この%w.t.を、(野生型his−IFN−βの濃度(50%増殖
阻害))/変異体IFN−βの濃度(50%増殖阻害)×100として計算した
。複数のアッセイについての%w.t.(白丸)および実験データセットについ
ての平均(x)を、示す。
抗増殖活性。抗ウイルスアッセイ(x軸)および抗増殖アッセイ(y軸)におけ
るアラニン置換型変異体(A1−E)の相対的活性を、比較した。図5および図
6に示される野生型his−IFN−βの平均パーセント(%w.t.(x))
を、この比較について使用した。活性において座標の損失/取得を伴うこれらの
変異体は、垂線上かまたは垂線に非常に近くにある。抗ウイルス活性または抗増
殖活性において不釣合いな損失/取得を伴うこれらの変異体は、対角線から有意
に低下する(DE1、D、C1)。有意性を、使用される平均%w.t.値に固
有な標準偏差を考慮して決定した。
に示される濃度でインターフェロン−β−1a(AVONEX(登録商標)とし
て使用される)またはインターフェロン−β−1a/マウスIg2a融合物の活
性を、EMCウイルスでチャレンジしたヒト肺癌腫細胞(A549)を用いた抗
ウイルスアッセイにおいて評価した。ウイルスとともに2日間インキュベートし
た後に、生存細胞をMTTで染色し、プレートを450nmで読みとり、そして
吸光度(細胞生存性を反映している)をY軸に示す。標準偏差をエラーバーで示
す。提供されたインターフェロン−β−1a(AVONEX(登録商標)バルク
中間体として使用される)の濃度(最大OD450の50%)、従って50%の
ウイルス殺傷(「50%細胞変性効果」)は、約0.4pMであり、そしてイン
ターフェロン−β−1a融合物の50%細胞変性効果は約0.15pMであった
。
aで処置したマウスの血漿におけるインターフェロン−β抗ウイルス活性の測定
) 50,000ユニットのインターフェロン−β−1a(AVONEX(登録
商標)バルク中間体として使用される)または50,000ユニットのインター
フェロン−β−1a/Fc融合物のいずれかを、マウスにiv注射した。これら
のマウスからの血液を、X軸に示されたインターフェロン注射して種々の時間の
後に、眼窩採血することにより得た。各時点で少なくとも3匹のマウスから採血
し、そして血漿を調製し、そしてインターフェロン−β活性を脳心筋炎ウイルス
でチャレンジしたヒト肺癌腫細胞(A549)を使用する抗ウイルス性アッセイ
において評価するときまで凍結した。生存細胞をMTTの溶液で染色し、プレー
トを450nmで読みとって、吸光度(細胞生存性およびインターフェロン−β
活性を反映する)を決定した。標準曲線を、インターフェロン−β−1aをAV
ONEX(登録商標)として使用した各プレートについて生成し、そしてこの標
準曲線を用いて各サンプルにおけるインターフェロン−β活性の量を測定した。
個々の動物のデータを示す。
ンリーディングフレームの全長DNA配列およびタンパク質配列。
ンリーディングフレームの全長DNA配列およびタンパク質配列。
ンリーディングフレームの全長DNA配列およびタンパク質配列。
ZL6206)のオープンリーディングフレームの全長DNA配列およびタンパ
ク質配列。
ZL6206)のオープンリーディングフレームの全長DNA配列およびタンパ
ク質配列。
ZL6206)のオープンリーディングフレームの全長DNA配列およびタンパ
ク質配列。
Claims (31)
- 【請求項1】 アミノ酸配列X−Y−Zを有する単離されたポリペプチドで
あって、ここで、Xは、グリコシル化インターフェロン−βのアミノ酸配列を含
むアミノ酸配列またはその一部を有するポリペプチドであり; Yは、必要に応じたリンカー部分であり;そして Zは、グリコシル化インターフェロン−β以外のポリペプチドの少なくとも一部
を含むポリペプチドである、単離されたポリペプチド。 - 【請求項2】 Xが、インターフェロン−β−1aである、請求項1に記載
の単離されたポリペプチド。 - 【請求項3】 請求項1に記載の単離されたポリペプチドであって、ここで
、Xは、以下の特性の少なくとも1つを有する変異体である:(a)該変異体は
、野生型インターフェロン−β−1aよりも高い抗ウイルス活性を有し、ここで
、該抗ウイルス活性は、ウイルスに誘導された細胞の溶解によって測定される;
(b)該変異体は、野生型インターフェロン−β−1aと比較して、抗増殖活性
よりも大きな抗ウイルス活性を有する;(c)該変異体は、インターフェロンレ
セプターを結合するが、野生型インターフェロン−β−1aと比較される場合、
そのレセプター結合活性と比較して、低められた抗ウイルス活性および低められ
た抗増殖活性を有する、単離されたポリペプチド。 - 【請求項4】 前記インターフェロン−β−1aが誘導体化されている、請
求項2に記載の単離されたポリペプチド。 - 【請求項5】 前記誘導体がポリアルキルグリコールポリマーである、請求
項4に記載の単離されたポリペプチド。 - 【請求項6】 Zが、免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部である、
請求項1に記載の単離されたポリペプチド。 - 【請求項7】 請求項6に記載の単離されたポリペプチドであって、ここで
、前記定常領域の少なくとも一部が、クラスIgM、クラスIgG、クラスIg
D、クラスIgAおよびクラスIgEから選択されるクラスの免疫グロブリン由
来である、単離されたポリペプチド。 - 【請求項8】 前記クラスがIgGである、請求項7に記載の単離されたポ
リペプチド。 - 【請求項9】 前記定常領域の少なくとも一部が、少なくともヒンジドメイ
ン、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含む、請求項6に記載の単離された
ポリペプチド。 - 【請求項10】 グリコシル化インターフェロン−βまたはその一部のアミ
ノ酸配列からなるアミノ末端領域を有し、そしてグリコシル化インターフェロン
−β以外のタンパク質の少なくとも一部を含むカルボキシ末端領域を有する、融
合タンパク質。 - 【請求項11】 Xが、インターフェロン−β−1aである、請求項10に
記載の単離されたタンパク質。 - 【請求項12】 請求項10に記載の単離されたタンパク質であって、ここ
で、Xは、以下の特性の少なくとも1つを有する変異体である:(a)該変異体
は、野生型インターフェロン−β−1aよりも高い抗ウイルス活性を有し、ここ
で、該抗ウイルス活性は、ウイルスに誘導された細胞の溶解によって測定される
;(b)該変異体は、野生型インターフェロン−β−1aと比較して、抗増殖活
性よりも大きな抗ウイルス活性を有する;(c)該変異体は、インターフェロン
レセプターを結合するが、野生型インターフェロン−β−1aと比較される場合
、そのレセプター結合活性と比較して、低められた抗ウイルス活性および低めら
れた抗増殖活性を有する、単離されたタンパク質。 - 【請求項13】 前記インターフェロン−β−1aが誘導体化されている、
請求項11に記載の単離されたタンパク質。 - 【請求項14】 前記誘導体がポリアルキルグリコールポリマーである、請
求項13に記載の単離されたタンパク質。 - 【請求項15】 前記インターフェロン−β以外のタンパク質の少なくとも
一部が、免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部である、請求項10に記載
の単離されたタンパク質。 - 【請求項16】 請求項15に記載の単離されたタンパク質であって、ここ
で、前記定常領域の少なくとも一部が、クラスIgM、クラスIgG、クラスI
gD、クラスIgAおよびクラスIgEから選択されるクラスの免疫グロブリン
由来である、単離されたタンパク質。 - 【請求項17】 前記クラスがIgGである、請求項16に記載の単離され
たタンパク質。 - 【請求項18】 前記定常領域の少なくとも一部が、少なくともヒンジドメ
イン、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含む、請求項15に記載の単離さ
れたタンパク質。 - 【請求項19】 請求項1および10に記載のタンパク質をコードする、単
離されたDNA配列。 - 【請求項20】 請求項19に記載のDNA配列および発現制御配列を含む
組換えDNAであって、ここで、該発現制御配列が、該DNAに作動可能に連結
されている、組換えDNA。 - 【請求項21】 請求項20に記載の組換えDNA配列を用いて形質転換さ
れた、宿主細胞。 - 【請求項22】 以下の工程:(a)請求項21に記載の宿主細胞の集団を
提供する工程;(b)前記組換えDNAによってコードされるポリペプチドが発
現される条件下で該細胞の集団を増殖させる工程;および(c)該発現されたポ
リペプチドを単離する工程、を包含する、組換えポリペプチドを産生する方法。 - 【請求項23】 グリコシル化インターフェロン−β、およびそれがネイテ
ィブには付随しないさらなるポリペプチドを含む、実質的に精製された形態のイ
ンターフェロン−β融合タンパク質。 - 【請求項24】 前記インターフェロン−βが、ヒトインターフェロン−β
−1aである、請求項23に記載の融合タンパク質。 - 【請求項25】 請求項24に記載の融合タンパク質であって、ここで、該
融合物は、以下:(a)野生型インターフェロン−β−1aよりも高い抗ウイル
ス活性であって、ここで、該抗ウイルス活性はウイルスに誘導された細胞の溶解
によって測定される、活性、(b)野生型インターフェロン−β−1aに対して
、抗増殖活性よりも大きな抗ウイルス活性;(c)レセプター結合活性を含むが
、野生型インターフェロン−β−1aと比較して、該レセプター結合活性に対し
て、低められた抗ウイルス活性および低められた抗増殖活性を含む、活性、から
なる群より選択される抗ウイルス活性を有する、融合タンパク質。 - 【請求項26】 請求項1、10および23に記載のインターフェロン−β
融合タンパク質の治療的有効量を含む、薬学的組成物。 - 【請求項27】 被験体において新脈管形成を阻害する方法であって、請求
項26に記載の組成物の有効量を被験体に投与する工程を包含する、方法。 - 【請求項28】 前記変異体が誘導体化されている、請求項3に記載の単離
されたポリペプチド。 - 【請求項29】 前記誘導体がポリアルキルグリコールポリマーである、請
求項27に記載の単離されたポリペプチド。 - 【請求項30】 前記変異体が誘導体化されている、請求項12に記載の単
離されたタンパク質。 - 【請求項31】 前記誘導体がポリアルキルグリコールポリマーである、請
求項29に記載の単離されたタンパク質。
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