RU2711322C1 - Улучшенные способы получения рекомбинантного полипептида - Google Patents
Улучшенные способы получения рекомбинантного полипептида Download PDFInfo
- Publication number
- RU2711322C1 RU2711322C1 RU2016128367A RU2016128367A RU2711322C1 RU 2711322 C1 RU2711322 C1 RU 2711322C1 RU 2016128367 A RU2016128367 A RU 2016128367A RU 2016128367 A RU2016128367 A RU 2016128367A RU 2711322 C1 RU2711322 C1 RU 2711322C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- polypeptide
- bdnf
- hybrid
- cleavage site
- pro
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 314
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 284
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 282
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 claims abstract description 205
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 claims abstract description 204
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims abstract description 116
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims abstract description 116
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 claims abstract description 61
- 102000007072 Nerve Growth Factors Human genes 0.000 claims abstract description 53
- 239000003900 neurotrophic factor Substances 0.000 claims abstract description 22
- 108010002231 IgA-specific serine endopeptidase Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 108090000742 Neurotrophin 3 Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 claims abstract description 8
- 229940032018 neurotrophin 3 Drugs 0.000 claims abstract description 8
- 102000003683 Neurotrophin-4 Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 108090000099 Neurotrophin-4 Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 229940097998 neurotrophin 4 Drugs 0.000 claims abstract description 6
- 102100029268 Neurotrophin-3 Human genes 0.000 claims abstract 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 80
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 53
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 53
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 31
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 23
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 22
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 22
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 15
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 claims description 10
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 25
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 16
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 229940077737 brain-derived neurotrophic factor Drugs 0.000 description 168
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 62
- 125000000174 L-prolyl group Chemical group [H]N1C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[C@@]1([H])C(*)=O 0.000 description 58
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 52
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 40
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 39
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 39
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 37
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 36
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 35
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 31
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 31
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 27
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 24
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 23
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 23
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 23
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 23
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 23
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 22
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 22
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 20
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 20
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 20
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 20
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 20
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 20
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 20
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 19
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 19
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 19
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 17
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 17
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 16
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 16
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 16
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 14
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 14
- 102000010175 Opsin Human genes 0.000 description 13
- 108050001704 Opsin Proteins 0.000 description 13
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 13
- 102000004961 Furin Human genes 0.000 description 12
- 108090001126 Furin Proteins 0.000 description 12
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 description 12
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 12
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 description 11
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 11
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 11
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 10
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 9
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 9
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 9
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- 108010033576 Transferrin Receptors Proteins 0.000 description 7
- 102100026144 Transferrin receptor protein 1 Human genes 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 7
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 108010001831 LDL receptors Proteins 0.000 description 6
- 102000000853 LDL receptors Human genes 0.000 description 6
- 102100021923 Prolow-density lipoprotein receptor-related protein 1 Human genes 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 6
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 6
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 101150084157 lrp-1 gene Proteins 0.000 description 6
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 6
- 102220534048 Brain-derived neurotrophic factor_R54A_mutation Human genes 0.000 description 5
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 5
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 5
- 101150056950 Ntrk2 gene Proteins 0.000 description 5
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 101000739876 Homo sapiens Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 4
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 4
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- 102000011965 Lipoprotein Receptors Human genes 0.000 description 4
- 108010061306 Lipoprotein Receptors Proteins 0.000 description 4
- 102100040705 Low-density lipoprotein receptor-related protein 8 Human genes 0.000 description 4
- 102000004230 Neurotrophin 3 Human genes 0.000 description 4
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 4
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 4
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 102000051542 human BDNF Human genes 0.000 description 4
- -1 linker compound Chemical class 0.000 description 4
- 108010031117 low density lipoprotein receptor-related protein 8 Proteins 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 101150035467 BDNF gene Proteins 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 3
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 3
- 108010001127 Insulin Receptor Proteins 0.000 description 3
- 102000003746 Insulin Receptor Human genes 0.000 description 3
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 3
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 3
- 101100369221 Mus musculus Tfrc gene Proteins 0.000 description 3
- 102100033237 Pro-epidermal growth factor Human genes 0.000 description 3
- 102000004584 Somatomedin Receptors Human genes 0.000 description 3
- 108010017622 Somatomedin Receptors Proteins 0.000 description 3
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 108091005971 Wild-type GFP Proteins 0.000 description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 3
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 229940077456 human brain-derived neurotrophic factor Drugs 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 3
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 3
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 3
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 2
- 102000005600 Cathepsins Human genes 0.000 description 2
- 108010084457 Cathepsins Proteins 0.000 description 2
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 2
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 description 2
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 description 2
- 102000024452 GDNF Human genes 0.000 description 2
- 108091010837 Glial cell line-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 2
- 102000001398 Granzyme Human genes 0.000 description 2
- 108060005986 Granzyme Proteins 0.000 description 2
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101001111439 Homo sapiens Beta-nerve growth factor Proteins 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 102220500028 Interferon-induced GTP-binding protein Mx2_K95A_mutation Human genes 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 2
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 2
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 2
- 206010029240 Neuritis Diseases 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700011066 PreScission Protease Proteins 0.000 description 2
- 108700025832 Serum Response Element Proteins 0.000 description 2
- 108090000787 Subtilisin Proteins 0.000 description 2
- 108010076818 TEV protease Proteins 0.000 description 2
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 2
- 241000723792 Tobacco etch virus Species 0.000 description 2
- 241000723873 Tobacco mosaic virus Species 0.000 description 2
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 2
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 102000046917 human NGF Human genes 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 229940065638 intron a Drugs 0.000 description 2
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 230000000508 neurotrophic effect Effects 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000012846 protein folding Effects 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 2
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- ITFICYZHWXDVMU-IPTZIORSSA-N (2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S,3S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-6-amino-2-[[(2S,3S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-amino-4-carboxybutanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-sulfanylpropanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]pentanedioic acid Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC2=CNC3=CC=CC=C32)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H]4CCCN4C(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N ITFICYZHWXDVMU-IPTZIORSSA-N 0.000 description 1
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- 230000006269 (delayed) early viral mRNA transcription Effects 0.000 description 1
- 241000242764 Aequorea victoria Species 0.000 description 1
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 1
- 206010003805 Autism Diseases 0.000 description 1
- 208000020706 Autistic disease Diseases 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000030814 Eating disease Diseases 0.000 description 1
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 1
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 1
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 208000019454 Feeding and Eating disease Diseases 0.000 description 1
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 1
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N HA peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 102100031000 Hepatoma-derived growth factor Human genes 0.000 description 1
- 101500024763 Homo sapiens BDNF precursor form Proteins 0.000 description 1
- 101001083798 Homo sapiens Hepatoma-derived growth factor Proteins 0.000 description 1
- 101000852815 Homo sapiens Insulin receptor Proteins 0.000 description 1
- 101000801254 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 16 Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 208000023105 Huntington disease Diseases 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 1
- 125000002842 L-seryl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])O[H] 0.000 description 1
- 102220465647 Lymphocyte activation gene 3 protein_R97E_mutation Human genes 0.000 description 1
- 239000012515 MabSelect SuRe Substances 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 208000028389 Nerve injury Diseases 0.000 description 1
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 1
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 1
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 102100036220 PC4 and SFRS1-interacting protein Human genes 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102000000447 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Human genes 0.000 description 1
- 108010055817 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 101100388690 Plasmodium falciparum (isolate K1 / Thailand) MEF-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 208000006289 Rett Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 241000242583 Scyphozoa Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 102100038803 Somatotropin Human genes 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 1
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 102100033725 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 16 Human genes 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000007801 affinity label Substances 0.000 description 1
- SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N all-trans-retinoic acid Chemical compound OC(=O)\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 206010002026 amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 230000000954 anitussive effect Effects 0.000 description 1
- 229940124584 antitussives Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000013528 artificial neural network Methods 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 150000001508 asparagines Chemical class 0.000 description 1
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 1
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004781 brain capillary Anatomy 0.000 description 1
- NNBFNNNWANBMTI-UHFFFAOYSA-M brilliant green Chemical compound OS([O-])(=O)=O.C1=CC(N(CC)CC)=CC=C1C(C=1C=CC=CC=1)=C1C=CC(=[N+](CC)CC)C=C1 NNBFNNNWANBMTI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 210000003986 cell retinal photoreceptor Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000004637 cellular stress Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 1
- 229910003460 diamond Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- ZZVUWRFHKOJYTH-UHFFFAOYSA-N diphenhydramine Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(OCCN(C)C)C1=CC=CC=C1 ZZVUWRFHKOJYTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 235000014632 disordered eating Nutrition 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 1
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 1
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 1
- 230000003628 erosive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 108010085617 glycopeptide alpha-N-acetylgalactosaminidase Proteins 0.000 description 1
- 108010033706 glycylserine Proteins 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 230000010005 growth-factor like effect Effects 0.000 description 1
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 1
- 102000044162 human IGF1 Human genes 0.000 description 1
- 102000047882 human INSR Human genes 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 229960001388 interferon-beta Drugs 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 239000008185 minitablet Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 230000005709 nerve cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000008764 nerve damage Effects 0.000 description 1
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000014511 neuron projection development Effects 0.000 description 1
- 238000011330 nucleic acid test Methods 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 208000015754 perinatal disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000004845 protein aggregation Effects 0.000 description 1
- 230000005892 protein maturation Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- 230000010837 receptor-mediated endocytosis Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 239000012925 reference material Substances 0.000 description 1
- 238000003571 reporter gene assay Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 229930002330 retinoic acid Natural products 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 201000000980 schizophrenia Diseases 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000012764 semi-quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 1
- 150000003355 serines Chemical class 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 210000003594 spinal ganglia Anatomy 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 description 1
- 150000003588 threonines Chemical class 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000031998 transcytosis Effects 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 229960001727 tretinoin Drugs 0.000 description 1
- 210000004885 white matter Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/48—Nerve growth factor [NGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2881—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD71
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/10—Tetrapeptides
- C07K5/1019—Tetrapeptides with the first amino acid being basic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
- C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
- C07K2317/522—CH1 domain
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
- C07K2317/524—CH2 domain
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
- C07K2317/526—CH3 domain
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
- C07K2317/53—Hinge
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/55—Fab or Fab'
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/60—Fusion polypeptide containing spectroscopic/fluorescent detection, e.g. green fluorescent protein [GFP]
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способам получения рекомбинантного полипептида нейротрофина посредством расщепления прополипептида нейротрофина IgA-протеазой, где эндогенный сайт ферментативного расщепления между просегментом и полипептидом нейротрофина заменен сайтом расщепления IgA-протеазой. Изобретение позволяет высокоэффективно получать активные полипептиды фактора роста нервов (NGF), нейротрофического фактора головного мозга (BDNF), нейротрофина 3 (NT-3) и нейротрофина 4 (NT-4). 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 4 ил., 22 табл., 8 пр.
Description
В данном документе представлены способы, предназначенные, среди прочего, для увеличения выхода биологически активных полипептидов, полученных рекомбинантным способом.
Уровень техники
В настоящее время большинство биофармацевтических препаратов производятся в клетках животных (млекопитающих), которые обычно секретируют рекомбинантный полипептид, представляющий интерес, с высокой эффективностью, качеством и соответствующими посттрансляционными (вторичными) модификациями (такими как, например, гликозилирование) в культивационную среду. Тем не менее, некоторые гибридные полипептиды, в особенности сложные гибридные полипептиды, полипептиды с низкой растворимостью или трудностями сворачивания, а также полипептиды, взаимодействующие с клеткой, экспрессирующей их, часто получают с очень низким выходом.
Например, антитела, как правило, экспрессируются в клетках млекопитающих с высокой эффективностью в биологически активной форме. Тем не менее, гибридные полипептиды, содержащие антитело, например, конъюгаты антител с зеленым флуоресцентным белком (GFP), совсем не экспрессируются и/или не секретируются, хотя такие белки были бы весьма интересны для экспериментальных и диагностических подходов (см., например, WO 2011/135040).
В некоторых случаях трудно экспрессируемые полипептиды могут быть получены в виде растворимых секретируемых неактивных белков-предшественников, например, так называемых зимогенов в случае протеаз, которые впоследствии могут подвергаться созреванию in vitro, например, путем протеолитической активации. В других случаях полипептиды, которые являются вредными для конкретной клетки-хозяина, могут быть экспрессированы в виде неактивных нерастворимых белковых агрегатов в клетке (телец включения (inclusion bodies, IB)), а потом подвергнуты рефолдингу in vitro. Тем не менее, процессинг прополипептидов может быть трудным или вообще невозможным. Кроме того, полученные зрелые полипептиды не содержат все посттрансляционные модификации.
Примерами слабо экспрессируемых полипептидов являются нейротрофические факторы, такие как NGF, BDNF, GDNF и NT-3 (см., например, Xia, Ch.-F., J. Gene Med. 10 (2008) 306-315; Boado, R.J., Pharm. Res. 24 (2007) 1772-1787; Negro, A., et al., J. Neurochem. 62 (1994) 471-478).
В публикации WO 2008/005847 сообщается о способе получения белков фактора VIII с помощью рекомбинантных методик. Удлиненные белком гликозилированные полипептиды описаны в WO 02/02597. В WO 2007/044323 сообщается о гибридных белках для доставки через гематоэнцефалический барьер. Модуляторы роста нервных клеток (амфитела) описаны в WO 00/64482. В WO 2012/087835 представлены композиции и способы улучшения сворачивания белков. Стабильные и растворимые антитела, ингибирующие TNF-альфа, описаны в WO 2006/131013. В WO 00/23473 сообщается о гибридных белках интерферона бета и их применении.
Сущность изобретения
В данном документе представлены способы улучшения процесса получения рекомбинантно продуцируемого полипептида.
Улучшение может представлять собой, например, повышенный выход, более надежный процесс получения, более простой процесс и/или уменьшение сложности последующей обработки.
Нужно указать, что улучшение достигается без ухудшения биофизических и/или биохимических свойств и/или биологических функций полипептида. В некоторых случаях одно или более чем одно из этих свойств даже улучшено.
Первый аспект, описанный в данном документе, заключается в том, что было обнаружено, что путем введения одного или более чем одного сайта гликозилирования может быть улучшена рекомбинантная продукция полипептида в клетке млекопитающего.
Один из аспектов, описанных в данном документе, представляет собой способ получения рекомбинантного полипептида с использованием вариантного полипептида, включающий следующие этапы:
- культивирование клетки млекопитающего, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую вариантный полипептид, где аминокислотная последовательность полипептида была модифицирована с помощью i) одной или более чем одной мутации поверхностно расположенных аминокислотных остатков, что приводит к более низкой изоэлектрической точке вариантного полипептида по сравнению с данным полипептидом, и/или ii) линкерного пептида, соединяющего два полипептида гибридного полипептида, и/или iii) N- или С-концевой слитой метки, содержащей аминокислоты, приводящие к более низкой изоэлектрической точке полипептида,
- извлечение рекомбинантного вариантного полипептида из клетки или культивационной среды и, таким образом, получение рекомбинантного полипептида.
Таким образом, в данном документе описан способ получения рекомбинантного полипептида с использованием вариантного полипептида, включающий следующие этапы:
- культивирование эукариотической клетки (в одном из воплощений клетки млекопитающего), содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую вариантный полипептид, где аминокислотная последовательность полипептида была модифицирована так, чтобы включать один или более чем один искусственный сайт гликозилирования,
- извлечение вариантного рекомбинантного полипептида из клетки или культивационной среды и, таким образом, получение рекомбинантного полипептида.
Один из аспектов, описанных в данном документе, представляет собой способ получения рекомбинантного полипептида с использованием вариантного полипептида, включающий следующие этапы:
- получение нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид,
- модификация нуклеиновой кислоты, чтобы она кодировала вариантный полипептид, где аминокислотная последовательность полипептида была модифицирована так, чтобы включать один или более чем один искусственный сайт гликозилирования,
- введение нуклеиновой кислоты в эукариотическую клетку (в одном из воплощений в клетку млекопитающего),
- культивирование эукариотической клетки, и
- извлечение вариантного рекомбинантного полипептида из клетки или культивационной среды и, таким образом, получение рекомбинантного полипептида.
Способы, описанные в данном документе, особенно подходят, например, для полипептидов, которые слабо или вовсе не экспрессируются/секретируются в клетках млекопитающих.
Введенный сайт (сайты) гликозилирования может быть расположен (расположены независимо от других) либо в самом полипептиде, либо в линкерном пептиде, соединяющем два полипептида гибридного полипептида, либо он может быть специфической меткой гликозилирования.
В одном воплощении полипептид содержит метку гликозилирования.
В одном воплощении полипептид содержит искусственный сайт гликозилирования. В одном воплощении искусственный сайт гликозилирования вводится путем точечной мутации поверхностно расположенной аминокислоты.
Второй аспект, описанный в данном документе, заключается в том, что было обнаружено, что если заменить в прополипептиде эндогенный сайт расщепления протеазой между просегментом и зрелым полипептидом на экзогенный (относительно происхождения полипептида) или искусственный сайт расщепления протеазой, то выход зрелого полипептида может быть повышен. Это изменение улучшает процессинг прополипептида в зрелую форму.
Таким образом, один из аспектов, описанных в данном документе, представляет собой способ получения рекомбинантного полипептида с использованием вариантного прополипептида, включающий следующие этапы:
- культивирование эукариотической клетки (в одном из воплощений клетки млекопитающего), содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид в виде прополипептида (гибридного полипептида просегмента и полипептида), в котором эндогенный сайт ферментативного расщепления между просегментом и полипептидом заменяется экзогенным сайтом расщепления протеазой,
- извлечение рекомбинантного вариантного полипептида или вариантного прополипептида из клетки или культивационной среды и, таким образом, получение рекомбинантного полипептида.
Один из аспектов, описанных в данном документе, представляет собой способ получения рекомбинантного полипептида с использованием вариантного прополипептида, включающий следующие этапы:
- получение нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид в виде прополипептида (гибридного полипептида из просегмента и полипептида),
- модификация нуклеиновой кислоты, чтобы она кодировала вариантный прополипептид, в котором эндогенный сайт ферментативного расщепления между просегментом и полипептидом заменяется экзогенным сайтом расщепления протеазой,
- введение нуклеиновой кислоты в эукариотическую клетку (в одном из воплощений в клетку млекопитающего),
- культивирование эукариотической клетки, и
- извлечение рекомбинантного вариантного полипептида или вариантного прополипептида из клетки или культивационной среды и, таким образом, получение рекомбинантного полипептида.
В одном воплощении экзогенный сайт расщепления протеазой выбирают из группы, содержащей сайт расщепления плазмином, сайт расщепления фурином, сайт расщепления IgA-протеазой, сайт расщепления протеазой TEV (от англ. tobacco etch virus - вируса табачной мозаики), сайт расщепления гранзимом В, сайт расщепления тромбином, сайт расщепления фактором 10, сайт расщепления энтерокиназой, сайт расщепления субтилизином, сайт расщепления катепсином, сайт расщепления металлопротеиназой, сайт расщепления протеазой IDES (от англ. IgG-degrading enzyme of Streptococcus pyogenes - фермент Streptococcus pyogenes, расщепляющий IgG), сайт расщепления протеазой PreScission или их функциональные варианты. В одном воплощении экзогенный сайт расщепления протеазой представляет собой сайт расщепления IgA-протеазой.
В одном воплощении расщепление прополипептида осуществляется в среде культивирования. В одном воплощении экзогенную протеазу, способную к расщеплению экзогенного сайта расщепления протеазой, добавляют в среду культивирования. В одном воплощении добавление происходит на этапе культивирования. В одном воплощении добавление происходит после этапа культивирования.
В одном воплощении экзогенную протеазу экспрессировали совместно из клетки, экспрессирующей прополипептид.
В одном воплощении культивирование является совместным культивированием клетки, экспрессирующей прополипептид, и клетки, экспрессирующей экзогенную протеазу.
В одном воплощении расщепление осуществляется после отделения клеток от среды культивирования. В одном воплощении расщепление происходит во время последующей обработки. В одном воплощении расщепление осуществляется на хроматографической колонке.
Третий аспект, описанный в данном документе, заключается в том, что было обнаружено, что с понижением изоэлектрической точки полипептида рекомбинантная продукция полипептида в клетке млекопитающего может быть повышена.
Таким образом, один из аспектов, описанных в данном документе, представляет собой способ получения рекомбинантного полипептида с использованием вариантного полипептида, включающий следующие этапы:
- культивирование эукариотической клетки (в одном из воплощений клетки млекопитающего), содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую вариантный полипептид, в котором аминокислотная последовательность полипептида была изменена с помощью одной или более чем одной мутации поверхностно расположенных аминокислотных остатков, что давало более низкую изоэлектрическую точку вариантного полипептида по сравнению с полипептидом,
- извлечение рекомбинантного вариантного полипептида из клетки или культивационной среды и, таким образом, получение рекомбинантного полипептида.
Один из аспектов, описанных в данном документе, представляет собой способ получения рекомбинантного полипептида с использованием вариантного полипептида, включающий следующие этапы:
- получение нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид,
- модификация нуклеиновой кислоты, чтобы она кодировала вариантный полипептид, в котором аминокислотная последовательность полипептида была изменена с помощью одной или более чем одной мутации поверхностно расположенных аминокислотных остатков, что давало более низкую изоэлектрическую точку вариантного полипептида по сравнению с данным полипептидом,
- введение нуклеиновой кислоты в эукариотическую клетку (в одном из воплощений в клетку млекопитающего),
- культивирование эукариотической клетки, и
- извлечение рекомбинантного вариантного полипептида из клетки или культивационной среды и, таким образом, получение рекомбинантного полипептида.
В одном воплощении полипептид имеет изоэлектрическую точку выше 9 (высокая изоэлектрическая точка, основная изоэлектрическая точка), а вариантный полипептид имеет изоэлектрическую точку, которая на 0,5 или более единиц рН ниже (более кислая) по сравнению с (родительским/дикого типа) полипептидом.
В одном воплощении полипептид представляет собой нейтрофин/нейротрофический фактор.
В одном воплощении изоэлектрическая точка понижается за счет введения отрицательно заряженной группировки.
В одном воплощении отрицательно заряженная группировка представляет собой линкерный пептид.
В одном воплощении отрицательно заряженная группировка представляет собой остаток поверхностно расположенный аминокислотный остаток. В одном воплощении один или более чем один аминокислотный остаток основного характера заменен нейтральным гидрофильным аминокислотным остатком и/или аминокислотным остатком кислотного характера или их комбинацией.
Четвертый аспект, описанный в данном документе, заключается в том, что было обнаружено, что путем корректировки длины и соединения линкерного пептида можно улучшить рекомбинантную продукцию гибридного полипептида в эукариотической клетке, такой как, например, клетка млекопитающего.
Таким образом, один из аспектов, описанных в данном документе, представляет собой способ получения (рекомбинантного) гибридного полипептида, включающий следующие этапы:
- культивирование эукариотической клетки (в одном из воплощений клетки млекопитающего), содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую гибридный полипептид,
- извлечение (рекомбинантного) гибридного полипептида из клетки или культивационной среды и, таким образом, получение (рекомбинантного) гибридного полипептида.
В одном воплощении одна часть гибридного полипептида представляет собой нейротрофин, а другая часть гибридного полипептида представляет собой антитело или фрагмент антитела.
Пятый аспект, описанный в данном документе, заключается в том, что было обнаружено, что
i) путем введения одного или более чем одного сайта гликозилирования, и/или
ii) путем замены в прополипептиде эндогенного сайта расщепления протеазой между просегментом и полипептидом на экзогенный сайт (относительно происхождения частей гибридного полипептида) или искусственный сайт расщепления протеазой, и/или
iii) путем понижения изоэлектрической точки полипептида, и/или
iv) путем корректировки длины, соединения и заряда линкерного пептида
можно улучшить рекомбинантную продукцию полипептида в клетке млекопитающего.
Таким образом, один из аспектов, описанных в данном документе, представляет собой способ получения (рекомбинантного) (гибридного) полипептида, включающий следующие этапы:
- культивирование эукариотической клетки (в одном из воплощений клетки млекопитающего), содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую вариантный (гибридный) полипептид, где аминокислотная последовательность (гибридного) полипептида была изменена
i) путем введения одного или более чем одного искусственного сайта гликозилирования, и/или
ii) путем замены в про(гибридном)полипептиде эндогенного сайта расщепления протеазой между просегментом и (гибридным) полипептидом на экзогенный сайт (относительно происхождения частей гибридного полипептида) или искусственный сайт расщепления протеазой, и/или
iii) путем понижения изоэлектрической точки (гибридного) полипептида, и/или
iv) путем корректировки длины линкерного пептида, корректировки соединения линкера, корректировки заряда линкера, введения одной или более чем одной мутации поверхностно расположенных аминокислотных остатков, дающих более низкую изоэлектрическую точку (гибридного) полипептида,
- извлечение (гибридного) полипептида или (гибридного) прополипептида из клетки или культивационной среды и, таким образом, получение (рекомбинантного) (гибридного) полипептида.
Один из аспектов, описанных в данном документе, представляет собой способ получения (рекомбинантного) гибридного полипептида, включающий следующие этапы:
- получение нуклеиновой кислоты, кодирующей гибридный полипептид,
- модификация нуклеиновой кислоты, чтобы она кодировала вариантный гибридный полипептид, в котором аминокислотная последовательность гибридного полипептида была изменена путем корректировки длины линкерного пептида, корректировки соединения линкера, корректировки заряда линкера, введения одной или более чем одной мутации поверхностно расположенных аминокислотных остатков, дающих более низкую изоэлектрическую точку гибридного полипептида,
- введение нуклеиновой кислоты в эукариотическую клетку (в одном из воплощений в клетку млекопитающего),
- культивирование эукариотической клетки, и
- извлечение (рекомбинантного) вариантного гибридного полипептида из клетки или культивационной среды и, таким образом, получение (рекомбинантного) гибридного полипептида.
В одном из воплощений предыдущих аспектов гибридный полипептид содержит биологически активную группу, линкерный пептид и одновалентную связывающую группу, которая связывается с рецептором гематоэнцефалического барьера (от англ. blood-brain-barrier, ВВВ).
В одном из воплощений рецептор гематоэнцефалического барьера выбран из группы, включающей рецептор трансферрина, рецептор инсулина, рецептор инсулиноподобного фактора роста, белок, связанный с рецептором липопротеина низкой плотности (LRP)/рецептор альфа-2-макроглобулина, белок 8, связанный с рецептором липопротеина низкой плотности (также известный как рецептор 2 аполипопротеина Е (ApoER2)), белок 1, связанный с рецептором липопротеина низкой плотности (также известный как рецептор альфа-2-макроглобулина (A2MR)), и гепарин-связывающий фактор роста, подобный эпидермальному фактору роста.
В одном из воплощений линкерный пептид содержит один или более чем один отрицательно заряженный аминокислотный остаток. В одном из воплощений линкерный пептид содержит два или более двух отрицательно заряженных аминокислотных остатков. В одном из воплощений линкерный пептид содержит два, или три, или четыре, или пять отрицательно заряженных аминокислотных остатков.
В одном из воплощений биологически активная группа представляет собой нейротрофический фактор. В одном из воплощений нейротрофический фактор представляет собой нейротрофический фактор головного мозга (brain derived neurotrophic factor, BDNF).
В одном из воплощений одновалентная связывающая группа связывается с рецептором гематоэнцефалического барьера и представляет собой одновалентный фрагмент антитела, предпочтительно, выбранный среди scFv, Fv, scFab, Fab, VHH.
В одном из воплощений гибридный полипептид представляет собой одноцепочечный гибридный полипептид, содержащий в качестве первой части человеческий нейротрофический фактор головного мозга, а в качестве второй части отдельный Fab- или scFv-фрагмент антитела против рецептора трансферрина, которые конъюгированы друг с другом либо напрямую, либо через линкерный пептид.
Один из аспектов, описанных в данном документе, представляет собой гибридный полипептид, включающий
- ровно один полипептид нейротрофического фактора дикого типа, или вариантный полипептид нейротрофического фактора, или его фрагмент с активностью нейротрофического фактора,
- связывающий домен, и
- линкерный пептид между полипептидом нейротрофического фактора и фрагментом антитела.
Один из аспектов, описанных в данном документе, представляет собой гибридный полипептид с активностью нейротрофического фактора (например, димерный комплекс), включающий
- ровно один тип полипептида нейротрофического фактора дикого типа, или вариантного полипептида нейротрофического фактора, или его фрагмента с активностью нейротрофического фактора,
- связывающий домен, и
- линкерный пептид между полипептидом нейротрофического фактора и фрагментом антитела.
В одном из воплощений связывающий домен представляет собой сайт связывания фрагмента антитела. В одном из воплощений связывающий домен представляет собой фрагмент антитела, содержащий сайт связывания антитела. В одном из воплощений фрагмент антитела специфически связывается с рецептором гематоэнцефалического барьера. В одном из воплощений фрагмент антитела представляет собой одновалентный фрагмент антитела, выбранный из группы, включающей scFv, Fv, scFab, Fab, VHH.
В одном из воплощений рецептор гематоэнцефалического барьера выбран из группы, включающей рецептор трансферрина, рецептор инсулина, рецептор инсулиноподобного фактора роста, белок, связанный с рецептором липопротеина низкой плотности (LRP)/рецептор альфа-2-макроглобулина, белок 8, связанный с рецептором липопротеина низкой плотности (также известный как рецептор 2 аполипопротеина Е (ApoER2)), белок 1, связанный с рецептором липопротеина низкой плотности (также известный как рецептор альфа-2-макроглобулина (A2MR)), и гепарин-связывающий фактор роста, подобный эпидермальному фактору роста.
В одном из воплощений гибридный полипептид содержит вторую одновалентную или двухвалентную связывающую группу, которая не связывается с рецептором ВВВ.
Один из аспектов, описанных в данном документе, представляет собой комплекс, содержащий
- в качестве первого компонента гибридный полипептид, описанный в данном документе, и
- в качестве второго компонента полипептид нейротрофического фактора дикого типа, или вариантный полипептид нейротрофического фактора, или его фрагмент с активностью нейротрофического фактора.
Один из аспектов, описанных в данном документе, представляет собой многомерный комплекс с активностью нейротрофического фактора, включающий
- в качестве первого компонента гибридный полипептид, описанный в данном документе, и
- в качестве второго компонента полипептид нейротрофического фактора дикого типа, или вариантный полипептид нейротрофического фактора, или его фрагмент с активностью нейротрофического фактора.
В одном из воплощений указанный комплекс представляет собой димерный комплекс.
В одном из воплощений всех аспектов нейротрофический фактор выбран среди фактора роста нервов (NGF), нейротрофического фактора головного мозга (BDNF), нейротрофического фактора глиальной клеточной линии (GDNF), нейротрофина 3 (NT-3) и нейротрофина 4 (NT-4). В одном предпочтительном воплощении нейротрофический фактор роста представляет собой BDNF.
Все аминокислотные последовательности, представленные в данном документе, являются конкретными аспектами данного изобретения.
Подробное описание изобретения
Причина (причины) низкого экспрессионного выхода рекомбинантно полученных полипептидов в клетках млекопитающих часто не известна и, как правило, трудно определима.
Некоторые полипептиды могут мешать функциям клетки-хозяина при экспрессии. Это может быть, например, неправильная сортировка в неправильное клеточное местоположение или экспрессия в неправильном пространственном (например, тип клеток) и/или временном (например, при зависимости от клеточного цикла) контексте. Кроме того, увеличение рекомбинантной экспрессии и секреции полипептидов может привести к неблагоприятным условиям сворачивания белка, например, приводящим к агрегации белка и/или клеточным стрессовым реакциям. В заключение, рекомбинантная экспрессия полипептидов может быть затрудненной (например, давая низкий экспрессионный выход) или даже невозможной в конкретной клетке-хозяине.
Способы, приведенные в данном документе, являются иллюстративными в отношении конкретных полипептидов, гибридных полипептидов и полипептидов, слитых с антителами. Эти молекулы используются только в качестве примера и не должны быть истолкованы как ограничивающие объем данного изобретения.
Нейротрофические белки вызывают высокий терапевтический интерес. Например, нейротрофический фактор головного мозга (BDNF) предлагается использовать для лечения или облегчения симптомов болезни Альцгеймера, Паркинсона, Хантингтона и перинатальной болезни белого вещества, болезни Дауна и аутизма/синдрома Ретта, шизофрении, депрессии, нарушения пищевого поведения, бокового амиотрофического склероза, рассеянного склероза, нервных повреждений, например, спинного мозга, а также других заболеваний (Apfel, S.C., Clin. Chem. Lab Med. 39 (2001) 351-355; Nagahara, A.H. and Tuszynski, M.H., Nat. Rev. Drug Discov. 10 (2011) 209-219; Zuccato, C. and Cattaneo, E., Nature Reviews Neurology 5 (2009) 311-322; Thoenen, H. and Sendtner, M., Nature Neuroscience Supplement 5 (2002) 1046-1050; Gharami, K., et al., J. Neurochem. 105 (2008) 369-379).
В человеческом организме нейротрофические белки находятся на очень низком уровне и часто экспрессируются специализированными типами клеток, расположенными в очень сложной микросреде (см., например, Greenberg, М.Е., et al., J. Neurosci. 29 (2009) 12764-12767). В соответствии с их природными функциями уровни экспрессии нейротрофинов в эукариотических клетках, обычно используемых для рекомбинантной промышленной продукции таких полипептидов (например, клетках СНО, клетках COS, клетках NSO и клетках НЕК), являются очень низкими (Acklin, С. et al., Int. J. Pept. Protein Res. 41 (1993) 548-552).
I. Повышение экспрессии путем введения сайтов N-гликозилирования
Одним из аспектов, описанных в данном документе, является введение одного или более чем одного (искусственного) сайта гликозилирования в полипептид для его рекомбинантной продукции. Путем ведения одного или более чем одного (искусственного) сайта гликозилирования может быть улучшена рекомбинантная продукция полипептида в эукариотической клетке, особенно в клетке млекопитающего. Этот способ особенно подходит, например, для полипептидов, которые слабо или совсем не экспрессируются/секретируются в клетках млекопитающих. Введенный сайт гликозилирования может находиться либо в самом полипептиде, либо в линкерном пептиде, соединяющем два полипептида гибридного полипептида, либо он может быть меткой специфического гликозилирования. Особенно предпочтительно введение сайта гликозилирования путем точечной мутации поверхностно локализованной аминокислоты для создания (искусственного) мотива N-гликозилирования.
Пример: Гибридные полипептиды, содержащие часть антитела и GFP
Были сконструированы иллюстративные гибридные полипептиды, содержащие антитело и группировку GFP.
GlySer-линкер (GGGGSGGGGSG; SEQ ID NO 01) был использован для слияния либо i) группировки eGFP (усиленный зеленый флуоресцентный белок, последовательность SEQ ID NO 02), либо ii) группировки emGFP (зеленый флуоресцентный белок Emerald; SEQ ID NO 03), либо iii) группировки tagGFP (SEQ ID NO 04) с С-концами тяжелых цепей (НС) анти-IGF-1R-антитела подкласса IgG1 (НС: SEQ ID NO 05; LC: SEQ ID NO 06). Различные гибриды тяжелой цепи имеют аминокислотную последовательность SEQ ID NO 07, 08 и 09.
Секреция гибридных полипептидов-антител не могла быть выявлена во всех клеточных культуральных супернатантах временно трансфицированных HEK293-клеток с использованием вестерн-блота и/или высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) на основе белка А. Также биологически активный GFP нельзя было контролировать за счет его биолюминесцентных свойств (GFP-специфическая флуоресценция). Но гибридные полипептиды могли быть обнаружены во фракции клеточного осадка путем вестерн-блота. Результаты приведены в следующей таблице.
Без привязки к этой теории GFP является цитоплазматическим мономерным белком с тенденцией к формированию (слабых) димеров. Таким образом, GFP дикого типа "от природы" (природная клетка медузы Aequorea Victoria) не предназначен для секреции, и, следовательно, молекула GFP должна быть сделана подходящей для секреции из-за несовместимости с системой секреции клеток млекопитающих.
Для того чтобы получить секретируемые GFP-содержащие гибридные полипептиды, в гибридный полипептид также был включен полипептид, полученный из человеческого светочувствительного мембраносвязанного рецептора опсина, связанного с G-белком, найденного в фоторецепторных клетках сетчатки, например, в качестве метки гликозилирования. С помощью этой метки гликозилирования в гибридный полипептид вводят дополнительные (искусственные) сайты N-гликозилирования.
Полипептид, полученный из рецептора опсина, был слит непосредственно, т.е. без промежуточного линкерного пептида, с С-концом GFP-группировки. Полипептид, полученный из опсина (NGTEGPNFYVPFSNATGVV; опсин-метка, SEQ ID NO 10), содержит два мотива сайта N-гликозилирования: мотив NGT и мотив NAT (обычный мотив сайта N-гликозилирования: N×S/T; Asn с последующей любой аминокислотой, за исключением Pro, а затем Ser или Thr). Временная экспрессия гибридных полипептидов, содержащих опсиновую метку гликозилирования (SEQ ID NO 11), в клетках HEK293 приводит к секреции гибридного полипептида. Результаты приведены в следующей таблице.
Из SDS-PAGE-анализа (размывание полос) можно видеть, что секретируемые гибридные полипептиды содержат дополнительные углеводы.
Гибридные полипептиды "антитело-GFP-опсиновая метка" очищали путем двухэтапной процедуры, в частности, аффинной хроматографии на белке А с последующей эксклюзионной хроматографией. Функциональность группировки антитела в гибридном полипептиде была продемонстрирована путем связывания с рецепторным белком IGF-1R с использованием поверхностного плазмонного резонанса (BIAcore) и интернализации в клетки посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза в клетках, сверхэкспресирующих IGF-1R, с помощью FACS и/или конфокальной микроскопии. Функциональность GFP-группировки была показана благодаря ее характеристикам зеленой флуоресценции.
Пример: Нейротрофические белки
Иллюстративным нейротрофическим белком является нейротрофический фактор головного мозга (BDNF).
i) Метка гликозилирования
Человеческий пре-про-BDNF дикого типа, содержащий С-концевую Т7 His6-метку (MASMTGGQQMG-HHHHHH, используется для аффинной очистки; SEQ ID NO 12), слитую через GSG-линкер, экспрессируют в клетках HEK239 (пре-про-BDNF-T7-His6; SEQ ID NO 13). Аминокислотная последовательность зрелого BDNF не содержит мотив N-гликозилирования и, следовательно, не является N-гликозилированным. Зрелый BDNF получают с низким выходом, который составляет лишь несколько мкг/мл. Низкий выход экспрессии гена не может быть улучшен путем оптимизации кодонов гена, или путем удаления потенциальных сайтов расщепления протеазой (пре-про-BDNF(-RGR)-T7-His6), или путем замены нативной сигнальной последовательности BDNF сигнальной последовательностью хорошо экспрессируемого антитела (MGWSCIILFL VATATGVHS; SEQ ID NO 14), или путем замены препросегмента BDNF таковым из NGF. Результаты приведены в следующей таблице (значения нормированы по концентрации зрелого BDNF).
Для того чтобы улучшить (секреторный) выход BDNF, в молекулу BDNF были введены (искусственные) сайты гликозилирования с использованием опсиновых меток гликозилирования различной длины: 16 аминокислотных остатков (NGTEGPNFYVPFSNAT; SEQ ID NO 15), 19 аминокислотных остатков (NGTEGPNFYVPFSNATGVV; SEQ ID NO 10) и 20 аминокислотных остатков (NGTEGPNFYVPFSNATGVVR; SEQ ID NO 16). С помощью этой модификации экспрессионный выход (нормированный по концентрации зрелого BDNF) может быть улучшен. Результаты приведены в следующей таблице (нормированы по концентрации зрелого BDNF).
Неожиданно варианты BDNF, содержащие метку гликозилирования, также имели улучшенную биологическую активность по сравнению с нативным негликозилированным BDNF (CHO-TrkB-люциферазный анализ с репортерным геном). Результаты приведены в следующей таблице.
Другими возможными сайтами гликозилирования являются AAANGTGGA (один мотив сайта N-гликозилирования; SEQ ID NO 17), ANITVNITV (два мотива сайта N-гликозилирования; SEQ ID NO 18) и NATGADNGTGAS (два мотива сайта N-гликозилирования; SEQ ID NO 19).
ii) Введенный мотив(ы) сайта N-гликозилирования
Для того чтобы улучшить (секреторный) выход BDNF, в аминокислотную последовательность BDNF были введены искусственные сайты N-гликозилирования. Искусственный сайт N-гликозилирования может быть введен, например, путем точечной мутации в аминокислотной последовательности BDNF (мотив сайта N-гликозилирования: Asn-Xxx-Ser/Thr; Ххх является любой аминокислотой кроме Pro). Соответствующие кодирующие нуклеиновокислотные последовательности были получены и временно экспрессированы в клетках HEK293. Нумерация мутаций основана на аминокислотной последовательности зрелого BDNF (SEQ ID NO 25). Для секретированных вариантов BDNF анализировали уровень экспрессии/секреции, степень N-гликозилирования (выведенную из миграции полосы из-за увеличения MW примерно на 3-5 кДа на каждый введенный и имеющийся сайт N-гликозилирования (по сравнению с негликозилированным референсом BDNF) в анализе иммуноблоттинга) и функциональность/связывание рецептора с помощью анализа с репортерным геном CHO-TrkB-люциферазы. Результаты представлены в следующих таблицах (экспрессионный выход и биологические активности, нормированные по концентрации зрелого BDNF) и на фиг. 3.
Активный: BDNF-активность в сравнении с активностью негликозилированного зрелого BDNF дикого типа, экспрессированного в Е.coli, подвергнутого рефолдингу и очищенного
Неактивный: никакой активности не выявлено
Функциональность/биологическая активность гликозилированных вариантов BDNF также была показана в анализе дорсальных корешковых ганглиев (dorsal root ganglion DRG). Активность, определенная в анализе DRG, была сравнима с негликозилированным BDNF дикого типа.
II. Повышение экспрессии путем модификации сайтов ферментативного расщепления
Часто секретируемые полипептиды синтезируются в виде препрополипептидов. Пресегмент представляет собой так называемую сигнальную последовательность. Просегмент может быть, например, необходим для сворачивания белка, клеточного нацеливания/транспортировки в конкретный клеточный компартмент (например, в лизосомы) или инактивации зрелого белка во время транспортировки и хранения в клетке или внеклеточной транспортировки (например, секреции в культуральную среду). Пре- и просегменты не являются необходимыми для биологической активности зрелого полипептида. Если просегмент не процессируется правильно, т.е. (пре-)просегмент не отщепляется от зрелого белка, например, в продуцирующей/секретирующей клетке, то он может изменять биофизические, биохимические и/или биологические активности зрелого полипептида.
Способ, представленный ниже, подходит для полипептидов, которые производятся in vivo из прополипептида путем ферментативного расщепления.
Один из аспектов, описанных в данном документе, представляет собой способ получения рекомбинантного полипептида из прополипептида с использованием вариантного прополипептида, включающий следующие этапы:
- культивирование клетки млекопитающего, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую прополипептид (гибридный полипептид из просегмента и полипептида), в котором эндогенный сайт ферментативного расщепления между просегментом и полипептидом заменяется экзогенным сайтом расщепления протеазой,
- извлечение рекомбинантного вариантного прополипептида из клетки или культивационной среды и, таким образом, получение рекомбинантного полипептида.
Один из аспектов, описанных в данном документе, представляет собой способ получения гибридного полипептида из гибридного прополипептида, включающий следующие этапы:
- культивирование клетки млекопитающего, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую вариантный гибридный прополипептид, в котором аминокислотная последовательность гибридного прополипептида была модифицирована путем замены в нативном гибридном прополипептиде эндогенного сайт расщепления протеазой между просегментом и гибридным полипептидом на экзогенный (относительно происхождения частей гибридного полипептида) или искусственный сайт расщепления протеазой,
- извлечение гибридного прополипептида из клетки или культивационной среды, отщепление гибридного прополипептида и, таким образом, получение (рекомбинантного) гибридного полипептида.
В одном из аспектов, описанных в данном документе, сайт расщепления протеазой между просегментом и зрелым полипептидом в прополипептиде заменяется экзогенным (относительно происхождения полипептида или частей гибридного полипептида) или искусственным сайтом расщепления протеазой.
Термин "эндогенный сайт расщепления протеазой», используемый в данном контексте, обозначает сайт расщепления протеазой, который в природе находится между просегментом и зрелым полипептидом.
Термин "экзогенный сайт расщепления протеазой», используемый в данном контексте, обозначает сайт расщепления протеазой, который в природе не обнаружен между просегментом и зрелым полипептидом.
При замене эндогенного сайта расщепления протеазой экзогенным сайтом расщепления протеазой процессинг и расщепление секретируемого прополипептида в его зрелой форме могут быть улучшены.
Экзогенный сайт расщепления протеазой может быть получен из любой протеазы, пока протеаза не присутствует/экспрессируется в клетке, из которой получен прополипептид, т.е. в которой прополипептид встречается в природе (частично или полностью).
Экзогенный сайт расщепления протеазой (по отношению к происхождению полипептида) может представлять собой любой экзогенный сайт расщепления протеазой, такой как, например, сайт расщепления IgA-протеазой, сайт расщепления протеазой TEV (от англ. tobacco etch virus - вирус табачной мозаики), сайт расщепления гранзимом В, сайт расщепления тромбином, сайт расщепления фактором 10, сайт расщепления энтерокиназой, сайт расщепления субтилизином, сайт расщепления катепсином, сайт расщепления металлопротеиназой, сайт расщепления протеазой IDES (от англ. IgG-degrading enzyme of Streptococcus pyogenes - фермент Streptococcus pyogenes, расщепляющий IgG), сайт расщепления протеазой PreScission или их функциональные варианты.
Расщепление прополипептида может происходить в различные моменты времени во время рекомбинантной продукции полипептида.
Расщепление прополипептида может происходить в культивационной среде. При этом экзогенную протеазу (обеспечивающую расщепление прополипептида) добавляют в культивационную среду, либо экзогенная протеаза (обеспечивающая расщепление прополипептида) коэкспрессируется в культивационной среде.
Кроме того, можно расщеплять прополипептид после его выделения из клеток, например, до, во время или после последующей обработки (но после культивирования).
В одном предпочтительном воплощении экзогенный сайт расщепления протеазой получен из другого организма, отличающегося от источника прополипептида и от рекомбинантной клетки, экспрессирующей этот прополипептид. Преимущество этого заключается в том, что можно определить точку процессинга прополипептида. Если клетка, экспрессирующая вариантный прополипептид, не коэкспрессирует экзогенную протеазу, и экзогенная протеаза не добавляется в культивационную среду, то расщепление уже не может быть осуществлено клеткой, экспрессирующей вариантный прополипептид, или во время культивирования, соответственно.
В одном воплощении расщепление прополипептида осуществляют во время очистки.
В одном воплощении расщепление прополипептида осуществляют на колонке во время процесса очистки. В одном конкретном воплощении колонна представляет собой аффинную колонку.
В одном предпочтительном воплощении расщепление прополипептида осуществляют путем инкубирования прополипептида с протеазой после того, как прополипептид был отделен от культивационной среды. В одном воплощении инкубацию осуществляют после первого этапа (хроматографической) очистки. В одном воплощении инкубацию осуществляют на колонке.
Эта методика также позволяет, например, включать в просегмент искусственную метку очистки, такую как, например, His6-метка, myc-метка, НА-метка или биотин/авидин-метка, для улучшения/упрощения очистки.
В одном воплощении прополипептид содержит просегмент и зрелый полипептид, где просегмент содержит метку очистки. В одном воплощении метка очистки выбрана из группы меток очистки, включающей His6-метку, myc-метку, НА-метку и биотин/авидин-метку.
В одном воплощении расщепление прополипептида, включающего метку очистки, осуществляют после этапа очистки с использованием метки очистки.
В любом случае отщепление просегмента от зрелого полипептида осуществляют перед введением зрелого полипептида пациенту. В одном воплощении расщепление осуществляют in vitro.
В одном предпочтительном воплощении эндогенный сайт расщепления протеазой представляет собой сайт расщепления IgA-протеазой, а метка очистки представляет собой гексагистидиновую (His6) метку. В одном воплощении гексагистидиновую метку конъюгируют через пептид GSG с сайтом расщепления протеазой.
Пример: пре-про-BDNF-вариант с экзогенным сайтом расщепления протеазой в прополипептиде BDNF
Примером полипептида, который экспрессируется в виде (пре)прополипептида и расщепляется в зрелую форму, является BDNF.
Человеческий BDNF дикого типа экспрессировали в клетках HEK293. Во время процессинга полипептида (т.е. во время экспрессии/рекомбинантной продукции) просегмент только частично удалялся под действием протеаз клетки-хозяина, что приводило к образованию смеси зрелого BDNF и непроцессированного про-BDNF. Человеческий про-BDNF процессировался во время секреции в клетке-хозяине, главным образом, с помощью фурина, секреторной конвертазы пробелков.
Был сконструирован про-BDNF-вариант, в котором природный сайт расщепления протеазы фурина был заменен экзогенным сайтом расщепления IgA-протеазой. IgA-протеаза распознает и расщепляет белки, содержащие аминокислотную последовательность N-X-Z-Pro-Pro/-Y-Pro-C (X - предпочтительно Pro или Ser; Y - Thr, Ser или Ala; Z - предпочтительно Arg или Thr). Аминокислотная последовательность про-BDNF-полипептида содержит сайт расщепления фурина (RVRR; SEQ ID NO 21). Сайт расщепления фурина был заменен сайтом расщепления IgA-протеазой (GSVVAPPAP; SEQ ID NO 22). Кроме того, через линкерный пептид GSG с С-концом BDNF был слит His6-сайт (НННННН, используется для аффинной очистки; SEQ ID NO 23). Также был удален потенциальный сайт расщепления протеазой (удаление С-концевой аминокислотной последовательности RGR; SEQ ID NO 24). В сравнительных вариантах мутация R54A была введена в прополипептид BDNF (пре-про-BDNF-полипептид имеет в аминокислотной позиции 54 аминокислотный остаток Ala вместо Arg), и/или вместо His6-метки использовали T7-His6-метку. Результаты приведены в следующей таблице (биологическая активность нормирована по концентрации зрелого BDNF).
Нумерация мутации R54A основана на аминокислотной последовательности пре-про-BDNF дикого типа (SEQ ID NO 20).
Сконструированный пре-про-BDNF-полипептид экспрессировали в клетках HEK293 с высоким выходом. Секретированный сконструированный про-BDNF-полипептид эффективно превращался in vitro в зрелый нативный BDNF путем расщепления IgA-протеазой.
Таким образом, в отличие от экспрессии нативного пре-про-BDNF-полипептида, содержащего природный сайт расщепления фурина/конвертазы пропептида, сконструированный про-BDNF полипептид, включающий экзогенный сайт расщепления IgA-протеазой, был получен в виде одного продукта экспрессии. Кроме того, были получены улучшенные экспрессионные выходы. Кроме того, зрелый BDNF-полипептид, полученный из сконструированного про-BDNF-полипептида, обладает повышенной биологической активностью, как зрелый BDNF-полипептид, полученный из пре-про-BDNF дикого типа, в клеточном анализе с репортерным геном люциферазы TrkB.
Пример: пре-про-BDNF-вариант с экзогенным сайтом расщепления протеазой и сконструированной меткой очистки в прополипептиде BDNF
Метки аффинности очень полезны для простой и эффективной очистки рекомбинантно полученных полипептидов. Тем не менее, искусственные метки очистки, которые остаются в конечном терапевтическом белке, неприемлемы для клинического применения по нескольким причинам, в том числе из-за потенциальной иммуногенности, изменений в биофизических и биохимических свойствах, а также биологической активности. Чтобы преодолеть эти ограничения, полезной является удаляемая метка очистки.
В одном воплощении (BDNF) прополипептид включает метку очистки.
Был сконструирован про-BDNF-вариант, в котором в прополипептид введена His6-метка. Кроме того, природный сайт расщепления фурином был заменен экзогенным сайтом расщепления IgA-протеазой, и/или в прополипептид была введена мутация R54A.
В сравнительном варианте His6-метка была слита через линкерный пептид GSG с С-концом BDNF. Кроме того, вместо His6-метки была использована T7-His6-метка. Результаты приведены в следующей таблице (биологическая активность нормирована по концентрации зрелого BDNF) и на фиг. 2.
Биологическую активность/функциональность полипептидов BDNF, полученных из различных вариантных про-BDNF-полипептидов, подтверждали в анализах in vitro и in vivo. Конструкции, содержащие сайт расщепления IgA-протеазой, показали улучшенную активность.
Удаляемая метка очистки (например, такая как гекса-гистидиновая метка), вставленная в N-концевую область пропептида, может быть использована для эффективного очищения, и будет отщепляется во время созревания белка in vitro. Таким образом, никакие потенциально иммуногенные пептидные последовательности не будут сохранены в зрелом полипептиде, который будет использоваться для введения in vivo.
III. Улучшение экспрессии путем снижения изоэлектрической точки
Некоторые полипептиды, например, нейротрофины, с основной изоэлектрической точкой (IEP), т.е. изоэлектрической точкой выше 9, имеют тенденцию к образованию агрегатов.
В одном из аспектов, описанных в данном документе, снижение изоэлектрической точки полипептида используется для увеличения выхода рекомбинантно продуцируемого полипептида с использованием клеток млекопитающих. Этот способ особенно подходит для полипептидов, имеющих изоэлектрическую точку выше 9 (высокая изоэлектрическая точка, основная изоэлектрическая точка), таких как, например, нейротрофины. Снижение (уменьшение) изоэлектрической точки может быть достигнуто за счет увеличения числа отрицательных зарядов в полипептиде, например, путем введением отрицательно заряженных аминокислотных остатков и/или слияния с отрицательно заряженной группировкой, такой как линкерный пептид. В качестве альтернативы, снижение IEP может быть достигнуто путем удаления положительных зарядов с поверхности полипептида, например, путем введения отрицательно заряженных аминокислотных остатков на поверхность полипептида. Это может быть сделано, например, путем замены одного или более чем одного основного аминокислотного остатка (остатков) остатком нейтральной гидрофильной аминокислоты и/или остатком кислой аминокислоты или их комбинацией.
Пример: варианты BDNF со сниженной изоэлектрической точкой
BDNF имеет изоэлектрическую точку примерно 10 и представляет собой липкую основную/щелочную молекулу (см., например, Leibrock, J., et al., Nature 341 (1989), 149-152).
Для того чтобы улучшить (секреторный) выход, были сконструированы варианты BDNF, в которых аминокислотные остатки были изменены таки образом, чтобы понизить изоэлектрическую точку молекулу. Кроме того, с С-концом BDNF сливали T7-His6-метку через линкерный пептид GSG. Кроме того, в одном сравнительном варианте удаляли потенциальный сайт расщепления протеазой (удаление С-концевой аминокислотной последовательности RGR; SEQ ID NO 23). В первом варианте были введены следующие аминокислотные мутации: Р60Е, K65D, K73D и K95A. Во втором варианте были введены следующие аминокислотные мутации: K65D, K73D, K95A и R97A. Значения IEP рассчитывали с использованием способа EMBOSS IEP (Alan Bleasby (ajb © ebi.ac.uk); European Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB10 1SD, UK). Результаты приведены в следующей таблице (биологические активности нормированы по концентрации зрелого BDNF).
В отличие от BDNF дикого типа сконструированные варианты BDNF с пониженной IEP стабильно накапливались в течение 3-6 дней в клеточной культуральной среде/супернатанте во временно трансфицированных клетках HEK293. Это также было показано с помощью исследования культивирования клеток, в котором очищенный зрелый BDNF (полученный в Е.coli) и очищенный myc-меченый вариант BDNF со сниженной IEP добавляли к растущей культуре клеток-хозяев HEK293 (концентрация BDNF, 10 мкг/мл). После 4 дней культивирования клеток определяли концентрацию оставшегося BDNF в клеточном культуральном супернатанте с помощью анализов SDS PAGE в восстанавливающих условиях и вестерн-блота: зрелый BDNF был полностью выведен из клеточного культурального супернатанта через 4 дня, в то время как myc-меченный вариант BDNF был почти полностью стабильным (см. фиг. 1).
IV. Повышение экспрессии путем сочетания различных модификаций
В одном из аспектов, приведенных в данном документе, для повышения рекомбинантной продукции полипептида была сделана/введена одна или более чем одна из следующих модификаций:
i) введение одного или более чем одного сайта гликозилирования, и/или
ii) замена эндогенного сайта расщепления протеазой между просегментом и зрелым полипептидом на экзогенный сайт (относительно происхождения полипептида) или искусственный сайт расщепления протеазой, и/или
iii) снижение изоэлектрической точки полипептида, и/или
iv) корректировка длины, соединения и заряда линкерного пептида.
Для дальнейшего повышения рекомбинантной продукции полипептида в некоторых воплощениях используются в комбинации любые две, любые три или все четыре модификации, описанные выше.
Пример: Нейротрофические белки
Иллюстративный нейротрофический белок представляет собой нейротрофический фактор головного мозга (BDNF).
В аминокислотной последовательности BDNF были сделаны две или более двух из следующих модификаций:
- введение одного или более чем одного искусственного сайта гликозилирования,
- введение опсиновой метки в качестве метки N-гликозилирования, и
- замена эндогенного сайта расщепления фурина экзогенным сайтом расщепления IgA-протеазой.
Результаты представлены в следующих таблицах (биологические активности нормированы по концентрации зрелого BDNF).
На фиг. 4 можно видеть, что экспрессионный/секреторный выход вариантных полипептидов BDNF, содержащих один или более чем один дополнительный сайт N-гликозилирования, улучшается (дорожка А, В и F на фиг. 4) по сравнению с вариантами BDNF без дополнительного N-гликозилирования (дорожка С, D и Е на фиг. 4).
V. Повышение экспрессии гибридных полипептидов, транспортирующихся через гематоэнцефалический барьер
Проникновение крупных биотерапевтических препаратов в мозг строго ограничено обширным и непроницаемым гематоэнцефалическим барьером (ВВВ) совместно с другими клеточными компонентами в нейрососудистом комплексе (neurovascular unit, NVU). Для преодоления этого препятствия были испытаны многие стратегии, и одна из них заключается в использовании путей трансцитоза, опосредованных эндогенными рецепторами, экспрессированными в эндотелии капилляров мозга. Против этих рецепторов были сконструированы рекомбинантные белки, такие как моноклональные антитела или полипептиды, для обеспечения рецептор-опосредованной доставки биотерапевтических препаратов в мозг.
Биотерапевтические препараты имеют огромный терапевтический потенциал для лечения патологии центральной нервной системы (ЦНС, central nervous system, CNS). Тем не менее, их путь в мозг предотвращается гематоэнцефалическим барьером. Предыдущие исследования продемонстрировали, что очень небольшой процент (примерно 0,1%) IgG, введенного в кровоток, способен проникать в компартмент ЦНС (Felgenhauer, Klin. Wschr. 52 (1974) 1158-1164). Это, безусловно, ограничивает любой фармакологический эффект из-за низкой концентрации биотерапевтического препарата в ЦНС. Таким образом, носители, включающие фрагменты антител, которые опосредуют транспорт в мозг биотерапевтических препаратов, таких как нейротрофические факторы, имеют большое медицинское значение.
Таким образом, были сконструированы гибридные полипептиды, содержащие эффекторную группу и одновалентную или двухвалентную связывающую группу, которая связывается с рецептором ВВВ (см., например, ЕР 12182181.3).
В одном воплощении одновалентная связывающая группа, специфически связывающаяся с рецептором гематоэнцефалического барьера, или одновалентный фрагмент антитела, специфически связывающийся с рецептором гематоэнцефалического барьера, предпочтительно выбраны среди scFv, Fv, scFab, Fab и VHH.
В одном воплощении эффекторная группа представляет собой нейротрофический полипептид, такой как BDNF.
В одном воплощении рецептор гематоэнцефалического барьера выбран из группы, включающей рецептор трансферрина, рецептор инсулина, рецептор инсулиноподобного фактора роста, белок 8, связанный с рецептором липопротеина низкой плотности, белок 1, связанный с рецептором липопротеина низкой плотности, и гепарин-связывающий фактор роста, подобный эпидермальному фактору роста
Пример: гибридные полипептиды, содержащие часть антитела и BDNF
Boado et al. (Biotechnol. Bioeng. 97 (2007) 1376-1386) сообщают о гибридном полипептиде антитело-BDNF, в котором амино-конец человеческого BDNF слит с карбоксильным концом тяжелой цепи химерного антитела, распознающим рецептор инсулина человека. Тем не менее, экспрессия этого гибридного полипептида не представляется возможной, поскольку гибридный полипептид агрегирует в клетке.
В целом, BDNF дикого типа или вариант BDNF может быть слит с полипептидной цепью антитела либо через С-конец, либо через N-конец. Поскольку BDNF действует только в виде гомодимера, разработка биологически активных гибридных полипептидов антитело-BDNF требует, чтобы и i) фолдинг, созревание и сборка BDNF-части, и ii) фолдинг и сборка из полипептидных цепей/доменов антитела были правильными. Таким образом, возможны различные форматы (комплексы) гибридных полипептидов, такие как, например, полное антитело, состоящее из двух тяжелых и легких цепей, Fab-фрагмент антитела, состоящий из легкой цепи и фрагмента тяжелой цепи, одноцепочечный Fab (scFab) или одноцепочечный Fv (scFv) в комбинации с N- или С-концевым слиянием с полипептидом BDNF. Также комплекс гибридного полипептида может содержать две или более двух различных полипептидных цепей, например, комбинацию BDNF-scFv-гибридного полипептида и зрелого (негибридного) BDNF-полипептида, BDNF-Fab(тяжелая цепь)-гибридного полипептида и BDNF-Fab(легкая цепь)-гибридного полипептида или BDNF-Fab(тяжелая цепь)-гибридного полипептида и Fab(легкая цепь)-гибридного полипептида и зрелого (не гибридного)-BDNF-полипептида. Кроме того, полипептид BDNF может быть слит либо непосредственно, либо через линкерный пептид с соответствующей полипептидной цепью антитела. Линкерные пептиды могут различаться по i) числу аминокислот, ii) виду аминокислот (например, отрицательно заряженных и/или гидрофобных аминокислот), и iii) сконструированным предполагаемым мотивам посттрансляционной модификации (например, мотивам сайтов N-гликозилирования). Например, полипептид BDNF может быть конъюгирован с различными фрагментами антител (например, Fab, scFab и scFv), соединенными с помощью различных линкерных пептидов, образуя различные биологически активные гибридные полипептиды.
Один из аспектов, описанных в данном документе, представляет собой гибридный полипептид, включающий
- ровно один полипептид BDNF дикого типа, или вариантный полипептид BDNF, или его фрагмент с активностью BDNF,
- фрагмент антитела, и
- линкерный пептид между полипептидом BDNF и фрагментом антитела.
Один из аспектов, описанных в данном документе, представляет собой гибридный полипептид с активностью BDNF (например, димерный комплекс), включающий
- ровно один тип из полипептида BDNF дикого типа, или вариантного полипептида BDNF, или его фрагмента с активностью BDNF,
- фрагмент антитела, и
- линкерный пептид между полипептидом BDNF и фрагментом антитела.
Другой аспект, описанный в данном документе, представляет собой димерный комплекс, содержащий
- в качестве первого компонента гибридный полипептид, описанный в данном документе, и
- в качестве второго компонента полипептид BDNF дикого типа, или вариант полипептида BDNF, или его фрагмент с активностью BDNF.
Было обнаружено, что только гибридные форматы "BDNF-антитело" экспрессируются и должным образом собираются в биологически активной форме в комплексе со вторым негибридным полипептидом BDNF, если формат содержит ровно один полипептид BDNF, ковалентно слитый через линкерный пептид с фрагментом антитела, и ровно один не гибридный полипептид BDNF.
Далее было установлено, что экспрессия таких конструкций может быть дополнительно улучшена с помощью линкерного пептида, содержащего один или более чем один отрицательно заряженный аминокислотный остаток.
Различные форматы гибридного полипептида подвергали временной экспрессии в клетках HEK293. Анализ проводили с использованием вестерн-блота и/или высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) на белке А. Результаты приведены в следующей ниже таблице (биологические активности нормированы по концентрации зрелого BDNF).
Описание графических материалов
Фиг. 1 Стабильность BDNF-вариантов во время культивирования клеток. BDNF дикого типа (А), полученный в Е.coli, и myc-меченый BDNF, полученный путем временной экспрессии в клетках HEK293 (В), добавляли к растущей культуре клеток HEK293 (10 мкг/мл) и определяли концентрацию BDNF в образцах в день 0 и день 4 с помощью анализов SDS-PAGE в восстанавливающих условиях и вестерн-блота с использованием антитела против BDNF для окрашивания/визуализации; дорожка 1: референсный материал от Peprotech (Е.coli); дорожка 2: маркер молекулярного веса; вестерн-блот был вырезан и повторно собран для простоты.
Фиг. 2 Анализ SDS-PAGE/вестерн-блот клеточных культуральных супернатантов, содержащих экспрессированные/секретированные вариантные полипептиды BDNF; дорожка 1: маркер молекулярного веса; дорожка 2: ряд 1 из таблицы 9; дорожка 3: ряд 5 из таблицы 9; дорожка 4: ряд 2 из таблицы 9; дорожка 5: ряд 4 из таблицы 9; дорожка 6: ряд 3 из таблицы 9; дорожка 7 - референс mBDNF; вестерн-блот был вырезан и повторно собран для простоты.
Фиг. 3 Анализ SDS-PAGE/вестерн-блот клеточных культуральных супернатантов, содержащих экспрессированные/секретированные вариантные BDNF-полипептиды; дорожка 1: маркер молекулярного веса; дорожка 2: ряд 1 из таблицы 6 (гликозилированный про-BDNF); дорожка 3: ряд 2 из таблицы 6 (про-BDNF); дорожка 4: ряд 3 из таблицы 6 (гликозилированный зрелый BDNF); дорожка 5: ряд 4 из таблицы 6 (зрелый BDNF).
Фиг. 4 Анализ SDS-PAGE/вестерн-блот клеточных культуральных супернатантов, содержащих экспрессированные/секретированные вариантные полипептиды BDNF, указанные в таблице 11; дорожка А: ряд 1 из таблицы 11; дорожка В: ряд 2 из таблицы 11; дорожка С: ряд 3 из таблицы 11; дорожка D: ряд 4 из таблицы 11; дорожка Е: ряд 5 из таблицы 11; дорожка F: ряд 6 из таблицы 11; звездочка означает, что были использованы различные условия экспрессии.
Следующие примеры, последовательности и графические материалы приведены для облегчения понимания данного изобретения, истинный объем которого изложен в прилагаемой формуле изобретения. Понятно, что в процедурах могут быть сделаны модификации без отклонения от сущности данного изобретения.
Примеры
Рекомбинантные методики ДНК
Для манипуляций с ДНК использовали стандартные способы, такие как описанные в Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Молекулярно-биологические реагенты использовали в соответствии с инструкциями изготовителей.
Генный синтез
Нужные гены и сегменты генов получали путем химического синтеза в Geneart GmbH (Регенсбург, Германия). Синтезированные гены и фрагменты генов клонировали в плазмиды для размножения/амплификации в Е.coli. Последовательность ДНК субклонированных генов и фрагментов генов проверяли путем секвенирования ДНК.
Определение белка
Белковую концентрацию очищенных полипептидов оценивали путем определения оптической плотности (OD) при 280 нм, используя коэффициент молярной экстинкции, рассчитанный на основании аминокислотной последовательности полипептида.
Описание основной/стандартной плазмиды для экспрессии в клетках млекопитающих
Нужные гены/полипептиды подвергали экспрессии путем временной трансфекции клеток эмбриональной почки человека (HEK293). Для экспрессии нужного гена/полипептида (например, гибридного полипептида "антитело-GFP", BDNF дикого типа, вариантных полипептидов BDNF, гибридных полипептидов BDNF-Fab и BDNF-scFv) использовали транскрипционную единицу, включающую следующие функциональные элементы:
- немедленный ранний энхансер и промотор из человеческого цитомегаловируса (HCMV), включая интрон А,
- 5'-нетранслируемую область (5'-UTR) тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина,
- ген, который должен быть экспрессирован, и
- последовательность полиаденилирования из бычьего гормона роста (BGH рА).
Помимо экспрессионной единицы/кассеты, содержащей нужный ген, который должен быть экспрессирован, основная/стандартная плазмида для экспрессии в клетках млекопитающих содержит
- сайт начала репликации из вектора pUC18, который делает возможной репликацию этой плазмиды в Е.coli, и
- ген бета-лактамазы, который придает устойчивость к ампициллину в Е.coli.
Пример 1
Создание плазмид для экспрессии антител
a) Создание плазмид для экспрессии родительского человеческого антитела против человеческого IGF-1R
Сегменты гена, кодирующие вариабельные области человеческой легкой каппа-цепи (Vk) и тяжелой цепи (VH), присоединяли к сегментам гена, кодирующим константную область человеческой легкой каппа-цепи (Ck) или константную область человеческой тяжелой цепи гамма-1 (СН1-шарнир-СН2-СН3), соответственно. Гены обеих цепей антитела экспрессировали из двух отдельных экспрессионных плазмид, включающих геномную экзон-интронную структуру генов антител. Аминокислотные последовательности зрелых (без сигнальных последовательностей) тяжелой и легкой цепей антитела против человеческого IGF-1R показаны в SEQ ID NO 05 и SEQ ID NO 06.
Экспрессия цепей антитела контролировалась укороченным (с делецией интрона А) немедленным ранним энхансером и промотором из человеческого цитомегаловируса (HCMV), включая 5'-нетранслируемую область (5'-UTR) человеческой тяжелой цепи иммуноглобулина, сигнальную последовательность тяжелой цепи мышиного иммуноглобулина и сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста (BGH рА). Экспрессионные плазмиды также содержали сайт начала репликации и ген бета-лактамазы из вектора pUC18 для амплификации плазмиды в Escherichia coli (см. Kopetzki, Е., et al., Virol. J. 5 (2008) 56; Ji, C, et al., J. Biol. Chem. 284(2009) 5175-5185).
b) Создание плазмиды для экспрессии легкой цепи антитела против рецептора трансферрина
Для того чтобы получить легкую цепь антитела против рецептора трансферрина, химически синтезировали ген легкой цепи, кодирующий сигнальную последовательность тяжелой цепи мышиного иммуноглобулина MGWSCIILFLVATATGVHS (SEQ ID NO 14), вариабельный домен VL крысиного антитела против мышиного рецептора трансферрина и константную область человеческой легкой цепи Vkappa. Аминокислотную последовательность VL-домена антитела крысы получали из Boado, R.J., et al., Biotechnol. Bioeng. 102 (2009) 1251-1258. Аминокислотная последовательность легкой цепи химерного крысиного/человеческого антитела против рецептора трансферрина показана в SEQ ID NO 80.
Пример 2
Создание плазмид для экспрессии гибридного полипептида "антитело - GFP"
a) Создание плазмид для экспрессии гибридных полипептидов "анти-IGF-1R-антитело - GFP"
Все гены, кодирующие гибридные полипептиды "тяжелая цепь человеческого анти-IGF-1R-антитела - GFP", собирали путем слияния химически синтезированного фрагмента ДНК, кодирующего соответствующий вариант GFP, и глицин-серинового линкера, состоящего из двух повторов Gly4Ser и дополнительного Gly (тяжелая цепь…LSPG-gggsggggsg-GFP), с 3'-концом гена тяжелой цепи анти-IGF-1R-антитела, кодирующего слегка усеченную константную область человеческой тяжелой цепи гамма-1 (удаление последней природной аминокислоты Lys). Аминокислотная последовательность гибридного белка, состоящего из тяжелой цепи анти-IGF-1R-антитела и eGFP, emGPF и tagGFP, показана в SEQ ID NO 07, SEQ ID NO 08 и SEQ ID NO 09, соответственно.
Гены тяжелой и легкой цепи антитела экспрессировали из двух отдельных экспрессионных плазмид, включающих геномную экзон-интронную структуру генов антитела.
b) Создание экспрессионных плазмид для гибридных полипептидов, состоящих из тяжелой цепи анти-IGF-1R-антитела и eGFP-опсиновой метки
Экспрессионные плазмиды для временной экспрессии в клетках HEK293 гибридных полипептидов, состоящих из тяжелой цепи анти-IGF-1R-антитела и GFP-опсиновой метки, получали из экспрессионных векторов, описанных выше. Они отличаются только в сегменте ДНК, кодирующем GFP-опсиновую метку, где пептид из 19 аминокислот (NGTEGPNFYVPFSNATGVV; опсин(М); SEQ ID NO 10) сливали непосредственно с С-концом соответствующего GFP. В качестве примера, аминокислотная последовательность гибридного полипептида, состоящего из тяжелой цепи анти-IGF-1R-антитела и eGFP-опсиновой (М) метки, показана в SEQ ID NO 33.
Пример 3
Создание экспрессионных плазмид BDNF
a) Создание экспрессионных плазмид для пре-про-BDNF дикого типа
Сегмент ДНК, кодирующий ген пре-про-BDNF человека, получали путем химического синтеза и вставляли в основной экспрессионный вектор, описанный выше. С этой целью ген пре-про-BDNF лигировали с CMV-промотором на его 5'-конце и с последовательностью полиаденилирования бычьего гормона роста на его 3'-конце. Аминокислотная последовательность пре-про-BDNF-белка дикого типа показана в SEQ ID NO 20.
b) Создание экспрессионных плазмид для вариантов BDNF
Для того чтобы получить оптимальный выход продукции, было сконструировано несколько вариантов BDNF (см. таблицу ниже):
- в некоторых вариантах сигнальная последовательность BDNF дикого типа (пресегмент) была заменена на сигнальную последовательность, полученную из высоко экспрессированной тяжелой цепи мышиного иммуноглобулина (MGWSCIILFLVATATGVHS);
- в некоторых вариантах использование кодонов в гене, кодирующем BDNF, было заменено на использование оптимизированных кодонов в просегменте и/или в зрелой части BDNF; гены BDNF с оптимизированными кодонами были получены путем обратной трансляции аминокислотной последовательности с использованием алгоритмов из Geneart (см., например, Fath, S., et al., PLOS One 6 (2011) e17596);
- в некоторых вариантах использовали T7-His6-метку (SEQ ID NO 12), так как она, как правило, увеличивает экспрессию белка (см., например, Luan, С.Н., et al., Genome Res. 14 (2004) 2102-2110);
- в большинство вариантов BDNF была включена His6-метка для упрощения получения/очистки образца;
- в некоторых вариантах последние три С-концевые аминокислоты, RGR-мотив зрелого BDNF, были удалены, так как они могут функционировать как зашифрованный сайт расщепления протеазой для протеаз, таких как фурин, или других конвертаз пробелка;
- в другом варианте сигнальная последовательность и просегмент BDNF были заменены соответствующей аминокислотной последовательностью человеческого NGF, так как было опубликовано, что этот вариант повышает экспрессию другого нейротрофина (Iwane et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 41 (1994) 225-232).
1: С-концевой RGR-мотив BDNF удален (deltaRGR)
2: сигнальная последовательность, полученная из высоко экспрессируемой тяжелой цепи иммуноглобулина мышиного антитела (MGWSCIILFLVATATGVHS), определенная аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO 14
3: сигнальная последовательность и про-фрагмент BDNF, замененные соответствующей последовательностью из человеческого NGF
с) Создание экспрессионных плазмид для вариантов пре-про(IgA)-BDNF и пре-про(IgA; His6). частично включающих His6-метку с N-конца зрелого BDNF в просегменте
Ген пре-про-(IgA)-BDNF кодирует вариант прополипептида, в котором природный сайт расщепления фурина (RVRR) заменен сконструированным сайтом расщепления IgA-протеазой с последовательностью GSVVAPPAP (см. таблицу ниже).
Кроме того, в некоторых вариантах в прополипептид BDNF вводили точечную мутацию R54A, чтобы удалить предполагаемый сайт расщепления протеазой (см. Mowla, S.J., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 12660-12666). Кроме того, в некоторых вариантах в профрагмент также включали удаляемую His6-метку с N-конца зрелого BDNF. Эта метка упрощает белковую очистку про(IgA; His6)-BDNF-вариантного белка. После окончательного созревания белка in vitro с помощью IgA-протеазы про(IgA; His6-фрагмент) удаляли и, таким образом, избегали потенциального риска иммуногенности.
Экспрессионные плазмиды для временной экспрессии пре-про(IgA)-BDNF- и пре-про(IgA; His6)-BDNF-вариантных генов/белков в клетках HEK293 получали из экспрессионного вектора, описанного выше, который кодирует пре-про-BDNF(-RGR)-Т7-His6-белок. Они дифференцируются по следующим характеристикам:
Нумерация мутации R54A основана на аминокислотной последовательности пре-про-BDNF дикого типа (SEQ ID NO 20)
d) Создание экспрессионных плазмид для вариантов BDNF со сконструированной изоэлектрической точкой
Ранее были описаны некоторые экспрессированные в Е.coli и подвергнутые рефолдингу варианты BDNF со сконструированной пониженной IEP. Ген пре-про-BDNF(-RGR)-T7-His6 подвергали мутированию соответственно, и полученные мутантные гены BDNF временно экспрессировали в клетках HEK293 (см. таблицу ниже). Кроме того, был сконструирован myc-меченый вариант BDNF, так как (1) myc-метка (EQKLISEEDL; SEQ ID NO 90) вводит изменение заряда примерно -3, и (2) myc-метка имеет человеческое происхождение и, таким образом, должна быть менее иммуногенной.
-RGD и (deltaRGR); удаление последних трех С-концевых аминокислот зрелого BDNF;
нумерация аминокислотных мутаций начинается с первой аминокислоты зрелого BDNF;
IEP зрелых BDNF(-RGR)-вариантов рассчитывали с использованием статистической программы Pepstats от European Molecular Biology Open Software Suite (EMBOSS).
e) Создание экспрессионных плазмид для вариантов BDNF с дополнительными сайтами гликозилирования
Были получены варианты BDNF, которые несут (1) С-концевую метку, содержащую сайты гликозилирования или (2) один сконструированный сайт гликозилирования в пределах зрелой BDNF-группировки.
Метки гликозилирования были выведены из опубликованных последовательностей (например, Meder, D., et al., J. Cell Biol. 168 (2005) 303-313; Bulbarelli, A., et al., J. Cell Sci. 115 (2002) 1689-1702; Perlman, S., et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 88 (2003) 3227-3235; WO 2002/002597), и предположительные сайты N-гликозилирования были предсказаны с помощью искусственной нейронной сети (сервер NetNglyc; http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/).
Для введения сайтов N-гликозилирования в зрелую BDNF-группировку последовательность проверяли на наличие аспарагинов, серинов или треонинов в последовательности зрелого BDNF. Затем на основе трехмерной белковой структуры человеческого BDNF (1bnd; www.rcsb.org) были исключены все не поверхностно расположенные остатки Asn, Ser или Thr. Для остальных поверхностно расположенных остатков Asn, Ser и Thr были идентифицированы смежные аминокислотные остатки, чтобы сконструировать предполагаемый сайт N-гликозилирования (консенсусный мотив: N-X-(S/T), X - любая аминокислота кроме Pro) путем сайт-направленного мутагенеза. Аминокислотные позиции этих предполагаемых сконструированных сайтов N-гликозилирования были использованы для идентификации соответствующих аминокислот в структурно и функционально гомологичных нейротрофинах NGF и NT-3 путем выравнивания последовательностей и сравнения 3D-структур белка. Были исключены те аминокислотные позиции, которые, как ожидается, будут частью поверхности взаимодействия нейротрофин::p75NTR или нейротрофин::Trk(А, В), на основании гомологичных кристаллических структур рецептор:лиганд (например, 3buk, 3ij2 и 2ifg). Отдельные мутации для поверхностно экспонированных предполагаемых сайтов N-гликозилирования вне предполагаемых поверхностей взаимодействия BDNF-TrkB/p75 указаны в приведенной ниже таблице (второй столбец).
Экспрессионные плазмиды для временной экспрессии N-гликозилированных вариантных белков BDNF в клетках HEK293 получены из экспрессионного вектора, кодирующего вариант BDNF пре-про-BDNF(-RGR)-T7-His6 (-RGR: усеченный зрелый BDNF дикого типа, в котором последние три С-концевые аминокислоты RGR были удалены; Т7-метка и His6-метка присоединены к усеченному С-концу BDNF через GSG-линкер). Сегменты BDNF, метки, гликолинкеры и мутации, введенные для создания дополнительных искусственных сайтов N-гликозилирования, представлены в следующей таблице.
SEQ ID NO № для аминокислотных мутаций, введенных путем сайт-направленного мутагенеза в зрелый BDNF (deltaRGR), иллюстративно приведены для BDNF-вариантов пре-про-BDNF(-RGR; M61T)-T7-His6 и пре-про-BDNF(-RGR; R81N)-T7-His6.
f) Создание экспрессионных плазмид для вариантов BDNF, содержащих комбинированные мутации для введения множественных (двух или более) сайтов N-гликозилирования и сайта расщепления IgA
Для того чтобы создать варианты BDNF с множественными сайтами N-гликозилирования, были объединены некоторые из дополнительных сайтов N-гликозилирования, выявленных в предыдущих экспериментах. Исходная конструкция вариантного полипептида пре-про(IgA)-BDNF(-RGR)-His6 характеризуется сайтом расщепления IgA-протеазой вместо нативного сайта фурина в просегменте, усечением с С-конца зрелого BDNF (удаление последних трех аминокислот RGR) и С-концевой His6-меткой. Желательные мутации и метки были введены/присоединены, как показано в приведенной ниже таблице.
g) Создание экспрессионных плазмид для вариантов BDNF. содержащих комбинированные мутации для введения множественных (двух или более) сайтов N-гликозилирования и сайта расщепления IgA
Для того чтобы создать варианты BDNF с множественными сайтами N-гликозилирования, были объединены некоторые из дополнительных сайтов N-гликозилирования, выявленных в предыдущих экспериментах. С этой целью в качестве исходного материала использовали вариантный белок пре-про-BDNF(-RGR)-T7-His6, который характеризуется усечением с С-конца зрелого BDNF (удалением последних трех аминокислот RGR) и С-концевой Т7-His6-меткой. Желательные мутации были вставлены, как показано в приведенной ниже таблице.
Пример 4
Создание экспрессионных плазмид для гибридных полипептидов, состоящих из фрагментов антитела и BDNF
a) Создание экспрессионных плазмид для гибридных полипептидов, состоящих из BDNF и Fab тяжелой цепи антитела
Для того чтобы получить гибридные полипептиды BDNF-(Gly4Ser)n-Fab(тяжелой цепи анти-IGF-1R-антитела), были сконструированы плазмиды для временной экспрессии в клетках HEK293, которые несут химически синтезированный фрагмент ДНК с CDS (кодирующей ДНК-последовательностью), кодирующей полипептиды со следующими характеристиками:
- пре-про-BDNF-группировка дикого типа с удаленным С-концевым RGR-мотивом слита на С-конце с глицин-богатым линкером с последующей Fab-частью тяжелой цепи (VH-CH1) человеческого анти-IGF-1R-антитела и С-концевой His6-меткой;
- глицин-богатый линкер состоит из мотива (G4S)2-GG, или (G4S)4-GG, или (G4S)6-GG (см. таблицу ниже).
b) Создание экспрессионных плазмид для гибридных полипептидов, состоящих из BDNF и Fab легкой цепи антитела
Для того чтобы получить гибридные полипептиды BDNF-(Gly4Ser)n-Fab, были сконструированы плазмиды для временной экспрессии в клетках HEK293, которые несут химически синтезированный фрагмент ДНК с CDS, кодирующей полипептиды со следующими характеристиками:
- пре-про-BDNF-группировка дикого типа с удаленным С-концевым RGR-мотивом слита на С-конце с глицин-богатым линкером с последующими Fab-доменами легкой цепи VL-Ckappa человеческого анти-IGF-1R-антитела и С-концевой His6-метки;
- глицин-богатый линкер состоит из мотива (G4S)2-GG, или (G4S)4-GG, или (G4S)6-GG (см. таблицу ниже).
c) Создание экспрессионной плазмиды для легкой цепи анти-IGF-1R-антитела
Нативную легкую цепь анти-IGF-1R-антитела использовали для создания BDNF-Fab-комплексов на основе анти-IGF-1R. Создание плазмиды для экспрессии легкой цепи анти-IGF-1R-антитела описано в примере 1.
d) Создание экспрессионной плазмиды для гибридных полипептидов BDNF-Fab(тяжелой цепи анти-IGF-1R-антитела). содержащих отрицательно заряженный Gly-Asp-линкер
Для того чтобы получить гибридный полипептид BDNF-(G3D)4-РаЬ(тяжелой цепи анти-IGF-1R-антитела), конструировали плазмиду для временной экспрессии в клетках HEK293, которая скрывала химически синтезированный фрагмент ДНК с CDS, кодирующей полипептид со следующими характеристиками:
- пре-про-BDNF-группировка дикого типа с удаленным С-концевым RGR-мотивом слита на С-конце с глицин-богатым отрицательно заряженным линкером с последующими Fab-доменами тяжелой цепи VH-CH1 человеческого анти-IGF-1R-антитела и С-концевой His6-меткой;
- глицин-богатый отрицательно заряженный линкер состоит из мотива (G3D)4-GGGS.
е) Создание экспрессионных плазмид для гибридных полипептидов BDNF-Fab(тяжелой цепи анти-IGF-1R-антитела), несущих сайт расщепления IgA в про-BDNF-сегменте, отрицательно заряженный GlyAsp-линкер и множественные сайты N-гликозилирования
Для того чтобы получить гибридные полипептиды про(IgA)-BDNF-(G3D)4-Fab (тяжелой цепи анти-IGF-1R-антитела) с множественными сайтами N-гликозилирования, конструировали плазмиды для временной экспрессии в клетках HEK293, которые несли химически синтезированный фрагмент ДНК с CDS, кодирующей полипептиды со следующими характеристиками:
- пре-про(IgA)-BDNF-группировка с удаленным С-концевым RGR-мотивом зрелого BDNF слита на С-конце с удлиненной опсин-меткой (NGTEGPNFYVPFSNATGVVR; опсин(L); SEQ ID NO 16) с последующими отрицательно заряженным линкером, богатым глицином и аспарагиновой кислотой, и Fab-частью тяжелой цепи (VH-CH1, частично удлинен пептидом EPKSC из шарнира) человеческого моноклонального антитела, направленного против инсулиноподобного фактора роста человека 1 (IGF-1R) и С-концевой His6-метки;
- отрицательно заряженный линкер, богатый глицином и аспарагиновой кислотой, состоит либо из мотива (G3D)4-GGGS, либо из мотива (G2D)5-G2SG.
Детали конструкций приведены в таблице ниже.
е) Создание экспрессионных плазмид для гибридных полипептидов BDNF-Fab(тяжелой цепи антитела против рецептора трансферрина), несущих сайт расщепления IgA в про-BDNF-сегменте, отрицательно заряженный GlyAsp-линкер и множественные сайты N-гликозилирования
Для того чтобы получить гибридные полипептиды про(IgA)-BDNF-(G3D)4-Fab(тяжелой цепи анти-TfR-антитела) с отрицательно заряженным GlyAsp-линкером и множественными сайтами N-гликозилирования, конструировали плазмиды для временной экспрессии в клетках HEK293, которые несли химически синтезированный фрагмент ДНК с CDS, кодирующей полипептиды со следующими характеристиками:
- пре-про(IgA)-BDNF-группировка с удаленным С-концевым RGR-мотивом слита на С-конце с опсин(L)-меткой с последующими отрицательно заряженным линкером, богатым глицином и аспарагиновой кислотой, и химерной крысиной/человеческой Fab-частью тяжелой цепью, в которой вариабельный домен VH получен из крысиного моноклонального антитела 8D3, которое направлено против мышиного рецептора трансферрина (mTfR), и в которой домен СН1 получен из человеческого IgG1, и С-концевой His6-меткой; аминокислотная последовательность VH-домена антитела получена из Boado, R.J. et al., Biotechnol. Bioeng. 102 (2009) 1251-1258);
- отрицательно заряженный линкер, богатый глицином и аспарагиновой кислотой, состоит из мотива (G3D)4-GGGS;
- в большинстве вариантов эндогенный сайт расщепления фурина/РС конвертазы между просегментом и зрелой частью BDNF заменен на сайт расщепления IgA-протеазой (GSVVAPPAP);
- в некоторых вариантах усеченная зрелая BDNF-группировка дикого типа (BDNF; deltaRGR) заменена на усеченный зрелый вариант BDNF, несущий искусственный сайт гликозилирования R209N (BDNF (deltaRGR; R209N)).
Детали конструкций приведены в таблице ниже.
Пример 6
е) Создание экспрессионной плазмиды для гибридных полипептидов BDNF-scFv
Для того чтобы получить гибридные полипептиды BDNF(G4S)3-scFv-тяжелая цепь анти-IGF-1R-антитела, конструировали плазмиды для временной экспрессии в клетках HEK293, которые несли химически синтезированный фрагмент ДНК с CDS, кодирующей полипептид со следующими характеристиками:
- пре-про-BDNF-группировка дикого типа с удаленным С-концевым RGR-мотивом слита на С-конце с (G4S)3-линкером с последующей scFv-группировкой человеческого антитела против человеческого IGF-1R;
- scFv-группировка антитела против человеческого IGF-1R построена из домена VL, за которым следует (G4S)4-GG-линкер, VH-область и His6-метка; аминокислотная последовательность гибридного белка пре-про-BDNF(-RGR)_(G4S)3_scFv-His6<IGF-1R> показана в SEQ ID NO 78.
Пример 7
Временная экспрессия, очистка и аналитическая характеризация полипептидов
Временная экспрессия
Полипептиды были получены путем временной трансфекции клеток HEK293 (линия, полученная из эмбриональных клеток почки человека 293), культивированных в среде F17 (Invitrogen Corp.). Для трансфекции использовали реагент "293-Free" Transfection Reagent (Novagen). Гибридные полипептиды, содержащие антитело и фрагмент антитела (Fab и scFv), экспрессировали с одной, двух или трех различных плазмид с использованием эквимолярном соотношения плазмиды после трансфекции. Трансфекцию выполняли согласно инструкциям производителя. Клеточные культуральные супернатанты, содержащие рекомбинантный полипептид, собирали в течение 4-7 дней после трансфекции. Супернатанты хранили при пониженной температуре до очистки.
Общая информация касательно рекомбинантной экспрессии человеческих иммуноглобулинов, например, в клетках HEK293, дана, например, в Meissner, P., et al., Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 197-203.
Очистка
a) GFP-гибридные полипептиды очищали с помощью двухэтапной процедуры, включающей хроматографию на белке А и эксклюзионную хроматографию на колонке Superdex 200™
Клеточные культуральные супернатанты, содержащие GFP-гибридные полипептиды, фильтровали. После этого GFP-гибридные полипептиды захватывали путем аффинной хроматографии с использованием колонки HiTrap MabSelectSuRe (GE Healthcare), уравновешенной PBS (1 мМ KH2PO4, 10 мМ NaHPO4, 137 мМ NaCl, 2.7 мМ KCl, рН 7,4). Несвязанные полипептиды удаляли путем промывания уравновешивающего буфера, и гибридный полипептид извлекали с помощью 0,1 М цитратного буфера, рН 2,8. Сразу после элюирования фракции нейтрализовали до рН 6,0 с помощью 1 М Трис-основания, рН 9,0.
Эксклюзионную хроматографию на Superdex 200™ (GE Healthcare, Упсала, Швеция) использовали в качестве второго этапа очистки. Эксклюзионную хроматографию проводили в 50 мМ гистидиновом буфере, 0,15 М NaCl, рН 6,8. Выделенные GFP-гибридные полипептиды хранили при -80°С.
b) Гистидин-меченные белки очищали с помощью двухэтапного протокола, начиная с аффинной хроматографии с иммобилизованным ионом металла (IMAC), и продолжая эксклюзионной хроматографией на колонке с Superdex 75™.
Клеточные культуральные супернатанты, содержащие гистидин-меченные полипептиды, подводили с помощью NaCl до конечной концентрации NaCl 500 мМ. Отфильтрованный культуральный супернатант наносили на колонку Ni-Sepharose™ 6 Fast Flow, предварительно уравновешенную NiA-буфером (50 мМ Tris, 300 мМ NaCl, 5 мМ имидазол, содержащий таблетку смеси ингибиторов протеаз без EDTA, как указано в инструкции производителя; EDTA-free Complete Mini Tablets; Roche Applied Science) со скоростью потока 1 мл/мин с использованием системы explorer 100 (GE Healthcare, Упсала, Швеция). Колонку промывали NiA-буфером до тех пор, пока показатели УФ не возвращались к исходному уровню. Гистидин-меченный полипептид элюировали линейным градиентом имидазола от 5 мМ до 300 мМ в 50 мМ TRIS и 500 мМ NaCl, рН 8,0, в 10 объемах колонки.
Эксклюзионную хроматографию на Superdex 75™ (GE Healthcare, Упсала, Швеция) использовали в качестве второго этапа очистки. Эксклюзионную хроматографию проводили в 50 мМ гистидиновом буфере, 0,15 М NaCl, рН 6,8. Элюированные гистидин-меченные белки хранили при -80°С.
Аналитическая характеризация
Белковые концентрации очищенных полипептидов определяли путем измерения оптической плотности (OD) при 280 нм, используя коэффициент молярной экстинкции, рассчитанный на основании аминокислотной последовательности. Чистоту и надлежащее образование димеров полипептидов анализировали с помощью SDS-PAGE в присутствии и в отсутствие восстанавливающего агента (5 мМ 1,4-дитиотреитол) и окрашивания Кумасси бриллиантовым синим. Содержание агрегатов в препаратах Fc-гибридных полипептидов определяли с помощью высокоэффективной SEC с использованием аналитической эксклюзионной колонки Superdex 200™ (GE Healthcare, Упсала, Швеция). Целостность аминокислотного остова выделенных полипептидов подтверждали с помощью масс-спектрометрии на Nano Electrospray QTOF после удаления N-гликанов путем ферментативной обработки комбинацией нейраминидазы, О-гликаназы и пептид-N-гликозидазы F (Roche Applied Science, Мангейм, Германия).
Определение концентрации BDNF в культуральных супернатантах
Концентрацию BDNF дикого типа, вариантов BDNF и гибридных полипептидов, содержащих BDNF, в культуральных супернатантах определяли путем полуколичественного анализа вестерн-блота с использованием рекомбинантного человеческого BDNF от Peprotech (каталоговый номер: 450-02) в качестве референсного стандарта. Для окрашивания использовали кроличье анти-BDNF-антитело (Santa Cruz, каталоговый номер: SC-20981) (первое антитело), конъюгированную с пероксидазой хрена овечью противокроличью антисыворотку (разведение 1:5000, Roche Diagnostics GmbH, Германия) (вторичное антитело) и усиленный хемилюминесцентный субстрат (LUMI-Light plus Western Blotting substrate, Roche Diagnostics GmbH, Германия).
Концентрацию BDNF-гибридных полипептидов также определяли путем BDNF ELISA с использованием набора BDNF Emax® ImmunoAssay Kit от Promega (каталоговый номер: G7610) в соответствии с инструкциями поставщика.
Пример 8
Функциональная характеризация in vitro
Определение биологической активности GFP дикого типа и GFP-содержащих гибридных полипептидов
Биологическую активность очищенного GFP дикого типа и GFP-содержащих гибридных полипептидов контролировали с помощью их свойств биолюминесценции (GFP-специфическая флуоресценция).
Определение аффинности связывания BDNF с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR, BIAcore)
Аминное сочетание примерно 750 резонансных единиц (RU) в системе захвата (захват МКА, специфичного для человеческого IgG, Jackson Immunoresearch) выполняли на чипе СМ5 при рН 4,5 с использованием набора для аминного связывания в соответствии с инструкцией производителя (поставляется компанией GE Healthcare, Упсала, Швеция). Человеческий Fc-меченый TrkB (R&D Systems, каталоговый номер: 688-ТК-100) захватывали в концентрации 5 мкг/мл. Избыточные сайты связывания блокировали путем введения смеси человеческих Fc в концентрации 1,25 мкМ (Biodesign, каталоговый номер: 50175). Различные концентрации BDNF-содержащих гибридных полипептидов в интервале от 0,1 нМ до 50 нМ пропускали со скоростью потока 10 мкл/мин через проточные ячейки при 298 К в течение 120-240 с. Фазу диссоциации наблюдали в течение периода до 600 с и прерывали путем переключения с раствора образца на проточный буфер. Поверхность подвергали регенерации путем промывания в течение 1 мин 100 мМ раствором фосфорной кислоты со скоростью потока 30 мкл/мин. Для всех экспериментов был выбран буфер HBS-P+, поставляемый компанией GE Healthcare (10 мМ HEPES ((4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота)), рН 7,4, 150 мМ NaCl, 0,05% (об/об) поверхностно-активного вещества Р20).
Разницу в объемных рефракционных показателях корректировали путем вычитания ответа, полученного для поверхности, связанной с бланком. Пустые введения также вычитали (двойной референс).
Константу равновесной диссоциации (Kd), определенную как ka/kd, определяли с помощью анализа кривых сенсограммы, полученных с несколькими различными концентрациями, используя пакет программного обеспечения BIAevaluation 4.1. После подгонки данных следовала подходящая модель связывания.
Определение аффинности связывания BDNF с помощью ELISA
Связывающие свойства BDNF-содержащих гибридных белков определяли с помощью ELISA TrkB. Планшеты Maxisorb покрывали 1 мкг/мл гибридного TrkB-Fc (R&D Systems) в PBS в течение ночи при температуре 4°С. После блокировки планшета с помощью PBSTC (PBS с 0,05% Tween-20 и 2% куриной сыворотки (Gibco)) в течение 1 ч при комнатной температуре и трех промываний с помощью PBST BDNF-содержащие гибридные белки или в только BDNF добавляли в лунки в концентрациях от 15 до 500 нг/мл в PBSTC и инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре. После шести промываний лунки инкубировали с мышиным анти-BDNF-антителом (клон 4F11.1A1, 1 мкг/мл в PBSTC) и, после дополнительных промываний, с противомышиным HRP-антителом (1:10000 в PBSTC), обе инкубации в течение 1 ч при комнатной температуре. После трех промываний с помощью PBST определяли активность HRP с использованием ABTS-субстрата и фотометрической оценки при длине волны 492 нм.
Определение биологической активности BDNF-содержащих гибридных белков с помощью анализа с репортерным геном TrkB
Биологическую активность BDNF-вариантов и BDNF-содержащих гибридных белков определяли с помощью TrkB-трансфицированных клеток линии СНО, содержащий стабильно трансфицированный ген-репортер люциферазы под контролем SRE (элемент ответа сыворотки)-содержащего промотора (СНО-K1-hTrkB/pSRE-Luc). За день до экспериментов клеточную среду заменяли с ростовой среды (среда Хэма F12, содержащая 10% FCS, 2 мМ L-глутамина, 300 мкг/мл G418 и 3 мкг/мл пуромицина) на такую же среду без FCS. На следующий день, 105 клеток на лунку высевали в 96-луночный планшет в 50 мкл среды, а затем BDNF добавляли гибридные белки в концентрациях от 0,02 нМ до 115 нМ в 50 мкл среды. После инкубации в течение 4 ч при 37°С, 7,5% CO2, клетки инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре и в каждую лунку добавляли 100 мкл реагента BrightGlo Luciferase Assay reagent (Promega). Люминисценцию мчитывали после 5-минутной инкубации, используя планшетный ридер Tecan (время интегрирования 100 мс).
Определение биологической активности BDNF-содержащих гибридных белков в анализе роста невритов SH-SY5Y
Биологическую активность BDNF-вариантов и BDNF-содержащих гибридных белков определяли с помощью анализа роста нейритов с использованием клеток человеческой нейробластомы SH-SY5Y. Вкратце, клетки SH-SY5Y высевали в 96-луночный планшет с плотностью 4000 клеток на лунку в нормальной ростовой среде (среда Хэма F12, 1х заменимые аминокислоты (PAN), 10% FCS, 2 мМ L-глутамина, 1х пируват натрия (PAN)) с добавлением 10 мкМ ретиноевой кислоты (Sigma), чтобы индуцировать дифференцировку нейронов. Через три дня среду заменяли ростовой среды, содержащей различные концентрации BDNF-гибридных белков. После трех дополнительных дней клетки фиксировали с использованием 4% параформальдегида в PBS в течение 10 мин при комнатной температуре, промывали, быстро пермеабилизовали (0,1% Тритон-Х-100), блокировали 1% BSA в PBS и окрашивали на анти-бета-тубулиновую иммунореактивность с использованием антитела TuJ1 (Covance) в разведении 1:1000 в PBS/1% BSA, с последующими тремя промываниями и инкубацией с Alexa-488-меченным противокозлиным антителом (Invitrogen). Число невритов определяли путем флуоресцентной микроскопии, оценивая одно поле зрения на лунку.
Определение связывающей активности гибридных белков, содержащих антитело/фрагмент антитела, с помощью FACS
Связывающая активность BDNF-гибридных белков с соответствующими целевыми рецепторами (рецептор трансферрина, IGF-1R) определяли с помощью FACS. Клетки, экспрессирующие соответствующий рецептор (мышиный рецептор трансферрина: мышиные эмбриональные фибробласты MEF-1; IGF-1R: фибробласты 3Т3, стабильно трансфицированные человеческим IGF-1R) собирали из их ростовых сред, промывали PBS и ресуспендировали в буфере FACS (PBS + 5% FCS; 100 мкл, содержащие 3×105 клеток на лунку в 96-луночном круглодонном планшете). Первичное антитело (в зависимости от используемого BDNF-гибридного белка, например, противочеловеческий Fab (Jackson ImmunoResearch) или анти-His6-антитело (Roche)) добавляли в концентрации 1-10 мкг/мл и клетки инкубировали в течение 2 ч на льду. После трех промываний буфером FACS связанное антитело обнаруживали с использованием РЕ-меченого вторичного антитела (Jackson ImmunoResearch, 1:5000 - 1:10000) в течение одного часа на льду. Клетки снова промывали и измеряли среднюю флуоресценцию на цитометре FACS Canto (Becton-Dickinson).
Claims (11)
1. Способ получения рекомбинантного полипептида нейротрофина, включающий следующие этапы:
- культивирование клетки млекопитающего, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид нейротрофина в виде прополипептида, состоящего из просегмента и полипептида, в котором эндогенный сайт ферментативного расщепления между просегментом и полипептидом заменен сайтом расщепления IgA-протеазой, где указанная клетка млекопитающего экспрессирует указанный прополипептид;
- добавление lgA-протеазы в культивационную среду с расщеплением прополипептида на просегмент и полипептид;
- извлечение рекомбинантного полипептида из культивационной среды и, таким образом, получение рекомбинантного полипептида нейротрофина,
при этом указанная клетка млекопитающего не является эмбриональной клеткой человека.
2. Способ получения рекомбинантного полипептида нейротрофина, включающий следующие этапы:
- культивирование клетки млекопитающего, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид нейротрофина в виде прополипептида, состоящего из просегмента и полипептида, в котором эндогенный сайт ферментативного расщепления между просегментом и полипептидом заменен сайтом расщепления IgA-протеазой, где указанная клетка млекопитающего экспрессирует указанный прополипептид;
- извлечение прополипептида из культивационной среды или клетки;
- обработка прополипептида IgA-протеазой с расщеплением прополипептида на просегмент и полипептид и, таким образом, получение рекомбинантного полипептида нейротрофина,
при этом указанная клетка млекопитающего не является эмбриональной клеткой человека.
3. Способ по п. 1 или 2, где нейротрофин выбран из фактора роста нервов (NGF), нейротрофического фактора головного мозга (BDNF), нейротрофина 3 (NT-3) и нейротрофина 4 (NT-4).
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP13198738 | 2013-12-20 | ||
EP13198738.0 | 2013-12-20 | ||
PCT/EP2014/077196 WO2015091144A1 (en) | 2013-12-20 | 2014-12-10 | Improved recombinant polypeptide production methods |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2019134445A Division RU2019134445A (ru) | 2013-12-20 | 2014-12-10 | Улучшенные способы получения рекомбинантного полипептида |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2016128367A RU2016128367A (ru) | 2018-01-25 |
RU2711322C1 true RU2711322C1 (ru) | 2020-01-16 |
Family
ID=49886715
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2016128367A RU2711322C1 (ru) | 2013-12-20 | 2014-12-10 | Улучшенные способы получения рекомбинантного полипептида |
RU2019134445A RU2019134445A (ru) | 2013-12-20 | 2014-12-10 | Улучшенные способы получения рекомбинантного полипептида |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2019134445A RU2019134445A (ru) | 2013-12-20 | 2014-12-10 | Улучшенные способы получения рекомбинантного полипептида |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US10370692B2 (ru) |
EP (1) | EP3083977B1 (ru) |
JP (1) | JP6618912B2 (ru) |
KR (1) | KR20160098277A (ru) |
CN (1) | CN105829542A (ru) |
BR (1) | BR112016012229A2 (ru) |
CA (1) | CA2929149A1 (ru) |
HK (1) | HK1223980A1 (ru) |
MX (1) | MX368656B (ru) |
RU (2) | RU2711322C1 (ru) |
WO (1) | WO2015091144A1 (ru) |
Families Citing this family (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DK3313879T3 (da) | 2015-06-24 | 2022-03-14 | Hoffmann La Roche | Anti-transferrinreceptor-antistoffer med tilpasset affinitet |
AR106189A1 (es) | 2015-10-02 | 2017-12-20 | Hoffmann La Roche | ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS CONTRA EL A-b HUMANO Y EL RECEPTOR DE TRANSFERRINA HUMANO Y MÉTODOS DE USO |
KR20180054864A (ko) | 2015-10-02 | 2018-05-24 | 에프. 호프만-라 로슈 아게 | 이중특이성 항-인간 cd20/인간 트랜스페린 수용체 항체 및 사용 방법 |
JP7361031B2 (ja) * | 2017-11-30 | 2023-10-13 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | ヒト化trkb遺伝子座を含む非ヒト動物 |
EP3854805A4 (en) * | 2018-09-21 | 2022-08-24 | Innovent Biologics (Suzhou) Co., Ltd. | NOVEL INTERLEUKIN 2 AND ITS USE |
KR102027955B1 (ko) | 2019-01-24 | 2019-10-02 | 이현종 | 로스터 후드용 내부커버 및 이의 제조방법 |
BR112022016948A2 (pt) * | 2020-02-25 | 2022-11-22 | Momenta Pharmaceuticals Inc | Enzimas para sialilação de glicanos |
IT202000032423A1 (it) * | 2020-12-24 | 2022-06-24 | Univ Degli Studi Di Trieste | Metodo per la produzione di forme processate proteoliticamente di fattori trofici o fattori di crescita |
US20230340058A1 (en) * | 2021-11-11 | 2023-10-26 | Tectonic Therapeutic, Inc. | Relaxin-2 fusion protein analogs and methods of using same |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2008025527A1 (en) * | 2006-08-31 | 2008-03-06 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Method for the production of insulin-like growth factor-i |
WO2009126616A2 (en) * | 2008-04-07 | 2009-10-15 | Zymogenetics, Inc. | Thrombin activator compostions and methods of making and using the same |
Family Cites Families (24)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
NZ236819A (en) * | 1990-02-03 | 1993-07-27 | Max Planck Gesellschaft | Enzymatic cleavage of fusion proteins; fusion proteins; recombinant dna and pharmaceutical compositions |
JPH07509444A (ja) | 1991-11-26 | 1995-10-19 | アルカーメス・インコーポレーテツド | トランスフェリンセレプター特異的抗体−神経薬又は診断薬複合体の製造法 |
US5586553A (en) | 1995-02-16 | 1996-12-24 | Minimed Inc. | Transcutaneous sensor insertion set |
EP1121382B9 (en) | 1998-10-16 | 2007-07-04 | Biogen Idec MA Inc. | Interferon-beta fusion proteins and uses |
IL129427A0 (en) * | 1999-04-13 | 2000-02-17 | Yeda Res & Dev | Preparation of biologically active molecules |
SE9901428D0 (sv) | 1999-04-21 | 1999-04-21 | Karolinska Innovations Ab | Amphibodies |
US20020127652A1 (en) * | 2000-02-11 | 2002-09-12 | Schambye Hans Thalsgard | Follicle stimulating hormones |
WO2002002597A2 (en) | 2000-06-30 | 2002-01-10 | Maxygen Aps | Peptide extended glycosylated polypeptides |
AR040778A1 (es) | 2002-08-06 | 2005-04-20 | Glaxo Group Ltd | Anticuerpos alterados o fragmentos funcionales que se unen a mag (glicoproteina asociada a mielina). |
GB0412186D0 (en) * | 2004-05-28 | 2004-06-30 | Univ Cambridge Tech | Production of recombinant protein |
US7697967B2 (en) | 2005-12-28 | 2010-04-13 | Abbott Diabetes Care Inc. | Method and apparatus for providing analyte sensor insertion |
CN105153306B (zh) | 2005-06-07 | 2020-12-11 | 艾斯巴技术-诺华有限责任公司 | 抑制TNFα的稳定和可溶的抗体 |
US8142781B2 (en) | 2005-10-07 | 2012-03-27 | Armagen Technologies, Inc. | Fusion proteins for blood-brain barrier delivery |
AU2007269233B2 (en) | 2006-06-30 | 2011-06-09 | Cnj Holdings, Inc. | Method of producing Factor VIII proteins by recombinant methods |
JP5959795B2 (ja) | 2006-08-18 | 2016-08-02 | アーメイゲン・テクノロジーズ・インコーポレイテッドArmagen Technologies, Inc. | 血液脳関門送達のための物質 |
JP2011528605A (ja) | 2008-07-21 | 2011-11-24 | アルスタシス,インコーポレイテッド | 組織内に管を形成するデバイス、方法、及びキット |
CA2757669A1 (en) | 2009-04-07 | 2010-10-14 | Roche Glycart Ag | Bispecific anti-erbb-1/anti-c-met antibodies |
UA117801C2 (uk) | 2010-11-30 | 2018-10-10 | Дженентек, Інк. | Лікування неврологічного порушення за допомогою антитіла, яке має низьку афінність до рецептора гематоенцефалічного бар'єру |
WO2012087835A2 (en) | 2010-12-22 | 2012-06-28 | Boston Biomedical Research Institute | Compositions and methods for enhancing protein folding |
KR101614195B1 (ko) | 2011-03-29 | 2016-04-20 | 로슈 글리카트 아게 | 항체 Fc 변이체 |
RU2013150331A (ru) | 2011-04-20 | 2015-05-27 | Рош Гликарт Аг | СПОСОБ И УСТРОЙСТВА ДЛЯ рН-ЗАВИСИМОГО ПРОХОЖДЕНИЯ ГЕМАТОЭНЦЕФАЛИЧЕСКОГО БАРЬЕРА |
RU2014137623A (ru) * | 2012-02-29 | 2016-04-20 | Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг | Колоночное ферментативное расщепление |
EP2668901A1 (en) | 2012-05-31 | 2013-12-04 | Roche Diagniostics GmbH | Sensor insertion assembly, sensor cartridge, and inserter |
CA2879496C (en) | 2012-08-29 | 2024-01-09 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Blood brain barrier shuttle |
-
2014
- 2014-12-10 JP JP2016541174A patent/JP6618912B2/ja active Active
- 2014-12-10 US US15/106,205 patent/US10370692B2/en active Active
- 2014-12-10 BR BR112016012229A patent/BR112016012229A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2014-12-10 WO PCT/EP2014/077196 patent/WO2015091144A1/en active Application Filing
- 2014-12-10 RU RU2016128367A patent/RU2711322C1/ru not_active IP Right Cessation
- 2014-12-10 EP EP14827183.6A patent/EP3083977B1/en active Active
- 2014-12-10 CA CA2929149A patent/CA2929149A1/en not_active Abandoned
- 2014-12-10 MX MX2016007207A patent/MX368656B/es active IP Right Grant
- 2014-12-10 RU RU2019134445A patent/RU2019134445A/ru unknown
- 2014-12-10 KR KR1020167016420A patent/KR20160098277A/ko not_active Application Discontinuation
- 2014-12-10 CN CN201480069054.1A patent/CN105829542A/zh active Pending
-
2016
- 2016-10-25 HK HK16112252.0A patent/HK1223980A1/zh unknown
-
2019
- 2019-05-15 US US16/413,063 patent/US11098338B2/en active Active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2008025527A1 (en) * | 2006-08-31 | 2008-03-06 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Method for the production of insulin-like growth factor-i |
WO2009126616A2 (en) * | 2008-04-07 | 2009-10-15 | Zymogenetics, Inc. | Thrombin activator compostions and methods of making and using the same |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
CHEN X. et al., Fusion protein linkers: property, design and functionality, Advanced drug delivery reviews, 2013, V. 65, N. 10, p.1357-1369. * |
KJELDSEN T. et al., A removable spacer peptide in an α-factor-leader/insulin precursor fusion protein improves processing and concomitant yield of the insulin precursor in Saccharomyces cerevisiae, Gene, 1996, V. 170, N. 1, p.107-112. * |
KJELDSEN T. et al., A removable spacer peptide in an α-factor-leader/insulin precursor fusion protein improves processing and concomitant yield of the insulin precursor in Saccharomyces cerevisiae, Gene, 1996, V. 170, N. 1, p.107-112. CHEN X. et al., Fusion protein linkers: property, design and functionality, Advanced drug delivery reviews, 2013, V. 65, N. 10, p.1357-1369. ГУЛЬКО Л. Б. и др., Получение полипептидного препарата VNTR22 (MUC1) с потенциальной вакцинирующей противоопухолевой активностью, Биотехнология, 2000, N. 3, с.3-8. * |
LO K. M. et al., High level expression and secretion of Fc-X fusion proteins in mammalian cells, Protein engineering, 1998, V. 11, N. 6, p.495-500. * |
ГУЛЬКО Л. Б. и др., Получение полипептидного препарата VNTR22 (MUC1) с потенциальной вакцинирующей противоопухолевой активностью, Биотехнология, 2000, N. 3, с.3-8. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN105829542A (zh) | 2016-08-03 |
WO2015091144A1 (en) | 2015-06-25 |
EP3083977B1 (en) | 2018-02-28 |
US20160326562A1 (en) | 2016-11-10 |
CA2929149A1 (en) | 2015-06-25 |
HK1223980A1 (zh) | 2017-08-11 |
US11098338B2 (en) | 2021-08-24 |
EP3083977A1 (en) | 2016-10-26 |
RU2016128367A (ru) | 2018-01-25 |
JP2017500040A (ja) | 2017-01-05 |
MX368656B (es) | 2019-10-10 |
RU2019134445A (ru) | 2019-12-20 |
US20190271021A1 (en) | 2019-09-05 |
BR112016012229A2 (pt) | 2017-09-26 |
MX2016007207A (es) | 2016-07-21 |
JP6618912B2 (ja) | 2019-12-11 |
KR20160098277A (ko) | 2016-08-18 |
US10370692B2 (en) | 2019-08-06 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2711322C1 (ru) | Улучшенные способы получения рекомбинантного полипептида | |
JP5963341B2 (ja) | 均質な抗体集団 | |
CN105175532B (zh) | 结合pcsk9的基于纤连蛋白的支架域蛋白质 | |
WO2021047558A1 (zh) | 断裂型内含肽、使用其的重组多肽的制备方法 | |
EP3331903B1 (en) | Heteromers comprising antibody domain fusion proteins | |
KR20210114927A (ko) | 이황화 결합을 특징 짓는 방법 | |
EP3917951A1 (en) | Aflibercept attributes and methods of characterizing and modifying thereof | |
US20220348623A1 (en) | Stabilized proteolytically activated growth differentiation factor 11 | |
US20230103563A1 (en) | Split ch2 domains | |
CN115803009A (zh) | 用于治疗眼病和癌症的vegf阱和微阱及方法 | |
JP2012528812A (ja) | ヒトccn1に対する抗体とその用途 | |
US11795205B2 (en) | Heterodimeric Relaxin fusions polypeptides | |
WO2017029129A1 (en) | Heteromers with enzymatic activity | |
US20230357341A1 (en) | Fusion protein containing erythropoietin polypeptide | |
EP2832854A1 (en) | Method for improving the recombinant expression of a polypeptide by C-terminal fusion to human neprilysin | |
CN116390952A (zh) | Fgfr1/klb靶向性激动型抗原结合蛋白及其与glp-1r激动肽的缀合物 | |
KR20210010428A (ko) | 신규 중간체 제조를 통한 지속형 약물 결합체의 제조 방법 | |
Kaden et al. | Homophilic interactions of the APP ectodomain are regulated by the loop region and affect ß-secretase cleavage of APP |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20201211 |