JP2012528812A - ヒトccn1に対する抗体とその用途 - Google Patents
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Abstract
哺乳動物細胞において、哺乳動物細胞膜結合型ヒトCCN1又はそのCCN1ドメインを組換え発現させる方法において、CCN1、又は哺乳動物細胞膜貫通ドメインにC末端で融合したそのCCN1ドメイン(CCN1融合タンパク質)をコードするベクターで、哺乳動物宿主細胞を形質転換させ、前記宿主細胞において前記CCN1又はCCN1ドメイン融合タンパク質を発現させ、前記膜結合CCN1又は前記CCN1ドメインを回収することを特徴とする方法。そして抗体の産生のための、そのような膜結合CCN1及びドメインの使用。ヒトCCN1に対する抗体は疾患の治療に有用である。
Description
本発明は、ヒトCCN1に対する抗体(CCN1抗体)、その製造方法、該抗体を含む薬学的組成物、及びその用途に関する。
CCN1(CYR61、GIG-1、IGFBP-10、SwissProt O00622)は、増殖因子誘導性前初期遺伝子で、CCNタンパク質ファミリーのメンバーであり、細胞接着、血管新生、アポトーシス、及び増殖停止又は増殖刺激のいずれかに関与している(Chen Y. 及び Xiao-Yan D., J. Cell. Biochem. 100 (2007) 1337-1345, 及びKubota, K. 及び Tagikawa, M., Angiogenesis 10 (2007) 1-11に概説)。CCN1はモジュラー構造からなり、38の保存システイン残基を含む。CCN1は他のCCNタンパク質(C末端モジュールを欠くCCN5を除く)と共通のモジュラー構造を共有する。CCN1は、インスリン様増殖因子結合タンパク質(IGFBP)様モチーフ(ドメインI、IGF-BP、アミノ酸26−97)、フォン・ヴィルブランドC型ドメイン(ドメインII、VWC、アミノ酸98−164)、トロンボスポンジンI型ドメイン(ドメインIII、TSP、アミノ酸228−273)、及びC末端モジュール(ドメインIV、CT、アミノ酸286−360)を含む。ドメインIIとIIIとの間には、可変ドメイン(Var、アミノ酸165−227)が位置する。CCN1は、インテグリンαvβ3に結合し、またこれを介して、血管新生促進活性を促進するように機能する(Chen, Nら, J. Biol. Chem. 42 (2004) 44166-44176)。CCN1のインテグリンαvβ3結合部位は、アミノ酸116−135(Chen Nら,J. Biol. Chem. 42 (2004) 44166-44176)の間と、ドメインIII(Leu, S.Jら, J. Biol.Chem. 278 (2003) 33801-33808)中に存在する。インテグリンα6β1とヘパリン結合部位は、細胞性媒介ドメインIII及びIVに位置する(Chenら, J. Biol. Chem. 276 (2001) 47329-47337)。
CCNタンパク質が、N末端近傍にインスリン様増殖因子結合タンパク質(IGFBP)様モチーフを共有しているが、IGFシグナル伝達経路における機能を示唆する明確な実験的な有意性は存在しない(Grotendorst, G.Rら, Endocrinology 141 (2000) 2254-2256)。フォン・ヴィルブランドC型ドメイン(VWC)、トロンボスポンジンI型ドメイン、及びC末端モジュール(WISP2/CCN5には存在していない)は、タンパク質−タンパク質相互作用、オリゴマー化(VWC)又は細胞外マトリックス分子及びレセプターとの相互作用にとって重要であると考えられている。
マウスCCN1は、ヒトCCN1と91%のアミノ酸配列同一性を共有する。マウスCCN1、及びマウスCCN1に対する抗体は、O'Brien, T.Pら, Mol. Cell. Biol. 10 (1990) 3569-3577)から知られている。また、CCN1と結合組織増殖因子-II(CTGF2/CTGH2)との間には高度な相同性が存在する。さらなる(しかしより低い)相同性が、NOV及びFISB-12とに見出されている。Babic, A.Mら, Proc. Natl. Acad. Sci.USA 95 (1998) 6355-6360には、ヒトCCN1に対する抗体が、FISB-12ではなく、マウスCCN1と交差反応性を示すことが記載されている。
CCN1とCCN1に対する抗体は、結合組織増殖因子-II''(CTGF-2)に関する国際公開第96/001896号、ヒトCCN1に関する国際公開第97/033995号、CCN1組成物及び方法に関する国際公開第01/55210号、CCN1組成物及び方法に関する国際公開第2005/040191号、結合組織増殖因子-II’’(CTGF-2)に関する国際公開第02/04480号、乳癌の治療及び診断用の標的としてのCCN1に関する国際公開第01/98359号、ヒト子宮筋腫の治療及び診断におけるCCN1の使用に関する国際公開第02/26193号に記載されている。Grotendorst, G.R. 及び Duncan, M.R., FASEB J. 19 (2005) 729-738には、CTGFのドメインに対する抗体が記載されており、N末端及びC末端ドメインに対する抗体へのある種の活性が見出されている。ドメインがプラスミン切断により産生された場合、この切断は可変ドメイン内で生じ、該ドメインは破壊された。
Dong Xieら, J. Biol. Chem. 276 (2001) 14187-14194には、CCN1がより進行した疾患に関連していること、Cancer Res. 64 (2004) 1987-199には、CCN1が神経膠腫で過剰発現し、インテグリン関連キナーゼ媒介性akt及びβ-カテニン-TCF/Lefシグナル伝達経路に関与していることが記載されている。
Schuetze, Nら, Protein Expr. Purif. 42 (2005) 219-225は、組換えCCN1の発現、精製及び機能試験に関する。Schuetzeは、バキュロウイルス発現ベクター中にオープンリーディングフレームをクローニングし、SF-21昆虫細胞にコンストラクトを形質移入した。組換えCCN1は、ヒトIgGのFc-ドメインとの融合タンパク質として発現され、プロテインG-セファロースカラムでのアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製された。CCN1が10%のシステイン残基を有しているので、精製及び取扱い中に容易に失われうるおそれのある非常に接着性のタンパク質である。また、該タンパク質は凝集体を形成し、精製中又は精製後に沈殿する傾向がある。Fc-タグの付加により、これらの困難は最小化された。筆者は、rCCN1タンパク質のFc-タグが、タンパク質の生化学的特性を変えるか又はそれに影響を与えるかどうかについて、はっきりしなかった。Leu, S.Jら, J. Biol. Chem. 278 (2003) 33801-33808には、ドメインI(IGFBP)、ドメインII(VWC)及びドメインIII(TSP1)のヘキサヒスチジンタグ化CCN1断片の組換え発現が記載されている。天然の非タグ化タンパク質は入手できない。
Jedsadayanmata, Aら, J. Biol. Chem. 274 (1999) 24321-24327には、ヒト血小板の活性化依存性接着の研究のための、CCN1の可変ドメイン(a.a.163−229)及びTSP1ドメイン(a.a.228−273)の一部を有するペプチドに対して産生された抗ペプチドポリクローナル抗体が記載されている。ポリクローナル抗血清は、大腸菌中で組換え的に生産されたVar-GST融合タンパク質でウサギを免疫化することにより産生された(Kireevaら, Exp. Cell Res. 233 (1997) 63-77)。米国特許第7521540号には、ヒトCyr61のアミノ酸163−229と210−225に結合する抗体が特許請求されている。米国特許第7521540によれば、GSTにCyr61のアミノ酸163−229を融合させたコンストラクトを使用し、ポリクローナルCyr61特異的抗血清が、ニュージーランドホワイトウサギの免疫化により作製された。
本発明は、哺乳動物細胞膜結合型ヒトCCN1、又はそのCCN1ドメインを哺乳動物細胞において組換え発現させる方法において、CCN1、又は哺乳動物細胞膜貫通ドメインにC末端的に融合したそのCCN1ドメイン(CCN1融合タンパク質)をコードする核酸ベクターを用いて哺乳動物細胞を形質転換させ、該宿主細胞において前記CCN1又はCCN1ドメイン融合タンパク質を発現させ、前記膜結合CCN1又はその前記CCN1ドメインを回収することを特徴とする方法を含む。好ましくは、前記CCN1ドメインは、CCN1の可変ドメインである。
本発明は、CCN1に対する抗体を生じさせるための、哺乳動物細胞膜結合型CCN1又はCCN1ドメインの使用をさらに含む。膜結合CCN1又はCCN1ドメインは、免疫源として、及び/又は本発明に係る抗体の選択のために使用することができる。好ましくは、前記CCN1ドメインは、CCN1の可変ドメインである。
本発明は、CCN1可変ドメインのアミノ酸210から228、及びPDGFレセプター(ヒトベータ型血小板由来増殖因子レセプター)の膜貫通ドメインにC末端的に融合するCCN1の可変ドメインからなる融合タンパク質に特異的に結合することを特徴とする、ヒトCCN1に対する抗体をさらに含み、該融合タンパク質は、哺乳動物、好ましくはヒト細胞の表面で発現される。このような細胞は、例えば、HEK293又はNIH3T3等の哺乳動物細胞系の細胞とできる。好ましくは、細胞はHEK293である。
本発明は、重鎖可変ドメインCDR3領域として配列番号:1のCDR3領域を含むことを特徴とする、CCN1に特異的に結合する抗体を含む。
好ましくは、CCN1に特異的に結合する抗体は、重鎖可変ドメインが、配列番号:1のCDR3領域と配列番号:2のCDR2領域を含むことを特徴とする。
好ましくは、CCN1に特異的に結合する抗体は、重鎖可変ドメインが、配列番号:1のCDR3領域、配列番号:2のCDR2領域、及び配列番号:3のCDR1領域を含むことを特徴とする。
好ましくは、CCN1に特異的に結合する抗体は、重鎖可変ドメインが、配列番号:1のCDR3領域、配列番号:2のCDR2領域、及び配列番号:3のCDR1領域を含み、軽鎖可変ドメインが、配列番号:4のCDR3領域、配列番号:5のCDR2領域、及び配列番号:6のCDR1領域を含むことを特徴とする。
好ましくは、CCN1に特異的に結合する抗体は、重鎖可変ドメインが配列番号:7を含むことを特徴とする。好ましくは、抗体は、重鎖可変ドメインが配列番号:7を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号:8を含むことを特徴とする。重鎖可変ドメイン配列番号:7及び軽鎖可変ドメイン配列番号:8は、ヒトラムダアイソタイプのものである。
好ましくは、CCN1に特異的に結合する抗体は、重鎖可変ドメインが重鎖可変ドメイン配列番号:7のCDRグラフト化IgG1サブタイプ型であり、軽鎖可変ドメインが軽鎖可変ドメイン配列番号:8のCDRグラフト化ラムダアイソタイプ型であることを特徴とする。
好ましくは、抗体は、モノクローナル抗体420が結合するのと同じCCN1エピトープ(配列番号:7及び8)に結合することを特徴とする。
好ましくは、本発明に係る抗体は、上述のアミノ酸配列又はアミノ酸配列断片及び特性により特徴付けられる。本発明に係る抗体は、好ましくはヒト由来のFc部分を含む。好ましくは、本発明に係る抗体は、ヒトIgG1又はIgG4アイソタイプのものである。IgG1及びIgG4定常鎖の例は、以下の配列表に提供する。好ましくは、抗体はヒトIgG1クラスのものである。好ましくは、抗体はヒト化されるか、又はヒト抗体である。
本発明に係る抗体は、好ましくは少なくとも10−7M−1〜10−12M−1の親和性で、CCN1、及び膜結合CCN1可変領域に特異的に結合する。本発明に係る抗体は、10μg/mlで50%以上、EA-Hy-926細胞と組換えCCN1との間の相互作用を阻害する(接着アッセイ)。
本発明は、疾患、好ましくは腫瘍疾患の治療のための、本発明に係る抗体を使用をさらに含む。
本発明は、疾患、好ましくは腫瘍疾患の治療のための医薬の製造のための、本発明に係る抗体の使用をさらに含む。
本発明は、本発明に係る抗体を含有せしめることを特徴とする、疾患、好ましくは腫瘍疾患(特に、乳癌、原発性神経膠腫、膵臓癌、膀胱乳頭腫、結腸腺癌、メラノーマ、髄芽種、小児腫瘍、線維肉腫)の治療のための医薬を製造する方法をさらに含む。
本発明は、本発明の抗体を含有する薬学的組成物をさらに含む。本発明は、疾患の治療における使用のための本発明の抗体の使用をさらに含む。本発明は、医薬の製造における使用のための本発明に係る抗体の使用をさらに含む。
「抗体」なる用語は、限定されるものではないが、全抗体及び抗体断片を含む種々の形態の抗体構造を包含する。本発明に係る抗体は、好ましくはヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、又は本発明の特徴的特性が保持されている限りは、さらに遺伝子的に改変された抗体である。「抗体断片」は完全長抗体の一部、好ましくはその可変ドメイン、又は少なくともその抗原結合部位を含む。抗体断片の例には、ダイアボディ、単鎖抗体分子、及び多重特異性抗体で、抗体断片から形成されたものが含まれる。scFv抗体は、例えばHouston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-96に記載されている。また、抗体断片は、VHドメインの特性を有する、すなわちVLドメインと共にアセンブリ可能であるか、又はCCN1に結合するVLドメインの特性を有する、すなわち機能的抗原結合部位にVHドメインと共にアセンブリ可能であり、それによって本発明に係る抗体の特徴を提供する単鎖ポリペプチドを含む。ここで使用される「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」なる用語は、単一のアミノ酸組成物の抗体分子の調製物を意味する。「ヒト化抗体」なる用語は、フレームワーク及び/又は「相補性決定領域」(CDR)が、親免疫グロブリンのものと比較して、異なる種の免疫グロブリンのCDRを含むように修飾されている抗体を意味する。好ましい実施態様では、マウスCDRは、ヒト抗体のフレームワーク領域にグラフトされ、「ヒト化抗体」が調製される。Riechmann, Lら, Nature 332 (1988) 323-327;及び Neuberger, M.Sら, Nature 314 (1985) 268-270を参照。
膜結合CCN1ドメインを組換え発現させるための方法、及びCCN1に対する抗体を産生させるための前記膜結合CCN1ドメインの使用に関し、ここで使用される「CCN1ドメイン」なる用語は、インスリン様増殖因子結合タンパク質(IGFBP)様モチーフ(ドメインI、IGF-BP、アミノ酸26−97)、フォン・ヴィルブランドC型ドメイン(ドメインII、VWC、アミノ酸98−164)、トロンボスポンジンI型ドメイン(ドメインIII、TSP、アミノ酸228−273)、C末端モジュール(ドメインIV、CT、アミノ酸286−360)、及び可変ドメイン(Var、アミノ酸165−227)を含む群から選択されるCCN1ドメインを意味する。膜結合CCN1ドメインを組換え発現させるための方法、及びCCN1に対する抗体を生じさせるための前記膜結合CCN1ドメインの使用に関し、CCN1ドメインなる用語は、1から8のアミノ酸がN末端で及び/又はC末端で欠失しているCCN1ドメイン断片もまた含む。
ここで使用される「CCN1に特異的に結合する」なる用語は、細胞当たり>100.000分子CCN1の量で、その膜結合CCN1を組換え的に発現する細胞、及び検出用抗体としてFITC標識された抗ヒトIgG抗体を使用するFACSにより、測定される細胞結合アッセイにおける、ヒトCCN1に対する抗体の結合性を意味する。10μg/mlの抗体濃度で、検出抗体単独(抗ヒトIgG抗体、FITC標識、同濃度、10μg/ml)でのバックグラウンド染色に関し、抗体が、蛍光を少なくとも10倍増加させるならば、結合が見出される。
ここで使用される「CCN1可変ドメインに特異的に結合する」なる用語は、細胞当たり>100.000分子可変ドメインの量で、膜結合可変ドメインを組換え的に発現する細胞、及び検出抗体としてFITC標識された抗ヒトIgG抗体を使用するFACSにより、測定される細胞結合アッセイにおける、ヒトCCN1の可変ドメイン(Var、アミノ酸165−227)に対する抗体の結合性を意味する。10μg/mlの抗体濃度で、検出用抗体単独(抗ヒトIgG抗体、FITC標識、同濃度、10μg/ml)でのバックグラウンド染色に関し、抗体が、蛍光を少なくとも8倍増加させるならば、結合が見出される。
FACSシグナルは、ポジティブ及びネガティブ(コントロール、ノイズシグナル)蛍光試料間の領域オーバーラップを形態測定学的に測定することにより定量される。有用なツールは、「Measuring Colocalization」MetaMorph Imaging softwareからのアルゴリズム(www.moleculardevices.com)である。
CCN1の直鎖状断片への結合は、VARドメイン(163.aaから240.aa)を包含する合成ペプチドを使用するELISAにより測定される。重複ペプチドを用いた測定に基づき、 Mab420は、ヒトCCN1のアミノ酸210から228からなるCCN1エピトープに結合する。
本発明に係るCCN1抗体は、CCN1の膜結合可変ドメインに、また抗体Mab420が結合するCCN1の可変ドメイン上の同じエピトープに特異的に結合する。本発明のCCN1抗体のエピトープ結合特性は、膜結合CCN1又は膜結合可変ドメインへの試験抗体の結合を妨害するMab420抗体の能力を測定するための、FACSインビトロ交差ブロッキング結合アッセイにより測定される細胞結合アッセイによって決定される。このようなアッセイでは、Mab420は、膜結合CCN1又はCCN1の膜結合可変ドメインを組換え的に発現する細胞に予め結合されており、試験抗体が続いて添加される。同濃度(10μg/ml)で、試験抗体の結合が、(同じ濃度であるが予め結合されたMab420のない試験抗体の結合性に関して)少なくとも15%阻害されているならば、エピトープは「同じ」である。
ここで使用される「本発明に係る抗体の可変ドメイン」(軽鎖の可変ドメイン(VL)、重鎖の可変ドメイン(VH))は、抗原への抗体の結合に直接関与している軽鎖及び重鎖ドメイン対のそれぞれを示す。軽鎖及び重鎖の可変ドメインは同じ一般構造を有し、各ドメインは、その配列が広範囲に保存されており、3つの「高頻度可変領域」(又は相補性決定領域、CDR)により結合される4つのフレームワーク(FR)領域を含む。フレームワーク領域はβシート立体構造を採り、CDRはβシート構造を連結するループを形成しうる。各鎖のCDRは、フレームワーク領域によりその3次元構造で保持され、他の鎖のCDRと共に抗原結合部位を形成する。抗体の重鎖及び軽鎖CDR3領域は、本発明に係る抗体の結合特異性/親和性において特に重要な役割を担っており、よって本発明のさらなる目的を提供する。
ここで使用される場合、「抗体の抗原結合部分」なる用語は、抗原結合の原因となる抗体のアミノ酸残基を意味する。抗体の抗原結合部分は、「相補性決定領域」又は「CDR」からのアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」又は「FR」領域は、ここで定められるような高頻度可変領域残基以外の可変ドメイン領域である。よって、抗体の軽鎖及び重鎖可変ドメインは、N末端からC末端へ、ドメインFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、及びFR4を含む。特に、重鎖のCDR3は、抗原結合に最も寄与し、抗体の特性を定める領域である。CDR及びFR領域は、Kabatら, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)の標準的定義に従い決定され、及び/又は「高頻度可変ループ」からの残基である。
この出願中で使用される「アミノ酸」なる用語は、アラニン(3文字コード:ala、1文字コード:A)、アルギニン(arg、R)、アスパラギン(asn、N)、アスパラギン酸(asp、D)、システイン(cys、C)、グルタミン(gln、Q)、グルタミン酸(glu、E)、グリシン(gly、G)、ヒスチジン(his、H)、イソロイシン(ile、I)、ロイシン(leu、L)、リジン(lys、K)、メチオニン(met、M)、フェニルアラニン(phe、F)、プロリン(pro、P)、セリン(ser、S)、スレオニン(thr、T)、トリプトファン(trp、W)、チロシン(tyr、Y)、及びバリン(val、V)を含む自然に生じるカルボキシα-アミノ酸の群を示す。
ここで使用される「核酸」又は「核酸分子」なる用語は、DNA分子及びRNA分子を含むことを意図している。核酸分子は一本鎖又は二本鎖であってよいが、好ましくは二本鎖DNAである。核酸は、他の核酸と機能的関係に配されている場合、「作用可能に結合」している。例えば、プレ配列又は分泌リーダーのDNAは、ポリペプチドの分泌に参画するプレタンパク質として発現されるならば、そのポリペプチドのDNAに作用可能に結合している;プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している;又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したDNA配列が共直線性であり、分泌リーダーの場合には近接していて読み枠にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが常套的な手法に従って使用される。ここで使用される場合、「細胞」、「細胞株」及び「細胞培養」なる表現は交換可能に使用され、そのような標記の全てが子孫を含む。よって、「形質転換体」及び「形質転換細胞」なる語は、初代の主題細胞、及び移行の回数に関係なくそこから得られた培養物も含まれる。また、全ての子孫は、計画的又は偶発的変異により、DNA量が厳密には同一でない場合もあることが理解される。最初に形質転換された細胞に対してスクリーニングされたものと同じ機能又は生物活性を有する変異体子孫も含まれる。
本発明に係る抗体は、好ましくは、定常鎖がヒト由来のものであることを特徴とする。このような定常鎖は従来からよく知られており、例えばKabatら, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)に記載されている。
例えば、有用なヒト軽鎖定常領域は、配列番号:9のラムダ軽鎖定常領域のアミノ酸配列を含む。例えば、有用なヒト重鎖定常領域は配列番号:10から13を含む。
本発明のさらなる実施態様は、本発明に係る抗体の重鎖及び軽鎖をコードする核酸である。
本発明は、本発明に係る抗体の治療的有効量を患者に投与することを特徴とする、治療を必要とする患者を治療する方法を含む。本発明は、本発明の抗体の治療のための使用を含む。本発明は、腫瘍疾患の治療のための医薬を調製するための、本発明に係る抗体の使用を含む。本発明は、腫瘍疾患の治療のための本発明に係る抗体の使用を含む。
本発明に係る抗体は、さらに「保存配列修飾」、つまり本発明に係る抗体の上述した特徴に影響を与えないか又はそれを改変しないヌクレオチド及びアミノ酸配列修飾を有するかかる抗体(変異抗体)を含む。修飾は、当該技術分野で知られている標準的技術、例えば部位特異的変異誘発及びPCR媒介性変異誘発により導入することができる。保存的アミノ酸置換には、アミノ酸残基が、類似した側鎖を有するアミノ酸残基と置き換えられるものが含まれる。類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で定まっている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、無電荷の極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン)、非極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン)、ベータ分枝状側鎖を有するアミノ酸(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)、及び芳香族側鎖を有するアミノ酸(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)が含まれる。よって、ヒト抗CCN1抗体中の予測される非必須アミノ酸残基は、好ましくは、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基で置き換えることができる。よって、「変異」抗CCN1抗体は、ここでは、親抗体の一又は複数の可変領域において、10まで、好ましくは約2から約5の付加、欠失及び/又は置換により、「親」抗CCN1抗体アミノ酸配列とはアミノ酸配列が異なっている分子を意味する。アミノ酸置換は、Riechmann, Lら, Nature 332 (1988) 323-327 及びQueen, Cら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-1003により記載されているように、分子モデリングに基づく変異誘発により実施することができる。
配列に関する同一性又は相同性は、最大のパーセント配列同一性を達成するために、必要ならば、配列をアラインさせ、間隙を導入した後、親配列と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとしてここで定義される。抗体配列中へのN末端、C末端、又は内部の伸展、欠失、又は挿入のいずれも、配列同一性又は相同性に影響を与えると解釈すべきではない。変異体は、ヒトCCN1の可変ドメインに結合する能力を保持しており、好ましくは親抗体のものよりも優れている性質を有する。例えば、変異体は治療中の副作用を低減させる場合がある。
例示的な「親」抗体は、抗体Mab420のCDR領域を含み、好ましくは、変異体の調製に使用される。好ましくは、親抗体はヒトフレームワーク領域を有しており、存在するならば、ヒト抗体定常ドメインを有する。例えば、親抗体はヒト化又はヒト抗体でありうる。
本発明に係る抗体は、好ましくは組換え手段により生産される。このような方法は従来から広く知られており、原核生物及び真核生物細胞中でのタンパク質発現と、続く抗体ポリペプチドの単離と、通常は薬学的に許容可能な純度までの精製を含む。タンパク質発現では、軽鎖及び重鎖又はその断片をコードする核酸を、標準的な方法で発現ベクター中に挿入する。発現は、適切な原核生物又は真核生物宿主細胞、例えばCHO細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、HEK293細胞、COS細胞、酵母、又は大腸菌細胞において実施され、抗体は細胞から(上清から又は細胞溶解後に)回収される。抗体の組換え生産は従来からよく知られており、例えば、Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202;Geisse, Sら, Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282;Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-161;Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880の概説文献に記載されている。抗体は、全細胞中に、細胞可溶化物中に、又は部分的に精製され、又は実質的に純粋な形態で存在しうる。カラムクロマトグラフィー及び当該技術分野でよく知られている他のものを含む標準的な技術により、他の細胞成分又は他の汚染物質、例えば他の細胞核酸又はタンパク質を除去するために、精製が実施される(Ausubel, Fら編 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)を参照)。NS0細胞における発現は、例えばBarnes, L.Mら, Cytotechnology 32 (2000) 109-123;Barnes, L.Mら, Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270に記載されている。一過性発現は、例えばDurocher, Yら, Nucl. Acids. Res. 30(2002) E9に記載されている。可変ドメインのクローニングは、Orlandi, Rら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837;Carter, Pら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289;Norderhaug, Lら, J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87に記載されている。好ましい一過性発現系(HEK293)は、Schlaeger, E.-J. 及び Christensen, K., Cytotechnology 30 (1999) 71-83、及びSchlaeger, E.-J., J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199に記載されている。モノクローナル抗体は、例えばプロテインA-セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィー等、一般的な免疫グロブリン精製手順により、培養培地から適切に分離される。モノクローナル抗体をコードするDNA及びRNAは、従一般的な手順を使用し、容易に単離し配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなDNA及びRNAの供給源となりうる。単離されると、DNAは発現ベクター内に挿入され得、ついで、宿主細胞、例えばそうでないと免疫グロブリンタンパク質を生産しないHEK293細胞、CHO細胞、又は骨髄腫細胞に形質移入され、宿主細胞において組換えモノクローナル抗体の合成が達成される。前記細胞株から得ることができる抗体は、本発明の好ましい実施態様である。
ヒトCCN1抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするDNAに適切なヌクレオチド変化を導入することにより、又はペプチド合成により調製される。しかしながら、このような修飾は、例えば上述したように、非常に限られた範囲でしか実施することができない。例えば、修飾により、上述の抗体の特徴、例えばIgGアイソタイプ及びエピトープ結合性を変化させることはできないが、組換え生産の収率、タンパク質安定性を改善し、又は精製を容易にすることができる。また、抗CCN1抗体の適切な立体構造の維持に関与していない任意のシステイン残基を、一般にはセリンで置換し、分子の酸化安定性を改善し、異常な架橋を防止することができる。反対に、システイン結合(類)を抗体に付加して、その安定性を改善することができる(特に、抗体がFv断片等の抗体断片である場合)。抗体の他の種類のアミノ酸変異体は、抗体の元来のグリコシル化パターンを変化させる。「変化させる」とは、抗体に見出される一又は複数の炭水化物部分の除去、及び/又は抗体に存在しない一又は複数のグリコシル化部位の付加を意味する。抗体のグリコシル化は典型的にはN結合である。N結合は、アスパラギン残基の側鎖に炭水化物部分が結合することを意味する。Xがプロリン以外の任意のアミノ酸であるトリペプチド配列アスパラギン-X-セリン及びアスパラギン-X-スレオニンは、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的結合のための認識配列である。よって、ポリペプチドにこれらのトリペプチド配列のいずれかが存在すると、潜在的グリコシル化部位が生じる。抗体へのグリコシル化部位の付加は、それが一又は複数の上述のトリペプチド配列を含むように(N結合グリコシル化部位の場合)、アミノ酸配列を変化させることによって簡便に達成される。
抗CCN1抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当該技術で知られている様々な方法で調製される。これらの方法には、限定されるものではないが、天然源(自然に生じるアミノ酸配列変異体の場合)からの単離、又はオリゴヌクレオチド媒介性(又は部位特異的)変異誘発、PCR変異誘発、ヒト化抗CCN1抗体の前もって調製された変異体又は非変異型のカセット変異誘発が含まれる。
抗体の他のタイプの共有結合的修飾は、米国特許第4640835号;同4496689号;同4301144号;同4670417号;同4791192号;同4179337号に記載されたように、種々の非タンパク質性ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリアルキレンの一つに抗体を結合させることを含む。
本発明に係る重鎖及び軽鎖可変ドメインは、発現ベクターコンストラクトが形成されるように、プロモーター、翻訳開始、定常領域、3'非翻訳領域、ポリアデニル化、及び転写終結の配列と組合わされる。重鎖及び軽鎖発現コンストラクトは単一ベクターに組み込まれ、宿主細胞中に、同時形質移入、連続的形質移入、又は別々に形質移入され、これがついで融合されて、双方の鎖を発現する単一の宿主細胞が形成される。
他の態様において、本発明は、薬学的に許容可能な担体と共に処方された、モノクローナル抗体、又はその抗原結合部分の一つ又は組合せを含む、本発明の組成物、例えば薬学的組成物を提供する。ここで使用される場合、「薬学的に許容可能な担体」には、任意の及び全ての溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤、及び吸収/再吸収遅延剤等で、生理学的に適合性があるものが含まれる。好ましくは、担体は注射又は注入に適している。本発明の組成物は当該分野で知られている様々な方法により投与することができる。当業者に理解されるように、投与の経路及び/又は方式は、所望される結果に応じて変わるであろう。薬学的に許容可能な担体には、滅菌水溶液又は分散液、及び注射可能な滅菌溶液又は分散液を調製するための滅菌パウダーが含まれる。薬学的に活性な物質用のこのような媒体又は薬剤の使用は、当該分野で知られている。水に加えて、担体は、例えば等張に緩衝された生理食塩水である。選択された投与経路にかかわらず、本発明の化合物は、適切な水和形態で使用され得、及び/又は本発明の薬学的組成物は、当業者に知られている一般的な方法により、薬学的に許容可能な投与形態に処方される。本発明の薬学的組成物における活性成分の実際の投与レベルは、患者に対して毒性がなく、特定の患者、組成物、及び投与方式に対して所望される治療的応答を達成するのに効果的な量(有効量)が得られるように変えてもよい。選択された投与レベルは、用いられる本発明の特定の組成物の活性、投与経路、投与時間、用いられる特定の化合物の排出速度、用いられる特定の組成物と組合せて使用される他の薬剤、化合物及び/又は物質、年齢、性別、体重、状態、一般的健康状態、及び治療される患者の以前の病歴、及び医療技術においてよく知られている類似の要因を含む、様々な薬物動態学的要因に依存するであろう。
本発明は、腫瘍に罹患している患者の治療のための、本発明に係る抗体の使用を含む。
本発明は、薬学的に許容可能な担体と共に、本発明に係る抗体の有効量を含有せしめることを含む薬学的組成物の製造方法、及びそのような方法のための本発明に係る抗体の使用をさらに提供する。本発明は、好ましくは薬学的に許容可能な担体と共に、乳癌、原発性神経膠腫、膀胱乳頭腫、結腸腺癌、メラノーマ、髄芽種、小児腫瘍、線維肉腫、卵巣癌、膵臓癌、又は前立腺癌等の癌に罹患した患者の治療のための薬剤を製造するための、有効量での本発明の抗体の使用を提供する。
また本発明は、好ましくは薬学的に許容可能な担体と共に、腫瘍に罹患している患者を治療するための薬剤を製造するための、有効量での本発明に係る抗体の使用を提供する。
次の実施例及び配列表は、本発明の理解を助けるために提供されるものであり、発明の真の範囲は、添付する特許請求の範囲に記載されている。本発明の精神を逸脱することなく、記載された手順において変更をなすことができることが理解される。
配列表の説明
配列番号:1 重鎖CDR3 Mab420
配列番号:2 重鎖CDR2 Mab420
配列番号:3 重鎖CDR1 Mab420
配列番号:4 軽鎖CDR3 Mab420
配列番号:5 軽鎖CDR2 Mab420
配列番号:6 軽鎖CDR1 Mab420
配列番号:7 可変重鎖 Mab420
配列番号:8 可変軽鎖 Mab420
配列番号:9 ヒトラムダ軽鎖
配列番号:10 ヒトγ1(アロタイプG1m1,17)定常領域
配列番号:11 ヒトγ1(アロタイプG1m17)定常領域)
配列番号:12 ヒトIgG4
配列番号:13 ヒトIgG4 SPLE-変異体
配列番号:1 重鎖CDR3 Mab420
配列番号:2 重鎖CDR2 Mab420
配列番号:3 重鎖CDR1 Mab420
配列番号:4 軽鎖CDR3 Mab420
配列番号:5 軽鎖CDR2 Mab420
配列番号:6 軽鎖CDR1 Mab420
配列番号:7 可変重鎖 Mab420
配列番号:8 可変軽鎖 Mab420
配列番号:9 ヒトラムダ軽鎖
配列番号:10 ヒトγ1(アロタイプG1m1,17)定常領域
配列番号:11 ヒトγ1(アロタイプG1m17)定常領域)
配列番号:12 ヒトIgG4
配列番号:13 ヒトIgG4 SPLE-変異体
実施例1
免疫化
a)ヒト変異体CCN1でのマウスの免疫化
Balb/c及びNMRIマウスを、腹腔内注射により、0日目には完全フロイントアジュバントと共に、28日目及び56日目には(双方とも不完全フロイントアジュバントと共に)単一のアミノ酸交換E173D又はF185Lを含む50μgの組換えヒトCCN1を用いて、84日目に不完全フロイントアジュバントと共に50μgの組換えタンパク質を用いて、免疫した。血液を91日目と108日目に採取し、血清を調製し、これを、ELISAによる力価決定のために使用した(以下を参照)。最も高い力価を有する動物を、50μgの組換えヒトCCN1の静脈内注射により、112日目における追加免疫のために選択した。
免疫化
a)ヒト変異体CCN1でのマウスの免疫化
Balb/c及びNMRIマウスを、腹腔内注射により、0日目には完全フロイントアジュバントと共に、28日目及び56日目には(双方とも不完全フロイントアジュバントと共に)単一のアミノ酸交換E173D又はF185Lを含む50μgの組換えヒトCCN1を用いて、84日目に不完全フロイントアジュバントと共に50μgの組換えタンパク質を用いて、免疫した。血液を91日目と108日目に採取し、血清を調製し、これを、ELISAによる力価決定のために使用した(以下を参照)。最も高い力価を有する動物を、50μgの組換えヒトCCN1の静脈内注射により、112日目における追加免疫のために選択した。
b)ヒト変異体CCN1でのNZWウサギの免疫化
ニュージーランドホワイトウサギを、0日目には完全フロイントアジュバントと共に、単一のアミノ酸交換E173D又はF185Lを含む100μgの組換えヒトCCN1で、21、43、65及び85日目には不完全フロイントアジュバントと共に100μgのタンパク質を用いて免疫した。全ての免疫化は、いくつかの部位に皮下的に実施した。力価決定のために、77と98日目に、血清を調製した。最終的な追加免疫を、100μgの組換えタンパク質を静脈注射することにより実施した。
ニュージーランドホワイトウサギを、0日目には完全フロイントアジュバントと共に、単一のアミノ酸交換E173D又はF185Lを含む100μgの組換えヒトCCN1で、21、43、65及び85日目には不完全フロイントアジュバントと共に100μgのタンパク質を用いて免疫した。全ての免疫化は、いくつかの部位に皮下的に実施した。力価決定のために、77と98日目に、血清を調製した。最終的な追加免疫を、100μgの組換えタンパク質を静脈注射することにより実施した。
ハイブリドーマの産生及びスクリーニング
ハイブリドーマを、標準的な手順に従い、マウス又はウサギの脾臓細胞を、マウスP3X63-Ag8653骨髄腫細胞又は240E-W2ウサギ形質細胞腫細胞に融合させることにより産生せしめた。ハイブリドーマを、単一アミノ酸交換E173D又はF185Lを含むヒト組換えCCN1及びマウス組換えCCN1への結合性について、ELISA(以下を参照)によりスクリーニングした。CCN1結合抗体を、ドメイン結合アッセイにおいて、及び可変ドメインからの2つのペプチドでのペプチドELISAにおいてさらに特徴付けした(表1)。
1):ペプチド3への結合性を欠くため、本発明に係る抗体ではない
ハイブリドーマを、標準的な手順に従い、マウス又はウサギの脾臓細胞を、マウスP3X63-Ag8653骨髄腫細胞又は240E-W2ウサギ形質細胞腫細胞に融合させることにより産生せしめた。ハイブリドーマを、単一アミノ酸交換E173D又はF185Lを含むヒト組換えCCN1及びマウス組換えCCN1への結合性について、ELISA(以下を参照)によりスクリーニングした。CCN1結合抗体を、ドメイン結合アッセイにおいて、及び可変ドメインからの2つのペプチドでのペプチドELISAにおいてさらに特徴付けした(表1)。
1):ペプチド3への結合性を欠くため、本発明に係る抗体ではない
ファージディスプレイ:
単一のアミノ酸交換F185Lを担持する組換え変異ヒトCCN1タンパク質に対して選択を適用することにより、ファージディスプレイを実施した。多量のヒトCCN1特異性Fabクローンを単離し、そのいくつかは、哺乳動物細胞の細胞表面に組換え的に発現される膜結合CCN1にまた結合可能であると同定した。それらのいくつかは、ヒトCCN1へのEA-Hy926細胞の接着を有意に阻害することができた。13の異なるFab抗体を全長IgG1抗体に転換させ、異種移植マウス腫瘍モデルにおいてインビボで試験した。
単一のアミノ酸交換F185Lを担持する組換え変異ヒトCCN1タンパク質に対して選択を適用することにより、ファージディスプレイを実施した。多量のヒトCCN1特異性Fabクローンを単離し、そのいくつかは、哺乳動物細胞の細胞表面に組換え的に発現される膜結合CCN1にまた結合可能であると同定した。それらのいくつかは、ヒトCCN1へのEA-Hy926細胞の接着を有意に阻害することができた。13の異なるFab抗体を全長IgG1抗体に転換させ、異種移植マウス腫瘍モデルにおいてインビボで試験した。
CCN1-結合抗体(Mab395、Mab396、Mab420、Mab434、及びMab971)を、例えばドメイン結合アッセイにおいて、及び可変ドメインからの4つのペプチドでのペプチドELISAにおいて、さらに特徴付けした(以下の実施例を参照)。
実施例2
膜結合CCN1及びCCN1ドメインの組換え発現
付着して増殖しているマウスNIH 3T3細胞(CRL-1658TM)又は懸濁適合したヒトHEK293(CRL-1573TM)細胞を、CCN1をコードする組換えベクター、又はPDGF-レセプター(ヒトベータ型血小板由来増殖因子レセプター、UniProt受託番号P09619、アミノ酸513から561)の膜貫通ドメインにC末端的に融合したそれぞれのCCN1で形質移入した。
膜結合CCN1及びCCN1ドメインの組換え発現
付着して増殖しているマウスNIH 3T3細胞(CRL-1658TM)又は懸濁適合したヒトHEK293(CRL-1573TM)細胞を、CCN1をコードする組換えベクター、又はPDGF-レセプター(ヒトベータ型血小板由来増殖因子レセプター、UniProt受託番号P09619、アミノ酸513から561)の膜貫通ドメインにC末端的に融合したそれぞれのCCN1で形質移入した。
懸濁適合したHEK293細胞を、FACSにより測定される細胞結合アッセイに使用した。付着して増殖しているNIH 3T3細胞を、蛍光顕微鏡において分析される細胞結合アッセイに使用した。
実施例3
ELISAによるヒトCCN1及び断片に対する抗体の結合の測定
ヒト及びマウスCCN1 ELISA
ヒト及びマウスCCN1への抗体の結合をELISAにより測定した。単一のアミノ酸交換E173D又はF185Lを含む組換えヒトCCN1、又はマウス組換えCCN1を、2−8℃で一晩インキュベートすることにより、PBS中、2.5μg/ml、25μl/ウェルで、384ウェルのヌンク・マキシソーププレート(Nunc Maxisorpplate)に固定した。室温で1時間、PBS/1%のBSAを用いてプレートをブロッキングし、その後、2回の洗浄工程(PBSに0.1%のトゥイーン-20)を施し、室温で1時間、ブロッキングバッファー又はハイブリドーマ上清中、異なる濃度の抗CCN1抗体と共にインキュベートした。さらに4回洗浄した後、抗体を、室温で1時間、ブロッキングバッファーに1:5000で希釈した抗マウスHRP(Amersham #NA9310)、抗ウサギHRP(Jackson Immunoresearch #711-036-152)、又は抗ヒトIgG-HRP((Jackson Immunoresearch #109-036-097)で検出した。さらに4回の洗浄工程の後、10分、25μlのTMB(Calbiochem #CL07)を添加することにより、シグナルを生じさせた。1NのHClを25μl添加した後、吸光度を450nmで読み取った。
ELISAによるヒトCCN1及び断片に対する抗体の結合の測定
ヒト及びマウスCCN1 ELISA
ヒト及びマウスCCN1への抗体の結合をELISAにより測定した。単一のアミノ酸交換E173D又はF185Lを含む組換えヒトCCN1、又はマウス組換えCCN1を、2−8℃で一晩インキュベートすることにより、PBS中、2.5μg/ml、25μl/ウェルで、384ウェルのヌンク・マキシソーププレート(Nunc Maxisorpplate)に固定した。室温で1時間、PBS/1%のBSAを用いてプレートをブロッキングし、その後、2回の洗浄工程(PBSに0.1%のトゥイーン-20)を施し、室温で1時間、ブロッキングバッファー又はハイブリドーマ上清中、異なる濃度の抗CCN1抗体と共にインキュベートした。さらに4回洗浄した後、抗体を、室温で1時間、ブロッキングバッファーに1:5000で希釈した抗マウスHRP(Amersham #NA9310)、抗ウサギHRP(Jackson Immunoresearch #711-036-152)、又は抗ヒトIgG-HRP((Jackson Immunoresearch #109-036-097)で検出した。さらに4回の洗浄工程の後、10分、25μlのTMB(Calbiochem #CL07)を添加することにより、シグナルを生じさせた。1NのHClを25μl添加した後、吸光度を450nmで読み取った。
可変ドメインペプチドELISA
ビオチン化された可変ドメインペプチド1−4及び成熟ヒトCCN1を、室温で1時間、0.5MのNa2CO3、pH9.5中、5ng/mlのストレプトアビジンプレコートマイクロタイタープレート(ヌンク)に被覆した。室温で1時間、PBS/1%のBSAを用いてプレートをブロッキングし、その後、2つの洗浄工程(PBSに0.1%のトゥイーン-20)を施し、室温で1時間、ブロッキングバッファー又はハイブリドーマ上清中、異なる濃度の抗CCN1抗体と共にインキュベートした。さらに4回洗浄した後、抗体を、室温で1時間、ブロッキングバッファーに1:5000で希釈した抗マウス-HRP(Amersham #NA9310)、抗ウサギHRP(Jackson Immunoresearch #711-036-152)、又は抗ヒトIgG-HRP((Jackson Immunoresearch #109-036-097)で検出した。さらに6回の洗浄工程の後、10分、25μlのTMB(Calbiochem #CL07)を添加することにより、シグナルを生じさせた。1NのHClを25μl添加した後、吸光度を450nmで読み取った。結果を表2に示す:
ビオチン化された可変ドメインペプチド1−4及び成熟ヒトCCN1を、室温で1時間、0.5MのNa2CO3、pH9.5中、5ng/mlのストレプトアビジンプレコートマイクロタイタープレート(ヌンク)に被覆した。室温で1時間、PBS/1%のBSAを用いてプレートをブロッキングし、その後、2つの洗浄工程(PBSに0.1%のトゥイーン-20)を施し、室温で1時間、ブロッキングバッファー又はハイブリドーマ上清中、異なる濃度の抗CCN1抗体と共にインキュベートした。さらに4回洗浄した後、抗体を、室温で1時間、ブロッキングバッファーに1:5000で希釈した抗マウス-HRP(Amersham #NA9310)、抗ウサギHRP(Jackson Immunoresearch #711-036-152)、又は抗ヒトIgG-HRP((Jackson Immunoresearch #109-036-097)で検出した。さらに6回の洗浄工程の後、10分、25μlのTMB(Calbiochem #CL07)を添加することにより、シグナルを生じさせた。1NのHClを25μl添加した後、吸光度を450nmで読み取った。結果を表2に示す:
実施例3
アフィニティー測定(BIAcore)
捕捉抗体(抗ヒト-IgG)を、アミンカップリング化学を使用し、CM5バイオセンサーチップの表面に固定した。5μl/分の流量で、0.1MのN-ヒドロキシスクシンイミドと0.4Mの1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドの1:1混合物を用い、フローセルを活性化させた。抗ヒトIgGを酢酸ナトリウムpH5.0で希釈し、約1000RUの表面密度になるように、特定量の固定化抗体(ここでは1000RU)を意図して注入した。フローセル1を参照(FC1=参照フローセル)としてブランクのままにしておいた。1Mのエタノールアミン/HCl、pH8.5を注入することにより、表面をブロックした。
アフィニティー測定(BIAcore)
捕捉抗体(抗ヒト-IgG)を、アミンカップリング化学を使用し、CM5バイオセンサーチップの表面に固定した。5μl/分の流量で、0.1MのN-ヒドロキシスクシンイミドと0.4Mの1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドの1:1混合物を用い、フローセルを活性化させた。抗ヒトIgGを酢酸ナトリウムpH5.0で希釈し、約1000RUの表面密度になるように、特定量の固定化抗体(ここでは1000RU)を意図して注入した。フローセル1を参照(FC1=参照フローセル)としてブランクのままにしておいた。1Mのエタノールアミン/HCl、pH8.5を注入することにより、表面をブロックした。
抗CCN1抗体(分析物1)及びヒトCCN1(分析物2)を、PBST+0.8MのNaClに希釈し、それぞれ10及び30μl/分の流量で注入した。接触時間(結合相)を、100nMの濃度の抗CCN1抗体で6分、0nMから500nMの8種の増加濃度のヒトCCN1で5分とした。ついで、チップ表面を10分、PBST+0.8MのNaClで洗浄した(解離相)。全ての相互作用は正確に25℃(標準的温度)で実施した。再生溶液として、40μlの0.85%のH3PO4を注入し、各結合サイクルの後に、任意の非共有結合タンパク質を除去した。1秒当たり1シグナルの検出速度で、シグナルを検出した。参照用フローセル、ブランクバッファー注入からのシグナルを引き(「二重参照」)、ソフトウェアBIA評価版4.1、Scrubber版2b+BiaFit1.6を使用し、データを評価した。全ての結合曲線を、結合モデルA+B=ABに対応する、この結合モデルに適合させた。意味のある速度定数をka(結合速度定数)、kd(解離速度定数)及びKD(解離平衡定数)について算出した。結果を表3に示す。
実施例4
細胞結合アッセイ(FACS及び蛍光顕微鏡)
NIH 3T3又は懸濁適合化HEK293細胞に、CCN1又は膜貫通ドメインに結合したそのドメインの発現を促進させる発現プラスミドを一過性に形質移入した。48時間後、上清を除去し、10μg/mlの試験抗体を、形質移入細胞が10×106になるまで、染色バッファー(PBS、3%のFCS、0.01%のNa-アジド)に添加した。氷上で2時間後、抗体を含まない染色バッファーで、細胞を3回洗浄した。二次(検出用)抗体(FITC標識抗ヒトIgG1モノクローナル抗体)を染色バッファーに10μg/mlで添加し、氷上で30分インキュベートした。抗体を含まない染色バッファーで、細胞を3回洗浄し、染色バッファー中に維持し、蛍光顕微鏡で顕微鏡観察するか(NIH 3T3)、又はFACSにより分析した(HEK293;488nmで励起、520nmで発光)。
細胞結合アッセイ(FACS及び蛍光顕微鏡)
NIH 3T3又は懸濁適合化HEK293細胞に、CCN1又は膜貫通ドメインに結合したそのドメインの発現を促進させる発現プラスミドを一過性に形質移入した。48時間後、上清を除去し、10μg/mlの試験抗体を、形質移入細胞が10×106になるまで、染色バッファー(PBS、3%のFCS、0.01%のNa-アジド)に添加した。氷上で2時間後、抗体を含まない染色バッファーで、細胞を3回洗浄した。二次(検出用)抗体(FITC標識抗ヒトIgG1モノクローナル抗体)を染色バッファーに10μg/mlで添加し、氷上で30分インキュベートした。抗体を含まない染色バッファーで、細胞を3回洗浄し、染色バッファー中に維持し、蛍光顕微鏡で顕微鏡観察するか(NIH 3T3)、又はFACSにより分析した(HEK293;488nmで励起、520nmで発光)。
暴露された融合タンパク質に抗体が強く結合すると、細胞の外膜が非常に明るい緑色蛍光になる(+++)。非形質移入細胞は完全に黒であり、バックグラウンド染色を示さない。中程度の陽性細胞は、細胞膜が明るい蛍光を示す(++及び+)。暴露された融合タンパク質に抗体が結合しないと、蛍光は完全にない(−)。結果を表4a及び4bに示す。
293+ヒトCCN1:HEK293細胞を膜結合全長CCN1融合体で一過性に形質移入
293+ヒトCCN1の可変ドメイン:HEK293細胞をCCN1の膜結合可変ドメインで一過性に形質移入
293+pmaxGFP:HEK293を緑色蛍光タンパク質の発現を生じせしめる発現ベクターを用いて一過性に形質移入
293+ヒトCCN1の可変ドメイン:HEK293細胞をCCN1の膜結合可変ドメインで一過性に形質移入
293+pmaxGFP:HEK293を緑色蛍光タンパク質の発現を生じせしめる発現ベクターを用いて一過性に形質移入
実施例5
エピトープ結合アッセイ(Biacore)
エピトープ領域を決定するために、様々な抗CCN1抗体を、アミンカップリング化学を使用して、CM5バイオセンサーチップの表面に固定した。5μl/分の流量で、0.1MのN-ヒドロキシスクシンイミドと0.4Mの1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドの1:1混合物を用いて、フローセルを活性化させた。10μg/mlで12分、抗CCN1抗体を、酢酸ナトリウム、pH5.0に注入し、約15000RUの表面密度になった。1Mのエタノールアミン/HCl、pH8.5を注入することにより、表面をブロックした。可溶性ヒトCCN1(分析物1)及び抗CCN1抗体(分析物2)を、PBST+0.8MのNaClで希釈し、30μl/分の流量で注入した。接触時間(結合相)を、250nMの濃度のヒトCCN1で150秒、100nMの濃度の抗CCN1抗体で300秒とした。ついで、チップ表面を10分、PBST+0.8MのNaClで3分洗浄した(解離相)。全ての相互作用は正確に25℃(標準的温度)で実施した。10mMのグリシン、pH2.0の再生溶液を150秒注入し、各結合サイクルの後に、任意の非共有結合タンパク質を除去した。1秒当たり1シグナルの検出速度で、シグナルを検出した。種々のエピトープ領域を決定するために、ヒトCCN1を注入し、固定抗体に結合させた。結合の少し後に、未知のエピトープを有する抗体を注入した。結合シグナルを示さない(阻害)抗体は、同じエピトープ群に属する。結合シグナルは種々のエピトープ領域を示す。3つの異なるエピトープ領域が、SPR技術により見出された(表5を参照)。
1):R&D Systemsの抗CCN1抗体MAB4055(http://www.rndsystems.com)
エピトープ結合アッセイ(Biacore)
エピトープ領域を決定するために、様々な抗CCN1抗体を、アミンカップリング化学を使用して、CM5バイオセンサーチップの表面に固定した。5μl/分の流量で、0.1MのN-ヒドロキシスクシンイミドと0.4Mの1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドの1:1混合物を用いて、フローセルを活性化させた。10μg/mlで12分、抗CCN1抗体を、酢酸ナトリウム、pH5.0に注入し、約15000RUの表面密度になった。1Mのエタノールアミン/HCl、pH8.5を注入することにより、表面をブロックした。可溶性ヒトCCN1(分析物1)及び抗CCN1抗体(分析物2)を、PBST+0.8MのNaClで希釈し、30μl/分の流量で注入した。接触時間(結合相)を、250nMの濃度のヒトCCN1で150秒、100nMの濃度の抗CCN1抗体で300秒とした。ついで、チップ表面を10分、PBST+0.8MのNaClで3分洗浄した(解離相)。全ての相互作用は正確に25℃(標準的温度)で実施した。10mMのグリシン、pH2.0の再生溶液を150秒注入し、各結合サイクルの後に、任意の非共有結合タンパク質を除去した。1秒当たり1シグナルの検出速度で、シグナルを検出した。種々のエピトープ領域を決定するために、ヒトCCN1を注入し、固定抗体に結合させた。結合の少し後に、未知のエピトープを有する抗体を注入した。結合シグナルを示さない(阻害)抗体は、同じエピトープ群に属する。結合シグナルは種々のエピトープ領域を示す。3つの異なるエピトープ領域が、SPR技術により見出された(表5を参照)。
1):R&D Systemsの抗CCN1抗体MAB4055(http://www.rndsystems.com)
実施例6
カニクイザルCCN1に対するMab420の交差反応性
カニクイザルCCN1に対するMab420の交差反応性を、膜結合カニクイザルCCN1を組換え的に発現させ、Mab420で染色する、FACSにおいて証明した。結果を表6に示す。
カニクイザルCCN1に対するMab420の交差反応性
カニクイザルCCN1に対するMab420の交差反応性を、膜結合カニクイザルCCN1を組換え的に発現させ、Mab420で染色する、FACSにおいて証明した。結果を表6に示す。
実施例7
CCN1媒介性接着アッセイ
該接着アッセイは、CCN1に対する抗体又はFab断片が、組換えCCN1のこの特定の活性をブロック可能かどうかを調査するためのものである。
96ウェル平底プレート(NUNCカタログ番号439454)を、PBS(GIBCOカタログ番号20012)中の0、0.625、1.25、2.5、5、10μg/mlでの組換えCCN1タンパク質50μl/ウェルで、37℃にて一晩被覆した。200μl/ウェルの洗浄バッファー(PBS/0.1%のBSA)でプレートを3回洗浄した。EA-Hy-926細胞を収集し、接着培地((F12の栄養剤HAM、Gibcoカタログ番号217650297)/0.05%のBSA)で洗浄し、1mlあたり2×105細胞の濃度で同じ培地に懸濁させた。100μlの細胞懸濁液を、最終的にウェル当たり20000細胞になるまで、3組、ウェルに添加した。5%のCO2と共に37℃で2−3時間、プレートをインキュベートし、200μl/ウェルのPBSで2回洗浄し、排出させた。100μlのカルセイン-AM(Molecular Probe カタログ番号C-3100、分子量=994.87、原液、DMSO中に1mM、50μg/50μl)を接着培地に2μMで添加し、5%のCO2と共に37℃で0.5−1時間、混合物をインキュベートした。分析は485/535nmで実施した。
CCN1媒介性接着アッセイ
該接着アッセイは、CCN1に対する抗体又はFab断片が、組換えCCN1のこの特定の活性をブロック可能かどうかを調査するためのものである。
96ウェル平底プレート(NUNCカタログ番号439454)を、PBS(GIBCOカタログ番号20012)中の0、0.625、1.25、2.5、5、10μg/mlでの組換えCCN1タンパク質50μl/ウェルで、37℃にて一晩被覆した。200μl/ウェルの洗浄バッファー(PBS/0.1%のBSA)でプレートを3回洗浄した。EA-Hy-926細胞を収集し、接着培地((F12の栄養剤HAM、Gibcoカタログ番号217650297)/0.05%のBSA)で洗浄し、1mlあたり2×105細胞の濃度で同じ培地に懸濁させた。100μlの細胞懸濁液を、最終的にウェル当たり20000細胞になるまで、3組、ウェルに添加した。5%のCO2と共に37℃で2−3時間、プレートをインキュベートし、200μl/ウェルのPBSで2回洗浄し、排出させた。100μlのカルセイン-AM(Molecular Probe カタログ番号C-3100、分子量=994.87、原液、DMSO中に1mM、50μg/50μl)を接着培地に2μMで添加し、5%のCO2と共に37℃で0.5−1時間、混合物をインキュベートした。分析は485/535nmで実施した。
組換えCCN1でプレートをコーティングし、洗浄バッファーでプレートを洗浄した後、抗体を添加した。抗体は0.5から10μg/mlの濃度で添加し、37℃で1時間、プレートでインキュベートした。続いて、洗浄バッファーでプレートを2回洗浄した。EA-Hy-926細胞を、上述したようにして添加した。CCN1へのEA-Hy-926細胞の接着を阻害する抗体により、カルセイン染色が低減される。
結果:
カルセイン染色は、CCN1に接着している細胞の数と相関する。細胞培養プレートに被覆されたCCN1へのいくつかの抗体の結合は、CCN1に接着する細胞を低減させた。ほとんどの強力な抗体を表7に示す。該抗体は、CCN1へのEA-Hy-926細胞の接着を54%から83%まで低減させた。
カルセイン染色は、CCN1に接着している細胞の数と相関する。細胞培養プレートに被覆されたCCN1へのいくつかの抗体の結合は、CCN1に接着する細胞を低減させた。ほとんどの強力な抗体を表7に示す。該抗体は、CCN1へのEA-Hy-926細胞の接着を54%から83%まで低減させた。
実施例8
MDA-MB-231(ATCC HTB-26)ヒト乳癌異種移植片増殖に対する抗CCN1抗体の抗腫瘍効果
研究設計:MDA-MB-231細胞(1×107細胞/マウス)を、マトリゲル(1:1)を用い、研究0日目に、SCID-べージュマウスの乳房脂肪体の領域に移植した。移植22日後に処置を開始し、51日目に研究を終了した。表8にはTGI(ビヒクル処置動物と比較した腫瘍増殖阻害性)を示す。
群
・ビヒクル、ip、2x/wk、n=10
・20mg/kgのMab420、ip、2x/wk、n=10
・20mg/kgのMab971、ip、2x/wk、n=10
・20mg/kgのMab396、ip、2x/wk、n=10
・20mg/kgのMab395、ip、2x/wk、n=10
・20mg/kgのMab434、ip、2x/wk、n=10
MDA-MB-231(ATCC HTB-26)ヒト乳癌異種移植片増殖に対する抗CCN1抗体の抗腫瘍効果
研究設計:MDA-MB-231細胞(1×107細胞/マウス)を、マトリゲル(1:1)を用い、研究0日目に、SCID-べージュマウスの乳房脂肪体の領域に移植した。移植22日後に処置を開始し、51日目に研究を終了した。表8にはTGI(ビヒクル処置動物と比較した腫瘍増殖阻害性)を示す。
群
・ビヒクル、ip、2x/wk、n=10
・20mg/kgのMab420、ip、2x/wk、n=10
・20mg/kgのMab971、ip、2x/wk、n=10
・20mg/kgのMab396、ip、2x/wk、n=10
・20mg/kgのMab395、ip、2x/wk、n=10
・20mg/kgのMab434、ip、2x/wk、n=10
実施例9
SKOV-3(ATCC HTB-77)卵巣癌異種移植片増殖に対する抗CCN1抗体の抗腫瘍効果
研究設計:SKOV3細胞(1×107細胞/マウス)を、マトリゲル(1:1)を用い、研究0日目に、SCID-べージュマウスにsc移植した。移植17日後に処置を開始し、44日目に研究を終了した。
群
・ビヒクル、ip、2x/wk、n=10
・20mg/kgのMab420、ip、2x/wk、n=10
・20mg/kgのMab395、ip、2x/wk、n=10
SKOV-3(ATCC HTB-77)卵巣癌異種移植片増殖に対する抗CCN1抗体の抗腫瘍効果
研究設計:SKOV3細胞(1×107細胞/マウス)を、マトリゲル(1:1)を用い、研究0日目に、SCID-べージュマウスにsc移植した。移植17日後に処置を開始し、44日目に研究を終了した。
群
・ビヒクル、ip、2x/wk、n=10
・20mg/kgのMab420、ip、2x/wk、n=10
・20mg/kgのMab395、ip、2x/wk、n=10
実施例10
SCIDベージュマウスのPanc-1膵臓癌モデルにおける抗CCN1抗体の研究
研究設計:Panc-1細胞(ATCC CRL-1469、5×106細胞/マウス)を、マトリゲル(1:1)を用い、研究0日目に、SCID-べージュマウスにsc移植した。移植14日後に処置を開始し、46日目に研究を終了した。
群
・ビヒクル、ip、2x/wk、n=10
・20mg/kgのMab395、ip、2x/wk、n=10
・20mg/kgのMab396、ip、2x/wk、n=10
・20mg/kgのMab420、ip、2x/wk、n=10
・20mg/kgのMab434、ip、2x/wk、n=10
SCIDベージュマウスのPanc-1膵臓癌モデルにおける抗CCN1抗体の研究
研究設計:Panc-1細胞(ATCC CRL-1469、5×106細胞/マウス)を、マトリゲル(1:1)を用い、研究0日目に、SCID-べージュマウスにsc移植した。移植14日後に処置を開始し、46日目に研究を終了した。
群
・ビヒクル、ip、2x/wk、n=10
・20mg/kgのMab395、ip、2x/wk、n=10
・20mg/kgのMab396、ip、2x/wk、n=10
・20mg/kgのMab420、ip、2x/wk、n=10
・20mg/kgのMab434、ip、2x/wk、n=10
実施例11
CCN1陰性細胞株MDA-MB-435(ATCC HTB-129)乳癌異種移植片増殖に対する抗CCN1抗体の抗腫瘍効果
研究デザイン:MDA-MB-435細胞(1×107細胞/マウス)を、マトリゲル(1:1)を用い、研究0日目に、SCID-べージュマウスにsc移植した。移植15日後に処置を開始し、44日目に研究を終了した。
群
・ビヒクル、ip、2x/wk、n=10
・20mg/kg Mab420、ip、2x/wk、n=10
CCN1陰性細胞株MDA-MB-435(ATCC HTB-129)乳癌異種移植片増殖に対する抗CCN1抗体の抗腫瘍効果
研究デザイン:MDA-MB-435細胞(1×107細胞/マウス)を、マトリゲル(1:1)を用い、研究0日目に、SCID-べージュマウスにsc移植した。移植15日後に処置を開始し、44日目に研究を終了した。
群
・ビヒクル、ip、2x/wk、n=10
・20mg/kg Mab420、ip、2x/wk、n=10
実施例12
Panc1動物モデルにおける抗CCN1抗体のインビボ画像解析
Panc1マウスモデルにおいて、研究の開始時に、動物に1×107のPanc1細胞を皮下注射した。マエストロ(Maestro)TMインビボ画像システム(LOT-Oriel GmbH & Co. KG,Germany)を使用し、Cy5標識抗体の静脈注射(SCIDマウス(2mg/kg)への静脈注射)から24時間後に、近赤外蛍光(NIRF)を測定した。Mab420は最も顕著な蛍光シグナルをもたらした。
Panc1動物モデルにおける抗CCN1抗体のインビボ画像解析
Panc1マウスモデルにおいて、研究の開始時に、動物に1×107のPanc1細胞を皮下注射した。マエストロ(Maestro)TMインビボ画像システム(LOT-Oriel GmbH & Co. KG,Germany)を使用し、Cy5標識抗体の静脈注射(SCIDマウス(2mg/kg)への静脈注射)から24時間後に、近赤外蛍光(NIRF)を測定した。Mab420は最も顕著な蛍光シグナルをもたらした。
Claims (18)
- 哺乳動物細胞において、哺乳動物細胞膜結合型ヒトCCN1又はそのCCN1ドメインを組換え発現させる方法において、CCN1、又は哺乳動物細胞膜貫通ドメインにC末端で融合したそのCCN1ドメイン(CCN1融合タンパク質)をコードする核酸ベクターで、哺乳動物宿主細胞を形質転換させ、前記宿主細胞において前記CCN1又はCCN1ドメイン融合タンパク質を発現させ、前記膜結合CCN1又は前記CCN1ドメインを回収することを特徴とする方法。
- 前記CCN1ドメインが、CCN1の可変ドメインであることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- ヒトCCN1に対する抗体を産生させるための、哺乳動物細胞膜結合型ヒトCCN1又はCCN1ドメインの使用。
- 前記CCN1ドメインが、CCN1の可変ドメインであることを特徴とする、請求項3に記載の使用。
- 哺乳動物細胞膜結合型CCN1又はCCN1ドメインで非ヒト動物を免疫し、前記CCN1に対する又は前記CCN1ドメインに対する抗体を回収することを特徴とする、請求項3又は4に記載の使用。
- CCN1可変ドメインのアミノ酸210から228と、PDGF-レセプター(ヒトベータ型血小板由来増殖因子レセプター)の膜貫通ドメインにC末端で融合したCCN1可変ドメインからなる融合タンパク質に特異的に結合し、前記融合タンパク質がヒト細胞の表面に発現されることを特徴とする、ヒトCCN1に対する抗体。
- 重鎖CDR領域として配列番号:1のCDR3領域、配列番号:2のCDR2領域及び配列番号:3のCDR1領域を含み、かつ軽鎖可変ドメインとして配列番号:4のCDR3領域、配列番号:5のCDR2領域及び配列番号:6のCDR1領域を含むことを特徴とする、ヒトCCN1に対する抗体。
- 重鎖可変ドメインが配列番号:7を含むことを特徴とする、請求項7に記載の抗体。
- 軽鎖可変ドメインが配列番号:8を含むことを特徴とする、請求項7に記載の抗体。
- モノクローナル抗体420が結合する同じCCN1エピトープ(配列番号:7及び8)に結合することを特徴とする、CCN1に対する抗体。
- 疾患の治療のための、請求項6から10のいずれか一項に記載のヒトCCN1に対する抗体の使用。
- 疾患が腫瘍疾患である、請求項11に記載の使用。
- 医薬の製造のための、請求項6から11のいずれか一項に記載のヒトCCN1に対する抗体の使用。
- 請求項6から11のいずれか一項に記載のヒトCCN1に対する抗体を含有せしめることを特徴とする、疾患の治療のための医薬の製造方法。
- 請求項6から10のいずれか一項に記載の抗体を含有する薬学的組成物。
- 疾患の治療において使用される、請求項6から10のいずれか一項に記載のヒトCCN1に対する抗体。
- 疾患が腫瘍疾患であることを特徴とする、請求項16に記載の抗体。
- 医薬の製造における使用のための、請求項6から10のいずれか一項に記載のヒトCCN1に対する抗体。
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