JP2009511067A - 抗体ライブラリーの細胞提示 - Google Patents

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Abstract

本発明は、細胞中で発現された場合、細胞膜上に提示される抗体または抗体フラグメントのライブラリーをコードするウイルスベクターに関する。本発明は、前記ウイルスベクター核酸を含む細胞、および所望の特性を有する抗体または抗体フラグメントについて前記ライブラリーをスクリーニングする方法を提供する。

Description

1.発明の分野
本発明は、細胞膜の表面上に抗体もしくは抗体フラグメントを提示する方法；細胞表面上に抗体もしくは抗体フラグメントを提示する細胞のライブラリーの製造方法；細胞表面上に抗体もしくは抗体フラグメントのライブラリーを発現する細胞；細胞膜上で抗体もしくは抗体フラグメントのライブラリーを発現させるためのウイルスベクターライブラリー；特定の抗原に結合する抗体もしくは抗体フラグメントのスクリーニング方法；結合特性が改善した、および／もしくは変化した抗体もしくは抗体フラグメントのスクリーニング方法；特定の抗原に結合する抗体もしくは抗体フラグメントをその細胞表面上に発現および提示する細胞のスクリーニング方法；結合特性が改善した、および／もしくは変化した抗体もしくは抗体フラグメントをその細胞表面上に発現および提示する細胞のスクリーニング方法；ならびに関連するキットを提供する。本発明はまた、リガンド結合(例えば、FcγR結合)が変化した、および／またはエフェクター機能(例えば、ADCC活性)が変化したFc変異体も提供する。
2.発明の背景
抗体は、特異的抗原に結合する免疫学的タンパク質である。ヒトおよびマウスなどの多くの哺乳動物においては、抗体は対形成した重鎖および軽鎖ポリペプチドから構築される。各鎖は、可変(Fv)および定常(Fc)領域と呼ばれる2つの異なる領域から作られる。軽鎖および重鎖Fv領域は、分子の抗原結合決定基を含み、標的抗原の結合を担う。Fc領域は抗体(例えば、IgG)のクラス(またはアイソタイプ)を規定し、いくつかのFc受容体および他のFcリガンドの結合を担い、エフェクター機能と呼ばれる一連の重要な機能を与える。限定されるものではないが、標的に対する特異性、免疫エフェクター機構を媒介する能力、および血清中での長い半減期などの、抗体のいくつかの重要な特徴は、抗体を強力な治療剤とする。所望の結合特異性を有する抗体を単離する組換えスクリーニング方法が開発されてきた。例えば、コンビナトリアル組換えDNA技術を用いて結合性分子の大きな発現ライブラリーを作製することができる。これは、組換え抗体ライブラリーが日常的に109個を超えるユニークなクローンを含む場合に、抗体工学の分野で特に真実である。結合性分子の大きなライブラリーの利用可能性は、多くの任意のリガンドに対する結合因子の供給源を提供してきた。
表面提示ライブラリーにより、結合性分子を提示する生物(例えば、ファージおよび酵母)を連続的な選択ラウンド(例えば、パンニング；概説については、Trends Biotechnol 9: 408-414; Coomberら、2002, Methods Mol Biol 178: 133-45, Kretzschmarら、2002, Curr Opin Biotechol 13: 598-602; Fernandez-Gacioら、2003, Bioorg Med Chem Lett. 13:213-216; Leeら、2003, Trends Biotechnol 21: 45-52;およびKondoら、2004, Appl Microbiol Biotechnol 64: 28-40を参照されたい)にかけることによって特異的結合性クローンの富化が可能になる。特に、ファージ提示抗体ライブラリーにおける進歩は、それらを従来のハイブリドーマ由来モノクローナル抗体のスクリーニングに対する魅力的な代替物にしてきた。ファージ提示ライブラリースクリーニングは、多数の異なるポリペプチド(典型的には、109個を超える)を1個のファージ提示ライブラリーに含有させることができるため、いくつかの他のスクリーニング方法よりも有利である。これにより、単一のスクリーニング工程で高度に多様なライブラリーのスクリーニングが可能になる。
ファージ上での小ペプチドまたは一本鎖タンパク質の提示は、細胞内プロセッシングもしくは翻訳後修飾(ファージもしくは原核宿主はそれらをすることができない)が必要でも望ましくもない限りは有利である。例えば、異種ポリペプチドの効率的な提示には、種々の翻訳後修飾、細胞内構造、ならびに宿主細胞の表面上に提示ポリペプチドを適切に輸送し、グリコシル化し、適合させ、集合させ、および固定するのに必要である特殊化された酵素およびシャペロンタンパク質の相補体を、必要とし得る。しかしながら、これらのプロセスはいずれも、バクテリオファージまたは原核細胞プロセスによっては達成することができない。さらに、原核細胞は常に効率的に機能的真核タンパク質を発現するわけではない。
細菌およびバクテリオファージ提示系はまた、該提示系の容量が小さいことによっても制限され、そのようなものとして、小ペプチドの提示にとってより好適であり、哺乳動物細胞上での小ペプチドの表面提示のための最近開発された方法である(例えば、Wolkowiczら、2005, J. Biol. Chem., 280: 15195-15201を参照)。結果として、バクテリオファージおよび哺乳動物抗体提示ライブラリーならびに方法では、抗体のフラグメントのみをその表面上に提示することが必要である。目的が「全抗体」を探索することである場合、抗体フラグメントを全抗体中にクローニングしなければならない。これが追加の工程を追加するだけでなく、多くの抗体フラグメントでは、全抗体およびそのようなライブラリーに変換された場合、抗原に対する親和性が低下する。さらに、そのような方法を用いて、抗体受容体(例えば、Fc受容体)または他のFcリガンドへの、Fc領域などの他の抗体ドメインの結合を試験することはできない。
酵母などのいくつかの真核細胞のために、全抗体細胞表面提示系が開発されてきているが(例えば、BoderおよびWittrup, 2000, Methods in Enzymology, 328:430-444を参照)、哺乳動物細胞上での全抗体提示の開発は遅れを取っている。さらに、これらの系において作製することができるライブラリーのサイズは限られている。抗体ライブラリーから所望の結合特性を有する抗体を単離する機会は、ライブラリーのサイズおよび多様性に比例するので、大きく、かつ多様なライブラリーを作製する方法の必要性が存在する。例えば、免疫されていないドナーから、抗体探索のためのナイーブ抗体ライブラリーを構築することを望む場合、これは特に重要である。現在、メンバー108個より大きいライブラリーサイズを構築することは、一過性トランスフェクションまたはエレクトロポレーションなどの従来のトランスフェクションツールを用いることによる、任意の真核細胞提示技術に対する挑戦である。かくして、大きな多様性を維持するが上記で考察されたいずれかの問題を排除する、真核細胞、特に、哺乳動物細胞に対する抗体細胞表面提示ライブラリーおよびライブラリースクリーニング方法の必要性が存在する。そのような系は、Fc領域中のもののような可変ドメインの外側の領域における抗体変異体の同定にとって特に有用であろう。Fc領域の、アミノ酸欠失、置換および付加などの改変は、Fc領域のそのリガンドおよび／または受容体への結合を変化させ、エフェクター機能における付随的変化をもたらすことが証明されている(例えば、Shieldsら、2001, J Biol Chem 276:6591-6604およびPrestaら、2002, Biochem Soc Trans 30:487-490ならびに米国特許公開第2004/0132101号を参照)。かくして、Fc領域を改変することにより、Fc含有分子の治療的有効性を改善することができる。哺乳動物細胞上での全抗体細胞表面提示のための系は、エフェクター機能が変化した改変されたFc領域を有する抗体の迅速な同定を容易にするであろう。
本明細書に記載の参考文献の引用または考察は、そのようなものが本発明に対する従来技術であることを認めるものではないと解釈されるべきである。
3.発明の概要
本発明は、本明細書で「本発明の抗体」などの用語で呼ばれる、細胞膜の細胞外表面上に提示される組換え抗体またはそのフラグメントに関する。特定の実施形態においては、本発明の組換え抗体は、重鎖もしくはそのフラグメント、および必要に応じて、軽鎖もしくはそのフラグメントを含み、該重鎖もしくは軽鎖はさらに、該抗体もしくはそのフラグメントを細胞表面に対して標的化するアミノ酸配列を含む。一実施形態においては、本発明の組換え抗体は、抗体を細胞表面に対して標的化するアミノ酸配列を有する完全長重鎖を含み、ここで、該アミノ酸配列が該重鎖のC末端に融合され、さらに完全長軽鎖を含んでもよい。さらに別の実施形態においては、本発明の組換え抗体は、抗体を細胞表面に対して標的化するアミノ酸配列を有する重鎖の一部を含み、ここで、該アミノ酸配列は該重鎖部分のC末端に融合され、さらに軽鎖またはそのフラグメントを含んでもよい。特定の実施形態においては、抗体を細胞表面に対して標的化する前記アミノ酸配列は、膜貫通ドメインである。別の実施形態においては、抗体を細胞表面に対して標的化する前記アミノ酸配列は、GPIアンカーシグナル配列である。
本発明はさらに、本明細書で「本発明のベクター」と呼ばれる、細胞膜の細胞外表面上に提示される組換え抗体またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドを含むベクターに関する。一実施形態においては、本発明のベクターは、ウイルスベクターである。特定の実施形態においては、本発明のベクターは、アデノウイルスベクターである。
本発明はまた、本明細書で「本発明のライブラリー」と呼ばれる、細胞膜の細胞外表面上に提示される組換え抗体またはそのフラグメントを含むライブラリーに関する。一実施形態においては、本発明のライブラリーは、重鎖可変領域のライブラリーを含む；それはさらに、軽鎖可変領域のライブラリーを含んでもよい；およびそれはさらに、変異体Fc領域のライブラリーを含んでもよい。一実施形態においては、本発明のライブラリーは、細胞膜の細胞外表面上に提示される組換え抗体またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドを含む細胞のライブラリーである。
本発明はまた、細胞膜の細胞外表面上に提示される組換え抗体またはそのフラグメントを含む本発明のライブラリーをスクリーニングする方法も提供する。一実施形態においては、ライブラリーをスクリーニングする方法により、特定の抗原に結合する抗体またはそのフラグメントの同定が可能になる。一実施形態においては、ライブラリーをスクリーニングする方法により、特定の抗原に対する結合が変化した抗体またはそのフラグメントの同定が可能になる。一実施形態においては、ライブラリーをスクリーニングする方法により、エフェクター分子(例えば、FcγRおよび／またはC1q)に対する結合が変化した抗体またはそのフラグメントの同定が可能になる。
本発明は、エフェクター分子(例えば、FcγRおよび／またはC1q)に対する結合が変化した変異体Fc領域を提供する。本発明はまた、エフェクター機能が変化した変異体Fc領域を提供する。一実施形態においては、本発明の変異体Fc領域は、低下した抗体依存的細胞媒介性細胞傷害性(ADCC)を有する。
4.図面の簡単な説明
本発明の例示的実施形態を説明する目的で、本明細書に図面を提供する(図面の簡単な説明については別節を参照)。
5.定義
本明細書で用いられる用語「抗体」および「(複数の)抗体」は、モノクローナル抗体、多特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ化抗体、キメラ抗体、一本鎖Fv(scFv)、ジスルフィド結合したFv(sdFv)、Fabフラグメント、F(ab')フラグメント、および抗イディオタイプ(抗Id)抗体(例えば、本発明の抗体に対する抗Id抗体など)、ならびに上記のいずれかのもののエピトープ結合フラグメントを指す。特に、抗体は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的活性フラグメント、すなわち、抗原結合部位を含む分子を包含し、これらのフラグメントは、限定されるものではないが、Fc領域またはそのフラグメントなどの別の免疫グロブリンドメインに融合されていても、されていなくてもよい。本明細書で用いられる用語「抗体」および「(複数の)抗体」はまた、Fc変異体、完全長抗体およびFc領域を含むFc変異体融合物、またはそれらのフラグメントを含む。Fc変異体融合物としては、限定されるものではないが、scFv-Fc融合物、可変領域(例えば、VLおよびVH)-Fc融合物、scFv-scFv-Fc融合物が挙げられる。抗体は、任意の型(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgAおよびIgY)、クラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2)またはサブクラスのものであってよい。
本明細書で言及される相補性決定領域(CDR)残基番号は、Kabatら(1991, NIH Publication 91-3242, National Technical Information Service, Springfield, VA)のものである。具体的には、軽鎖可変ドメイン中の残基24-34 (CDR1)、50-56 (CDR2)および89-97 (CDR3)ならびに重鎖可変ドメイン中の31-35 (CDR1)、50-65 (CDR2)および95-102 (CDR3)である。CDRは抗体間でかなり変動する(さらに定義により、Kabat共通配列との相同性を示さないであろう)ことに留意されたい。フレームワーク残基の最大アラインメントは、該番号付けシステムにおける「スペーサー」残基の挿入をFv領域のために用いることを必要とすることが多い。本明細書で言及されるCDRはKabatら、上掲のものであることが理解されよう。さらに、任意の所与のKabat部位番号での特定の個々の残基の種類(identity)は、種間または対立遺伝子分岐に起因して、抗体鎖間で変化してもよい。
本明細書で用いられる「Fc領域」は、第1の定常領域免疫グロブリンドメインを除く抗体の定常領域を含むポリペプチドを含む。かくして、Fcとは、IgA、IgDおよびIgGの最後の2個の定常領域免疫グロブリンドメイン、ならびにIgEおよびIgMの最後の3個の定常領域免疫グロブリンドメイン、ならびにこれらのドメインのN末端の可撓性ヒンジを指す。IgAおよびIgMについては、FcはJ鎖を含んでもよい。IgGについては、Fcは、免疫グロブリンドメインCガンマ2およびCガンマ3(Cγ2およびCγ3)ならびにCガンマ1(Cγ1)とCガンマ2(Cγ2)との間のヒンジを含む。Fc領域の境界は変動しうるが、ヒトIgG重鎖Fc領域は通常、そのカルボキシル末端に残基C226またはP230を含むと定義され、ここで、その番号付けは、Kabatら(1991, NIH Publication 91-3242, National Technical Information Service, Springfield, VA)に記載のEU指標に従うものである。「Kabatに記載のEU指標」とは、Kabatら、上掲に記載のヒトIgG1 EU抗体の残基番号付けを指す。Fcは、単独でこの領域を指すか、または抗体、抗体フラグメント、もしくはFc融合タンパク質の内容においてこの領域を指してもよい。Fc変異体タンパク質は、抗体、Fc融合物、またはFc領域を含む任意のタンパク質もしくはタンパク質ドメインであってもよい。特に好ましいのは、Fc領域の非天然の変異体である変異体Fc領域を含むタンパク質である。非天然Fc領域(本明細書では「変異体Fc領域」とも呼ぶ)のアミノ酸配列は、野生型アミノ酸配列と比較して、少なくとも1個のアミノ酸残基の置換、挿入および／または欠失を含む。挿入または置換の結果として変異体Fc領域の配列中に出現する任意の新規アミノ酸残基を、非天然アミノ酸残基と呼ぶことができる。注記：限定されるものではないが、Kabatの270、272、312、315、356および358などのいくつかのFc位置で多型性が観察されており、従って、提供された配列と従来技術における配列との間にはわずかな差異が存在してもよい。
本明細書で用いられる用語「膜貫通ドメイン」とは、細胞の細胞膜を橋渡すことができるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質のドメインを指す。これらのドメインを用いて、細胞膜上に抗体を固定することができる。
「キメラ抗体」は、抗体の異なる部分が、非ヒト抗体から誘導された可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体などの異なる免疫グロブリン分子から誘導された分子である。キメラ抗体を製造する方法は、当業界で公知である。例えば、Morrison, 1985, Science 229:1202; Oiら、1986, BioTechniques 4:214; Gilliesら、1989, J. Immunol. Methods 125:191-202; ならびに米国特許第5,807,715号、第4,816,567号、および第4,816,397号、CDR-移植(EP 239,400; PCT公開第WO 91/09967号; ならびに米国特許第5,225,539号、第5,530,101号、および第5,585,089号)、ベニアリングまたは再表面化 (EP 592,106; EP 519,596; Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5): 489-498; Studnickaら、1994, Protein Engineering 7:805; およびRoguskaら、1994, PNAS 91:969)、ならびに鎖シャッフリング(米国特許第5,565,332号)を参照されたい。
「ヒト化抗体」は、所定の抗原に結合することができ、かつ実質的にヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有するフレームワーク領域と、実質的に非ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有するCDRを含む抗体またはその変異体もしくはフラグメントである。ヒト化抗体は、CDR領域の全部または実質的に全部が、非ヒト免疫グロブリン(すなわち、ドナー抗体)のものに相当し、フレームワーク領域の全部または実質的に全部が、ヒト免疫グロブリン共通配列のものである、少なくとも1個、および典型的には2個の可変ドメイン(Fab、Fab'、F(ab')2、Fabc、Fv)の実質的に全部を含む。一実施形態においては、ヒト化抗体は、典型的には、ヒト免疫グロブリンのものである免疫グロブリン定常領域(Fc)の少なくとも一部をも含む。通常、抗体は軽鎖、ならびに重鎖の少なくとも可変ドメインを両方含むであろう。抗体はまた、重鎖のCH1、ヒンジ、CH2、CH3、およびCH4領域を含んでもよい。ヒト化抗体を、限定されるものではないが、IgM、IgG、IgD、IgAおよびIgEなどの任意のクラスの免疫グロブリン、ならびに限定されるものではないが、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4などの任意のアイソタイプから選択することができる。別の実施形態においては、定常ドメインは、ヒト化抗体が細胞傷害活性を示すことが望ましい場合には補体固定性定常ドメインであり、そのクラスは典型的には、IgG1である。そのような細胞傷害活性が望ましくない場合、定常ドメインはIgG2クラスのものであってよい。ヒト化抗体は、2個以上のクラスまたはアイソタイプに由来する配列を含んでもよく、所望のエフェクター機能を最適化するために特定の定常ドメインを選択することは、当業者の範囲内にある。ヒト化抗体のフレームワークおよびCDR領域は、親配列と正確に一致する必要はなく、例えば、ドナーCDRまたは共通フレームワークを、その部位でCDRまたはフレームワーク残基が共通抗体または輸入抗体に一致しないように、少なくとも1個の残基の置換、挿入または欠失により突然変異誘発させることができる。しかしながら、そのような突然変異は、広範囲なものではないであろう。一実施形態においては、少なくとも75％、少なくとも90％、および／または少なくとも95％のヒト化抗体残基が、親フレームワーク領域(FR)およびCDR配列のものと一致するであろう。ヒト化抗体を、限定されるものではないが、CDR移植(欧州特許第EP 239,400号; PCT公開第WO 91/09967号; ならびに米国特許第5,225,539号、第5,530,101号、および第5,585,089号)、ベニアリングもしくは再表面化(欧州特許第EP 592,106号および第EP 519,596号; Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5): 489-498; Studnickaら、1994, Protein Engineering 7(6): 805-814; およびRoguskaら、1994, PNAS 91:969-973)、鎖シャッフリング(米国特許第5,565,332号)、ならびに、例えば、米国特許第6,407,213号、米国特許第5,766,886号、PCT特許公開第WO 93/17105号、Tanら、2002, J. Immunol. 169:1119-25, Caldasら、2000, Protein Eng. 13: 353-60, Moreaら、2000, Methods 20: 267-79, Bacaら、1997, J. Biol. Chem. 272: 10678-84, Roguskaら、1996, Protein Eng. 9: 895-904, Coutoら、1995, Cancer Res. 55 (23 Supp): 5973s - 5977s, Coutoら、1995, Cancer Res. 55: 1717-22, Sandhu JS, 1994, Gene 150: 409-10、およびPedersenら、1994, J. Mol. Biol. 235: 959-73に開示された技術などの、当業界で公知の様々な技術を用いて製造することができる。しばしば、フレームワーク領域中のフレームワーク残基を、CDRドナー抗体に由来する対応する残基で置換して、抗原結合を変化および／または改善する。これらのフレームワーク置換を、当業界でよく知られた方法、例えば、抗原結合にとって重要なフレームワーク残基を同定するためのCDRとフレームワーク残基との相互作用のモデリングおよび特定の位置での通常とは異なるフレームワーク残基を同定するための配列比較により同定する(例えば、Queenら、米国特許第5,585,089号; およびRiechmannら、1988, Nature 332:323を参照)。
本明細書で用いられる用語「感染多重度」(MOI)は、細胞あたりの感染性ウイルス粒子の数を意味する。
用語「ADCC」(抗体依存的細胞媒介性細胞傷害性)とは、Fc受容体(FcR)を発現する非特異的細胞傷害性細胞(例えば、ナチュラルキラー細胞(NK)細胞、好中球、およびマクロファージ)が標的細胞上の結合した抗体を認識し、その後、該標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介性反応を指す。ADCCを媒介するための主要な細胞であるNK細胞は、FcγRIIIのみを発現するが、単球はFcγRI、FcγRIIおよびFcγRIIIを発現する。目的の分子のADCC活性を評価するために、in vitroでのADCCアッセイ(例えば、米国特許第5,500,362号および米国特許第5,821,337号に記載のものなど)を実施することができる。そのようなアッセイのための有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞(PBMC)およびナチュラルキラー(NK)細胞が挙げられる。
「補体依存的細胞傷害性」および「CDC」とは、補体の存在下での標的細胞の溶解を指す。補体活性化経路は、同族(cognate)抗原と複合体化した分子、例えば抗体への、補体系の第1成分(C1q)の結合により開始する。補体活性化を評価するために、例えば、Gazzano-Santoroら、1996, J. Immunol. Methods, 202:163に記載のものなどのCDCアッセイを実施することができる。
6.発明の詳細な説明
本発明は、本明細書では「本発明の抗体」などの用語で呼ばれる、細胞膜の細胞外表面上に提示される組換え抗体またはそのフラグメントに関する。
一実施形態においては、本発明の抗体は、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である。一実施形態においては、本発明の抗体はヒト抗体である。
一実施形態においては、本発明の抗体は、IgA、IgE、IgM、IgD、IgYおよびIgGからなる群より選択される免疫グロブリン型のものである。
一実施形態においては、本発明の組換え抗体は、該抗体を細胞表面に対して標的化するアミノ酸配列を有する重鎖またはそのフラグメントを含む。一実施形態においては、本発明の組換え抗体は、重鎖またはそのフラグメントのC末端に融合させた、該抗体を細胞表面に対して標的化するアミノ酸配列を有する重鎖またはそのフラグメントを含む。
別の実施形態においては、本発明の組換え抗体は、該抗体を細胞表面に対して標的化するアミノ酸配列を有する軽鎖またはそのフラグメントを含む。特定の実施形態においては、本発明の組換え抗体は、軽鎖またはそのフラグメントのC末端に融合させた、該抗体を細胞表面に対して標的化するアミノ酸配列を有する軽鎖またはそのフラグメントを含む。
一実施形態においては、本発明の組換え抗体は、該抗体を細胞表面に対して標的化するアミノ酸配列をC末端に融合した完全長重鎖を含み、さらに、完全長軽鎖またはそのフラグメントを含んでもよい。さらに別の実施形態においては、本発明の組換え抗体は、重鎖部分のC末端に融合させた、該抗体を細胞表面に対して標的化するアミノ酸配列を有する該重鎖の部分を含み、さらに軽鎖またはそのフラグメントを含んでもよい。
特定の実施形態においては、抗体を細胞表面に対して標的化する前記アミノ酸配列は、膜貫通ドメインである。別の実施形態においては、抗体を細胞表面に対して標的化する前記アミノ酸配列は、GPIアンカーシグナル配列である。
本発明はさらに、本明細書で「本発明のベクター」と呼ばれる、細胞膜の細胞外表面上に提示される組換え抗体またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドを含むベクターに関する。一実施形態においては、本発明のベクターは複製することができる。一実施形態においては、本発明のベクターはウイルスベクターである。一実施形態においては、本発明のベクターはアデノウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである。特定の実施形態においては、本発明のベクターはアデノウイルスベクターである。
本発明はまた、本明細書で「本発明のライブラリー」と呼ばれる、細胞膜の細胞外表面上に提示される組換え抗体またはそのフラグメントを含むライブラリーにも関する。本発明は、抗体または抗体フラグメントのライブラリーならびに細胞表面上に抗体および／または抗体フラグメントのライブラリーを提示する細胞をスクリーニングする方法を提供する。これらの方法は、限定されるものではないが、抗体ライブラリーを細胞に送達するためのウイルスベクターなどのベクターを用いることを含み、ここで、該ライブラリーの発現は、細胞表面上での該抗体の提示をもたらす。また、抗体および／または抗体フラグメントのライブラリーをコードおよび／または提示するウイルスベクターおよび細胞も提供される。
一実施形態においては、本発明のライブラリーは、重鎖可変領域のライブラリーを含んでもよい；それはさらに、軽鎖可変領域のライブラリーを含んでもよい；およびそれは変異体Fc領域のライブラリーをさらに含んでもよい。
一実施形態においては、本発明のライブラリーは、細胞膜の細胞外表面上に提示される組換え抗体またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドを含む細胞のライブラリーである。一実施形態においては、哺乳動物細胞は、本発明のライブラリーを含む。特定の実施形態においては、本発明のライブラリーは、NS0細胞、CHO細胞、Vero細胞、Sf-9細胞、COS7細胞、および293細胞からなる群より選択される細胞により構成される。
本発明はまた、細胞膜の細胞外表面上に提示される組換え抗体またはそのフラグメントを含む本発明のライブラリーをスクリーニングする方法も提供する。一実施形態においては、ライブラリーをスクリーニングする方法により、特定の抗原に結合する抗体またはそのフラグメントの同定が可能になる。一実施形態においては、ライブラリーをスクリーニングする方法により、特定の抗原に対する結合が変化した抗体または抗体フラグメントの同定が可能になる。一実施形態においては、ライブラリーをスクリーニングする方法により、エフェクター分子(例えば、FcγRおよび／またはC1q)に対する結合が変化した抗体またはそのフラグメントの同定が可能になる。
本発明は、エフェクター分子(例えば、FcγRおよび／またはC1q)への結合が変化した変異体Fc領域を提供する。本発明はまた、エフェクター機能が変化した変異体Fc領域も提供する。一実施形態においては、本発明の変異体Fc領域は、低下した、抗体依存的細胞媒介性細胞傷害性(ADCC)を有する。
本発明は、所望の結合特性を有する少なくとも1種の抗体またはそのフラグメントを発現する哺乳動物細胞を選択する方法であって、a)細胞表面上に提示される抗体もしくは抗体フラグメントをコードする核酸の、発現ベクター中のライブラリーの、哺乳動物細胞への導入；b)それぞれのベクターによりコードされたポリペプチドの発現および細胞表面提示を可能にするように該ライブラリーを含む哺乳動物細胞を培養すること；c)該細胞を抗原と接触させること；およびd)該抗原に結合するポリペプチドを提示した少なくとも1個の細胞表面を含む細胞を単離することを含む、前記方法を提供する。本発明はさらに、1)単離された哺乳動物細胞から核酸を回収すること；2)該核酸に由来する少なくとも1個の抗体可変領域をコードする核酸を増幅すること；3)挿入された核酸と共に、分泌される可溶性抗体をコードする第2のベクターに増幅された核酸を挿入すること、および4)宿主細胞を第2のベクターで形質転換することを含む方法を、提供する。
特定の実施形態においては、前記抗体またはそのフラグメントは、前記ポリペプチドを細胞表面提示のために標的化することができるアミノ酸配列(例えば、限定されるものではないが、膜貫通ドメイン配列およびGPIアンカーシグナル配列)を含む。一実施形態においては、抗体またはそのフラグメントの重鎖は、該ポリペプチドを細胞表面提示のために標的化することができるアミノ酸配列を含む。別の実施形態においては、抗体またはそのフラグメントの軽鎖は、該ポリペプチドを細胞表面提示のために標的化することができるアミノ酸配列を含む。
一実施形態においては、細胞のライブラリー中の大部分のまたは全ての細胞は、1種のクローン抗体のみを発現する。別の実施形態においては、細胞のライブラリー中の大部分のまたは全ての細胞は、少なくとも2種の異なる抗体を発現する。1つの実施形態においては、本発明のベクターは、抗体重鎖またはそのフラグメントをコードする。別の実施形態においては、本発明のベクターはさらに、抗体または抗体フラグメントの軽鎖をコードし、ここで重鎖および軽鎖は両方とも形質導入された細胞中で発現される。特定の実施形態においては、本発明のベクターは、ウイルスベクターである。
本発明はさらに、細胞中で発現された場合、細胞膜上に提示される抗体または抗体フラグメントのライブラリーをコードするウイルスベクターを提供する。本発明は、ウイルスベクター核酸を含む細胞、および所望の特性を有する抗体または抗体フラグメントのライブラリーをスクリーニングする方法を提供する。
本発明はまた、抗体依存的細胞媒介性細胞傷害性(ADCC)作用に基づいて抗体をスクリーニングする方法も提供する。一実施形態においては、ウイルスベクターは、抗体Fc変異体のライブラリーをコードする。
6.1ウイルスベクター
本発明のウイルスベクターは、細胞中で発現された場合、抗体または抗体フラグメントが細胞表面に結合する該抗体または抗体フラグメントに関する重鎖配列のライブラリーをコードする核酸を含む。一実施形態においては、細胞表面に結合した場合、抗体または抗体フラグメントのライブラリーは、細胞膜の細胞外側に存在する。一実施形態においては、前記ウイルスベクターライブラリーはさらに、抗体または抗体フラグメントの軽鎖配列のライブラリーをコードする(図1A-C中の例I-VIを参照)。
ウイルスベクターは、抗体または抗体フラグメントライブラリーを送達するためのいくつかの利点を提供する。該ライブラリーの多様性は、抗体ライブラリーを調製し、スクリーニングする場合、1つの考慮事項である。典型的には、ファージ提示抗体ライブラリーは、約109個のユニークな抗体の多様性を有してもよい。細胞提示抗体ライブラリーの場合、それぞれの細胞が1個のユニークな抗体のみを発現する場合、等価な多様性を達成するためには少なくとも109個、一般的には1010個以上の細胞を使用する必要がある。これは、スクリーニングのために取り扱うには多数の細胞であり、多様性を維持しながら、より少数の細胞でも機能するのが好ましいであろう。本発明においては、ウイルスベクターを用いて、抗体または抗体フラグメントライブラリーを送達する。これにより、選択した感染多重度(MOI)での感染が可能になる。細胞あたり、一定の平均数のユニークな抗体を提示するようにMOIを調整することができる。例えば、細胞あたり、平均50個のユニークな抗体の発現を可能にするであろう50のMOIを用いることができる。他のライブラリースクリーニング方法と同様、本発明の方法は、第1ラウンドのスクリーニング／富化を含んでもよい。本発明のいくつかの実施形態においては、前記細胞を、最大で10-2、10-1、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、50、100、200、500、103、104、または105のMOIで感染させる。必要に応じて、選択された抗体をコードするウイルスベクターをスクリーニングすることにより、さらなるラウンドのスクリーニングを実施することができる。一実施形態においては、選択の第2ラウンドは、第1ラウンドの選択におけるよりも低いMOIを用いる。
任意のウイルスベクターを、本発明に従って用いることができる。ウイルスベクターとしては、限定されるものではないが、レトロウイルスベクター、ワクシニアベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター(例えば、HSV)、バキュロウイルスベクター、サイトメガロウイルス(CMV)ベクター、パピローマウイルスベクター、サルウイルス(SV40)ベクター、シンドビスベクター、セムリキ森林熱ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターが挙げられる。一実施形態においては、ウイルスベクターは高力価のウイルスベクターである。高力価ウイルスベクターは、1 mlあたり、少なくとも109個のウイルス粒子の力価に単離および／または濃縮することができるものである。一実施形態においては、ウイルスベクター抗体ライブラリーは、高力価ウイルスベクターである。一実施形態においては、本発明のウイルスベクターは、アデノウイルス、バキュロウイルス、AAVまたはヘルペスウイルスベクターである。一実施形態においては、前記ウイルスベクターはワクシニアベクターではない。
一実施形態においては、ウイルスベクターはAAVベクターである。一実施形態においては、AAVベクターは、抗体重鎖および軽鎖ライブラリーの両方をコードする。例えば、抗体をコードするAAVベクターのさらなる記載については、US20055003482、US20040265955およびFangら、Nat Biotechnol. 2005 May;23(5):584-90を参照されたい。本明細書に記載の抗体重鎖と共に、読み枠を合わせて（in-frame）GPIアンカーまたは膜貫通コード配列をクローニングすることにより、これらのベクターを本発明において用いることができる。
一実施形態においては、ウイルスベクターはアデノウイルスベクターである。アデノウイルスベクターは、ウイルスベクターの核酸をアデノウイルスキャプシドタンパク質中にパッケージングすることができるアデノウイルスから誘導された、任意のベクターであってよい。このアデノウイルスベクターは、任意のアデノウイルス血清型に由来するものであってよく、または少なくとも2個の異なるアデノウイルス血清型に由来する異なる部分を有するキメラアデノウイルスベクターであってもよい。アデノウイルスベクターは、ヒトまたは別の動物のアデノウイルスに由来するものであってよい。一実施形態においては、アデノウイルスベクターは、ヒトアデノウイルス血清型2、3、5、12、35または40に由来する。アデノウイルスベクターは、感染させる細胞に関して、複製能がある、または複製能がないものであってよい。一実施形態においては、アデノウイルスベクターは、感染させる細胞に関して、複製能がある。例えば、アデノウイルスベクターは、E1領域の欠失を含んでもよく、このベクターを用いて、E1遺伝子をトランスに発現する293細胞を感染させ、アデノウイルスベクターの複製を可能にする。多くの他のアデノウイルスベクター遺伝子欠失および対応する相補的な細胞系の組合せが当業界で公知である。一実施形態においては、アデノウイルスベクターは、感染させる細胞に関して複製能がないものであってよい。例えば、E1欠失させたアデノウイルスベクターを用いて、A549細胞を感染させる。一実施形態においては、複製能がないアデノウイルスベクターを、ヘルパーウイルス(例えば、E1タンパク質を発現する)を用いてレスキューする。一実施形態においては、1)細胞を、細胞表面上に提示されるであろう抗体をコードする複製能のないアデノウイルスに感染させる；2)所望の結合特性を有する抗体を提示するものについて、細胞をスクリーニングおよび選別する；3)陽性選別された細胞をヘルパーウイルスに感染させて、ウイルスベクターをレスキューする。ヘルパーウイルスは、アデノウイルスベクターについての少なくとも1種の相補的遺伝子産物(例えば、E1欠失させたアデノウイルスについては、E1タンパク質)を発現する任意のウイルスであってよい。一実施形態においては、ヘルパーウイルスはアデノウイルスである。一実施形態においては、アデノウイルスベクターは、温度感受性突然変異を担持する結果として複製能がないものであってよい。例えば、ts369突然変異(Hasson, T.B.ら、J Virol 63(9):3612-21(1989))を含むアデノウイルスベクターは、40℃で培養した場合は複製欠陥であるが、より低い温度で培養することによりレスキューすることができる。一実施形態においては、1)細胞表面上で提示されるであろう抗体をコードする温度感受性アデノウイルスベクターに、非許容的温度で、細胞を感染させる；2)所望の結合特性を有する抗体を提示する細胞を選択する；3)該細胞をウイルス複製を許容する温度で培養することにより、ウイルスを選択された細胞からレスキューする。
一実施形態においては、前記ウイルスベクターは、抗体またはそのフラグメントの重鎖をコードする。別の実施形態においては、ウイルスベクターはさらに、抗体またはそのフラグメントの軽鎖をコードし、従って、重鎖および軽鎖抗体ポリペプチドの両方を発現することができる。この実施形態においては、重鎖および軽鎖の両方は、細胞表面上に一緒に提示される。一実施形態においては、重鎖および軽鎖は、細胞表面上に全抗体として提示される。別の実施形態においては、重鎖および軽鎖は、細胞表面上に抗体フラグメントとして提示される。一実施形態においては、軽鎖は重鎖コード配列の5'(上流)に位置する。理論によって束縛されることを望むものではないが、これは非毒性重鎖の過剰を回避することができる(Proudfoot, 1986, Nature, 322:562-565; およびKohler, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:2 197)。重鎖および軽鎖のコード配列は、cDNAまたはゲノムDNAを含んでもよい。
一実施形態においては、前記ウイルスベクターの核酸は、選択マーカーのコード領域をさらに含む。いくつかの選択システム／マーカーを用いることができ、例えば、限定されるものではないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(Wiglerら、Cell 11:223 (1977))、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ (Szybalski & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202 (1992))、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ (Lowyら、Cell 22:8 17 (1980))遺伝子を、それぞれ、tk-、hgprt-またはaprt-細胞中で用いることができる。また、代謝拮抗物質耐性を、以下の遺伝子に対する選択の基礎として用いることができる：メトトレキサートに対する耐性を付与するdhfr(Wiglerら、Natl. Acad. Sci. USA 77:357 (1980); OHareら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527 (1981))；ミコフェノール酸に対する耐性を付与するgpt(Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072 (1981))；アミノグリコシドG-418に対する耐性を付与するneo(Clinical Pharmacy 12:488-505; WuおよびWu, Biotherapy 3:87-95 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993); Mulligan, Science 260:926-932 (1993);ならびにMorganおよびAnderson, Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217 (1993); T1B TECH 11 :155-215 (May 1993))；ならびにヒグロマイシンに対する耐性を付与するhygro(Santerreら、Gene 30:147 (1984))。組換えDNA技術の分野で一般的に知られる方法を、所望の組換えクローンを選択するために慣用的に適用することができ、そのような方法は、例えば、Sambrookら(編)、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, (2001); Ausubelら(編)、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1998); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); ならびにDracopoliら(編)、Current Protocols in Human Genetics、第12および13章、John Wiley & Sons, NY (1999); Colberre-Garapinら、1981, J. Mol. Biol. 150:1に記載されている。
本明細書に記載されるように、一実施形態においては、組換え全抗体分子を発現させる。別の実施形態においては、免疫グロブリン分子のフラグメント(例えば、Fabフラグメント、F(ab')フラグメント、およびエピトープ結合フラグメント)を発現させる。
6.2核酸
抗体または抗体フラグメントをコードする配列のライブラリーを発現させる場合、該抗体または抗体フラグメントは細胞表面に結合される。これを達成するために、ウイルスベクターライブラリーの核酸は、少なくとも2個の機能し得る形で連結されたコード領域を含む。例えば、図1を参照されたい。第1のコード領域は、抗体鎖(例えば、重鎖)ライブラリーをコードする。第2のコード領域は、細胞膜に固定され、および／または結合するアミノ酸配列をコードする。１つのポリペプチドが翻訳の際に形成されるように、第1および第2のコード領域は読み枠を合わせてかつ機能し得る形で連結される。これは、抗体または抗体フラグメントの重鎖と、細胞膜に固定され、および／または結合するアミノ酸配列とを含む融合タンパク質をもたらす。一実施形態においては、第1および第2のコード領域を、互いに直接連結／近接させることができる。別の実施形態においては、少なくとも1個のコドンが第1および第2のコード領域の間にあるか、またはそれらを分離している。一実施形態においては、少なくとも1個のコドンが、抗体鎖(例えば、重鎖)と膜固定／結合ドメインの間にリンカーまたはスペーサー配列を提供する。一実施形態においては、第2のコード領域は、細胞膜に固定されおよび／もしくは結合するアミノ酸配列をコードするか、またはそれは膜貫通ドメインもしくはGPIアンカーをコードする。
ウイルスベクターライブラリーに関しては、ライブラリーの前記第1のコード領域は、抗体または抗体フラグメントの重鎖をそれぞれコードする核酸配列の遺伝的に多様なレパートリーであろう。一実施形態においては、第2のコード領域は、ライブラリーを通して同じである(例えば、分解促進因子(DAF)に由来するGPIアンカードメイン)。
一実施形態においては、第1のコード領域を、プロモーターに機能し得る形で連結する。一実施形態においては、プロモーターはウイルスベクターに関して異種性である。例えば、異種性プロモーターは、前記ウイルスベクターが由来するのと同じウイルスに由来するものではない。別の実施形態においては、プロモーターは異種性ではない。例えば、プロモーターはウイルスベクターが由来するのと同じウイルスに由来するものである。
プロモーターは、本質的には、選択された細胞中で活性であるか、または活性となるように誘導することができる任意のプロモーターであってよい。しかし、ウイルスベクターのタイプは、プロモーターの選択に影響を及ぼすことがありうる。例えば、特定のウイルスベクターと干渉し得るプロモーターを回避するのが望ましい。例えば、アデノウイルスベクター中の同じプロモーターのコピーは、該ベクターの複製の際に相同組換えを誘導し得る(例えば、Stecherら、2003, Methods Mol Med. 76:135-52; Carlsonら、2002, Methods Enzymol. 346:277-92を参照)。逆に、特定のウイルスベクターがプロモーターと干渉し得る場合、該プロモーターを回避するのが望ましい(例えば、Graveら、2000, J Gene Med. 2:433-43を参照)。
抗体重鎖またはそのフラグメントをコードする第1のコード領域の発現を制御するのに用いることができるプロモーターとしては、限定されるものではないが、SV40初期プロモーター領域(BernoistおよびChambon, 1981, Nature 290:304-310)、ラウス肉腫ウイルスの3'長末端反復配列中に含まれるプロモーターであるCMVプロモーター (Yamamotoら、1980, Cell 22:787-797)、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagnerら、1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445)、メタロチオネイン遺伝子の調節配列(Brinsterら、1982, Nature 296:39-42)、テトラサイクリン(Tet)プロモーター(Gossenら、1995, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89:5547-5551); ADC (アルコールデヒドロゲナーゼ)プロモーター、PGK(ホスホグリセロールキナーゼ)プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター、リンパ球様細胞中で活性である免疫グロブリン遺伝子制御領域 (Grosschedlら、1984, Cell 38:647-658; Adamesら、1985, Nature 318:533-538; Alexanderら、1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444)、精巣細胞、乳腺細胞、リンパ球様細胞および肥満細胞中で活性であるマウス乳腺腫瘍ウイルス制御領域(Lederら、1986, Cell 45:485-495)、肝臓中で活性であるアルブミン遺伝子制御領域(Pinkertら、1987, Genes and Devel. 1:268-276)、肝臓中で活性であるα-フェトプロテイン遺伝子制御領域(Krumlaufら、1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammerら、1987, Science 235:53-58；肝臓中で活性であるα1-抗トリプシン遺伝子制御領域(Kelseyら、1987, Genes and Devel. 1:161-171)、骨髄細胞中で活性であるβ-グロビン遺伝子制御領域(Mogramら、1985, Nature 315:338-340; Kolliasら、1986, Cell 46:89-94)；脳のオリゴデンドロサイト中で活性であるミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域(Readheadら、1987, Cell 48:703-712);骨格筋中で活性であるミオシン軽鎖-2遺伝子制御領域(Sani, 1985, Nature 314:283-286);神経細胞中で活性であるニューロン特異的エノラーゼ(Morelliら、1999, Gen. Virol. 80:571-83);神経細胞中で活性である脳由来神経栄養因子(BDNF)遺伝子制御領域(Tabuchiら、1998, Biochem. Biophysic. Res. Com. 253:818-823);アストロサイト中で活性であるグリア細胞繊維性酸性タンパク質(GFAP)プロモーター(Gomesら、1999, Braz J Med Biol Res 32(5): 619-631; Morelliら、1999, Gen. Virol. 80:571-83)ならびに視床下部中で活性である性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域(Masonら、1986, Science 234:1372-1378)が挙げられる。
一実施形態においては、ポリアデニル化シグナルは、第2のコード領域の3'に位置し、それに機能し得る形で連結される。本質的には、前記核酸を含有する特定の細胞型において活性である任意のポリアデニル化シグナルを用いることができる。しかし、ウイルスベクターのタイプが、ポリアデニル化シグナルの選択に影響することがありうる。本発明と共に有用であるポリアデニル化シグナルとしては、限定されるものではないが、SV40およびウシ成長ホルモン遺伝子に由来するものである。
一実施形態においては、前記核酸は、第1のコード領域の上流(5')に位置し、それに機能し得る形で連結されたアミノ末端シグナルペプチド配列のコード領域も含む。理論的考慮によって制限されることを望むものではないが、シグナルペプチドは、最初に小胞体(ER)中に輸送されるようにタンパク質に指令する。一実施形態においては、該タンパク質のアミノ末端のシグナル配列は、該タンパク質の翻訳後プロセッシングの際に切断される。一実施形態においては、天然シグナル配列が保持される。別の実施形態においては、天然シグナル配列を欠失させ、異種シグナル配列と置換する。選択された異種シグナル配列は、特定の宿主細胞により認識され、場合によりプロセシングされる(すなわち、シグナルペプチダーゼにより切断される)ものであるべきである。
一実施形態においては、ウイルスベクター核酸は、抗体軽鎖または抗体軽鎖のフラグメントのコード配列をさらに含む。図1Cおよび1Eに示されるように、軽鎖コード配列を、重鎖コード配列に機能し得る形で連結されたプロモーターとは異なるプロモーターに機能し得る形で連結することができる。換言すれば、軽鎖の発現が、重鎖の発現と直接関連しない。別の実施形態においては、図1の例IVおよびVIに示されるように、軽鎖コード配列を、内部リボゾーム進入部位(IRES)または自己プロセッシング切断配列により、重鎖コード配列と同じプロモーターに機能し得る形で連結する。
図1A-Cの例I-VIに示されるベクターは、本発明のウイルスベクター構築物の非限定例を描写するものである。
6.3ウイルスベクターライブラリー構築物
本発明のウイルスベクターライブラリーを、当業者には公知の任意のいくつかの方法により構築することができる。本質的には、任意の抗体ライブラリーをウイルスベクター中にクローニングし、本発明に従って用いることができる。簡単に述べると、それぞれ抗体または抗体フラグメントの重鎖をコードする核酸配列の多様なレパートリーをコードする核酸のライブラリーを単離する。例えば、抗体重鎖をコードする核酸配列のレパートリーを、限定されるものではないが、抗体cDNAライブラリー、すなわち抗体を発現する任意の組織または細胞から単離された核酸(例えば、ポリA＋RNA)から作製されたcDNAライブラリーから、単離することができる。次いで、コード配列のレパートリーを、例えば、PCRにより増幅し、それを、当業界で公知の標準的な方法を用いてウイルスベクター(例えば、複製可能なウイルスベクター)中にクローニングすることができる。抗体コード配列のライブラリーも、市販されている。一実施形態においては、前記ライブラリーを、ヒト抗体に由来するコード領域を用いて構築する。いくつかの実施形態においては、前記ライブラリーは、少なくとも100、103、104、105、106、5 x 106、107、5 x 107、108、5 x 108、109、5 x 109、1010、5 x 1010、1011、5 x 1011または1012の異なる抗体を発現する。
一度、抗体重鎖をコードする核酸のライブラリーが得られたら、それをウイルスベクター中にクローニングする。本質的には、ウイルスベクター中に核酸をクローニングするための公知の任意の方法を用いることができる。これらの方法としては、限定されるものではないが、制限酵素消化および連結、pcr SOEing(Hortonら、1989, Gene, 77, 61-68)または組換えが挙げられる。一実施形態においては、ウイルスベクターはアデノウイルスベクターであり、クローニング方法は組換えである。組換えを、当業界で公知の任意の方法によって実施することができる。一実施形態においては、BJ5183組換え方法／系を用いる(例えば、PCT特許公開WO 02/067861およびWO 96/17070を参照)。簡単に述べると、コード領域のライブラリーをプラスミド中にクローニングして、アデノウイルスベクターへの挿入領域と同種の配列がフランキングしたコード領域を作製する。このプラスミドライブラリーを、適合性のアデノウイルスベクタープラスミドを用いて、BJ5183細胞中に同時形質転換する。前記挿入を含む完全長アデノウイルスベクタープラスミドを単離し、哺乳動物細胞中にトランスフェクトして、アデノウイルスベクターライブラリーを作製する。
アデノウイルスベクターライブラリーを構築するための別の組換え法は、例えば、ViraPower(商標)Adenoviral Gateway(登録商標)Vectorsを用いる、Invitrogen(Carlsbad, California)社製Gateway(登録商標)システムを用いる。このシステムは、アデノウイルスベクターの完全DNA配列を含むプラスミドを用いる。アデノウイルスベクターは、E1およびE3コード領域中に欠失を含む。アデノウイルスベクターを、E1タンパク質を発現する293A細胞(Invitrogen, CA)中で増殖させることができる。E3は、in vitroでのアデノウイルスの複製のための非必須領域である。
このシステムに核酸をクローニングするためのプロトコルは、Invitrogen社から入手可能である。簡単に述べると、例えば、このシステムを用いてアデノウイルスベクターを構築する方法を以下に記載する。核酸のライブラリーを、進入ベクター中にクローニングし、進入クローンを作製する。進入ベクターとしては、限定されるものではないが、pENTR(商標)/D-TOPO(登録商標); pENTR(商標)/SD/D-TOPO(登録商標); pENTR(商標)/TEV/D-TOPO(登録商標); pENTR(商標)1A; pENTR(商標)2B; pENTR(商標)3C; pENTR(商標)4; およびpENTR(商標)11(全てInvitrogen, CAから入手可能である)が挙げられる。これらのベクターは、組換え部位(例えば、attR1およびattR2)にフランキングするマルチクローニング部位(MCS)を含む。核酸のライブラリーをMCS中にクローニングし、個々のライブラリー配列に組換え部位をフランキングさせる。次の工程は、アデノウイルスベクタープラスミド(例えば、pAd/PL-DEST(商標)またはpAd/CMV/V5-PL-DEST(両方ともInvitrogenから入手可能である))中に、進入ベクターに由来するライブラリーをクローニングすることである。このクローニング工程は、進入ベクター中の組換え部位と、アデノウイルスベクタープラスミド中のものとの間の組換えを用いて、アデノウイルスベクタープラスミドライブラリーを作製する。ウイルスベクター粒子を作製するために、組換えたアデノウイルスベクタープラスミドライブラリーをPacIで消化し、293A細胞中にトランスフェクトする。次いで、ウイルスを増幅させ、必要に応じて精製して、アデノウイルスベクターライブラリーのストック液を作製する。さらなる詳細については、以下のInvitrogen(商標)の説明書：pAd/CMV/V5-PL-DEST(商標)およびpAd/PL-DEST(商標)Gateway(登録商標)Vectors, Version D, Sept 28, 2005; ViraPower(商標)Adenoviral Expression System, Version B, July 11, 2005を参照されたい。
本明細書に記載の抗体を提示する細胞をスクリーニングする方法を、他の抗体スクリーニング方法および／またはシステムと組み合わせて用いることができる。例えば、本発明の一実施形態は、細胞表面上に抗体のライブラリーを発現する哺乳動物細胞を用いる。このライブラリーは、任意の起源に由来するものであってよい。それは、ヒト細胞から単離された大きなライブラリーであってよく、本質的には被験体または被験体群に由来する抗体可変領域の完全なヒトレパートリーでありうる。別の実施形態においては、前記ライブラリーを、目的の抗原で免疫したマウス(例えば、ヒト抗体を発現するマウス)から単離することができる。従って、前記ライブラリーは、目的の抗原に結合する抗体について富化される。別の実施形態においては、ファージ提示抗体ライブラリーを、目的の抗原に対してスクリーニングする。次いで、本発明の抗体ライブラリーを、目的の抗原に結合する抗体を発現するファージから作製する。再び、前記ライブラリーは、目的の抗原に結合する抗体について富化される。さらに別の実施形態においては、本発明の抗体ライブラリーを、ヒト化抗体フラグメントのライブラリーから作製する。ヒト化抗体フラグメントを、限定されるものではないが、フレームワークシャッフリング(例えば、PCT公開WO 05/042743)および低相同性ヒト化(例えば、PCT公開WO 05/035575)などの当業者には公知の任意の方法により作成することができる。別の実施形態においては、前記ライブラリーは、目的の抗原に結合する抗体から誘導された突然変異CDRライブラリーである。突然変異CDRライブラリーは、親抗体のCDR配列のCDR突然変異である抗体をコードするライブラリーである。突然変異CDRとしては、限定されるものではないが、結晶学的研究により接触残基であると決定されたCDRアミノ酸を突然変異させることにより作製されたライブラリー(例えば、Dall'Acquaら、1996 Biochemistry 35:9667-76)；1個の天然CDR(例えば、最も高い結合効率を有すると考えられるもの)を保持し、他の5個のCDR(例えば、Raderら、1998, PNAS 95:8910-15)の代わりにCDRのライブラリーと組み合わせることにより作製されたライブラリー；「CDRウォーキング」(例えば、Yangら、1995, J Mol Biol 254:392-403)により作製されたライブラリー；および親抗体のそれぞれのCDRを別々に突然変異させる方法(例えば、Wuら、1998, PNAS 95:6037-42)により作製されたライブラリーが挙げられる。従って、抗体の任意のライブラリーを、本発明に従って用いて、細胞膜上で該ライブラリーを発現させることができる。一実施形態においては、前記ライブラリーは、親抗体から誘導された親和性成熟ライブラリーである。
一実施形態においては、ファージ提示抗体ライブラリーを、目的の抗原に対してスクリーニングする。次いで、本発明のための抗体ライブラリーを、目的の抗原に結合する抗体を発現するファージから作製する。一実施形態においては、それぞれ選択されたファージに由来する重鎖および軽鎖可変領域の両方を、それぞれ重鎖および軽鎖をコードするウイルスベクター(例えば、アデノウイルスベクター)中にクローニングする。従って、同じ重鎖および軽鎖の組合せが維持される。別の実施形態においては、重鎖および軽鎖の可変領域を単離し、無作為に組み合わせる。従って、理論的には、前記ライブラリーは、それぞれ予め選択された重鎖可変配列と、それぞれ予め選択された軽鎖配列との全ての組合せを含む。例えば、最初のファージスクリーニングにより1,000個のユニークなファージおよび抗体配列が得られた場合、それぞれ予め選択された重鎖可変配列と、それぞれ予め選択された軽鎖配列との全ての組合せから構成されるライブラリーは、本発明のウイルスベクター中にクローニングすることができる106の可能性のあるユニークな抗体配列を計上するであろう。この方法は、最初のファージライブラリーよりもさらにずっと多様なレパートリーを作製する。さらに、ファージ提示方法は、特定の抗体フラグメントに制限されるが、それに対しこの方法では、抗体フラグメントのファージ中での最初の選択されたスクリーニングおよびその後の、例えば、ファージ選択工程から単離された可変領域配列から作製された全抗体のスクリーニングが可能になる。本発明の抗体ライブラリーを作製するのに用いることができるファージ提示方法の例としては、Brinkmanら、1995, J. Immunol. Methods 182:41-50; Amesら、1995, J. Immunol. Methods 184:177-186; Kettleboroughら、1994, Eur. J. Immunol. 24:952-958; Persicら、1997, Gene 187:9-18; Burtonら、1994, Advances in Immunology 57:191-280; PCT公開WO 90/02809、WO 91/10737、WO 92/01047、WO 92/18619、WO 93/11236、WO 95/15982、WO 95/20401、およびWO97/13844; ならびに米国特許第5,698,426号、第5,223,409号、第5,403,484号、第5,580,717号、第5,427,908号、第5,750,753号、第5,821,047号、第5,571,698号、第5,427,908号、第5,516,637号、第5,780,225号、第5,658,727号、第5,733,743号および第5,969,108号に開示されたものが挙げられる。
さらなる詳細および抗体ライブラリーをクローニングする方法については、例えば、PCT特許公開WO 2005/063817; WO 95/15393; およびHiguchiら、1997 J Immunological Methods 202:193-204を参照されたい。
6.4選択戦略および方法
一度、ウイルスベクター抗体ライブラリーを構築したら、それを少なくとも1種の目的の抗原に対してスクリーニングすることができる。スクリーニングに関する多くの変更を、本明細書に記載のように本発明から逸脱することなく行うことができることは、当業者には理解されるであろう。
一般的には、細胞をウイルスベクター抗体ライブラリーに感染させる。好適なMOIを、限定されるものではないが、入手可能な細胞数；スクリーニングすることができるかもしくはスクリーニングすることが望ましい細胞数；ウイルスベクターの力価；ウイルスベクターによる細胞の感染性；および細胞に対するウイルスベクター感染の毒性などの、いくつかの因子に基づいて用いることができる。一般的には、MOIなどの感染手順を、ライブラリーのスクリーニングの前に最適化することができる。
感染後、細胞を培養して、細胞表面上に提示される抗体ライブラリーを発現させる。次いで、この細胞を、目的の抗原に結合するか、または所望の特性(例えば、Fc受容体への結合)を有する抗体を発現するものについてスクリーニングする。細胞を本明細書に記載され、当業者には公知の方法によりスクリーニングすることができる。所望の特性を有する抗体を発現する細胞を、他の細胞から分離する。
この時点で、陽性抗体をコードする核酸を単離し、これを用いてさらなる特性評価のために対応する抗体を発現させることができる。あるいは、所望の抗体を発現するウイルスベクターを単離し、さらに別のラウンドのスクリーニングに供することができる。この第2ラウンドのスクリーニングにおいては、同じか、または異なるMOIを用いることができる。一実施形態においては、第2およびその後のラウンドのスクリーニングは、最初の感染よりも低いMOIを用いる。一実施形態においては、それぞれその後のラウンドのスクリーニングにおいて、MOIを減少させる。出願人はメカニズムの憶測によって束縛されることを望むものではないが、最初のライブラリーのユニークな個々のメンバーのうちのほんのわずかな割合のものを、最初のスクリーニング方法において選択することができる。最初の感染の最初のMOIが高いほど、より多数の無関係の抗体の選択を誘導し得る。これは、高いMOIを有する最初の感染が、それぞれの細胞中での複数のウイルスベクターの感染と、抗体の発現をもたらすためである。従って、選択された細胞は、選択しようとする抗原に結合する1個の抗体を発現しなければならないだけでなく、同じ細胞中で無関係の抗体を発現する任意の他のウイルスベクターも選択することができる。従って、多くの場合、より低いMOIを用いて、少なくとも第2ラウンドの選択を実施することが望ましい。本発明のいくつかの実施形態においては、第2の選択工程は、最大で10-6、10-5、10-4、10-3、0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1または10のMOIを用いる。より低いMOIを用いて、各細胞が1個以下のウイルスベクターにより感染することを実際に保証することができる。これにより、「キャリーオーバー」配列またはウイルスベクターが排除される。
一度、所望の特性を有する抗体をコードするウイルスベクターを同定したら、これらの抗体のコード領域を、さらなる評価および／または抗体の製造のために他の発現ベクター／システムにクローニングすることができる。選択された抗体を、当業界で公知かつ本明細書に記載の方法によって改変することもできる。
一度、細胞表面上に抗体を発現する細胞のライブラリーが構築されたら、次の工程は、所望の抗原に結合する抗体を発現する細胞をスクリーニングし、選択するか、または所望の特性(例えば、Fc受容体に対する変化した結合親和性)を有する抗体を選択することである。このスクリーニングおよび選択工程を、本明細書に記載のものなどの当業界で公知の任意の様々な技術を用いて達成することができる。例えば、目的の抗原をタグ付けし(例えば、蛍光マーカー)、これを用いて細胞表面上に抗体を結合させることができる；かくして、該抗原に結合する抗体を発現する細胞を標識する。いくつかの蛍光標識が当業界で公知であり、市販されている(例えば、Molecular Probes: Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, R. P. Haugland、第9版、Molecular Probes, (OR, 2004)を参照)。
一実施形態においては、抗原をビオチン標識する。細胞は抗原に結合し、ストレプトアビジンにコンジュゲートした標識を用いて、該抗原に結合した細胞を標識する。一実施形態においては、PEコンジュゲートしたストレプトアビジンを用いる。一実施形態においては、前記抗原はストレプトアビジンを含み、標識されたビオチンを検出試薬として用いる。これらの標識された細胞を、当業界で公知の技術を用いて同定および単離することができる。例えば、蛍光タグ付き抗原の場合、細胞を、例えば、フローサイトメーターにより分離／選別し、蛍光に基づいて選別することができる。例えば、PCT公開WO 04/014292、WO 03/094859、WO 04/069264、WO 04/028551、WO 03/004057、WO 03/040304、WO 00/78815、WO 02/070007およびWO 03/075957、米国特許第5,795,734号、第6,248,326号および第6,472,403号、Pecheurら、2002, FASEB J. 16: 1266-1268; Almedら、2002, J.Histochemistry & Cytochemistry 50:1371-1379を参照されたい。別の実施形態においては、蛍光細胞を、蛍光顕微鏡を用いて観察し、微小ガラスピペット、マイクロピペッターまたはマイクロマニピュレーターなどの標準的なマイクロマニピュレーション技術を用いて直接単離することができる。別の実施形態においては、細胞を、ビーズを用いて選別／分離することができる(例えば、磁気ビーズ；Chestnutら、1996, J Immunological Methods 193:17-27を参照)。例えば、抗原をビオチン化し、該抗原に結合する抗体を発現する細胞を、ストレプトアビジン被覆ビーズを用いて単離することができる。
一実施形態においては、抗原を蛍光標識する。一実施形態においては、蛍光標識を、Aqua、Texas-Red、FITC、ローダミン、ローダミン誘導体、フルオレセイン、フルオレセイン誘導体、カスケードブルー、Cy5、フィコエリトリン、GFPまたはGFP誘導体、例えば、EGFPからなる群より選択する。
一実施形態においては、抗原を組換え生産し、ペプチドタグ、例えば、FLAG、HISタグを組み込む。ペプチドタグに対する抗体を用いて、特定の抗原に結合する細胞を検出および選別／選択または排除することができる。
例えば、第2の抗原ではなく、第1の抗原に結合する抗体のスクリーニングの場合、2個以上の抗原を選択工程において用いることができる。この場合、第2の抗原に結合しない抗体を発現する細胞を選別することによって陰性選択工程を行った後、第1の抗原に結合する抗体を選別する陽性選択工程を行うことができる。一実施形態においては、陽性選択工程を行った後、陰性選択工程を行う。一実施形態においては、陽性および陰性選択工程を本質的に同時に行う。例えば、第1および第2の抗原を、異なる蛍光分子で標識する。両抗原を、前記抗体を提示する細胞と一緒にインキュベートする。抗体の濃度を、この実施形態のために最適化することができる。次いで、第2の抗原ではなく、第1の抗原に結合するものについて、細胞を同時に選別する(例えば、2色FACS分析)。当業者であれば、本明細書の教示に基づいて、連続的スクリーニング／選択工程を用いることにより、および多色FACS分析により、複数の抗原への結合について陰性および／または陽性にスクリーニングすることができる。
いくつかの実施形態においては、特定の細胞型(標的細胞)に結合する抗体を選択することができる。ファージにより提示された抗体に関するそのような選択は、例えば、Hutsら、2001, Cancer Immunol. Immunother. 50:163-171に記載されている。標的細胞を固定されていても固定されていなくてもよいが、それは例えば、固定により変化する細胞表面抗原に結合する抗体を選択する機会を提供することができる。特定の細胞型を、前記プロセスにおいてスクリーニング／選択しようとする生物学的機能を参照して選択することができる。好適な細胞型は、所望の生物学的機能を有する抗体が結合すると予想されるものであろう。例えば、癌細胞の増殖を阻害することができる抗体を単離することが望ましい場合、そのような抗体は癌細胞に結合することができると予想される。かくして、癌細胞に結合することができるそのような抗体を最初に選択することが好適である。細胞に結合する抗体を選択するために、抗体を提示する細胞を、結合をもたらす条件を用いて、標的細胞への結合についてスクリーニングすることができる。例えば、抗体を発現する細胞ではなく、標的細胞に結合するビオチン結合抗体を、ストレプトアビジン被覆磁気ビーズに結合させることができる。次いで、これらのビーズを用いて、標的細胞を固定する。抗体を発現する細胞を、固定した細胞と混合し、磁気ビーズに結合するものを単離することができる。特異的な公知の抗原ではなく細胞に結合する抗体の選択は、細胞表面上に提示された従来未知であった抗原に結合する抗体を選択する可能性があるという利点を有する。そのような抗原はタンパク質である必要はなく、2個以上の細胞表面分子を含んでもよい。選択した種類の細胞または特定の分子への結合に対する選択工程を、1回または複数回、例えば、少なくとも約2、3、4、5、6、もしくは7回繰り返すことができる。必要に応じて、2回以上の異なる予備選択工程を、同時に、または連続的に実施することができる。例えば、2種類の異なる癌細胞に結合する抗体を選択することができる。
必要に応じて、陽性選択工程の前後で実施することができる1回以上の陰性選択工程により、さらなる精製を達成することができる。例えば、癌細胞に結合する抗体を選択する場合、抗体を提示する細胞を非癌細胞に結合させ(例えば、上記のように)、これらの細胞に結合しない抗体をさらなる試験のために保持させることができる。そのような陰性選択は、非標的細胞に非特異的に結合する抗体のうち少なくともいくつかを排除することができる。あるいは、非標的タンパク質(例えば、標的抗原と比較して非関連性であるか、または類似する抗原)を固相支持体に固定し、陰性選択工程において用いて、非標的タンパク質に結合する抗体発現細胞を排除する。別の例においては、密接に関連する構造を有する受容体のファミリーの一部である特定の受容体に対する抗体を単離することが望ましい。この特定の受容体に特異的な抗体を単離する確率を増加させるために、前記ファミリーに由来する他の受容体の1つ、いくつか、または全部を用いて、陰性選択工程を実施することができる。陰性選択工程においては、非標的抗原に結合しない抗体を発現する細胞を、さらなる試験のために保持することができる。この選択は、固相支持体または非標的タンパク質に非特異的に結合する抗体の少なくともいくつかを排除することができる。同様に、特定のタンパク質に結合する抗体を提示する細胞を選択する場合、細胞を、標的タンパク質との結合に関して競合する非関連性であるかまたは類似するタンパク質と混合することができる。
本発明のスクリーニング方法は、1、2、3、4、5、6、7、8個以上の選択工程を用いてもよい。2回目のスクリーニングを実施するのに用いられる方法は、用いるウイルスベクターに依存しうる。例えば、アデノウイルスベクターを用いて、ウイルスベクターを、スクリーニング／選択のその後のラウンドのために直接単離することができる。例えば、細胞(例えば、293に基づく細胞)を、最初にウイルスベクターライブラリーに感染させた後、目的の抗原に結合する抗体を発現する細胞を選択する。次いで、細胞を溶解させて、パッケージングされたウイルスベクターを放出させる。ウイルスベクターの感染性を排除しない任意の数の方法により細胞を溶解することができる(例えば、細胞を1回または複数回解凍する)。細胞溶解物を、次のラウンドのスクリーニング／選択において感染のために直接用いることができるか、またはウイルスベクターを最初に精製することができる。
アデノウイルスベクターの場合、感染のMOI、スクリーニング／選別の時間およびウイルスベクターを単離する時間を考慮する必要がある。例えば、MOIが高すぎる場合、細胞を、スクリーニング／選別方法の前に溶解させることができる。さらに、スクリーニング／選別工程を感染直後に実施する場合、抗体は、細胞表面上に、または十分な量でまだ提示されていなくてもよい。スクリーニング工程を実施するのが遅すぎる場合、細胞を、ウイルスベクター毒性(例えば、複製)から溶解しうる。ベクターの単離の試みが早すぎる場合、十分なウイルスベクターがパッケージングされなくてもよい。アデノウイルスベクターは遺伝子発現のために何十年も用いられてきたが、これらのパラメーターの最適化は当業者の技術の範囲内にある。
当業者であれば、本発明に従って用いることができる細胞を容易に同定することができる。抗体を提示した細胞を発現させるのに用いることができる細胞としては、限定されるものではないが、CHO、BHK、HeLa、COS、COS7、MDCK、TM4、CV1、VERO、BRL 3A、Hep G2; MMT 060562; TRI; MRC5; FS4; NIH 3T3、W138、NS0、SP/20および他のリンパ球細胞、ならびにPERC6、HEK 293、293Aなどのヒト細胞、例えば、BT483、Hs578T、HTB2、BT20およびT47Dなどの乳癌細胞系、ならびに、例えば、CRL7030およびHsD78Bstなどの通常の乳腺細胞系が挙げられる。一実施形態においては、前記細胞は、293誘導体である。一実施形態においては、前記細胞は少なくとも1個のE1アデノウイルスタンパク質を発現し、E1コード領域は細胞のゲノム中に組み込まれる。
所望の特性を有する抗体を発現する細胞および／またはウイルスベクターを前記工程において同定する場合、それらをコードする核酸を単離および再試験して、それらが所望の生物学的特性を有する抗体をコードすることを確実にする。個々の形質転換体または形質転換体のプールを単離する場合、再試験のために組換え核酸をこれらから取得することができる。例えば、個々の形質転換体を単離した場合、前記抗体をコードする核酸を精製し、それを用いて哺乳動物細胞をトランスフェクトした後、該抗原に対するその結合特性に関して特性評価することができる。形質転換体のプールを単離した場合、陽性と試験されたプールに由来する抗体をコードする核酸を用いて細胞を形質転換して、1個の抗体を発現する個々の形質転換体を作製することができる。
これらの個々の形質転換体に由来する抗体をコードする核酸を用いて細胞をトランスフェクトし、抗体を発現させ、単離し、機能について試験し、それによって所望の機能を有するタンパク質または抗体を同定することができる。個々の形質転換体または形質転換体のプールを単離しなかった場合、前記タンパク質または少なくとも抗体可変領域をコードする核酸を、例えば、発現された抗体可変領域をコードする配列をPCRで増幅することにより、陽性と試験された該形質転換体または形質転換体のプールから取得することができる。次いで、PCRにより増幅することができるこれらの配列を、好適なベクター中に再挿入し、これを用いて個々の形質転換体を作製することもできる。これらの形質転換体に由来する組換えDNAを用いて、哺乳動物細胞をトランスフェクトして、前記抗体を発現させ、機能について再試験することができる。
6.5 Fc受容体／リガンド結合および／または抗体依存的細胞媒介性細胞傷害性(ADCC)および／または補体依存的細胞傷害性(CDC)の特性に基づくスクリーニング
抗体のFc領域は、Fc受容体および他のリガンドなどのいくつかのリガンドと相互作用し、エフェクター機能と呼ばれる一連の重要な機能的能力を与える。IgGクラスに対するFc受容体の重要なファミリーは、Fcγ受容体(FcγR)である。これらの受容体は、抗体と細胞性免疫とのコミュニケーションを媒介する(Raghavanら、1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220; Ravetchら、2001, Annu Rev Immunol 19:275-290)。ヒトにおいては、このタンパク質ファミリーとしては、アイソフォームFcγRIA、FcγRIB、およびFcγRICなどのFcγRI(CID64)；アイソフォームFcγRIIA、FcγRIIB、およびFcγRIICなどのFcγRII(CD32)；ならびにアイソフォームFcγRIIIAおよびFcγRIIIBなどのFcγRIII(CID16)が挙げられる(Jefferisら、2002, Immunol Lett 82:57-65)。典型的には、これらの受容体は、Fcへの結合を媒介する細胞外ドメイン、膜貫通領域、および細胞内でのシグナリング事象を媒介し得る細胞内ドメインを有する。異なるFcγRサブタイプは、異なる細胞型上で発現される(Ravetchら、1991, Annu Rev Immunol 9:457-492に概説されている)。例えば、ヒトにおいては、FcγRIIIBは好中球にのみ認められるが、FcγRIIIAはマクロファージ、単球、ナチュラルキラー(NK)細胞、およびT細胞のサブ集団上に認められる。
Fc/FcγR複合体の形成は、エフェクター細胞を結合抗原の部位に誘導し、典型的には、細胞内のシグナリング事象ならびに炎症メディエーターの放出、B細胞活性化、エンドサイトーシス、食作用、および細胞傷害性攻撃などの重要なその後の免疫応答をもたらす。細胞傷害性および食作用性エフェクター機能を媒介する能力は、抗体が標的化された細胞を破壊する潜在的な機構である。FcγRを発現する非特異的細胞傷害性細胞が、標的細胞上に結合した抗体を認識した後、該標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介性反応を、抗体依存的細胞媒介性細胞傷害性(ADCC)と呼ぶ(Raghavanら、1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220; Ghetieら、2000, Annu Rev Immunol 18:739-766; Ravetchら、2001, Annu Rev Immunol 19:275-290)。注目すべきことに、ADCCを媒介する主要な細胞であるNK細胞は、FcγRIIIAのみを発現するが、単球はFcγRI、FcγRIIおよびFcγRIIIを発現する(Ravetchら、1991、前掲)。
別の重要なFcリガンドは、補体タンパク質C1qである。C1qへのFc結合は、補体依存的細胞傷害性(CDC)と呼ばれるプロセスを媒介する(Wardら、1995, Ther Immunol 2:77-94に概説されている)。C1qは、6個の抗体に結合することができるが、2個のIgGへの結合が補体カスケードを活性化するのに十分である。C1qは、C1rおよびC1sセリンプロテアーゼとの複合体を形成して、補体経路のC1複合体を形成する。
全てのFcγRはIgGサブクラスのFc上の同じ領域に結合するが、異なる親和性で結合する(例えば、FcγRIは高親和性であるが、FcγRIIおよびFcγRIIIは低親和性の結合因子である)。FcγR間の他の差異は機構上のものである。例えば、FcγRI、FcγRIIA/C、およびFcγRIIIAは、免疫複合体により誘発される活性化の正の調節因子であり、免疫受容体チロシンに基づく活性化モチーフ(ITAM)を有することを特徴とするが、FcγRIIBは免疫受容体チロシンに基づく阻害モチーフ(ITIM)を有し、従って、阻害的である。かくして、活性化受容体と阻害性受容体との間のバランスが重要な検討材料である。例えば、負の調節因子FcγRIIBへのFc結合を未変化のままにするか、または低下さえさせながら、正の調節因子(例えば、FcγRIIIA)へのFc結合を増強することにより、腫瘍細胞のADCCを介する破壊の増強などのエフェクター機能の最適化が得られる。別の検討材料は、FcγRおよび／またはC1qへの結合が所望の様式で調節(modulate)されるが、それらがその安定性、可溶性、構造的完全性ならびにFcRnおよびプロテインAおよびGなどの他の重要なFcリガンドと相互作用する能力を維持するように、Fc変異体を操作すべきであることである。
抗体は、治療的使用などの多くの用途において有用である。用途に応じて、抗体の所望のADCCおよび／またはCDC特性は変化してもよい。例えば、診断用途(例えば、ELISA、ウェスタンブロットなど)においては、抗体のADCCおよび／またはCDC活性は、通常は無意味であり、該診断用途に対してはほとんど効果を有しない。抗腫瘍抗原抗体を用いる場合、増加したADCCおよび／またはCDCは、in vivoもしくはさらにはin vitroのの細胞傷害性を増加させ、従って、腫瘍細胞の殺傷に関して抗体の効力を増加させるのが望ましい。例えば、抗体をアンタゴニストまたはアゴニストとしてin vivoで用いる場合の用途においては、低下した、低いCDCおよび／もしくはADCC活性を有するか、または該活性のない抗体を用いるのが望ましいことがある。これは、Fc/FcγR媒介エフェクター機能が致死的な積載物(payload)の近くに健康な免疫細胞を持って行き、標的細胞に沿って正常なリンパ組織の枯渇をもたらす場合、標的細胞に薬剤(例えば、毒素およびアイソトープ)を送達するように設計された抗体については特に当てはまる(Hutchinsら、1995, PNAS USA 92:11980-11984; Whiteら、2001, Annu Rev Med 52:125-145)。これらの場合、補体またはエフェクター細胞をあまり動員しないFc変異体の使用が非常に有用であろう(例えば、Wuら、2000, Cell Immunol 200:16-26; Shieldsら、2001, J. Biol Chem 276:6591-6604; 米国特許第6,194,551号; 米国特許第5,885,573号およびPCT特許公開WO 04/029207を参照)。従って、本発明は、Fc受容体(例えば、FcγR)および／またはFcリガンド(例えば、C1q)結合および／またはエフェクター機能(例えば、ADCC活性)に基づく抗体ライブラリーのスクリーニング方法をさらに提供する。本発明を用いて、これらの特徴のいずれか、もしくはその組合せを有する抗体および／または抗体変異体をスクリーニングすることができる。
様々な突然変異誘発がFcドメインに対して実行されてきた(例えば、Duncanら、1988, Nature 332:563-564; Lundら、1995, Faseb J 9:115-119; Lundら、1996, J Immunol 157:4963-4969; Armourら、1999, Eur J Immunol 29:2613-2624; Shieldsら、2001, J Biol Chem 276:6591-6604; Jefferisら、2002, Immunol Lett 82:57-65; Prestaら、2002, Biochem Soc Trans 30:487-490; 米国特許第5,624,821号、第5,885,573号ならびにPCT特許公開WO 00/42072、WO 99/58572およびWO 04/029207を参照)。Fcドメイン中の大多数のアミノ酸置換はFcγR結合を低下させるか、または除去するが、いくらかはFcγRに対するより高い親和性をもたらした。Fcドメイン内の特定の改変／置換および／または新規アミノ酸の例については、Ghetieら、1997, Nat Biotech. 15:637-40; Duncanら、1988, Nature 332:563-564; Lundら、1991, J. Immunol 147:2657-2662; Lundら、1992, Mol Immunol 29:53-59; Alegreら、1994, Transplantation 57:1537-1543; Hutchinsら、1995, Proc Natl. Acad Sci U S A 92:11980-11984; Jefferisら、1995, Immunol Lett. 44:111-117; Lundら、1995, Faseb J 9:115-119; Jefferisら、1996, Immunol Lett 54:101-104; Lundら、1996, J Immunol 157:4963-4969; Armourら、1999, Eur J Immunol 29:2613-2624; Idusogieら、2000, J Immunol 164:4178-4184; Reddyら、2000, J Immunol 164:1925
-1933; Xuら、2000, Cell Immunol 200:16-26; Idusogieら、2001, J Immunol 166:2571-2575; Shieldsら、2001, J Biol Chem 276:6591-6604; Jefferisら、2002, Immunol Lett 82:57-65; Prestaら、2002, Biochem Soc Trans 30:487-490; 米国特許第5,624,821号; 第5,885,573号; 第5,677,425号; 第6,165,745号; 第6,277,375号; 第5,869,046号; 第6,121,022号; 第5,624,821号; 第5,648,260号; 第6,194,551号; 第6,737,056号; 第6,821,505号; 第6,277,375号; 米国特許出願第10/370,749号; 第11/203,253号; 第11/203,251号ならびにPCT公開WO 94/2935; WO 99/58572; WO 00/42072; WO 01/58957; WO 02/060919, WO 04/016750; WO 04/029207; WO 04/035752およびWO 05/040217を参照されたい。
Fc領域内の任意の位置に導入された少なくとも1個のアミノ酸置換(すなわち、非天然アミノ酸残基)、欠失または挿入を含むFc領域を、本明細書では「変異体Fc領域」と呼ぶ。変異体Fc領域を含むポリペプチド(例えば、抗体またはFc融合タンパク質)を、本明細書では一般的に「Fc変異体」またはより具体的には、「Fc変異体抗体」および「Fc変異体融合タンパク質」と呼ぶ。本明細書に開示される細胞表面提示方法を、変異体Fc領域を有する抗体のライブラリーの発現およびスクリーニングに用いることができることが意図される。
変異体Fc領域を有する抗体を含むライブラリー(本明細書では「Fc変異体ライブラリー」とも呼ぶ)を、本発明に従って、所望のFc関連機能またはその欠如についてスクリーニングすることができる。一実施形態においては、Fc変異体のライブラリーは、同じ可変領域またはFab領域を含む抗体を含む。いくつかの実施形態においては、前記ライブラリーは、ヒンジドメイン、CH3ドメイン、CH2ドメインの変異体、またはその任意の組合せを含む。
Fc変異体およびFc変異体抗体ライブラリーを構築する方法は、当業界で公知である。例えば、特許公開WO 05/0037000; WO 06/023420; およびWO 06/023403を参照されたい。Fc変異体ライブラリーが、Fc領域内の任意の位置に導入された少なくとも1個のアミノ酸置換、欠失または挿入を有するFc領域を含むことが意図される。また、Fc変異体ライブラリーが、Fc領域の外側の1個以上の位置にさらなるアミノ酸残基置換(すなわち、非天然アミノ酸残基)、欠失または挿入を含んでもよいことも意図される。特定の実施形態においては、Fc変異体ライブラリーは、Fc領域内の任意の位置に少なくとも1個の非天然アミノ酸残基を有するFc領域を含む。特定の実施形態においては、Fc変異体ライブラリーは、Fc領域内の1個以上の位置に、それぞれ19個の非天然アミノ酸残基を含むFc領域を含む。他の特定の実施形態においては、Fc変異体ライブラリーは、Fc領域内の1個以上の位置に、非天然アミノ酸残基のサブセットを含むFc領域を含む。さらに他の実施形態においては、Fc変異体ライブラリーは、1個以上の位置に1個以上のアミノ酸残基の挿入を含むFc領域を含む。
いかなる特定の理論によっても束縛されることを望むものではないが、本発明のアミノ酸置換(すなわち、非天然アミノ酸残基)、欠失および／または挿入は、限定されるものではないが、そのFcγRおよび／もしくはC1qに対する抗体の親和性、細胞傷害エフェクターおよび／もしくは補体カスケード機能を媒介する能力、タンパク質安定性、抗体半減期ならびにエフェクター細胞および／もしくは分子の動員などの、下流のエフェクター機能に影響する1個以上の因子を変化させることにより、抗体のADCCおよび／またはCDC活性を調節する。
一実施形態においては、前記ライブラリーは、アミノ酸残基：230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、242、246、250、251、256、257、259、260、261、265、266、269、273、274、275、277、281、282、298、327、328、329、330、332、346、347および348からなる群より選択される位置(この番号付けシステムはKabatら(1991, NIH Publication 91-3242, National Technical Information Service, Springfield, VA)に記載のEU指標のものである)に、少なくとも1個のアミノ酸残基置換(すなわち、非天然アミノ酸残基)、欠失または挿入を有するFc変異体を含む。
本発明の別の実施形態においては、Fc変異体ライブラリーは、1個以上のアミノ酸残基：230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、242、246、250、251、256、257、259、260、261、265、266、269、273、274、275、277、281、282、298、327、328、329、330、332、346および348(この番号付けシステムはKabatに記載のEU指標のものである)において、それぞれ非天然アミノ酸残基を有するFc変異体を含む。
一実施形態においては、ライブラリーのFc変異体は、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、239、240、242、246、250、251、257、259、260、261、265、269、273、274、275、277、281、282、284、287、291、298、300、302、304、306、308、310、314、316、318、319、321、323、327、328、329、330、332および336からなる群より選択される位置であって、そのFc領域中の残基の番号付けはKabatに記載のEU指標のものである前記位置に、少なくとも1個のアミノ酸置換(すなわち、非天然アミノ酸残基)、欠失または挿入を含む。一実施形態においては、ライブラリーは、Fc領域中の少なくとも2個、または少なくとも3個、または少なくとも4個、または少なくとも5個、または少なくとも6個、または少なくとも7個、または少なくとも8個、または少なくとも9個、または少なくとも10個、または少なくとも20個、または少なくとも30個、または少なくとも40個、または少なくとも50個、または少なくとも60個、または少なくとも70個、または少なくとも80個、または少なくとも90個、または少なくとも100個、または少なくとも200個のアミノ酸残基を含むFc変異体を含む。
一実施形態においては、ライブラリーのFc変異体は、アミノ酸残基：230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、242、246、250、251、256、257、259、260、261、265、266、269、273、274、275、277、281、282、298、327、328、329、330、332、346および348からなる群より選択される位置(この番号付けシステムはKabatに記載のEU指標のものである)の後に少なくとも1個の挿入を含む。この挿入は任意のアミノ酸残基であってよい。特定の実施形態においては、本発明のFc変異体は、選択された位置の後に2個以上のアミノ酸残基の挿入を含む。他の特定の実施形態においては、本発明のFc変異体は、複数の位置の後に1個以上のアミノ酸残基の挿入を含んでもよい。
特定の実施形態においては、ライブラリーのFc変異体は、アミノ酸残基：230、231、232、233、234、235、236、237、238、239および240からなる群より選択される位置であって、その番号付けシステムがKabatに記載のEU指標のものである前記位置の後に、少なくとも1個の挿入を含む。この挿入は、任意のアミノ酸残基であってよい。特定の実施形態においては、本発明のFc変異体は選択された位置の後に2個以上のアミノ酸残基の挿入を含んでもよい。他の特定の実施形態においては、本発明のFc変異体は、複数の位置の後に1個以上のアミノ酸残基の挿入を含んでもよい。
他の実施形態においては、ライブラリーのFc変異体は、置換と挿入の組合せを含む。他の実施形態においては、ライブラリーのFc変異体は、1個以上の置換と1個以上の挿入との組合せを含む。
本発明はまた、アミノ酸残基：230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、242、246、250、251、256、257、259、260、261、265、266、269、273、274、275、277、281、282、298、327、328、329、330、332、346および348からなる群より選択される位置であって、その番号付けシステムがKabatに記載のEU指標のものである前記位置に、少なくとも1個のアミノ酸残基の置換(すなわち、非天然アミノ酸残基)、欠失または挿入を含むFc変異体も提供する。
特定の実施形態においては、本発明のFc変異体は、231L、231I、231V、231N、231Q、231T、231S、232K、232R、234K、234R、235V、235I、235A、235G、236K、236R、236L、236I、236V、236A、237R、237K、238N、238Q、238V、238L、238I、238E、238D、238A、238G、238M、238C、239D、240G、240A、240H、240D、240E、246R、246E、246D、246W、246F、246M、246C、250S、250V、250I、250L、251A、251G、251E、251D、251V、251I、256R、256K、260R、260K、260E、260D、261S、261T、266A、266G、274R、277V、277I、277L、277S、277T、281S、281T、282F、282W、346R、346K、348Gおよび348Aからなる群より選択される少なくとも1個の非天然アミノ酸残基(この番号付けシステムはKabatに記載のEU指標のものである)を含む。
特定の実施形態においては、本発明のFc変異体は、231L、231N、231T、232K、234R、235V、235A、235I、236R、236V、236A、237R、237G、238N、238V、238E、238L、238G、238M、238Q、239D、240G、240H、240E、246R、246E、246W、246M、250S、250V、251A、251E、251I、256R、260R、260E、261S、265、266A、274R、277V、277T、281S、282F、346Rおよび348Aからなる群より選択される少なくとも1個の非天然アミノ酸残基(この番号付けシステムはKabatに記載のEU指標のものである)を含む。
別の特定の実施形態においては、本発明のFc変異体は、198T、234R、236R、236A、237R、238L、238E、238N、238V、238Q、240E、240G、248E、251A、251E、266A、277Tからなる群より選択される少なくとも1個の非天然アミノ酸残基を含む。さらにべつの特定の実施形態においては、本発明のFc変異体は、246R/251E/260R、240G/198T、237R/236Aからなる群より選択される、非天然アミノ酸残基の少なくとも1個の組合せを含む。
特定の実施形態においては、本発明のFc変異体は、アミノ酸残基：230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、242、246、250、251、256、257、259、260、261、265、266、269、273、274、275、277、281、282、298、327、328、329、330、332、346および348からなる群より選択される位置(この番号付けシステムはKabatに記載のEU指標のものである)の後に、少なくとも1個の挿入を含む。この挿入は、任意のアミノ酸残基であってよい。特定の挿入を、本明細書では「In」とそれに続いて、挿入されたアミノ酸残基の1文字コードおよび該挿入に直接隣接する残基の位置を記載したものとして特定する。例えば、「InG231/232」は、残基231と232の間にグリシンの挿入を含む変異体Fcを表す。特定の実施形態においては、本発明のFc変異体は、選択された位置の後に2個以上のアミノ酸残基の挿入を含んでもよい。他の特定の実施形態においては、本発明のFc変異体は、複数の位置の後に、1個以上のアミノ酸残基の挿入を含んでもよい。
特定の実施形態においては、本発明のFc変異体は、アミノ酸残基：230、231、232、233、234、235、236、237、238、239および240からなる群より選択される位置であって、該番号付け系がKabatに記載のEU指標のものである前記位置の後に、挿入を含む。この挿入は、任意のアミノ酸残基であってよい。特定の実施形態においては、本発明のFc変異体は、複数の位置の後に、1個以上のアミノ酸残基の挿入を含んでもよい。特定の他の実施形態においては、本発明のFc変異体は、複数の位置の後に1個以上のアミノ酸残基の挿入を含んでもよい。
別の特定の実施形態においては、本発明のFc変異体は、少なくとも1個の以下の挿入：InR234/235; InV235/236; InR236/237; InR237/238; InV238/239; InN238/239; InL238/239; InE238/239; InG238/239; InS239/240; InG240/241およびInE240/241を含む。
特定の実施形態においては、本発明のFc変異体は、置換と挿入の組合せを含んでもよい。他の実施形態においては、本発明のFc変異体は、本明細書に開示される1個以上の置換と1個以上の挿入の組合せを含んでもよい。特定の実施形態においては、本発明のFc変異体は、以下の挿入および置換の組合せ：InG240/241/I198T、InL238/239/P238Q、InE238/239/V348A、InS239/240/V266A、およびInR237/238/G236Aのうち少なくとも1個を含む。
一実施形態においては、本発明のFc変異体を、米国特許第5,624,821号; 第5,885,573号; 第5,677,425号; 第6,165,745号; 第6,277,375号; 第5,869,046号; 第6,121,022号; 第5,624,821号; 第5,648,260号; 第6,194,551号; 第6,737,056号; 第6,821,505号; 第6,277,375号; 米国特許出願第10/370,749号; 第11/203,253号; 第11/203,251号ならびにPCT公開WO 94/2935; WO 99/58572; WO 00/42072; WO 01/58957; WO 02/060919, WO 04/016750; WO 04/029207; WO 04/035752およびWO 05/040217に開示されたものなどの他の公知のFc変異体と組み合わせることができる。
上記の特定のアミノ酸残基に加えて、いくつかのさらなるアミノ酸残基を、前記ヒンジ中で挿入、欠失および／または置換して、該ヒンジの特性を変化させることができることが、当業者には明らかであろう。類似する特性を有するアミノ酸残基のファミリーは、当業界で定義され、いくつかの例を表1に示す。
Figure 2009511067
保存的アミノ酸置換を、上記のように、ヒンジの前記改変のために作製することができることが特に意図される。「保存的アミノ酸置換」とは、機能的に等価なアミノ酸を置換するアミノ酸置換を指す。保存的アミノ酸変化は、得られるペプチドのアミノ酸配列におけるサイレントな変化をもたらす。例えば、類似する極性をもつ1個以上のアミノ酸は、機能的等価物として働き、該ペプチドのアミノ酸配列内でサイレントな変化をもたらす。また、電荷的に中性であり、残基をより小さい残基と置き換える置換は、該残基が異なる群に含まれる場合でも、「保存的置換」であると考えられる(例えば、フェニルアラニンの、より小さいイソロイシンでの置換)。類似する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当業界で定義されている。保存的アミノ酸置換のいくつかのファミリーを、表1(上掲)に示す。
用語「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸類似体または変異体の使用も指す。表現型上はサイレントなアミノ酸置換を作製する方法に関する指針は、Bowieら、「タンパク質配列におけるメッセージの解読：アミノ酸置換に対する寛容(Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions)」(1990, Science 247:1306-1310)に提供されている。
本発明はさらに、本発明のFc変異体を作製するための、ヒンジの改変中への非天然アミノ酸の組込みを包含する。そのような方法は、当業者には公知であり、例えば、天然の生合成機構を用いて非天然アミノ酸をタンパク質中に組込むことを可能にすることが挙げられ、例えば、Wangら、2002 Chem. Comm. 1: 1-11; Wangら、2001, Science, 292: 498-500; van Hestら、2001. Chem. Comm. 19: 1897-1904を参照されたい。代替的な戦略は、アミノアシル-tRNAの生合成を担う酵素に焦点を当てており、例えば、Tangら、2001, J. Am. Chem. 123(44): 11089-11090; Kiickら、2001, FEBS Lett. 505(3): 465を参照されたい。
当業者であれば、Fc変異体ライブラリーを、変化したFcγRおよび／もしくはC1q結合特性(結合特性の例としては、限定されるものではないが、結合特異性、平衡解離定数(KD)、解離および結合速度(それぞれ、KoffおよびKon)、結合親和性および／もしくはアビディティが挙げられる)を有するFc変異体についてスクリーニングすることができること、ならびに、抗体の用途に関して、特定の変化がより望ましいか、またはより望ましくないことを理解するであろう。平衡解離定数(KD)がKoff/Konと定義されることは当業界でよく知られている。低いKDを有する結合性分子(例えば、抗体)が、高いKDを有する結合性分子(例えば、抗体)よりも好ましいことが一般的に理解される。しかしながら、いくつかの例においては、KonまたはKoffの値はKDの値よりも関連性が高い場合がある。当業者であれば、いかなる速度論的パラメーターが所与の抗体用途にとって最も重要であることを決定できる。例えば、負の調節因子FcγRIIBへのFc結合を未変化のままにするか、または低下さえさせながら、1つ以上の正の調節因子(例えば、FcγRIIIA)へのFc結合を増強する改変は、ADCC活性の増強と相関するはずである。あるいは、1つ以上の正の調節因子への結合を低下させ、および／またはFcγRIIBへの結合を増強させた改変は、ADCC活性の低下と相関するはずである。従って、結合親和性の比率(例えば、平衡解離定数(KD))は、Fc変異体のADCC活性が増強されているか、または減少しているかを示すことができる。例えば、FcγRIIIA/FcγRIIB平衡解離定数(KD)の比率の減少は、ADCC活性の改善と相関するはずであり、一方、該比率の増加はADCC活性の減少と相関するはずである。さらに、C1qへの結合を増強する改変は、CDC活性の増強と相関するはずであるが、C1qへの結合を低下させる改変は、CDC活性の低下または排除と相関するはずである。
本発明の一実施形態においては、Fc変異体ライブラリーを提示した細胞を、未改変のFc領域を含む以外はFc変異体と同じアミノ酸配列を有するポリペプチド(本明細書では「比較分子」と呼ぶ)と比較して、少なくとも1つのFc受容体／リガンド(例えば、FcγRIIIA、FcγRIIB、C1qなど)に対する結合親和性の変化についてスクリーニングする。従って、本発明はまた、比較分子と比較して少なくとも1つのFc受容体／リガンド(例えば、FcγRIIIA、FcγRIIB、C1qなど)に対する結合親和性が変化したFc変異体(本明細書では「本発明のFc変異体」とも呼ぶ)も提供する。
FcγRおよび／またはC1q結合特性の変化についてスクリーニングするのに用いることができる様々な方法が当業界に存在する。一実施形態においては、スクリーニングするのに用いられるFcγR(例えば、FcγRIIIAおよび／もしくはFcγRIIB)ならびに／またはC1qを、例えば、限定されるものではないが、本明細書に記載のもの(例えば、下記の「実施例」の節を参照)などの当業界でよく知られた技術を用いて蛍光標識する。一実施形態においては、スクリーニングに用いられるFcγR(例えば、FcγRIIIAおよび／もしくはFcγRIIB)ならびに／またはC1qは、ストレプトアビジンとの融合物であり、そして標識されたビオチンを、Fcを発現する細胞を標識するのに用いる。この標識を、本明細書に記載のように検出することができる。一実施形態においては、フローサイトメトリーを用いて、所望の特性を有する抗体Fc領域を選別／選択する。例えば、蛍光標識されたFcγRIIIAを用いて、結合親和性が変化した抗体のFc領域についてスクリーニングすることができる。例えば、この細胞を、平均蛍光に基づいて選別することができ、高いか、もしくは増加した平均蛍光を有する細胞は結合親和性が増加している可能性があるものとして選別されるか、または低いか、もしくは減少した平均蛍光を有する細胞は結合親和性が減少している可能性があるものとして選別される。一実施形態においては、全ての変異体Fc抗体(例えば、抗ヒトIgG抗体)に結合する別の標識された抗体を用いて、細胞表面上に提示された総抗体Fcについて正規化することもできる。例えば、細胞を、抗ヒトIgG抗体により結合した細胞について最初に選別した後、FcγRIIIAに結合する(陽性選択)か、または結合しない(陰性選択)細胞について選別することができる。一実施形態においては、細胞を、FcγRIIIAに結合する(陽性選択)か、または結合しない(陰性選択)細胞について最初に選別した後、抗ヒトIgG抗体に結合する細胞について選別することができる。別の実施形態においては、FcγRIIIAに結合する細胞を第1の蛍光分子で標識し、抗ヒトIgG抗体に結合する細胞を第2の蛍光抗体で標識し、FcγRIIIAおよび抗ヒトIgG抗体の両方への結合について陽性であるものについて細胞を同時に選別する。代替的な実施形態においては、FcγRIIIAへの結合について陰性であるもの(または低い結合親和性を有するもの)および抗ヒトIgG抗体への結合について陽性であるものについて、細胞を同時に選別する。
本発明の一実施形態においては、Fc変異体ライブラリーを提示した細胞を、FcγRIIIAに対する増加したかまたは高い結合についてスクリーニングする。本発明の一実施形態においては、Fc変異体ライブラリーを提示した細胞を、FcγRIIIAに対する減少したか、または低い結合親和性についてスクリーニングする。一実施形態においては、本発明のFc変異体ライブラリーを、FcγRIIIAに対する増加したか、もしくは高い親和性および未変化であるか、低下したか、もしくは増強されたFcγRIIBに対する親和性についてスクリーニングする。一実施形態においては、本発明のFc変異体ライブラリーを、1)FcγRIIIAに対する、増加したか、もしくは高い親和性；2)未変化であるか、低下したか、もしくは増加したFcγRIIBに対する親和性および3)未変化であるか、低下したか、もしくは増加した、C1qに対する親和性、についてスクリーニングする。別の実施形態においては、本発明のFc変異体ライブラリーを、1)FcγRIIIAに対する減少した親和性；および2)増加したFcγRIIBに対する親和性についてスクリーニングする。
一実施形態においては、本発明のFc変異体ライブラリーを、増加したか、または高いFcγRIIIA/FcγRIIB平衡解離定数(KD)の比率についてスクリーニングする。別の実施形態においては、本発明のFc変異体ライブラリーを、減少したか、または低いFcγRIIIA/FcγRIIB平衡解離定数(KD)の比率についてスクリーニングする。本発明の一実施形態においては、Fc変異体ライブラリーを提示した細胞を、FcγRIIBへの増加したか、または高い結合についてスクリーニングする。本発明の一実施形態においては、Fc変異体ライブラリーを提示した細胞を、FcγRIIBへの減少したか、または低い結合についてスクリーニングする。本発明の一実施形態においては、Fc変異体ライブラリーを提示した細胞を、C1qに対する減少したか、または低い結合親和性についてスクリーニングする。本発明の一実施形態においては、Fc変異体ライブラリーを提示した細胞を、C1qに対する増加したか、または高い結合親和性についてスクリーニングする。
一実施形態においては、本発明のFc変異体は、FcγRIIIAに対する増加したか、または高い結合親和性を有する。本発明の別の実施形態においては、本発明のFc変異体は、FcγRIIIAに対する減少したか、または低い結合親和性を有する。さらに別の実施形態においては、本発明のFc変異体は、FcγRIIIAに対する増加したか、もしくは高い親和性および未変化であるか、低下したか、もしくは増強されたFcγRIIBに対する親和性を有する。さらに別の実施形態においては、本発明のFc変異体は、1)FcγRIIIAに対する増加したか、もしくは高い親和性；2)未変化であるか、低下したか、もしくは増加したFcγRIIBに対する親和性および3)未変化であるか、低下したか、または増加したC1qに対する親和性を有する。別の実施形態においては、本発明のFc変異体は、1)FcγRIIIAに対する減少した親和性；および2)増加したFcγRIIBに対する親和性を有する。特定の実施形態においては、FcγRIIIAおよび／もしくはFcγRIIBおよび／もしくはC1qへの本発明のFc変異体の結合親和性は、比較分子と比較して増加または減少している。
一実施形態においては、本発明のFc変異体は、増加したか、または高いFcγRIIIA/FcγRIIB平衡解離定数(KD)の比率を有する。別の実施形態においては、本発明のFc変異体は、減少したか、または低いFcγRIIIA/FcγRIIB平衡解離定数(KD)の比率を有する。本発明のさらに別の実施形態においては、本発明のFc変異体は、FcγRIIBに対する増加したか、または高い結合を有する。一実施形態においては、本発明のFc変異体は、FcγRIIBに対する減少したか、または低い結合を有する。本発明の他の実施形態においては、本発明のFc変異体は、C1qに対する減少したか、または低い結合親和性を有する。本発明のさらに他の実施形態においては、本発明のFc変異体は、C1qに対する増加したか、または高い結合親和性を有する。特定の実施形態においては、FcγRIIIAおよび／もしくはFcγRIIBおよび／もしくはC1qに対する本発明のFc変異体の結合親和性は、比較分子と比較して増加または減少している。
特定の実施形態においては、本発明のFc変異体は、比較分子のものよりも、少なくとも2倍、または少なくとも3倍、または少なくとも5倍、または少なくとも7倍、または少なくとも10倍、または少なくとも20倍、または少なくとも30倍、または少なくとも40倍、または少なくとも50倍、または少なくとも60倍、または少なくとも70倍、または少なくとも80倍、または少なくとも90倍、または少なくとも100倍、または少なくとも200倍大きい、Fc受容体および／またはリガンド(例えば、FcγRIIIA、C1q)に対する親和性を有する。他の実施形態においては、本発明のFc変異体は、比較分子と比較して、少なくとも10％、または少なくとも20％、または少なくとも30％、または少なくとも40％、または少なくとも50％、または少なくとも60％、または少なくとも70％、または少なくとも80％、または少なくとも90％、または少なくとも100％、または少なくとも150％、または少なくとも200％増加した、Fc受容体および／またはリガンド(例えば、FcγRIIIA、C1q)に対する親和性を有する。
特定の実施形態においては、本発明のFc変異体は、比較分子と比較して、少なくとも2倍、または少なくとも3倍、または少なくとも5倍、または少なくとも7倍、または少なくとも10倍、または少なくとも20倍、または少なくとも30倍、または少なくとも40倍、または少なくとも50倍、または少なくとも60倍、または少なくとも70倍、または少なくとも80倍、または少なくとも90倍、または少なくとも100倍、または少なくとも200倍、または少なくとも400倍、または少なくとも600倍低下した、Fc受容体および／またはリガンド(例えば、FcγRIIIA、C1q)に対する平衡解離定数(KD)を有する。別の特定の実施形態においては、本発明のFc変異体は、比較分子と比較して、少なくとも10％、または少なくとも20％、または少なくとも30％、または少なくとも40％、または少なくとも50％、または少なくとも60％、または少なくとも70％、または少なくとも80％、または少なくとも90％、または少なくとも100％、または少なくとも150％、または少なくとも200％低下した、Fc受容体および／またはリガンド(例えば、FcγRIIIA、C1q)に対する平衡解離定数(KD)を有する。
特定の実施形態においては、本発明のFc変異体は、比較分子と比較して、少なくとも2倍、または少なくとも3倍、または少なくとも5倍、または少なくとも7倍、または少なくとも10倍、または少なくとも20倍、または少なくとも30倍、または少なくとも40倍、または少なくとも50倍、または少なくとも60倍、または少なくとも70倍、または少なくとも80倍、または少なくとも90倍、または少なくとも100倍、または少なくとも200倍低下した、Fc受容体および／またはリガンド(例えば、FcγRIIIA、C1q)に対する親和性を有する。他の実施形態においては、本発明のFc変異体は、比較分子と比較して、少なくとも10％、または少なくとも20％、または少なくとも30％、または少なくとも40％、または少なくとも50％、または少なくとも60％、または少なくとも70％、または少なくとも80％、または少なくとも90％、または少なくとも100％、または少なくとも150％、または少なくとも200％低下した、Fc受容体および／またはリガンド(例えば、FcγRIIIA、C1q)に対する親和性を有する。
特定の実施形態においては、本発明のFc変異体は、比較分子と比較して、少なくとも2倍、または少なくとも3倍、または少なくとも5倍、または少なくとも7倍、または少なくとも10倍、または少なくとも20倍、または少なくとも30倍、または少なくとも40倍、または少なくとも50倍、または少なくとも60倍、または少なくとも70倍、または少なくとも80倍、または少なくとも90倍、または少なくとも100倍、または少なくとも200倍、または少なくとも400倍、または少なくとも600倍増加した、Fc受容体および／またはリガンド(例えば、FcγRIIIA、C1q)に対する平衡解離定数(KD)を有する。別の特定の実施形態においては、本発明のFc変異体は、比較分子と比較して、少なくとも10％、または少なくとも20％、または少なくとも30％、または少なくとも40％、または少なくとも50％、または少なくとも60％、または少なくとも70％、または少なくとも80％、または少なくとも90％、または少なくとも100％、または少なくとも150％、または少なくとも200％増加した、Fc受容体および／またはリガンド(例えば、FcγRIIIA、C1q)に対する平衡解離定数(KD)を有する。
いくつかの実施形態においては、Fc変異体抗体ライブラリーを、比較分子と比較して増加したか、または減少したADCCおよび／またはCDCについてスクリーニングする。従って、本発明は、比較分子と比較して増加したか、または減少したADCCおよび／またはCDCを有するFc変異体も提供する。
本発明の一実施形態においては、Fc変異体ライブラリーを提示した細胞を、高い、低い、増加した、減少した、または本質的に未変化のADCC活性についてスクリーニングする。特定の実施形態においては、Fc変異体ライブラリーを提示した細胞を、高いか、または増加したADCC活性についてスクリーニングする。別の特定の実施形態においては、Fc変異体ライブラリーを提示した細胞を、低いか、または減少したADCC活性についてスクリーニングする。さらに別の特定の実施形態においては、Fc変異体ライブラリーを提示した細胞を、未変化のADCC活性についてスクリーニングする。本発明の一実施形態においては、Fc変異体ライブラリーを提示した細胞を、高い、低い、増加した、減少した、または本質的に未変化のCDC活性についてスクリーニングする。特定の実施形態においては、Fc変異体ライブラリーを提示した細胞を、高いか、または増加したCDC活性についてスクリーニングする。別の特定の実施形態においては、Fc変異体ライブラリーを提示した細胞を、低いか、または減少したCDC活性についてスクリーニングする。さらに別の特定の実施形態においては、Fc変異体ライブラリーを提示した細胞を、未変化のCDC活性についてスクリーニングする。
一実施形態においては、本発明のFc変異体は、高いか、または増加したADCC活性を有する。別の実施形態においては、本発明のFc変異体は、低いか、または減少したADCC活性を有する。さらに別の実施形態においては、本発明のFc変異体は、未変化のADCC活性を有する。他の実施形態においては、本発明のFc変異体は、高いか、または増加したCDC活性を有する。さらに他の実施形態においては、本発明のFc変異体は、低いか、または減少したCDC活性を有する。さらに他の実施形態においては、本発明のFc変異体は、未変化のCDC活性を有する。特定の実施形態においては、本発明のFc変異体のADCCおよび／またはCDCは、比較分子と比較して増加、減少するか、または未変化である。
特定の実施形態においては、本発明のFc変異体は、比較分子のものよりも少なくとも2倍、または少なくとも3倍、または少なくとも5倍、または少なくとも10倍、または少なくとも50倍、または少なくとも100倍大きいADCCおよび／またはCDC活性を有する。さらに別の実施形態においては、本発明のFc変異体は、比較分子と比較して、少なくとも10％、または少なくとも20％、または少なくとも30％、または少なくとも40％、または少なくとも50％、または少なくとも60％、または少なくとも70％、または少なくとも80％、または少なくとも90％、または少なくとも100％、または少なくとも150％、または少なくとも200％増加したADCCおよび／またはCDC活性を有する。
別の特定の実施形態においては、本発明のFc変異体は、比較分子と比較して、少なくとも2倍、または少なくとも3倍、または少なくとも5倍、または少なくとも10倍、または少なくとも50倍、または少なくとも100倍低下したADCCおよび／またはCDC活性を有する。さらに別の実施形態においては、本発明のFc変異体は、比較分子と比較して、少なくとも10％、または少なくとも20％、または少なくとも30％、または少なくとも40％、または少なくとも50％、または少なくとも60％、または少なくとも70％、または少なくとも80％、または少なくとも90％、または少なくとも100％、または少なくとも150％、または少なくとも200％減少したADCCおよび／またはCDC活性を有する。
本発明のFc変異体は、少なくとも1個のアミノ酸置換、欠失または挿入を有するFc領域(本明細書では「本発明の変異体Fc領域」と呼ぶ)を含む。本発明の変異体Fc領域を、Fc融合タンパク質または他の抗体などのさらなる分子に組込んで、Fc受容体(例えば、FcγR)および／もしくはFcリガンド(例えば、C1q)結合ならびに／またはエフェクター機能(例えば、ADCC活性)を調節することができることが意図される。異種分子を本発明の変異体Fc領域と組み合わせることにより、これを「de novo」で達成することができる。あるいは、または必要に応じて、本発明の変異体Fc領域中に存在する同じアミノ酸置換、欠失または挿入を含むように、Fc領域を含むポリペプチドのFc領域を改変することにより、これを達成することができる。従って、本発明は、本発明の変異体Fc領域を、Fcを含むポリペプチドに導入することを含む、Fc受容体(例えば、FcγR)および／もしくはFcリガンド(例えば、C1q)結合ならびに／またはエフェクター機能(例えば、ADCC活性)を調節するための方法を提供する。融合タンパク質を作製し、アミノ酸置換、欠失または挿入を導入する方法は当業界でよく知られており、化学的合成および組換え発現技術が挙げられる(例えば、Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubelら(編)、John Wiley & Sons (NY, 1998); Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第3版、J. Sambrookら(編)、Cold Spring Harbor Laboratory Press (NY, 2001)を参照)。
一実施形態においては、本発明は、アミノ酸残基：230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、242、246、250、251、256、257、260、261、265、266、269、273、274、275、277、277、281、282、298、327、328、329、330、332、346、347および348からなる群より選択される位置(この番号付けシステムはKabatに記載のEU指標のものである)に、少なくとも1個のアミノ酸残基置換(すなわち、非天然アミノ酸残基)、欠失または挿入を導入することを含む、Fc受容体(例えば、FcγR)および／もしくはFcリガンド(例えば、C1q)結合ならびに／またはエフェクター機能(例えば、ADCC活性)が変化したFc変異体を作製する方法を提供する。
一実施形態においては、本発明は、アミノ酸残基：230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、242、246、250、251、256、257、259、260、261、265、266、269、273、274、275、277、277、281、282、298、327、328、329、330、332、346および348からなる群より選択される位置(この番号付けシステムはKabatに記載のEU指標のものである)に、少なくとも1個のアミノ酸残基置換(すなわち、非天然アミノ酸残基)、欠失または挿入を導入することを含む、Fc受容体(例えば、FcγR)および／もしくはFcリガンド(例えば、C1q)結合ならびに／またはエフェクター機能(例えば、ADCC活性)が変化したFc変異体を作製する方法を提供する。
別の実施形態においては、本発明は、231L、231I、231V、231N、231Q、231T、231S、232K、232R、234K、234R、235V、235I、235A、235G、236K、236R、236L、236I、236V、236A、237R、237K、238N、238Q、238V、238L、238I、238E、238D、238A、238G、238M、238C、239D、240G、240A、240H、240D、240E、246R、246E、246D、246W、246F、246M、246C、250S、250V、250I、250L、251A、251G、251E、251D、251V、251I、256R、256K、260R、260K、260E、260D、261S、261T、266A、266G、274R、277V、277I、277L、277S、277T、281S、281T、282F、282W、346R、346K、348Gおよび348Aからなる群より選択される少なくとも1個の非天然アミノ酸残基(この番号付けシステムはKabatに記載のEU指標のものである)を導入することを含む、Fc受容体および／もしくはFcリガンド結合ならびに／またはエフェクター機能が変化したFc変異体を作製する方法を提供する。
特定の実施形態においては、本発明は、231L、231N、231T、232K、234R、235V、235A、235I、236R、236V、236A、237R、237G、238N、238V、238E、238L、238G、238M、238Q、239D、240G、240H、240E、246R、246E、246W、246M、250S、250V、251A、251E、251I、256R、260R、260E、261S、265、266A、274R、277V、277T、281S、282F、346Rおよび348Aからなる群より選択される少なくとも1個の非天然アミノ酸残基(この番号付けシステムはKabatに記載のEU指標のものである)を導入することを含む、Fc受容体および／もしくはFcリガンド結合ならびに／またはエフェクター機能が変化したFc変異体を作製する方法を提供する。
別の特定の実施形態においては、本発明は、198T、234R、236R、236A、237R、238L、238E、238N、238V、238Q、240E、240G、248E、251A、251E、266A、277Tからなる群より選択される少なくとも1個の非天然アミノ酸残基を導入することを含む、Fc受容体および／もしくはFcリガンド結合ならびに／またはエフェクター機能が変化したFc変異体を作製する方法を提供する。さらに別の特定の実施形態においては、本発明のFc変異体は、246R/251E/260R、240G/198T、237R/236Aからなる群より選択される非天然アミノ酸残基の組合せのうち少なくとも1個を含む。
特定の実施形態においては、本発明は、アミノ酸残基：230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、242、246、250、251、256、257、259、260、261、265、266、269、273、274、275、277、277、281、282、298、327、328、329、330、332、346および348からなる群より選択される位置(この番号付けシステムはKabatに記載のEU指標のものである)の後に、少なくとも1個の挿入を導入することを含む、Fc受容体および／もしくはFcリガンド結合ならびに／またはエフェクター機能が変化したFc変異体を作製する方法を提供する。この挿入は、任意のアミノ酸残基であってよい。特定の挿入を、本明細書では「In」とそれに続いて、挿入されたアミノ酸残基の1文字コードおよび該挿入に直接隣接する残基の位置を記載したものとして特定する。例えば、「InG231/232」は、残基231と232の間にグリシンの挿入を含む変異体Fcを表す。特定の実施形態においては、本発明のFc変異体は、選択された位置の後に2個以上のアミノ酸残基の挿入を含んでもよい。他の特定の実施形態においては、本発明のFc変異体は、複数の位置の後に、1個以上のアミノ酸残基の挿入を含んでもよい。
特定の実施形態においては、本発明は、アミノ酸残基：230、231、232、233、234、235、236、237、238、239および240からなる群より選択される位置(この番号付けシステムはKabatに記載のEU指標のものである)の後に、少なくとも1個の挿入を導入することを含む、Fc受容体および／もしくはFcリガンド結合ならびに／またはエフェクター機能が変化したFc変異体を作製する方法を提供する。この挿入は、任意のアミノ酸残基であってよい。特定の実施形態においては、本発明のFc変異体は、選択された位置の後に2個以上のアミノ酸残基の挿入を含んでもよい。他の特定の実施形態においては、本発明のFc変異体は、複数の位置の後に、1個以上のアミノ酸残基の挿入を含んでもよい。
別の特定の実施形態においては、本発明は、InR234/235; InV235/236; InR236/237; InR237/238; InV238/239; InN238/239; InL238/239; InE238/239; InG238/239; InS239/240; InG240/241およびInE240/241からなる群より選択される少なくとも1個の挿入を導入することを含む、Fc受容体および／もしくはFcリガンド結合ならびに／またはエフェクター機能が変化したFc変異体を作製する方法を提供する。
特定の実施形態においては、本発明は、置換と挿入の組合せを導入することを含む、Fc受容体および／もしくはFcリガンド結合ならびに／またはエフェクター機能が変化したFc変異体を作製する方法を提供する。他の実施形態においては、本発明は、本明細書に開示される1個以上の置換と、1個以上の挿入との組合せを導入することを含む、Fc受容体および／もしくはFcリガンド結合ならびに／またはエフェクター機能が変化したFc変異体を作製する方法を提供する。特定の実施形態においては、本発明は、InG240/241/I198T、InL238/239/P238Q、InE238/239/V348A、InS239/240/V266A、およびInR237/238/G236Aからなる群より選択される挿入および置換の少なくとも1つの組合せを導入することを含む、Fc受容体および／もしくはFcリガンド結合ならびに／またはエフェクター機能が変化したFc変異体を作製する方法を提供する。
6.6 抗体
本質的には、全ての型の抗体を、本発明に従って用いることができる。これらのものとしては、限定されるものではないが、合成抗体、モノクローナル抗体、組換え産生された抗体、イントラボディ、多特異的抗体、ダイアボディ、二特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、合成抗体、一本鎖Fv(scFv)、Fabフラグメント、F(ab')フラグメント、ジスルフィド結合したFv(sdFv)、および抗イディオタイプ(抗Id)抗体、ならびに上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントが挙げられる。本発明の方法において用いられる抗体としては、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分が挙げられる。本発明の免疫グロブリン分子は、任意の型(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgAおよびIgY)、クラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2)または免疫グロブリン分子のサブクラスのものであってよい。
抗体または抗体フラグメントは、鳥類および哺乳動物(例えば、ヒト、マウス、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリ)などの任意の動物起源に由来するものであってよい。一実施形態においては、前記抗体はヒトまたはヒト化モノクローナル抗体である。本明細書で用いられる「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、ヒト免疫グロブリンライブラリーまたはヒト遺伝子に由来する抗体を発現するマウスから単離された抗体を含む。本発明に従って用いられる抗体または抗体フラグメントは、一価特異的、二価特異的、三価特異的なものであってよく、またはより大きい多価特異性のものであってよい。多特異的抗体は、所望の標的分子の異なるエピトープに特異的に結合することができるか、または標的分子ならびに異種ポリペプチドもしくは固相支持体材料などの異種エピトープの両方に特異的に結合することができる。例えば、PCT公開WO 93/17715、WO 92/08802、WO 91/00360およびWO 92/05793; Tuttら、1991, J. Immunol. 147:60-69; 米国特許第4,474,893号、第4,714,681号、第4,925,648号、第5,573,920号、第5,601,819号; ならびにKostelnyら、1992, J. Immunol. 148:1547-1553を参照されたい。本発明を、ラクダ科動物の単一ドメイン抗体などの単一ドメイン抗体を用いて実施することもできる(例えば、Muyldermansら、2001, Trends Biochem. Sci. 26:230; Nuttallら、2000, Cur. Pharm. Biotech. 1:253; ReichmannおよびMuyldermans, 1999, J. Immunol. Meth. 231:25; PCT公開WO 94/04678およびWO 94/25591;米国特許第6,005,079号を参照)。
本発明の実施形態は、任意の標的に結合する抗体を含む。抗体は、任意の種に由来するものであってよく、キメラ抗体またはヒト化抗体であってもよい。一実施形態においては、前記抗体はヒト抗体である。一実施形態においては、前記抗体はヒト化抗体である。
また、Fc変異体ライブラリーを、限定されるものではないが、抗フルオレセインモノクローナル抗体、4-4-20(Kranzら、1982 J. Biol. Chem. 257(12):6987-6995)、ヒト化抗TAG72抗体(CC49)(Shaら、1994 Cancer Biother. 9(4): 341-9)、限定されるものではないが、PCT公開WO 04/014292、WO 03/094859および米国特許継続出願第10/863,729号に開示されたものなどのEph受容体に特異的に結合する抗体、限定されるものではないが、LM609 (Scripps)、マウスモノクローナル抗体LM609(PCT公開WO 89/015155および米国特許第5，753,230号)などのインテグリンαvβ3に特異的に結合する抗体；ヒト化モノクローナル抗体MEDI-522(a.k.a. VITAXIN(登録商標), MedImmune, Inc., Gaithersburg, MD; Wuら、1998, PNAS USA 95(11): 6037-6042; PCT公開WO 90/33919およびWO 00/78815)、WO2005/05059106に開示されたインターフェロンαに対する抗体、WO/2006/059106に開示されたインターフェロン受容体1に対する抗体、Erbitux(商標)(IMC-C225としても知られる)(ImClone Systems Inc.)、EGFRに対するキメラ化モノクローナル抗体；転移性乳癌を有する患者の治療のためのヒト化抗HER2モノクローナル抗体であるHERCEPTIN(登録商標)(トラスツズマブ)(Genentech, CA)；クロット形成の予防のための血小板上の抗糖タンパク質IIb/IIIa受容体であるREOPRO(登録商標)(アブシキシマブ)(Centocor)；急性腎臓同種移植片拒絶の予防のための免疫抑制性ヒト化抗CD25モノクローナル抗体であるZENAPAX(登録商標)(ダクリズマブ)(Roche Pharmaceuticals, Switzerland)などの、当業界で既に記載されている抗体から作製するか、または本発明の変異体Fc領域をそれに導入することができる。他の例は、ヒト化抗CD18 F(ab')2(Genentech)；ヒト化抗CD18 F(ab')2であるCDP860(Celltech, UK)；CD4に融合された抗HIV gp120抗体であるPRO542(Progenics/Genzyme Transgenics)；抗CD14抗体であるC14(ICOS Pharm)；ヒト化抗VEGF IgG1抗体(Genentech)；マウス抗CA 125抗体であるOVAREX(商標)(Altarex)；マウス抗17-IA細胞表面抗原IgG2a抗体であるPANOREX(商標)(Glaxo Wellcome/Centocor)；キメラ抗EGFR IgG抗体であるIMC-C225 (ImClone System)；ヒト化抗αVβ3インテグリン抗体であるVITAXIN(商標)(Applied Molecular Evolution/MedImmune)；ヒト化抗CD52 IgG1抗体であるCampath 1H/LDP-03 (Leukosite)；ヒト化抗CD33 IgG抗体であるSmart M195(Protein Design Lab/Kanebo)；キメラ抗CD20 IgG1抗体であるRITUXAN(商標)(IDEC Pharm/Genentech, Roche/Zettyaku)；ヒト化抗CD22 IgG抗体であるLYMPHOCIDE(商標)(Immnomedics)；ヒト化抗HLA抗体であるSmart ID10(Protein Design Lab)；放射標識マウス抗HLA DR抗体であるONCOLYM(商標)(Lym-1)(Technicline)；ヒト化IgG1抗体である抗CD11a(Genentech/Xoma)；ヒト化抗ICAM3抗体であるICM3(ICOS Pharm)；霊長類化抗CD80抗体であるIDEC-114(IDEC Pharm/Mitsubishi)；放射標識マウス抗CD20抗体であるZEVALIN(商標)(IDEC/Shering AG)；ヒト化抗CD40L抗体であるIDEC-131(IDEC/Eisai)；霊長類化抗CD4抗体であるICEC-151(IDEC)；霊長類化抗CD23抗体であるIDEC-152(IDEC/Seikagaku)；ヒト化抗CD3 IgGであるSMART抗CD3(Protein Design Lab)；ヒト化抗補体因子5(C5)抗体である5G1.1 (Alexion Pharm)；霊長類化抗CD4 IgG1抗体であるIDEC-151(IDEC Pharm/SmithKline Beecham)；ヒト抗CD4 IgG抗体であるMDX-CD4(Medarex/Eisai/Genmab)；ヒト化抗TNF-α IgG4抗体であるCDP571(Celltech)；ヒト化抗α4β7抗体であるLDP-02 (LeukoSite/Genentech)；ヒト化抗CD4 IgG抗体であるOrthoClone OKT4A (Ortho Biotech)；ヒト化抗CD40L IgG抗体であるANTOVA(商標)(Biogen)；ヒト化抗VLA-4 IgG抗体であるANTEGREN(商標)(Elan)；ヒト抗CD64(FcγR)抗体であるMDX-33(Medarex/Centeon)；ヒト化抗IgE IgG1抗体であるrhuMab-E25(Genentech/Novartis/Tanox Biosystems)；霊長類化抗CD23抗体であるIDEC-152(IDEC Pharm)；マウス抗CD147 IgM抗体であるABX-CBL (Abgenix)；ラット抗CD2 IgG抗体であるBTI-322(Medimmune/Bio Transplant)；マウス抗CD3 IgG2a抗体であるOrthoclone/OKT3(Ortho Biotech)；キメラ抗CD25 IgG1抗体であるSIMULECT(商標)(Novartis Pharm)；ヒト化抗β2インテグリンIgG抗体であるLFP-01 (LeukoSite)マウス抗CD18 F(ab')2である抗LFA-1(Pasteur-Merieux/Immunotech)；ヒト抗TGF-β2抗体であるCAT-152(Cambridge Ab Tech)；ならびにキメラ抗第VII因子抗体であるCorsevin M(Centocor)である。
本発明に従って用いることができるさらなる抗体は、例えば、限定されるものではないが、KS 1/4膵臓癌抗原(PerezおよびWalker, 1990, J. Immunol. 142: 3662-3667; Bumal, 1988, Hybridoma 7(4): 407-415)、卵巣癌抗原(CA125) (Yuら、1991, Cancer Res. 51(2): 468-475)、前立腺酸リン酸(Tailorら、1990, Nucl. Acids Res. 18(16): 4928)、前立腺特異的抗原 (HenttuおよびVihko, 1989, Biochem. Biophys. Res. Comm. 160(2): 903-910; Israeliら、1993, Cancer Res. 53: 227-230)、メラノーマ関連抗原p97 (Estinら、1989, J. Natl. Cancer Instit. 81(6): 445-446)、メラノーマ抗原gp75 (Vijayasardahlら、1990, J. Exp. Med. 171(4): 1375-1380)、高分子量メラノーマ抗原 (HMW-MAA) (Nataliら、1987, Cancer 59: 55-63; Mittelmanら、1990, J. Clin. Invest. 86: 2136-2144)、前立腺特異的膜抗原、癌性胚抗原(CEA) (Foonら、1994, Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 13: 294)、多型上皮ムチン抗原、ヒト乳脂肪球抗原、CEA、TAG-72などの結腸直腸腫瘍関連抗原 (Yokataら、1992, Cancer Res. 52: 3402-3408)、CO17-1A (Ragnhammarら、1993, Int. J. Cancer 53: 751-758); GICA 19-9 (Herlynら、1982, J. Clin. Immunol. 2: 135)、CTA-1およびLEA、バーキットリンパ腫抗原-38.13、CD19 (Ghetieら、1994, Blood 83: 1329-1336)、ヒトBリンパ腫抗原-CD20 (Reffら、1994, Blood 83:435-445)、CD33 (Sgourosら、1993, J. Nucl. Med. 34:422-430)、ガングリオシドGD2 (Salehら、1993, J. Immunol., 151, 3390-3398)、ガングリオシドGD3 (Shitaraら、1993, Cancer Immunol. Immunother. 36:373-380)、ガングリオシドGM2 (Livingstonら、1994, J. Clin. Oncol. 12: 1036-1044)、ガングリオシドGM3 (Hoonら、1993, Cancer Res. 53: 5244-5250)などのメラノーマ特異的抗原、T抗原DNA腫瘍ウイルスおよびRNA腫瘍ウイルスのエンベロープ抗原などのウイルスにより誘導される腫瘍抗原、結腸、膀胱腫瘍癌胎児抗原のCEAなどの癌胎児抗原α-フェトプロテインなどの腫瘍特異的移植型の細胞表面抗原(TSTA) (Hellstromら、1985, Cancer. Res. 45:2210-2188)、ヒト肺癌抗原L6、L20などの分化抗原(Hellstromら、1986, Cancer Res. 46: 3917-3923)、線維肉腫の抗原、ヒト白血病T細胞抗原-Gp37 (Bhattacharya-Chatterjeeら、1988, J. of Immun. 141:1398-1403)、新生糖タンパク質、スフィンゴ脂質、EGFR (上皮増殖因子受容体)などの乳癌抗原、HER2抗原 (p185HER2)、多型上皮ムチン(PEM) (Hilkensら、1992, Trends in Bio. Chem. Sci. 17:359)、悪性ヒトリンパ球抗原-APO-1 (Bernhardら、1989, Science 245: 301-304)、胎児赤血球に認められるI抗原、成人赤血球に認められる初期内胚葉I抗原、移植前の胚、胃癌において認められるI(Ma)、乳腺上皮に認められるM18、M39、骨髄細胞に認められるSSEA-1、結腸直腸癌に認められるVEP8、VEP9、Myl、VIM-D5、D156-22、結腸癌に認められるTRA-1-85(血液群H)、C14、肺癌に認められるF3、胃癌に認められるAH6、胚性癌細胞に認められるYハプテン、Ley、A431細胞に認められるTL5(血液群A)、EGF受容体、膵臓癌に認められるE1シリーズ(血液群B)、胚性癌細胞に認められるFC10.2、胃癌抗原、腺癌に認められるCO-514(血液群Lea)、腺癌に認められるNS-10、A431細胞のEGF受容体に認められるCO-43(血液群Leb)、G49、結腸癌に認められるMHC(血液群Aleb/Ley)、結腸癌に認められる19.9、胃癌ムチン、骨髄細胞に認められるT5A7、メラノーマに認められるR24、胚性癌細胞に認められる4.2、GD3、D1.1、OFA-1、GM2、OFA-2、GD2、およびM1:22:25:8、ならびに4〜8段階の胚に認められるSSEA-3およびSSEA-4などの分化抗原(Feizi, 1985, Nature 314: 53-57)などの癌抗原または腫瘍抗原に特異的に結合することができる。一実施形態においては、抗原は、皮下T細胞リンパ腫に由来するT細胞受容体由来ペプチドである(Edelson, 1998, The Cancer Journal 4:62を参照)。
6.7 本発明の特異的抗原および融合パートナー
本明細書に記載のように、本発明の方法を、任意の抗体に適用することができる。例えば、Fc変異体ライブラリーを、任意の抗体から作製するか、または本発明の変異体Fc領域を任意の抗体に導入することができる。さらに、本発明の変異体Fc領域を用いて、Fc融合タンパク質を作製することができる。従って、実質的に任意の分子を、本発明に従って用いることができる抗体および／またはFc融合タンパク質により標的化し、および／またはそれに組み込むことができるが、例えば、限定されるものではないが、以下の一覧のタンパク質、ならびに以下の一覧のタンパク質に属するサブユニット、ドメイン、モチーフおよびエピトープが挙げられる：レニン；ヒト成長ホルモンおよびウシ成長ホルモンなどの成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；α-1抗トリプシン；インスリンA鎖；インスリンB鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；第VII因子、第VIIIC因子、第IX因子、組織因子(TF)、およびvon Willebrand因子などの凝固因子；Cタンパク質などの抗凝固因子；心房性ナトリウム利尿因子；肺界面活性物質；ウロキナーゼもしくはヒト尿もしくは組織型プラスミノーゲン活性化因子(t-PA)などのプラスミノーゲン活性化因子；ボンベシン；トロンビン；造血増殖因子；腫瘍壊死因子αおよびβ；エンケファリナーゼ；RANTES(regulated on activation normally T-cell expressed and secreted)；ヒトマクロファージ炎症タンパク質(MIP-1-α)；ヒト血清アルブミンなどの血清アルブミン；Muellerian阻害物質；レラクシンA鎖；レラクシンB鎖；プロレラクシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；β-ラクタマーゼなどの微生物タンパク質；DNase；IgE；CTLA-4などの細胞傷害性Tリンパ球関連抗原(CTLA)；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子(VEGF)；例えば、EGFR、VEGFRなどのホルモンもしくは増殖因子の受容体；αインターフェロン(α-IFN)、βインターフェロン(β-IFN)およびγインターフェロン(γ-IFN)などのインターフェロン；インターフェロン受容体1などのインターフェロン受容体成分；AもしくはDタンパク質；リウマチ因子；骨由来神経栄養因子(BDNF)、ニューロトロフィン-3、4、5もしくは6(NT-3、NT-4、NT-5もしくはNT-6)、または神経成長因子などの神経栄養因子；血小板由来増殖因子(PDGF)；αFGFおよびβFGFなどの線維芽細胞増殖因子；上皮増殖因子(EGF)；TGF-1、TGF=2、TGF-3、TGF-4、もしくはTGF-5などのTGF-αおよびTGF-βなどのトランスフォーミング増殖因子(TGF)；インスリン様増殖因子IおよびII(IGF-IおよびIGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脳IGF-I)、インスリン様増殖因子結合タンパク質；CD2、CD3、CD4、CD8、CD11a、CD14、CD18、CD19、CD20、CD22、CD23、CD25、CD33、CD40、CD40L、CD52、CD63、CD64、CD80およびCD147などのCDタンパク質；エリスロポエチン；骨誘導因子；イムノトキシン；骨形態形成タンパク質(BMP)；インターフェロンα、β、およびγなどのインターフェロン；M-CSF、GM-CSF、およびG-CSFなどのコロニー刺激因子(CSF)；インターロイキン(IL)、例えば、IL-1〜IL-13；TNFα、HMGB1；HMGB2；スーパーオキシドジスムターゼ；T細胞受容体；表面膜タンパク質；分解促進因子；例えば、AIDSエンベロープの一部などのウイルス抗原、例えば、gp120；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレッシン；調節タンパク質；LFA-1、Mac 1、p150.95、VLA-4、ICAM-1、ICAM-3およびVCAMなどの細胞接着分子；a4/p7インテグリン、およびそのいずれかまたはサブユニットを含むXv/p3インテグリン、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、α7、α8、α9、αD、CD11a、CD11b、CD51、CD11c、CD41、αIIb、αIELbなどのインテグリンαサブユニット；CD29、CD18、CD61、CD104、β5、β6、β7およびβ8などのインテグリンβサブユニット；限定されるものではないが、αVβ3、αVβ5およびα4β7などのインテグリンサブユニットの組合せ；いくつかのアポトーシス経路；IgE；血液群抗原；flk2/flk3受容体；肥満(OB)受容体；mpl受容体；CTLA-4；Cタンパク質；YKL-40およびAMCaseなどのキチナーゼもしくはキチナーゼ様分子；EphA2、EphA4、EphB2などのEph受容体；HLA-DRなどのヒト白血球抗原(HLA)；補体受容体CR1、C1Rqなどの補体タンパク質ならびにC3、およびC5などの多の補体因子；GpIbα、GPIIb/IIIaおよびCD200などの糖タンパク質受容体。
本発明に従って用いることができるさらなる分子は、限定されるものではないが、以下のものなどの癌抗原に特異的に結合するものである：ALK受容体(プレイオトロフィン受容体)、プレイオトロフィン、KS 1/4膵臓癌抗原；卵巣癌抗原(CA125)；前立腺酸リン酸；前立腺特異的抗原(PSA)；メラノーマ関連抗原p97；メラノーマ抗原gp75；高分子量メラノーマ抗原(HMW-MAA)；前立腺特異的膜抗原；癌性胚抗原(CEA)；多型上皮ムチン抗原；ヒト乳脂肪球抗原；CEA、TAG-72、CO17-1A、GICA 19-9、CTA-1およびLEAなどの結腸直腸腫瘍関連抗原；バーキットリンパ腫抗原-38.13；CD19；ヒトBリンパ腫抗原-CD20；CD33；ガングリオシドGD2、ガングリオシドGD3、ガングリオシドGM2およびガングリオシドGM3などのメラノーマ特異的抗原；腫瘍特異的移植型細胞表面抗原(TSTA)；T抗原、DNA腫瘍ウイルスおよびRNA腫瘍ウイルスのエンベロープ抗原などのウイルスにより誘導される腫瘍抗原；結腸のCEA、5T4癌胎児トロホブラスト糖タンパク質および膀胱腫瘍癌胎児抗原などの癌胎児抗原α-フェトプロテイン；ヒト肺癌抗原L6およびL20などの分化抗原；線維肉腫の抗原；ヒト白血病T細胞抗原-Gp37；新生糖タンパク質；スフィンゴ脂質；EGFR(上皮増殖因子受容体)などの乳癌抗原；NY-BR-16；NY-BR-16およびHER2抗原(p185HER2)；多型上皮ムチン(PEM)；悪性ヒトリンパ球抗原-APO-1；胎児赤血球に認められるI抗原などの分化抗原；成人赤血球に認められる初期内胚葉I抗原；移植前の胚；胃癌に認められるI(Ma)；乳腺上皮に認められるM18、M39；骨髄細胞に認められるSSEA-1；VEP8；VEP9；Myl；VIM-D5；結腸直腸癌に認められるD156-22；TRA-1-85(血液群H)；精巣および卵巣癌に認められるSCP-1；結腸癌に認められるC14；肺癌に認められるF3；胃癌に認められるAH6；Yハプテン；胚性癌細胞に認められるLey；TL5(血液群A)；A431細胞に認められるEGF受容体；膵臓癌に認められるE1シリーズ(血液群B)；胚性癌細胞に認められるFC10.2；胃癌抗原；腺癌に認められるCO-514(血液群Lea)；腺癌に認められるNS-10；CO-43(血液群Leb)；A431細胞のEGF受容体に認められるG49；結腸癌に認められるMH2(血液群ALeb/Ley)；結腸癌に認められる19.9；胃癌ムチン；骨髄細胞に認められるT5A7；メラノーマに認められるR24；胚性癌細胞に認められる4.2、GD3、D1.1、OFA-1、GM2、OFA-2、GD2、およびM1:22:25:8ならびに4〜8細胞段階の胚に認められるSSEA-3およびSSEA-4；皮下T細胞リンパ腫抗原；MART-1抗原；シアリルTn(STn)抗原；結腸癌抗原NY-CO-45；肺癌抗原NY-LU-12変異体A；腺癌抗原ART1；腫瘍随伴性関連脳-精巣癌抗原(癌神経抗原MA2；腫瘍随伴性神経抗原)；神経癌腹部抗原2(NOVA2)；血液細胞癌抗原遺伝子520；腫瘍関連抗原CO-029；腫瘍関連抗原MAGE-C1(癌／精巣抗原CT7)、MAGE-B1(MAGE-XP抗原)、MAGE-B2(DAM6)、MAGE-2、MAGE-4a、MAGE-4bおよびMAGE-X2；癌-精巣抗原(NY-EOS-1)；YKL-40ならびに上記ポリペプチドのいずれかの断片。
6.8 下流の操作
本発明のスクリーニング方法を用いて単離された1個以上のポリペプチドを、さらに改変することができることが意図される。例えば、本発明に従って単離された抗体を改変することができる(すなわち、共有結合するような該抗体への任意の型の分子の共有結合により)。例えば、限定されるものではないが、抗体誘導体としては、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化により、また公知の保護基／遮断基による誘導体化、タンパク質分解切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質への連結などにより、改変された抗体が挙げられる。多くの化学修飾のいずれかを公知の技法により実行することができ、限定されるものではないが、特異的化学的切断、アセチル化、ホルミル化などが包含される。特定の実施形態においては、本発明に従って単離された抗体、またはそのフラグメントを、限定されるものではないが、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、小分子、模倣物質、合成薬剤、無機分子、および有機分子などの生物活性分子と融合させる。他の実施形態においては、本発明に従って単離された抗体、またはそのフラグメントを、診断剤、検出剤または治療剤にコンジュゲートさせる。そのような薬剤およびコンジュゲーションの方法は、当業者にはよく知られており、いくつかの出典に開示されている(例えば、Arnonら、「癌治療における薬剤の免疫標的化のためのモノクローナル抗体(Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy)」、Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeldら(編)、pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstromら、「薬剤送達のための抗体(Antibodies For Drug Delivery)」、Controlled Drug Delivery (第2版), Robinsonら(編)、pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe,「癌治療における細胞傷害性薬剤の抗体担体：総論(Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review)」、Monoclonal Antibodies ‘84: Biological And Clinical Applications, Pincheraら(編)、pp. 475-506 (1985); 「癌治療における放射標識抗体の治療的使用の分析、結果、および予測される未来(Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy)」、Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwinら(編)、pp. 303-16 (Academic Press 1985)およびThorpeら、1982, Immunol. Rev. 62:119; 国際公開WO 93/15199; WO 93/15200; WO 97/33899; WO 97/34911; WO 01/77137; WO 03/075957; 米国特許公開2006/0040325を参照)。
あるいは、または必要に応じて、本発明に従って単離された抗体またはそのフラグメントを、ポリペプチド部分に融合させることができる。抗体をポリペプチド部分に融合させるか、またはコンジュゲートさせる方法は、当業界で公知である。例えば、米国特許第5,336,603号; 第5,622,929号; 第5,359,046号; 第5,349,053号; 第5,447,851号、および第5,112,946号; EP 307,434; EP 367,166; PCT公開 WO 96/04388およびWO 91/06570; Ashkenaziら、1991, PNAS USA 88:10535; Zhengら、1995, J 1mmunol 154:5590;ならびにVilら、1992, PNAS USA 89:11337を参照されたい；それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み入れられるものとする。抗体またはそのフラグメントの、部分への融合は直接的である必要はないが、リンカー配列を介して行ってもよい。そのようなリンカー分子は、当業界で一般的に知られており、Denardoら、1998, Clin Cancer Res 4:2483; Petersonら、1999, Bioconjug Chem 10:553; Zimmermanら、1999, Nucl Med Biol 26:943; Garnett, 2002, Adv Drug Deliv Rev 53:171に記載されている。
一実施形態においては、本発明に従って単離された抗体またはそのフラグメントを、異種タンパク質もしくはポリペプチド(またはそのフラグメント、好ましくは、少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90もしくは少なくとも100アミノ酸のポリペプチド)に組換え的に融合させるか、または化学的にコンジュゲート(共有および非共有結合の両方を包含する)させて、融合タンパク質を作製する。あるいは、または必要に応じて、抗体またはそのフラグメントを用いて、該抗体を特定の細胞表面受容体に特異的な抗体に融合させるか、もしくはそれにコンジュゲートさせることにより、in vitroもしくはin vivoで、特定の細胞型に異種ポリペプチドを標的化することができる。あるいは、抗体を第2の抗体にコンジュゲートさせて、Segalによる米国特許第4,676,980号に記載されたような抗体異種コンジュゲートを形成させることができる。
6.9 膜貫通ドメイン
本発明においては、膜貫通ドメインのコード配列は、第1のコード領域の下流に位置し、それに機能し得る形で連結されている(図1)。従って、当業界でよく知られる技術を用いてそれを検出することができる細胞膜上に局在化することができる融合タンパク質を発現させる。
タンパク質の膜貫通領域は、細胞膜の脂質二重層を貫通するのに適切なサイズである高度に疎水性または親油性のドメインであり、それによって、細胞膜中にタンパク質、ペプチド、または受容体を固定する。それらは、典型的には、常にではないが、15〜30個のアミノ酸を含むであろう。細胞膜上に異なるタンパク質を発現させるために異なる起源のタンパク質に由来するいくつかの膜貫通ドメインを用いることを記載するChouら(1999 Biotechnology and Bioengineering 65(2):160-169)を参照されたい。当業者であれば、Chouらにより実施された方法を適合させて、本発明における使用のために異なる膜貫通ドメインおよび／もしくはGPIアンカードメインを最適化またはスクリーニングすることができる。
膜貫通タンパク質は、1個または複数個の膜貫通ドメインから含んでもよい。例えば、受容体チロシンキナーゼ、特定のサイトカイン受容体、受容体グアニリルシクラーゼおよび受容体セリン／トレオニンタンパク質キナーゼは、単一の膜貫通ドメインを含む。しかしながら、チャネルおよびアデニリルシクラーゼなどの様々な他のタンパク質は、いくつかの膜貫通ドメインを含む。
多くの細胞表面受容体は、それらが膜貫通領域を含む通り、「７回膜貫通ドメイン」タンパク質とに分類される。膜貫通タンパク質受容体としては、限定されるものではないが、インスリン受容体、インスリン様増殖因子受容体、ヒト成長ホルモン受容体、グルコース輸送因子、トランスフェリン受容体、上皮増殖因子受容体、低密度リポタンパク質受容体、上皮増殖因子受容体、レプチン受容体、インターロイキン受容体、例えば、IL-1受容体、IL-2受容体などが挙げられる。
真核系における様々な手法は、目的のポリペプチドおよび別のタンパク質に由来する膜貫通ドメインを含む融合タンパク質を作製し、該融合タンパク質を細胞膜に固定することにより、表面提示を達成する。理論によって束縛されることを望むものではないが、真核細胞においては、多数の分泌されたタンパク質および膜結合タンパク質は、翻訳と同時に小胞体膜を横切って転位する(WickerおよびLodish, Science 230:400 (1985); VernerおよびSchatz, Science 241:1307 (1988); Hartmannら、Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:5786 (1989); Matlackら、Cell 92:381 (1998))。この同時転位プロセスの第1工程においては、「シグナル配列」と呼ばれる、発生期のポリペプチドのN末端疎水性断片が、シグナル認識粒子により認識され、該シグナル認識粒子と膜受容体との相互作用により小胞体膜へと標的化される。シグナル配列は、小胞体膜に進入し、その後の発生期ポリペプチド鎖は小胞体膜中の転位装置を通して通過し始める。分泌されるタンパク質またはI型膜タンパク質のシグナル配列は、小胞体膜の内腔側上のシグナルペプチダーゼにより切断され、転位鎖から切り出される。残りの分泌タンパク質鎖は小胞体の内腔に放出される。I型膜タンパク質は、通常は「膜貫通ドメイン」と呼ばれる、第2の疎水性断片により膜に固定される。I型膜タンパク質のC末端は、細胞の細胞質ゾル中に位置するが、N末端は細胞表面上に提示される。
本明細書で用いられる用語「II型シグナルアンカードメイン」または「II型膜貫通ドメイン」とは、翻訳の際に、II型方向で小胞体膜中にポリペプチドを標的化し、固定する真核生物のII型内在性膜タンパク質に認められる疎水性アミノ酸配列を指す。用語「II型方向」とは、N末端は細胞質中に存在するが、C末端は小胞体の内腔内または細胞外細胞表面上に存在するタンパク質トポロジーを指す。
対照的に、ある種のタンパク質は、切断されないシグナル配列、すなわち、膜貫通部分として機能する「シグナルアンカー配列」を有する。シグナルアンカーI型タンパク質は、細胞質ゾル中に位置するC末端を有し、これはI型膜タンパク質に類似するが、シグナルアンカーII型タンパク質は、細胞質ゾル中に位置するN末端を有する。II型シグナルアンカーの例は、例えば、Yokoyarna-Kobayashiら、Gene 228:161(1999)に記載されている。
一実施形態においては、膜貫通ドメインは、I型タンパク質に由来する。
膜貫通ドメインの例が本明細書に記載されているが、本発明の融合タンパク質の膜貫通ドメインは、細胞原形質膜を貫通し、該膜に他のドメインを固定することができる任意のアミノ酸配列であってよい。特徴的な膜貫通ドメインは、一般的には、連続的な疎水性アミノ酸、次いで荷電したアミノ酸を含む。従って、当業者であれば、特定のタンパク質のアミノ酸配列の分析に際して、該タンパク質内の膜貫通ドメインの局在および数を予測することができる。膜貫通ドメインは、疎水性領域または両親媒性領域を含んでもよい。疎水性領域は、限定されるものではないが、フェニルアラニン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、バリン、システイン、トリプトファン、アラニン、トレオニン、グリシンおよびセリンなどの疎水性アミノ酸を含み、かつ疎水性αヘリックスを含む。
両親媒性領域は、疎水性および親水性アミノ酸および部分の両方を有し、かつ両親媒性αヘリックスを含んでもよい。親水性アミノ酸としては、限定されるものではないが、アルギニン、アスパラギン酸、リジン、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、チロシンおよびプロリンが挙げられる。安定なαヘリックスを形成する膜貫通ドメインは、当業界で以前に記載されている。
本質的には、任意の膜貫通ドメインが本発明と適合する。膜貫通ドメインとしては、限定されるものではないが、以下に由来するものが挙げられる：腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバー、CD30、血小板由来増殖因子受容体(PDGFR、例えば、ヒトPDGFRのアミノ酸514-562；Chestnutら、1996 J Immunological Methods 193:17-27; また、Gronwaldら、1988 PNAS 85:3435を参照)；神経成長因子受容体、マウスB7-1 (Freemanら、1991 J Exp Med 174:625-631)、アシアロ糖タンパク質受容体H1サブユニット(ASGPR; Speissら、1985 J Biol Chem 260:1979-1982)、CD27、CD40、CD120a、CD120b、CD80 (Freemanら、1989 J Immunol 143:2714-22)、リンホトキシンβ受容体、ガラクトシルトランスフェラーゼ(例えば、GenBank 受託番号AF155582)、シアリルトランスフェラーゼ(例えば、GenBank受託番号NM-003032)、アスパルチルトランスフェラーゼ1 (Asp1; 例えば、GenBank受託番号AF200342)、アスパルチルトランスフェラーゼ2 (Asp2; 例えば、GenBank受託番号NM-012104)、シンタキシン6 (例えば、GenBank受託番号NM-005819)、ユビキチン、ドーパミン受容体、インスリンB鎖、アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ(例えば、GenBank受託番号NM-002406)、APP(例えば、GenBank受託番号A33292)、Gタンパク質結合受容体、トロンボモジュリン (Suzukiら、1987 EMBO J 6, 1891)およびTRAIL受容体。一実施形態においては、膜貫通ドメインは、ヒトタンパク質に由来するものである。本発明の目的のために、タンパク質に由来する膜貫通ドメインの全部または一部を用いることができる。特定の実施形態においては、膜貫通ドメインは、Asp2の残基454-477、APPの残基598-661(例えば、APP 695の)、ガラクトシルトランスフェラーゼの残基4-27、Asp1の残基470-492、シアリルトランスフェラーゼの残基10-33、アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼの残基7-29またはシンタキシン6の残基261-298である。膜貫通ドメインの例は、特許公開WO 03/104415およびUS20040126859にも記載されている。一実施形態においては、膜貫通ドメインは、例えば本明細書に記載のような、ヒトタンパク質に由来するものである。
一実施形態においては、本発明の細胞表面提示抗体またはそのフラグメントは、LLIGISIASLCLVVALLALLCHLRKKQ(配列番号109)のアミノ酸配列を有するトロンボモジュリンの膜貫通ドメインを含む。
一実施形態においては、Invitrogen(Carlsbad, California; カタログ番号V660-20)社製pDisplay(商標)ベクターを、ウイルスベクターを構築するためのクローニング工程の1つにおいて用いる。pDisplay(商標)ベクターは、組換えタンパク質を哺乳動物細胞の表面に標的化するように設計された哺乳動物発現ベクターである。ベクターのN末端分泌シグナルおよび血小板由来増殖因子受容体(PDGFR)のC末端膜貫通アンカードメインと共に読み枠を合わせて目的の遺伝子をクローニングすることにより、目的のタンパク質を細胞表面に標的化し、固定する。さらなる詳細については、Invitrogen社製の「哺乳動物細胞の表面上でのタンパク質の発現のためのpDisplay(商標)ベクター」バージョンCという表題の製品マニュアルを参照されたい。
6.10 GPI-アンカーシグナル配列
酵素、外殻タンパク質、表面抗原、および接着分子などの様々な細胞表面タンパク質を、GPIアンカーを介して原形質膜に付着させる(Burikoferら、2002 FASEB J 15:545)。GPIは翻訳後に付加される脂質アンカーである；従って、異なる膜貫通ドメインを有し特定の細胞質伸長部に連結する従来のポリペプチドアンカーと違って、GPIアンカーは、それに連結されたタンパク質に関係なく、膜に付着する共通の脂質構造を利用する(Englundら、Annul Rev. Biochem. 62:121 (1993))。GPIアンカーシグナル配列は、多くのタンパク質について同定されている(例えば、Caresら、Science 243:1196 (1989)を参照)。GPIアンカーシグナルは、他の非GPIアンカータンパク質のC末端に対して成功裏に作製されており、これらのGPIアンカータンパク質は細胞表面上で被覆され、機能的である(Andersonら、P.N.A.S. 93:5894 (1996); Brunschwigら、J. Immunother. 22:390 (1999))。GPIアンカーは、タンパク質標的化、膜貫通シグナリング、および小分子の取込み(エンドサイトーシス)において機能すると提唱されている。原形質膜タンパク質のGPIアンカーは、原生動物および菌類から脊椎動物までの真核生物に存在する。本発明において用いることができるGPIアンカードメインの例については、Doering, T. L.ら、(1990) J. Biol. Chem. 265:611-614; McConville, M. J.ら、(1993) Biochem. J. 294:305-324;およびPCT公開WO 03/017944を参照されたい。
理論的考慮によって制限されることを望むものではないが、タンパク質合成の直後に、GPI改変シグナルを含むタンパク質は、長さ約15-20アミノ酸の疎水性配列によってER内腔に固定される。Albertsら、Molecular Biology Of The Cell、第3版、p. 591 (1994)。GPIアンカーは、ER中で予め構築され、そしてGPI結合の後、改変されたタンパク質がグリコシル化され、原形質膜の外部表面に運ばれる。GPIアンカーをペプチドのC末端に共有結合させるプロセスは、粗面ER中の酵素により触媒される。ERの酵素は、元の膜-アンカー配列を切断した後、新しいカルボキシル末端をエタノールアミンのアミノ基に結合させる。このアンカーは、典型的には、イノシトールリン脂質に連結された、ホスホエタノールアミン(EthN-P)、いくつかの糖類、例えば、N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)およびマンノースを含む(Ikezawa 2002 Biol Pharm Bull 25: 409-417)。さらに、イノシトールリン脂質は、典型的には、1-アルキル、2-アシルグリセロールを含む。しかしながら、アンカー中のイノシトールリン脂質は変化してもよい。例えば、赤血球上で発現されるタンパク質のイノシトールリン脂質は、原形質膜への付着のさらなる地点を提供するさらなるイノシトール結合脂肪酸を有する。そのようなアンカーは、「2本足の」と記載される。従って、本発明のGPIアンカーは、「1本足の」、「2本足の」または「3本足の」ものであってよい。
合成GPIアンカー配列を作製するためのいくつかの一般的な要件が存在する。これらは、該分子(10-20アミノ酸)のC末端の疎水性領域であるが、その後ろに、塩基性残基のクラスター、すなわち、前駆体の切断およびアンカーの付着が起こる、スペーサー領域の後ろで該疎水性領域および小アミノ酸に先行する7〜10残基の「スペーサードメイン」が存在しない。GPIアンカーは予め構築され、小胞体(ER)中の発生期タンパク質に付加される。この工程と同時に、最初のC末端ペプチドは除去されて、それによりGPIアンカーが該タンパク質上の新しいC末端アミノ酸に共有結合される。
本発明は、GPIアンカーシグナル配列を用いて、本明細書に記載のように細胞膜上で抗体を発現させる。GPIアンカーシグナル配列コード領域を、第1のコード領域の下流に配置し、これに機能し得る形で連結する。従って、当業界でよく知られる技術を用いてそれを検出することができる細胞膜上に局在化することができる融合タンパク質を発現させる(図1)。
GPIアンカータンパク質は、該タンパク質をERに指向させるN末端シグナル配列も用いると考えられる。このシグナルを当業界で公知の一般的な方法によりコード領域として作製することができる。
本質的には、任意のGPIアンカーシグナル配列を本発明に従って用いることができる。GPIアンカーシグナル配列は、当業界で公知であり、および／または当業界で公知の方法、例えば、http://mendel.imp.univie.ac.at/gpi/gpi_server.htmlで利用可能なBig-P予測分析を用いて決定することができ、Eisenhaberら、1999 J Mol Biol 292: 741-758; Eisenhaberら、2003 Nucleic Acids Research 31: 3631-3634; Eisenhaberら、Protein Engineering 14: 17-25; Eisenhaberら、2000 TIBS 25: 340-341; およびEisenhaberら、1998 Protein Engineering 11: 1155-1161に記載されている。
一実施形態においては、GPIアンカーシグナル配列を、真核生物、哺乳動物、霊長類またはヒトのタンパク質に由来するGPIアンカーシグナルから選択する。GPIアンカーシグナル配列としては、限定されるものではないが、以下に由来するものが挙げられる：分解促進因子(DAF；Carasら、1987 Science 238:1280-83)；ウロモジュリン、アルカリホスファターゼ、BP-3、ジペプチジルペプチダーゼ、トリパノソーマ・ブルセイ変異体表面タンパク質(VSG；Doeringら、J Bio Chem. 1990 256:611-614)；C8結合タンパク質(Doeringら、1990)；アルカリホスファターゼ；アセチルコリンエステラーゼ；59-ヌクレオチダーゼ；アルカリホスホジエステラーゼI；トレハラーゼ；リーシュマニア表面プロテアーゼPSP(gp63)；腎臓ジペプチダーゼ(MDP)；アミノペプチダーゼP；NAD 1グリコヒドロラーゼ；カルボキシペプチダーゼM；炭酸脱水酵素IV；カイコアミノペプチダーゼN；ADP-リボシルトランスフェラーゼ；酵母アスパルチルプロテアーゼ；コレラ硝酸還元酵素；プラスモジウムトランスフェリン受容体；CD14；CD16；CD48；葉酸結合タンパク質；ウロキナーゼ受容体；CNTF受容体；トリパノソーマVSGおよびPARP(プロサイクリン)；トキソプラズマ表面抗原(P22;P30およびP43)；ジアルジアGP49；ゾウリムシ表面抗原；Thy-1；CD55(DAF)；Ly6ファミリー(CD59；Ly6A/E)；癌性胚抗原(CEA)；Qa-2；CD24、プリオン(PrP C; PrP Sc);イカのSgp-1およびSgp-2；NCAM-120(最も短いCD56)；CD58(LFA-3；Seedら、1987 Nature 329:840-842)；タマホコリカビの接触部位A；マウスF3；ChickF11；ニワトリアキソニン-1；ポリスホンジリウムGP64；バッタのREGA-1；5NTD_BOVIN; 5NTD_DISOM; 5NTD_HUMAN; 5NTD_RAT; ACES_TORCA; ACES_TORMA; AMPM_HELVI; AMPM_MANSE; AXO1_HUMAN; BCM1_HUMAN; BCM1_MOUSE; BCM1_RAT; BM86_BOOMI; BST1_HUMAN; BST1_MOUSE; BST1_RAT; CADD_CHICK; CADD_HUMAN; CAH4_HUMAN; CD24_HUMAN; CD24_MOUSE; CD24_RAT; CD48_HUMAN; CD48_MOUSE; CD48_RAT; CD52_HUMAN; CD52_MACFA; CD59_AOTTR; CD59_CALSQ; CD59_CERAE; CD59_HSVSA; CD59_HUMAN; CD59_PAPSP; CD59_PIG; CD59_RAT; CD59_SAISC; CEPU_CHICK; CGM6_HUMAN; CNTR_CHICK; CNTR_HUMAN; CNTR_RAT; CONN_DROME; CSA_DICDI; CWP1_YEAST; CWP2_YEAST; DAF_HUMAN; DAF_PONPY; DAF1_MOUSE; FOL1_HUMAN; FOL1_MOUSE; FOL2_HUMAN; FOL2_MOUSE; G13A_DICDI; G13B_DICDI; GAS1_YEAST; GLYP_HUMAN; GLYP_RAT; GP46_LEIAM; GP63_LEICH; GP63_LEIDO; GP63_LEIGU; GP63_LEIMA; GP85_TRYCR; GPCK_MOUSE; HYA1_CAVPO; HYA1_HUMAN; HYA1_MACFA; HYR1_CANAL; LACH_DROME; LACH_SCHAM; LAMP_HUMAN; LAMP_RAT; LY6A_MOUSE; LY6C_MOUSE; LY6E_MOUSE; LY6F_MOUSE; LY6G_MOUSE; MDP1_HUMAN; MDP1_MOUSE; MDP1_PIG; MDP1_RABIT; MDP1_RAT; MDP1_SHEEP; MKC7_YEAST; MSA1_SARMU; NAR3_HUMAN; NART_MOUSE; NCA_HUMAN; NRT1_RAT; NRT2_RAT; NRTR_CHICK; NRTR_HUMAN; NRTR_MOUSE; NTRI_RAT; OPCM_BOVIN; OPCM_HUMAN; OPCM_RAT; PAG1_TRYBB; PARA_TRYBB; PARB_TRYBB; PARC_TRYBB; PONA_DICDI; PPB1_HUMAN; PPB2_HUMAN; PPB3_HUMAN; PPBE_MOUSE; PPBI_BOVIN; PPBI_HUMAN; PPBI_RAT; PPBJ_RAT; PRIO_ATEGE; PRIO_ATEPA; PRIO_CALJA; PRIO_CEBAP; PRIO_CERAE; PRIO_CERAT; PRIO_CERMO; PRIO_CERNE; PRIO_CERPA; PRIO_CERTO; PRIO_COLGU; PRIO_CRIGR; PRIO_CRIMI; PRIO_GORGO; PRIO_HUMAN; PRIO_MACFA; PRIO_MACSY; PRIO_MANSP; PRIO_MESAU; PRIO_MOUSE; PRIO_PANTR; PRIO_PONPY; PRIO_PREFR; PRIO_RAT; PSA_DICDI; SP63_STRPU; THY1_CHICK; THY1_HUMAN; THY1_MACMU; THY1_MOUSE; THY1_RAT; TIP1_YEAST; TIR1_YEAST; TREA_HUMAN; TREA_RABIT; UPAR_BOVIN; UPAR_HUMAN; UPAR_MOUSE; UPAR_RAT; VCA1_MOUSE; VSA1_TRYBB; VSA8_TRYBB; VSAC_TRYBB; VSE2_TRYBR; VSG2_TRYEQ; VSG4_TRYBR; VSG7_TRYBR; VSI1_TRYBB; VSI2_TRYBB; VSI3_TRYBB; VSI4_TRYBB; VSI5_TRYBB; VSI6_TRYBB; VSIB_TRYBB; VSM0_TRYBB; VSM1_TRYBB; VSM2_TRYBB; VSM4_TRYBB; VSM5_TRYBB; VSM5_TRYBR; VSM6_TRYBB; VSWA_TRYBR; VSWB_TRYBR; VSY1_TRYCO; YAP3_YEAST; YJ9O_YEAST;ならびにYJ9P_YEAST。一実施形態においては、GPIアンカーシグナル配列は、DAFのC末端の37アミノ酸である。GPIアンカーシグナル配列のさらなる例については、米国特許第5,968,742号およびDoeringら、1990、上掲を参照されたい。特定のGPIアンカーシグナルの例としては、限定されるものではないが、表2に列挙されるものが挙げられる。
Figure 2009511067
6.11 内部リボソーム進入部位
IRESを用いて、単一のベクターから2個以上のタンパク質を発現させる。IRES配列を一般的に用いて、第2、第3、第4のコード配列などの発現を駆動する。
IRESエレメントは、ピコルナウイルスmRNAにおいて初めて発見された(Jacksonら、1990, Trends Biochem Sci 15:477-S3; Jacksonら、1995, RNA 1:985-1000)。本発明に従って用いることができるIRESの例としては、限定されるものではないが、以下に由来するかまたはそれから誘導されたものが挙げられる：ピコルナウイルス、例えば、HAV(Glassら、1993, Virol 193:842-852)、例えば、Novagen社から市販されている脳心筋炎ウイルス(EMCV)(Dukeら、1992, J. Virol 66:1602-9; Jang & Wimmer, 1990, Gene Dev 4:1560-1572)、およびポリオウイルス(Bormanら、1994, EMBO J 13:3149-3157); HCV (Tsukiyama-Koharaら、1992, J Virol 66:1476-1483) BVDV (Frolov Iら、1998, RNA. 4:1418-1435); リーシュマニアウイルス、例えば、LRV-1 (Magaら、1995, Mol Cell Biol 15:4884-4889); レトロウイルス、例えば、MoMLV (Torrentら、1996, Hum Gene Ther 7:603-612)、VL30 (Harveyマウス肉腫ウイルス)、REV (Lopez-Lastraら、1997, Hum Gene Ther 8:1855-1865); および真核生物mRNA、例えば、免疫グロブリン重鎖結合タンパク質 (BiP) (Macejak & Sarnow, 1991, Nature 353:90- 94)、アンテナペディアmRNA (Ohら、1992, Gene & Dev 6:1643-1653)、線維芽細胞増殖因子2 (FGF-2) (Vagnerら、1995, Mol Cell Biol 15:35-44)、PDGF-B (Bernsteinら、1997, J Biol Chem 272:9356-9362)、IGFII (Teerinkら、1995, Biochim Biophys Acta 1264:403-408)、翻訳開始因子elF4G (Gan & Rhoads, 1996, J Biol Chem 271:623-626)、インスリン様増殖因子 (IGFU)、酵母転写因子TFIID およびHAP4、および血管内皮増殖因子(VEGF) (Steinら、1998, Mol Cell Biol 18:3112-3119; Huezら、1998, Mol Cell Biol 18:6178-6190)ならびに米国特許第6,692,736号に記載のもの。また、IRESは、カルジオウイルス、ライノウイルス、アフトウイルス、HCV、フレンドマウス白血病ウイルス(FrMLV)およびモロニーマウスI型白血病ウイルス(MoMLV)などの様々なウイルスにおいても報告されている。本明細書で用いられる用語「IRES」は、IRES配列の機能的変異体が、下流のシストロンの開始コドンへの直接的内部リボソーム進入を促進し、cap依存的翻訳を誘導することができる限り、該変異体を包含する。本発明において用いられるIRESは、哺乳動物、ウイルスまたは原生動物のものであってよい。
かくして、下流のシストロンの産物を、ポリタンパク質の切断もモノシストロン性mRNAの生成も必要とせずに、二シストロン性(または多シストロン性)mRNAから発現させることができる。一般的に用いられる内部リボソーム進入部位は、長さ約450ヌクレオチドであり、一次配列の中程度の保存および二次構造の強力な保存を特徴とする。IRESの最も顕著な一次配列の特徴は、ピリミジンに富む部位であり、それはIRESの3'末端の約25ヌクレオチド上流に位置する。Jacksonら、1990 (Trends Biochem Sci, 15(12):477-83)を参照されたい。
ピコルナウイルスIRESの3つの主要なクラスが同定および特性評価されている：(1)カルジオおよびアフトウイルスクラス(例えば、脳心筋炎ウイルス、Jangら、1990, Gene Dev 4:1560-1572)；(2)エンテロおよびライノウイルスクラス(例えば、ポリオウイルス、Bormanら、1994, EMBO J. 13:314903157)；および(3)A型肝炎ウイルス(HAY)クラス(Glassら、1993, Virol l93:842-852)。最初の2つのクラスについては、2つの一般原理が適用される。第1に、IRESの約450ヌクレオチドの配列の多くは、リボソーム結合および翻訳開始を誘導する特定の二次および三次構造を維持するように機能する。第2に、リボソーム進入部位は、保存されたオリゴピリミジン管の約25ヌクレオチド下流の、IRESの3'末端に位置するAUGトリプレットである。翻訳開始は、リボソーム進入部位(カルジオウイルス)または次の下流のAUG(エンテロ／ライノウイルスクラス)で起こり得る。アフトウイルスにおいては、開始は両方の部位で起こる。
HCVならびにウシウイルス性下痢ウイルス(BVDV)などのペスチウイルスまたは古典的豚コレラウイルス(CSFV)は、それぞれ341および370ヌクレオチドの長い5'-UTRを有する。これらの5'-UTR断片は、類似するRNA二次構造を形成し、適度に効率的なIRES機能を有し得る(Tsukiyama- Koharaら、1992, J. Virol. 66:1476-1483; Frolov Iら、1998, RNA 4:1418-1435)。最近の研究により、フレンドマウス白血病ウイルス(MLV)の5'-UTRおよびラットレトロトランスポゾンウイルス様30S(VL30)配列が両方とも、レトロウイルス起源のIRES構造を含むことが示された(Torrentら、1996, Hum Gene Ther 7:603-612)。
真核細胞においては、翻訳は通常、開始因子の制御下で、キャップ付きmRNAの5'末端からのリボソーム走査により開始する。しかしながら、いくつかの細胞mRNAは、キャップ依存的翻訳を媒介するIRES構造を有することが見出された(van der Veldeら、1999, Int J Biochem Cell Biol. 31:87-106)。非限定的な例は、免疫グロブリン重鎖結合タンパク質(BiP) (Macejakら、1991, Nature 353:90-94)、ショウジョウバエのアンテナペディアmRNA (Ohら、1992, Gene & Dev 6:1643-1653)、線維芽細胞増殖因子2(FGF-2) (Vagnerら、1995, Mol Cell Biol 15:35-44)、血小板由来増殖因子B (PDGF-B) (Bernsteinら、1997, J Biol Chem 272:9356-9362)、インスリン様増殖因子II (Teerinkら、1995, Biochim Biophys Acta 1264:403-408)、翻訳開始因子eIF4G (Gan & Rhoads, 1996, J Biol Chem 271:623-626)および血管内皮増殖因子(VEGF) (Steinら、1998, Mol Cell Biol 18:3112-3119; Huezら、1998, Mol Cell Biol 18:6178-6190)である。
IRESを、当業界で公知の標準的な組換えおよび合成方法を用いて調製することができる。クローニングの便宜のため、制限部位を、用いるIRES断片の末端に作製することができる。
6.12 自己プロセッシング切断部位・配列
この機構は本発明の一部ではないが、自己プロセッシング切断部位、自己プロセッシング切断配列または2A様配列の活性は、ペプチド結合の形成を防止するコドン間でのリボソームスキッピングを伴うことがあり(de Felipeら、2000, Human Gene Therapy 11: 1921-1931; Donnellyら、2001, J. Gen. Virol. 82:1013- 1025)、このドメインはむしろ自己溶解酵素のように働くと考えられた(Ryanら、1989, Virol. 173.35-45)。
「自己プロセッシング切断部位」または「自己プロセッシング切断配列」とは、翻訳に際して、自己プロセッシング切断部位を含むポリペプチドの迅速な分子内(シス)切断が起こり、別の成熟タンパク質またはポリペプチド産物の発現をもたらす、DNAまたはアミノ酸配列を指す。また、「自己プロセッシング切断部位」または「自己プロセッシング切断配列」とは、翻訳に際して、該配列が当業界で公知かつ本明細書に記載の「リボソームスキップ」をもたらすDNAまたはアミノ酸配列を指す。「自己プロセッシング切断部位」を、本明細書で2A部位、配列またはドメインにより例示される、翻訳後または同時翻訳プロセッシング切断部位と呼ぶこともある。2A部位、配列またはドメインは、リボソームの活性を改変して、エステル結合の加水分解を促進し、それによって、別の下流の翻訳産物の合成を可能にする様式で翻訳複合体から該ポリペプチドを放出させることにより、翻訳作用を示すと報告された(Donnellyら、2001, J Gen Virol. 82:1013-25)。あるいは、「自己プロセッシング切断部位」、「自己プロセッシング切断配列」または2A配列もしくはドメインは、それ自身のC末端をシスに切断して、一次切断産物を生成することにより、「自己タンパク質溶解」または「切断」を示す(Furler; Palmenberg, 1990, Ann. Rev. Microbiol. 44:603-623)。
この機構は本発明の一部ではないが、2A様配列または自己プロセッシング切断部位は、ペプチド結合の形成を防止するコドン間でのリボソームスキッピングを伴うことがあり(de Felipeら、2000, Human Gene Therapy 11: 1921-1931; Donnellyら、2001, J. Gen. Virol. 82:1013- 1025)、このドメインはむしろ自己溶解酵素のように働くとも考えられた(Ryanら、1989, Virol. 173.35-45)。
口蹄疫ウイルス2Aオリゴペプチドは、リボソームスキップ機構を介して2つの連続的タンパク質の翻訳を媒介することが以前に証明された(Donnellyら、2001, J Gen Virol. 82:1013-25; Szymczakら、2004, Nat Biotechnol. 5:589-94.; Klumpら、2001, Gene Ther. 10:811-7; De Felipeら、2000, Hum Gene Ther. 11:1921-31; Halpinら、1999, Plant J. 17:453-9; Mattionら、1996, J Virol. 70:8124-7; およびde Felipe P.ら、1999, Gene Ther. 6:198-208)。複数のタンパク質が、単一のオープンリーディングフレーム(ORF)としてコードされる。二シストロン系での翻訳の間に、上流遺伝子の3'末端のFMDV 2A配列の存在は、下流のシストロンとのペプチド結合形成を無効にし、「リボソームスキップ」および上流タンパク質への翻訳されたFMDV 2Aオリゴペプチドの結合をもたらす(Donnellyら、2001, J Gen Virol. 82(Pt 5): 1013-25)。プロセッシングは、化学量論的様式で起こり、90〜99％の高さであると見積もられ、近いモル等量の両方のタンパク質種をもたらす(Donnellyら、2001, J Gen Virol. 82(Pt 5):1027-41)。さらに、欠失分析によると、アミノ酸配列依存的プロセッシング活性は、FMDV 2AオリゴペプチドのC末端の小さい断片に局在していた(Ryanら、1994, EMBO J. 13:928-33)。ピコルナウイルスファミリー(FMDVが属する)の多くのメンバーは、類似する機構の同時翻訳的プロセッシングを使用して、個々のタンパク質を生成する(Donnellyら、2001, J Gen Virol. 82(Pt 5):1027-41)。実際、刊行物により、13アミノ酸という小さな断片がリボゾームスキップを引き起こし得ることが示された(Ryanら、1994, EMBO J. 13:928-33)。二シストロン性ベクター系へのトランケートされたバージョンのペプチドの組込みにより、ほとんど全てのプロセッシング活性は、非ウイルスベクター系においても保存されることが示された(Donnellyら、2001, J Gen Virol. 82(Pt 5):1027-41)。少なくとも4つのコード配列が、これらの型のエレメントの戦略的配置により、単一のプロモーター下で効率的に発現された(Szymczakら、2004, Nat Biotechnol. 22:589-94)。従って、FMDV 2Aオリゴペプチドなどの自己プロセッシング切断部位を本発明において用いて、重鎖および軽鎖コード領域の発現を連結することができる。
本発明のために、自己プロセッシング切断部位をコードするDNA配列は、限定されるものではないが、エンテロ、ライノ、カルジオ、アフト、または口蹄疫ウイルス(FMDV)などのピコルナウイルスから誘導されたウイルス配列により例示される。一実施形態においては、自己プロセッシング切断部位コード配列は、FMDVから誘導される。
FMDV 2Aドメインは、典型的には、長さ約19アミノ酸(例えば、LLNFDLLKLAGDVESNPGP(配列番号56)；TLNFDLLKLAGDVESNPGP (配列番号57)、Ryanら、J. Gen. Virol. 72.2727-2732 (1991))であると報告されているが、しかしながら、わずか13アミノ酸残基(例えば、LKLAGDVESNPGP(配列番号58))のオリゴペプチドも、天然のFMDVポリタンパク質プロセッシングにおけるその役割と類似する様式で2AのC末端での切断を媒介することが示された。あるいは、本発明に従うベクターは、Donnellyら、2001, J. Gen. Virol. 82:1027-1041に考察されたような他の2A様領域のアミノ酸残基をコードしてもよく、限定されるものではないが、ピコルナウイルス、昆虫ウイルス、C型ロタウイルス、トリパノソーマ反復配列または細菌であるテマトガ・マリチム(Thermatoga maritime)に由来する2A様ドメインが挙げられる。
2A配列の変異体が、ポリタンパク質の効率的なプロセッシングを媒介するその能力について研究されてきた(Donnellyら、2001)。そのような変異体は、本発明により特に意図され、包含される。一実施形態においては、2A配列は、変異体2A配列である。
自己プロセッシング切断部位およびそれらをコードするベクターのさらなる例および説明は、US20050042721およびUS2005003482に見出される。
6.13 特定の実施形態
本発明のさらなる実施形態を、表3に提供する。
Figure 2009511067
Figure 2009511067
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7.実施例
ここで、本発明を以下の実施例を参照して説明する。これらの実施例は、例示目的のみで提供されるものであり、本発明はこれらの実施例に制限されると決して解釈されるべきではない。
7.1 実施例1：抗体の哺乳動物細胞表面提示
以下の節は、哺乳動物細胞の表面上に効率的に提示される抗体融合ポリペプチドの作製および特性評価を説明する。
膜貫通ドメインおよび／またはGPIアンカーシグナルを含む免疫グロブリン重鎖融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、PCRにより作製する。ここで記載の実験は、特に注記しない限り、抗EphA2抗体12G3H11の重鎖を一例として用いる。GPIアンカーシグナル融合パートナーの代表例を表2に列挙する。種々の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、以下の機能し得る形で連結された配列エレメント：5'末端-CMV極初期プロモーター-軽鎖シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド-軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド-κ軽鎖定常領域をコードするポリヌクレオチド-ECMV IRES-重鎖リーダーペプチドをコードするポリヌクレオチド(ユニークなXbaI制限エンドヌクレアーゼ認識エレメントを含む配列)-重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド-IgG1重鎖定常領域をコードするポリヌクレオチド-ユニークなNotI制限エンドヌクレアーゼ認識エレメント-Mo-MuLV IRES-ネオマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド-SV40ポリA-3'末端 を有する発現カセットを含む抗体発現ベクターであるpABHL中にクローニングする。pABDisplayは、重鎖定常領域遺伝子の3'末端に機能し得る形で連結されたポリヌクレオチドをコードするDAF変異体GPIアンカーシグナルをさらに含むpABHLの誘導体であり、pABDisplayベクターは免疫グロブリン重鎖-DAF vGPIアンカーシグナル融合ポリペプチドをコードする。
重鎖融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、12G3H11抗EphA2抗体の重鎖遺伝子をコードするプラスミドから、PCRにより作製する。PCR反応混合物は、1個のフォワードプライマーUniXbaI(配列番号 )および複数のリバースプライマーを含む。このUniXbaIプライマーは、クローニングを容易にするためのXbaI制限エンドヌクレアーゼの認識配列を含む。融合パートナー特異的リバースプライマーセットを、重鎖と読み枠を合わせた融合パートナー(例えば、膜貫通ドメイン)をコードするヌクレオチド残基を含み、各セットが約70ヌクレオチドの複数の部分的に重複するリバースプライマーを含むように設計した。各セットの第1のリバースプライマーは、その3'末端に約20ヌクレオチド残基を含み、重鎖と融合パートナーとの間の接続部の重鎖部分をコードするDNA配列にアニーリングする。第2のおよびそれに引き続くリバースプライマーは、その3'末端に約20残基を含み、上記リバースプライマーの5'の約20残基の大部分と同一である。最後のリバースプライマーは、融合パートナーのC末端と、その後のクローニング手順を容易にするためのNotI制限エンドヌクレアーゼの認識配列とをコードするヌクレオチド残基を含む。分解促進因子(DAF vGPI)の変異体GPIアンカーシグナルに融合させた抗Eph2重鎖をコードするポリヌクレオチド配列を作製するのに用いられた3つのリバースプライマーの配列を、上記のプライマー設計原理の一例として、表4に列挙する。
Figure 2009511067
予想されるサイズのPCR産物をXbaIおよびNotIで消化し、同様に消化されたpABHLベクターに連結して哺乳動物細胞中での発現を容易にする。連結産物を用いて、製造業者のプロトコルに従ってDH10Bコンピテント大腸菌細胞を形質転換する。正確な挿入物を含むpABHLのコロニーを、当業界で公知の様々な方法(例えば、DNA調製物の制限消化、試験配列の診断的PCR増幅)を用いて同定することができる。その同一性は、ジデオキシシークエンシング反応(例えば、BigDye(登録商標)Terminator v3.0 Cycle Sequencing Ready Reaction Kit, ABI)を用いる配列決定によりさらに確認することができる。プラスミドDNAを、製造業者のプロトコルに従ってQIAGEN MiniおよびMaxi Plasmid Kitを用いて、選択されたクローンから調製する。
HEK-293T細胞を、試験する抗EphA2抗体融合ポリペプチドをコードするベクターを用いて一過的にトランスフェクトする。トランスフェクトされた細胞を、約24〜48時間培養して、抗体を発現させる。
抗EphA2融合抗体の細胞表面提示は、FITC結合抗ヒトIgG抗体を用いてトランスフェクト細胞を染色し、標準的なプロトコルに従ってそれらをフローサイトメーター上で分析することにより検出する。図2(左側)に示されるのは、抗EphA2抗体に融合されたDAF vGPI、CM GPIまたはトロンボモジュリンTMを発現する細胞を用いて得られたフローサイトメトリープロフィールである。
細胞表面提示された抗EphA2融合抗体の抗原結合特性を、該細胞をビオチン化EphA2-Fc融合ポリペプチドと共にインキュベートすることにより確認する。細胞表面に結合したEphA2-Fc融合タンパク質は、該細胞をFITC結合抗ビオチン抗体でさらに染色し、標準的なプロトコルに従ってそれらをフローサイトメーター上で分析することにより、可視化する。図2(右側)に示されるのは、抗EphA2抗体重鎖のC末端に融合されたDAF vGPI、CM GPIまたはトロンボモジュリンTMを発現する細胞を用いて得られたフローサイトメトリープロフィールである。
7.2 実施例2：Fc変異体ライブラリー構築物
以下の実施例は、DAF vGPIに融合された抗EphA2抗体のFc変異体を含むライブラリーの作製を記載する。2つの異なるライブラリーを構築した：Fc置換ライブラリー(SL-Fc)およびFc挿入ライブラリー(IL-Fc)。
前者は、A231、P232、E233、L242、K246、T250、L251、P257、V259、T260、C261、V273、K274、F275、W277、G281およびV282の、19個の他の天然アミノ酸のいずれか1個での。例えば、置換ライブラリーは、位置231のA残基の、G、L、M、F、W、K、Q、E、S、P、V、I、C、Y、H、R、N、DおよびTからなる群より選択されるアミノ酸残基での置換を有するFc領域を含む。個々の置換は、標準的な命名法を用いて特定される。例えば、残基231でのアラニン(A)のグリシン(G)への置換を有するFc変異体を、A231Gと特定する。
SL-Fcライブラリーを含むFc変異体を、縮重プライマーを用いるPCR反応により作製する。SL-Fc作製のためのプライマーを、表5に列挙する。別個のセットのPCR反応を用いて、Fc置換ライブラリー中で標的化されたそれぞれのアミノ酸残基の全てのありうる置換に対応する重鎖をコードするポリヌクレオチドを作製する。例えば、残基A231の置換突然変異体をコードするポリヌクレオチドを、以下の3つのPCR反応により作製する。1)231A残基特異的プライマーおよびMDAD-20ユニバーサルプライマーを用いて、抗EphA2重鎖に融合されたDAF vGPIのFc領域を増幅する。2)UniXbaIユニバーサルおよび231A/232P/233Erev残基特異的プライマーを用いて、抗EphA2重鎖に融合されたDAF vGPIのFd領域を増幅する。3)最初の2つの反応に由来するPCR断片を、ユニバーサルプライマーUniXbaIおよびMDAD-20を用いて重複PCRにより連結する。残基A231の全てのありうる置換突然変異体に対応するす正確なサイズのPCR断片を、反応物3から単離し、XbaIおよびNotI制限エンドヌクレアーゼを用いて消化し、定量する。標的化された各残基に対応するPCR断片を等モル量ずつ混合し、該混合物を、12G3H11抗EphA2抗体の軽鎖を含むpABDisplayベクター中に連結することにより、SL-Fcライブラリーを作製する。
Figure 2009511067
Figure 2009511067
Fc挿入ライブラリー(IL-Fc)は、アミノ酸残基230と231、231と232、232と233、233と234、234と235、235と236、236と237、237と238、238と239、239と240、または240と241の間に1個のアミノ酸残基の挿入を有する変異体Fc領域を含み、挿入された残基は20個の天然アミノ酸のいずれか1個を含んでもよい。個々の挿入物は、「In」とそれに続いて、挿入されたアミノ酸残基の1文字コードおよび該挿入物に直接隣接する残基の位置を記載したものとして特定する。例えば、InG231/232は、残基231と232の間にグリシンの挿入を含む変異体Fcを表す。
IL-Fcライブラリーを含むFc変異体を、縮重プライマーを用いるPCR反応により作製する。IL-Fc作製のためのプライマーを、表6に列挙する。別個のセットのPCR反応を用いて、Fc挿入ライブラリー中で標的化されたそれぞれの位置での全てのありうるアミノ酸挿入に対応する重鎖をコードするポリヌクレオチドを作製する。例えば、位置230/231に挿入突然変異体をコードするポリヌクレオチドを、以下の3つのPCR反応により作製する。1)位置特異的プライマー230/231InforおよびユニバーサルプライマーMDAD-20を用いて、抗EphA2重鎖に融合されたDAF vGPIのFc領域を増幅する。2)ユニバーサルプライマーUniXbaIおよびInrevを用いて、抗EphA2重鎖に融合されたDAF vGPIのFd領域を増幅する。3)最初の2つの反応に由来するPCR断片を、ユニバーサルプライマーUniXbaIおよびMDAD-20を用いる重複PCRにより連結する。位置230/231の全てのありうる挿入突然変異体に対応する正確なサイズのPCR断片を反応物3から単離し、XbaIおよびNotI制限エンドヌクレアーゼで消化し、定量する。それぞれ標的化された位置に対応するPCR断片を等モル量ずつ混合し、該混合物を、12G3H11抗EphA2抗体の軽鎖を含むpABDisplayベクター中に連結することにより、IL-Fcライブラリーを作製する。
Figure 2009511067
7.3 実施例3：ストレプトアビジンに融合されたFcγRIIIA試薬
プライマー対SA1/SA2(表7を参照)を用いて、ストレプトミセス・アビジニ(Streptomyces avidinii)の鋳型ゲノムDNAからストレプトアビジンをコードするポリヌクレオチドSをPCR増幅する。プライマー対A1/A2(表7を参照)を用いて、ヒト骨髄cDNAライブラリー(Clontech)鋳型に由来するFcγRIIIAの細胞外ドメインをコードするポリヌクレオチドFをPCR増幅する。プライマーA2およびSA1の部分的配列相補性を利用する重複PCRを用いて、FcγRIIIA-ストレプトアビジン融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドFAを作製する。NcoI/NheI消化されたポリヌクレオチドFAを、pET-28a(Novagen)発現ベクター中にクローニングし、FcγRIIIA-ストレプトアビジン融合ポリペプチドを、製造業者の説明書に従って、細菌中で発現させる。組換えFcγRIIIA-ストレプトアビジン融合タンパク質を、封入体から回収し、Gaoら(1997, Proc Natl Acad Sci U S A. 94:11777-82)に記載のようにして再折り畳みさせる。次いで、再折り畳みされた融合タンパク質を、製造業者の説明書に従って、イムノビオチンカラム(PIERCE)上で精製する。FcγRIIIA-ストレプトアビジン調製物の最終濃度は、約2.4 mg/mlである。
Figure 2009511067
7.4 実施例4：FcγRIIIA結合特性が変化したFc変異体の選択
対照実験を実施して、Lipofectamine(商標)2000(Invitrogen)を用いる一過性トランスフェクションのための条件を最適化する。DAF vGPIシグナル配列に融合された抗EphA2抗体を発現するpABDisplayベクターを様々な量(例えば、0.05、0.1、0.5、1.0、2.0、4および10μg)で用いて、HEK-293細胞をトランスフェクトする。抗EphA2抗体-DAF vGPI融合ポリペプチドの発現レベルを、該トランスフェクト細胞をFcγRIIIA-ストレプトアビジン融合タンパク質と接触させた後、FITC結合抗ストレプトアビジン抗体で染色することにより確認する。続いて、この細胞を、フローサイトメーターを用いて分析する。蛍光強度の再現性のあるシフトが、試験した各ベクター量について認められる。最も大きいシフトは、4μg以上のプラスミド量について観察される。代表的なフローサイトメトリープロフィールを、図3に示す。
対照実験を実施して、細胞表面FcγRIIIA結合アッセイのための条件を最適化する。DAF GPIシグナルに融合された抗EphA2抗体を発現するpABDisplayベクター 10μgを用いて、HEK-293細胞をトランスフェクトする。別のアリコートのトランスフェクト細胞を、1:500、1:1000、1:2000、1:3000、1:4000または1:5000倍希釈されたFcγRIIIA-ストレプトアビジン融合タンパク質と接触させた後、FITC結合抗ストレプトアビジン抗体で染色する。続いて、細胞を、フローサイトメーターで分析する。用いるFcγRIIIA-ストレプトアビジン融合タンパク質の各濃度は蛍光強度のシフトをもたらすが、そのシフトは1:1000を超えるFcγRIIIA-SAの希釈率ではあまり顕著ではない。代表的なフローサイトメトリープロフィールを、図4に示す。
Fc変異体ライブラリーの一過性トランスフェクション：12 mlの増殖培地中のHEK-293細胞(6 x 106個の細胞)を、トランスフェクションの前日に100 x 20 mmの組織培養プレートにプレーティングする。トランスフェクションの当日に、0.5〜10μgのFc突然変異体ライブラリープラスミドを、OPTI-MEM培地中の30μlのLipofectamine 2000と混合し、HEK-293細胞の培地中に添加する。トランスフェクション後48時間37℃でインキュベートした後、トランスフェクト細胞を、Accutase(商標)酵素細胞分離培地(Chemicon)を用いることにより分離させ、冷FACSバッファー(PBS/10％FBS)で洗浄する。細胞を、1:500〜1:5000倍希釈した組換えFcγRIIIA-ストレプトアビジン融合タンパク質を含む200μlのFACバッファー中に再懸濁し、室温（RT）で20分間インキュベートする。細胞をFACSバッファーで再度洗浄し、標準的なプロトコルに従って、RTで20分間、FITC結合抗ストレプトアビジン抗体で染色する。細胞を洗浄して、未結合の抗ストレプトアビジン抗体を除去し、2 x 106/mlの密度で再懸濁する。
FcγRIIIAに対する親和性が変化したFc変異体を発現する細胞の単離：再懸濁された細胞を、フローサイトメーター上で分析する。蛍光染色プロフィールの代表的な例を、図5Aに示す。非常に低いか、または非常に高い蛍光強度を有する細胞を、FACSによって単離することができる。非常に低い染色を有する細胞を選別するのに好適なゲートの例を、図5Aに示す。単離された細胞をフローサイトメーター上で再度分析して、選別物の品質を調べる(図5B)。
一過的にトランスフェクトされたライブラリーDNAの回収：選別された細胞を遠心分離により回収し、0.4 mlの細胞溶解溶液(0.6％SDSおよび10 mM EDTA)中に再懸濁する。RTで20分間インキュベートした後、100μlの5 M NaClを細胞溶解物に添加する。細胞溶解物を、遠心分離により清澄化し、上清をフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール(25:24:1)で抽出する。DNAを、水性画分からエタノールを用いて沈殿させる。DH10B大腸菌細胞を、回収されたDNAの半分を用いてエレクトロポレーションにより形質転換し、100μg/mlカルベンシリンを含むLB寒天プレート上にプレーティングする。一晩増殖させた後、全ての細菌細胞を寒天プレートから掻き取り、プラスミドDNA抽出に用いる。
選択のさらなるラウンド：回収されたプラスミドDNAを、上記選択プロセスのさらなるラウンド(例えば、合計3ラウンド)に供して、FcγRIIIA結合親和性が変化したFc変異体をコードするクローンについてさらに富化することができる。
7.5 実施例5：単離されたFc変異体の最初の特性評価
実施例4に記載の選択手順を用いて単離されたFc変異体を、以下のように最初に特性評価する。約3ラウンドの選択後、DH10B大腸菌細胞を、選別された細胞集団から回収されたDNAを用いて形質転換し、個々の細菌クローンを選択し、プラスミドDNAを標準的なプロトコルに従って単離する。
HEK-293細胞を、単離されたプラスミドDNAを用いてトランスフェクトする。トランスフェクト細胞のアリコートを、FITC結合抗ヒトIgG(H+L)抗体で染色し、フローサイトメーター上で分析して、Fc変異体の細胞表面発現レベルを確認する。染色プロフィールの例を、図6A、BおよびCに示す。
単離されたFc変異体のFcγRIIIA結合親和性も決定する。トランスフェクト細胞の別のアリコートを、組換えFcγRIIIA-ストレプトアビジン融合タンパク質と共にインキュベートした後、実施例3に記載のようにFITC結合抗ストレプトアビジン抗体で染色する。細胞の染色プロフィールを、フローサイトメーターを用いて決定する。染色プロフィールの例を、図6D、EおよびFに示す。
高い細胞表面発現および低いFcγRIIIA親和性を示す染色プロフィールを有するFc変異体クローンを、さらなる特性評価のために選択する。そのようなクローンの例は、図6CおよびFに示されるFc変異体InR236/237である。
実施例6：可溶性Fc変異体の哺乳動物発現
可溶性Fc変異体を発現させるために、DAF vGPIシグナル配列を含まないFc変異体をコードするオリゴヌクレオチドを、UniXbaIおよびBackNotI(BackNotI: TCAATGAATTCGCGGCCGCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGC (配列番号55))プライマーを用いるPCRにより作製する。予想されるサイズのPCR産物を、XbaIおよびNotI制限エンドヌクレアーゼで消化し、12G3H11抗EphA2抗体の軽鎖を含むXbaI NotI切断したpABHL発現ベクターに連結する。正確な発現構築物を有する細菌クローンを、当業界で公知の様々な方法を用いて同定することができる(例えば、ベクターDNA調製物の制限消化、ベクター配列の診断的PCR増幅)。さらに、該クローンの同一性を、ジデオキシ法(例えば、BigDye(登録商標) Terminator v3.0 Cycle Sequencing Ready Reaction Kit, ABI)を用いる配列決定により確認することができる。プラスミドDNAを、製造業者のプロトコルに従ってQIAGEN MiniおよびMaxi Plasmid Kitを用いて選択されたクローンから調製する。
Lipofectamine(商標)2000(Invitrogen)トランスフェクション試薬を用いて、可溶性Fc変異体をコードするポリヌクレオチドを含むpABHLベクターをHEK-293細胞にトランスフェクトする。トランスフェクト細胞を9日間インキュベートして、Fc変異体を産生させる。馴化培地を、インキュベーション期間の3、6および9日目に回収する。Fc変異体を、プレキャストプロテインAカラム(GE Healthcare)を用いて精製する。結合したFc変異体を、低いpHのバッファーを用いてカラムから溶出させ、中和し、PBSに対して透析する。精製されたFc変異体の濃度を、280 nmでの溶液の光学密度から算出する。
7.6 実施例7：Fc結合アッセイ
上記方法を用いて単離されたFc変異体を、ELISAアッセイ形式で、1個以上の単離されたFc受容体および／またはFcリガンド(例えば、FcγRIIIA、C1q)に対するその結合親和性についてアッセイする。ELISAアッセイを、標準的なプロトコルに従って実施する。市販の試薬を、製造業者の説明書に従って用いる。
マイクロタイタープレートを、プロテインA/G(PIERCE)溶液(0.25μg/ml)で被覆し、4℃で一晩インキュベートする。残りの結合部位を、PBSバッファー中の4％スキムミルク(ブロッキングバッファー)を用いて、37℃で1時間ブロックした。約25〜50μlの対照、野生型またはFc変異体突然変異抗体溶液を各ウェルに添加し、37℃で1時間インキュベートする。ウェルを洗浄した後、FcγRIIIA-ストレプトアビジン融合タンパク質(1％BSA中の1:1000希釈液)を37℃で1時間添加した後、洗浄し、ビオチン結合HRPと共に30分間インキュベートする。30μlのテトラメチルベンズイジン(TMB)基質(Pierce)を添加した後、30μlの0.2 M H2SO4で中和することにより、検出を行う。吸光度を450 nmで読み取る。IC50値を決定し、同時に(例えば、同じマイクロタイタープレート中で)アッセイされた野生型抗体対照について得られたものに対して正規化してもよい。野生型およびいくつかのFc変異体の結合曲線の例を、図7に示す。
マイクロタイタープレートを、プロテインA/G(PIERCE)溶液(0.25μg/ml)で被覆し、4℃で一晩インキュベートする。残りの結合部位を、ブロッキングバッファーを用いて、37℃で1時間ブロックする。ウェルあたり約25〜50μlの野生型またはFc変異体突然変異抗体溶液を各ウェルに添加し、37℃で1時間インキュベートする。ウェルを洗浄した後、約100μlの2μg/mlヒトC1q(Quidel, CA)を、37℃で1時間添加する。ウェルを洗浄した後、それらをヒツジ抗ヒトC1q抗体(BioDesign)と共に37℃で1時間インキュベートする。さらに洗浄した後、ウェルを西洋わさびペルオキシダーゼ結合ロバ抗ヒツジIgG(Serotec, NC)と共に室温で1時間インキュベートする。西洋わさびペルオキシダーゼ活性を、TMB基質(KPL、MD)を用いて検出する。反応を0.2 M H2SO4でクエンチする。吸光度を450 nmで読み取る。IC50値を決定し、同時に(例えば、同じマイクロタイタープレート中で)アッセイされた野生型抗体対照について得られたものに対して正規化してもよい。野生型およびいくつかのFc変異体の結合曲線の例を、図8に示す。
FcγRIIIA-ストレプトアビジンおよびC1qに対するいくつかのFc変異体の代表的な結合曲線を、それぞれ図7および図8に示す。抗EphA2野生型抗体およびIgG4アイソタイプ対照抗体を、実施する各アッセイのための、それぞれ陽性および陰性対照として用いる。アッセイしたFc変異体の各々は、野生型抗体と比較して、FcγRIIIAおよびC1qに対する低下した結合を有する。これらのFc変異体および他のものに関するデータを、表8にまとめる。
実施例8：細胞表面受容体結合アッセイ
上記方法を用いて単離された可溶性Fc変異体を、1個以上のFc受容体(例えば、FcγRIIIA、FcγRII)を発現する細胞の表面に対するその結合親和性についてアッセイする。
2個の細胞型、すなわち、細胞表面上に存在する少量のFcγRIと共にFcγRIIを主に発現するTHP-1細胞およびほとんど専らFcγRIIIAを発現するNK細胞を用いる。初期継代のTHP-1細胞を使用し、NK細胞を、Miltenyi Biotec社製NK細胞単離キットを用いることにより健康なドナーから単離する。ヒトNK細胞表面へのFc変異体の結合については(FcγRIIIA)、様々な濃度(例えば、10μg/ml〜1μg/ml)のFc変異体約10μlを細胞に添加し、4℃で30分間インキュベートする。細胞をFACSバッファーで洗浄した後、FITC結合ヤギ抗ヒトIgG(H+L)Fab(Pierce)で、4℃で30分間染色する。次いで、細胞を洗浄し、Guava EasyCyteサイトメーターにより分析する。THP-1細胞表面に対するFc変異体の結合については(FcγRIおよびFcγRII)、様々な濃度(例えば、10μg/ml〜1μg/ml)のFc変異体約10μlを細胞に添加し、4℃で30分間インキュベートする。細胞をFACSバッファーで洗浄した後、FITC結合ヤギ抗ヒトIgG(H+L)Fab(Pierce)で、4℃で30分間染色する。次いで、細胞を洗浄し、Guava EasyCyteサイトメーターにより分析する。
いくつかのFc変異体により結合したTHP-1およびNK細胞の割合を、それぞれ図9および10に示す。抗EphA2野生型抗体およびIgG4アイソタイプ対照抗体を、実施した各アッセイについて、それぞれ陽性および陰性対照として用いる。アッセイしたFc変異体の各々は、野生型抗体と比較して、THP-1およびNK細胞上に存在する細胞表面受容体に対する低下した結合を有する。これらのFc変異体および他のものに関するデータを、表8にまとめる。
実施例9：抗原結合
当業界でよく知られた方法を用いて、抗原結合を測定することができる。例えば、標準的なプロトコルに従うELISAに基づくアッセイを用いることができる。簡単に述べると、マイクロタイタープレートをプロテインA/G(PIERCE)溶液(0.25μg/ml)で被覆し、4℃で一晩インキュベートする。次いで、プレートをPBS/0.1％Tween-20で洗浄し、残りの結合部位をブロッキングバッファーでブロックする。約5000 ng/ml〜約5 ng/mlの濃度の試験抗体50μlを各ウェルに添加し、37℃で約60分間インキュベートする。ビオチン結合EphA2タンパク質(例えば、Dall’Acqua, F.M.ら、J Immunol, 177: 1129-1138 (2006)に記載のEphA2-Fc融合物)の好適な希釈液約50μlを各ウェルに添加し、37℃で約60分間インキュベートした後、洗浄する。西洋わさびペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンを各ウェルに添加し、製造業者の説明書に従って37℃で30分間インキュベートする。30μlのテトラメチルベンズイジン(TMB)基質(Pierce)を添加した後、30μlの0.2 M H2SO4で中和することにより、検出を行う。吸光度を450 nmで読み取る。
低下したFc受容体結合および／またはADCC活性を示したいくつかのFc変異体のリガンド結合活性を、ELISAにより試験した。野生型抗EphA2抗体および無関係の特異性の2種の抗体(Vitaxinおよび抗HMBG1)を、各アッセイについて、それぞれ陽性および陰性対照として用いた。ビオチン化ヒトEphA2タンパク質を用いるELISAアッセイにより、抗体を試験した。試験した全てのFc変異体は、野生型抗体のものと類似するヒトEphA2に対する結合親和性を示した；IC50値を示している(図11)。
実施例10：抗体依存的細胞媒介性細胞傷害性(ADCC)アッセイ
抗体依存的細胞媒介性細胞傷害性(ADCC)を、4時間の非放射性乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)放出アッセイ(Promega Corporation, Madison, WI)においてアッセイする。簡単に述べると、EphA2を発現するA549標的細胞を、96穴U底プレートに分注し(1 x 104個/50μl)、37℃で20分間、抗体の連続希釈液(50μl)と共に予備インキュベートする。次いで、ヒトエフェクター細胞(100μl)を50:1および25:1のエフェクター：標的細胞比で添加する。健康なヒトドナーからリンパ球分離培地(Lymphocyte Separation Medium)(MP Biomedicals, Irvine, CA)を用いて精製し、培地(RPMI-1640 10% FBS - 2mM L-Glu- Pen/Strep, 5 ng/mlのIL-2)中に再懸濁し、37℃で一晩インキュベートした末梢血単核細胞(PBMC)を、エフェクター細胞として用いた。37℃で4時間インキュベートした後、プレートを遠心分離し、30分間結合酵素アッセイを用いて、細胞上清へのLDHの放出を測定することにより、細胞死を分析する。特異的溶解の割合を、以下の式に従って算出する：特異的溶解率(％)＝100 x (EX-ESpon-TSpon)/(Tmax-Tspon)(式中、EXは実験ウェルからの放出を表し、Esponはエフェクター細胞のみの自発的放出であり、Tsponは標的細胞のみの自発的放出であり、Tmaxは溶解した標的細胞からの最大放出である)。
図12に示されるのは、いくつかの単離されたFc変異体を用いて実施された代表的なADCCアッセイから得た細胞傷害性曲線である。陽性対照である野生型抗EphA2抗体および陰性対照である抗CD4抗体(R347)も、このアッセイに含まれる。CD4ではなく、EphA2を発現するA549細胞を、標的として用いる。エフェクター細胞を、健康なヒトドナーから精製する。このアッセイを、2つの異なる比率の標的：エフェクター細胞(50:1および25:1)ならびにウェルあたり0.1〜10000 ngの抗体濃度を用いて実施する。それぞれのFc変異体および陰性対照はバックグラウンドを超える活性をほとんど有さないか、または全く有さないが、野生型抗体は両方の標的：エフェクター比で標的細胞の効率的な溶解を媒介する。いくつかのFc変異体に関する結果を、表8にまとめる。
Figure 2009511067
実施例11：cDNAライブラリー合成
最初に、例えば、QIAGEN RNeasyキットを用いることにより、12人の健康なドナーの末梢血単核細胞(PBMC)から、総RNAを単離する。さらに、いくつかの供給源(Bioscience, カタログ番号636170、BD Bioscience, カタログ番号6594-1、Origene technologies and Biochain Institute, Inc. カタログ番号M1234246)に由来する材料を混合することにより、mRNAのプールを取得する。製造業者の説明書に従って、Superscript III RTキット(Invitrogen)を用いることにより、ヒトcDNAライブラリーを合成する。
実施例12：pENABdisplayベクターの構築
pENTR(商標)2B(Invitrogen)を、XbaIおよびSfoIで消化して、ccdB遺伝子を欠失させる。抗体発現カセットを含む、SpeIおよびBSTZ17Iで消化された12G3H11 pABdisplayベクターに由来する大きい方の断片を、XbaI/SfoIで消化されたpENTR(商標)2Bベクター中にクローニングした。pENPABdisplayと命名された得られたベクターは、attL1およびattL2組換えシグナルによりフランキングする12G3H11抗EphA2-DAF vGPI融合抗体発現カセットを含む。
実施例13：pENABdisplay重鎖ライブラリーの構築
再構成されたVH断片を、ヒトcDNAライブラリー(実施例11を参照)からPCR増幅する。用いるプライマーを、表9に列挙する。シグナル配列をコードするポリヌクレオチドを増幅するPCR反応を、製造業者の示唆に従って、40 ngのpENABdisplay、10 pmolのHcldfフォワードプライマーおよび84830-D10-リバースプライマー、ならびにPfu ultra Taqポリメラーゼ(Stratagene、カタログ番号600380)を含む100μl量で実施する。PCR反応を最初に95℃で5分間加熱し、次いで、95℃で30秒間、55℃で30秒間、68℃で45秒間の25サイクル行い、68℃で7分間保持する。例えば、QIAgen PCR精製キット(カタログ番号28106)を用いることにより、PCR産物を精製する。製造業者の説明書に従って、Taq DNAポリメラーゼ(Invitrogen、カタログ番号18038-018)、50 pmolのMedieu-VH1-15ならびに50 pmolのプールされたリバース-Medieu-JH1、-JH2および-JH3プライマーを用いて、cDNAライブラリーから重鎖可変領域を個別に増幅する。5分間変性させた後、95℃で30秒間、52℃で60秒間および72℃で60秒間を8サイクル行って、鋳型を増幅し；さらに、95℃で30秒間、62℃で30秒間、72℃で60秒間を32サイクル行ってその鋳型を増幅し、72℃で7分間保持する。VH断片をアガロースゲル精製し、フォワード-HcldFならびにプールされたリバース-medieu-JH1、-JH2および-JH3プライマーを用いて、VH断片およびシグナル配列を用いて重複PCRを実施する。Taq DNAポリメラーゼ、20 ngの各鋳型および50 pmolのプライマーを用いて、PCR反応を実施する。5分間変性させた後、プライマーを用いずに95℃で30秒間、55℃で45秒間および68℃で60秒間を8サイクル行って鋳型を増幅する。プライマーを用いて95℃で30秒間、55℃で30秒間、68℃で60秒間を25サイクル行ってその鋳型をさらに増幅し、72℃で7分間保持する。PCR産物を以前に記載のようにゲル精製する。等モル量の各産物を混合し、XbaIおよびSalI制限エンドヌクレアーゼ(New England Biolabs)で消化し、pENPABdisplayベクター中にクローニングして、重鎖(IgG1)ライブラリーを作製する。ライブラリーの多様性の程度を、96個のクローンを配列決定することにより決定する。
Figure 2009511067
Figure 2009511067
Figure 2009511067
実施例14：pENABdisplay軽鎖ライブラリーの構築
再構成された抗体κおよびλ軽鎖断片を、ヒトcDNAライブラリー(実施例11を参照)からPCR増幅する。用いるプライマーを、表9に列挙する。12個のVHλフォワードプライマーを、2個のλリバースプライマーと対形成させて、抗体λ軽鎖可変および定常領域を増幅させる。同様に、11個のVHκフォワードプライマーを、κリバースプライマーと対形成させて、抗体κ軽鎖可変および定常領域を増幅させる。Pfu Ultra(Stratagene)を使用し、製造業者の説明書に従って、各反応を10 pmolの各プライマーを用いて別々に行う。最初の3分間の変性の後、95℃で30秒間、52℃で30秒間、68℃で90秒間を30サイクル行ってPCR反応物を増幅し、68℃で10分間保持する。PCR産物をプールし、アガロースゲル精製し、BssHIIおよびClaI制限エンドヌクレアーゼで消化する。同様に消化したpENABdisplayベクターを用いて、産物をT4 DNAに連結し、フェノール-クロロホルム抽出し、沈殿させ、DH10Bエレクトロコンピテント細胞中に形質転換する。ライブラリーの多様性の程度を、96個のクローンを配列決定することにより決定する。
実施例15：pENABdisplay重鎖-軽鎖ライブラリーの構築
それぞれ、重鎖および軽鎖ライブラリーの多様な抗体重鎖および軽鎖を、単一の重鎖-軽鎖ライブラリーにまとめるために、pENPABdisplay軽鎖ライブラリーを、XbaIおよびNotI制限エンドヌクレアーゼで消化する。pENPABdisplay重鎖ライブラリーを同様に消化して多様な重鎖コード断片を放出させ、次いで、アガロースゲル精製し、XbaI／NotI消化されたpENABdisplay軽鎖ライブラリー中に連結する。
実施例16：アデノウイルス発現ベクターの構築
Gateway(登録商標)システムを用いて、pENABdisplay VH-VLライブラリーの抗体発現カセットを、製造業者の説明書に従って、LR反応によりpAd/PL-DEST(Invitrogen、カタログ番号V494-20)ベクター中に組み換える。この反応物をフェノール-クロロホルム抽出し、沈殿させ、DH10Bエレクトロコンピテント細胞中に形質転換する。得られるpAd/Pl-VH-VL発現ベクターのプラスミドDNA単離後、PacIを用いる消化を行って、左右のウイルスITRを露出させ、細菌性配列を除去する。ITR断片をフェノール-クロロホルム抽出し、沈殿させ、Lipofectamine 2000(Invitrogen)を用いてHEK-293A細胞中にトランスフェクトする。細胞変性作用が観察された後、ウイルスを収穫する。BD AdenoX Rapidタイターキット(Becton Dickinson, CA)により、ウイルス力価を決定する。
pAd/PL-DESTは、トランスにE1タンパク質を提供する細胞系(例えば、293A細胞)でのみ増殖することができる複製能力のないアデノウイルスに基づく。上記のpAd/PL-DESTに基づくライブラリーは、E1タンパク質を条件的に発現し、かくして、ウイルス複製を条件的に支援する細胞系を用いるスクリーニングにとって非常に好適である。そのような細胞系を、誘導性哺乳動物プロモーター(例えば、Clontech社製テトラサイクリン誘導性プロモーター)を含むE1タンパク質発現構築物を用いる好適な細胞の安定的トランスフェクションにより作製することができる。スクリーニング手順自体は、以下の実施例に記載のように実施することができる。1)ライブラリーによる感染、2)ライブラリーによりコードされる抗体の細胞表面提示を可能にするための感染細胞のインキュベーション、3)所望の特性を有する抗体を発現する細胞の選択の際には、E1タンパク質発現を防ぐべきである。所望の特性を有する抗体をコードするアデノウイルスを含む選択された細胞中で、E1タンパク質発現を誘導して、ウイルス複製を促進し、そして、該ウイルスの回収を援助すべきである。
あるいは、pENABdisplay重鎖-軽鎖ライブラリーを、ts369突然変異を含む改変されたpAd/PL-DESTベクター(Hasson, T.B.ら、J Virol 63(9):3612-21 (1989))中に組み換えることができる。ts369突然変異を含むpAd/PL-DESTベクターを作製する方法を、以下に説明する。ライブラリーのスクリーニングを、実施例17に記載のプロトコルを用いて実施することができる。
7.7 実施例17：原理の証明：人工アデノウイルスライブラリーのスクリーニング
ts369突然変異を含むpAd/PL-DESTベクター(Hasson, T.B.ら、J Virol 63(9):3612-21 (1989))は、野生型配列を含むpAd/PL-DESTベクターのRsrII断片(位置9666〜17373)を、ts369突然変異を含む断片と置換することにより作製する。簡単に述べると、pAd/PL-DESTのRsrII断片(位置9666〜17373)を、2個のRsrII部位を有する改変されたマルチクローニング部位を有するpUC18ベクター中にクローニングする。ts369に対応する塩基対置換を、製造業者の説明書に従って、オリゴヌクレオチドTS369FおよびTS369R(それぞれ配列番号110および111)を用いるQuickChangeキット(Stratagene)を用いて野生型断片中に導入する。ts369を含むRsrII断片を、RsrIIで切断したpAd/PL-DEST中に挿入して、pAd/PL-DEST/ts369を作製する。全てのクローニング工程を、標準的な実験室プロトコルを用いて実施する。
10C2抗EphA2抗体、3F2抗EphA2抗体、Abegrin抗αvβ3インテグリン抗体、抗PCDGF抗体、3F2抗EphA2 ScFvFc(一本鎖Fv-Fc融合物)、およびAbegrin抗αvβ3インテグリンScFvFcを含む、pENPABdisplay発現構築物を、標準的なクローニング手順を用いて作製する。これらの発現構築物を、製造業者の推奨に従って、Gateway(登録商標)(Invitrogen)システムのLR反応を用いてpAd/PL-DEST/ts369ベクター中に送達する。LR反応物をフェノール-クロロホルム抽出し、沈殿させ、DH10Bエレクトロコンピテント細胞中に形質転換する。得られるpAd/PL/ts369発現ベクターのプラスミドDNA単離後、PacIを用いて消化を行って、左右のウイルスITRを露出させ、細菌性配列を除去する。ITR断片をフェノール-クロロホルム抽出し、沈降させ、Lipofectamine 2000(Invitrogen)を用いてHEK-293A細胞中にトランスフェクトする。細胞変性作用が観察された後、ウイルスを収穫する。ウイルス粒子／ml(VP/ml)として表されるウイルス力価を、Quick Titer(商標)Adenovirus Quantitation Kit(Cell Biolabs, Inc)を用いて決定する。感染多重度(MOI)を、VP/ml力価に基づいて算出する。
a)Abegrin抗αvβ3インテグリン抗体および3F2抗EphA2 ScFvFcを発現するウイルス、b)抗PCDGF抗体および10C2抗EphA2抗体を発現するウイルス、ならびにc)3F2抗EphA2抗体およびAbegrin抗αvβ3インテグリンScFvFcを発現するウイルスのアリコートを混合することにより、人工ライブラリーを調製して、100:1のウイルス粒子の最終的な比率を達成する。
ヒトIgG1のFc部分と融合させたヒトEphA2の細胞外ドメインからなるヒトEphA2-Fc融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド(配列番号112)を、標準的なプロトコルに従って、重複PCRにより作製することができる。市販のヒトcDNAを、PCR反応のための鋳型として用いることができる(例えば、Ambion社製のFirstChoice(登録商標)PCR-ReadyおよびRACE-Ready cDNA)。ヒトEphA2-Fc融合タンパク質は、ヒト胚性腎臓(HEK)293細胞中で発現させ、標準的なプロトコルを用いてプロテインAアフィニティクロマトグラフィーにより精製することができる。ヒトEphA2-Fcビオチン化は、製造業者の説明書に従ってEZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotinylation Kit(Pierce, Rockford, IL)を用いて行うことができる。
ヒトαvβ3インテグリン(Chemicon、#CC1018)を、製造業者の説明書に従ってEZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotinylation Kit(Pierce, Rockford, IL)を用いてビオチン化する。
対照実験を行って、αVβ3-ビオチンを用いる細胞表面提示抗体の検出のための条件を最適化する。293A細胞を、Abegrin抗αvβ3インテグリンScFvFcまたは3F2抗EphA2 ScFvFcをコードするアデノウイルスにMOI＝2.5で感染させる。感染細胞を、40℃で24時間インキュベートする。細胞を収穫し、4 x 106細胞/mlで再懸濁し、室温(RT)で20分間、4％ミルク中でインキュベートする。感染細胞の別のアリコートを、RTで30分間、4％ミルク中の10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml、1μg/mlまたは0.5μg/mlのαVβ3-ビオチンと接触させ、氷上でさらに10分間接触させる。細胞を洗浄して未結合のsαVβ3-ビオチンを除去し、製造業者の推奨に従ってFITC結合抗ヒトIgG-Fc(Pierce)またはAPC結合ストレプトアビジン(Pierce)で染色する。非感染293A細胞も同様に処理し、陰性対照として用いる。蛍光染色された細胞を、フローサイトメーター上で分析する。得られたデータを、表10にまとめる。
Figure 2009511067
原理の証明 選択実験I：30 mlの増殖培地中の293A細胞(15 x 106細胞)を、感染の前日にT-175組織培養フラスコ中に入れ、37℃で一晩インキュベートする。細胞を、3F2抗EphA2抗体を発現するウイルスおよびAbegrin抗αvβ3インテグリンScFvFcを発現するウイルスの100:1の比の混合物を含む人工ライブラリーで感染させる。細胞を、標準的なプロトコルを用いて、1〜2.5のMOIで感染させた。ts369突然変異体アデノウイルスの増殖のための限界温度である40℃で24時間インキュベートした後、感染細胞を収穫し、4 x 106細胞/mlで再懸濁し、室温(RT)で20分間、4％ミルク中でインキュベートする。次いで、細胞を、RTで30分間、そして氷上でさらに10分間、4％ミルク中の0.5〜1μg/mlのαVβ3-ビオチンと接触させる。細胞を洗浄して未結合のαVβ3-ビオチンを除去する。表面結合したαVβ3-ビオチンを有する細胞を、製造業者の説明書に従って、磁気ビーズにコンジュゲートさせた抗ビオチン抗体(Miltenyi Biotech)を用いて陽性選択する。単離された細胞を、製造業者の推奨に従って、FITC結合抗ヒトIgG-Fc(Pierce)およびAPC結合ストレプトアビジン(Pierce)で二重染色する。染色された細胞をフローサイトメーター上で試験し、FITCおよびAPC染色の両方を提示する細胞を、FACS機器を用いて単離する。様々な段階の選択プロセスに対応した細胞のフローサイトメトリープロフィール、ならびに二重陽性細胞を選別するための選択基準を規定するゲートを、図13に示す。単離された二重陽性細胞の半分を、37℃の許容温度でインキュベートして、アデノウイルスの回収を可能にする。回収されたウイルスを第2ラウンドの選択にかけてもよい。細胞のもう一方の半分を、溶解バッファー(10 mM EDTAおよび0.6％SDS)中で溶解し、フェノール-クロロホルム抽出し、エタノール沈殿させて、ウイルスDNAを回収する。ウイルスにコードされた抗体配列を、単離されたDNAからPCR増幅し、標準的な手順を用いてクローニングする。十分に多い数のクローンを配列決定して、選択プロセスの効率を決定する。図13に示される選択実験から得たクローンの86％が、Abegrin抗αvβ3インテグリンScFvFc特異的配列を含んでいた；選択前には、Abegrin抗αvβ3インテグリンScFvFcは、開始時人工ライブラリーの1％に相当する。
原理の証明 選択実験II：用いた人工ライブラリーは、Abegrin抗αvβ3インテグリン抗体および3F2抗EphA2 ScFvFcをそれぞれコードするウイルスを100:1比で含む。ビオチン化EphA2リガンドを、細胞表面に提示された3F2抗EphA2 ScFvFcの検出に用いる。実験を、１つ前の段落に記載のように行った。図14に示される選択実験で単離された細胞から誘導されたクローンの34％は、3F2抗EphA2 ScFvFc特異的配列を含んでいた；選択前には、3F2抗EphA2 ScFvFcは、開始時人工ライブラリーの1％に相当する。
原理の証明 選択実験III：用いた人工ライブラリーは、抗PCDGF完全長抗体および10C2抗EphA2完全長抗体をそれぞれコードするウイルスを100:1比で含む。ビオチン化EphA2リガンドを、細胞表面に提示された10C2抗EphA2抗体の検出に用いる。実験を、2つ前の段落に記載のように行った。図15に示される選択実験で単離された細胞から誘導されたクローンの87％が、10C2抗EphA2抗体特異的配列を含んでいた；選択の前には、10C2抗EphA2抗体は、開始時人工ライブラリーの1％に相当する。
本発明の特定の実施形態は、説明のために上記されたものであるが、当業者であれば、添付の特許請求の範囲に記載の本発明から逸脱することなく、詳細の多くの変更を行うことができることを理解できるであろう。
本明細書に記載の全ての刊行物、特許および特許出願は、それぞれ個々の刊行物、特許または特許出願が具体的かつ個々に参照により本明細書に組み込まれる旨記載されるのと同じ程度に、参照により本明細書に組み入れられるものとする。さらに、2005年10月14日に提出された米国特許仮出願第60/726,161号は、あらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする。
図1A-Cは、抗体またはそのフラグメントの細胞表面提示に用いることができる発現カセット(I-VI)の非限定例の模式図である。 図1A-Cは、抗体またはそのフラグメントの細胞表面提示に用いることができる発現カセット(I-VI)の非限定例の模式図である。 図1A-Cは、抗体またはそのフラグメントの細胞表面提示に用いることができる発現カセット(I-VI)の非限定例の模式図である。 図2は、膜貫通ドメインまたはGPIアンカーシグナルを含む抗体融合ポリペプチドを発現する染色されたHEK-293T細胞の蛍光強度プロフィールである。i)カルボキシペプチダーゼMのGPIアンカーシグナル(CM GPI)、ii)DAFのフレームシフト突然変異GPIアンカーシグナル(DAF mutGPI)、iii)DAFの変異体GPIアンカーシグナル(DAF vGPI)、またはiv)トロンボモジュリンの膜貫通ドメイン(TM；2つの独立に単離されたクローンを分析した)に融合された重鎖を含む抗EphA2抗体を発現するHEK-293T細胞を、FITC結合抗ヒトIgGまたはビオチン化EphA2-Fc融合タンパク質／FITC結合抗ビオチン抗体で染色し、フローサイトメーターを用いて分析した。同様に染色された(293T+FITC)、ならびに染色されなかった(293T)、HEK-293T細胞を、陰性対照として含めた。CM GPI、DAF vGPI、またはTMに融合させた抗EphA2抗体を発現する細胞は、対照細胞のものよりも有意に高い蛍光強度を示した。DAF mutGPIに融合させた抗EphA2抗体を発現する細胞は、対照HEK-293T細胞のものと実質的に同じである蛍光強度を示した。 図3は、DAF vGPIを含む抗EphA2融合抗体をコードする様々な量のプラスミドDNAでトランスフェクトされたアフィニティー染色されたHEK-293T細胞の蛍光強度プロフィールである。HEK-293T細胞を、様々な量(0.05、0.1、0.5、1.0、2.0、4および10μg)のプラスミドDNAでトランスフェクトした。まず、トランスフェクト細胞をFcγRIIIA-ストレプトアビジン融合タンパク質と接触させた後、FITC結合抗ストレプトアビジン抗体で染色した。続いて、細胞をフローサイトメーター上で分析した。非トランスフェクトHEK-293T細胞を、陰性対照として含めた。全てのトランスフェクト細胞集団のフローサイトメトリープロフィールは、対照細胞と比較して、平均蛍光強度の有意なシフトを示す。 図4は、DAF vGPIを含む抗EphA2融合抗体を発現するアフィニティー染色されたHEK-293T細胞の蛍光強度プロフィールである。HEK-293T細胞を、DAF vGPIを含む抗EphA2融合抗体をコードする10μgのプラスミドDNAでトランスフェクトした。トランスフェクト細胞をアリコートに分割し、様々な希釈率のFcγRIIIA-ストレプトアビジン融合タンパク質(1:500、1:1000、1:2000、1:3000、1:4000および1:5000)と共にインキュベートした。次いで、細胞を、FITC結合抗ストレプトアビジン抗体で染色し、フローサイトメトリーにより分析した。フローサイトメトリープロフィールは、漸減量のFcγRIIIA-ストレプトアビジン融合タンパク質の使用が、染色強度の減少をもたらしたことを示している。 図5は、FcγRIIIAに対する低い結合親和性を有するFc変異体の単離に用いられた選別パラメーターである。HEK-293細胞を、Fc変異体挿入ライブラリー(Fc-IL)で一過的にトランスフェクトし、FcγRIIIA-ストレプトアビジン融合タンパク質／FITC結合抗ストレプトアビジン抗体で染色した。(A)低い蛍光強度(M1マーカーに従って合計値の約10％)を有する細胞を、ゲートR2を用いて単離した。(B)単離された細胞集団は、均一な低い蛍光強度を示した。 図6は、DAF vGPIを含む抗EphA2融合抗体のFc変異体を発現する染色されたHEK-293細胞の蛍光強度プロフィールである。DAF vGPIを含む抗EphA2融合抗体の野生型(AおよびD)、K246E Fc変異体(BおよびE)またはInR236/237 Fc変異体(CおよびF)を発現するHEK-293細胞を、フローサイトメトリーにより分析した。細胞を、FITC結合抗ヒトIgG抗体(A-C)またはFcγRIIIA-ストレプトアビジン融合タンパク質／FITC結合抗ストレプトアビジン抗体で染色した。各パネルは、抗体を発現する(黒色の線)および対照の(灰色の線)HEK-293細胞のフローサイトメトリープロフィールを含む。FITC結合抗ヒトIgG抗体で染色された3つ全ての細胞集団は、対照細胞について観察されたものとは有意に異なる類似するレベルの蛍光強度を示した。FcγRIIIA-ストレプトアビジン融合タンパク質／FITC結合抗ストレプトアビジン抗体で染色した場合、野生型またはK246E Fc変異体抗体を発現する細胞のみが、対照HEK-293細胞について観察されたものよりも有意に高い蛍光強度を示した。 図7は、Fc変異体InR236/237、InN238/239、およびInV238/239のELISAに基づくFcγRIIIA結合曲線である。野生型またはFc変異体InR236/237、InN238/239、およびInV238/239抗EphA2抗体とのFcγRIIIA相互作用に関する結合曲線を、標準的なELISAプロトコルを用いて確立した。同じ抗原特異性のIgG4アイソタイプ抗体を、陰性対照として含めた。この結合曲線は、FcγRIIIAと、InR236/237、InN238/239、またはInV238/239 Fc変異体との相互作用が、FcγRIIIAと、IgG4陰性対照抗体のFc領域との相互作用よりも弱いことを示している。FcγRIIIAは、野生型Fc領域を含む陽性対照抗体への強固な結合を示した。 図8は、Fc変異体InG240/241、InR234/235、InL238/239、InE238/239、InS239/240、InR237/238、およびK246R/L251E/T260RのELISAに基づくC1q結合曲線である。野生型またはFc変異体InG240/241、InR234/235、InL238/239、InE238/239、InS239/240、InR237/238、およびK246R/L251E/T260R抗EphA2抗体とのC1qの相互作用に関する結合曲線を、標準的なELISAプロトコルを用いて確立した。同じ抗原特異性のIgGアイソタイプ抗体を、陰性対照として含有させた。Fc変異体の各々は、野生型抗体と比較して、C1qへの結合の低下を示す。 図9は、THP-1細胞へのFc変異体K246R/L251E/T260R、InR236/237、InN238/239、InV238/239、InG240/241、InR234/235、InL238/239、InE238/239、InS239/240およびInR237/238の結合率(％)を示す。FcγRIIIAではなく、FcγRIおよびFcγRIIを発現するTHP-1単球を、野生型またはFc変異体K246R/L251E/T260R、InR236/237、InN238/239、InV238/239、InG240/241、InR234/235、InL238/239、InE238/239、InS239/240およびInR237/238抗EphA2抗体と接触させた。それぞれの抗体により結合されたTHP-1単球の割合を、該細胞をFITC結合抗ヒトIgG Fabで染色し、それらをフローサイトメーター上で分析することにより決定した。得られた結果は、野生型抗体と比較して、試験したFc変異体の各々によるFcγRIおよびFcγRIIの結合の低下を示す。 図10は、NK細胞へのFc変異体InR236/237、InN238/239、およびInV238/239の結合率(％)を示す。FcγRIIIAを発現するNK細胞を、野生型またはFc変異体InR236/237、InN238/239、およびInV238/239抗EphA2抗体と接触させた。各抗体により結合されたNK細胞の割合を、該細胞をFITC結合抗ヒトIgG Fabで染色し、それらをフローサイトメーター上で分析することにより決定した。同じ抗原特異性のIgG4アイソタイプ抗体を、陰性対照として含めた。得られた結果は、野生型抗体と比較して、試験したFc変異体の各々によるFcγRIIIAの結合の低下を示している。 図11は、Fc変異体InR236/237、InN238/239、InV235/236、およびInG238/239のELISAに基づくEphA2結合曲線である。野生型およびFc変異体InR236/237、InN238/239、InV235/236、およびInG238/239抗EphA2抗体のヒトEphA2結合を、標準的なELISAプロトコルを用いて決定した。Vitaxin(登録商標)(抗αvβ3インテグリン抗体)および抗HMGB1抗体を、陰性対照としてこのアッセイに含めた。結果は、試験したFc変異体の各々が、野生型抗体のものと類似する親和性でヒトEphA2に結合することを示している。 図12は、Fc変異体InR236/237、InN238/239、InV238/239のin vitroでのADCC活性を示す。Fc変異体InR236/237、InN238/239、InV238/239のADCC活性を、標準的なプロトコルを用いて、50:1(左側パネル)または25:1(右側パネル)のエフェクター：標的細胞比で決定した。野生型抗EphA2抗体および抗CD4抗体(R347)を、それぞれ陽性および陰性対照として含めた。EphA2を発現するA549細胞を、標的として用いた。精製されたヒト末梢血単核細胞を、エフェクターとして用いた。細胞傷害性を、0.1〜10000 ng/mlの抗体濃度で決定した。試験したFc変異体の各々は、陰性対照抗体のものと同様のADCC活性を示す。野生型抗EphA2抗体は、同じ条件下で強固なADCC活性を示した。 図13は、原理の証明の選択実験Iに由来するフローサイトメトリープロフィールである。細胞を、αVβ3-ビオチンと共にインキュベートした後、FITC結合抗ヒトIgG-FcおよびAPC結合ストレプトアビジンで染色した。提示サンプルは以下の通りである：(A)陰性対照293A細胞、(B)細胞表面に提示された、3F2抗EphA2抗体をコードするts369突然変異アデノウイルスに感染させた293A細胞、(C)細胞表面に提示された、Abegrin抗αVβ3インテグリンScFvFcをコードするts369突然変異アデノウイルスに感染させた293A細胞、(D)磁気ビーズ媒介選択の前に人工ライブラリーに感染させた293A細胞、(E)磁気ビーズ媒介選択の後に人工ライブラリーに感染させた293A細胞。ゲートP6を用いて、二重陽性細胞を選別した。 図14は、原理の証明の選択実験IIに由来するフローサイトメトリープロフィールである。細胞を、ビオチン化EphA2と共にインキュベートした後、FITC結合抗ヒトIgG-FcおよびAPC結合ストレプトアビジンで染色した。提示されたサンプルは以下の通りである：(A)陰性対照293A細胞、(B)細胞表面に提示された、Abegrin抗αVβ3インテグリン抗体をコードするts369突然変異アデノウイルスに感染させた293A細胞、(C)細胞表面に提示された3F2抗EphA2 ScFvFcをコードするts369突然変異アデノウイルスに感染させた293A細胞、(D)磁気ビーズ媒介選択の前に人工ライブラリーに感染させた293A細胞、(E)磁気ビーズ媒介選択の後に人工ライブラリーに感染させた293A細胞。ゲートP6を用いて、二重陽性細胞を選別した。ゲートP6によりカバーされる細胞の割合を、このパネルに示す。 図15は、原理の証明の選択実験IIIに由来するフローサイトメトリープロフィールである。細胞を、ビオチン化EphA2と共にインキュベートした後、FITC結合抗ヒトIgG-FcおよびAPC結合ストレプトアビジンで染色した。提示されたサンプルは以下の通りである：(A)陰性対照293A細胞、(B)細胞表面に提示された、抗PCDGF抗体をコードするts369突然変異アデノウイルスに感染させた293A細胞、(C)細胞表面に提示された10C2抗EphA2 ScFvFcをコードするts369突然変異アデノウイルスに感染させた293A細胞、(D)磁気ビーズ媒介選択の前に人工ライブラリーに感染させた293A細胞、(E)磁気ビーズ媒介選択の後に人工ライブラリーに感染させた293A細胞。ゲートP6を用いて、二重陽性細胞を選別した。ゲートP6によりカバーされる細胞の割合を、このパネルに示す。

Claims (20)

  1. 細胞表面上に抗体またはそのフラグメントを提示した細胞のライブラリーを作製する方法であって、
    a. 細胞集団を、細胞膜の細胞外表面上に提示される組換え抗体またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドを含むベクターのライブラリーに感染させること、および
    b. 細胞表面上での該抗体またはそのフラグメントの発現を可能にする条件下で、該細胞集団を培養すること、
    を含む前記方法。
  2. 前記抗体またはそのフラグメントが、細胞表面に対して該抗体を標的化するアミノ酸配列を含み、該アミノ酸配列が抗体の重鎖または軽鎖のC末端に融合されている、請求項１に記載の方法。
  3. 前記アミノ酸配列が、膜貫通ドメインまたはGPIアンカーシグナル配列を含む、請求項２に記載の方法。
  4. 前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項１に記載の方法。
  5. 前記ベクターが、アデノウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである、請求項４に記載の方法。
  6. 前記抗体またはそのフラグメントが、IgA、IgE、IgM、IgD、IgYおよびIgGからなる群より選択される免疫グロブリン型のものである、請求項１に記載の方法。
  7. 前記抗体またはそのフラグメントが、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項１に記載の方法。
  8. 前記抗体またはそのフラグメントがFc領域を含み、該Fc領域が天然のFc領域であるか、または少なくとも1個のアミノ酸置換、挿入もしくはその組合せを含むFc領域である、請求項１に記載の方法。
  9. 前記抗体またはそのフラグメントが、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、または重鎖および軽鎖可変領域の両方を含む、請求項１に記載の方法。
  10. 所望の特性を有する抗体またはそのフラグメントを単離する方法であって、請求項１に記載の方法によって作製された細胞のライブラリーを選択にかけることによって、所望の特性を有する抗体またはそのフラグメントを発現する少なくとも1種の細胞を単離することを含む、前記方法。
  11. 単離された細胞からポリヌクレオチドを単離する工程をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
  12. 細胞のライブラリーを標識された試薬と共にインキュベートし、該標識された試薬の結合に基づいて、該細胞のライブラリーを選別することにより、選択を行う、請求項１１に記載の方法。
  13. 標識された試薬が、抗原またはエフェクター分子である、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記所望の特性が、特定の抗原への結合である、請求項１１に記載の方法。
  15. 前記所望の特性が、エフェクター分子への結合である、請求項１１に記載の方法。
  16. 細胞表面上に抗体またはそのフラグメントを提示させる方法であって、
    a. 該抗体の重鎖もしくは軽鎖のC末端に融合された、細胞表面に対して該抗体を標的化するアミノ酸配列を含む組換え抗体またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドを含むベクターに、細胞を感染させること；および
    b. 細胞表面上での該抗体またはそのフラグメントの発現を可能にする条件下で、該細胞集団を培養すること、
    を含む前記方法。
  17. W277T、K246R/L251E/T260R、InR234/235、InV235/236、InR236/237、InR237/238、InV238/239、InN238/239、InL238/239、InE238/239、InG238/239、InS239/240、InG240/241、InE240/241、InG240/241/I198T、InL238/239/P238Q、InE238/239/V348A、InS239/240/V266A、InR237/238/G236Aからなる群より選択される、少なくとも1個のアミノ酸置換、挿入またはその組合せを含む、エフェクター分子に対する親和性が低下した変異体Fc領域を含む抗体またはそのフラグメント。
  18. エフェクター分子が、C1q、FcγRIIIAからなる群より選択される、請求項１７に記載の抗体またはそのフラグメント。
  19. 前記抗体が、低下したエフェクター機能を有する、請求項１７に記載の抗体またはそのフラグメント。
  20. 前記エフェクター機能が、ADCCである、請求項１９に記載の抗体またはそのフラグメント。
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