EA012464B1

EA012464B1 - Антитело против cd20 и его применение

Info

Publication number: EA012464B1
Application number: EA200700210A
Authority: EA
Inventors: Барретт Аллан; Вэйдун Цзян; Ин Тан; Джеффри Дин Уоткинс
Original assignee: Эпплайд Молекьюлар Эволюшн, Инк.
Priority date: 2004-08-04
Filing date: 2005-07-18
Publication date: 2009-10-30
Also published as: DK1776384T3; BR122018016031B8; BRPI0514068B8; EA200700210A1; CA2573192C; WO2006020114A3; BRPI0514068B1; CN101001873B; JP2008511292A; KR100864549B1; MX2007001345A; KR20070038541A; CA2573192A1; NO339556B1; ES2426816T3; CN101001873A; US7740847B2; DK2213683T3; EP2213683B1; JP5055603B2

Abstract

В настоящем изобретении предлагаются антитела против CD20, содержащие аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, состоящую из SEQ ID NO:13; аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, состоящую из SEQ ID NO:14; и вариант исходной области Fc IgG1 человека, где вариант области Fc включает аминокислотные замены, выбранные из группы, состоящей из 247I/339Q и 247I/339D. Также предлагается фармацевтическая композиция, содержащая указанное антитело. Антитело против CD20 может использоваться для лечения лимфомы.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к полипептидам, которые включают новый вариант области Ес. Конкретно, новый вариант области Ес настоящего изобретения включает как минимум одну аминокислотную замену, описанную здесь, которая обеспечивает измененную эффекторную функцию или измененный период полужизни в сыворотке иммуноглобулина, включающего вариант области Ес, по сравнению с исходным иммуноглобулином, не содержащим аминокислотной замены. Кроме того, в изобретении предлагается способ изменения эффекторной функции моноклонального антитела или увеличения периода полужизни в сыворотке полипептида, с которым функционально связан вариант области Ес по изобретению. Раскрыто терапевтическое применение полипептидов, белков, особенно моноклональных антител, которые включают вариант области Ес по изобретению.

Предшествующий уровень техники

В настоящее время имеется как минимум семнадцать моноклональных антител, зарегистрированных в Соединенных Штатах для использования в качестве терапевтических средств для человека. Кроме того, несколько сотен моноклональных антител проходят клинические испытания и тысячи - доклинические испытания на предмет лечения различных заболеваний или нарушений, включая, например, отторжение трансплантата, рак, воспалительные заболевания, сепсис, нефрит, болезнь Альцгеймера, аллергию, диабет, аутоиммунные заболевания, артрит, рассеянный склероз и инфекционные заболевания. Область терапевтических моноклональных антител позиционируется как быстро развивающаяся в ближайшие годы. После вакцин антитела (или иммуноглобулины, 1д) составляют второй наиболее распространенный вид биофармацевтических агентов, тестируемых в клинических испытаниях (8!оскетт, Ь.Н. с1 а1. В1осйеш1са1 8оае!у Ттапкасйопк, 31:433-436, 2003).

Генная инженерия значительно способствовала развитию области терапевтических моноклональных антител. Эффективность потенциального терапевтического моноклонального антитела часто варьирует при умеренных изменениях белковой последовательности антитела. Изменение одной аминокислоты в вариабельной области моноклонального антитела способно изменить сродство, с которым антитело связывает антигенный эпитоп, а также такие свойства антитела, как величина К_оп или величина К_о££. Такие аминокислотные изменения могут определять успешность или неуспешность применения моноклонального антитела в качестве терапевтического агента. Сходным образом, небольшие изменения в последовательности аминокислот области Ес моноклонального антитела могут давать выраженные изменения свойств эффекторной функции антитела или периода полужизни белка, с которым область Ес функционально связана.

Область Ес антитела (т.е. карбоксиконцевые концы тяжелых цепей антитела, охватывающие домены СН2, СН3 и часть шарнирной области (см. фиг. 1)) ограничена в изменчивости и вовлечена в осуществление физиологических функций, которые выполняет антитело. Эффекторные функции, которые могут быть приписаны области Ес антитела, варьируют в зависимости от класса и подкласса антитела и включают (ί) связывание антитела через область Ес со специфическим рецептором Ес (ЕсЯ) на клетке, который запускает различные биологические реакции, включая, например, фагоцитоз и уничтожение покрытых антителами частиц, клиренс иммунных комплексов, высвобождение медиаторов воспаления, плацентарный перенос и контроль выработки иммуноглобулина, (и) зависимую от комплемента цитотоксичность (СЭС), где область Ес связывает компонент С1с| комплемента и таким образом инициирует классический путь активации комплемента, который приводит к лизису мишени, (ш) зависимую от антитела клеточно-опосредованную цитотоксичность (ЛЭСС). при которой определенные клетки иммунной системы человека, например, фагоциты и ΝΚ клетки, через рецептор Есу связываются с областью Ес антитела через специфические связывающие антитело рецепторы на иммунных клетках с последующим сигнальным уничтожением образования, с которым связано антитело, и (ίν) связывание с тучными клетками, базофилами и эозинофилами.

Аффинность, с которой область Ес может связываться со специфическим ЕсЯ (например, ЕсЯп), или уровень, на котором область Ес может опосредовать СЭС или АЭСС активность, представляют собой важные факторы для определения эффективности и периода полужизни терапевтических белков, особенно моноклональных антител.

Специализированная модификация аминокислот в области Ес человеческого 1дС представляет собой область активных исследований, которые дают информацию о взаимоотношениях структурафункция, важную для разработки терапевтических белков, особенно моноклональных антител (см., например, патент США № 6165745 и публикацию РСТ № ^02004/035752 относительно изменения периода полужизни в сыворотке полипептида, функционально связанного с областью Ес, и патент США № 6737056 и публикацию РСТ № ^02004/029207 относительно изменения эффекторной функции моноклонального антитела, которое включает модифицированную область Ес).

Для разработки новых терапевтических белков, особенно моноклональных антител, была бы полезна способность рационально сконструировать область Ес со специфическими модификациями аминокислот, которые обеспечивают желательное полезное свойство для целевого антитела. Не следует ожидать, что все моноклональные антитела будут усовершенствованы в качестве терапевтических средств за счет одной и той же конкретной аминокислотной модификации в области Ес. Терапевтическое моноклональ

- 1 012464 ное антитело, которое связывает один целевой антиген, может выиграть от увеличения специфической эффекторной функции, тогда как другое терапевтическое моноклональное антитело, которое связывает другой целевой антиген, может выиграть от увеличения или даже уменьшения другой эффекторной функции. Одно терапевтическое моноклональное антитело может выиграть от способности связывать специфический рецептор Ре с большим сродством, тогда как другое антитело может быть усовершенствовано в качестве терапевтического средства связыванием этого рецептора Рс с более низким сродством и, таким образом, выведением из организма с более высокой скоростью. Кроме того, конкретная модификация или замена аминокислоты области Рс и полученный эффект, который принес бы пользу терапевтическому антителу, может зависеть от антигенной мишени, с которой связывается антитело и/или заболевания или расстройства, которое должно быть улучшено с помощью антитела.

Способы и композиции, которые изменяют конкретные эффекторные функции, связанные с областью Рс антитела, необходимы, чтобы улучшить свойства существующих терапевтических антител, а также для создания новых терапевтических антител с желательными свойствами.

Моноклональные антитела с вариантом области Рс могут использоваться для лечения различных заболеваний или расстройств, включая, например, воспалительные расстройства, рак, аутоиммунные расстройства, расстройства проведения сигнала в клетках и инфекционные заболевания. Кроме того, способы и композиции, которые изменяют период полужизни в сыворотке терапевтического белка, либо увеличивая период полужизни и, таким образом, обеспечивая примение меньших доз, либо уменьшая период полужизни и, таким образом, обеспечивая более быстрый клиренс из организма, могли бы принести пользу для создания терапевтических антител, а также других терапевтических белков.

Что необходимо для улучшения эффективности терапевтического белка, особенно моноклонального антитела, так это варианты области Рс с улучшенными свойствами.

Краткое изложение сущности изобретения

В настоящем изобретении предлагаются варианты области Рс, т.е. области Рс, которые включают описанную здесь аминокислотную замену (например, см. табл. 1), которые придают полезные свойства полипептидам, включающим указанные варианты области Рс.

Положения Рс исходной области Рс, в которых может быть осуществлена любая замена аминокислоты для создания варианта области Рс по изобретению, включают положения 279, 341, 343 и 373 области Рс, где нумерация остатков, т. е. номер их положения в области Рс представляет собой номер индекса ЕС в соответствии с КаЬа1 (см. фиг. 2 в данном описании). В настоящем изобретении предлагаются варианты области Рс, которые включают замену аминокислоты в положении 279, 341, 343 или 373 исходной области Рс или любое из их сочетаний. Исходная область Рс может необязательно содержать остатки аминокислот, которые не встречаются в природе, в положениях, отличных от 279, 341, 343 и 373. Остатками природных аминокислот в этих положениях человеческого 1дС являются валин (279), глицин (341), пролин (343) и тирозин (373).

В предпочтительных вариантах осуществления по настоящему изобретению остаток аминокислоты, которым заменен остаток, присутствующий в исходной области Рс, представляет собой остаток природной аминокислоты. Если не указано иное, исходная область Рс может представлять собой природную или неприродную область Рс, предпочтительно человеческого происхождения или в значительной мере человеческого происхождения.

Последовательность аминокислот исходной области Рс предпочтительно является такой, как показано в 8ЕО ΙΌ N0: 1, 2, 3 или 4. Предпочтительно исходная область Рс содержит природный остаток аминокислоты в положении, где должна быть произведена замена для создания варианта области Рс по изобретению. Кроме того, со всех точек зрения понятно, что вариант области Рс представляет собой исходную область Рс, измененную таким образом, чтобы включать как минимум одну замену аминокислоты, как описано в данном описании. Кроме того, понятно, что исходная область Рс может представлять собой полноразмерную область Рс или ее часть, которая включает остаток аминокислоты, подлежащий замене для создания варианта области Рс.

В настоящем изобретении дополнительно предлагаются полипептиды, предпочтительно моноклональные антитела, которые включают вариант области Рс (или его функциональный фрагмент), который включает как минимум одну замену аминокислоты в положении 279, 341, 343 или 373 в сравнении с исходной областью Рс. Вариант области Рс, который включает как минимум одну замену аминокислоты в положении Рс 279, 341, 343 или 373, может дополнительно включать как минимум одну дополнительную замену аминокислоты в области Рс по сравнению с остатком аминокислоты, присутствующим в природной области Рс такого же типа, как вариант области Рс.

В одном осуществлении вариант области Рс (т.е. вариант исходной области Рс) включает как минимум 1, 2, 3 или больше замен аминокислот, выбранных из следующих:

- 2 012464

235С, 235В, 236Г,

236В,	236Υ,	237К,	237Ν,	237В,	238Е,	2385,	238Н,	2381,	2381,,
238У,	238И,	238Υ,	2441,,	245В,	247А,	247ϋ,	247Е,	247В,	247М,
247Ν,	2470,	247К,	2475,	247Т,	247И,	247Υ,	248Е,	248Р,	2480,
248И,	2491,,	249М,	249Ν,	249Р,	249Υ,	251Н,	2511,	251И,	2540,
254Е,	254В,	254С,	254Н,	2541,	254К,	2541,,	254М,	254Ν,	254Р,
2540,	254В,	254ν,	254И,	254Υ,	255К,	255Ν,	256Н,	2561,	256К,
256Ъ,	256ν,	256И,	256Υ,	257А,	2571,	257М,	257Ν,	2575,	2580,
2608,	262Ь,	2643,	265К,	2655,	267Н,	2671,	267К,	268К,	269Ν,
2690,	271Т,	272Н,	272К,	2721,,	272К,	279А,	279Ω,	279Е,	279С,
279Н,	2791,	279К,	2791,,	27 9М,	279Ν,	2790,	279В,	2795,	279Т,
279И,	279Υ,	280Т,	283В,	283С,	283Н,	2831,	283К,	283Ь,	283М,
283Р,	283В,	283Т,	283И,	283Υ,	285Ν,	286Г,	288Ν,	288Р,	292Е,
2 92 В,	292С,	2921,	2921,,	2935,	293У,	301И,	304Е,	307Е,	307М,
312Р,	315Г,	315К,	3151,,	315Р,	315В,	316Е,	316К,	317Р,	317Т,
318Ν,	318Р,	318Т,	332Е,	332С,	3321,,	332М,	3325,	3327,	332Н,
33919,	339Е,	339Е,	339С,	339Н,	3391,	339К,	3390,	339М,	339Ν,
3390,	339К,	3393,	339И,	339Υ,	3410,	341Е,	341Е,	341Н,	3411,
341К,	3411,,	341М,	341Ν,	341Р,	3410,	341В,	3415,	341Т,	34ΐν,
341’Л,	341Υ,	343А,	343ϋ,	343Е,	343Е,	3435,	343Н,	3431,	343К,
3431,,	343М,	343Ν,	3430,	343К,	3433,	343Т,	3437,	343К,	343Υ,
373ϋ,	373Е,	373Е,	373С,	373Н,	3731,	373К,	3731,,	373М,	373Ν,
3730,	373В,	3733,	373Т,	373У,	373И,	375В,	376Е,	376Е,	376С,
376Н,	3761,	3761,,	376М,	376Ν,	376Р,	3760,	376В,	3768,	376Т,
376ν,	37 6й,	376Υ,	377С,	377К,	377Р,	378Ν,	379Ν,	3790,	3795,
379Т,	380ϋ,	380Ν,	3803,	380Т,	382ϋ,	382Е,	382Н,	3821,	382К,
3821,,	382М,	382Ν,	382Р,	3820,	382В,	3825,	382Т,	382У,	382И,
382Υ,	385Е,	385Р,	386К,	423Ν,	424Н,	424М,	4247,	4260,	4261,,
427Ν,	429А,	429В,	429М,	430А,	430ϋ,	430В,	4300,	430Н,	4301,
430К,	430Ь,	430М,	430Ν,	430Р,	4300,	430К,	4305,	430Т,	430ν,
430И,	430Υ,	431Н,	431К,	431Р,	432В,	4325,	438С,	438К,	4381,,
438Т,	438И,	439Е,	439Н,	4390,	440ϋ,	440Е,	440В,	440С,	440Н,

4401, 440К, 4401,, 440М, 4400, 440Т, 440ν или 442К.

В предпочтительном осуществлении вариант области Ес включает, как минимум, 1, 2, 3 или больше замен аминокислот, выбранных из следующих:

2356, 236Г, 236В, 236Υ, 237К, 237Ν,

- 3 012464

237К,	238Е,	2386,	238Н,	2381,	238Σ,	238ν,	238И,	238Υ,	245К,
247А,	247Р,	247Е,	247Е,	247М,	247Ν,	2470,	247Р,	247Т,	247Н,
247Υ,	248Е,	248Р,	2482,	248И,	249Ъ,	249М,	249Ν,	249Р,	249Υ,
251Е,	2511,	251И,	2540,	254Е,	254Е,	2546,	254Н,	2541,	254К,
2541,,	254М,	254Ν,	254Р,	2540,	254К,	254ν,	254И,	254Υ,	255К,
255Ν,	256Н,	2561,	256К,	256Σ,	256И,	257А,	2571,	257М,	257Ν,
2575,	2580,	2603,	262Ь,	2645,	265К,	2655,	267Н,	2671,	267К,
268К,	269Ν,	2690,	271Т,	272Н,	272К,	272К,	279А,	279ϋ,	2796,
279Н,	279Ν,	2790,	2795,	279Т,	279Н,	279Υ,	280Т,	283Е,	283Н,
283К,	283М,	283К,	283И,	285Ν,	286Г,	288Ν,	288Р,	292Е,	2926,
2921,	301И,	304Е,	307Е,	307М,	312Р,	315Г,	315Ь,	315Р,	3161?,
317Р,	317Т,	318Ν,	318Р,	318Т,	332Ь,	332М,	332К,	3325,	332И,
	339Г,	3391,	ЧЭОК·	этом	ээ сш	.да-?	ччов		т -5 сил
— -г _г			- * м				л.,	_г	,
339Υ,	34Ю,	341Е,	341Е,	341Н,	3411,	341К,	341Ь,	341М,	341Ν,
341Р,	3410,	341Н,	3415,	341Т,	34ΐν,	341И,	341Υ,	3430,	343Е,
3436,	343Н,	343К,	343Ν,	3430,	34 ЗК,	3435,	343Т,	343Й,	343Υ,
37313,	373Е,	3736,	373Н,	3731,	373К,	373Ь,	373М,	3730,	373Й,
3733,	373Т,	373И,	375Р,	3766,	376Ν,	376Р,	3760,	376Р,	3765,
376Т,	3767,	376И,	376Υ,	3776,	377К,	377Р,	378ϋ,	378Ν,	379Ν,
3790,	37 9Т,	380Ν,	3805,	380Т,	382ϋ,	332Е,	3821,	332К,	3821,,
3820,	382К,	3825,	382Т,	382ν,	382И,	382Υ,	385Е,	386К,	423Ν,
424Н,	424М,	424ν,	426Б,	426Ь,	427Ν,	429А,	429Г,	429М,	430А,
4300,	430Г,	4306,	430Н,	430Г,	430К,	430Ь,	430М,	430Ν,	430Р,
4302,	430К,	4305,	430Т,	430У,	4 ЗОН,	430Υ,	431Н,	431К,	431Р,
432Я,	4325,	438К, 438Ь, 438Т, 438И, 439Е, 4400, 4401	или	440Ь.

Варианты области Рс по настоящему изобретению предпочтительно характеризуют с помощью одного или более описанных здесь экспериментальных способов. Такие варианты области Рс обеспечивают измененную эффекторную функцию или измененный период полужизни в сыворотке для моноклонального антитела, которое включает вариант области Рс, или измененный период полужизни в сыворотке для полипептида, с которым вариант области Рс функционально связан.

Предпочтительно исходная область Рс варианта области Рс по изобретению представляет собой природную или кодированную зародышевой линией область Рс человеческого происхождения, выбранную из группы, которая состоит из 1дС. 1дЛ, 1дЕ, 1дМ и 1дО или их полиморфного варианта или их функционального фрагмента. Предпочтительно исходная область Рс представляет собой область Рс 1дС и более предпочтительно - область Рс 1дС1, 1дО3 или 1дС4. Исходная область Рс может необязательно включать одну или более аминокислотную замену(замены) по сравнению с природной областью Рс, отличные от описанных здесь (т.е. замен, перечисленных в табл. 1), в особенности одну или более замен, известных в данной области техники или описанных в патентах США 6165745 или 6737056; или публикациях РСТ №№ \νϋ2004/035752 или ν02004/029207 (все из которых включены здесь во всей своей полноте); такая(такие) аминокислотная(ые) замена(замены) при наличии в исходной области Рс должна также присутствовать в области Рс варианта изобретения и в полипептиде, включающем область Рс варианта изобретения, если она не находилась в положении, впоследствии замененном для создания варианта области Рс.

В изобретении предлагается полипептид, предпочтительно моноклональное антитело, включающий вариант области Рс изобретения или его функциональный фрагмент. В предпочтительном осуществлении моноклональное антитело, включающее вариант области Рс изобретения, представляет собой гибридное антитело. В более предпочтительном осуществлении моноклональное антитело, включающее вариант области Рс изобретения, представляет собой приближенное к человеческому антитело или антитело человека, в котором каркасная последовательность и последовательность константной области, находящиеся в антителе, в значительной мере имеют человеческое происхождение. Гибридное, приближенное к человеческому или человеческое антитело является предпочтительно полноразмерным антителом или одноцепочечным антителом. Когда моноклональное антитело, включающее вариант области Рс

- 4 012464 изобретения, предназначено для применения в качестве терапевтического агента у человека, область Ес предпочтительно имеет в значительной мере человеческое происхождение.

Предпочтительно полипептид, включающий вариант области Ес изобретения или функционально связанный с ним (т.е. «вариант полипептида), содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену в варианте области Ес в сравнении с исходной областью Ес и демонстрирует измененную эффекторную функцию или измененный период полужизни в сыворотке по сравнению с полипептидом, включающим исходную область Ес указанного варианта области Ес, где как минимум одна замена аминокислоты в варианте области Ес представляет собой (1) любую замену аминокислоты в положении 279, 341, 343 или 373 области Ес или (ίί) как минимум одну из следующих замен аминокислот в области

Ес: 235С, 235К,

236Е,	236В,	236Υ,	237К,	237Ν,	237В,	238Е,	238С,	238Н,	2381,
2381,	238У,	238«,	238Υ,	2441,	245К,	247А,	247ϋ,	247Е,	247Е,
247М,	247Ν,	2470,	247К,	2475,	247Т,	247«,	247Υ,	248Е,	248Р,
2480,	248«,	2491,	249М,	249Ν,	249Р,	249Υ,	251Н,	2511,	251«,
2540,	254Е,	254Г,	254С,	254Н,	2541,	254К,	254Ь,	254М,	254Ν,
254Р,	2540,	254В,	254ν,	254«,	254Υ,	255К,	255Ν,	256Н,	2561,
256К,	25бЬ,	256У,	256«,	256Υ,	257А,	2571,	257М,	257Ν,	2575,
258ϋ,	2603,	262Ъ,	2645,	265К,	2655,	267Н,	2671,	267К,	268К,
269Ν,	2690,	271Τ,	272Н,	272К,	2721,	272К,	279А,	2790,	279Е,
279(3,	279Н,	2791,	279К,	2791,	279М,	279Ν,	2790,	279В,	2795,
279Т,	279«,	279Υ,	280Т,	283Е,	2830,	283Н,	2831,	283К,	283Ь,
283М,	283Р,	283В,	283Т,	283«,	283Υ,	285Ν,	286Р,	286Ν,	288Р,
292Е,	292Е,	292С,	2921,	2921,	2935,	293ν,	301«,	304Ξ,	307Е,
307М,	312Р,	315Ε,	315К,	315Ь,	315Р,	315В,	316Е,	316К,	317Р,
317Т,	318Ν,	318Ρ,	318Т,	332Е,	332С,	3321,	332М,	3325,	332ν,
332«,	339ϋ,	339Ε,	339Е,	339С,	339Н,	3391,	339К,	339Ь,	339М,
339Ν,	3390,	339В,	3395,	339«,	339Υ,	34Ю,	341Е,	341Е,	341Н,
3411,	341К,	34И,	341М,	341Ν,	341Р,	3410,	341В,	3415,	341Т,
34ΐν,	341«,	341Υ,	34 ЗА,	3430,	343Е,	343Е,	343С,	343Н,	3431,
343К,	3431,	343Μ,	343Ν,	3430,	343В,	3435,	343Т,	343ν,	343«,
343Υ,	3730,	373Ε,	373Е,	373С,	373Н,	3731,	373К,	373Ь,	373М,
373Ν,	3730,	373В,	3735,	373Т,	373ν,	373«,	375К,	376Е,	376Г,
376С,	376Н,	3761,	3761,	376М,	376Ν,	376Р,	3760,	376В,	3765,
376Т,	376ν,	376«,	376Υ,	3776,	377К,	377Р,	378Ν,	379Ν,	3790,
3795,	379Т,	3800,	380Ν,	3803,	380Т,	3820,	382Е,	382Н,	3821,
382К,	3821,	382М,	382Ν,	382Р,	3820,	382К,	3825,	382Т,	382ν,
382«,	382Υ,	385Е,	385Р,	386К,	423Ν,	424Н,	424М,	424’7,	426ϋ,
4261,	427Ν,	429А,	429Е,	4 2 9М,	430А,	4300,	430Е,	4306,	430Н,
4301,	430К,	4301,	430М,	430Ν,	430Р,	4300,	430К,	4305,	430Т,
4307,	430«,	430Υ,	431Н,	431К,	431Р,	432В,	4325,	438'3,	438К,
4331.,	438Т,	438«,	439Е,	439Н,	4390,	440ϋ,	440Е,	440Е,	4406,
440Е,	4401,	440К,	440Ь,	440М,	4400,	440Т,	4 4 Ον или 4 42К

или (ΐϊϊ) как минимум, две замены аминокислот, перечисленных в (1) или (ίί) выше, или (ίν) как минимум, 1, 2 или 3 замены аминокислот, перечисленных в (1) или (ίί) выше, в дополнение как минимум к одной замене аминокислоты в области Ес, не перечисленной в (1) или (ίί) выше. Предпочтительно изменение эффекторной функции представляет собой повышение ЛОСС, снижение ЛЭСС. повышение СЭС.

- 5 012464 снижение СЭС. повышение сродства связывания С1с.|. снижение сродства связывания С 1с|. повышение сродства связывания ЕсЯ (предпочтительно ЕсЯп) или снижение сродства связывания ЕсЯ (предпочтительно ЕсЯи) по сравнению с указанным полипептидом без замены аминокислоты в области Ес (т.е. с исходной областью Ес).

В изобретении предлагается моноклональное антитело, которое включает вариант области Ес, включающий как минимум одну из следующих замен аминокислот в области

Гс: 247А, 247Е,

247М,	247Т,	247Ό,	247Υ,	249Е,	249Υ,	254Γ,	254Μ,	254Υ,	256А,
2583,	279А,	283А,	2831,	283К,	283Μ,	283В,	288Ν,	292Α,	311А,
31Ю,	311Ν,	311Т,	3ΐιν,	311Υ,	3151,,	318Ν,	318Ρ,	318Τ,	318ν,
332Т,	332ν,	3390,	339Г,	3396,	3391,	339Κ,	339Μ,	339Ν,	3390,
339В,	3395,	339Т,	37 6А,	376У,	377С,	377Κ,	379Ν,	380Ν,	3808,
382А,	3821,	385Е,	427Ν,	4 2 9Μ,	434И, 4361, 4406, 44	ОН, 4401 или

440Ь [предпочтительно 247А, 247Е, 247М, 247Т, 247У, 247Υ, 254Г,

254Υ, 258ϋ, 279А, 283М, 288Ν, 292А, 31Ю, 311Ν, 311Т, 3151,,

318Ν, 318Р, 318Т, 316ν, 339ϋ, 3391, 339К, 33914, 339Ν, 3390,

339В, 3395, 376А, 376ν, 377К, 379Ν, 380Ν, 382А, 4401 или 44ОЬ], где моноклональное антитело. которое включает вариант области Ес. демонстрирует повышение ЛЭСС по сравнению с моноклональным антителом, которое включает исходную область Ес.

В изобретении предлагается моноклональное антитело. которое включает вариант области Ес. включающий как минимум одну из следующих замен аминокислот в области Ес:

				2350	, 235В
2355,	236Е,	236В,	236Υ,	237Е,	237К,	237Ν,	237В,	238Ε,	2386,
238Н,	2381,	238Ь,	238ν,	238И,	238Υ,	2476,	247Κ,	249Ъ,	249Р,
250К,	250М,	250В,	251Н,	2511,	251И,	252Υ,	2541.,	254Р,	2540,
254Т,	254ν,	25βν,	257А,	2571,	257М,	257Ν,	2575,	257У,	2605,
2 621.,	2645,	265Н,	265К,	2655,	2676,	267Н,	2671,	267К,	269Ν,
2 69β,	270А,	2706,	270К,	270М,	270Ν,	271Τ,	272Η,	272К,	2721,
272Ν,	272В,	279Ώ,	279Г,	279К,	2791,,	279Й,	2830,	283?,	2836,
283Н,	2831,,	283И,	283Υ,	285Ν,	288Р,	292Ε,	292Γ,	2926,	2921,
2 935,	293У,	301И,	304Е,	307А,	307Е,	307Μ,	311Γ,	3111,	311К,
3115,	312Р,	314 Г,	3141,	314У,	314И,	315Γ,	315Ρ,	316Е,	317Р,
327Т,	328У,	329Υ,	3326,	332К,	332Ъ,	332В,	332И,	34Ю,	341Е,
341.Г,	341Н,	3411,	341К,	3411,,	341М,	341Ν,	341Ρ,	3410,	341К,
3413,	341Т,	341И,	341Υ,	343А,	343Р,	343Ε,	343Γ,	3436,	343Н,
3431.,	343М,	343Ν,	3430,	343К,	3435,	343Τ,	343ν,	343И,	343Υ,
373А,	373ϋ,	373Е,	373Р,	3736,	3731,	373Κ,	373Ь,	373М,	373Ν,
3730,	373В,	3733,	373Т,	373У,	373И,	375Κ,	37 6Α,	376Е,	376Г,
3766,	376Н,	376И,	376Υ,	3790,	382ϋ,	3825,	430Η,	430К,	430Ν,
4300,	430В,	430И,	432В,	4325,	4341, 4400, 440Т, 440ν или	: 442К
[предпочтительно 235В, 236Г,	236Υ,	237Ε,	237Κ,	237Ν,	237В,
238Е,	2386,	238Н,	2381,	2381.,	238ν,	238Η,	238Υ,	247В,	250К,
251Н,	254Т,	2571,	257М,	257Ν,	2578,	257ν,	265Η,	265К,	2653,
2676,	267Н,	2671,	267К,	269Ν,	2690,	270Α,	2706,	270К,	270М,
270Ν,	271Т,	272Ν,	272В,	28ВР,	292Е,	301И,	304Ε,	316Е,	317Р,
32 7Т,	328ν,	329Υ,	332К,	332В,	341Е,	3411,	341Μ,	341Р,	3410,
341К,	341Т,	341И,	341Υ,	343И,	373А,	373Ε,	3736,	3735,	376А,
37 6И,	432В	или 4325),

- 6 012464 где моноклональное антитело, которое включает вариант области Ре, демонстрирует снижение ЛБСС активности по сравнению с моноклональным антителом, включающим исходную область Рс.

В изобретении предлагается моноклональное антитело, которое включает вариант области Рс, включающий как минимум одну из следующих замен аминокислот в области Рс: 238Ь, 244Ь

245Р,	2 4 9Р,	252Υ,	256Р,	257а,	2571,	257М,	257Ν,	2573,	257У,
258С,	2603,	262Ь,	270К,	272Ь,	272Н,	279А,	279Б,	2795,	279Н,
27 914,	279Ν,	2792,	279Р,	2795,	279Т,	279М,	279Υ,	283А,	283Б,
283Г,	2833,	283Н,	2831,	283К,	2831,	283Ν,	283Р,	2830,	283К,
2833,	283Т,	283И,	283Υ,	285Ν,	286Г,	288Ν,	288Р,	2937,	307Е,
307М,	311А,	3111,	311К,	31И,	ЗИМ,	31ΐν,	ЗИМ,	312Р,	316К,
317Р,	318Ν,	318Т,	332Е,	332Н,	332К,	3321,	332М,	332Р,	3325,
332И,	339Ν,	339Т,	339И,	341Р,	343Е,	343Н,	343К,	3430,	343Р,
343Т,	343Υ,	375Р,	376С,	3761,	376М,	376Р,	376Т,	376ν,	377К,
378Г),	378Ν,	380Ν,	3803,	380Т,	382Г,	382Н,	3821,	382К,	3821,
382М,	382Ν,	3820,	382К,	3825,	382Т,	382ν,	382М,	382Υ,	423Ν,
427Ν,	430А,	430Г,	430(3,	430Н,	4301,	430К,	4301,	430М,	430Ν,
4302,	430К,	4303,	430Т,	430У,	430Υ,	431Н,	431К,	434Е,	434(3,
434Н,	434И,	434Υ,	4361,	436Ь,	436Т,	438К,	4381,	438Т,	438И,
4 4 ОК	или 442К [предпочтительно	245Е,	252Υ,	256Р,	257А,	2571,
25714,	257Ν,	2573,	257У,	25813,	2603,	2621,	27 9А,	279ϋ,	279С,
279Н,	279Ν,	2792,	2793,	279Т,	279М,	279Υ,	283Г,	283Н,	283К,
283К,	285Ν,	286Г,	307Е,	307М,	3111,	311К,	3111,	ЗИМ,	312Р,
318Ν,	318Т,	3323,	339М,	343Е,	343Н,	343К,	3430,	343Р,	375К,
377К,	378Б,	378Ν,	3803,	380Т,	382Г,	382К,	3820,	382К,	3825,
382Т,	382ν,	382И,	382Υ,	423Ν,	427Ν,	430А,	430Г,	430Н,	4301,
430Ь,	430М,	430Ν,	4302,	430Е,	4303,	430ν,	430Υ,	431Н,	431К,
434Е,	434С,	434Н, 4	34М, 434Υ, 43	61, 4361, 438К, 4381, или	438И],

где моноклональное антитело, которое включает вариант области Рс, демонстрирует повышенное сродство связывания РсВи по сравнению с моноклональным антителом, включающим исходную область Рс.

В изобретении предлагается моноклональное антитело, которое включает вариант области Рс, включающий как минимум одну из следующих замен аминокислот в области

Рс: 2352, 236Υ,

237К,	237Р,	238Е,	2386,	238Н,	238И,	247Ά,	247Э,	247Е,	247Г
2 47С,	247Н,	2471,	2471,	247М,	247Ν,	2470,	247К,	2475,	247М
247Υ,	248А,	248Е,	248Р,	2480,	248М,	249Е,	2491,	249М,	249Υ,
251Р,	251Н,	2511,	251И,	254ϋ,	254Е,	254Е,	2546,	254Н,	2541,
2 54 К,	2541,	254М,	254Ν,	254Р,	2540,	254Н,	254Т,	254У,	254К,
254Υ,	255К,	255Ν,	256Е,	256Н,	2561,	256К,	256М,	256Р,	256М,

- 7 012464

256Υ,	2643,	2653,	265Υ,	267С,	2671,	268ϋ,	268Κ,	270Α,	270М,
2791,	279К,	279Ъ,	260Т,	292Е,	292Г,	292(3,	2921,	2921,,	31Ю,
311Е,	ЗИГ,	3113,	311Ν,	311К,	311Υ,	315Г,	315Κ,	315Ρ,	316?,
317Т,	326И,	327Т,	339Е,	339С,	339Ь,	339В,	34Ю,	341Ξ,	341Г,
3411,	341К,	341Ъ,	341М,	341Ν,	3410,	341К,	3413,	341Τ,	341У,
341И,	341Υ,	343М,	343ν,	343И,	373А,	373ϋ,	373С,	373Κ,	3731,,
373М,	373Ν,	3730,	3733,	373Т,	37 ЗУ,	373Н,	376Η,	3761.,	3 7 5И,
376Υ,	424М,	424ν,	4260,	42 ЭД,	429Е,	429М,	430ϋ,	4 ЗОН,	431Р,
432В,	4323,	4390, 440Ά,	4400,	440Е,	4 40Γ	или	440М
[предпочтительно ;	237В,	247Ό,	247Е,	247Г,	247Η,	2471,	247Ь,
247М,	247Ν,	2470,	247И,	247Υ,	248А,	248Г,	248Ρ,	2480,	248И,
249Ь,	249М,	249Υ,	251Н,	2511,	251И,	254ϋ,	254Ε,	254Е,	254(3,
254Н,	2541,	254К,	254М,	254Ν,	254Р,	2540,	254Β,	254Т,	254У,
254И,	254Υ,	255К,	255Ν,	256Г,	256Н,	256Κ,	256Μ,	256В,	256Й,
265Υ,	280Т,	292(3,	2921,	31Ю,	311Е,	3116,	311Ν,	315Г,	315Р,
316Т,	317Т,	327Т,	3410,	341Е,	341Г,	3411,	341Ь,	341Υ,	343К,
373А,	373(3,	373М,	3730,	376И,	376Υ,	424Μ,	424У,	4300,	430И,

431Е или 4323], где моноклональное антитело, которое включает вариант области Рс, демонстрирует сниженное сродство связывания РсКл по сравнению с моноклональным антителом, включающим исходную область Рс.

Ес: 236Υ, 244Ъ,

247А,	2470,	247Е,	2470,	247Ν,	2470,	247В,	2475,	247И,	248В,
2 4 8 Р,	2480,	248И,	249Е,	2491.,	249М,	249Ν,	249Р,	249Υ,	251Е,
251Е,	2511,	251И,	254А,	254Г,	254К,	254Ь,	254М,	254В,	254Υ,
255К,	256Ά,	256С,	2561,	256Ь,	256М,	256Р,	2560,	256И,	256Υ,
2603,	268ϋ,	2790,	2793,	279И,	279Υ,	280К,	280Т,	283Е,	283С,
283Н,	2831,	283К,	2830,	283М,	283Ν,	283Р,	283В,	2833,	283И,
2921,,	307А,	307М,	ЗИГ,	3111,	ЗПК,	зиь,	ЗИМ,	ЗИТ,	31ΐν,
ЗИИ,	311Υ,	312Р,	314Е,	3141,	314У,	314Н,	314Υ,	315Г,	315К,
315Ь,	315Р,	315К,	316К,	317Р,	317Т,	318Ν,	318Т,	332А,	3320,
332Е,	332Р,	3320,	3321,,	332М,	3320,	3323,	332Т,	3327,	332И,
332Υ,	339ϋ,	339Г,	3390,	339Н,	3391,	339К,	339Ν,	3390,	339В,
3395,	339Т,	339И,	339Υ,	34Ю,	341Е,	341Е,	341Н,	3411,	341К,

- 8 012464

3411,	341М,	341Ν,	341Р,	3410,	341В,	3415,	341Т,	34IV,	341И,
341Υ,	34 ЗА,	3430,	343Е,	3436,	343Н,	343К,	3431,,	343И,	343Ν,
3432,	343К,	3432,	343Т,	343И,	343Υ,	373ϋ,	373Е,	373Е,	373Н,
3731,	373К,	373Ъ,	373М,	373Ν,	3730,	373В,	373Т,	37 ЗУ,	373К,
375В,	37 6А,	376Г,	3760,	376Н,	3761,,	376Ν,	376Р,	3760,	376К,
3763,	376Т,	376У,	377Р,	379Ν,	3790,	3795,	379Т,	380А,	380Ν,
3803,	380Т,	3821,	3821,	3820,	382ν,	386К,	4260,	42 61,	429А,
429Е,	429М,	430А,	430Ώ,	430Г,	4300,	430Н,	4301,	430К,	4301,
430М,	430Ν,	430Р,	430В,	4303,	430Т,	430У,	430И,	430Υ,	431Н,
431Р,	432В,	4323	, 434И, 434Υ, 4381,, 438И, 4400 или	440Υ
[предпочтительно 236Υ,	248Е,	248Р,	2480,	248И,	249Е,	2491,
249М,	249Ν,	249Υ,	251Н,	2511,	251И,	254Е,	254К,	2541,	254М,
254В,	254Υ,	255К,	256А,	256С,	2561,	2561,	256М,	256Р,	2560,
256И,	2603,	280К,	283К,	307М,	311Г,	3111,	311К,	3111,	ЗИМ,
311Т,	3ΐιν,	311И,	311Υ,	3141,	314У,	314И,	314Υ,	315Р,	317Р,
3320,	3321,,	332М,	3323,	332И,	3390,	339Е,	3391,	339К,	339Ν,
3393,	339И,	339Υ,	34Ю,	341Е,	341Г,	341Н,	3411,	341К,	34И,
341М,	341Ν,	341Р,	3410,	341В,	3413,	341Т,	341У,	341И,	341Υ,
343Б,	343Е,	343С,	343Н,	343К,	343Ν,	3430,	343В,	3435,	343Т,
343Н,	343Υ,	373Е,	373Г,	373Н,	3731,	373К,	3731,	3730,	373В,
373Т,	373И,	37 6А,	3766,	376Ν,	376Р,	3760,	376В,	3765,	376Т,
376X7,	377Р,	379Ν,	3790,	379Т,	3821,	3820,	386К,	426ϋ,	426Ь,
429Г,	429М,	4 30А,	430ϋ,	430Е,	430С,	430Н,	4301,	430К,	430Ъ,
430М,	430Ν,	430Р,	430В,	4303,	430Т,	4 30У,	430И,	430Υ,	431Н,
431Р,	434Υ,	4381,	или	440Υ],

где моноклональное антитело, которое включает вариант области Ес, демонстрирует повышенную СЭС активность по сравнению с моноклональным антителом, включающим исходную область Ес.

Вс: 2350, 2353

236В,	237Е,	237К,	237Ν,	237В,	238А,	238Е,	238(3,	238Н,	2381,
238Σ,	238У,	238Н,	238Υ,	245В,	247Н,	2471,	2471,	247Т,	247Υ,
250М,	252Υ,	254ϋ,	254Е,	2541,	254Р,	2540,	254Т,	254У,	255Ν,
257А,	2571,	257М,	257Ν,	2575,	257У,	2621,	2645,	265Н,	265Υ,
261(3,	267Н,	2671,	267К,	268К,	269Ν,	2690,	2700,	270М,	270Ν,
271Т,	272Н,	2721,	272Ν,	2 92А,	2935,	301И,	307Е,	311Е,	3115,
316Ε,	318Р,	327Т,	328У,	329Υ,	ЗЗОК,	330В,	332Е,	332М,	3431,
3735,	3780,	380Р,	382Р,	382Г,	382Ν,	382Р,	382В,	3825,	382Ν,
382Υ,	385Е,	385Р,	423Ν,	424Н,	424М	или 427Ν [предпочтительно
235С,	2355,	236В,	237Е,	237К,	2 37Ν,	237В,	238А,	238Е,	2385,
238Н,	2381,	238Ь,	238ν,	238И,	238Υ,	245В,	2471,	2471,	247Т,
2 5 ОМ,	257А,	2571,	257М,	2621,	2645,	267С,	267Н,	2671,	267К,
268К,	269Ν,	2690,	2700,	270М,	270Ν,	271Т,	272Н,	301И,	3115,
3271,	329Υ,	ЗЗОК, 3780,	385Е,	423Ν	или	424Н],

где моноклональное антитело, которое включает вариант области Ес, демонстрирует пониженную активность СЭС по сравнению с моноклональным антителом, включающим исходную область Ес.

Изобретение дополнительно включает моноклональное антитело, которое включает вариант облас- 9 012464 ти Ес по изобретению, где указанное антитело специфически связывается с целевым антигеном человека. Предпочтительно целевой антиген выбирается из группы, которая состоит из СЭ3, СЭ20, СЭ25, ΤΝΡα, Нег2/пеи, СП33, СП52, ЕСЕЯ, ЕрСАМ, МиС1, 6Ό3, СЕА, СА125, НЬА-ПЯ, ТСЕЗ, УБОЕ, (ЮЕХ 6ПЕ11, грелина или любого их предшественника или функционального фрагмента.

В изобретении предлагается вариант полипептида, который включает вариант области Ес, включающий как минимум одну из следующих замен аминокислот в области

			Ес:	2381,	2441,	245К,
249Р,	252Υ,	256Р,	257А,	2571,	257М,	257Ν,	2573,	257У,	258ϋ,
2603,	2621.,	270К,	2721.,	272К,	279А,	2796,	2790,	279Н,	279Μ,
279Ν,	2792,	279К,	2793,	279Т,	279И,	279Υ,	283А,	283ϋ,	283Γ,
2836,	283Н,	2831,	283К,	283Ь,	283Ν,	283Р,	2830,	283Κ,	2835,
283Т,	283Н,	283Υ,	285Ν,	286Е,	288Ν,	288Р,	293У,	307Ε,	307Μ,
ЗИА,	3111,	311К,	3111.,	ЗИМ,	31ΐν,	ЗИН,	312Р,	316Κ,	317Ρ,
318Ν,	318Т,	332Г,	332Н,	332К,	3321.,	332М,	332Е,	3323,	332Η,
339Ν,	339Т,	339Н,	341Р,	343Е,	343Н,	343К,	3430,	343Κ,	343Τ,
343Υ,	375К,	3766,	3761,	376М,	376Р,	376Т,	37 6ν,	377Κ,	378ϋ,
378Ν,	380Ν,	3803,	380Т,	382Г,	382Н,	3821,	382К,	3821,	382Μ,
382Ν,	3820,	382Н,	3823,	382Т,	382ν,	382К,	382Υ,	423Ν,	427Ν,
430А,	430Г,	4306,	430Н,	4301,	430К,	4301,	430М,	430Ν,	4300,

4 30Ρ.,	4305,	430Τ,	430ν,	430Υ,	431Η,	431К,	434Γ,	4346,	434Η,
434И,	434Υ,	4361,	436Ь,	436Τ,	438Κ, 4381, 438Τ, 438Η, 440Κ или
442Κ	[предпочтительно 245Ε, 252Υ, 256Ρ	, 257А,	2571,	257Μ,	257Ν,
2573,	257ν,	2580,	2603,	2621.,	279Α,	279ϋ,	2796,	279Η,	279Ν,
27 90,	2795,	279Τ,	279И,	279Υ,	283Ρ,	283Η,	283Κ,	283Ρ,	285Ν,
286Ε,	307Ε,	307Μ,	3111,	ЗИК,	3111,	ЗИМ,	312Ρ,	31831,	318Τ,
3323,	339И,	343Ε,	343Η,	343Κ,	3430,	343Ρ,	375Ρ,	377Κ,	378ϋ,
378Ν,	3803,	380Τ,	382Γ,	392Κ,	3820,	382Κ,	3825,	382Τ,	382ν,
382И,	382Υ,	423Ν,	427Ν,	4 30Α,	430Γ,	430Η,	4301,	430Ь,	430Μ,
430Ν,	4300,	430Κ,	4303,	4307,	430Υ,	431Η,	431Κ,	434Γ,	4346,
434Η,	4 34И,	434Υ,	4361, 4361, 4	38Κ, 4 381. или	438Η],

где вариант полипептида демонстрирует увеличенный период полужизни в сыворотке в сравнении с исходным полипептидом (т. е. полипептидом, идентичным варианту полипептида, но без аминокислотной замены, перечисленной здесь выше).

В изобретении предлагается вариант полипептида, который включает вариант области Ес, включающий как минимум одну из следующих замен аминокислоты в области

Ес: 2350, 236Υ, 237К,

- 10 012464

237?,	238Е,	238С,	238Η,	238ГС,	247Α,	2470,	247Ε,	247Γ,	2476,
247Н,	2471,	2475,	247Μ,	247Ν,	2472,	247Ρ,	2475,	247И,	247Υ,
2 4 8А,	248Г,	248Р,	248Ω,	248И,	249Ε,	2495,	249Μ,	249Υ,	251Ε,
251Н,	2511,	251И,	254ϋ,	254Ε,	254Ε,	2546,	254Η,	2541,	254Κ,
2545,	254М,	254Ν,	254Ρ,	2542,	254Κ,	254Τ,	2544,	254И,	254Υ,
255К,	255Ν,	256Г,	256Η,	2561,	256Κ,	256Μ,	256Η,	256Μ,	256Υ,
2643,	2655,	265Υ,	2676,	2671,	26817,	268Κ,	270Α,	270Μ,	2791,
279К,	2795,	280Т,	292Ε,	292Γ,	2926,	2921,	2925,	3110,	311Ε,
311Р,	3116,	311Ν	311Κ,	311Υ,	315Γ,	315Κ,	315Ρ,	316Γ,	317Τ,
326Ν,	327Т,	339Е,	3396,	3395,	339Η,	34Ю,	341Ε,	341Ε,	3411,
341К,	3415,	341М,	341Ν,	3410,	341Κ,	3413,	341Τ,	34ΐν,	341И,
341Υ,	343М,	343У,	343И,	373Α,	37 3ϋ,	373С,	373Κ,	3735,	373Μ,
37 3Ν,	3730,	3735,	373Τ,	37 ЗУ,	373И,	376Η,	3765,	376Ν,	376Υ,
424М,	424У,	426ϋ,	429Α,	429Γ,	429Μ,	430ϋ,	430И,	431Ρ,	432Κ,
4323,	4392,	44017,	440Ε,	44ΟΓ или 440Μ [предпочтительно	237Ρ,
2470,	247Е,	247Г,	247Η,	247Ь,	247Μ,	247Ν,	2472,	2471ί,	247Υ,
248А,	248Г,	248Р,	2480,	248И,	2495,	249Μ,	249Υ,	251Η,	2511,
251И,	254ϋ,	254Е,	254Γ,	254(3,	254Η,	2541,	254Κ,	254Μ,	254Ν,
254Р	, 2542,	254Н,	254Τ,	254ν,	254Η,	254Υ,	255Κ,	255Ν,	256Γ,
25611	, 256К,	256М,	256Κ,	256И,	265Υ,	280Τ,	2926,	2921,	31Ю,
311Е	, 3116,	311Ν,	315Ρ,	315Ρ,	316Τ,	317Τ,	327Τ,	3410,	341Ε,
341Г	, 3411,	3411,,	341Υ,	343Ν,	373Α,	3733,	373Μ,	3730,	376И,
37 6Υ	, 424М,	424У,	, 43017	, 4 ЗОИ	, 431Ρ	или	4323],

где вариант полипептида демонстрирует уменьшенный период полужизни в сыворотке в сравнении с исходным полипептидом (т.е. полипептидом, идентичным варианту полипептида, но без аминокислотной замены, перечисленной здесь выше).

В одном осуществлении изобретения предлагается способ увеличения активности ЛЭСС моноклонального антитела, предпочтительно терапевтического моноклонального антитела (или его функционального фрагмента), который включает создание нуклеиновой кислоты, включающей нуклеиновую кислоту, кодирующую вариант области Рс, который включает как минимум одну из следующих замен аминокислот:

247А, 247Е, 247Н, 2471, 2475,

24 7Μ,	247Τ,	247ν,	247Υ,	249Ε,	249Υ,	251Γ,	254Γ,	254Μ,	254Υ,
256Α,	256Μ,	258Э,	268ϋ,	268Ε,	279Α,	2 8 0Α,	280Κ,	283Α,	2831,
283Κ,	283Μ,	283Κ,	288Ν,	292Α,	311Α,	31Ю,	311Ν,	31ΙΤ,	3ΐιν,
311Υ,	3155,	318Ν,	318Ρ,	318Τ,	318У,	330Κ,	332Τ,	332У,	339ϋ,
339Γ,	3396,	3391,	339Κ,	339Μ,	339Ν,	3390,	339Κ,	3393,	339Τ,
376Α,	376У,	3776,	377Κ,	379Ν,	380Ν,	3805,	382Α,	3821,	385Ε,
427Μ,	429Μ,	434И, 4	361,	4406,	440Η,	4401	или	4405
[предпочтительно	247Α,	247Ε,	247Μ,	247Τ,	247ν,	247Υ,	254Γ,
254Υ,	2580,	279Α,	283Μ,	288Ν,	292Α,	31Ю,	311Ν,	311Τ,	3155,
318Ν,	318Ρ,	318Τ,	318У,	339ϋ,	3391,	339Κ,	339Μ,	339Ν,	3390,

339К, 3393, 376А, 316У, 377К, 379Ν, 380Ν, 382А, 4401 или 4405].

Может быть создана молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая вариант области Рс (например, из молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей исходную область Рс или природную область Рс), с включением как минимум одной замены аминокислоты, как перечислено выше, причем или молекула

- 11 012464 нуклеиновой кислоты функционально присоединяется к дополнительной кодирующей антитело нуклеиновой кислоте (например, последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей остальную часть тяжелой цепи 1д), или способ может дополнительно включать последующее функциональное связывание нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант области Ее (т.е. после введения как минимум одной замены аминокислоты из перечисленных выше) с дополнительной кодирующей антитело нуклеиновой кислотой. Способ может дополнительно включать экспрессию и очистку моноклонального антитела, которое включает вариант области Ес. Способ может дополнительно включать экспрессию и очистку моноклонального антитела, которое включает исходную область Ес. Способ может дополнительно включать измерение активности ЛИСС моноклонального антитела, которое включает вариант области Ес, и моноклонального антитела, включающего исходную область Ес, любым способом, известным в данной области техники или описанным здесь. Способ может дополнительно включать отбор моноклонального антитела, которое включает вариант области Ес, с более высокой активностью ЛИСС, чем у моноклонального антитела, включающего исходную область Ес (т.е. увеличенной, предпочтительно как минимум на 5, 10, 12, 14, 16, 18, 20% или более). Изобретение дополнительно включает моноклональное антитело или его функциональный фрагмент, включающие вариант области Ес, полученный согласно данному способу.

В одном осуществлении изобретения предлагается способ уменьшения активности ЛИСС моноклонального антитела, предпочтительно терапевтического моноклонального антитела (или его функционального фрагмента), который включает создание нуклеиновой кислоты, включающей нуклеиновую кислоту, кодирующую вариант области Ес, который включает как минимум одну из следующих замен аминокислот:

235Ώ, 235В, 2353, 236Г, 236В,

236Υ,	237Е,	237К,	237Ν,	237В,	238Е,	2380,	238Н,	2381,	23811,
238ν,	238И,	238Υ,	2470,	247В,	24911,	249Р,	250К,	250М,	250В,
251Н,	2511,	251И,	252Υ,	2541,	254Р,	52542,	254Т,	254ν,	256ν,
25'Ά,	2571,	257М,	257Ν,	2575,	257ν,	2605,	26211,	2645,	265Н,
265К,	2653,	2670,	3267Н,	2671,	267К,	269Ν,	2692,	270А,	2700,
270К,	270М,	270Ν,	271Т,	272Н,	272К,	272Ь,	272Ν,	272В,	279ϋ,
279Е,	279К,	279Ь,	279И,	283ϋ,	2ВЗЕ,	2838,	283Н,	283Ь,	283Т,
283И,	233Υ,	285Ν,	288Р,	292Е,	292Е,	2920,	2921,	2935,	293ν,
301И,	304Е,	307А,	307Е,	30714,	311Е,	3111,	311К,	3115,	312Р,
314Е,	3141,	314У,	314И,	315Г,	315Р,	316Г,	317Р,	327Т,	328ν,
329Υ,	3320,	332К,	332Σ,	332В,	332И,	3410,	341Е,	34 1Г,	341Η,
3411,	341К,	341Ь,	341М,	341Ν,	341Р,	3412,	341В,	3413,	341Τ,
34114,	341Υ,	343А,	343Р,	343Е,	343Г,	3430,	343Н,	34 31,	34 ЗМ,
343Ν,	3430,	343К,	3433,	343Т,	343ν,	343И,	343Υ,	37 ЗА,	373ϋ,
373Е,	373Е,	3730,	3731,	373К,	3731,	373М,	373Ν,	3732,	373Ε,
3733,	373Т,	373ν,	373И,	375В,	376А,	376Е,	376Е,	3760,	376Η,
37 6И,	376Υ,	3792,	382Р,	3823,	4 29А,	429Е,	430Н,	430К,	4 30Μ,
4302,	430В,	430И,	432В,	4328,	4341, 440Р, 4	4ОТ, 44ОУ или	442Κ
[предпочтительно	235В,	236Г,	236К,	236Υ,	237Е,	237К,	237Ν,
237В,	238Е,	2380,	238Н,	2381,	2381,	238У,	238И,	238Υ,	247В,
24 9Р,	250К,	251Н,	254Т,	2571,	257М,	257Ν,	2573,	257\7,	265Н,
265К,	2658,	2670,	267Н,	2671,	267К,	269Ν,	2692,	270А,	2700,
2 7 ОК,	270М,	270Ν,	271Т,	272В,	28ΘΡ,	292Е,	301И,	304Е,	316Г,
317Р,	327Т,	329Υ,	332К,	332В,	341Е,	3411,	341М,	341Р,	341(2,
341В,	341Т,	341Н,	341Υ, 4 2 9А	343И, , 432В	373А, 373Е, или 4328].	3730,	3735,	376й,

Может быть создана молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая вариант области Ес (например, из молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей исходную область Ес или природную область Ес), с включением как минимум одной замены аминокислоты из перечисленных выше, при этом либо молекула нуклеиновой кислоты функционально присоединяется к дополнительной кодирующей антитело нук

- 12 012464 леиновой кислоте (например, последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей остальную часть тяжелой цепи 1д), либо способ может дополнительно включать последующее функциональное присоединение нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант области Ре (т.е. после введения как минимум одной замены аминокислоты из перечисленных выше), к дополнительной кодирующей антитело нуклеиновой кислоте. Способ может дополнительно включать экспрессию и очистку моноклонального антитела, которое включает вариант области Рс. Способ может дополнительно включать экспрессию и очистку моноклонального антитела, которое включает исходную область Рс. Способ может дополнительно включать измерение активности АИСС моноклонального антитела, которое включает вариант области Рс, и моноклонального антитела, которое включает исходную область Рс, любым способом, известным в данной области техники или описанным здесь. Способ может дополнительно включать отбор моноклонального антитела, которое включает вариант области Рс, с активностью АЭСС ниже, чем у моноклонального антитела, включающего исходную область Рс (т.е. уменьшенной, предпочтительно как минимум на 5, 10, 12, 14, 16, 18, 20% или более). Изобретение дополнительно включает моноклональное антитело или его функциональный фрагмент, которые включают вариант области Рс, полученный согласно данному способу.

В одном осуществлении изобретения предлагается способ увеличения сродства связывания РсВи моноклонального антитела, предпочтительно терапевтического моноклонального антитела (или его функционального фрагмента), который включает создание нуклеиновой кислоты, включающей нуклеиновую кислоту, кодирующую вариант области Рс, который включает как минимум одну из следующих замен аминокислот:

238Ь, 244Ь, 245В, 249Р, 252Υ,

256Р,	257А,	2571,	257М,	257Ν,	2573,	257ν,	258ϋ,	2603,	2620,
270К,	2720,	272К,	279А,	279Э,	2795,	279Н,	279М,	279Ν,	2790,
279В,	2798,	279Т,	279И,	279Υ,	283А,	283ϋ,	283Г,	2835,	283Н,
2831,	283К,	2831,	283Ν,	283Р,	2830,	283В,	2835,	283Т,	283И,
283Υ,	285Ν,	286Г,	288Ν,	288Р,	293ν,	307Α,	307Е,	307М,	ЗИА,
3111,	311К,	3111,	ЗИМ,	311У,	ЗИН,	312Ρ,	316К,	317Р,	318Ν,
318Т,	332Г,	332Н,	332К,	332Ь,	332М,	332В,	3325,	332П,	339Ν,
339Т,	339Ν,	341Р,	343Е,	343Н,	343К,	3430,	343К,	343Т,	343Υ,
375В,	3765,	3761,	376М,	376Р,	376Т,	376ν,	377К,	3780,	378Ν,
380Ν,	3803,	380Т,	382Г,	382Н,	3821,	382К,	3821,,	382М,	382Ν,
3820,	382К,	3823,	382Т,	382У,	382Н,	382Υ,	423Ν,	427Ν,	430А,
430Г,	4305,	430Н,	4301,	430К,	4301,,	430М,	430Ν,	4300,	430К,
4303,	430Т,	430ν,	430Υ,	431Н,	431К,	434Г,	4345,	434Н,	434И,
434Υ,	4361,	4360,	436Т,	438К,	4361,,	438Т, 4	38И, 440К или 442К
[предпочтительно 245В,	252Υ,	256Р,	257А,	2571,	257М,	257Ν,
2573,	257У,	2580,	262Ь,	27 9Ά,	279β,	2795,	279Н,	279Ν,	2790,
2793,	279Т,	279Ν,	279Υ,	263Е,	283Н,	283К,	283В,	285Ν,	286Г,
307А,	307Е,	307М,	3111,	зик,	3111,	ЗИМ,	312Р,	318Ν,	318Т,
3323,	339Н,	343Е,	343Н,	343К,	3430,	343В,	375В,	377К,	378ϋ,
378Ν,	3805,	380Т,	382Г,	382К,	3820,	382В,	3823,	38 2Т,	382ν,
382Н,	382Υ,	423Ν,	427Ν,	430А,	430Г,	430Н,	4301,	430Σ,	430М,
430Ν,	4300,	430В,	4305,	430У,	430Υ,	431Н,	431К,	434Г,	4346,
434Н,	434И,	434Υ,	4361,	436Ь, 438К, 4	381, или	438К]

Может быть создана молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая вариант области Рс (например, из молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей исходную область Рс или природную область Рс), с включением как минимум одной замены аминокислоты из перечисленных выше; при этом либо эта молекула нуклеиновой кислоты функционально присоединяется к дополнительной кодирующей антитело нуклеиновой кислоте (например, последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей остальную часть тяжелой цепи 1д), либо способ может дополнительно включать последующее функциональное присоединение нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант области Рс (т.е. после введения как минимум одной замены аминокислоты из перечисленных выше), к дополнительной кодирующей антитело нуклеи

- 13 012464 новой кислоте. Способ может дополнительно включать экспрессию и очистку моноклонального антитела, которое включает вариант области Ре. Способ может дополнительно включать экспрессию и очистку моноклонального антитела, которое включает исходную область Рс. Способ может дополнительно включать измерение сродства связывания РсКп моноклонального антитела, которое включает вариант области Рс, и моноклонального антитела, которое включает исходную область Рс, любым способом, известным в данной области техники или описанным здесь. Способ может дополнительно включать отбор моноклонального антитела, которое включает вариант области Рс, со сродством связывания РсКп, большим, чем сродство связывания РсКп моноклонального антитела, которое включает исходную область Рс (т.е. увеличенной, предпочтительно как минимум на 5, 10, 12, 14, 16, 18, 20% или более). Изобретение дополнительно включает моноклональное антитело или его функциональный фрагмент, которые включают вариант области Рс, полученный согласно данному способу.

В одном осуществлении изобретения предлагается способ увеличения ίη νίνο периода полужизни полипептида в сыворотке, предпочтительно терапевтического полипептида, который включает создание нуклеиновой кислоты, включающей нуклеиновую кислоту, кодирующую вариант области Рс, который включает как минимум одну из следующих замен аминокислот:

			23ВЬ,	244Ь,	245В,	, 249Р	Г
252Υ,	256Р,	257А,	2571,	257М,	257Ν,	2573,	257ν,	258ϋ,	2603,
2621,,	270К,	272Ь,	272В,	27 9А,	279ϋ,	279С,	279Н,	279М,	279Ν,
2790,	279В,	2793,	279Т,	279П,	279Υ,	283А,	283Р,	283Г,	2836,
283Н,	2831,	283К,	283Ь,	283Ν,	283Р,	2930,	283В,	2833,	283Т,
283К,	283Υ,	285Ν,	286Е,	288Ν,	288Р,	293ν,	307А,	307Е,	307М,
ЗИЛ,	3111,	311К,	311Ь,	ЗИМ,	31ΐν,	ЗИИ,	312Р,	316К,	317Р,
318Ν,	318Т,	332Г,	332Н,	332К,	3321,,	332Μ,	332В,	3325,	332И,
339Ν,	339Т,	339И,	34ΙΡ,	343Е,	343Н,	343Κ,	3430,	343К,	343Т,
343Υ,	375К,	3760,	3761,	376М,	376Р,	376Τ,	376ν,	377К,	378Р,
378Ν,	380Ν,	3805,	380Т,	382Е,	382Н,	3821,	382К,	3821,,	382М,
382Ν,	3820,	382В,	3823,	382Т,	382ν,	382И,	382Υ,	423Ν,	427Ν,
430А,	430Г,	430С,	430Н,	4301,	430К,	430Ь,	430М,	430Ν,	4300,
430В,	4303,	430Т,	430ν,	430Υ,	431Н,	43ΙΚ,	434Р,	4346,	434Н,
434Н,	434Υ,	4361,	436Ь,	436Т, 438К, 438Ь, 438Т, 438И, 440К или
442К	[предпочтительно 245В, 252Υ, 256Р	, 257А,	2571,	257М,	257Ν,
2573,	257ν,	258Б,	262Ь,	279А,	279ϋ,	2796,	279Н,	279Ν,	2790,
2793,	279Т,	279И,	279Υ,	283Г,	283Н,	283К,	283В,	285Ν,	286Г,
307А,	307Е,	307М,	3111,	ЗИК,	ЗИЬ,	ЗИМ,	312Р,	318Ν,	318Т,
3325,	339И,	343Е,	343Н,	343К,	3430,	343В,	375В,	377К,	378ϋ,
378Ν,	3303,	380Т,	382Г,	382К,	3822,	382К,	3825,	382Т,	382ν,
382И,	382Υ,	423Ν,	427Ν,	4 30А,	430Р,	430Н,	4301,	4301,,	430М,
430Ν,	4300,	430В,	4303,	430У,	430Υ,	431Н,	431К,	434Г,	4346,
434Н,	434Н,	434Υ,	4361,	436Ь,	438К,	4381, или 438И] .

Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая вариант области Рс, может быть функционально связана с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей терапевтический белок. Может быть создана молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая вариант области Рс (например, из молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей исходную область Рс или природную область Рс) с включением как минимум одной замены аминокислоты из перечисленных выше, при этом молекула нуклеиновой кислоты функционально связывается с дополнительной кодирующей полипептид нуклеиновой кислотой (например, последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей отличную от Рс область слитого белка), или способ может дополнительно включать последующее функциональное присоединение нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант области Рс, после введения, как минимум, одной замены аминокислоты из перечисленных выше, к нуклеиновой кислоте, кодирующей отличный от Рс партнера слияния. Способ может дополнительно включать экспрессию и очистку полипептида, включающего вариант области Рс. Способ может дополнительно включать экспрессию и очистку полипептида, включающего исходную область Рс. Способ может дополнительно включать измерение периода полужизни в сыворотке ίη νίνο полипептида,

- 14 012464 включающего вариант области Ее, и полипептида, включающего исходную область Ее, любым способом, известным в данной области техники или описанным здесь. Способ может дополнительно включать отбор полипептида, который включает вариант области Ее, где период полужизни полипептида в сыворотке ίη νίνο увеличен по сравнению с полипептидом, включающим исходную область Ес (т.е. увеличен, предпочтительно как минимум на 5, 10, 12, 14, 16, 18, 20% или более). Изобретение дополнительно включает полипептид (т.е. полипептид слияния), который включает вариант области Ес, полученный согласно данному способу.

В одном осуществлении изобретения предлагается способ уменьшения сродства связывания ЕсКи моноклонального антитела, предпочтительно терапевтического моноклонального антитела (или его функционального фрагмента), который включает создание нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант области Ес, включающего, как минимум, одну из следующих замен аминокислот:

				235<2, 236Υ,
237К,	237В,	238Е,	2380,	238Н, 238И,	24 7А,	247Р,	247Е,	247Г,
24 7С,	247Н,	2471,	247Ь,	247М, 247Ν,	2472,	247В,	2475,	247И,
247Υ,	248А,	2480,	248Р,	2482, 248И,	249Е,	2491,	249М,	249Υ,
251Г,	251Н,	2511,	251И,	2540, 254Е,	254Г,	2540,	254Н,	2541,
25ΊΚ,	2541,,	254М,	254Ν,	254Р, 2542,	254В,	254Т,	254ν,	254И,
254Υ,	255К,	255Ν,	2560,	256Н, 2561,	256К,	256М,	256Н,	256Н,
255Υ,	2643,	2653,	265Υ,	52670, 2671,	2680,	268К,	240Ά,	270М,
2791,	279К,	2790,	280Т,	292Е, 2920,	2920,	2921,	292Ь,	31Ю,
311Е,	ЗИГ,	3110,	ЗИМ,	ЗИН, 311Υ,	315Г,	315К,	315Р,	3160,
317Т,	326И,	327Т,	339Е,	3390, 339Ь,	339К,	3410,	341Е,	3410,
3411,	341К,	341Ь,	341М,	341Ν, 3412,	341В,	3413,	341Т,	34ΐν,
34 Ж,	341Υ,	343М,	343У,	343И, 373А,	373ϋ,	3730,	373К,	373Ь,
373М,	373Ν,	3732,	3733,	373Т, 373У,	373Н,	376Н,	37 бЬ,	376И,
376Υ,	424М,	424ν,	4260,	429А, 429Г,	429М,	4300,	4 ЗОИ,	431Р,
432В,	4323,	4341,	4390	, 440А, 4400, 440Е, 440Г или	4 4 ОМ
[предпочтительно 237В, 247Р, 247Е,	2470,	247Н,	247Ь,	247М,
247Ν,	2472,	247И,	247Υ,	248А, 248Г,	248Р,	2482,	2482,	249Ь,
249М,	249Υ,	251Н,	2511,	251И, 254ϋ,	254Е,	254Г,	2540,	254Н,
2541,	254К,	254М,	254Ν,	254Р, 254В,	254Т,	254ν,	254И,	254Υ,
255К,	255Ν,	256Г,	256Н,	256К, 256М,	256В,	256Н,	2 65Υ,	280Т,
2 920,	2921,	31Ю,	311Е,	311С, 311Ν,	315Г,	315Р,	316Т,	317Т,
327Т,	34Ю,	341Е,	341Г,	341Ь, 341Υ,	343Н,	373А,	3730,	373М,
3732,	376И, 376Υ, 424М, 4	24У, 430ϋ, 430Н, 43ΙΡ или	4323].

Может быть создана молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая вариант области Ес (например, из молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей исходную область Ес или природную область Ес), с включением, как минимум, одной замены аминокислоты из перечисленных выше, при этом нуклеиновая кислота, кодирующая вариант области Ес, функционально присоединяется к нуклеиновой кислоте, кодирующей дополнительную последовательность антитела (например, последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей остальную часть тяжелой цепи 1д), или способ может дополнительно включать последующее функциональное присоединение нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант области Ес после введения как минимум одной замены аминокислоты из перечисленных выше, к дополнительной кодирующей антитело нуклеиновой кислоте. Способ может дополнительно включать экспрессию и очистку моноклонального антитела, которое включает вариант области Ес. Способ может дополнительно включать экспрессию и очистку мсноклонального антитела, которое включает исходную область Ес. Способ может дополнительно включать измерение сродства связывания ЕсКи моноклонального антитела, которое включает вариант области Ес, и моноклонального антитела, которое включает исходную область Ес, любым способом, известным в данной области техники или описанным здесь. Способ может дополнительно включать отбор моноклонального антитела, которое включает вариант области Ес, со сродством связывания ЕсКи ниже, чем у моноклонального антитела, включающего исходную область Ес

- 15 012464 (т.е. уменьшенным, предпочтительно как минимум на 5, 10, 12, 14, 16, 18, 20% или больше). Изобретение дополнительно включает моноклональное антитело (которое включает вариант области Ес), полученное согласно данному способу.

В другом существлении изобретения предлагается способ уменьшения периода полужизни в сыворотке ίη νινο полипептида, предпочтительно терапевтического полипептида, который включает создание нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант области Ес, включающий как минимум одну из следующих замен аминокислот:

2350,	236Υ,	237К,	237К,	238Е,	2386,	238Η,	238И,	247Α,	247Э,
247Е,	247Г,	2476,	247Н,	2471,	2471,,	247Μ,	247Ν,	2470,	247Β,
2475,	247И,	247Υ,	248А,	248Г,	248Р,	2480,	248Η,	249Ε,	2491,,
24 9М,	249Υ,	251Г,	251Н,	2511,	251И,	254ϋ,	254Ε,	254Ε,	2546,
254Н,	2541,	254К,	2541,,	254М,	254Ν,	254Ρ,	2540,	254Β,	254Τ,
2547,	254Ν,	254Υ,	255К,	255Ν,	256Г,	256Η,	2561,	25 6Κ,	2 5 6Μ,
256В,	256Н,	256Υ,	2643,	2653,	265Υ,	32676,	2671,	268ϋ,	268Κ,
270А,	270М,	2791,	279К,	279Е,	280Т,	292Ε,	292Ε,	2926,	2921,
2921,	31Ю,	311Е,	ЗИГ,	3116,	311Ν,	311Η,	311Υ,	315Γ,	315Κ,
315Р,	316Г,	317Т,	326И,	327Т,	339Е,	3396,	3391,,	339Ε-,	34Ю,
3413,	341Р,	3411,	341К,	341Ь,	341М,	341Ν,	34Ю,	341Η,	3415,
341Τ,	341У,	341И,	341Υ,	34 ЗМ,	343ν,	343Ή,	373Α,	3730,	3736,
373К,	3731,,	373М,	373Ν,	3730,	3733,	373Τ,	373ν,	373Η,	376Η,
376Ь,	37 6И,	376Υ,	424М,	424ν,	426Р,	42 9Α,	429Ε,	429Μ,	430ϋ,
4 ЗОИ,	431Р,	432К,	4323,	4341, 4390, 440А, 44	Οϋ, 440Ε, 44	ОГ или
440М	[предпочтительно 237В, 2470	', 247Ε	, 247Γ,	247Η,	2471,	247Μ,
247Ν,	2470,	247И,	247Υ,	248А,	248Ε,	248Ρ,	2480,	248О,	2491,,
249М,	24 9Υ,	251Н,	2511,	251И,	2540,	254Ε,	254Γ,	2546,	254Η,
2541,	254К,	254М,	254Ν,	254Р,	254Κ,	254Τ,	254ν,	254И,	254Υ,
255К,	255Ν,	256Г,	256Н,	256К,	256Μ,	256Κ,	256Η,	265Υ,	280Τ,
2925,	2921,	31Ю,	311Е,	3116,	311Ν,	315Γ,	315Ρ,	316Τ,	317Τ,
327Т,	34Ю,	341Е,	341Г,	3411,,	341Υ,	343Κ,	373Α,	3736,	373Μ,
3730,	376И,	376Υ,	424М,	424У,	430ϋ,	430Ю,	431Ρ	или	4325].

Нуклеиновая кислота, кодирующая вариант области Ес, может быть функционально связана с нуклеиновой кислотой, кодирующей терапевтический белок. Может быть создана молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая вариант области Ес (например, из молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей исходную область Ес или природную область Ес), с включением как минимум одной замены аминокислоты из перечисленных выше, при этом молекула нуклеиновой кислоты функционально присоединяется к дополнительной кодирующей полипептид нуклеиновой кислоте (например, последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей отличную от Ес область слитого белка), или способ может дополнительно включать последующее функциональное связывание нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант области Ес после введения как минимум одной замены аминокислоты из перечисленных выше, с нуклеиновой кислотой, кодирующей отличный от Ес партнер слияния. Способ может дополнительно включать экспрессию и очистку полипептида, включающего вариант области Ес. Способ может дополнительно включать экспрессию и очистку полипептида, включающего исходную область Ес. Способ может дополнительно включать измерение периода полужизни в сыворотке ίη νινο полипептида, включающего вариант области Ес, и полипептида, включающего исходную область Ес, любым способом, известным в данной области техники или описанным здесь. Способ может дополнительно включать отбор полипептида, который включает вариант области Ес, где период полужизни полипептида в сыворотке ίη νινο уменьшен по сравнению с полипептидом, включающим исходную область Ес (т.е. уменьшение, предпочтительно как минимум на 5, 10, 12, 14, 16, 18, 20% или больше). Изобретение дополнительно включает полипептид (т.е. слитый полипептид), который включает вариант области Ес, полученный согласно данному способу.

В другом осуществлении изобретения предлагается способ увеличения активности СЭС монокло- 16 012464 нального антитела, предпочтительно моноклонального терапевтического антитела, который включает конструирование области Ес антитела с включением как минимум одной из следующих замен аминокислот:

236Υ,	2440,	247А,	2470,	247Ε,	2476,	247Ν,	2470,	24 7В,	2475,
247И,	248В,	248Р,	2480,	248Η,	249Е,	2490,	249М,	249Ν,	249Р,
249Υ,	250К,	250В,	251Р,	251Η,	2511,	251И,	254А,	254Е,	254К,
2541,,	254М,	254В,	254Υ,	255Κ,	2 5 6А,	2566,	2561,	2560,	256М,
256Р,	2560,	256И,	256Υ,	2603,	2680,	2790,	2795,	279И,	279Υ,
280К,	280Т,	283Е,	2836,	283Η,	2831,	283К,	2830,	283М,	283Ν,
283Р,	283В,	2835,	283И,	292Ь,	307А,	307М,	ЗИГ,	3111,	ЗИК,
3110,	ЗИМ,	ЗИТ,	31ΐν,	ЗИИ,	311Υ,	312Р,	314Г,	3141,	314ν,
314И,	314Υ,	315Е,	315К,	3150,	315Р,	315В,	316К,	317Р,	317Т,
ЗИМ,	318Т,	332А,	332ϋ,	332Е,	332Е,	3326,	332Н,	3320,	332М,
332Ν,	332(2,	3325,	332Т,	332ν,	332И,	332Υ,	339ϋ,	339Е,	3396,
339Н,	3391,	339К,	339Ν,	3390,	339В,	3395,	339Т,	339И,	339Υ,
3410,	341Е,	341В,	341Н,	3411,	341К,	3410,	341М,	341Ν,	341Р,
341(2,	341В,	3413,	341Т,	34ΐν,	341П,	341Υ,	343А,	343ϋ,	343Е,
3436,	343Н,	343К,	3430,	343Μ,	343Ν,	3430,	343В,	3435,	343Т,
343Ν,	343Υ,	373ϋ,	373Е,	373Ε,	373Н,	3731,	373К,	3730,	373М,
373Ν,	3730,	373В,	373Т,	373У,	373И,	375В,	376А,	376Е,	3766,
376Н,	3760,	376Ν,	376Р,	3760,	375В,	3765,	376Т,	376У,	377Р,
379Ν,	379(2,	3793,	379Т,	380Α,	380Ν,	3808,	380Т,	3821,	3820,
3820,	382У,	386К,	426ϋ,	4260,	429А,	429Е,	429М,	4 30А,	430ϋ,
4 30 В,	4306,	430Н,	4301,	430Κ,	4300,	430М,	430Ν,	430Р,	430В,
4305,	430Т,	430ν,	430И,	430Υ,	431Н,	431Р,	432В,	4325,	43414,
434Υ,	4380,	438Й,	4400	или 440Υ [предпочтительно	236Υ,	248В,
248Р,	248(2,	248И,	249Ε,	2491,,	24 9М,	249Ν,	249Υ,	250К,	250В,
251Н,	2511,	251И,	254Α,	254Е,	254К,	2540,	254М,	254К,	254Υ,

255К,

280К,

ЗИП,

332М,

339Т,

25бА,

283Н,

2566,

307М,

311Υ,

3323,

341М,

343Э,

339И,

341Ν,

343Е,

3141,

332И,

339Υ,

2561,

311Е,

314ν,

2560,

3111,

256М,

311К,

256Р,

3110,

343Υ,

373И,

377Р,

341Р,

3436,

373ϋ,

376А,

332Υ,

34Ю,

3410,

343Н,

373Е,

314И,

3390,

341Е,

341Й,

314Υ,

339В,

341Е,

3413,

2560,

256И, зим,

429Г,

429М,

379Ν,

430А,

3766,

3790,

4300,

430М,

431Р,

343К,

373Н,

6Ν,

379Т,

430Г,

343Ν,

31,

376Р,

3821,

4306,

315Р,

3391,

341Н,

341Т,

3430,

373К,

3762,

3820,

430Н,

317Р,

339К,

3411,

341У,

343В,

3730,

376В,

386К,

4301,

311Т,

3320,

339Ν,

2603,

31ΐν,

3320,

3393,

341К,

341И,

3435,

3730,

3763,

426ϋ,

430К,

3410,

341Υ,

343Т,

373В,

376Т,

4260,

4301.,

4305,

438Ь или 440Υ].

Может быть создана молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая вариант области Ес (например, из молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей исходную область Ес или природную область Ес), с включением как минимум одной замены аминокислоты из перечисленных выше, при этом молекула

430Ν,

432В,

430Р,

434Υ,

430В,

430Т, 430У, 430И, 430Υ, 431Н,

- 17 012464 нуклеиновой кислоты функционально связывается с дополнительной кодирующей антитело нуклеиновой кислотой (например, последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей остальную часть тяжелой цепи 1д), или способ может дополнительно включать последующее функциональное присоединение нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант области Ес после введения как минимум одной замены аминокислоты из перечисленных выше, к дополнительной кодирующей антитело нуклеиновой кислоте. Способ может дополнительно включать экспрессию и очистку моноклонального антитела, которое включает вариант области Ес. Способ может дополнительно включать экспрессию и очистку моноклонального антитела, которое включает исходную область Ес. Способ может дополнительно включать измерение активности СЭС моноклонального антитела, которое включает вариант области Ес, и моноклонального антитела, которое включает исходную область Ес, любым способом, известным в данной области техники или описанным здесь. Способ может дополнительно включать отбор моноклонального антитела, которое включает вариант области Ес, с большей активностью СЭС, чем у моноклонального антитела, которое включает исходную область Ес (т.е. увеличенной, предпочтительно как минимум на 5, 10, 12, 14, 16, 18, 20% или более). Изобретение дополнительно включает моноклональное антитело, которое включает вариант области Ес, полученный согласно данному способу.

В другом осуществлении изобретения предлагается способ уменьшения реакции СЭС моноклонального антитела, предпочтительно моноклонального терапевтического антитела, который включает конструирование области Ес антитела с включением как минимум одной из следующих замен аминокислот:

2358,	2355,	236В,	237Е,	237К,	237Ν,	237В,	238А,	238Е,	2388,
238Н,	2381,	238Ь,	238ν,	238«,	238Υ,	245В,	247Н,	2471,	2470,
247Т,	247Υ,	25ОМ,	252Υ,	254ϋ,	254Е,	2541,	254Р,	2540,	254Т,
2547,	255Ν,	257А,	2571,	257М,	257Ν,	2575,	257ν,	2620,	2643,
265Н,	265Υ,	2678,	267Н,	2671,	267К,	268К,	269Ν,	2690,	2708,
270М,	270Ν,	271Т,	272Н,	2721,,	272Ν,	292А,	2938,	301«,	307Е,
311Е,	3118,	316Р,	318Р,	327Т,	328ν,	329Υ,	ЗЗОК,	330В,	332К,
339Е,	339М,	3431,	3738,	3780,	3800,	382ϋ,	382Г,	382Ν,	382Р,
382К,	3828,	382«,	382Υ,	385Е,	385Р,	423Ν,	424Н, 424М или	427Ν
[предпочтительно 2358,	2355,	236В,	237Е,	237К,	237Ν,	237В,
238А,	238Е,	2388,	238Н,	2381,	2380,	238У,	238«,	238Υ,	245К,
2471,	2471,,	247Т,	250М,	257А,	2571,	257М,	2620,	2645,	2678,
267Н,	2671,	267К,	268К,	269Ν,	2690,	2708,	270М,	270Ν,	271Т,
272Н,	301«,	3115,	327Т,	329Υ, ЗЗОК, ЗЗОК, 3780, 385Е, 423Ν или

424Н].

Может быть создана молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая вариант области Ес (например, из молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей исходную область Ес или природную область Ес), с включением как минимум одной замены аминокислоты из перечисленных выше, при этом молекула нуклеиновой кислоты функционально присоединяется к дополнительной кодирующей антитело нуклеиновой кислоте (например, последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей остальную часть тяжелой цепи 1д), или способ может дополнительно включать последующее функциональное связывание нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант области Ес после введения как минимум одной замены аминокислоты из перечисленных выше, с дополнительной кодирующей антитело нуклеиновой кислотой. Способ может дополнительно включать экспрессию и очистку моноклонального антитела, которое включает вариант области Ес. Способ может дополнительно включать экспрессию и очистку моноклонального антитела, которое включает исходную область Ес. Способ может дополнительно включать измерение активности СЭС моноклонального антитела, которое включает вариант области Ес, и моноклонального антитела, включающего исходную область Ес, любым способом, известным в данной области техники или описанным здесь. Способ может дополнительно включать отбор моноклонального антитела, которое включает вариант области Ес, с активностью СЭС ниже, чем у моноклонального антитела, которое включает исходную область Ес (т.е. уменьшенной, предпочтительно как минимум на 5, 10, 12, 14, 16, 18, 20% или более). Изобретение дополнительно включает моноклональное антитело, которое включает вариант области Ес, полученный согласно данному способу.

В другом осуществлении изобретения предлагается изолированная молекула нуклеиновой кислоты, которая включает молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую вариант области Ес по изобретению или

- 18 012464 его функциональный фрагмент. Более предпочтительно изолированная молекула нуклеиновой кислоты включает нуклеиновую кислоту, которая кодирует полипептид, включающий вариант области Ес по изобретению. Предпочтительно вариант области Ес полипептида, кодируемый указанной нуклеиновой кислотой, включает замену аминокислоты, как показано в табл. 1, по сравнению с исходной областью Ес варианта. Предпочтительно полипептид представляет собой моноклональное антитело и даже более предпочтительно, моноклональное антитело представляет собой полноразмерное антитело или одноцепочечное антитело. Моноклональное антитело может быть гибридным, гуманизированным или человеческим моноклональным антителом.

В другом осуществлении изобретения предлагается вектор, предпочтительно (но не ограничиваясь этим) плазмида, рекомбинантный вектор экспрессии, вектор экспрессии дрожжей или ретровирусный вектор экспрессии, который включает полинуклеотид, кодирующий полипептид, включающий вариант области Ес полипептида по изобретению.

В другом осуществлении изобретения предлагается клетка-хозяин, которая включает молекулу нуклеиновой кислоты по данному изобретению. Предпочтительно клетка-хозяин по изобретению включает один или более векторов или конструктов, включающих молекулу нуклеиновой кислоты по данному изобретению. Клетка-хозяин по изобретению представляет собой клетку, в которую был введен вектор по изобретению (например, путем трансформации, преобразования, заражения, трансфекции, электропорации и т. п.), причем указанный вектор включает полинуклеотид, кодирующий полипептид, который включает вариант области Ес полипептида по изобретению. Вектор необязательно может быть стабильно включен в хромосому клетки-хозяина. Типы клеток-хозяев включают клетки млекопитающих, бактерий, дрожжей и растений. Предпочтительно клетка-хозяин представляет собой клетку СНО, клетку С08, клетку 8Р2/0, клетку N80, клетку дрожжей или производное или потомка любого предпочтительно го вида клеток.

В другом осуществлении изобретения предлагается фармацевтическая композиция, которая включает полипептид, включающий вариант области Ес по изобретению или его функциональный фрагмент. Предпочтительно полипептид представляет собой моноклональное антитело, даже более предпочтительно терапевтическое моноклональное антитело. Моноклональное антитело может быть гибридным, гуманизированным или человеческим моноклональным антителом. Альтернативно, полипептид может быть полипептидом, отличным от антитела, обладающим преимуществом измененного периода полужизни в сыворотке, что обеспечивается путем функционального связывания и совместной экспрессии с вариантом области Ес по изобретению. Фармацевтическая композиция по изобретению может дополнительно включать фармацевтически приемлемый носитель. В указанной фармацевтической композиции полипептид, который включает вариант области Ес, представляет собой активный ингредиент. Предпочтительно фармацевтическая композиция включает однородную или в значительной степени однородную популяцию моноклональных антител, которые включают вариант области Ес по изобретению. Фармацевтическая композиция для терапевтического применения предпочтительно является стерильной и может быть лиофилизированной.

В изобретении предлагается способ ингибирования активности белка у нуждающегося в этом млекопитающего, предпочтительно человека, который включает введение указанному млекопитающему терапевтически эффективного количества или профилактически эффективного количества полипептида (предпочтительно моноклонального антитела), включающего вариант области Ес по изобретению. Предпочтительно, полипептид, который включает вариант области Ес, представляет собой связывающий партнер белка, который подлежит ингибированию. В изобретении дополнительно предлагается способ лечения или профилактики заболевания или расстройства, которые могут быть облегчены путем ингибирования проведения сигнала в результате связывания моноклонального антитела, включающего вариант области Ес по изобретению, с его антигенным эпитопом, который включает введение нуждающемуся в таком лечении или профилактике больному (например, человеку), терапевтически или профилактически эффективного количества моноклонального антитела по изобретению.

Изобретение включает предмет производства, который включает упаковочный материал и полипептид, включающий вариант области Ес полипептида по изобретению, находящийся в указанном упаковочном материале. Изобретение дополнительно включает композиции, которые включают моноклональные антитела и гетерологичные полипептиды, включающие описанный здесь вариант области Ес и физиологически или фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предлагается полипептид, который включает:

ί) немодифицированную каркасную область (ЕЯ) человека (например, никаких изменений не было осуществлено в отношении природного каркаса человека) и ίί) вариант области Ес.

В некоторых вариантах осуществления немодифицированная каркасная область человека представляет собой каркас зародышевой линии человека. В других вариантах осуществления настоящего изобретения предлагаются композиции, которые включают полипептид, где полипептид включает: 1) как минимум одну рандомизированную последовательность СОЯ и ίί) вариант области Ес по изобретению. В до

- 19 012464 полнительных вариантах осуществления настоящего изобретения предлагаются композиции, которые включают полипептид, где полипептид включает: 1) немодифицированную каркасную область человека (например, каркас зародышевой линии человека), ίί) как минимум одну рандомизированную последовательность СОК и ϊϊΐ) вариант области Рс по изобретению.

Настоящее изобретение охватывает терапевтическое и диагностическое применение для моноклональных антител гетерологичных полипептидов, которые включают вариант области Рс по изобретению, раскрытый в данном описании.

Описание фигур

На фиг. 1 показано схематическое представление молекулы 1дС с разметкой различных областей и сегментов.

На фиг. 2 показано выравнивание различных исходных последовательностей аминокислот Рс, включая человеческий Ι§01 ((8Еф ΙΌ N0:1) показаны аллотипы а и отличные от а), человеческий Ι§02 (8Еф ΙΌ N0:2), человеческий 1§С3 (8Еф ΙΌ N0:3), человеческий 1§С4 (8Еф ΙΌ N0:4), мышиный 1дС1 (8Еф ΙΟ N0:5), мышиный Ι§02Ά (8Еф ΙΌ N0:6), мышиный Ι§02Β (8Еф ΙΌ N0:7) и мышиный Ι§03 (8Еф ΙΌ N0:8).

На фиг. 3 показаны различные последовательности аминокислот, включая область СН2 (8Еф ΙΌ N0:9) и область СН3 (8Еф ΙΌ N0:10) человеческого Ι§01, а также аллотипа £ (8Еф ΙΌ N0:11) и аллотипа а, ζ (8Еф ΙΌ N0:12) последовательности человеческого !дС1, которые включают СН1, шарнир, области СН2 и СН3.

На фиг. 4 показаны различные последовательности аминокислот, которые содержатся в пределах: (а) вариабельной области легкой цепи (ЬСУК) антитела против СЭ20 (Ι) (8Еф ΙΌ N0:13); (Ь) вариабельной области тяжелой цепи (НСУК) антитела против СЭ20 (Ι) (8Еф ΙΌ N0:14); (с) ЬСУК антитела против С.О20 (ΙΙ) (8Еф ΙΌ N0:15); и НСУК антитела против СЭ20 (ΙΙ) (8Еф ΙΌ N0:16). На фиг. 4е показаны последовательности аминокислот, содержащиеся в пределах вариабельной области антитела против ί.Ό20 (см. Временную заявку США 60/471958, зарегистрированную 20 мая, 2003 г., и патент США 5843439, оба включены в данное описание).

На фиг. 5а показана полная последовательность аминокислот легкой цепи для антитела АМЕ 133 против ί.Ό20. На фиг. 5Ь показана полная последовательность нуклеиновой кислоты легкой цепи для АМЕ 133.

На фиг. 6 показаны последовательности аминокислот и нуклеиновой кислоты для полной тяжелой цепи трех предпочтительных вариантов антитела АМЕ 133 против ί.Ό20. Конкретно, на фиг. 6а показана последовательность аминокислот полной тяжелой цепи варианта 247Ι/339Ο. На фиг. 6Ь показана последовательность нуклеиновой кислоты полной тяжелой цепи варианта 247Ι/339Ο. На фиг. 6с показана последовательность аминокислот полной тяжелой цепи варианта 247Ι/339Ό. На фиг. 6й показана последовательность нуклеиновой кислоты полной тяжелой цепи варианта 247Ι/339Ό. На фиг. 6е показана последовательность аминокислот полной тяжелой цепи варианта 378Ό. На фиг. 6£ показана последовательность нуклеиновой кислоты полной тяжелой цепи варианта 378Ό.

Подробное описание изобретения

В данных подробном описании и формуле изобретения нумерация остатков аминокислот в тяжелой цепи иммуноглобулина (область Рс) представляет собой нумерацию в соответствии с индексом ЕС, по КаЬа! с1 а1., 8сс.|испсск о£ Рго!еш8 о£ Ιιηιηιιηο1ο§χα1 ΙπΙογοκΙ. 5^4Ь Ей. РиЬРс НеаРЬ 8егуюе, №1Ропа1 ΙηκΙίΙυΙοκ о£ НеаРР, ВеШекйа, МО (1991). Индекс ЕС согласно КаЬа! относится к нумерации остатков человеческого Ιβ0 антитела и отображается в данном описании на фиг. 2. Например, в положении 438 человеческий Ι§01, Ι§02, Ι§03, Ι§04 и мышиный Ι§03 содержат аминокислоту О. хотя мышиный Ι§01 содержит аминокислоту Ι, мышиный Ι§02η содержит аминокислоту Т, а мышиный Ι§02Β содержит аминокислоту К. Кроме того, замены в данном описании обозначаются номером положения аминокислоты, в котором производится замена, с последующим обозначением аминокислоты, заменяющей присутствующую в исходной области Рс в том же положении (например, 2490 означает замену остатком глицина остатка, который находится в положении 249 исходной области Рс). Номер относится к положению в человеческом Ι§01 независимо от того, является ли исходная область Рс человеческим Ι§01; если исходная область Рс не является человеческим Ι§01, номер относится к гомологичному положению в исходной области Рс, если бы он был выровнен с человеческим Ι§01 в этом положении.

В данном описании термины субъект и больной обозначают любое животное, у которого может терапевтически применяться полипептид, который включает вариант области Рс по изобретению, включая человека, а также других млекопитающих (таких как, например, домашние животные (например, собаки, кошки), спортивные животные (например, лошади) и сельскохозяйственные животные (например, коровы, свиньи и овцы)), которые могут получить пользу от такой терапии.

В данном описании лечение или профилактика относится к заболеванию или расстройству, связанному с аномальными уровнями белка, или такому, при котором пациент может получить пользу от изменения активности или уровня белка.

Термин «изолированный», если он используется в связи с нуклеиновой кислотой, обозначает нуклеиновую кислоту, которая идентифицирована и отделена как минимум от одной загрязняющей нуклеи

- 20 012464 новой кислоты, с которой она обычно связана в их природном источнике. Изолированная нуклеиновая кислота находится в форме или состоянии, отличном от того, в котором она найдена в природе. Изолированные молекулы нуклеиновой кислоты, таким образом, отличаются от молекул нуклеиновых кислот, которые существуют в природных клетках. Изолированная молекула нуклеиновой кислоты включает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащуюся в клетках, которые рутинно экспрессируют кодируемый ей полипептид, где, например, молекула нуклеиновой кислоты находится в плазмиде или имеет хромосомную локализацию, отличную от локализации в природных клетках. Изолированная нуклеиновая кислота может находиться в одноцепочечной или двухцепочечной форме. Если изолированная молекула нуклеиновой кислоты должна использоваться для экспрессии белка, олигонуклеотид или полииуклеотид должен содержать как минимум смысловую или кодирующую цепь, но может содержать и смысловую, и антисмысловую цепи (т.е. может быть двухцепочечным).

Молекула нуклеиновой кислоты является функционально связанной или функционально присоединенной, если она расположена в функциональной связи с другой молекулой нуклеиновой кислоты. Например, промотор или энхансер функционально связан с кодирующей последовательностью нуклеиновой кислоты, если он воздействует на транскрипцию последовательности; или сайт связывания рибосомы функционально связан с кодирующей последовательностью нуклеиновой кислоты, если он расположен таким образом, чтобы облегчить трансляцию. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая вариант области Рс, является функционально связанной с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей гетерологичный белок (т.е. белок или его функциональный фрагмент, который как таковой в естественных условиях не включает область Рс), если она расположена таким образом, что экспрессируемый слитый белок включает гетерологичный белок или его функциональный фрагмент, присоединенный спереди или сзади к варианту области Рс полипептида; гетерологичный белок может непосредственно соседствовать с вариантом области Рс полипептида или, может быть отделен от него последовательностью линкера любой длины и состава. Сходным образом, молекула полипептида (который используется в данном описании синонимично с белком) является функционально связанной или функционально присоединенной, если она находится в функциональной связи с другим полипептидом.

В данном описании термин функциональный фрагмент в отношении полипептида или белка (например, вариант области Рс или моноклональное антитело) относится к фрагментам такого белка, которые сохраняют как минимум одну функцию полноразмерного полипептида. Фрагменты могут варьировать по размеру от шести аминокислот до всей последовательности аминокислот полноразмерного полипептида минус одна аминокислота. Функциональный фрагмент варианта области Рс полипептида по данному изобретению сохраняет как минимум одну замену аминокислоты, как определено в данном описании. Функциональный фрагмент варианта области Рс полипептида сохраняет как минимум одну функцию, известную в данной области техники, которая связана с областью Рс (например, ЛИСС, СЭС. связывание с рецептором Рс, связывание С1ц, негативная регуляция рецепторов на поверхности клетки или может, например, увеличивать ίη νίνο или ίη νίίτο период полужизни полипептида, с которым он функционально связан).

Термин очищенный или очистка относится к значительному удалению как минимум одного загрязняющего компонента из образца. Например, антиген-специфичное антитело может быть очищено полным или значительным удалением (как минимум, 90, 91, 92, 93, 94, 95% или более предпочтительно, как минимум, 96, 97, 98 или 99%) как минимум одного загрязняющего неиммуноглобулинового белка; оно может также быть очищено удалением иммуноглобулинового белка, который не связывается с тем же антигеном. Удаление не-иммуноглобулиновых белков и/или удаление иммуноглобулинов, которые не связываются с конкретным антигеном, приводит к увеличению процентного содержания антигенспецифичных иммуноглобулинов в образце. В другом примере полипептид (например, иммуноглобулин), экспрессированный в бактериальных клетках-хозяевах, очищают полным или значительным удалением белков клеток-хозяев; таким образом процент полипептида в образце повышается.

Термин «природный», если он относится к полипептиду (например, области Рс) в данном описании используется для указания на то, что полипептид имеет последовательность аминокислот, состоящую из последовательности аминокислот полипептида, которая обычно встречается в природе или ее природного полиморфизма. Природный полипептид (например, природная область Рс) может быть произведен рекомбинантными средствами или может быть выделен из природного источника.

Термин вектор экспрессии в данном описании относится к рекомбинантной молекуле ДНК, содержащей желательную кодирующую последовательность и соответствующие последовательности нуклеиновой кислоты, необходимые для экспрессии функционально связанной кодирующей последовательности в конкретном организме хозяина.

В данном описании термин клетка-хозяин относится к любой эукариотной или прокариотной клетке (например, бактериальным клеткам, таким как Е. со11, клеткам СНО, дрожжевым клеткам, клеткам млекопитающих, клеткам птиц, клеткам амфибий, клеткам растений, клеткам рыб и клеткам насекомых), находящейся в условиях ίη νίίτο или ίη 8Йи, или ίη νίνο. Например, клетки-хозяева могут находиться в трансгенном животном.

В данном описании исходный полипептид представляет собой полипептид, включающий после

- 21 012464 довательность аминокислот, которая может быть заменена или изменена (например, заменой аминокислоты) для создания варианта (т.е. варианта полипептида). В предпочтительных вариантах осуществления исходный полипептид включает как минимум часть природной или неприродной области Рс, т.е. области Рс природного происхождения или области Рс с как минимум одной модификацией последовательности аминокислот. В некоторых вариантах осуществления изобретения отдельно охватываются варианты, короче или длиннее, чем исходный полипептид. В особенно предпочтительных вариантах осуществления исходный полипептид отличается по функции (например, повышенная или сниженная эффекторная функция, связывание рецептора, период полужизни ίη νίνο или ίη νίίτο и т.д.) по сравнению с вариантом.

В данном описании термин вариант исходного полипептида относится к полипептиду, который включает последовательность аминокислот, отличающуюся от последовательности исходного полипептида как минимум одной заменой аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления вариант включает как минимум 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 или 90% или наиболее предпочтительно как минимум 95, 97 или 99% области Рс (т.е. часть области Рс). В предпочтительных вариантах осуществления вариант области Рс исходного полипептида включает как минимум одну замену аминокислоты в исходном полипептиде, причем замена произведена в области Рс. Исходный полипептид может быть природным полипептидом или не быть им.

В данном описании термин область Рс относится к С-концевой области тяжелой цепи иммуноглобулина (например, как показано на фиг. 1). Область Рс может быть природной последовательностью области Рс или вариантом области Рс. Хотя общепринятые границы области Рс тяжелой цепи иммуноглобулина могут варьировать, область Рс тяжелой цепи 1дО человека обычно определяется как область, которая простирается от остатка аминокислоты в положении Су§226 или от Рго230, до его карбоксильного конца. В некоторых вариантах осуществления варианты включают только части области Рс и могут включать или не включать карбоксильный конец. Область Рс иммуноглобулина обычно включает два константных домена, СН2 и СН3, как показано, например, на фиг. 1. В некоторых вариантах осуществления рассматриваются варианты, содержащие один или более константных доменов. В других вариантах осуществления рассматриваются варианты без таких константных доменов (или только с частями таких константных доменов).

Домен СН2 области Рс 1дС человека (также обозначается как Су2домен) обычно простирается от приблизительно аминокислоты 231 до приблизительно аминокислоты 340 (см. фиг. 2). Домен СН2 является уникальным в том, что не является тесно спаренным с другим доменом. Две Ν-связанные разветвленные углеводные цепи вставлены между двумя доменами СН2 интактной природной молекулы 1§С.

Домен СН3 области Рс 1дС человека (также обозначается как Су3домен) обычно представляет собой фрагмент, состоящий из остатков, расположенных ближе к С-концу по отношению к СН2 домену в области Рс, который простирается от приблизительно остатка аминокислоты 341 до приблизительно остатка аминокислоты 447 (см. фиг. 2).

Функциональная область Рс обладает эффекторной функцией области Рс с природной последовательностью. Как минимум, одна эффекторная функция полипептида, который включает вариант области Рс по данному изобретению, может быть усилена или ослаблена по отношению к полипептиду, который включает природную область Рс или исходную область Рс варианта. Примеры эффекторных функций включают, не ограничиваясь ими: связывание С1с.|; комплемент-зависимую цитотоксичность (СЭС); связывание с рецептором Рс; зависимую от антитела опосредуемую клетками цитотоксичность (ЛОСС); фагоцитоз; негативную регуляцию рецепторов на поверхности клетки (например, рецептора В-клеток; ВСЯ) и т.д. Для таких эффекторных функций может быть необходимым, чтобы область Рс была функционально связана с доменом связывания (например, вариабельным доменом антитела), и их можно оцененить с применением различных тестов (например, анализа связывания Рс, теста ЛОСС, теста СЭС, истощения клеток-мишеней из образцов цельной или фракционированной крови и т.д.).

Природная последовательность области Рс или область Рс дикого типа относится к последовательности аминокислот, идентичной последовательности аминокислот области Рс, которая обычно встречается в природе. Иллюстративные природные последовательности области Рс человека показаны на фиг. 2 и включают природную последовательность области Рс человеческого 1дО1 (аллотипы £ и а, ζ, т.е. аллотипы, отличные от А, и А); природную последовательность области Рс человеческого 1дС2; природную последовательность области Рс человеческого 1дС3; и природную последовательность области Рс человеческого 1дС4, а также их природные варианты. Природные последовательности областей Рс мыши также показаны на фиг. 2.

Вариант области Рс включает последовательность аминокислот, которая отличается от природной последовательности области Рс с (или ее фрагмента) посредством как минимум одной замены аминокислоты, как определено в данном описании. В предпочтительных вариантах осуществления вариант области Рс содержит как минимум одну замену аминокислоты по сравнению с областью Рс с природной последовательностью или областью Рс исходного полипептида, предпочтительно 1, 2, 3, 4 или 5 замен аминокислот в области Рс с природной последовательностью или в области Рс исходного полипептида. В

- 22 012464 альтернативном осуществлении вариант области Ес может быть создан в соответствии со способами, раскрытыми в данном описании, и этот вариант области Ес может быть слит с выбранным гетерологичным полипептидом, таким как вариабельный домен антитела или полипептид, отличный от антитела, например, доменом связывания рецептора или лиганда.

В данном описании термин производное в контексте полипептидов относится к полипептиду, который включает последовательность аминокислот, которая была изменена путем введения замены остатка аминокислоты. Термин производное в данном описании также относится к полипептиду, который был модифицирован ковалентным присоединением любого вида молекулы к полипептиду. Например, не ограничиваясь перечисленным, антитело может быть модифицировано, например, гликозилированием, ацетилированием, пэгилированием, фосфорилированием, амидированием, дериватизацией с помощью известных защитных/блокирующих групп, протеолитическим расщеплением, присоединением к клеточному лиганду или другому белку и т.д. Производное полипептида может быть получено путем химических модификаций с использованием способов, известных специалистам в данной области техники, включая, но не ограничиваясь ими, специфическое химическое расщепление, ацетилирование, присоединение формиата, метаболический синтез туникамицина и т.д. Кроме того, производное полипептида обладает функцией, подобной или идентичной полипептиду, из которого оно было получено. Понятно, что полипептид, который включает вариант области Ес по данному изобретению, может быть производным, как определено в данном описании, предпочтительно дериватизация производится в пределах области Ес.

Выражение в значительной мере человеческого происхождения в данном описании в отношении полипептида (например, области Ес или моноклонального антитела) указывает на то, что полипептид имеет последовательность аминокислот, которая как минимум на 80%, как минимум, на 85%, более предпочтительно, как минимум, на 90, 91, 92, 93, 94% или даже более предпочтительно, как минимум, на 90, 95, 97, 98 или 99% гомологична последовательности природного человеческого полипептида.

Термины «рецептор Ес» или «ЕсК» используются для описания рецептора, который связывается с областью Ес (например, областью Ес антитела). Предпочтительный ЕсК представляет собой природную последовательность ЕсК. Более того, предпочтительным ЕсК является такой, который связывается с 1дС антителом (гамма рецептор) и включает рецепторы подклассов ЕсуК1, ЕсуКП, ЕсуКШ, включая аллельные варианты и формы альтернативного сплайсинга этих рецепторов. Рецепторы ЕсуКП включают ЕсуКПЛ («активирующий рецептор») и ЕсуКПВ («ингибирующий рецептор»), которые имеют сходные последовательности аминокислот, отличающиеся в основном в цитоплазматических доменах рецептора. ЕсКк рассмотрены в Кате1сН апб К1пе!, Аппи. Кеу. 1ттипо1. 9:457-92 (1991); Саре1, е! а1., 1ттипотс11юб5 4:25-34 (1994); и бе Наак е! а1., 1. ЬаЬ. С1т. Меб. 126:330-41 (1995). Другой предпочтительный ЕсК включает рецептор новорожденных, ЕсКп, который ответственен за перенос иммуноглобулинов 1дС матери плоду (Сиуег е! а1., 1. 1ттипо1. 117:587 (1976) и К1т е! а1., 1. 1ттипо1. 24:249 (1994)). Другие ЕсКк, включая те, которые будут идентифицированы в будущем, охватываются термином ЕсК в данном описании.

Выражения зависимая от антител клеточно-опосредованная цитотоксичность и АПСС относятся к клеточно-опосредованной реакции, в ходе которой неспецифические цитотоксические клетки (например, неспецифические), которые экспрессируют ЕсКк (например, природные клетки-киллеры (ΝΚ), нейтрофилы и макрофаги), распознают связанное антитело на клетке-мишени и далее вызывают лизис клеток-мишеней. Основные клетки, опосредующие АЭСС, клетки ΝΚ, экспрессируют только ЕсуКШ, тогда как моноциты экспрессируют ЕсуК1, ЕсуКП и ЕсуКШ.

В данном описании выражение эффекторные клетки относится к лейкоцитам (предпочтительно, человеческим), которые экспрессируют один или более ЕсКк и выполняют эффекторные функции. Предпочтительно, клетки экспрессируют как минимум ЕсуКШ и выполняют эффекторную функцию АПСС. Примеры лейкоцитов, которые опосредуют АПСС, включают РВМС, клетки ΝΚ, моноциты, цитотоксические Т-клетки и нейтрофилы. Эффекторные клетки могут быть выделены из природного источника (например, из крови или РВМС).

Вариант полипептида с измененным сродством связывания ЕсКп представляет собой вариант либо с усиленным (т.е. увеличенным, более высоким или повышенным), либо ослабленным (т.е. уменьшенным, сниженным или более низким) сродством связывания ЕсКп по сравнению с исходным вариантом полипептида или с полипептидом, который включает природную область Ес, измеренным при рН 6,0. Вариант полипептида, который демонстрирует повышенное связывание или повышенное сродство связывания с ЕсКп, связывает ЕсКп с более высоким сродством, чем исходный полипептид. Вариант полипептида, который демонстрирует сниженное связывание или сниженное сродство связывания с ЕсКп, связывает ЕсКп с более низким сродством, чем исходный полипептид. Варианты полипептида, которые демонстрируют сниженное сродство связывания с ЕсКп, могут обладать низким или незначительным связыванием с ЕсКп, например, 0-20% связывания с ЕсКп в сравнении с исходным полипептидом. Вариант полипептида, который связывает ЕсКп с повышенным сродством по сравнению с исходным полипептидом, представляет собой такой полипептид, который связывает ЕсКп с более высоким сродством связывания, чем исходный полипептид, когда количества варианта полипептида и исходного полипепти

- 23 012464 да при тестировании связывания по существу являются одинаковыми, и все другие условия являются идентичными. Например, вариант полипептида с повышенным сродством связывания ЕсЯп может проявлять от приблизительно 1,10-кратного до приблизительно 100-кратного (более типично, от приблизительно 1,2-кратного до приблизительно 50-кратного) повышения сродства связывания ЕсЯп в сравнении с исходным полипептидом, где сродство связывания ЕсЯп определяют, например, в тесте ЕЫ8А или другим способом, доступным специалисту в данной области техники.

В данном описании замена аминокислоты относится к замене как минимум одного существующего остатка аминокислоты в данной последовательности аминокислот другим «заменяющим» остатком аминокислоты. Заменяющий остаток или остатки, могут быть природными остатками аминокислот (т.е. такими, которые кодируются генетическим кодом), выбранными из аланина (А1а); аргинина (Агд); аспарагина (Акп); аспарагиновой кислоты (Акр); цистеина (Сук); глутамина (С1п); глутаминовой кислоты (С1и); глицина (С1у); гистидина (Н1к); изолейцина (11е); лейцина (Ьеи); лизина (Ьук); метионина (Ме!); фенилаланина (РЕе); пролина (Рго); серина (8ег); треонина (ТЬг); триптофана (Тгр); тирозина (Туг); и валина (Уа1). Замещение одним или более остатками неприродных аминокислот также охватывается определением замены аминокислоты в данном описании. Не встречающийся в природе остаток аминокислоты относится к остатку, который отличается от встречающихся в природе остатков аминокислот, перечисленных выше, который способен ковалентно связываться со смежным остатком(ами) аминокислот в полипептидной цепи. Примеры остатков не встречающихся в природе аминокислот включают норлейцин, омитин, норвалин, гомосерин и другие аналоги остатков аминокислот, такие как описанью Е11тап е! а1. МеШ. Еп/лт. 202: 301-336 (1991).

Термин сигнал теста относится к результирующему показателю любого способа обнаружения белок-белкового взаимодействия, включая, но не ограничиваясь ими, измерения поглощения при колориметрических тестах, интенсивности флуоресценции или распадов в минуту. Форматы анализа могут включать ЕЫ8А, ЕАС8 или другие методы. Изменение сигнала теста может отражать изменение жизнеспособности клеток и/или изменение в кинетике обратной реакции, прямой реакции обоих показателей. Более высокий сигнал теста относится к измеренному числовому значению результирующего показателя, большему чем другое числовое значение (например, вариант может иметь более высокое (большее) измеренное значение в тесте ЕЫ8А в сравнении с исходным полипептидом). Пониженный сигнал теста относится к измеренному числовому значению результирующего показателя, более низкому, чем другое числовое значение (например, вариант может иметь более низкое (меньшее) измеренное значение в тесте ЕЬ18А в сравнении с исходным полипептидом).

Термин сродство связывания относится к равновесной константе диссоциации (выраженной в единицах концентрации), ассоциированной с каждым взаимодействием при связывании Ес рецептор-Ес. Сродство связывания непосредственно относится к соотношению кинетической скорости обратной реакции (обычно регистрируемой в единицах, обратных времени, например, секунды^-1), деленной на кинетическую скорость прямой реакции (обычно регистрируемую в единицах концентрации на единицу времени, например, молярность/секунду). Обычно нельзя однозначно утверждать, являются ли изменения равновесных констант диссоциации следствием отличий в скорости прямой реакции, скорости обратной реакции или обоих показателей, за исключением случая, когда каждый из этих параметров определяется экспериментально (например, измерениями с помощью В1АСОЯЕ или 8АРШУЫЕ).

В данном описании шарнирная область относится к участку аминокислот в человеческом 1дС1, который простирается от С1и216 до Рго230 человеческого 1дС1. Шарнирные области других изотипов 1дС могут быть выравнены с последовательностью !дС1 размещением первого и последнего остатков цистеина, образующих 8-8 связи между тяжелыми цепями в одних и тех же положениях.

С1с.| представляет собой полипептид, который включает сайт связывания для области Ес иммуноглобулина. С1с.| вместе с двумя сериновыми протеазами, С1г и С1к, образует комплекс С1, первый компонент пути СЭС.

В данном описании термин антитело, который используется взаимозаменяемым образом с термином иммуноглобулин или 1д, используется в самом широком смысле и особенно охватывает моноклональные антитела (включая полноразмерные моноклональные антитела), поликлональные антитела, мультиспецифичные антитела (например, биспецифичные антитела) и фрагменты антител, до тех пока они проявляют желательную биологическую активность или функциональную активность. Одноцепочечные антитела, гибридные, человеческие и гуманизированные или приматизированные (СЭЯпривитые) антитела, а также гибридные или СЭВ-привитые одноцепочечные антитела и т.п., включая части, полученные от различных видов, также охватываются настоящим изобретением и термином антитело. Различные части таких антител могут быть соединены вместе химически с помощью традиционных способов, синтетическим путем или могут быть получены как смежный белок с использованием генно-инженерных способов. Например, нуклеиновые кислоты, кодирующие гибридную или гуманизированную цепь, могут быть экспрессированы для получения смежного белка, см., например, патент США № 4816567; Европейский патент № 0125023 В1; патент США № 4816397; Европейский патент № 0120694 В1; XVО 86/01533; Европейский патент № 0194276 В1; патент США № 5225539; Европейский патент № 0239400 В1 и патенты США №№ 5585089 и 5698762. См. также, Ие^тап, Я. е! а1. ВюТесНпоЕ

- 24 012464 оду, 10:1455-1460, 1993, относительно приближенных к приматным антител, и Ьабпег е! а1., патент США № 4946778, а также В1гб, Я.Е. е! а1., 8с1епсе, 242:423-426, 1988, относительно одноцепочечных антител. Понятно, что все формы антител, которые включают область Ес (или ее часть) охватываются в данном описании в пределах термина антитело. Кроме того, антитело может быть помечено обнаружимой меткой, закреплено на твердой фазе и/или конъюгировано с гетерологичным соединением (например, ферментом или токсином) в соответствии со способами, известными в данной области техники.

В данном описании термин фрагменты антител относится к части интактного антитела. Примеры фрагментов антител включают, не ограничиваясь ими, линейные антитела; одноцепочечные молекулы антител; пептиды Ес или Ес', ЕаЬ и фрагменты ЕаЬ, а также мультиспецифичные антитела, образованные из фрагментов антител. Фрагменты антител предпочтительно сохраняют как минимум часть шарнирной области и необязательно область СН1 тяжелой цепи 1дС. В других предпочтительных вариантах осуществления фрагменты антитела включают как минимум часть области СН2 или полностью область СН2.

В данном описании термин функциональный фрагмент, если он используется в отношении моноклонального антитела, предназначен для обозначения части моноклонального антитела, которая все еще сохраняет функциональную активность. Функциональная активность может представлять собой, например, антиген-связывающую активность или специфичность, рецептор-связывающую активность или специфичность, активность эффекторной функции и т.п. Функциональные фрагменты моноклонального антитела включают, например, отдельные тяжелые или легкие цепи и их фрагменты, такие как УЪ, УН и Еб; одновалентные фрагменты, такие как Ρν, ЕаЬ и ЕаЬ'; двухвалентные фрагменты, такие как Е(аЬ')2; одноцепочечные Еν Сскг); и фрагменты Ес. Такие термины описаны, например, в Наг1о\ге апб Ьапе, АпбЬоб1е8: А ЬаЬога!огу Мапиа1, Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу, №\ν Уогк (1989); Мо1ес. Вю1оду апб Вю1ес11по1оду: А Сотргекепзгуе Эе^к Яекегепсе (Муега, Я.А. (еб.), №\ν Уогк: УСН РиЬНккег, 1пс.); Нийоп е! а1., Се11 Вюркуыск, 22:189-224 (1993); Р1иск111ип апб 8кегга, Ме111. Еп7уто1., 178:497-515 (1989) и ш Оау, Ε.Ό., Абνапсеб 1ттипоскет18!гу, 8есопб Еб., ^беу-Ь188, 1пс., №\ν Уогк, ΝΥ (1990). Термин «функциональный фрагмент» предназначен для включения, например, фрагментов, образованных путем расщепления протеазой или восстановления моноклонального антитела, а также с помощью способов рекомбинации ДНК, известных специалистам в данной области техники.

В данном описании термин фрагмент относится к полипептиду, который включает последовательность аминокислот как минимум из 5, 15, 20, 25, 40, 50, 70, 90, 100 или более остатков аминокислот смежной последовательности аминокислот другого полипептида. В предпочтительном осуществлении фрагмент пептида сохраняет как минимум одну функцию полноразмерного полипептида.

В данном описании термин гибридное антитело включает одновалентные, двухвалентные или многовалентные иммуноглобулины. Одновалентное гибридное антитело представляет собой димер, образованный гибридной тяжелой цепью, связанной с помощью дисульфидных мостиков с гибридной легкой цепью. Двухвалентное гибридное антитело представляет собой тетрамер, образованный из двух димеров тяжелая цепь-легкая цепь, связанных с помощью как минимум одного дисульфидного мостика. Гибридная тяжелая цепь антитела для использования у человека включает связывающую антиген область, происходящую из тяжелой цепи отличного от человеческого антитела, которая связана как минимум с частью константной области человеческой тяжелой цепи, такой как СН1 или СН2. Гибридная легкая цепь антитела для использования у человека включает связывающую антиген область, происходящую из легкой цепи отличного от человеческого антитела, связанную как минимум с частью константной области человеческой легкой цепи (СЬ). Антитела, фрагменты или производные, содержащие гибридные тяжелые цепи и легкие цепи с такой же или другой специфичностью связывания вариабельной области, могут также быть получены соответствующим объединением полипептидных отдельных цепей, в соответствии со стадиями известного способа. При таком подходе, хозяев, экспрессирующих гибридные тяжелые цепи, культивируют отдельно от хозяев, экспрессирующих гибридные легкие цепи, и цепи иммуноглобулина отдельно извлекают, а затем объединяют. Альтернативно, хозяева могут культивироваться совместно, и цепям дают объединяться самопроизвольно в среде культивирования, с последующим извлечением собранного иммуноглобулина или фрагмента, или обе цепи - легкую и тяжелую - можно экспрессировать в одной и той же клетке-хозяине. Способы получения гибридных антител известны в данной области техники (см., например, патенты США №№ 6284471; 5807715; 4816567 и 4816397).

В данном описании гуманизированные формы отличных от человеческих (например, мышиных) антител (т.е. гуманизированные антитела) представляют собой антитела, которые содержат минимальную последовательность, происходящую из отличного от человеческого иммуноглобулина, или такая последовательность отсутствует. По большей части, гуманизированные антитела представляют собой человеческие иммуноглобулины (антитело реципиента), где остатки гипервариабельной области реципиента заменены остатками гипервариабельной области видов, отличных от человека (антитело донора), таких как мышь, кролик или негуманоидный примат, имеющими желательные специфичность, аффинность и емкость. В некоторых случаях остатки каркасной области (ЕЯ) иммуноглобулина человека заменены соответствующими остатками, отличными от человеческих. Кроме того, гуманизированные антитела могут включать остатки, которые не обнаружены в антителе реципиента или антителе донора. В общем, такие модификации осуществляют для дальнейшего улучшения функциональности антитела.

- 25 012464

Обычно, гуманизированное антитело включает в значительной мере все из как минимум одного, обычно из двух вариабельных доменов, где все или в значительной мере все гипервариабельные петли (СИЯ) соответствуют таковым отличного от человеческого иммуноглобулина и все или в значительной мере все остатки РЯ являются остатками последовательности человеческого иммуноглобулина.

Гуманизированное антитело также может включать, как минимум, часть константной области (Рс) иммуноглобулина, обычно человеческого иммуноглобулина. Пример способа, который используется для создания гуманизированных антител, описан в патенте США № 5225539.

В данном описании термин иммуноадгезин обозначает антитело-подобные молекулы, которые сочетают домен связывания гетерологичного белка адгезина (например, рецептора, лиганда или фермента) с константным доменом иммуноглобулина. Структурно, иммуноадгезины включают слияние аминокислотной последовательности адгезина с желательной специфичностью связывания, которая отличается от сайта распознавания и связывания антигена (сайт объединения антигена) антитела (т.е. является гетерологичной), с последовательностью константного домена иммуноглобулина.

В данном описании термин домен связывания лиганда» относится к любому природному рецептору или любой его области или производному, которые сохраняют, как минимум, качественно лигандсвязывающую способность соответствующего природного рецептора. В некоторых вариантах осуществления рецептор представляет собой полипептид клеточной поверхности, который содержит внеклеточный домен, являющийся гомологичным члену надсемейства иммуноглобулинов. Другие рецепторы, которые не являются членами надсемейства иммуноглобулинов, но тем не менее конкретно охватываются данным определением, представляют собой рецепторы для цитокинов, и в особенности, рецепторы с тирозинкиназной активностью (рецепторные тирозинкиназы), члены надсемейств рецепторов гематопоэтина и фактора роста нервов и молекулы клеточной адгезии (например, Е-, Ь- и Р-селектины).

В данном описании термин домен связывания рецептора относится к любому природному лиганду для рецептора, включая, например, молекулы клеточной адгезии, или любому участку или производному такого природного лиганда, сохраняющему, как минимум, качественную способность связывания рецептором соответствующего природного лиганда.

В данном описании термин «гибрид антитело-иммуноадгезин» включает молекулу, которая объединяет как минимум один домен связывания антитела с как минимум одним иммуноадгезином. Примеры включают, не ограничиваясь ими, биспецифичные гибриды СИ4-1дО, описанные в Вегд с1 а1., ΡΝΑ8 (И8А) 88:4723-4727 (1991) и Скатом е1 а1., 1. 1ттипо1., 153:4268 (1994).

В данном описании изолированный полипептид представляет собой такой полипептид, который идентифицирован и отделен и/или извлечен из компонента его природного окружения. Загрязняющие компоненты его природного окружения представляют собой вещества, которые мешали бы диагностическому или терапевтическому использованию полипептида и могут включать ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворенные вещества. В некоторых вариантах осуществления изолированный полипептид очищается (1) более чем на 95 мас.% полипептидов, что определяют по методу Ьомгу, и предпочтительно более чем на 99 мас.%, (2) до степени, достаточной, чтобы получить как минимум 15 остатков Ν-концевой или внутренней последовательности аминокислот путем использования секвенатора с вращающейся чашей, или (3) до однородности с помощью метода 8Ό8-ΡΑΟΕ в восстанавливающих или невосстанавливающих условиях с использованием окрашивания кумасси синим или серебром. Изолированный полипептид включает пслипептид ίη кйи в пределах рекомбинантных клеток, поскольку как минимум один компонент естественного окружения полипептида должен отсутствовать. Обычно, однако, изолированный полипептид получают с использованием как минимум одной стадии очистки.

В данном описании термин лечение относится как к терапевтическому лечению, так и к профилактическим или предупредительным мерам. Субъекты или больные, которые нуждаются в лечении, включают пациентов, у которых уже возникло расстройство, а также тех, у кого расстройство должно быть предупреждено.

В данном описании термины расстройство и заболевание, которые используются взаимозаменяемым образом, обозначают любое состояние, при котором пациент может получить пользу от лечения вариантом полипептида (полипептидом, который включает вариант области Рс по изобретению), включая хронические и острые расстройства или заболевания (например, патологические состояния, которые способствуют возникновению у пациента конкретного расстройства). В некоторых вариантах осуществления расстройство представляет собой рак. В некоторых вариантах осуществления термин аутоиммунное заболевание, который используется взаимозаменяемым образом с термином аутоиммунное расстройство, применяется для обозначения состояния у субъекта, которое характеризуется повреждением клеток, ткани и/или органа, вызванным иммунологической реакцией субъекта по отношению к его собственным клеткам, тканям и/или органам. Термин воспалительное заболевание, который используется взаимозаменяемым образом с термином воспалительное расстройство, применяется для обозначения состояния у субъекта, которое характеризуется воспалением. Аутоиммунные расстройства могут быть связаны с воспалением или не связаны с ним. Более того, воспаление может быть или не быть вызвано аутоиммунным расстройством. Определенные расстройства могут быть охарактеризованы и как аутоим

- 26 012464 мунные, и как воспалительные расстройства.

В данном описании термины рак и раковый обозначают или описывают физиологическое состояние у млекопитающих, которое обычно характеризуется неупорядоченным ростом клеток. Примеры рака включают, не ограничиваясь ими, карциному, лимфому, бластому, саркому и лейкоз. Более конкретные примеры таких видов рака включают плоскоклеточный рак, мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, аденокарциному легкого, плоскоклеточную карциному легкого, рак брюшины, гепатоцеллюлярный рак, рак желудочно-кишечного тракта, рак поджелудочной железы, глиобластому, рак шейки матки, рак яичника, рак печени, рак мочевого пузыря, гепатому, рак молочной железы, рак ободочной кишки, рак колоректальной области, карциному эндометрия или матки, карциному слюнной железы, рак почки, рак печени, рак предстательной железы, рак вульвы, рак щитовидной железы, карциному печени и различные виды рака головы и шеи. В данном описании термин метка относится к выявляемым соединению или композиции, которые непосредственно или непрямым способом конъюгируют с полипептидом. Метка может обнаруживаться сама по себе (например, радиоизотопные метки или флуоресцентные метки) или, в случае ферментной метки, может катализировать химическое изменение субстратного соединения или композиции, которое может быть обнаружено.

В данном описании термин рецептор относится к полипептиду, который способен связываться как минимум с одним лигандом. Предпочтительный рецептор представляет собой рецептор на поверхности клетки или растворимый рецептор, имеющий внеклеточный лигандсвязывающий домен и, необязательно, другие домены (например, трансмембранный домен, внутриклеточный домен и/или мембранный якорь). Рецептор, который оценивают с помощью теста, раскрытого в данном описании, может быть интактным рецептором, его фрагментом или производным (например, слитым белком, который включает домен связывания рецептора, слитый с одним или более гетерологичными полипептидами). Более того, рецептор, который оценивают на предмет его связывающих свойств, может находиться в клетке или быть изолированным, и необязательно им может быть покрыт планшет для анализа или некоторая другая твердая фаза, или он может быть меченным непосредственно и использоваться как зонд.

В данном описании термин заболевание, которое реагирует на антитело относится к любому заболеванию или медицинскому состоянию, для которого показано лечебное действие, по крайней мере, частичное, терапией антителами. Примеры таких заболеваний и медицинских состояний включают, не ограничиваясь ими, лимфому (показано лечение с помощью ΒΙΤυΧΑΝ), инфекционное заболевание (респираторный синцитиальный дыхательный вирус, показано лечение с помощью 8ΥΝΑΟΙ8), пересадку почки (показана полезность ΖΕΝΑΡΑΧ), болезнь Крона и ревматоидный артрит (показано лечение с помощью ΒΕΜΙΟΑΩΕ). карциному молочной железы (показано лечение с помощью ΗΕΚΓΕΡΤΙΝ) и рак ободочной кишки (показано лечение с помощью ΕΩΒΕίΌΕΘΜΑΒ). В данном описании термин «заболевание, которое реагирует на иммуноадгезин» относится к любому заболеванию или медицинскому состоянию, для которого показано лечение, по крайней мере, частичное, терапией иммуноадгезином.

В данном описании вариант полипептида, который опосредует зависящую от антител клеточноопосредованную цитотоксичность (ΑΩΟΟ) в присутствии эффекторных клеток человека более эффективно, чем исходное антитело, представляет собой вариант полипептида, который ίη νίΐτο или ίη νίνο в значительной мере более эффективен в опосредовании ΑΟΕΌ когда количества варианта полипептида и исходного антитела, которые используются в тесте, в значительной мере являются одинаковыми. Например, такой вариант вызывает лизис большего количества клеток-мишеней в данном анализе ΑΟΕΌ чем исходный полипептид в идентичном анализе ΑΩΟΟ. Такие варианты могут быть идентифицированы, например, с применением теста ΑΩΤΌ но другие анализы или способы определения активности Α^СС также могут применяться (например, модели на животных). В предпочтительных вариантах осуществления вариант полипептида приблизительно в 1,2, 1,3 или 1,4 раза, 1,5 раза, 50 раз, 100 раз, приблизительно 500 раз или приблизительно в 1000 раз более эффективен в опосредовании ΑΩί'Ό чем исходный полипептид.

Термин «симптомы заболевания, которое реагирует на антитело или иммуноадгезин» относится к симптомам, обычно связанным с конкретным заболеванием. Например, симптомы, обычно связанные с болезнью Крона, включают боль в животе, диарею, ректальное кровотечение, снижение массы тела, лихорадку, снижение аппетита, дегидратацию, анемию, вздутие, фиброз, воспаление кишечника и недоедание. Фраза в таких условиях, что симптомы уменьшаются относится к любой степени качественного или количественного уменьшения выявляемых симптомов любого заболевания, которое реагирует на антитело или иммуноадгезин, включая, но не ограничиваясь ими, выявляемое влияние на скорость выздоровления от заболевания (например, скорость увеличения массы тела) или уменьшение как минимум одного из симптомов, которые обычно сопровождают конкретное заболевание (например, если заболевание, которое реагирует на антитело или иммуноадгезин, было болезнью Крона, уменьшение как минимум одного из следующих симптомов: боли в животе, диареи, ректального кровотечения, снижения массы тела, лихорадки, снижения аппетита, дегидратации, анемии, вздутия, фиброза, воспаления кишечника и недоедания).

- 27 012464

Моноклональные антитела и рецепторы

Полноразмерное антитело (иммуноглобулин или 1д), найденное в природе, представляет собой молекулу иммуноглобулина, состоящую из четырех пептидных цепей, двух тяжелых (Н) цепей (приблизительно 50-70 кДа при полном размере) и двух легких (Ь) цепей (приблизительно 50-70 кДа при полном размере), связанных между собой дисульфидными связями. Амино-концевая часть каждой цепи включает вариабельную область, состоящую приблизительно из 100-110 аминокислот или более, в основном ответственную за распознавание антигена. Карбокси-концевая часть каждой цепи определяет константную область, в основном ответственную за эффекторную функцию.

Легкие цепи классифицированы как каппа или лямбда и характеризуются специфической константной областью. Тяжелые цепи классифицированы как гамма, мю, альфа, дельта или эпсилон и определяют изотип антитела как 1дС, 1дМ, 1дА, 1дБ и 1дЕ, соответственно. Каждый тип тяжелой цепи характеризуется специфической константной областью.

Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (в данном описании НСУВ) и константной области тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи включает три домена (СН1, СН2 и СН3) для 1дС, 1дБ и 1дА; и 4 домена (СН1, СН2, СН3 и СН4) для 1дМ и 1дЕ. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (в данном описании ЬСУВ) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи включает один домен, СЬ. Области НСУВ и ЬСУВ могут быть дополнительно подразделены на области гипервариабельности, названные областями, определяющими комплементарность (СБВ), перемежаемые областями, которые являются более консервативными, и которые названы каркасными областями (РВ). Каждый НСУВ и ЬСУВ состоит из трех СБВ и четырех РВ, расположенных от амино-конца в направлении карбокси-конца в следующем порядке: РВ1, СБВ1, РВ2, СБВ2, РВ3, СБВ3, РВ4. Отнесение аминокислот к каждому домену производится в соответствии с хорошо известными договоренностями [например, КаЬаГ 8сс.|испсс5 ο£ Ρτοίβίηδ ο£ Iттиηο1οд^са1 1йегей, Ναΐίοηαΐ ΙηκΙίΙυΙοδ ο£ Нса11Н, ΒοϊΠοδάπ, Мб. (1991)]. Функциональная способность антитела к связыванию специфического антигена определяется совместно шестью СЭВ Однако даже один вариабельный домен, который включает только три СЭВ специфичных для антигена, сам по себе может быть способен распознавать и связывать антиген, хотя и с более низкой аффинностью, чем полный РаЬ.

Моноклональные антитела по изобретению могут быть получены с использованием, например, методов гибридомы, хорошо известных в данной области техники, а также, рекомбинантной технологии, технологии дисплея фага, синтетических технологий или комбинаций таких технологий, хорошо известных в данной области техники. Термин моноклональное антитело в данном описании не ограничивается антителами, полученными с помощью технологии гибридомы. Моноклональное антитело относится к антителу, которое происходит из одной копии или клона, включая например, любой эукариотный, прокариотный или фаговый клон, а не к способу, которым оно получено. Моноклональное антитело может быть интактным (полным или полноразмерным) антителом, в значительной мере интактным антителом, функциональным фрагментом антитела или оно может быть гибридным антителом, человеческим антителом или гуманизированным антителом.

Популяция моноклональных антител относится к гомогенной или в значительной мере гомогенной (или чистой) популяции антитела, т.е. как минимум приблизительно 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96%, более предпочтительно как минимум приблизительно 97 или 98% или наиболее предпочтительно как минимум 99% антител в популяции являются идентичными и должны конкурировать в тесте ЕЫ8А за один и тот же антиген или эпитоп.

Термин специфически связывается или предпочтительно связывается в данном описании относится к ситуации, где один член пары специфического связывания не связывается в значительной мере с молекулами, отличными от специфического связывающего партнера(ов). Термин применим также к ситуациям, где, например, антигенсвязывающий домен антитела по изобретению является специфическим для конкретного эпитопа, который присутствует на ряде антигенов, и в этом случае конкретное антитело, несущее антигенсвязывающий домен, будет способно связываться с различными антигенами, несущими эпитоп.

Область Рс относится к части интактного антитела, например, 1дС, образованной в результате расщепления ферментом папаином (см. фиг. 1). Область Рс представляет собой гомодимер, где каждая цепь включает часть шарнирной области, а также домены СН2 и СН3. Область Рс представляет собой димер, образованный благодаря межцепочечным дисульфидным мостикам между шарнирными областями и множественным нековалентным связям между доменами СН3. 1дС представляет собой самый обширный класс 1д в организме, который составляет приблизительно 75% от общего количества иммуноглобулинов и в равной мере распределен между внутрисосудистым и внесосудистым пулами. Очень мало 1дС вырабатывается на ранних стадиях первичной реакции на антиген, но он представляет собой основную форму антитела, вырабатываемого в ходе вторичной реакции.

Как описано выше, антитела содержат области, в основном области СН2 и СН3, которые принимают участие в функциях, отличных от связывания антигенов. Взятые вместе, эти области и часть последовательности линкера в общем известны как область Рс и выполняют несколько эффекторных функций, опосредуемых связыванием эффекторных молекул.

- 28 012464

Эффекторные функции, опосредованные областью Рс антитела, могут быть разделены на две категории: (1) эффекторные функции, которые выполняются после связывания антитела с антигеном (такие функции включают, например, участие каскада комплемента или содержащих рецептор Рс (РсК)- клеток); и (2) эффекторные функции, которые выполняются независимо от связывания антигена (эти функции обеспечивают, например, постоянное присутствие в кровотоке и способность переноса через клеточные барьеры путем трансцитоза). Например, связывание компонента С1с.| комплемента с антителами активирует систему комплемента. После опсонизации активация комплемента играет важную роль в лизисе клеточных патогенов. Активация комплемента также стимулирует воспалительную реакцию и может также быть вовлечена в аутоиммунные реакции гиперчувствительности. Кроме того, антитела связываются с клетками через область Рс, причем сайт связывания Рс с рецептором расположен в области Рс антитела, которая связывается с РсК на клетке. Существует большое количество РсК, которые являются специфичными для антител различных классов, включая 1дС, 1дЕ, 1дА и 1дМ. Хотя данное изобретение не ограничивается каким-либо конкретным механизмом, связывание антитела с РсК на поверхности клеток запускает множество важных и разнообразных биологических реакций, включая поглощение и разрушение покрытых антителами частиц, клиренс иммунных комплексов, лизис покрытых антителами клеток-мишеней клетками-киллерами (АЭСС), высвобождение медиаторов воспаления, плацентарный перенос и контроль выработки иммуноглобулина.

Несколько эффекторных функций антитела опосредуются РсК§, которые связываются с областью Рс антитела. РсК определяются их специфичностью для изотипов иммуноглобулина; рецепторы Рс для антител 1дС обозначают как РсуК, для 1дЕ как РсеК, для 1дА как РсаК и т.д. Идентифицированы три подкласса РсуК: РсуК1 (СЭ64), РсуКИ (СЭ32) и РсуКШ (СЭ16).

Поскольку каждый подкласс РсуК кодируется двумя или тремя генами, а альтернативный сплайсинг РНК приводит к множественным транскриптам, существует широкое разнообразие изоформ РсуК. Три гена, кодирующие подкласс РсуК! (РсуК1А, РсуК1В и РсуК1С) сосредоточены в области !с|21.1 длинного плеча хромосомы 1;

гены, кодирующие РсуК11 изоформы (РсуКПА, РсуК11В и РсуКПС), и два гена, кодирующие РсуКШ (РсуКША и РсуКШВ) , сосредоточены в области !с|22. Эти различные подтипы РсК экспрессируются на различных видах клеток (например, Каус1с11 апб Κίηβΐ, Аппи. Кеу. 1ттипо1. 9: 457-492 (1991)). Например, у человека РсуКШВ найден только на нейтрофилах, тогда как РсуКША найден на макрофагах, моноцитах, клетках ΝΚ и субпопуляции Т-клеток. Следует отметить, что РсуКША присутствует на клетках ΝΚ, одном из видов клеток, принимающих участие в АЭСС.

Человеческий рецептор РсуКША (СЭ16) обладает распространенным полиморфизмом в положении 158 во внеклеточном домене, который кодирует или фенилаланин, или валин в этом положении. Аллель V РсуК1НА имеет более высокое сродство к 1дС1 человека, чем аллель Р. Аллель У158 также опосредует АЭСС более эффективно. Данные клинических исследований показали корреляцию между генотипом рецептора РсуКША у больных, получавших лечение ритуксаном (Кйихап) и терапевтическим эффектом. Показано, что и клинический, и молекулярный ответы и период до прогрессирования заболевания, были лучшими у больных, гомозиготных по генотипу РсуКША-158V (приблизительно 20% населения). И наоборот, больные, гетерозиготные или гомозиготные по генотипу РсуКША-158Р с более низкой аффинностью (приблизительно 80% населения) отвечают хуже. Эти данные указывают на то, что мутации Рс, которые усиливают активность АЭСС носителей 158Р, могут усиливать клиническую эффективность лечения рака с помощью антител. Генетический полиморфизм также присутствует в рецепторе РсуКПА (СЭ32) человека в положении 131 во внеклеточном домене, который кодирует или гистидин (Н), или аргинин (К) в этом положении. Обнаружено, что полиморфизм в положении 131 влияет на способность связываться с человеческим 1дС. Недавние данные также показывают корреляцию между полиморфизмом РсуКПА в положении 131 и клиническим ответом на ритуксан. Больные, гомозиготные по аллели Н131, давали значительно более высокий показатель ответа, чем 2 другие группы.

РсуК1, РсуК11 и РсуКШ представляют собой рецепторы надсемейства иммуноглобулинов (1д8Р); РсуК1 содержит три домена 1д8Р во внеклеточном домене, тогда как РсуК11 и РсуКШ содержат только два 1д8Р домена в своих внеклеточных доменах. Другой тип рецептора Рс представляет собой рецептор Рс новорожденных (РсКп). РсКп является структурно сходным с основным комплексом гистосовместимости (МНС) и состоит из α-цепи, нековалентно связанной с в2-микроглобулином.

Варианты области Ге

В настоящем изобретении предлагаются варианты полипептида, последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие варианты полипептида, а также способы создания вариантов полипептида. Предпочтительно, варианты полипептида по настоящему изобретению отличаются от исходного полипептида как минимум одной аминокислотной модификацией, предпочтительно аминокислотной заменой. Исходный, дикого типа, начальный или невариантный полипептид предпочтительно включает как минимум часть области Рс антитела, и аминокислотная замена в варианте полипептида имеет место в области Рс. Исходный полипептид, включающий область Рс, может быть получен с применением спосо

- 29 012464 бов, доступных в данной области техники для создания полипептидов, включающих область Рс или его часть. В предпочтительных вариантах осуществления исходный полипептид представляет собой антитело. Исходный полипептид может, однако, быть любым другим полипептидом, который включает как минимум часть области Рс (например, иммуноадгезином). Часть области Рс в исходном полипептиде может представлять собой природную или неприродпую последовательность, предпочтительно она представляет собой природную последовательность человеческого происхождения. В некоторых вариантах осуществления вариант области Рс может быть создан (например, в соответствии со способами, раскрытыми в данном описании) и может быть слит с выбранным гетерологичным полипептидом, таким как вариабельный домен антитела или домен связывания рецептора или лиганда или любой терапевтический полипептид.

В предпочтительных вариантах осуществления исходный полипептид включает область Рс или ее функциональную часть. Обычно область Рс исходного полипептида должна включать область Рс с природной последовательностью, и предпочтительно природную последовательность области Рс человека. Однако область Рс исходного полипептида может содержать одну или более предварительно существовавших изменений или модификаций (например, замен аминокислот) в сравнении с природной последовательностью области Рс. Например, С1с.|-связывающая активность области Рс может быть предварительно изменена или РсуК связывающая активность области Рс может быть изменена. Могут быть сконструированы желательный вариант области Рс или нуклеиновая кислота, кодирующая целевой вариант области Рс, без функционального присоединения к желательному партнеру слияния варианта области Рс (например, вариабельной области антитела, гетерологичному белку) и затем функционально связан с ним. В дополнительных вариантах осуществления исходная область Рс полипептида является концептуальной (например, воображаемым продуктом размышлений или визуальным представлением на компьютере или на бумаге) и, хотя он физически не существует, конструктор антител может выбрать желательный вариант последовательности аминокислот области Рс и создать полипептид, включающий такую последовательность, или ДНК, кодирующую желательный вариант последовательности аминокислот области Рс. Однако в предпочтительных вариантах осуществления доступна нуклеиновая кислота, кодирующая область Рс исходного полипептида, и данную последовательность нуклеиновой кислоты изменяют для создания варианта последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант области Рс.

Нуклеиновая кислота, кодирующая вариант исходного полипептида (или просто вариант области Рс), может быть получена способами, известными в данной области техники, с использованием указаний данной спецификации для конкретных последовательностей. Такие способы включают, не ограничиваясь ими, получение путем сайт-специфичного (или олигонуклеотид-опосредованного) мутагенеза, ПЦР мутагенеза (например, Уа11с11с с1 а1., Ыис. Аайк Кек. 17:723-733 (1989)) и кассетного мутагенеза (например, ^е11к е1 а1., Оепе 34:315-323 (1985)) ранее полученной нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид. Сайт-специфичный мутагенез представляет собой предпочтительный способ получения вариантов. Данный способ хорошо известен в данной области техники (см., например, Сайег е1 а1. Ыискю Аайк Кек. 13: 4431-4443 (1985) и Кипке1 е1 а1., Ргос. ЫаЙ. Асай. 8οΐ. И8Л 82: 488 (1987)).

Альтернативно или дополнительно, желательная последовательность аминокислот, кодирующая вариант полипептида, может быть определена, и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая такой вариант аминокислотной последовательности полипептида (т.е. полипептида, который включает вариант области Рс, который включает замену аминокислоты, описанную в данном описании), может быть создана синтетическим путем. Она все еще рассматривается как вариант области Рс исходной области Рс, даже если исходная область Рс не была молекулярным предшественником варианта области Рс, но вместо этого последовательность аминокислот области Рс присутствовала в исходном варианте в отсутствие желательной замены аминокислоты.

Последовательность аминокислот исходного полипептида может быть модифицирована для того, чтобы создать вариант области Рс с измененной аффинностью связывания Рс рецептором или активностью ίη νίίτο и/или ίη νίνο и/или измененной активностью АЭСС ίη νίίτο и/или ίη νίνο и/или измененной активностью СЭС ίη νίίτο и/или ίη νίνο. Последовательность аминокислот исходного полипептида также может быть модифицирована для того, чтобы создать вариант области Рс с измененными свойствами связывания комплемента и/или периодом полужизни в кровотоке.

Значительные модификации биологических свойств области Рс могут достигаться путем выбора аминокислотных замен, которые значительно различаются по действию на изменение (а) структуры скелета полипептида в области замены, например, в качестве складчатой или спиральной конформации, (Ь) заряда или гидрофобности молекулы в целевом сайте или объема боковой цепи, (й) взаимодействия с углеводом или (е) гибкости движений домена. Остатки природного происхождения делят на классы на базе общих свойств боковой цепи:

(1) гидрофобные: норлейцин, тек а1а, νа1, 1еи, 11е;

(2) нейтральные гидрофильные: сук, кег, 1Нг;

(3) кислые: акр, д1и;

(4) основные: акт §1η, Ык, 1ук, агд;

(5) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: д1у, рго; и

- 30 012464 (6) ароматические: !гр, !уг, рйс.

Неконсервативные замены обычно влекут за собой замену члена одного из этих классов членом другого класса. Консервативные замены обычно влекут за собой замену члена одного из этих классов другим членом того же класса.

Как показано в примерах ниже, можно создать вариант области Ес с измененной активностью (эффекторная функция(и) и/или фармакокинетика). Можно, например, модифицировать один или более аминокислотных остатков области Ес с целью изменения (например, увеличения или уменьшения) активности ЛЭСС или активности СЭС или аффинности связывания ЕсЯп. В предпочтительных вариантах осуществления модификация представляет собой замену, как приведено в табл. 1 данного описания. Обычно производят замену аминокислоты по одному или более остаткам области Ес, идентифицированную в данном описании, как влияющую на активность ΆΌΟΟ, с целью создания такого варианта области Ес. В предпочтительных вариантах осуществления обычно заменяют не более чем от одного до приблизительно десяти остатков в области Ес. Области Ес в данном описании, включающие одну или более замен аминокислот, предпочтительно сохраняют как минимум приблизительно 80%, предпочтительно как минимум приблизительно 90% и наиболее предпочтительно как минимум приблизительно 95% исходной последовательности области Ес или природной последовательности области Ес человека.

Путем введения подходящей модификации(й) аминокислотной последовательности в исходной области Ес можно создать вариант области Ес, который (в сравнении с исходной областью Ес) (а) опосредует АЭСС в присутствии эффекторных клеток человека более или менее эффективно и/или (Ь) опосредует ΟΌΟ в присутствии человеческого комплемента более или менее эффективно и/или (с) связывает С1с.| с желаемой аффинностью и/или (б) связывает Ес гамма рецептор (ЕсуЯ) или рецептор Ес новорожденных (ЕсЯп) с желательной аффинностью. Такие варианты области Ес обычно включают как минимум одну модификацию аминокислоты в области Ес. Предпочтительно модификация представляет собой замену аминокислоты, более предпочтительно замена аминокислоты является такой, как перечислено в табл. 1-9 данного описания.

В предпочтительных вариантах осуществления исходная область Ес полипептида представляет собой область Ес человека или ее функциональный фрагмент, например, природная область Ес человеческого 1дО1 (аллотипы £ и а, ζ), 1дС2, 1дС3, 1дС4, и все аллотипы, известные или обнаруженные у любых видов. Такие области содержат природные последовательности, такие, например, как показанные на фиг. 2 (8ЕО ΙΌ N0: 1-8) и фиг. 3 (8Е0 ΙΌ N0: 9-12) данного описания.

В некоторых вариантах осуществления с целью создания области Ес с повышенной АЭСС активностью исходный полипептид предпочтительно обладает предварительно существующей ЛЭСС активностью (например, исходный полипептид включает область Ес человеческого 1дО1 или человеческого 1дС3). В некоторых вариантах осуществления вариант обладает повышенной активностью ЛЭСС (например, большими уровнями по сравнению с исходным в соответствии с описанными здесь тестами ΆΌΟΟ) в сравнении с исходным полипептидом, т.е. моноклональное антитело, которое включает вариант области Ес, обладает повышенной активностью ЛЭСС при сравнении в идентичных условиях с моноклональным антителом, которое включает исходную область Ес или природную последовательность области Ес 1дО1 или 1дС3, но в других отношениях является идентичным моноклональному антителу, включающему вариант области Ес.

В предпочтительных вариантах осуществления замену(ы) аминокислоты вводят в домены СН2 и/или СН3 области Ес. В предпочтительных вариантах осуществления исходная область Ес, используемая как шаблон для создания таких вариантов, включает область Ес 1дС человека.

В некоторых вариантах осуществления для того, чтобы создать вариант области Ес с увеличенной активностью ΟΌΟ, исходный полипептид предпочтительно обладает предсуществующей активностью ΟΌΟ. В некоторых вариантах осуществления вариант обладает повышенной активностью ΟΌΟ (например, большие уровни по сравнению с исходным в соответствии с описанным здесь анализом ΟΌΟ) в сравнении с исходным полипептидом, т.е. моноклональное антитело, которое включает вариант области Ес, обладает повышенной активностью ΟΌΟ при сравнении в идентичных условиях с моноклональным антителом, включающим исходную область Ес или природную последовательность области Ес 1дО1 или 1дО3, но в других отношениях идентичным моноклональному антителу, которое включает вариант области Ес.

Варианты полипептида, описанные в данном описании, могут подвергаться дальнейшим модификациям, в зависимости от желательного или предусмотренного применения полипептида. Такие модификации могут включать, например, дальнейшее изменение последовательности аминокислот (замена, вставка и/или делеция аминокислотных остатков), модификации углеводов, слияние с гетерологичным(и) полипептидом(ами) и/или ковалентные модификации. Такие дополнительные модификации могут быть осуществлены до, одновременно с или после модификации(й) аминокислот(ы), раскрытых в данном описании, что изменяет связывание с рецептором Ес и/или активность ΆΌΟΟ и/или активность ΟΌΟ.

Альтернативно или дополнительно, может быть полезным сочетать модификации аминокислот с одной или более дополнительных модификаций аминокислот, которые изменяют функцию связывания

- 31 012464

С1с.| и/или СЭС области Ес. Например, исходный полипептид может быть неспособен связывать С 1с| и/или опосредовать СЭС и может быть модифицирован в соответствии с указаниями в данном описании таким образом, что он приобретает эти дополнительные эффекторные функции. Более того, полипептиды с предсуществующей С1 с| связывающей активностью, необязательно дополнительно обладающие способностью опосредовать СОС. могут быть модифицированы таким образом, что один или оба из этих видов активности повышаются (или альтернативно, снижаются). Конкретные модификации аминокислот области Ес, которые изменяют связывание С1с| и/или изменяют активность СЭС, описаны в данном описании (см. табл. 2, 7, 8 и 10) и, например, в \УО0042072.

Как раскрыто выше, можно спроектировать область Ес или ее часть с измененной эффекторной функцией, например, путем модификации активности СЭС и/или активности ЛЭСС. Например, можно создать вариант области Ес с улучшенной СЭС активностью и улучшенной ЛЭСС активностью. Альтернативно, если желательно уменьшить или устранить эффекторную функцию, можно спроектировать вариант области Ес со сниженной СЭС активностью и/или сниженной ЛЭСС активностью. В других вариантах осуществления можно повысить только один из этих видов активности и необязательно также снизить другой вид активности, например, для создания варианта области Ес с улучшенной ЛЭСС активностью, но сниженной активностью СЭС, и наоборот. Кроме того, можно создать вариант области Ес с модифицированной аффинностью связывания с ЕсКи, протеином А, и/или другими белками, которые связываются с Ес.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предлагаются композиции, которые включают вариант исходного полипептида, где исходный полипептид включает область Ес (или ее часть) и где вариант включает по крайней мере одну модификацию остатка поверхностной аминокислоты в пределах области Ес (см., например, ΌβίδβηΚοίετ, ВюсЬешШту, 20 (9):2361-70, Άρτίΐ 1981, и \УО0042072). В других вариантах осуществления настоящего изобретения предлагаются композиции, которые включают вариант исходного полипептида, содержащего область Ес, где вариант включает по крайней мере одну модификацию остатка неповерхностной аминокислоты в области Ес. В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение включает вариант исходного полипептида, содержащего область Ес, где вариант включает как минимум одну модификацию поверхностной аминокислоты и как минимум одну модификацию неповерхностной аминокислоты, обе в области Ес.

Комбинированные варианты

В некоторых вариантах осуществления вариант области Ес по настоящему изобретению включает две или более модификаций аминокислот (например, замены). Такие комбинированные варианты могут быть получены, например, путем выбора двух или более замен аминокислот, описанных выше (например, см. табл. 1) или одной или более замен аминокислот, как приведено в табл. 1, в дополнение к заменам, известным в данной области техники.

Комбинированные варианты, приведенные в табл. 10, и другие комбинированные варианты (такие как раскрытые в \УО0042072 в сочетании с раскрытыми здесь) могут быть исследованы на предмет определенной активности (например, ЕсКп-связывающей активности, активности ЛЭСС и активности СЭС) в разнообразных тестах (см., примеры ниже). В этой связи могут быть идентифицированы полезные комбинированные варианты.

В определенных предпочтительных вариантах осуществления множественные замены аминокислот в вариантах области Ес по настоящему изобретению содержат одну замену аминокислоты, которая повышает ЛЭСС активность, и одну модификацию аминокислоты, которая повышает аффинность связывания с рецептором Ес новорожденных (ЕсКи) (например, при рН 6,0) полипептида, включающего вариант области Ес. В других вариантах осуществления комбинированные варианты настоящего изобретения содержат одну модификацию поверхностной аминокислоты в варианте области Ес по настоящему изобретению, и одну модификацию неповерхностной аминокислоты. Дополнительные комбинированные варианты в вариантах области Ес настоящего изобретения могут быть созданы путем сочетания двух или более описанных здесь замен аминокислот или как минимум одной описанной здесь замены аминокислоты с описанными в \УО0042072.

Анализ вариантов полипептида

В настоящем изобретении предлагаются различные тесты для скрининга вариантов области Ес или полипептидов, включающих вариант области Ес по данному изобретению. Скриниговые тесты могут использоваться для поиска или подтверждения полезных вариантов. Например, комбинированные варианты (см., например, табл. 10) могут подвергаться скринингу для поиска вариантов с измененным связыванием ЕсК, и/или измененной ЛЭСС и/или измененной СЭС активностью (например, повышенной или сниженной активностью ЛЭСС или активностью СЭС) и/или модифицированной способностью истощать клетки-мишени (например, В-клетки) из цельной крови. Кроме того, как описано ниже, тесты по данному изобретению могут применяться для поиска или подтверждения вариантов, которые обладают полезной терапевтической активностью для субъекта (например, такого, как человек с симптомами заболевания, которое отвечает на антитело или иммуноадгезин). Разнообразные типы анализа могут применяться для оценки любого изменения в варианте в сравнении с исходным полипептидом (см. скрининговые анализы, предлагаемые, например, в \УО0042072). Дополнительные иллюстративные тесты описаны

- 32 012464 ниже.

В предпочтительных вариантах осуществления вариант полипептида (т.е. полипептида, включающего вариант области Рс по настоящему изобретению или ее функциональную часть) представляет собой моноклональное антитело, которое в существенной мере сохраняет способность специфически связывать антиген (через немодифицированную антигенсвязывающую область или модифицированную антигенсвязывающую область) в сравнении с исходным полипептидом (например, связывающая способность предпочтительно менее, чем приблизительно в 20 раз, 10 раз, 7 раз или менее, чем приблизительно в 5 раз отличается от таковой исходного полипептида). Связывающая способность варианта полипептида с антигеном может быть определена с использованием таких способов, как ЕЬ18А, анализ сортировкой по флуоресценции активированных клеток (РАС8) или радиоиммунопреципитация (К1А), например, для оценки вариантов по настоящему изобретению могут применяться тесты связывания РсК. Например, связывание с Рс рецепторами, такими как РсуК1, РсуКПа, РсуКПЬ, РсуКШ, РсКи и т.д., можно измерить титрованием варианта полипептида и измерением связанного варианта полипептида с использованием антитела, которое специфически связывается с вариантом полипептида в формате ЕЫ8А (см. примеры ниже). Например, может быть проведен скрининг варианта, который включает антитело, в стандартном тесте ЕЫ8А для определения связывания с РсКи при рН 6,0 и рН 7,0 или рН 7,4. Твердая поверхность, покрытая стрептавидином или неутравидином, может использоваться для захвата меченного биотином РсКи любых видов, таких как мышь или человек. После блокирования захвата рецептор может инкубироваться с вариантами полипептида (например, антителами, разведенными в буферных растворах при рН 6,0 или рН 7,0). На следующей стадии добавляют молекулу, специфичную для человеческих антител (например, козьи (РаЬ')₂ против человеческого РаЬ, конъюгированные с ферментом). После этого можно добавлять субстрат для определения количества связывания варианта полипептида с иммобилизованным РсКн при рН 6,0 или рН 7,0 или рН 7,4. Результаты данного анализа можно сравнивать со способностью исходного полипептида (невариантного) связывать тот же РсК. В других предпочтительных вариантах осуществления компоненты для проведения ЕЫ8А (например, с РсКн) для скрининга вариантов упакованы в набор (например, с инструкцией по применению).

Анализ АОСС также может использоваться для скрининга вариантов по настоящему изобретению. Анализ АОСС может проводиться ίη νίίτο или ίη νίνο. Для оценки активности АОСС варианта полипептида анализ АОСС ίη νίίΓΟ может проводиться с использованием различных соотношений эффектор/мишень. В типичном анализе АОСС можно было бы использовать линию клеток-миленей, экспрессирующих один из следующих антигенов-мишеней: 0020, СО22, СО33, СО40, СО63, рецептор Е6Р, рецептор кег-2, специфичный для простаты мембранный антиген, углевод Льюиса Υ, ганглиозиды СЭ2 и 6Ό3, 1атр-1, СО-029, Ь6 и ер11А2. Эффекторные клетки могут быть получены от здорового донора (например, в день эксперимента), и РВМС, очищенные с использованием Н|51орас.|ие (81дта). Далее клеткимишени предварительно инкубируют с 1дС, включающим вариант области Рс изобретения, например, с концентрацией 0,1-1000 нг/мл в течение приблизительно 30 мин перед смешиванием с эффекторными клетками при соотношениях эффектор/мишень, например, 40:1, 20:1 и 10:1. Затем активность АОСС может быть измерена колориметрически с использованием Су1о1охюйу Ое1ес1юи Κίί (Коске Мо1еси1аг ΒίοскетюаЕ) для количественного определения гибели и лизиса клеток на базе измерения активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ), высвобожденной из цитозоля поврежденных клеток в супернатант. Активность АОСС также может быть измерена в тестах с нагрузкой хромом клеток-мишеней путем измерения результирующего высвобождения хрома 51. Независимая от антител клеточная цитотоксичность может быть определена измерением активности ЛДГ из клеток-мишеней и эффекторных клеток в отсутствие антитела. Общее высвобождение может быть измерено после добавления 1% Тритона Х-100 к смеси клеток-мишеней и эффекторных клеток. Инкубация клеток-мишеней и эффекторных клеток может проводиться в течение оптимизированного периода времени (0,54-18 ч) при 37°С в 5,0% СО₂ с последующим центрифугированием планшетов для анализа. Далее супернатанты могут быть перенесены в 96-луночные планшеты и инкубированы с реактивом для обнаружения ЛДГ в течение 30 мин при 25°С. Затем может быть измерено поглощение образца при 490 нм с применением ридера микропланшет. Затем может быть рассчитан процент цитотоксичности с использованием следующего уравнения: % цитотоксичности = экспериментальное значение - низкий контроль/высокий контроль - низкий контроль х 100%. Процент цитотоксичности анти-СО20 и вариантов затем можно сравнить непосредственно с равным количеством Ритуксана для получения относительной эффективности. В типичном анализе АОСС можно было бы использовать клетки 8Κν6.4 с избыточной экспрессией антигена СЭ20 (например, приобретенные у Атепсаи Туре Си11иге ί.'ο1ΕΗίοη) в качестве источника клеток-мишеней. Многие вариации этого анализа известны в данной области техники (см., например, /искегтаг! еί а1., СКС Сп1 Кеу МюгоЬю1 1978;7 (1) :126).

Пригодные эффекторные клетки для таких тестов включают, не ограничиваясь ими, природные ΝΚ, макрофаги и другие РВМС.

Альтернативно или дополнительно, активность АОСС вариантов полипептида по настоящему изобретению может быть оценена ίη νίνο, например, на животной модели, такой как раскрыта в С1уис8 еί а1. ΡΝΛ8 (И8А) 95:652-656 (1998)).

- 33 012464

Также может быть осуществлен скрининг вариантов настоящего изобретения на предмет активации комплемента. Для оценки активации комплемента может быть проведен анализ СЭС (см., например, Саххапо-ЗагИого е! а1., 1. 1ттипо1. Мебюбк. 202:163 (1996)). Например, различные концентрации варианта полипептида и человеческого комплемента могут быть разбавлены буферным раствором. Клетки, экспрессирующие антиген, с которым связывается вариант полипептида, могут быть разбавлены до плотности приблизительно 1х 10⁶ клеток/мл. Смеси варианта полипептида, разбавленного человеческого комплемента и клеток, экспрессирующих антиген, могут быть добавлены в плоскодонный 96-луночный планшет для культивирования клеток и инкубированы в течение 2 ч при 37°С и 5% СО₂ для облегчения опосредованного комплементом лизиса клеток. Затем добавляют 50 мкл аламара голубого (Асситеб 1п!ета!1опа1) в каждую лунку и инкубируют в течение ночи при 37°С. Поглощение можно измерить с помощью 96-луночного флуориметра с возбуждением на длине волны 530 нм и излучением на длине волны 590 нм. Результаты могут быть выражены в относительных единицах флуоресценции (КЕИ). Концентрация образца может быть рассчитана на основе стандартной кривой, и для интересующего варианта полипептида может быть рассчитан процент активности в сравнении с невариантным полипептидом.

В некоторых вариантах осуществления варианты полипептида по настоящему изобретению не активируют комплемент или активируют комплемент слабо. Например, вариант полипептида демонстрирует приблизительно 0-10% активности СЭС в данном тесте в сравнении с контрольным антителом, содержащим немутированную область Ес 1дС1. Предпочтительно, вариант не проявляет никакой активности СЭС (например, выше фоновой) в описанном выше анализе СЭС. В других вариантах осуществления вариант полипептида по настоящему изобретению обладает усиленной активностью СЭС в сравнении с исходным полипептидом (например, предпочтительно проявляя от приблизительно 1,1, 1,5, 1,7 или от 2кратного до приблизительно 100-кратного (или более) повышение активности СЭС ш νίΙΐΌ или ш у1уо при сравнении значений 1С₅₀).

Также может быть проведен скрининг вариантов полипептида по настоящему изобретению на предмет истощения клеток-мишеней в тесте с цельной кровью. Например, может быть проведен скрининг различных концентраций варианта полипептида со специфичностью к мишени ί.Ό20 на предмет истощения В-клеток в тесте с цельной кровью с применением Еаск (Уидтеу8!ег е! а1., 2003 Су!оте1гу 52А, 101-109). Свежеотобранную кровь инкубируют с различными концентрациями варианта полипептида при 37°С и 5% СО2 в течение 4 ч (время может варьировать). После инкубации красные кровяные клетки лизируют согласно инструкции производителя с помощью реактива аммония хлорида (Веск!опЭккшзоп кат. №555899), и В-клетки определяют с помощью Еаск с использованием флуоресцентно меченого антитела, специфичного для В-клеток (например, анти-СЭ19). Результаты могут быть выражены как % истощения В-клеток относительно или необработанного образца, или образца, инкубированного с посторонним (не истощающим) антителом.

В предпочтительных вариантах осуществления вариант полипептида истощает В-клетки более эффективно, чем исходный полипептид. Вариант полипептида может истощать В-клетки, например, в два или более раз сильнее, чем исходный полипептид, и предпочтительно в пять или более раз сильнее. Также вариант может демонстрировать большую эффективность в истощении В-клеток. Например, вариант может истощать такой же процент В-клеток, как и исходный полипептид, но при этом используется приблизительно в пять раз меньше, и предпочтительно приблизительно в десять раз меньше антитела. Истощение клеток-мишеней, опосредованное вариантами, может быть улучшено в сравнении с исходным полипептидом от приблизительно в 2 раза, 3 раза, 5 раз до приблизительно в 1000 раз или более, и предпочтительно от приблизительно в 5 раз до приблизительно в 1000 раз.

Также может быть проведен скрининг вариантов по настоящему изобретению ш у1уо. Может применяться любой тип анализа ш у1уо. Конкретный пример одного типа анализа приведен ниже. Этот иллюстративный анализ позволяет осуществить доклиническую оценку вариантов Ес ш у1уо. Вариант, подлежащий изучению, может быть встроен в область Ес конкретного антитела, относительно которого известно, что оно обладает определенной активностью. Например, вариант может быть встроен в область Ес анти-СО20 1дС путем мутагенеза. Это позволяет сравнить исходный 1дС и вариант Ес 1дС непосредственно с ритуксаном (веществом, которое доказанно способствует регрессии опухоли).

Доклиническая оценка может быть проведена в 2 фазы (фармакокинетическую и фармакодинамическую фазы). Цель фармакокинетических исследований фазы I состоит в определении наличия расхождений в скорости клиренса между вариантом Ес 1дС и антителом с доказанной активностью ш у1уо (например, ритуксаном). Различия в скорости клиренса могут быть причиной различий в стационарном уровне 1дС в сыворотке. Соответственно, если обнаружены различия в стационарных концентрациях, данные должны быть нормализованы для обеспечения точных сравнений. Целью фармакодинамических исследований фазы II является определение влияния мутаций Ес, в данном случае, на рост опухоли. В предварительных исследованиях применялась однократная доза ритуксана, которая полностью ингибировала рост опухоли. Поскольку это не позволяет измерить количественные различия, следует использовать интервал доз.

Фармакокинетическое сравнение фазы I для варианта Ес, исходного Ес дикого типа и ритуксана может быть осуществлено, например, следующим образом. Во-первых, 40 мкг (или другая подлежащая

- 34 012464 исследованию доза) на животное может быть введено внутривенно с количественным определением уровня 1дС в плазме через 0, 0,25, 0,5, 1, 24, 48, 72, 96, 120, 168 и 336 ч. Эти данные могут быть обработаны, например, с использованием фармакокинетической программы (ΨίηΝοηΕίη) и двухкомпартментальной фармакокинетической модели с нулевой задержкой для получения скорости клиренса. Скорость клиренса может использоваться для определения стационарного уровня в плазме по следующему уравнению: С=доза/(скорость клиренса х ΐ), где ΐ представляет собой интервал между введением доз и С представляет собой стационарный уровень в плазме.

Фармакокинетические эксперименты могут быть проведены на мышах, не несущих опухоли, например, с минимальным количеством 5 мышей на каждую временную точку.

Для следующей фазы иллюстративная модель на животных может быть использована следующим образом. В правый бок мыши СВ17-8СШ могут быть подкожно имплантированы 10⁶ клеток Вар. Немедленно после имплантации может быть введен внутривенно болюс антитела с вариантом Рс, антитела с Рс дикого типа и ритуксан, и введение продолжают до достижения опухолью размера более 2 см в диаметре. Объем опухоли можно определять каждый понедельник, среду и пятницу путем измерения длины, ширины и глубины опухоли с использованием кронциркуля (объем опухоли=длина х ширина х глубина). График «объем опухоли-время» дает скорость роста опухоли для фармакодинамических расчетов. Следует использовать как минимум около 10 животных в каждой группе.

Фаза II фармакодинамического сравнения антитела с вариантом Рс, антитела с Рс дикого типа и ритуксана может проводиться следующим образом. Согласно опубликованным данным ритуксан в дозе 10 мкг/г 1 раз в неделю полностью ингибировал рост опухоли ίη νίνο (С1упе§ е! а1., Ναΐ Меб. 6(4): 443-6, 2000). Таким образом, могут исследоваться еженедельные дозы в интервале 10, 5, 1, 0,5 и 0 мкг/г. Стационарный уровень в плазме, при котором рост опухоли ингибируется на 50%, может быть определен графически на основе соотношения между стационарным уровнем в плазме и эффективностью. Стационарный уровень в плазме может быть рассчитан, как описано выше. При необходимости τ может корректироваться соответствующим образом для антитела с каждым вариантом Рс и антителом с Рс дикого типа в зависимости от их фармакокинетических свойств для достижения сравнимого с ритуксаном стационарного уровня в плазме. Статистически улучшенные фармакодинамические значения для антитела с вариантом Рс в сравнении с исходным полипептидом (например, антителом с Рс дикого типа) и ритуксаном обычно показывают, что антитело с вариантом Рс демонстрирует улучшенную активность ίη νίνο.

Дополнительное фармакодинамическое сравнение антител с вариантом Рс, антител с Рс дикого типа и ритуксана может быть проведено на обезьянах, как было описано ранее (ЯеГГ е! а1., В1ооб 83, 435-445, 1994). Зависимость «доза-ответ» для истощения периферических В-клеток и В-клеток лимфатического узла может использоваться для сравнения относительной эффективности вариантов Рс с Рс дикого типа и ритуксаном, которые вводятся внутривенно и/или подкожно. Статистически улучшенные фармакодинамические значения варианта Рс в сравнении с исходным полипептидом (например, Рс дикого типа) и ритуксаном в целом будут показывать, что антитело с вариантом Рс демонстрирует улучшенную активность ίη νί\Ό.

В дополнительных вариантах осуществления производят скрининг вариантов (т.е. полипептидов, включающих вариант области Рс по настоящему изобретению или его часть) таким образом, что идентифицируют варианты, которые полезны для терапевтического применения, как минимум у двух видов. Такие варианты обозначают в данном описании как улучшенные варианты у двух видов, и они особенно полезны для идентификации вариантов, которые являются лечебными для людей, и также демонстрируют (или, вероятно, будут демонстрировать) эффективность на животной модели. В этой связи, в настоящем изобретении предлагаются способы идентификации вариантов, которые имеют высокие шансы быть зарегистрированными для клинических испытаний на людях, поскольку данные на животных моделях, вероятно, будут поддерживать любые заявки на тестирование на людях, направленные в правительственные регуляторные органы (например, Управление пищевых продуктов и лекарств США).

В некоторых вариантах осуществления улучшенные варианты у двух видов идентифицируют, вопервых, проведением анализа АЭСС с использованием эффекторных клеток человека для поиска улучшенных вариантов, и затем проведением второго анализа АЭСС с использованием эффекторных клеток мышей, крыс или отличных от человека приматов для идентификации подмножества улучшенных вариантов, которые представляют собой улучшенные варианты у двух видов. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предлагаются способы для идентификации улучшенных вариантов у двух видов, которые включают: а) обеспечение: ί) клетками-мишенями, ίί) композицией, которая включает рассматриваемый вариант исходного полипептида, содержащий как минимум часть области Рс, где рассматриваемый вариант включает как минимум одну замену аминокислоты в области Рс, и где рассматриваемый вариант опосредует цитотоксичность в отношении клеток-мишеней в присутствии эффекторных клеток первого вида (например, человека) более эффективно, чем исходный полипептид, и ш) эффекторными клетками второго вида (например, мыши, крысы или отличного от человека примата), и Ь) инкубацию композиции с клетками-мишенями в таких условиях, в которых рассматриваемый вариант связывается с клетками-мишенями, образуя тем самым клетки-мишени, связанные с рассматриваемым

- 35 012464 вариантом, с) смешивание эффекторных клеток второго вида с клетками-мишенями, связанными с рассматриваемым вариантом, и б) измерение цитотоксичности в отношении клеток-мишеней, опосредованной рассматриваемым вариантом.

В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает стадию е) определения того, опосредует ли рассматриваемый вариант цитотоксичность в отношении клеток-мишеней в присутствии эффекторных клеток второго вида более эффективно, чем исходный полипептид. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает стадию ί) идентификации рассматриваемого варианта как улучшенного варианта у двух видов, который опосредует цитотоксичность в отношении клетокмишеней в присутствии эффекторных клеток второго вида более эффективно, чем исходный полипептид. В предпочтительных вариантах осуществления идентифицированные варианты с двойной видовой специфичностью затем подвергают скринингу ίη νινο в одном или более тестах на животных.

В некоторых вариантах осуществления улучшенные варианты у двух видов идентифицируют, вопервых, проведением анализа на цельной крови с использованием крови человека для поиска улучшенных вариантов, и затем проведением второго анализа на цельной крови с использованием крови мыши, крысы или отличного от человека примата для идентификации подмножества улучшенных вариантов, которые представляют собой улучшенные варианты у двух видов. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предлагаются способы идентификации улучшенных вариантов у двух видов, которые включают: а) обеспечение: ί) клетками-мишенями, ίί) композицией, которая включает рассматриваемый вариант исходного полипептида, содержащий как минимум часть области Ес, где рассматриваемый вариант включает как минимум одну замену аминокислоты в области Ес, и где рассматриваемый вариант опосредует истощение клеток-мишеней в присутствии крови первого вида (например, человека) более эффективно, чем исходный полипептид, и ш) кровью второго вида (например, мыши, крысы или отличного от человека примата), Ь) инкубацию композиции с клетками-мишенями в таких условиях, что рассматриваемый вариант связывается с клетками-мишенями, образуя тем самым клеткимишени, связанные с рассматриваемым вариантом, с) смешивание крови второго вида с клеткамимишенями, связанными с рассматриваемым вариантом, и б) измерение истощения клеток-мишеней, опосредованного рассматриваемым вариантом. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает стадию е) определения того, опосредует ли рассматриваемый вариант истощение клетокмишеней в присутствии крови второго вида более эффективно, чем исходный полипептид. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает стадию ί) идентификации рассматриваемого варианта как улучшенного варианта у двух видов, который опосредует истощение клеток-мишеней в присутствии крови второго вида более эффективно, чем исходный полипептид. В предпочтительных вариантах осуществления идентифицированные варианты с двойной видовой специфичностью затем подвергают скринингу ίη νινο в одном или более тестах на животных.

В некоторых вариантах осуществления улучшенные варианты у двух видов идентифицируют проведением любого из описанных выше тестов с использованием человеческих компонентов (например, клеток человека, ЕсЯ человека, и т.д.) для идентификации улучшенных вариантов, и затем выполняют такой же анализ (или другой анализ) с компонентами животных, отличных от человека (например, мышиными клетками, мышиными ЕсЯ, и т.д.). В этой связи, может быть идентифицировано подмножество вариантов, которые показывают хороший эффект в соответствии с данными критериями как в тесте на основе человеческих материалов, так и в тесте на основе материалов второго вида.

Типичный способ для идентификации улучшенных вариантов у двух видов представляет собой следующее. Во-первых, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей как минимум часть области Ес 1дС. подвергают мутации таким образом, что экспрессируемая аминокислотная последовательность содержит как минимум одну замену аминокислоты, таким образом, образуя тем самым вариант. Этот экспрессированный 1дС вариант затем характеризуют в тесте ЛЭСС с использованием РВМС человека или их подмножества (например, ΝΚ клеток или макрофагов). Если обнаружена повышенная АЭСС активность, то осуществляют скрининг варианта во втором тесте АЭСС с использованием мышиных или крысиных РВМС. Альтернативно или дополнительно, может быть проведен анализ связывания варианта с клонированными рецепторами грызунов или клеточными линиями. В конечном итоге, если найденный вариант оказывается улучшенным по данным второго теста, что делает его вдвойне улучшенным, то осуществляют скрининг варианта ίη νινο на мышах или крысах.

Типичные молекулы, содержащие вариант области Те

Вариант области Ес по настоящему изобретению может быть частью молекулы большего размера. Молекулы большего размера могут быть, например, моноклональными антителами, поликлональными антителами, гибридными антителами, гуманизированными антителами, биспецифичными антителами, иммуноадгезинами и т.д. Кроме того, вариант области Ес изобретения может быть функционально связан с отличным от антитела полипептидом, благодаря которому он может приобретать измененный (повышенный или пониженный) период полужизни. Поэтому очевидно, что имеется широкий спектр применения для вариантов области Ес по настоящему изобретению.

- 36 012464

Антитела, содержащие варианты области Ге

В предпочтительных вариантах осуществления молекула, содержащая вариант области Ес (например, полипептид) представляет собой антитело. Способы получения антител описаны ниже.

(ί) Выбор и получение антигена

Обычно, когда молекула, содержащая вариант области Ес, представляет собой антитело, антитело направлено против целевого антигена. Предпочтительно антиген представляет собой полипептид, и введение антитела млекопитающему, которое страдает от заболевания или расстройства и которому могло бы быть полезным снижение количества или активности молекулы антигена, может приводить к терапевтической пользе для такого млекопитающего. Однако, также могут применяться антитела, направленные против неполипептидных антигенов (таких, как связанные с опухолью гликолипидные антигены; см. патент США 5091178).

Примеры антигенов включают, не ограничиваясь ими, такие молекулы, как ренин; гормон роста, включая гормон роста человека и бычий гормон роста; рилизинг-фактор гормона роста; паратиреоидный гормон; тироксинстимулирующий гормон; липопротеины; альфа-1-антитрипсин; А-цепь инсулина; Вцепь инсулина; проинсулин; фолликулостимулирующий гормон; кальцитонин, лютеинизирующий гормон; глюкагон; факторы свертывания, такие как фактор УШС, фактор IX, тканевой фактор (ТЕ) и фактор вон Виллебранда; противосвертывающие факторы, такие как протеин С; натрийуретический фактор предсердий; легочный сурфактант; активатор плазминогена, такой как урокиназа или активатор плазминогена мочи человека или тканевого типа (ΐ-ΡΑ); бомбезин; тромбин; гемопоэтический фактор роста; факторы некроза опухоли альфа и бета; энкефалиназа; ΚΑΝΤΕ8 (экспрессия и секреция обычно регулируются активаций Т-клеток); воспалительный белок макрофагов человека (ΜΙΡ-1-альфа); альбумин сыворотки, такой как альбумин сыворотки человека; антимюллеров гормон; А-цепь релаксина; В-цепь релаксина; прорелаксин; мышиный гонадотропин-ассоциированный пептид; микробный белок, такой как бета-лактамаза; ДНКаза; ΙβΕ; антиген, ассоциированный с цитотоксичными Т-лимфоцитами (СТЕЛ), такой как ΟΤΕ-ΑΠ; ингибин; активин; фактор роста эндотелия сосудов (УйСЕ); рецепторы гормонов или факторов роста; протеин А или Ό; ревматоидные факторы; нейротрофический фактор, такой как нейротрофический фактор из кости (ΒΌΝΡ), нейротрофин-3, -4, -5 или -6 (ΝΤ-3, ΝΤ-4, ΝΤ-5 или ΝΤ-6) или фактор роста нервов; фактор роста из тромбоцитов (ГЭСЕ); фактор роста фибробластов, такой как аЕСЕ и вЕСЕ; эпидермальный фактор роста (ЕСЕ); трансформирующий фактор роста (ТСЕ), такой как ТСЕальфа и ТСЕ-бета, включая ТСЕ-1, ТСЕ-2, ТСЕ-3, ТСЕ-4 или ТСЕ-5; инсулиноподобный фактор роста-Ι и -II (ЮЕ-Ι и ЮЕ-ΙΙ); дез(1-3)-IСЕ-I (мозговой ЮЕ-Ι), белки, связывающие инсулиноподобный фактор роста; белки СО, такие как СЭ3, СЭ4, СЭ8, СЭ19 и СЭ20; эритропоэтин; остеоиндуктивные факторы; иммунотоксины; костный морфогенный белок (ΒΜΡ); фактор роста и дифференцировки (например, СЭК8) интерферон, такой как интерферон-альфа, -бета и -гамма; колониестимулирующие факторы (С8Е), например, М-С8Е, СМ-С8Е и С-С8Е; интерлейкины (Ш), например, от ГЪ-1 до ГЪ-10; супероксиддисмутаза; рецепторы Т-25 клеток; поверхностные белки мембраны; фактор ускорения распада комплемента; вирусный антиген, такой как, например, часть оболочки СПИДа; транспортные белки; рецепторы хоминга; аддрессины; регуляторные белки; интегрины, такие как СО11а, СЭ11Ь, СЭ11с, СЭ18, ΚΆΜ, ΥΕΑ-4 и VСЛΜ; ассоциированный с опухолью антиген, такой как ΗΕΒ2, ΗΕΒ3 или ΗΕΒ4 рецептор; грелин член пути апоптоза; и фрагменты или предшественники любого из перечисленных выше полипептидов.

Предпочтительные антигены включают, не ограничиваясь ими, белки СО, такие как СЭ3, СЭ4, СЭ8, СЭ19, СЭ20 и СЭ34; члены семейства рецепторов ΕτϋΒ, такие как рецептор ΕСЕ, рецептор ΗΕΒ2, ΗΕΒ3 или ΗΕΒ4; молекулы адгезии клеток, такие как ΕΤΑ-Γ Мас1, р150.95, νΕΑ-4, Ι0ΑΜ-1, VСЛΜ, а4/р7 интегрин и (Χνφ3 интегрин, включая 5 или их субъединицы (например, анти-СОПа, анти-СЭ18 или анти-СЭПЬ антитела); факторы роста, такие как УЕСЕ; тканевой фактор (ΤΕ); альфа-интерферон (αΙΕΝ); факторы роста и дифференцировки, например, СОЕ-8; интерлейкин, такой как Ш-8; Ι§Ε; антигены групп крови; рецептор П1<2/Г113; рецептор ожирения (ОВ); рецептор тр1; СΤ^Л-4. протеин С и грелин.

Растворимые антигены или их фрагменты необязательно конъюгированные с другими молекулами, могут применяться как иммуногены для создания антител. Для трансмембранных молекул, таких как рецепторы, их фрагменты (например, внеклеточный домен рецептора) могут применяться как иммуногены. Альтернативно, клетки, экспрессирующие трансмембранную молекулу, могут применяться как иммуноген. Такие клетки могут быть получены из природного источника (например, линии раковых клеток) или могут быть клетками, которые были трансформированы рекомбинантными способами для экспрессии трансмембранной молекулы. Другие антигены и их формы, полезные для приготовления антител, должны быть понятны специалистам в данной области.

(Н) Поликлональные антитела

В настоящем изобретении предлагаются поликлональные антитела с вариантами области Ес. Например, репертуар человеческого иммуноглобулина, включающий модифицированные константные области ^СЕ может быть трансплантирован мышам с инактивированным иммуноглобулином, что дает мышей, экспрессирующих репертуар ^С, содержащий модифицированные области Ес (см., например, Μβηάβζ, Μ.Ε с1 а1., ЧаШгс Сепейск 15:146 (1997)). Предпочтительно поликлональные антитела у живот

- 37 012464 ных индуцируют множественными подкожными (п/к) или внутрибрюшинными (в/бр) инъекциями соответствующего антигена и адъюванта. Может быть полезно конъюгировать соответствующий антиген с белком, который является иммуногенным для вида, подлежащего иммунизации (например, гемоцианином моллюска, альбумином сыворотки, бычим тироглобулином или соевым ингибитором трипсина) с использованием бифункционального или дериватизирующего агента, например, малеимидобензоилсульфосукцинимидного сложного эфира для конъюгации через цистеиновые остатки, N гидроксисукцинимида для конъюгации через лизиновые остатки, глутаральдегида, янтарного ангидрида, 80С1₂ или КШ=С=МК, где К и К1 представляют собой различные алкильные группы.

Примеры общего протокола иммунизации для кролика и мыши приведены ниже. Животных иммунизируют против антигена, иммуногенных конъюгатов или производных путем комбинирования, например, 100 мкг или 5 мкг белка или конъюгата (например, для кролика или мыши, соответственно) с 3 объемами полного адъюванта Фрейнда и введения раствора внутрикожно во множество мест. Через месяц животных повторно иммунизируют 1/5 или 1/10 от исходного количества пептида или конъюгата в полном адъюванте Фрейнда путем подкожной инъекции во множество мест. Через семь-четырнадцать дней у животных берут кровь, и определяют титр антител в сыворотке. Животных повторно иммунизируют до достижения титром фазы плато. Предпочтительно животного повторно иммунизируют конъюгатом того же антигена, но конъюгированного с другим белком и/или посредством другого сшивающего реагента. Конъюгаты также могут быть приготовлены в культуре рекомбинантных клеток в виде слитых белков. Кроме того, для применения с целью увеличения иммунного ответа подходящими являются агрегирующие агенты, такие как квасцы.

(ΐϊϊ) Моноклональные антитела

В настоящем изобретении предлагаются моноклональные антитела с вариантами области Рс. Моноклональные антитела могут быть получены многими путями, включая использование способа гибридомы (например, описанного в КоР1ег е! а1., №!иге, 256: 495, 1975) или способами рекомбинирования ДНК (например, патент США № 4816567).

В методе гибридомы мышь или другое подходящее животное-хозяин, такое как хомячок или обезьяна-макака, иммунизируют для образования лимфоцитов, которые вырабатывают или способны вырабатывать антитела, которые будут специфично связываться с белком, который использовался для иммунизации. Альтернативно, лимфоциты могут быть иммунизированы ίη уйго. Затем лимфоциты сливают с клетками миеломы, используя подходящий агент для слияния, такой как полиэтиленгликоль, для образования клетки гибридомы. Клетки гибридомы, приготовленные таким образом, высевают и выращивают в подходящей среде культивирования, которая предпочтительно содержит одно или больше веществ, которые ингибируют рост или выживание не слитых исходных клеток миеломы. Например, если в исходных клетках миеломы отсутствует фермент гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансфераза (НОРКТ или НРКТ), среда культивирования для таких гибридом типично должна включать гипоксантин, аминоптерин и тимидин (среда НАТ), вещества, которые препятствуют росту НОРКТ-дефицитных клеток.

Предпочтительными клетками миеломы являются те, которые эффективно сливаются, поддерживают стабильную продукцию антител на высоком уровне выбранными антитело-продуцирующими клетками и являются чувствительными к среде, такой как НАТ среда. Среди них предпочтительными клеточными линиями миеломы являются линии миеломы мышей, такие как происходящие из МОРС-21 и МРС11 мышиных опухолей, доступные от 8а1к ИъШШе Се11 ОкйтЬийоп Сеп!ег, 8ап О1едо, Са11£огша И8А, и клетки 8Р-2 или Х63-Ад8-653, доступные от Атепсап Туре СиРиге Со11ес11оп, КоскуШе, Магу1апй И8А. Клеточные линии миеломы человека и гетеромиеломы мыши/человека также были описаны для продукции человеческих моноклональных антител (например, ^ζ^Γ, Р Iттиηο1., 133: 3001 (1984)).

Среду культивирования, в которой растут клетки гибридомы, анализируют на продукцию моноклональных антител, направленных против антигена. Предпочтительно, специфичность связывания моноклональных антител, продуцированных клетками гибридомы, определяют с помощью иммунопреципитации или с помощью анализа связывания ίη уйго, такого как ША или ЕЫ8А. После того, как определено, что клетки гибридомы продуцируют антитела с желательными специфичностью, аффинностью и/или активностью, клоны могут быть субклонированы с помощью методик ограниченного разведения, и выращены стандартными способами. Подходящие для этой цели среды культивирования включают, например, Ό-МЕМ или среду КРМI-1640. Кроме того, клетки гибридомы могут быть выращены ίη у1уо как асцитные опухоли у животного. Моноклональные антитела, секретируемые субклонами, подходящим способом отделяют от среды культивирования, асцитной жидкости или сыворотки путем традиционных методик очистки иммуноглобулина, таких как, например, хроматография на протеин А-сефарозе, гидроксиапатите, гель-электрофорез, диализ или аффинная хроматография.

ДНК, кодирующая моноклональные антитела, легко изолируется и секвенируется с использованием традиционных методик (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, которые способны связываться специфично с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи моноклональных антител). Клетки гибридомы служат предпочтительным источником такой ДНК. После выделения ДНК может быть помещена в векторы экспрессии, которые затем трансфицируют в клетки-хозяева, такие как клетки Е. со11, обезьяньи клетки С08, клетки яичника китайского хомячка (СНО) или клетки миеломы, которые иначе

- 38 012464 не продуцируют белок иммуноглобулина, для достижения синтеза моноклональных антител в рекомбинантных клетках-хозяевах. Рекомбинантная продукция антител более подробно описана ниже.

В некоторых вариантах осуществления антитела или фрагменты антител выделяют из фаговых библиотек антител с применением способов, описанных, например, в МсСаГГеПу е! а1., №!иге, 348: 552554 (1990). С1асккоп е! а1., Уинге, 352:624-628 (1991) и Магкз е! а1., 1. Мо1. Вю1., 222: 581-597 (1991) описывают выделение мышиных и человеческих антител, соответственно, с использованием фаговых библиотек. Последующие публикации описывают продукцию высокоаффинных человеческих антител (диапазон нМ) путем перетасовки цепи (Магкк е! а1., ВюТесЬпо1оду, 10: 779-783 (1992)), а также комбинаторную инфекцию и рекомбинацию ш νί\Ό как стратегию конструирования очень больших библиотек фага (например, \Уа1ег1юи5е е! а1., Уе. Аабк. Яек., 21: 2265-2266 (1993)). Таким образом, эти способы и подобные способы представляют собой жизнеспособные альтернативы традиционным способам гибридомы моноклонального антитела, хорошо известным в области техники выделения монсклональных антител. Кроме того, ДНК может быть модифицирована, например, путем замены гомологичных мышиных последовательностей последовательностью, кодирующей константные домены тяжелой и легкой цепей человека (например, патент США №. 4816567 и Моткоп, е! а1., Ргос. №!. Асаб. 8а И8А, 81: 6851 (1984)), или путем ковалентного присоединения к кодирующей иммуноглобулин последовательности всей или части последовательности, кодирующей неиммуноглобулиновый полипептид. Типично такими неиммуноглобулиновыми полипептидами заменяют константные домены антитела или ими заменяют вариабельные домены антигенсвязывающего сайта антитела для создания гибридного бивалентного антитела, который включает один антигенсвязывающий сайт, обладающий специфичностью в отношении антигена, и другой антигенсвязывающий сайт, обладающий специфичностью в отношении другого антигена.

(ίν) Гуманизированные и человеческие антитела

В настоящем изобретении предлагаются гуманизированные и человеческие антитела с вариантами области Ес изобретения. В предпочтительных вариантах осуществления гуманизированное антитело включает последовательности аминокислот человеческого антитела вместе с остатками аминокислот, которые не происходят из антитела человека. В некоторых вариантах осуществления человеческие последовательности в гуманизированном антителе включают каркасные области (ЕЯ) и последовательности или остатки, которые не происходят из антитела человека, включающие один или более СОЯ. Следует отметить, что ЕЯ и СОЯ могут быть определены на базе нумерации аминокислотных остатков в вариабельных областях тяжелой и УЪ цепей. Термин СОЯ предназначен для обозначения несмежных антигенсвязывающих сайтов, найденных в вариабельной области полипептидов и тяжелой, и легкой цепей. Такие области были определены КаЬа! е! а1. (1. Вю1. СНет. 252:6609-6616 (1977) и ЯаЬа! е! а1. 8ес.|иепсе5 оГ Рго!ет§ оГ 1ттипо1одюа1 1п!егек! (1991); ЯаЬа!), СНобиа е! а1. (1. Мо1. Вю1. 196:901-917 (1987)); СНобиа и МасСа11ит е! а1. (Л. Мо1. Вю1. 262:732-745 (1996); МасСа11ит, где определения включают перекрывание или подмножества аминокислотных остатков при сравнении друг с другом. В любом случае применение любого из этих определений, отдельно (например, определение ЯаЬа!) или в сочетании (только для примера, комбинированное определение ЯаЬа! и С1ю11ла) в отношении СОЯ антитела (включая гуманизированное антитело), предназначено для использования в рамках термина, который определен и используется в данном описании.

Кроме того, термин каркас, если он используется для обозначения вариабельной области антитела, предназначен для обозначения всех остатков аминокислот вне областей СОЯ в вариабельной области антитела. Следовательно, длина каркаса вариабельной области составляет приблизительно 100-120 аминокислот, но термин предназначен только для обозначения аминокислот вне СОЯ. Термин каркасная область предназначен для обозначения каждого домена каркаса, который отделен СОЯ. Следовательно, для конкретного примера области УН и для СОЯ, как определено ЯаЬа!, каркасная область 1 (ЕЯ1) соответствует домену вариабельной области, который охватывает аминокислоты 1-30; каркасная область 2 (ЕЯ2) соответствует домену вариабельной области, который охватывает аминокислоты 36-49; область 3 (ЕЯ3) соответствует домену вариабельной области, который охватывает аминокислоты 66-94, и область 4 (ЕЯ4) соответствует домену вариабельной области от аминокислоты 103 до конца вариабельной области. ЕЯ для легкой цепи подобным образом разделены каждым из СОЯ вариабельной области легкой цепи. Подобным образом, с использованием определения СОЯ СЪо!Ыа или МасСа11ит или любой комбинации определений СОЯ, границы каркаса отделяются соответствующими концами СОЯ, как описано выше. Несмотря на множественные определения СОЯ, в некоторых вариантах осуществления предпочтительно использовать определение ЯаЬа! для определения СОЯ.

Остатки в гуманизированном антителе, которые не происходят из антитела человека, могут быть остатками или последовательностями, привнесенными или происходящими из других видов (включая, не ограничиваясь ею, мышь) или данные последовательности могут быть случайными последовательностями аминокислот (например, созданные из случайных последовательностей нуклеиновой кислоты), которые вставлены в последовательность гуманизированного антитела. Как отмечено выше, последовательности аминокислот в гуманизированном антителе предпочтительно представляют собой ЕЯ, в то время как остатки, которые не происходят от человеческого антитела (происходящие из других видов или слу

- 39 012464 чайные последовательности аминокислот), предпочтительно соответствуют СОЯ. Однако в некоторых вариантах осуществления один или более ЕЯ могут содержать один или более отличных от человеческих остатков аминокислот. В случаях изменений или модификаций (например, путем введения отличного от человеческого остатка) в каркас, в других отношениях являющийся человеческим, для измененной или модифицированной области ЕЯ возможно соседство с модифицированной СОЯ из других видов или случайной последовательностью СОЯ, хотя в других вариантах осуществления измененная ЕЯ не является смежной с измененной последовательностью СОЯ из других видов или случайной последовательностью СОЯ. В некоторых вариантах осуществления каркасные последовательности гуманизированного антитела являются полностью человеческими (т.е. никаких изменений каркаса не было осуществлено для человеческого каркаса). В предпочтительных вариантах осуществления каркасные последовательности гуманизированного антитела являются полностью человеческой зародышевой линией (т.е. никаких изменений каркаса не было осуществлено в каркасе зародышевой линии человека).

Остатки аминокислот от видов, отличных от человека, или случайной последовательности часто называют импортированными остатками, которые обычно берут в импортном вариабельном домене. Гуманизация может быть осуществлена в значительной степени в соответствии со способом νίπ^ι· и соавт. (например, 1опек е! а1., Иа!иге, 321: 522-525 (1986); Шесйтапп е! а1, Иа!иге, 332: 323-327 (1988); Уегйоеуеп е! а1., 8с1епсе, 239: 1534-1536 (1988)) путем замены соответствующих последовательностей антитела человека последовательностями СОЯ грызуна (или другого млекопитающего). Кроме того, могут быть также созданы антитела, где значительно меньшая часть, чем интактный вариабельный домен человека, заменена соответствующей последовательностью из видов, отличных от человека (например, патент США 4816567). На практике гуманизированные антитела обычно представляют собой антитела человека, в которых некоторые остатки СОЯ и, возможно, некоторые остатки ЕЯ заменены остатками из аналогичных сайтов в антителах грызунов или, как отмечено выше, в которых последовательности СОЯ были заменены случайными последовательностями. Только для примера, без ограничения, способы придания донорным СОЯ связывающей аффинности на каркасе вариабельной акцепторной области антитела описаны в νθ 01/27160 А1 и в патентных заявках США с регистрационными номерами 09/434870 и 09/982464.

При выборе вариабельных доменов человека, и легкой, и тяжелой цепей, предназначенных для использования в получении гуманизированных антител, важно уменьшать антигенность. В соответствии с так называемым методом наилучшего соответствия осуществляют скрининг последовательности вариабельного домена антитела грызуна, подлежащего гуманизации, против полной библиотеки известных последовательностей вариабельных доменов человека. Затем человеческая последовательность, ближайшая к последовательности грызуна, принимается как человеческий каркас (ЕЯ) для гуманизированного антитела (например, 81тк е! а1., 1. 1ттипо1., 151: 2296 (1993), и Сйо!Ыа е! а1., 1. Мо1. Вю1., 196: 901 (1987)). В другом способе используется конкретный каркас, полученный из консенсусной последовательности всех человеческих антител конкретной подгруппы легких или тяжелых цепей. Один и тот же каркас может использоваться для нескольких различных гуманизированных антител (например, Сайег е! а1., Ргос. ЫаЙ. АсаО. 8е1. И8А, 89: 4285 (1992); Ргек1ае е! а1., 1. 1ттипо1., 151: 2623 (1993)).

В других вариантах осуществления нет необходимости в «предварительном выборе» конкретного каркаса антитела человека (т. е. нет необходимости выбирать человеческий каркас с ближайшей гомологией или последовательностью последовательности с данным рассматриваемым антителом, которое должно быть гуманизировано). В данных вариантах осуществления общий или универсальный человеческий каркас может использоваться для принятия одной или более СОЯ, отличных от человеческих. В предпочтительном осуществлении единый универсальный, полностью человеческий каркас используется в качестве каркаса для всех антител, которые должны быть гуманизированы, независимо от его гомологичности с каркасной последовательностью(ями) рассматриваемых антител. В этой связи, гуманизированные антитела могут быть созданы без внесения каких-либо изменений в каркасную область. Данный универсальный, полностью человеческий каркас может затем принять одну или более последовательностей СОЯ. В одном осуществлении одна или более последовательностей СОЯ представляют собой последовательности СОЯ антител из других видов (например, мыши или крысы), которые были модифицированы в сравнении с соответствующей СОЯ в интактном антителе других видов (т.е. производится одновременное введение СОЯ и модификация СОЯ, подлежащей введению в универсальный человеческий каркас). Модификация соответствует одному или более изменениям аминокислот (в модифицированной СОЯ) в сравнении с соответствующей СОЯ в интактном антителе другого вида. В одном осуществлении все остатки аминокислот в СОЯ включены в библиотеку, хотя в других вариантах осуществления не все остатки аминокислот СОЯ включены в библиотеку. В другом осуществлении одна или более последовательностей СОЯ представляют собой случайные последовательности, заменяющие последовательности СПЯ.

В предпочтительных вариантах осуществления антитела гуманизированы с сохранением высокого сродства к антигену и других полезных биологических свойств. В некоторых вариантах осуществления сродство гуманизированного антитела к антигену выше, чем сродство соответствующего негуманизированного интактного антитела или его фрагмента или части (например, рассматриваемого антитела гры

- 40 012464 зуна). В этой связи, в некоторых вариантах осуществления гуманизированные антитела получают с помощью анализа исходных последовательностей и различных концептуальных гуманизированных продуктов с использованием трехмерных моделей исходной и гуманизированной последовательности. Трехмерные модели иммуноглобулина широко доступны и знакомы специалистам в данной области техники. Доступны компьютерные программы, которые иллюстрируют и демонстрируют вероятные трехмерные конформационные структуры выбранных для рассмотрения последовательностей иммуноглобулинов. Их проверка позволяет провести анализ вероятной роли остатков в функционировании последовательности рассматриваемого иммуноглобулина, т. е. анализ остатков, влияющих на способность рассматриваемого иммуноглобулина связываться со своим антигеном. Таким способом из реципиентной и импортируемой последовательностей могут быть выбраны и соединены остатки РК, в результате чего достигается желаемое свойство антитела, такое как повышенная аффинность к целевому антигену(ам). Обычно остатки СОК непосредственно и наиболее значительно влияют на связывание антигена.

Разнообразные конкретные способы, хорошо известные специалистам в данной области техники, могут применяться для введения СОК антитела (или случайных последовательностей, заменяющих СОК антитела) в каркасы антител (см., например, заявки США 09/434879 и 09/982464). В некоторых вариантах осуществления перекрывание олигонуклеотидов может использоваться для синтеза гена антитела или его части (например, гена, кодирующего гуманизированное антитело). В других вариантах осуществления мутагенез матрицы антитела может быть осуществлен с использованием способа Киηке1 (ниже), например, для введения модифицированной СОК или случайной последовательности для замены СОК. В некоторых вариантах осуществления вариабельные области легкой и тяжелой цепей гуманизированы раздельно, и затем совместно экспрессируют как гуманизированную вариабельную область. В других вариантах осуществления гуманизированные вариабельные области формируют вариабельную область интактного антитела. В некоторых вариантах осуществления область Рс интактного антитела, которая включает гуманизированную вариабельную область, была ранее модифицирована (например, была осуществлена как минимум одна модификация аминокислоты в области Рс). Например, антитело, которое было гуманизированное с помощью случайной СОК и без изменений каркаса, может включать как минимум одну модификацию аминокислоты в области Рс.

В других вариантах осуществления применяются трансгенные животные (например, мыши), которые способны после иммунизации вырабатывать полный репертуар человеческих антител в отсутствие выработки эндогенного иммуноглобулина. Например, было описано, что гомозиготная делеция гена соединяющего участка (ГН) тяжелой цепи антитела у гибридных и мутантных по зародышевой линии мышей приводит к полному ингибированию эндогенной выработки антител. Перенос генного массива зародышевой линии человеческого иммуноглобулина в зародышевую линию мутантных мышей будет приводить к выработке человеческих антител при антигенной нагрузке (см., например, ^акοЬον^ΐк е1 а1., Ргос. Май. Асай. 8сг И8А, 90: 2551 (1993), и ^акοЬον^ΐк е1 а1., ЫаШге, 362: 255-258 (1993)). Человеческие антитела могут также быть произведены из фаговых дисплейных библиотек (например, НοοдеηЬοοт е1 а1., Г Μο1. Бю1., 227: 381 (1991), и УаидШ е1 а1., ХаИие БюйсЬ 14: 309 (1996)).

В настоящем изобретении предлагаются способы создания гуманизированных антител (и фрагментов антител), которые включают как минимум одну замену аминокислоты, как приведено здесь в табл. 1, в области Рс (в сравнении с исходным полипептидом, включающим область Рс без замены аминокислоты). Ниже обсуждаются дополнительные способы создания гуманизированного антитела. В настоящем изобретении также предлагаются композиции, которые включают антитела и фрагменты антител, созданные такими способами. Важно, что обсуждаемые ниже способы гуманизации и другие способы гуманизации (например, обсужденные выше), могут сочетаться с вариантами Рс по настоящему изобретению. В этой связи, гуманизированные антитела с измененными, уникальными областями Рс могут быть сконструированы в соответствии с настоящим изобретением.

В некоторых вариантах осуществления предлагается способ конструирования популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененную область УН, который включает: а) обеспечение представления первой и второй ссылочной последовательностей аминокислот, причем первая ссылочная последовательность включает последовательность донорной области УН, при этом донорная вариабельная область включает 1) РК и и) три СОК как определено согласно комбинированным определениям КаЬа1 и С1ю11иа; причем вторая ссылочная последовательность включает последовательность акцепторной области УН, включающую РК; Ь) синтез первых олигонуклеотидов, кодирующих части РК акцепторной области УН, где части РК при сравнении со второй ссылочной последовательностью являются немодифицированными; и популяции вторых олигонуклеотидов, каждый из которых кодирует 1) как минимум часть первой СОК, которая была модифицирована, причем первая СОК выбрана из группы, которая состоит из НСОК1, НСЭК2 и НСОК3, где модифицированная первая СОК включает иную аминокислоту в одном или более положениях в сравнении с соответствующими донорными СОК первой ссылочной последовательности и ίί) одну или более частей немодифицированных РК, которые способны гибридизоваться с первыми олигонуклеотидами; с) смешивание первых олигонуклеотидов с популяцией вторых олигонуклеотидов для создания перекрывающихся олигонуклеотидов и й) обработку перекрывающихся олигонуклеотидов в таких условиях, что создается популяция нуклеиновых кислот, кодирующих измененную

- 41 012464 область УН, где ЕК, которые кодируются нуклеиновыми кислотами, кодирующими измененную область УН, являются немодифицированными в отношении второй ссылочной последовательности.

В других вариантах осуществления предлагается способ конструирования популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененную область УЪ, который включает: а) обеспечение представления первой и второй ссылочных последовательностей аминокислот, причем первая ссылочная последовательность включает последовательность донорной области УЪ, при том, что донорная область включает 1) ЕК и и) три СЭВ. определенных согласно комбинированным определениям КаЬа! и С1ю11на; вторая ссылочная последовательность включает последовательность акцепторной области УЪ, которая включает ЕК; Ь) синтез первых олигонуклеотидов, кодирующих части ЕК акцепторной области УЪ, где части ЕК при сравнении со второй ссылочной последовательностью являются немодифицированными; и популяцию вторых олигонуклеотидов, каждый из которых кодирует: 1) как минимум, часть первой СОК, которая была модифицирована, причем первая СОК выбрана из группы, которая состоит из ЪСОК1, ЪСОК2 и ЪСОКЗ, где модифицированная первая СОК включает иную аминокислоту в одном или более положениях в сравнении с соответствующими донорными СОК первой ссылочной последовательности и и) одну или более частей немодифицированных ЕК, которые способны гибридизоваться с первыми олигонуклеотидами; с) смешивание первых олигонуклеотидов с популяцией вторых олигонуклеотидов для создания перекрывающихся олигонуклеотидов и б) обработку перекрывающихся олигонуклеотидов в таких условиях, что конструируется популяция нуклеиновых кислот, кодирующих измененную область УЪ, где ЕК, которые кодируются нуклеиновыми кислотами, кодирующими измененную область УЪ, являются немодифицированными по отношению ко второй ссылочной последовательности.

В некоторых вариантах осуществления рассматривается способ конструирования популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененную область УН, который включает:

a) обеспечение представления первой и второй ссылочных последовательностей аминокислот, причем первая ссылочная последовательность включает последовательность донорной области УН, при том что донорная вариабельная область включает 1) ЕК и ίί) три СОК как определено согласно комбинированным определениям КаЬа! и Οιοίΐιία; вторая ссылочная последовательность включает акцепторную последовательность области УН, которая включает ЕК;

b) синтез популяции первых олигонуклеотидов, каждый из которых кодирует как минимум часть первой СОК, выбранной из группы, которая состоит из НСОК1, НСЭК2 и НСОКЗ, где модифицированная первая СОК включает иную аминокислоту в одном или более положениях в сравнении с соответствующими донорными СОК первой ссылочной последовательности; и вторых олигонуклеотидов, кодирующих ί) части ЕК акцепторной области УН, где части ЕК при сравнении с ссылочной последовательностью являются немодифицированными и ίί) одну или более частей СОК, которые способны гибридизоваться с популяцией первых олигонуклеотидов;

c) смешивание популяции первых олигонуклеотидов со вторыми нуклеотидами для создания перекрывающихся олигонуклеотидов и

б) обработку перекрывающихся олигонуклеотидов в таких условиях, что создается популяция нуклеиновых кислот, кодирующих измененную область УН, где ЕК, которые кодируются измененными нуклеиновыми кислотами, кодирующими измененную область УН, являются немодифицированными в отношении второй ссылочной последовательности.

В других вариантах осуществления предлагается способ конструирования популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененную область УЪ, который включает: А) обеспечение представления первой и второй ссылочных последовательностей аминокислот, причем первая ссылочная последовательность включает последовательность донорной области УЪ, при том, что донорная вариабельная область включает ί) ЕК и ίί) три СОК как определено согласно комбинированным определениям КаЬа! и С1ю11на; вторая ссылочная последовательность включает последовательность акцепторной области УЪ, которая включает ЕК; В) синтез а) популяции первых олигонуклеотидов, каждый из которых кодирует как минимум часть первой СОК, выбранной из группы, которая состоит из ЪСОК1, ЪСОК2 и ЪСОКЗ, где модифицированная первая СОК включает иную аминокислоту в одном или более положениях в сравнении с соответствующими донорными СОК первой ссылочной последовательности; и Ь) вторых олигонуклеотидов, кодирующих ί) части ЕК акцепторной области УЪ, где части ЕК при сравнении с ссылочной последовательностью являются немодифицированными, и ίί) одну или более частей СОК, которые способны гибридизоваться с популяцией первых олигонуклеотидов; С) смешивание популяции первых олигонуклеотидов со вторыми олигонуклеотидами для создания перекрывающихся олигонуклеотидов; и Ό) обработку перекрывающихся олигонуклеотидов в таких условиях, что создается популяция нуклеиновых кислот, кодирующих измененную область УЪ, где ЕК, которые кодируются измененной нуклеиновой кислотой, являются немодифицированными в отношении второй ссылочной последовательности.

В некоторых вариантах осуществления представление первой и второй ссылочных последовательностей существует в электронной форме. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает стадию (е) совместной экспрессии популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененную область тяжелой цепи, с нуклеиновой кислотой, кодирующей измененную область УН, с нуклеиновой кислотой, кодирующей вариабельную область легкой цепи, таким образом, чтобы создать разнородную

- 42 012464 популяцию измененных гетеромерных вариабельных областей. В некоторых вариантах осуществления синтез включает химический синтез. В некоторых вариантах осуществления акцептор является человеческим. В некоторых вариантах осуществления обработка на стадии (б) включает удлинение с помощью полимеразы.

В других вариантах осуществления рассматривается способ конструирования популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененную область УЪ, который включает: а) обеспечение представления первой и второй ссылочных последовательностей аминокислот, причем первая ссылочная последовательность включает последовательность донорной области УЪ, при том, что донорная вариабельная область включает 1) ЕЯ и ίί) три СОЯ; вторая ссылочная последовательность включает последовательность акцепторной области УЪ, включающей ЕЯ; Ь) синтез популяции генных последовательностей измененной области УЪ антитела, где ЕЯ измененных областей УЪ являются идентичными ЕЯ второй ссылочной последовательности, и, по крайней мере, первая СОЯ измененных областей УЪ антитела была модифицирована, где модифицированная первая СОЯ включает иную аминокислоту в одном или более положениях в сравнении с соответствующей донорной СОЯ первой ссылочной последовательности.

В некоторых вариантах осуществления рассматривается способ конструирования популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененную область УЪ, который включает: а) обеспечение представления первой и второй ссылочных последовательностей аминокислот, причем первая ссылочная последовательность включает последовательность донорной области УЪ, при том что донорная вариабельная область включает ί) ЕЯ и ίί) три СОЯ; вторая ссылочная последовательность включает последовательность акцепторной области УЪ, которая включает ЕЯ; Ь) синтез популяции генных последовательностей измененной области УЪ антитела, где ЕЯ измененных областей УЪ являются идентичными ЕЯ второй ссылочной последовательности и, по крайней мере, первая СОЯ измененной области УЪ антитела была модифицирована, где модифицированная первая СОЯ включает иную аминокислоту в одном или более положениях в сравнении с соответствующей донорной СОЯ первой ссылочной последовательности.

В некоторых вариантах осуществления представление первой и второй ссылочных последовательностей существует в электронной форме. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает стадию совместной экспрессии популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененную область УЪ, с нуклеиновой кислотой, кодирующей область УН, таким образом, чтобы создать разнородную популяцию измененных гетеромерных вариабельных областей. В некоторых вариантах осуществления акцептор является человеческим. В некоторых вариантах синтез включает использование перекрывающихся олигонуклеотидов.

В других вариантах осуществления рассматривается способ конструирования популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененную область УН, который включает: а) обеспечение представления ссылочной последовательности аминокислот, причем ссылочная последовательность включает последовательность акцепторной области УН, которая включает ЕЯ; Ь) синтез популяции генных последовательностей антитела с измененной областью УН, где ЕЯ измененных областей УН являются идентичными ЕЯ ссылочной последовательности и, по крайней мере, первая СОЯ измененных вариабельных областей антитела включает случайную последовательность аминокислот.

В других вариантах осуществления рассматривается способ конструирования популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененную область УЪ, который включает: а) обеспечение представления ссылочной последовательности аминокислот, причем ссылочная последовательность включает последовательность акцепторной области УЪ, которая включает ЕЯ; Ь) синтез популяции генных последовательностей измененной области УЪ антитела, где ЕЯ измененных областей УЪ являются идентичными ЕЯ ссылочной последовательности и, по крайней мере, первая СОЯ измененных областей УЪ антитела включает случайную последовательность аминокислот.

В других вариантах осуществления рассматривается способ конструирования популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененную область УН, который включает: а) обеспечение представления ссылочной последовательности аминокислот, причем ссылочная последовательность включает человеческую последовательность акцепторной области УН, включающей ЕЯ; Ь) синтез популяции генных последовательностей измененной области УН антитела, где ЕЯ измененных областей УН являются идентичными ЕЯ ссылочной человеческой последовательности и, по крайней мере, первая СОЯ измененных вариабельных областей антитела включает случайную последовательность аминокислот. В некоторых вариантах осуществления представление человеческой ссылочной последовательности существует в электронной форме.

В других вариантах осуществления рассматривается способ конструирования популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененную область УЪ, который включает: а) обеспечение представления ссылочной последовательности аминокислот, причем ссылочная последовательность включает последовательность человеческой акцепторной области УЪ, включающей ЕЯ; Ь) синтез популяции генных последовательностей измененной области УЪ антитела, где ЕЯ измененных областей УЪ являются идентичными ЕЯ человеческой ссылочной последовательности и, по крайней мере, первая СОЯ измененных областей УЪ антитела включает случайную последовательность аминокислот.

В некоторых вариантах осуществления представление ссылочной последовательности существует в

- 43 012464 электронной форме. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает стадию совместной экспрессии популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененную область УЪ, с нуклеиновой кислотой, кодирующей область УН, таким образом, чтобы создать разнородную популяцию измененных гетеромерных вариабельных областей. В некоторых вариантах осуществления синтез включает использование перекрывающихся нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления СБВ определены согласно определению КаЬа£

В некоторых вариантах осуществления одна или более РВ модифицированы одновременно с введением одной или более модифицированных СБВ. В других вариантах осуществления модифицированные каркасные области являются смежными с модифицированными СБВ.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предлагаются способы конструирования популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененную область УН, которые включают: а) обеспечение представления первой и второй ссылочных последовательностей аминокислот, причем первая ссылочная аминокислотная последовательность включает последовательность донорной области УН, при этом донорная вариабельная область включает: ί) РВ и и) три СБВ, как определено согласно комбинированным определениям КаЬаί и Οιοίΐιία; вторая ссылочная последовательность аминокислот включает последовательность акцепторной области УН, которая включает РВ; Ь) синтез а) первой популяции олигонуклеотидов, которая включает олигонуклеотиды, кодирующие РВ модифицированной области УН или ее часть, где РВ области УН или ее часть, содержит множество измененных аминокислот в одном или более положениях в сравнении с акцепторной каркасной областью ссылочной последовательности, где положения каркаса, которые были изменены, выбраны среди положений акцепторного каркаса второй ссылочной последовательности, которая отличается в соответствующем положении в сравнении с положениями донорного каркаса первой ссылочной последовательности; и Ь) второй популяции олигонуклеотидов, каждый из которых кодирует ί) как минимум одну модифицированную СБВ или ее часть, где модифицированная СБВ или ее часть, включает иную аминокислоту в одном или более положениях в сравнении с соответствующей ссылочной последовательностью аминокислот донорной СБВ и и) одну или более частей смежных РВ, которые способны гибридизоваться с первой популяцией олигонуклеотидов; и с) смешивание первой и второй популяций олигонуклеотидов таким образом, чтобы создать перекрывающиеся олигонуклеотиды; и б) обработку перекрывающихся олигонуклеотидов в таких условиях, что создается популяция нуклеиновых кислот, кодирующих измененную область УН. В некоторых вариантах осуществления представление первой и второй ссылочных последовательностей существует в электронной форме. В других вариантах осуществления способы дополнительно включают стадию (е) совместной экспрессии популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененную область УН, с нуклеиновой кислотой, кодирующей область УЪ, таким образом, чтобы создать разнородную популяцию измененных гетеромерных вариабельных областей. В дополнительных вариантах осуществления синтез включает химический синтез. В некоторых вариантах осуществления акцептор является человеческим. В предпочтительных вариантах осуществления одна или более разнородных популяций измененных гетеромерных вариабельных областей представляют собой часть антитела, которая включает область Рс, где область Рс включает как минимум одну замену аминокислоты в сравнении с исходным полипептидом, содержащим область Рс.

В других вариантах осуществления настоящего изобретения предлагаются способы конструирования популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененную область УЪ, которые включают: а) обеспечение представления первой и второй ссылочных последовательностей аминокислот, причем первая ссылочная последовательность аминокислот включает последовательность донорной области УЪ, при этом донорная вариабельная область включают ί) РВ и и) три СБВ как определено согласно комбинированным определениям КаЬаί и Οιοίΐιία; вторая ссылочная последовательность аминокислот включает последовательность акцепторной области УЪ, которая включает РВ; Ь) синтез а) первой популяции олигонуклеотидов, которая включает олигонуклеотиды, кодирующие РВ модифицированной области УЪ или ее часть, где каркасная область области УЪ или ее часть содержит множество измененных аминокислот в одном или более положениях в сравнении с акцепторной каркасной областью ссылочной последовательности, где положения каркаса, которые были изменены, выбраны среди положений акцепторного каркаса второй ссылочной последовательности, которая отличается в соответствующих положениях в сравнении с положениями донорного каркаса первой ссылочной последовательности; и Ь) второй популяции олигонуклеотидов, каждый из которых кодирует ί) как минимум, одну модифицированную СБВ или ее часть, где модифицированная СБВ или ее часть, включает иную аминокислоту в одном или более положениях в сравнении с соответствующей донорной ссылочной последовательностью аминокислот СБВ и ίί) одну или более частей смежных РВ, которые способны гибридизоваться с первой популяцией олигонуклеотидов; с) смешивание первой и второй популяций олигонуклеотидов таким образом, чтобы создать перекрывающиеся олигонуклеотиды; и б) обработку перекрывающихся олигонуклеотидов в таких условиях, что конструируется популяция нуклеиновых кислот, кодирующих измененную область УЪ. В других вариантах осуществления представление первой и второй ссылочных последовательностей существует в электронной форме. В дополнительных вариантах осуществления способы дополнительно включают стадию (е) совместной экспрессии популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененную

- 44 012464 область УЬ, с нуклеиновой кислотой, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи, таким образом, чтобы создать разнородную популяцию измененных гетеромерных вариабельных областей.

В некоторых вариантах осуществления способы включают: а) обеспечение представления первой и второй ссылочных последовательностей аминокислот, причем первая ссылочная аминокислотная последовательность включает последовательность донорной области УН, при этом донорная вариабельная область включает 1) ЕК и ίί) три СОК как определено согласно комбинированным определениям КаЬа! и С1ю11на; вторая ссылочная последовательность аминокислот включает последовательность акцепторной области УН, которая включает ЕК; Ь) синтез а) первой популяции олигонуклеотидов, которая включает олигонуклеотиды, кодирующие каркасную область модифицированной области УН или ее часть, где ЕК области УН или ее часть содержит множество измененных аминокислот в одном или более положениях в сравнении с ссылочной последовательностью акцепторной ЕК, где положения каркаса, которые были изменены, выбраны среди положений акцепторного каркаса второй ссылочной последовательности, которая отличается в соответствующем положении в сравнении с положениями донорного каркаса первой ссылочной последовательности; и Ь) второй популяции олигонуклеотидов, каждый из которых кодирует ί) как минимум, одну модифицированную СОК или ее часть, где модифицированная СОК или ее часть включает иную аминокислоту в одном или более положениях в сравнении с соответствующей ссылочной последовательностью аминокислот донорной СОК и ίί) одну или более частей смежных ЕК, которые способны гибридизоваться с первой популяцией олигонуклеотидов; и с) смешивание первой и второй популяций олигонуклеотидов таким образом, чтобы создать перекрывающиеся олигонуклеотиды; и б) удлинение перекрывающихся олигонуклеотидов с помощью ДНК-полимеразы в таких условиях, что конструируется популяция нуклеиновых кислот, кодирующих измененную область УН.

В других вариантах осуществления настоящего изобретения предлагаются способы создания популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененную область УЬ, которые включают: а) обеспечение представления первой и второй ссылочных последовательностей аминокислот, причем первая ссылочная аминокислотная последовательность включает последовательность донорной области УЬ, при этом донорная вариабельная область включает 1) ЕК и ίί) три СОК как определено согласно комбинированным определениям КаЬа! и С1ю(1на; вторая ссылочная последовательность аминокислот включает последовательность акцепторной области УЬ, которая включает ЕК; Ь) синтез а) первой популяции олигонуклеотидов, которая включает олигонуклеотиды, кодирующие ЕК модифицированной области УЬ или ее часть, где ЕК области УЬ или ее часть содержит множество измененных аминокислот в одном или более положениях в сравнении с ссылочной последовательностью акцепторной ЕК, где положения каркаса, которые были изменены, выбраны среди положений акцепторного каркаса второй ссылочной последовательности, которая отличается в соответствующем положении в сравнении с положениями донорного каркаса первой ссылочной последовательности; и Ь) второй популяции олигонуклеотидов, каждый из которых кодирует: 1) как минимум, одну модифицированную СОК или ее часть, где модифицированная СОК или ее часть включает иную аминокислоту в одном или более положениях в сравнении с соответствующей донорной ссылочной последовательностью аминокислот СОК и ίί) одну или более частей смежных ЕК, которые способны гибридизоваться с первой популяцией олигонуклеотидов; и с) смешивание первой и второй популяций олигонуклеотидов таким образом, чтобы создать перекрывающиеся олигонуклеотиды; и б) удлинение перекрывающихся олигонуклеотидов с помощью ДНК-полимеразы в таких условиях, что конструируется популяция нуклеиновых кислот, кодирующих измененную область УЬ.

В некоторых вариантах осуществления одну или более модификаций вводят в каркас, одновременно с введением одной или более модифицированных СОК. Модифицированные СОК могут включать одно или более изменений аминокислот в сравнении с соответствующей СОК ссылочной последовательности. В некоторых вариантах осуществления способы конструирования популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененную область УН, включают: а) обеспечение представления первой и второй ссылочных последовательностей аминокислот, причем первая ссылочная аминокислотная последовательность включает последовательность донорной области УН, при этом донорная вариабельная область включает ί) ЕК и ίί) три СОК как определено согласно комбинированным определениям КаЬа! и С1ю11на; вторая ссылочная последовательность аминокислот включает последовательность акцепторной области УН, которая включает ЕК; Ь) синтез ί) первой популяции олигонуклеотидов, каждый из которых кодирует как минимум одну модифицированную СОК, где модифицированная СОК включает иную аминокислоту в одном или более положениях в сравнении с соответствующей донорной ссылочной последовательностью аминокислот СОК; и ίί) второй популяции олигонуклеотидов, которая включает олигонуклеотиды, кодирующие модифицированные части каркаса области УН, причем модифицированная часть содержит множество измененных аминокислот в одном или более положениях в сравнении с ссылочной последовательностью акцепторной каркасной области, где положения каркаса, которые были изменены, выбраны среди положений акцепторного каркаса второй ссылочной последовательности, которая отличается в соответствующем положении в сравнении с положениями донорного каркаса первой ссылочной последовательности; с) смешивание первой и второй популяций олигонуклеотидов при таких условиях, что как минимум часть олигонуклеотидов гибридизуются таким образом, чтобы создать перекрывающиеся олигонуклеотиды; и б) обработку перекрывающихся олигонуклеотидов в таких условиях, что соз

- 45 012464 дается популяция нуклеиновых кислот, кодирующих измененную область νΗ. В некоторых вариантах осуществления представление первой и второй ссылочных последовательностей существует в электронной форме. В дополнительных вариантах осуществления способы дополнительно включают стадию (е) совместной экспрессии популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененную область νΗ, с нуклеиновой кислотой, кодирующей область νΈ, таким образом, чтобы создать разнородную популяцию измененных гетеромерных вариабельных областей. В других вариантах осуществления акцептор является человеческим.

В других вариантах осуществления настоящего изобретения предлагаются способы конструирования популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененную область νΈ, которые включают: а) обеспечение представления первой и второй ссылочных последовательностей аминокислот, причем первая ссылочная аминокислотная последовательность включает последовательность донорной области νΈ, при том, что донорная вариабельная область включает 1) РК и ίί) три СОК, как определено согласно комбинированным определениям КаЬа1 и С1то11иа; вторая ссылочная последовательность аминокислот включает последовательность акцепторной области νΈ, которая включает РК; Ь) синтез 1) первой популяции олигонуклеотидов, каждый из которых кодирует как минимум одну модифицированную СОК, где модифицированная СОК включает иную аминокислоту в одном или более положениях в сравнении с соответствующей ссылочной последовательностью аминокислот донорной СОК; и ίί) второй популяции олигонуклеотидов, которая включает олигонуклеотиды, кодирующие модифицированные части каркаса области νΈ, при этом модифицированная часть содержит множество измененных аминокислот в одном или более положениях в сравнении с ссылочной последовательностью акцепторной РК, где положения каркаса, которые были изменены, выбраны среди положений акцепторного каркаса второй ссылочной последовательности, которая отличается в соответствующем положении в сравнении с положениями донорного каркаса первой ссылочной последовательности; с) смешивание первой и второй популяций олигонуклеотидов при таких условиях, что как минимум часть олигонуклеотидов гибридизуется таким образом, чтобы создать перекрывающиеся олигонуклеотиды; и б) обработку перекрывающихся олигонуклеотидов в таких условиях, что конструируется популяция нуклеиновых кислот, кодирующих измененную область νΈ.

В некоторых вариантах осуществления могут быть созданы антитела или фрагменты антител, которые включают вариант Рс и вариант области измененной тяжелой цепи. Например, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предлагаются способы конструирования популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененную область νΗ, которые включают: а) обеспечение представления первой и второй ссылочных последовательностей аминокислот, причем первая ссылочная последовательность включает последовательность донорной области νΗ, при этом донорная вариабельная область включает ί) РК и ίί) три СОК как определено согласно комбинированным определениям КаЬа! и С1ю11иа; вторая ссылочная последовательность включает последовательность акцепторной области νΗ, которая включает РК; Ь) синтез А) первых олигонуклеотидов, кодирующих части РК акцепторной области νΗ, где части РК при сравнении со второй ссылочной последовательностью являются немодифицированными; и В) популяцию вторых олигонуклеотидов, каждый из которых кодирует ί) как минимум часть первой СОК, которая была модифицирована, причем первая СОК выбрана из группы, которая состоит из НСЭКГ НСЭК2 и НСЭК3. где модифицированная первая СОК включает иную аминокислоту в одном или более положениях в сравнении с соответствующими донорными СОК первой ссылочной последовательности и ίί) одну или более частей немодифицированных РК, которые способны гибридизоваться с первыми олигонуклеотидами; с) смешивание первых олигонуклеотидов с популяцией вторых олигонуклеотидов для создания перекрывающихся олигонуклеотидов; и б) обработку перекрывающихся олигонуклеотидов в таких условиях, что создается популяция нуклеиновых кислот, кодирующих измененную область νΗ, где РК, которые кодируются нуклеиновыми кислотами, кодирующими измененную область νΗ, являются немодифицированными в отношении второй ссылочной последовательности. В некоторых вариантах осуществления способы дополнительно включают стадию совместной экспрессии популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененную область νΗ, с нуклеиновой кислотой, кодирующей область νΈ, таким образом, чтобы создать разнородную популяцию измененных гетеромерных вариабельных областей.

В других вариантах осуществления настоящего изобретения предлагаются способы конструирования популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененную область νΈ, которые включают: а) обеспечение представления первой и второй ссылочных последовательностей аминокислот, причем первая ссылочная последовательность включает последовательность донорной области νΈ, при том, что донорная вариабельная область включает ί) РК и ίί) три СОК, как определено согласно комбинированным определениям КаЬа1 и С1то11иа; вторая ссылочная последовательность включает последовательность акцепторной области νΈ, которая включает РК; Ь) синтез а) первых олигонуклеотидов, кодирующих части РК акцепторной области νΈ, где части РК при сравнении со второй ссылочной последовательностью являются немодифицированными; и Ь) популяции вторых олигонуклеотидов, каждый из которых кодирует ί) как минимум часть первой СОК, которая была модифицирована, причем первая СОК выбрана из группы, которая состоит из ЬСОК1, ЬСОК2 и ЬСОК3, где модифицированная первая СОК включает иную ами

- 46 012464 нокислоту в одном или более положениях в сравнении с соответствующими донорными СОЯ первой ссылочной последовательности и ίί) одну или более частей немодифицированных ЕЯ, которые способны гибридизоваться с первыми олигонуклеотидами; с) смешивание первых олигонуклеотидов с популяцией вторых олигонуклеотидов для создания перекрывающихся олигонуклеотидов и б) обработку перекрывающихся олигонуклеотидов в таких условиях, что конструируется популяция нуклеиновых кислот, кодирующих измененную область УЪ, где ЕЯ, которые кодируются нуклеиновыми кислотами, кодирующими измененную область УЪ, являются немодифицированными в отношении второй ссылочной последовательности.

В других вариантах осуществления настоящего изобретения предлагаются способы конструирования популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененную область УН, которые включают: А) обеспечение представления первой и второй ссылочных последовательностей аминокислот, причем первая ссылочная последовательность включает последовательность донорной области УН, при том, что донорная вариабельная область включает ί) ЕЯ и ίί) три СОЯ, как определено согласно комбинированным определениям КаЬа! и С1ю11иа; вторая ссылочная последовательность включает последовательность акцепторной области УН, которая включает ЕЯ; В) синтез а) популяции первых олигонуклеотидов, каждый из которых кодирует как минимум часть первой СОЯ, выбранной из группы, которая состоит из НСОЯ1, НСОЯ2 и НСЭЯЗ. где модифицированная первая СОЯ включает иную аминокислоту в одном или более положениях в сравнении с соответствующими донорными СОЯ первой ссылочной последовательности; и Ь) вторых олигонуклеотидов, кодирующих: ί) части ЕЯ акцепторной области УН, где части ЕЯ при сравнении с ссылочной последовательностью являются немодифицированными и ίί) одну или более частей СОЯ, которые способны гибридизоваться с популяцией первых олигонуклеотидов; С) смешивание популяции первых олигонуклеотидов со вторыми олигонуклеотидами, чтобы создать перекрывающиеся олигонуклеотиды; и Ό) обработку перекрывающихся олигонуклеотидов в таких условиях, что конструируется популяция нуклеиновых кислот, кодирующих измененную область УН, где ЕЯ, которые кодируются нуклеиновыми кислотами, кодирующими измененную область УН, являются немодифицированными в отношении второй ссылочной последовательности.

В некоторых вариантах осуществления способы дополнительно включают стадию совместной экспрессии популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененную область УН, с нуклеиновой кислотой, кодирующей область УЪ, таким образом, чтобы создать разнородную популяцию измененных гетеромерных вариабельных областей.

В других вариантах осуществления настоящего изобретения предлагаются способы конструирования популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененную область УЪ, которые включают: А) обеспечение представления первой и второй ссылочных последовательностей аминокислот, причем первая ссылочная последовательность включает последовательность донорной области УЪ, при том что донорная вариабельная область включает ί) ЕЯ и ίί) три СОЯ как определено согласно комбинированным определениям КаЬа! и С1ю11иа; вторая ссылочная последовательность включает последовательность акцепторной области УЪ, которая включает ЕЯ; В) синтез а) популяции первых олигонуклеотидов, каждый из которых кодирует как минимум часть первой СОЯ, выбранной из группы, которая состоит из ЪСОЯ1, ЪСОЯ2 и ЪСОЯЗ, где модифицированная первая СОЯ включает иную аминокислоту в одном или более положениях в сравнении с соответствующими донорными СОЯ первой ссылочной последовательности; и Ь) вторых олигонуклеотидов, кодирующих ί) части ЕЯ акцепторной области УЪ, где части ЕЯ при сравнении с ссылочной последовательностью являются немодифицированными и ίί) одну или более частей СОЯ, которые способны гибридизоваться с популяцией первых олигонуклеотидов; С) смешивание популяции первых олигонуклеотидов со вторыми олигонуклеотидами, чтобы создать перекрывающиеся олигонуклеотиды; и Ό) обработку перекрывающихся олигонуклеотидов в таких условиях, что конструируется популяция нуклеиновых кислот, кодирующих измененную область УЪ, где ЕЯ, которые кодируются нуклеиновыми кислотами, кодирующими измененную область УЪ, являются немодифицированными в отношении второй ссылочной последовательности.

В других вариантах осуществления настоящего изобретения предлагаются способы улучшения связывающего сродства вариабельной области мутированного гуманизированного антитела, которые включают: а) обеспечение последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей первую вариабельную область мутантного гуманизированного антитела, причем мутантная вариабельная область включает (ί) человеческий каркас антитела дикого типа, (ίί) три отличных от человеческих СОЯ тяжелой цепи, и (ш) три отличных от человеческих СОЯ легкой цепи, где СОЯ определяются согласно комбинированным определениям КаЬа! и ΟΗοίΗιη, где как минимум одна из СОЯ легкой цепи представляет собой содержащую мутацию СОЯ легкой цепи, которая включает как минимум одну отличную аминокислоту как минимум в одном положении в сравнении с соответствующей отличной от человеческой СОЯ дикого типа, и где первая вариабельная область мутантного антитела обладает более высокой связывающей аффинностью, чем соответствующая вариабельная область немутантного антитела; Ь) мутацию последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей первую вариабельную область мутантного антитела при таких условиях, что кодируется вторая вариабельная область мутантного гуманизированного антитела, причем вторая вариабельная область мутантного гуманизированного антитела включает как минимум одну до

- 47 012464 полнительную отличную аминокислоту как минимум в одном положении в содержащей мутацию СОЯ легкой цепи, при этом дополнительная мутация в сочетании с первой мутацией приводит к более высокой связывающей аффинности. В некоторых вариантах осуществления содержащая мутацию СОЯ легкой цепи первой вариабельной области мутантного гуманизированного антитела представляет собой СЭЯ3 (ЪСОЯ3).

В других вариантах осуществления как минимум одна из СОЯ отличной от человеческой тяжелой цепи первой мутантной вариабельной области гуманизированного антитела включает мутацию, таким образом, иная аминокислота кодируется как минимум в одном положении в сравнении с соответствующей отличной от человеческой СОЯ дикого типа. В дополнительных вариантах осуществления мутация СОЯ тяжелой цепи находится в НСЭЯ3.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предлагаются способы одновременной модификации как минимум одной СОЯ и как минимум одной РЯ при конструировании популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененную область УН, которые включают: а) обеспечение представления первой и второй ссылочных последовательностей аминокислот, причем первая ссылочная аминокислотная последовательность включает последовательность донорной области УН, при том, что донорная вариабельная область включает 1) четыре РЯ и ίί) три СОЯ, как определено согласно комбинированным определениям КаЬа! и С1ю11на; вторая ссылочная последовательность аминокислот включает последовательность акцепторной области УН, которая включает четыре РЯ, как определено согласно комбинированным определениям КаЬа! и С1ю11на; Ь) синтез 1) для каждой РЯ, которая подлежит модификации, популяции олигонуклеотидов, каждый из которых кодирует модифицированную РЯ или ее часть, причем модифицированная РЯ или ее часть содержит множество измененных аминокислот в одном или более положениях в сравнении с соответствующей каркасной областью в акцепторной области УН ссылочной последовательности, где положения РЯ, которые изменены, выбраны среди положений акцепторного каркаса второй ссылочной последовательности, которая отличается в соответствующем положении в сравнении с положениями донорной каркасной области первой ссылочной последовательности; и ίί) для каждой СОЯ, которая должна быть модифицирована, популяции олигонуклеотидов, каждый из которых кодирует модифицированную СОЯ или ее часть, где модифицированная СОЯ включает иную аминокислоту в одном или более положениях в сравнении с соответствующей ссылочной последовательностью аминокислот донорной СОЯ; и ш) для каждой из любых оставшихся и немодифицированных РЯ олигонуклеотидов, кодирующих РЯ или ее часть, с такой же последовательностью, как и соответствующая РЯ второй ссылочной акцепторной последовательности; и ίν) для каждой из любых оставшихся и немодифицированных СОЯ олигонуклеотидов, кодирующих СОЯ или ее часть, с такой же последовательностью, как и у соответствующей СОЯ первой ссылочной донорной последовательности, где отдельные олигонуклеотиды от (1) до (ίν), которые кодируют смежные части области УН, содержат перекрывающиеся последовательности на концах; и с) смешивание олигонуклеотидов и популяций олигонуклеотидов, синтезированных на стадии Ь) при таких условиях, что перекрывающиеся последовательности отдельных олигонуклеотидов гибридизуются таким образом, чтобы создать перекрывающиеся олигонуклеотиды; и б) обработку перекрывающихся олигонуклеотидов в таких условиях, что образуется популяция нуклеотидов, кодирующих измененную область УН. В некоторых вариантах осуществления представление первой и второй ссылочных последовательностей существует в электронной форме. В дополнительных вариантах осуществления каркасная область, подлежащая модификации, выбирается из группы, которая состоит из НРЯ1, НРЯ2 и НРЯ3. В других вариантах осуществления СОЯ, подлежащая модификации, представляет собой НСЭЯ3. В других вариантах осуществления способ дополнительно включает стадию е) по совместной экспрессии популяции нуклеиновых кислот, кодирующих область УН, с популяцией нуклеиновых кислот, кодирующих область УЪ, таким образом, чтобы создать разнородную популяцию измененных гетеромерных вариабельных областей. В различных вариантах осуществления способ дополнительно включает стадию е) совместной экспрессии популяции нуклеиновых кислот, кодирующих область УН, с популяцией нуклеиновых кислот, кодирующих область УЪ, таким образом, чтобы создать разнородную популяцию измененных гетеромерных вариабельных областей.

В других вариантах осуществления применяются способы одновременной модификации как минимум одной СОЯ и как минимум одной РЯ при конструировании популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененную область УЪ, где указанный способ включает: а) обеспечение представления первой и второй ссылочных последовательностей аминокислот, причем первая ссылочная аминокислотная последовательность включает последовательность донорной области УЪ, при этом донорная вариабельная область включает: ί) четыре РЯ и ίί) три СОЯ, как определено согласно комбинированным определениям КаЬа! и С1ю11на; вторая ссылочная последовательность аминокислот включает последовательность акцепторной области УЪ, которая включает четыре РЯ, как определено согласно комбинированным определениям КаЬа! и С1ю11на; Ь) синтез ί) для каждой РЯ, которая подлежит модификации, популяции олигонуклеотидов, каждый из которых кодирует модифицированную РЯ или ее часть, причем модифицированная РЯ или ее часть содержит множество измененных аминокислот в одном или более положениях в сравнении с соответствующей каркасной областью в акцепторной области УЪ ссылочной последовательности, где измененные положения области РЯ выбраны среди положений акцепторной РЯ второй

- 48 012464 ссылочной последовательности, которая отличается в соответствующем положении в сравнении с положениями донорной РК первой ссылочной последовательности; и ίί) для каждой СОК, которая должна быть модифицирована, популяции олигонуклеотидов, каждый из которых кодирует модифицированную СОК или ее часть, где модифицированная СОК включает иную аминокислоту в одном или более положениях в сравнении с соответствующей ссылочной последовательностью аминокислот донорной СОК; и ίίί) для каждой из любых оставшихся и немодифицированных областей РК, олигонуклеотидов, кодирующих РК или ее часть, с такой же последовательностью, как и у соответствующей РК второй ссылочной акцепторной последовательности; и ίν) для каждой из любых оставшихся и не модифицированных СОК, олигонуклеотидов, кодирующих СОК или ее часть, с такой же последовательностью, как и у соответствующей СОК первой ссылочной донорной последовательности, где отдельные олигонуклеотиды от (ί) до (ίν), которые кодируют смежные части УЪ, содержат на концах перекрывающиеся последовательности, и с) смешивание олигонуклеотидов и популяций олигонуклеотидов, синтезированных на стадии Ь), при таких условиях, что перекрывающиеся последовательности отдельных олигонуклеотидов гибридизуются таким образом, чтобы создать перекрывающиеся олигонуклеотиды; и й) обработку перекрывающихся олигонуклеотидов в таких условиях, что образуется популяция нуклеотидов, кодирующих измененную область УЪ. В некоторых вариантах осуществления способы дополнительно включают стадию совместной экспрессии популяции нуклеиновых кислот, кодирующих область УЪ, с популяцией нуклеиновых кислот, кодирующих область УН, таким образом, чтобы создать разнородную популяцию измененных гетеромерных вариабельных областей.

(ν) Мультиспецифичные антитела

В настоящем изобретении предлагаются мультиспецифичные антитела, включающие вариант области Рс. Мультиспецифичные антитела обладают специфичностью связывания, по меньшей мере, к двум различным антигенам. В то время как такие молекулы обычно должны связывать только два антигена (т.е., биспецифичные антитела, ВкАЬк), антитела с дополнительной специфичностью, такие как триспецифичные антитела, охватываются данным выражением, когда оно здесь используется. Примеры ВкАЬк включают, не ограничиваясь ими, антитела с одним плечом, направленным против антигена опухолевой клетки, и с другим плечом, направленным против молекулы цитотоксического триггера, такого как анти-РсуК1/анти-СП15, анти-р185НЕК2/РсуК111 (СЭ16), анти-СП3/антитело против злокачественной В-клетки (Ό1Ό0), анти-СП3/анти-р185НЕК2, анти-СП3/анти-р97, анти-СП3/антитело против почечноклеточной карциномы, анти-С^3/анти-ОУСЛК-3, анти-СП3/Ь-О1 (антитело против карциномы толстого кишечника), анти-СП3/антитело против аналога меланоцитстимулирующего гормона, анти-ЕСР рецептор/анти-СО3, анти-С^3/анти-СЛМЛI, анти-СП3/анти-СП19, анти-С^3/МοУ18, антитело против молекулы клеточной адгезии нервных клеток (NСЛМ)/анти-СВ3, антитело против фолатсвязывающего белка (РВР)/анти-СВ3, антитело против ассоциированного с карциномой антигена (АМОС-31)/против-СО3; ВкАЬк с одним плечом, которое специфически связывается с антигеном опухоли, и со вторым плечом, которое связывается с токсином, таким как антисапорин/анти-1й-1, анти-СП22/антисапорин, антиСП7/антисапорин, анти-СП38/антисапорин, анти-СЕА/анти-А цепь рицин, анти-интерферон-альфа (ΙΕΝальфа) /против идиотипа гибридомы, анти-СЕА/ против алкалоида барвинка; ВкАЬк против превращающих ферментов, активирующих пролекарства, такие как анти-СО30/против щелочной фосфатазы (которая катализирует превращение пролекарства митомицина фосфата в митомициновый спирт); ВкАЬк, которые могут использоваться как фибринолитические агенты, такие как антифибрин/против тканевого активатора плазминогена ЦРА), антифибрин/против активатора плазминогена урокиназного типа (иРа); ВкАЬк для направленной доставки иммунных комплексов к рецепторам поверхности клеток, таких как антитело против липопротеина низкой плотности (ЕПЬ)/анти-РсК (например, РсуК1, РсуКП или РсуКШ); ВкАЬк для применения в лечении инфекционных заболеваний, такие как анти-СЭ3/против вируса простого герпеса (Н8У), против рецептора Т-клеток: СЭ3 комплекс/против гриппа, анти-РсуК/анти-ВИЧ; ВкАЬк для обнаружения опухоли ίη νίίΓο или ίη νίνο, такие как анти-СЕА/анти-ЕОТиВЕ, анти-СЕА/антиОРТА, анти-р185НЕК2/анти-гаптен; ВкАЬк как адъюванты вакцин; и ВкАЬк как диагностические агенты, такие как антикроличий 1дС/анти-ферритин, против пероксидазы хрена (НКР)/антигормон, антисоматостатин/против вещества Р, анти-НКР/анти-Р1ТС, анти-СЕА/против β-галактозидазы.

Примеры триспецифичных антител включают, не ограничиваясь ими, анти-СО3/анти-СО4/антиСЭ37, анти-СО3/анти-СО5/анти-СО37 и анти-СО3/анти-СО8/анти-СО37. Биспецифичные антитела могут быть получены как полноразмерные антитела или фрагменты антител (например, биспефицические антитела Р(аЬ')₂). Способы получения биспецифичных антител известны из уровня техники. Традиционное получение биспецифичных полноразмерных антител базируется на коэкспрессии двух пар тяжелой цепилегкой цепи иммуноглобулина, где две цепи имеют различную специфичность (например, МШйеш еί а1., Уинге, 305: 537-539 (1983)). Из-за случайной сортировки тяжелых и легких цепей иммуноглобулина, эти гибридомы (квадромы) продуцируют потенциальную смесь из десяти различных молекул антител, из которых только одна имеет правильную биспецифичную структуру. Очистка правильной молекулы может быть проведена с помощью стадий аффинной хроматографии. Подобные методы раскрыты в патенте ν0 93/08829 и в Т^аиηеске^ е1 а1, ЕМВО 1., 10: 3655-3659 (1991).

- 49 012464

При другом подходе вариабельные домены антитела с желательной специфичностью связывания (сайты связывания антитело-антиген) соединяются с последовательностями постоянных доменов иммуноглобулина. Соединение предпочтительно осуществляется с константным доменом тяжелой цепи иммуноглобулина, который включает по меньшей мере часть шарнира области СН2 и СН3. Предпочтительно присутствие по меньшей мере в одном из гибридов первой константной области тяжелой цепи (СН1), содержащей сайт, необходимый для связывания легкой цепи. ДНК, кодирующие гибриды тяжелой цепи иммуноглобулина и, при желании, легкой цепи иммуноглобулина, вставляют в отдельные экспрессионные векторы, и котрансфецируют в подходящие организмы-хозяева. Это обеспечивает большую гибкость при подгонке взаимных пропорций трех полипептидных фрагментов в осуществлениях, когда неравные соотношения трех полипептидных цепей используются при конструировании для обеспечения оптимальных выходов. Однако можно вставить кодирующие последовательности для двух или всех трех полипептидных цепей в один экспрессионный вектор, когда экспрессия по меньшей мере двух полипептидных цепей в равных соотношениях приводит к высоким выходам или когда соотношения не имеют особого значения. В предпочтительном осуществлении данного подхода, биспецифичные антитела составляют из гибридной тяжелой цепи иммуноглобулина с первой специфичностью связывания на одном плече, и гибридной пары тяжелой цепи-легкой цепи иммуноглобулина (обеспечение второй специфичности связывания) на другом плече (смотри, например, патент XV0 94/04690). В соответствии с другим подходом, описанным в патенте ν096/27011, соединение между парой молекул антител может быть спроектировано для максимизации процента гетеродимеров, которые извлекаются из культуры рекомбинантных клеток. Биспецифичные антитела также включают поперечно-сшитые антитела или гетероконъюгаты антител. Например, одно из антител в гетероконъюгате может быть соединено с авидином, а другое - с биотином.

В. Иммуноадгезивные молекулы в настоящем изобретении также предлагаются иммуноадгезивные молекулы, которые включают вариант области Рс. В одном типе создания иммуноадгезина сочетается домен(ы) связывания адгезина (например, внеклеточный домен (ЕСЭ) рецептора) с областью Рс тяжелой цепи иммуноглобулина (например, вариантом области Рс). Обычно при получении иммуноадгезинов настоящего изобретения, нуклеиновая кислота, кодирующая связывающий домен адгезина, должна соединяться по С-концу с нуклеиновой кислотой, кодирующей ^концевую последовательность константного домена иммуноглобулина, однако ^концевые соединения также возможны.

Обычно, при таких гибридизациях кодируемый гибридный полипептид должен сохранять, по меньшей мере, функционально активный шарнир, домены СН2 и СН3 константной области тяжелой цепи иммуноглобулина. Соединение также осуществляют с С-концом части константного домена Рс или непосредственно №конца с СН1 тяжелой цепи или соответствующей областью легкой цепи. Точный сайт, у которого осуществляется соединение, не является критичным; конкретные сайты хорошо известны и могут быть выбраны с целью оптимизации биологической активности, секреции или связывающих характеристик иммуноадгезина.

В некоторых осуществлениях последовательность адгезина соединена с ^концом варианта области Рс иммуноглобулина 01. Возможно соединение полной константной области тяжелой цепи с последовательностью адгезина. Однако в предпочтительных осуществлениях, в гибридизации используется последовательность, которая начинается в области шарнира непосредственно выше сайта расщепления папаином, который химически определяет Рс ΙβΟ (т.е. остаток 216, принимая первый остаток константной области тяжелой цепи как 114), или аналогичные сайты других иммуноглобулинов. В определенных предпочтительных осуществлениях, аминокислотная последовательность адгезина соединяется с (а) шарнирной областью и СН2 и СН3 или (Ь) СН1, шарниром, доменами СН2 и СН3 тяжелой цепи Ι§0. В некоторых осуществлениях иммуноадгезины являются биспецифичными.

Альтернативно, последовательности адгезина могут быть вставлены между последовательностями тяжелой и легкой цепи иммуноглобулина, таким образом, что получают иммуноглобулин, включающий гибридную тяжелую цепь. В таких осуществлениях последовательности адгезина могут соединяться с 3' концом тяжелой цепи иммуноглобулина в каждом плече иммуноглобулина, или между шарниром и доменом СН2, или между доменами СН2 и СН3 (см., например, НооденЬоот е! а1. , Мо1. Iттиηο1. 28:10271037 (1991)).

Хотя присутствие легкой цепи иммуноглобулина не является необходимым в иммуноадгезинах настоящего изобретения, легкая цепь иммуноглобулина может присутствовать или ковалентно связанной с тяжелой цепью гибридного полипептида иммуноглобулина-адгезина, или непосредственно соединяться с адгезином. В первом случае ДНК, кодирующая легкую цепь иммуноглобулина, обычно коэкспрессируется с ДНК, кодирующей гибридный белок адгезина-тяжелой цепи иммуноглобулина. В процессе секреции гибридная тяжелая цепь и легкая цепь будут ковалентно связаны для обеспечения иммуноглобулинподобной структуры, которая включает две пары тяжелой цепи-легкой цепи иммуноглобулина, связанных дисульфидными связями. Способы, пригодные для получения таких структур раскрыты, например, в патенте США № 4816567.

В предпочтительных осуществлениях иммуноадгезины создаются с помощью соединения последо

- 50 012464 вательности кДНК, кодирующей часть адгезина в рамке считывания, с последовательностью кДНК иммуноглобулина. Однако также может применяться соединение с геномными фрагментами иммуноглобулина. Как правило, последний тип гибридизации требует присутствия регуляторных последовательностей Ц для экспрессии. кДНК, кодирующие константные области тяжелой цепи ЦС. могут быть выделены основываясь на опубликованных последовательностях из библиотек кДНК, происходящих из селезенки или лимфоцитов периферической крови, с помощью гибридизации или способов полимеризационной цепной реакции (ПЦР). кДНК, кодирующие «адгезиновую» и иммуноглобулиновую части иммуноадгезина, могут быть вставлены в тандеме в плазмидный вектор, который направляет эффективную экспрессию в выбранных клетках-хозяевах.

Варианты полипептидов с измененным периодом полужизни

Рецептор Ес новорожденных ЕсКп представляет собой основной гомолог комплекса гистосовместимости (МНС), который не только доставляет ЦС через плацентарный барьер в ходе беременности, но также вовлекается в регуляцию периода полужизни ЦС в сыворотке. Недавний обзор по ЕсКп см. в бйебе, V и Е.8. ^атб, Аппи. Кеу. Iттиηо1. 18:739-766, 2000. ЕсКп связывается с ЦС зависимым от рН образом, когда связывание возникает при слегка кислых значениях рН, и при рН 7,4 связывание является незначительным или не определяется. Предполагается, что ЦС захватываются экспрессирующими ЕсКп клетками и входят в кислые эндосомы, где происходит взаимодействие ЕсКп-ЦС. Затем ЦС переносятся на поверхность клетки и высвобождаются при приблизительно нейтральных значениях рН. ЦС, которые не связываются с ЕсКп, после поступления в клетки, входят в лизосомальные компартменты и распадаются. С этой моделью согласуется гипотеза о том, что полипептиды, включающие вариант области Ес, который связывается с ЕсКп с повышенной аффинностью, обладают более длительным периодом полужизни в сыворотке, чем полипептиды с меньшим сродством.

Роль ЕсКп как переносчика ЦС указывает на то, что варианты областей Ес с измененной аффинностью к ЕсКп, могут быть терапевтически полезными или в контексте моноклонального антитела, или будучи функционально связанными с гетерологичным белком, т.е. с не антителом. Терапевтические полипептиды, которые могли бы принести пользу в результате быстрого выведения из организма субъекта или больного или из-за отсутствия переноса через плацентарную мембрану, например, радиоактивно меченные полипептиды, могли бы принести пользу, будучи функционально связанными с областью Ес, которая проявляет сниженную аффинность к ЕсКп. Альтернативно, полипептиды, которые могли бы извлечь выгоду из более длительного периода полужизни в сыворотке и, таким образом, необходимости более редкого введения, или из транспорта через плацентарную мембрану, предпочтительно были бы функционально связаны с областью Ес, которая проявляет повышенную связывающую аффинность к ЕсКп (смотри табл. 2, 5 и 6). Охватываются многочисленные сочетания характеристик Ес, например, область Ес с повышенной связывающей аффинностью к ЕсКп, но с незначительной СЭС или АЭСС активностью или ее отсутствием, может быть создана путем введения одной или больше замен аминокислот Ес, которые увеличивают связывающую аффинность к ЕсКп, как перечислено в табл. 2, например, в исходной области Ес [8С4, или в исходной области Ес !дС1 в сочетании с заменой аминокислоты, которая снижает активность СЭС и АЭСС.

Предпочтительные полипептиды, которые могли бы извлечь выгоду из увеличения периода полужизни в сыворотке, будучи функционально связанными с вариантом области Ес по изобретению, которая демонстрирует повышенную связывающую аффинность к ЕсКп, в сравнении с исходным полипептидом, представляют собой терапевтические полипептиды млекопитающих, включая такие молекулы, как, например, ренин; гормон роста; человеческий гормон роста; бычий гормон роста; рилизинг-фактор гормона роста; грелин; паратгормон; тиреотропный гормон; липопротеин; А-цепь инсулина; В-цепь инсулина; а1-антитрипсин; РАЫ; проинсулин; тромбопоэтин; фолликулостимулирующий гормон; кальцитонин; лютеинизирующий гормон; глюкагоны; факторы свертывания, такие как фактор СТПС, фактор IX, тканевой фактор, фактор вон Виллебрандта; противосвертывающие факторы, такие как протеин С; атриальный натрийуретический фактор; сурфактант легких; активатор плазминогена, такой как урокиназа или активатор плазминогена человеческой мочи или тканевого типа (!-РА); бомбезин; тромбин; гемопоэтический фактор роста; интерлейкины, например, с ГС-1 по ГЬ-10, ГГ-20; фактор некроза опухолей-альфа и -бета; энкефалиназа; альбумин сыворотки, такой как альбумин сыворотки человека; антимюллеров гормон; А-цепь релаксина; В-цепь релаксина; прорелаксин; пептид, связанный с гонадотропином мыши; микробный белок, такой как бета-лактамаза; ДНКаза; ингибин; активин; фактор роста эндотелия сосудов (VЕСЕ); рецепторы гормонов или факторов роста; интегрин; белок А или Ό; ревматоидные факторы; нейротрофический фактор, такой как нейротрофический фактор мозгового происхождения (ΒΌΝΕ), нейротрофин-3, -4, -5 или -6 (ΝΤ-3, ΝΤ-4, ΝΤ-5 или ΝΤ-6), или фактор роста нервов, такой как NСЕ-бета, кардиотропины (фактор гипертрофии сердца), такие как кардиотропин-1 (СТ-Ц фактор роста тромбоцитов (РЭСК); фактор роста фибробластов, такой как аЕСЕ и ЬЕСЕ, эпидермальный фактор роста (ЕСЕ) или его рецептор; трансформирующий фактора роста (ТСЕ), такой как Τ6Е-альфа и Τ6Е-бета, включая Τ6Е-β1, Τ6Е-β2, Τ6Е-β3, Τ6Е-β4 или Τ6Е-β5; инсулиноподобный фактор роста -I и -II; дез(1-3)-ЮЕ-[ (мозговой ЮЕ-Ц белки, связывающие инсулиноподобные факторы роста; белки ССТ такие как СЭ-3,

- 51 012464

СО-4, СО-8 и СО-19; эритропоэтин; остеоиндуктивные факторы; иммунотоксины; костный морфогенный белок кости, ростовой дифференцировочный фактор (например, СОЕ-8); интерферон, такой как интерферон-альфа, -бета и -гамма; колониестимулирующие факторы (С8Ек), например, М-С8Е; СМ-С8Е и СС8Е; анти-НЕЯ-2 антитело без природной области Ес 1дС; анти-Я8У антитело без природной области Ес 1дС; супероксиддисмутаза; рецепторы Т-клеток; белки мембраны клеточной поверхности; фактор ускорения распада комплемента; вирусный антиген, такой как, например, протион оболочки ВИЧ-1; транспортный белок; клеточные рецепторы, ответственные за «хоминг-эффект»; аддрессины; регуляторные белки; антитела без природной области Ес 1дС; а также фрагменты или предшественники любого из вышеперечисленных полипептидов.

Вариант области Ес, включающий замену аминокислоты по изобретению, которая обеспечивает измененный период полужизни в сыворотке для полипептида (т. е. повышенную связывающую аффинность к ЕсЯп), с которым он функционально связан, предпочтительно функционально связан с карбокси- или аминоконцом целевого полипептида, таким образом, образуя слитый белок.

Последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие варианты областей Ге

В настоящем изобретении также предлагаются последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие варианты областей Ес, а также композиции, векторы и клетки-хозяева, которые включают последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие варианты областей Ес. В настоящем изобретении также предлагаются рекомбинантные способы получения вариантов области Ес.

В общем, для получения рекомбинантных вариантов, нуклеиновую кислоту, кодирующую вариант, выделяют и вставляют в вектор. Клетки-хозяева могут быть трансфецированы вектором, что позволяет амплифицировать последовательность нуклеиновой кислоты, и/или полученный вариант пептида. Последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие варианты пептидов настоящего изобретения, могут быть выделены и секвенированы с использованием традиционных способов (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, которые способны специфически связываться с нуклеиновой кислотой, кодирующей вариант). В общем, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая вариант, функционально связана с другими элементами, такими как сигнальная последовательность (например, секреторные сигнальные последовательности), ориджин репликации, по меньшей мере один маркерный ген, энхансер, промотор или терминатор транскрипции. В определенных осуществлениях клетки-хозяева стабильно трансфецированы нуклеиновой кислотой, кодирующей вариант, для создания клеточной линии, экспрессирующей конкретный вариант. В предпочтительных осуществлениях изобретения варианты экспрессируются в клетках СНО, N80, 8р2/0, РЕЯ.С6 или НЕК293. Способы рекомбинации хорошо известны из уровня техники.

Последовательности нуклеиновой кислоты могут подвергаться мутациям таким образом, что могут быть получены варианты области Ес. Например, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая исходную область Ес (например, 8Е0 Ш N0: 1-12), может подвергаться мутации таким образом, что это ведет по меньшей мере к одной замене аминокислоты, когда последовательность нуклеиновой кислоты экспрессируется. Кроме того, последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие по меньшей мере часть исходной области Ес, могут подвергаться мутации с образованием аминокислотных последовательностей, которые включают по меньшей мере часть варианта области Ес.

В определенных осуществлениях синтез на базе кодонов используется для создания мутантных последовательностей. Примеры синтеза на базе кодонов включают, например, описанные в патентах США 5264563, 5523388 и 5808022. Коротко, синтез на базе кодонов может быть выполнен последовательным взаимодействием мономеров на отдельных подложках с образованием по меньшей мере двух разных триплетов. Взаимодействие может быть осуществлено в отдельных реакционных сосудах с последующим смешиванием подложек из реакционных сосудов и разделением смешанных подложек на два или более отдельных реакционных сосудов с повторением стадий взаимодействия, смешивания и разделения один или более раз в реакционных сосудах с конечной стадией смешивания или разделения. Кроме того, олигонуклеотиды могут быть отделены от подложек.

Терапевтическое применение и составы

В некоторых осуществлениях в настоящем изобретении предлагаются терапевтические составы, которые включают описанные здесь варианты. Не подразумевается, что настоящее изобретение ограничивается конкретной природой терапевтической композиции. Например, такие композиции могут включать вариант полипептида (или его часть), предлагаемую вместе с физиологически приемлемыми жидкостями, гелями, твердыми носителями, разбавителями, адъювантами и наполнителями, а также их сочетаниями (смотри, например, Яеттд!оп'к Рйаттасеийса1 8с1епсек 16!Е еййюп, Око1, А. Ей. (1980)).

Кроме того, варианты полипептидов могут использоваться вместе, перед или после других терапевтических агентов, включая, не ограничиваясь ими, салицилаты, стероиды, иммуносупрессанты, антитела или антибиотики. Конкретные терапевтические агенты, которые могут использоваться с вариантами настоящего изобретения, включают, не ограничиваясь ими, следующие соединения: соединения азобензола (патент США № 4312806), бензил-замещенные производные родамина (патент США № 5216002), цинковые соли Ь-карнозина (патент США № 5238931), 3-фенил-5-карбоксипиразолы и изотиазолы (патент США № 5294630), 1Ь-10 (патент США № 5368854), хинолиновые ингибиторы синтеза лейкотриена (па

- 52 012464 тент США № 5391555), 2'-гало-2'-дезоксиаденозин (патент США № 5506213), соединения фенола и бензамида (патент США № 5552439), трибутирин (патент США № 5569680), некоторые пептиды (патент США № 5756449), омега-3-полиненасыщенные кислоты (патент США № 5792795), УЪЛ-4 блокаторы (патент США № 5932214), преднизолона метасульфобензоат (патент США № 5834021), агенты, ограничивающие действие цитокинов (патент США № 5888969), и никотин (патент США № 5889028).

Варианты полипептидов могут использоваться вместе с агентами, которые снижают жизнеспособность или пролиферативный потенциал клетки. Агенты, которые снижают жизнеспособность или пролиферативный потенциал клетки, могут функционировать множеством способов, включая, например, ингибирование синтеза ДНК, ингибирование деления клетки, индукцию апоптоза или индукцию неапоптотической гибели клеток. Конкретные примеры цитотоксических и цитостатических агентов включают, не ограничиваясь ими противовирусный белок лаконоса, абрин, рицин и каждую из их А-цепей, доксорубицин, цисплатин, йод-131, иттрий-90, рений-188, висмут-212, таксол, 5-фторурацил, УР-16, блеомицин, метотрексат, виндезин, адриамицин, винкристин, винбластин, ΒСNυ, митомицин и циклофосфамид и некоторые цитокины, такие как ΤΝΕ-α и ΤΝΕ-β. Таким образом, цитотоксические или цитостатические агенты могут включать, например, радионуклиды, химиотерапевтические лекарства, белки и лектины.

Терапевтические композиции могут содержать, например, такие обычно применяемые добавки, как связующие агенты, наполнители, носители, консерванты, стабилизирующие агенты, эмульгаторы, буферы и наполнители, такие как, например, маннит фармацевтической чистоты, лактозу, крахмал, магния стеарат, натрия сахаринат, целлюлозу, магния карбонат и тому подобное. Эти композиции обычно содержат 1-95% активного ингредиента, предпочтительно 2%-70% активного ингредиента.

Варианты полипептидов настоящего изобретения можно также смешивать с разбавителями или наполнителями, которые являются совместимыми и физиологически приемлемыми. Подходящие разбавители и наполнители представляют собой, например, воду, физиологический раствор, декстрозу, глицерин или тому подобное, а также их сочетания. Кроме того, при желании, композиции могут содержать небольшие количества вспомогательных веществ, таких как увлажняющие или эмульгирующие агенты, стабилизирующие или буферирующие рН агенты.

В некоторых осуществлениях терапевтические композиции настоящего изобретения готовят или в виде жидких растворов или суспензий, таких как спреи, или в виде твердых форм. Составы для перорального применения обычно включают такие обычно применяемые добавки как связующие агенты, наполнители, носители, консерванты, стабилизирующие агенты, эмульгаторы, буферы и наполнители, например, маннит фармацевтической очистки, лактозу, крахмал, магния стеарат, натрия сахаринат, целлюлозу, магния карбонат и тому подобное. Эти композиции имеют форму растворов, суспензий, таблеток, пилюль, капсул, составов для постоянного высвобождения или порошков и обычно содержат 1-95% активного ингредиента, предпочтительно 2-70%. Один пример композиции для перорального применения, пригодной для доставки терапевтических композиций настоящего изобретения, описан в патенте США № 5643602.

Дополнительные составы, пригодные для других способов введения, таких как местное введение, включают мази, настойки, кремы, лосьоны, трансдермальные пластыри и суппозитории. Для мазей и кремов традиционные связующие вещества, носители и наполнители могут включать, например, полиалкиленгликоли или триглицериды. Пример способа местной доставки описан в патенте США № 5834016. Другие липосомальные способы доставки также могут использоваться (см., например, патенты США №№ 5851548 и 5711964).

Составы также могут содержать более одного активного соединения, если это необходимо для конкретного показания, которое подлежит лечению, предпочтительно с дополняющими активностями, которые не влияют неблагоприятно друг на друга. Такие молекулы подходят для присутствия в сочетании в количествах, которые являются эффективными для достижения поставленной цели.

Также могут быть приготовлены препараты для постоянного высвобождения. Подходящие примеры препаратов для постоянного высвобождения включают полупроницаемые матрицы твердых гидрофобных полимеров, которые содержат вариант полипептида, причем такие матрицы имеют фасонную форму, например, пленки или микрокапсулы. Примеры матриц для постоянного высвобождения включают, не ограничиваясь ими, полиэфиры, гидрогели (например, поли(2-гидроксиэтилметакрилат) или поли(виниловый спирт)), полилактиды, сополимеры Ь-глутаминовой кислоты и γ-этил-Ь-глутамата, недеградируемый этилвинилацетат, деградируемые сополимеры молочной кислоты-гликолевой кислоты, такие как ΕυΡΕΟΝ ΌΕΡΟΤ (инъецируемые микросферы, состоящие из сополимера молочной кислотыгликолевой кислоты сополимера и лейпролида ацетата) и поли-Э-(-)-3-гидроксимасляная кислота. Если полимеры, такие как этиленвинилацетат и молочная кислота-гликолевая кислота, способны высвобождать молекулы на протяжении периода 100 дней, то некоторые гидрогели высвобождают белки за более короткие промежутки времени.

Варианты полипептидов настоящего изобретения могут применяться для лечения субъекта. Такое лечение может осуществляться при введении субъекту с заболеванием или может осуществляться при введении субъекту профилактически (например, субъекту, склонному к заболеванию). Примеры состоя

- 53 012464 ний, которые могут поддаваться лечению, включают, не ограничиваясь ими, рак (например, если вариант полипептида связывается с НЕК2 рецептором, СЭ20 или фактором роста эндотелия сосудов (УБОР)); аллергические состояния, такие как астма (с анти-1дЕ антителом); и ЬРА-1-опосредованные заболевания (например, если вариант полипептида представляет собой анти-ЬРА-1 или анти-1САМ-1 антитело) и т.д.

В предпочтительных осуществлениях изобретения варианты полипептидов, применяемые для лечения субъектов, включают антитела или иммуноадгезины. Также в предпочтительных осуществлениях заболевания, которые лечат, представляют собой заболезания, которые отвечают на антитело или иммуноадгезин. Примеры заболеваний, которые отвечают на антитело или иммуноадгезин, включают такие заболевания и медицинские состояния, как лимфома (доказано, что реагирует на лечение с помощью КИТИХАМ, анти-СЭ20 антитела), инфекционное заболевание (доказано, что реагирует на лечение с помощью δΥΝΑΘΙδ, антитела, направленного на Р белок респираторного синцитиального вируса), почечный трансплантат (ΖΕΝΆΡΆΧ, антитело против рецептора 1Ь-2, доказано, что является полезным), болезнь Крона и ревматоидный артрит (доказано, что реагирует на лечение с помощью КЕМ1САЭЕ, анти-ΤΝΕ-α антитела), карцинома молочной железы (доказано, что реагирует на лечение с помощью НЕКСЕРТШ, анти-НЕК2 антитела), и рак толстого кишечника (доказано, что реагирует на лечение с помощью ЕЭЕЕСОЬОМАБ, анти-17-1А антитела). Варианты полипептидов, применяемые для лечения рака, предпочтительно должны включать замену аминокислоты в области Рс по изобретению, которая обеспечивает повышенную активность АЭСС и/или повышенную активность СЭС для полипептида.

В некоторых осуществлениях изобретения вариант полипептида с улучшенной АЭСС активностью используется при лечении заболеваний или расстройств, где разрушение или уничтожение ткани или чужеродных микроорганизмов является желательным. Например, вариант может использоваться для лечения рака; воспалительных заболеваний; инфекций (например, бактериальных, вирусных, грибковых или дрожжевых инфекций); и других состояний (таких как зоб), где уничтожение ткани является желательным. В других осуществлениях вариант полипептида обладает сниженной активностью АЭСС. Такие варианты могут применяться для лечения заболеваний или расстройств, где полипептид, содержащий область Рс, с длительным периодом полужизни является желательным, но полипептид предпочтительно не обладает нежелательной(ыми) эффекторной(ыми) функцией(ями). Например, полипептид, содержащий область Рс, может быть антителом против тканевого фактора (ТР); анти-1дЕ антителом; и антиинтегриновым антителом (например, анти-а437 антителом). Желательный механизм действия таких полипептидов, содержащих область Рс, может представлять собой блокирование связывания пар лигандрецептор. Более того, полипептид, содержащий Рс область со сниженной АЭСС активностью, может быть антителом-агонистом.

Варианты полипептидов, которые применяются для лечения рака, должны предпочтительно включать замену аминокислоты по изобретению в области Рс (смотри, например, табл. 2 в данном описании), которая придает полипептиду повышенную АЭСС активность и/или повышенную СЭС активность.

Варианты полипептидов настоящего изобретения могут вводиться любым пригодным способом, включая парентеральное, подкожное, местное, внутрибрюшинное, внутрилегочное и интраназальное введение, а также введение непосредственно в очаг поражения (например, в случае местного иммуносупрессивного лечения). Парентеральные инфузии включают внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное или подкожное введение. Кроме того, для введения варианта полипептида может подходить импульсная инфузия, конкретно, с уменьшением доз варианта полипептида. Предпочтительно дозировка осуществляется с помощью инъекций, наиболее предпочтительно, путем внутривенных или подкожных инъекций, частично в зависимости от того, будет ли введение коротким или хроническим.

Для профилактики или лечения заболевания подходящая схема дозирования варианта полипептида будет зависеть от типа заболевания, которое подлежит лечению, тяжести и протекания заболевания, вводится ли вариант полипептида для профилактических или лечебных целей, предыдущего лечения, анамнеза больного и ответа на вариант полипептида, а также частоты посещения врача. Вариант полипептида пригоден для введения больному однократно или в виде курсового лечения.

Например, в зависимости от типа и тяжести заболевания около от 0,1 мкг/кг до 15 мг/кг (например, 0,120 мг/кг) варианта полипептида составляет начальную кандидатную дозу для введения больному в виде либо, например, одного или нескольких приемов, либо путем непрерывной инфузии. Типичная суточная доза может варьировать от приблизительно 1 до 100 мг/кг или более, в зависимости от вышеупомянутых факторов. Для повторных введений в течение нескольких дней или дольше, в зависимости от состояния, лечение продолжают до достаточного уменьшения или устранения симптомов. Успешность такого лечения легко контролировать с помощью традиционных способов и тестов, которые могут использоваться для коррекции дозы с целью достижения терапевтического эффекта.

Эти предполагаемые количества варианта полипептида во многом являются объектом терапевтического усмотрения. Ключевым фактором в выборе подходящей дозы и схемы лечения является получаемый результат. Рассматриваемые в данном контексте факторы включают конкретное расстройство, которое подлежит лечению, конкретное млекопитающее, которое подлежит лечению, клиническое состояние индивидуального больного, причину расстройства, место доставки антитела, конкретный тип антитела,

- 54 012464 способ введения, схему введения и другие факторы, известные практикующим врачам.

Терапевтически эффективное количество варианта полипептида для введения представляет собой уровень дозировки, необходимый больному для того, чтобы уменьшить симптомы заболевания, подлежащего лечению. Кроме того, терапевтически эффективное количество может означать количество терапевтического агента, достаточное для того, чтобы задержать или минимизировать, или предупредить возникновение заболевания, например, задержать или минимизировать, или предупредить распространение рака. Терапевтически эффективное количество может обозначать количество терапевтического агента (например, вариант полипептида), а также может обозначать количество терапевтического агента, которое обеспечивает терапевтическую пользу с точки зрения лечения или контроля заболевания у субъекта. Кроме того, терапевтически эффективное количество в отношении терапевтического агента по изобретению обозначает количество терапевтического агента отдельно или в сочетании с другими видами лечения, что обеспечивает терапевтическую пользу при лечении или контроле заболевания у субъекта. Для варианта полипептида не требуется, но необязательно он может быть составлен с одним или более агентами, которые применяются в настоящее время для профилактики или лечения целевого расстройства. Эффективное количество таких других агентов зависит от количества варианта полипептида, присутствующего в составе, типа расстройства или лечения, и других факторов, обсужденных выше. Первый профилактический или терапевтический агент (например, вариант полипептида или полипептид, который включает вариант области Рс по изобретению или его функциональный фрагмент) может быть введен до, одновременно или после введения второго профилактического или терапевтического агента субъекту с расстройством.

Терапевтические агенты по изобретению могут быть заморожены или лиофилизованы для хранения и последующего восстановления в подходящем стерильном носителе перед использованием. Лиофилизация и восстановление может приводить к различным степеням потери активности антитела. Дозировка может потребовать коррекции для компенсации. В общем, предпочтительным является рН между 6 и 8.

Применение моноклонального антитела, которое включает вариант области Рс настоящего изобретения, для лечения или профилактики по меньшей мере одного из вышеупомянутых расстройств (например, рака), где антиген, с которым связывается моноклональное антитело, является вредоносным, или при котором больной получает пользу от уменьшения уровней антигена, рассматривается в данном описании. Кроме того, рассматривается использование антитела, которое включает вариант области Рс настоящего изобретения, для применения в производстве лекарства для лечения по меньшей мере одного из вышеупомянутых расстройств.

Применяемые здесь термины лечение, лечить и тому подобное обозначают получение желательного фармакологического и/или физиологического эффекта. Эффект может быть профилактическим в плане полного или частичного предупреждения заболевания или его симптома и/или может быть терапевтическим в плане частичного или полного излечения заболевания и/или неблагоприятного воздействия, характерного для заболевания. «Лечение» в данном описании включает введение соединения настоящего изобретения для лечения заболевания или расстройства у млекопитающего, особенно человека, и включает: (а) профилактику возникновения заболевания у субъекта, который может быть склонен к болезни, но ее наличие еще не диагностировано; (Ь) ингибирование заболевания, т. е. остановку его развития; и (с) облегчение заболевания, т.е. индукция регресса заболевания или расстройства или облегчение его симптомов или осложнений. Схемы дозирования могут быть скорректированы таким образом, чтобы обеспечить оптимальный желательный ответ (например, терапевтический или профилактический ответ). Например, может вводиться единый болюс, несколько раздельных доз может вводиться через интервалы времени или доза может быть пропорционально уменьшена или увеличена, как диктует острая необходимость в клинической ситуации.

Антитела против СБ20

Антитело против СБ20, включающее вариант области Рс настоящего изобретения, рассматривается как охватываемое данным изобретением (смотри, например, пример 4 и фиг. 4 в данном описании). В одном осуществлении антитело против СЭ20 включает вариант области Рс по изобретению, или его часть, которая включает замену аминокислоты, как перечислено в табл. 1-10 в данном описании, антитело против СЭ20 может дополнительно включать пептид с последовательностью, показанной в 8Е0 ΙΌ N0: 13, 14, 15 или 16. В другом осуществлении антитело против СБ20 включает вариант области Рс по изобретению, или его часть, которая включает замену аминокислоты, как перечислено в табл. 1-10 в данном описании, и дополнительно включает пептиды с последовательностями, показанными в:

a) 8ЕО ΙΌ N0: 13 и 8Ер ΙΌ N0: 14;

b) 8ЕО ΙΌ N0: 15 и 8ЕО ΙΌ N0: 16;

c) 8ЕО ΙΌ N0: 17, 18, 19, 20, 21 и 22; или

б) 8ЕО ΙΌ N0: 23, 24, 25, 26, 27 и 28.

Более предпочтительно антитело против СБ20 по изобретению включает вариант области Рс, или ее часть, которая включает замену(ы) аминокислот, выбранных из группы, которая состоит из:

a) 247Ι и 339Ό;

b) 247Ι и 339Р; и

- 55 012464

с) 378Ό;

и дополнительно включает вариабельную область, которая включает полипептиды с последовательностями, выбранными из группы, которая состоит из:

a) 8ЕО ΙΌ N0: 13 и 8ЕО ГО N0: 14;

b) 8ЕО ΙΌ N0: 15 и 8ЕО ΙΌ N0: 16;

c) 8ЕО ΙΌ N0: 17, 18, 19, 20, 21 и 22; и

б) 8ЕО ΙΌ N0: 23, 24, 25, 26, 27 и 28.

Дополнительные применения вариантов области Ре

Варианты и последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие варианты по настоящему изобретению, могут применяться различным образом. Например, варианты по настоящему изобретению могут применяться в тестах скрининга лекарственных средств. Например, соединения-кандидаты могут оцениваться на предмет их способности изменять или вмешиваться в эффекторные функции Ес путем контакта варианта с соединением-кандидатом и определения связывания соединения-кандидата с вариантом. Вариант может быть иммобилизован с применением способов, известных из уровня техники, таких как связывание С8Т варианта гибридного белка с полимерными гранулами, содержащими глутатион. Гибридный ген, кодирующий слитый белок С8Т, конструируется путем соединения ДНК, кодирующей целевой вариант, с ДНК, кодирующей карбоксильный конец С8Т (см., например., 8ιηί11ι е! а1., Сепе 67:31 [1988]). Слитый конструкт затем трансформируют в подходящую систему экспрессии (например, Е. сой ХА90), в которой экспрессия слитого С8Т белка может быть индуцирована с помощью изопропил-Г-О-тиогалактопиранозида (ГРТС). Индукция с помощью ГРТС должна давать слитый белок как основную составляющую растворимых клеточных белков. Слитые белки могут быть очищены способами, известными специалистам в данной области, включая очистку глутатион-аффинной хроматографией. Связывание соединения-кандидата с вариантом коррелирует со способностью соединения разрушать одну или больше эффекторных функций.

В другом способе скрининга или вариант, или выбранный ЕсЯ иммобилизуют с использованием способов, известных из уровня техники, таких как абсорбция на пластиковом планшете для микротитрования или специфическое связывание С8Т-гибридного белка с полимерными гранулами, содержащими глутатион. Например, вариант С8Т связывают с глутатион-сефарозными гранулами. Иммобилизованный вариант затем вводят в контакт с ЕсЯ и соединением-кандидатом. Далее несвязанный пептид удаляют и комплекс солюбилизируют и анализируют для определения количества связанного меченого пептида. Уменьшение связывания является показателем того, что соединение-кандидат ингибирует взаимодействие варианта с ЕсЯ. Этот способ скрининга является особенно эффективным при использовании вариантов настоящего изобретения, которые демонстрируют повышенный уровень вариантов А данного способа, который позволяет проводить скрининг соединений, которые способны разрушать предварительно образованный комплекс вариант/рецептор Ес. Например, в некоторых осуществлениях комплекс, включающий вариант, связанный с ЕсЯ, иммобилизуют, как описано выше, и приводят в контакт с соединением-кандидатом. Растворение комплекса соединением-кандидатом коррелирует со способностью соединения разрушать или ингибировать взаимодействие между исследуемым вариантом и ЕсЯ. С этой точки зрения соединения с терапевтическим потенциалом (например, у людей) могут быть идентифицированы (например, соединения, пригодные для лечения заболеваний у человека, таких как аутоиммунные заболевания).

Другой способ скрининга лекарств обеспечивает высокопроизводительный скрининг для соединений, обладающих подходящей связывающей аффинностью с вариантами пептида и подробно описан в \У0 84/03564. Коротко, большое количество различных исследуемых пептидных соединений небольшого размера синтезируется на твердом субстрате, таком как пластиковые иглы или другая поверхность. Исследуемые пептидные соединения затем вводят в реакцию с вариантами пептидов и промывают. Далее связанные варианты пептидов обнаруживают с помощью способов, хорошо известных из уровня техники.

В другом способе используют антитела, направленные против вариантов пептидов. Такие антитела, способные специфично связываться с вариантами пептидов, конкурируют с исследуемым соединением за связывание с данным вариантом. Таким способом антитела могут применяться для обнаружения присутствия любого пептида, который несет одну или более антигенных детерминант варианта пептида.

Настоящее изобретение рассматривает многие другие средства скрининга соединений. Приведенные выше примеры представлены только для иллюстрации спектра существующих способов. Обычный специалист в данной области будет понимать, что могут применяться многие другие способы скрининга.

Конкретно, настоящее изобретение рассматривает применение линий клеток, трансфицированных нуклеиновой кислотой, кодирующей по меньшей мере один вариант области Ес для скрининга соединений на активность и конкретно для высокопроизводительного скрининга соединений из комбинаторных библиотек (например, библиотек, содержащих свыше 10⁴ соединений). Линии клеток по данному изобретению могут применяться в разнообразных способах скрининга.

Варианты по настоящему изобретению могут применяться как агент для аффинной очистки. Например, вариант может быть иммобилизован на твердой фазе, такой как смола 8ерНабех или фильтро

- 56 012464 вальная бумага, с применением способов, хорошо известных из уровня техники. Иммобилизованный вариант затем вводится в контакт с образцом, содержащим антиген, который подлежит очистке, и после этого подложку промывают подходящим растворителем, который будет удалять по существу весь материал из образца, за исключением антигена, который подлежит очистке, связанного с иммобилизованным вариантом полипептида. В конечном итоге подложку промывают другим подходящим растворителем, таким как глициновый буфер, рН 5,0, который будет высвобождать антиген из варианта полипептида.

Вариант полипептида также может быть пригоден в диагностических тестах (например, для определения экспрессии интересующего антигена в конкретных клетках, тканях или сыворотке). Для диагностического применения вариант обычно будет помечен частью, которая поддается обнаружению (такие метки также пригодны для тестирования областей Ес, описанных выше). Доступны многочисленные метки, включая, но не ограничиваясь этим, радиоизотопы (например, 8, С, Ι, Н и Н), флуоресцентные метки (например, хелаты редкоземельных металлов (хелаты европия) или флуоресцеин и его производные, родамин и его производные, дансил, лиссамин, фикоэритрин и техасский красный) и различные метки на основе реакции фермент-субстрат (смотри, например, патент США Νο. 4275149), и люциферазу, люциферин, 2,3-дигидрофталазиндионы, малатдегидрогеназу, уреазу, пероксидазу, такую как пероксидаза хрена (ΗΒΡΟ), щелочную фосфатазу, 3-галактозидазу, глюкоамилазу, лизоцим, оксидазы Сахаров (например, глюкозооксидазу, галактозооксидазу и глюкоза-6-фосфатдегидрогеназу), гетероциклические оксидазы (такие как уриказа и ксантиноксидаза), лактопероксидазу, микропероксидазу и тому подобное). Примеры сочетаний ферментов-субстратов включают, например: (1) пероксидазу хрена (ΗΒΡΟ) с пероксидом водорода в качестве субстрата, где пероксид водорода окисляет предшественник красителя (например, ортофенилендиамин (ΟΡΌ) или 3,3',5,5'-тетраметилбензидин гидрохлорид (ТМВ)); (ίί) щелочную фосфатазу (АР) с паранитрофенилфосфатом в качестве хромогенного субстрата; и (ίίί) Όгалактозидазу (В-О-Са1) с хромогенным субстратом или флуорогенным субстратом.

Варианты настоящего изобретения могут также применяться для диагностических тестов ίη νίνο. Например, вариант полипептида метят радионуклидом так, что локализация антигена или клеток, экспрессирующих его, может быть определена с помощью иммуносцинтиографии.

Таблица 1. Варианты Ес

Псложение’ Замена аминокислоты *

2 35	С,	в
2 36	Е,	Н,	Υ
237	К,	Ν,	в
238	Е,	С,	Н,	I,	ь,	V,	И,
244	Ь
2 4 5	В
24 7	А,	0,	Е,	Г,	м,	Ν,	2,
24 8	Е,	Рг	2,	и
24 9	ь.	И,	Ν,	р,	Υ
251	н,	I,	к
254	д,	Е,	Е,	С,	н,	I,	К,
255	К,	N
256	н,	Ή	К,	Ь,	V,	и,	У
257	А,	I,	и,		5
258	Э
260	3
262	ь

К, 8, Т, И, Υ

Ъ, Μ, Ν, Р, с, К, V, Η, Υ

- 57 012464

2643

265 К,3

267 Η, I,К

268К

269 М,О

271Т

272 Н, К, Ъ,К

279

А,

0,

Р,

б,

н,

I, к,

1,

м,

Ν,

0,

К,

3,

Т,

И, Υ

280

Т

283

Г,

6,

Н,

I,

к,

Ь,

м,

р,

В,

Т,

и,

Υ

286

Г

288

Ν,

₽

292

Е,

Г,

с,

I,

ь

293

3,

V

301

И

304

Е

307

Е,

м

312

Р

315

Г,

К,

0,

Р,

к

316

г,

к

317

Р,

т

31 8

Ν,

Р,

т

332

Р,

С,

ь.

м,

5,

V,

и

339

0,

Е,

Г,

С,

Н,

I,

к,

ь,

м.

Ν,

0,

К,

3,

и,

Υ

341

0,

Е,

Г,

н,

I,

К,

Ъ,

м,

Ν,

Р,

<2,

В,

з,

т.

V, и,

Υ

34 3

А,

ϋ,

Е,

Г,

6,

В,

I,

к,

Ь,

м,

Ν,

с,

К,

5,

Т, V,

Η, Υ

373

Э,

Е,

Г,

6,

н,

I,

К,

ь,

м,

N.

0,

к.

3,

т,

V, и

375

К

3^_,6

Е,

г,

С,

н,

I,

1,

м,

Ν,

р,

0,

В,

5,

т.

V,

И, Υ

377

с,

к,

Р

378

β,

N

379

Ν,

<2,

3,

т

380

ϋ,

Ν,

3,

т

382

0,

Е,

Н,

I,

К,

Ъ,

м.

Ν,

₽,

0,

К,

3,

Т,

V,

И, Υ

385 Е, Р

- 58 012464

38 6	К
4 23	N
424	Н,	м,	, V
42 6	э,	ь
427	N
429	А,	г.	, м
4 3 9	А,	0,	, г,	с,	н,	I,	К, Ъ, Μ, Ν, Р, 0, В, 3, Т, V, К, Υ
431	н.	К,	, Р
432	В,	5
438	с,	к,	- ъ,	т.	и
439	Е,	Н,
440	0,	Е,	, г,	6,	Н,	I,	К, Ь, М, 0, Т, V
442	К
* Положение	аминокислоты	Ес	в соответствии с нумерацией ЕС
* Например,	в	положении	249	: 249Ь, 249М, 249Ν или 249Υ

Таблица 2. Варианты Ес: изменения эффекторной функции

Вариант*	АОСС	АЭСС	Связывание	Связывание	сое	С ОС
	повышена	снижена	Гскп	РсКп	повышена	снижена
			повышено	снижено

3 5С

X

2350

235В

53

236Г

236В

236Υ

237Е

237К

237Ν

237К

238А

238Е

238С

238Н

- 59 012464

2381	X	X
2385		X	X			X
23817		X				X
238И		X		X		X
238Υ		X		X		X
2 4 45			X		X
245Κ		X	X			X
247Α	X			X	X
247ϋ				X	X
247Ε				X	X
247Ε	X			X
2476		X		X	X
247Η	X			X		X
2471	X			X		X
2475	X			X		X
247Μ	X			X
247Ν				X	X
2470				X	X
2478.		X		X	X
2475				X	X	X
247Τ	X
24 7Υ	X
24 7И				X	X
247Υ	X			X		X
248Α				X
24 8 Ε				X	X
248Ρ				X	X
2480				X	X
248Η				X	X
249Ε	X			X	X
249Ь		X		X	X
249Μ				X	X
249Χ					X
249Ρ		X	X		X
249Υ	X			X	X

- 60 012464

250К	X	X
2 5 ОМ		X	X			X
250В		X		X	X
251?	X			X	X
251Н		X		X	X
2 511		X		X	X
251И		X		X	X
252Υ		X	X			X
254Й				X	X
254Ω				X		X
254Е				X		X
254 Г	X			X	X
254С				X
2 54Н				X
2541				X		X
2 54 К				X	X
254Ь		X		X	X
254М	X			X	X
254Ν				X
254Р		X		X		X
2540		X		X		X
254В				X	X
254Т		X		X		X
254У		X		X		X
254И				X	X
254Υ	X			X	X
255К				X	X
255Ν				X		X
256А	X		X		X
256Е	X			X
256С			X		X
256Н				X
2561				X	X
256К				X
256Ь					X

- 61 012464

256М	X
256Р			X
2560
256В
2 5 6ν		X
256И
256Υ
257А		X	X
2571		X	X
257М		X	X
257Ν		X	X
2575		X	X
257ν		X	X
258Ω	X		X
2605		X	X
2621		X	X
2643		X
-ιζευ		V
ιυ-οπ		Λ
265Κ		X
2655		X
265Υ		X
2673		X
267Η		X
2671		X
267Κ		X
268Ρ	X
268Ε	X		X
268Κ
269Ν		X
2 690		X
270Α		X
2700		X
270Κ		X	X
270Μ		X
270Ν		X

XX

X

XX

X

XX

X

X X

X

- 62 012464

271Т		X				X
272Н		X	X			X
272К		X	X
272Ь		X	X			X
272Ν		X				X
272Р.		X	X
279Ά	X		X
27 90		X	X
279Г		X
2796			X
2 7 9Н			X
2792				X
279К		X		X
27 90		X		X
27 9М			X
279Ν			X
2790			X		X
			V
27 Эк
2793			X		X
279Т			X
27 9И		X	X		X
279Υ			X		X
2 8 0А	X			X
280К	X				X
280Т				X	X
2 8 ЗА	X		X
283Ώ		X	X
283Е		X	X		X
2836		X	X		X
283Н		X	X		X
2831	X		X		X
283К	X		X		X
2830		X	X		X
283М	X				X
283Ν			X		X

- 63 012464

283Р	X	X
2 8 30			X
283В	X		X		X
2835			X		X
283Т			X
283И		X	X		X
28 3Υ		X	X
285Ν		X	X
286Г			X
288Ν	X		X
288Р		X	X
292А	X					X
292Е		X		X
292Г		X		X
292С		X		X
2 921		X		X
2 921.				X	X
7 а тс		X				X

2 9 ЗУ		X	X
301И		X				X
304Е		X
307А		X	X		X
307Е		X	X			X
307М		X	X		X
311А	X		X
31Ю	X			X
311Е				X		X
311Г		X		X	X
3115				X
3111		X	X		X
311К		X	X		X
311Ь			X		X
зим			X		X
311К				X	X
311Ν	X			X

- 64 012464

3112	X	X
311Т	X				X
31ΐν	X		X		X
311И			X		X
311Υ	X			X	X
312Ρ		X	X		X
314Γ		X		X	X
3141		X			X
314ν		X		X	X
314И		X		X	X
314Υ					X
315Γ		X		X	X
315Κ				X	X
315Ь	X				X
315 Ρ		X		X	X
315Κ					X
316Γ		X		X		X
326Κ			X		X
317Ρ		X	X		X
317Τ				X	X
318Ν	X		X		X
31 8Ρ	X					X
318Τ	X		X		X
318ν	X
326И		X		X	X
327Τ		X		X		X
328ν		X				X
329Υ		X				X
330Κ	X					X
330Κ						X
332Α					X
332ϋ	X				X
332Ε	X				X
332Γ			X		X
3326					X

- 65 012464

332Н	X	X	X
3 32К		X	X			X
3321		X	X		X
332М			X		X
332Ν					X
3320					X
332К		X	X
3323			X		X
332Т	X				X
332X7	X				X
332«		X	X		X
332Υ					X
339Э	X				X
339Е				X		X
339Г	X				X
3396	X			X	X
339Н					X
С С Γϊτ	X				X
339К	X				X
3391				X
339М	X					X
339Ν	X		X		X
3390	X				X
3 3 9В	X			X	X
3395	X				X
3 3 9Т	X		X		X
339«			X		X
339Υ					X
34Ю		X		X	X
34 1Е		X		X	X
341Г		X		X	X
34 1Н		X			X
3411		X		X	X
341К		X		X	X
3411		X		X	X

- 66 012464

341М

341Ν

341Р

3410

341К

3413

341Т

341У

341И

341Υ

343А

3430

343Е

343?

3436

343Н

3431

343К

343Ь

3М

343Ы

3430

343Е

3438

343Т

343ν

343И

3Υ

ЗА

373ϋ

373Е

ЗЕ

36

373Н

31

X

- 67 012464

373К	X	X	X
3731		X		X	X
373М		X		X	X
373Ν		X		X	X
3732		X		X	X
373К		X			X
3733		X		X		X
373Т		X		X	X
373У		X		X	X
373Η		X		X	X
375В		X	X		X
376Ά	X		X		X
3 7 6Ε		X
37 6Γ		X			X
37 6С		X	X		X
37 6Н		X		X	X
37 61			X
37 6Ь				X	X
376М			X
376Ν					X
376Р			X		X
37 62					X
376К					X
3763					X
3 7 6Т			X		X
37 6У	X		X		X
37 6И		X		X
37 6 Υ		X		X
3773	X
377К	X		X
37 7 Р					X
37 8 ϋ			X			X
378Ν			X
379Ν	X				X
3790		X			X

- 68 012464

37 93					X
37 9Т					X
380ή			X		X	X
3800
38 ΟΝ	X		X		X
3805	X		X		X
38 ОТ			X		X
382Ά	X
382ϋ		X				X
38 2 Г	X		X			X
382Η			X
3821	X		X		X
382Κ			X
382Ь			X		X
382М			X
382Ν			X			X
382Р						X
3820			X		X
382В			X			X
3825		X	X			X
382Т			X
3827			X		X
382И			X			X
382Υ			X			X
38 5Е	X					X
385Р						X
386К					X
423Ν			X			X
424Н						X
42414		X		X		X
4247				X
4260				X	X
426Ь					X
427Ν	X		X			X
429А		X		X	X

- 69 012464

429Г

ЭМ X

430А

430ϋ

ЗОЕ

306

ЗОН

301

3 ОК

300

3 ОМ

430Ν

43ОР

300

430К

4305

430Т

430ν

ЗОИ

430Υ

431Н

431К

431Р

432К

4325

4346

434Н

4341

434И X

434Υ

4361 X

361,

436Т

4386

38 К

X

- 70 012464

438Σ	X	X
438Т			X			X
438И			X		X
439Е						X
439Н						X
4390				X		X
4 4 0А				X		X
440ϋ		X		X
4 40Е				X
440Г				X		X
4406	X					X
440Н	X		X
4 401	X					X
440К			X			X
4401	X		X			X
440М				X		X
440Ν
4400					X
440К
440Т		X
4 4 Ой		X
440Н
440Υ					X
442К		X	X
* Варианты,	тестированные	в антителе	против	СБ20, область	ГС
1д61

Таблица 3. Повышенная АБСС

Замена аминокислоты *

Положение*

247

249

251

254

256

258

А, Е, Η, I, Ь, Μ, Т, V, Υ

Е, Υ

Г

Г, Μ, Υ

А, М

Б

- 71 012464

268	β.	Е
279	А
280	А,	К
283	А,	I,	К,	М, В
288	N
292	А
311	А,	β,	Ν,	Т, V, Υ
315	Ъ
318	Ν,	Р,	т,	V
330	К
332	Т,	V
339	β,	Е,	С,	I, К, Μ, Ν, 0, В, Ξ, Т
376	А,	V
377	с,	к
379	N
380	Ν,	5
382	А,	I
385	Е
427	N
429	М
434	И
436	I
440	б,	Н,	I,	ъ
⁺ Положение	аминокислоты	Гс	в соответствии с нумерацией
ЕС
* Например,	в положении 249:	249Е	или 249Υ

Таблица 4. Сниженная ЛЭСС

Положение

Замена аминокислоты

235 о,

В,

236

Е,

В,

237

Е,

К,

Ν,

238

Е,

С, н,

V, И, Υ

247

249

- 72 012464

250	к,	м,	К
251	н,	I,	И
252	Υ
254	ь,	Р,	0,	т,	V
2 56	V
257	А,	I,	м,	Ν,	3,	V
2 60	3
2 62	I
264	3
2 65	н,	к,	3
2 67	С,	н,	I,	к
2 69	Ν,	0
2 70	А,	С,	К,	м,	N
271	Т
272	н.	К,	Ь,	Ν,	В
27 9	ϋ,	?,	К,	ь,	и
283	β.	Г,	С,	н.	ь,	Т,	и,	Υ
2 85	Ν
288	Р
2 92	Е,	Г,	о,	I
2 93	3,	V
301	И
304	Е
30*^?	А,	Е,	м
311	Е,	I,	К,	3
312	Р
314	Е,	I,	V,	к
315	Е,	Р
316	Г
317	Р
327	Т
328	V
32 9	Υ
332	с,	К,	Ь,	К,	и
341	Е,	Е,	Г,	Н,	I,	К,		Μ, Ν, В, 0, В, 3, Ί, и, Υ

- 73 012464

343	А,	υ,	Е,	Г,	с,	н,	ь,	м.	Ν,	Ω,	к,
373	А,	с,	Е,	Г,	6,	I,	К,	5,	м,	Ν,	с,
375	К
376	А,	Е,	г,	с,	н,	и.	Υ
379	0
382	ϋ,	5
429	А,	Г
430	Н,	К,	Ν,	0,	К,	к
432	К,	3
434	I
440	0,	Т,	V
442	к

Положение аминокислоты Ес в соответствии с нумерацией ЕС

Таблица 5. Повышенная аффинность связывания РсКп

238	Ь
244	ь
245	к
249	Р
252	Υ
256	₽
257	А,	I,	м,	Ν,	5,	V
258	ϋ
260	3
262	ь
270	к
272	ь,	К
279	А,	ϋ,	С,	Н,	М,	Ν,	0,	к
283	А,	э,	г.	с,	н,	I,	к,	ь
285	N
286	Г
288	Ν,	Р
293	V
307	А,	Е,	м

- 74 012464

311	А,	I,	К,	ь,	м,	V,	и
312	Р
316	К
317	Р
318	Ν,	т
332	Е,	Н,	К,	Ь,	и,	К,	5, И
339	Ν,	Т,	и
341	Р
343	Е,	н.	К,	0,	В,	Т,	Υ
375	К
376	С,	И	М,	Р,	Т,	V
377	к
378	ϋ.	N
380	Ν,	5,	т
382	Е,	н,	I,	К,	ь,	м,	Ν, о, В, 3, Т, V, И, Υ
423	N
427	N
430	А,	Г,	с.	н,	I,	К,	Ь, Μ, Ν, 0, к, 3, т, V, Υ
431	н,	к
434	Е,	6,	н.	И,	Υ
436	I,	Ь,	т
438	К,	0,	Т,	и
440	к
442	к
⁺ Положение	аминокислоты Ес в	соответствии с нумерацией ЕС

Таблица 6. Сниженная аффинность связывания РсЯп

Положение⁴ Замена аминокислоты

235	0
236	Υ
237	к,	В
238	Е,	С, н,	к
247	А,	υ, е_г	т,	С, Η, I, Ъ, Μ, Ν, 0, К, 3, И, Υ
248	А,	г, р,	0,	и
249	Е,	ь, м,	Υ

- 75 012464

251	Г,	Н, I, и
254	ϋ,	Е, Г, С,	Н,	I, К,	ь,	И,	Ν,	Р, о, Н, Т, V, И, У
255	к.	N
256	Г,	Н, I, К,	м,	К, И,	Υ
264	3
265	Ξ,	Υ
267	С.	I
268	Ό,	к
270	А,	м
278	I,	к, ь
28С	т
292	Е,	Г, 6, I,	ь
311	э,	Е, Г, 6,	Ν,	к, υ
315	Е,	К, Р
316	Е
317	Т
32 6	И
327	т
339	Е,	с, ъ, к
341	0,	Е, Г, I,	К,	Ь, И,	Ν,	С,	к,	5, т, V, Η, Υ
34 3	м,	V, И
373	А,	β, 6, К,	Ь,	Μ, Ν,	0,	5,	т,	V, н
376	Н,	Е, и, Υ
424	м,	V
426	ϋ
4 29	А,	г, м
4 30	О,	и
431	Р
432	К,	3
434	I
439	0
440	А,	0, Е, Г,	м
* Положение	аминокислоты	Ес	в соответствии	с нумерацией ЕС

- 76 012464

Таблица 7. Повышенная СЭС

Полэжение⁺ Замена аминокислоты ^236 Ϋ

244 1

247

А,

о.

Е,

С, Ν, Й,

в,

з,

и

248

г,

Р,

<2,

И

249

Е,

ь,

м,

Ν,

р,

Υ

250

к,

в

251

Г,

н,

I,

И

254

А,

г,

к,

ь,

м.

к,

Υ

255

К

256

А,

6,

I,

ь.

м,

р,

ΰ.

и,

Υ

260

3

268

О

27 9

С,

3,

И,

Υ

28 0

к.

т

28 3

г,

б.

н.

I,

к,

Е,

м,

Ν,

р, в,

3,

и

292

ь

307

А,

м

311

Г,

I,

К,

ь,

м,

т,

V,

И,

Υ

312

Р

314

г,

I,

V,

Н,

Υ

315

г,

К,

И,

Р,

к

316

к

317

Р,

т

318

Ν,

т

332

А,

О,

Е,

Г,

с,

н,

Е,

И,

Ν, <э,

3,

Т,

V, К,

Υ

339

о,

Р,

с,

н,

I,

к.

Ν,

0,

К, 3,

т,

и,

Υ

341

0,

Е,

Г,

Н,

I,

К,

ь,

м,

Ν, Р,

<2,

в,

3, т,

V, и, Υ

343

А,

Е,

с,

и,

К,

Е,

м,

Ν, <2,

В,

3,

т, н_г

Υ

373

О,

Е,

К,

Н,

I,

К,

Е,

м,

Ν, 0,

К,

Т,

V, и

3’5

К

37 6

А,

Г,

С,

н,

ь,

Ν,

Р,

<2,

В, 3,

т.

V

377 Р

379 Ν, й, 3, Т

- 77 012464

380	А,	Ν,	3,	т
382	I,	ь,	0,	V
386	К
426	ϋ,	ь
429	А,	г,	м
430	А,	β,	Г,	С, Н, I, К, 1, Μ, Ν, Р, В, 3, Т, ν_Γ Η, Υ
431	н,	Р
4 32	К,	5
434	И,	Υ
438	Ь /	и
440		Υ

* Положение аминокислоты Ес в соответствии с нумерацией ЕС

Таблица 8. Сниженная СГОС

Положение* Замена аминокислоты

235	С,	5
236	В
2 37	Е,	к,	Ν,	В
238	А,	Е,	С,	н,
243	К
247	н,	I,	Ъ,	Т,
250	м
252	Υ
254	ϋ,	Е,	I,	р,
255	N
257	А,	I,	м.	Ν,
262	Ь
264	3
265	н.	Υ
2 67	с,	н,	I,	К
268	к
269	Ν,	ΰ
27 0	3,	м,	N
271	т
272	н,	ь,	N

- 78 012464

292	А
293	3
301	Ы
307	Е
311	Е,	3
316	Г
318	Р
327	т
328	V
329	Υ
330	К,	К
332	Е,	м
343	I
373	3
378	ϋ
380	О
382	о,	Г, Ν, Р, К, 3, Η, Υ
385	Е,	Р
423	N
42 4	н,	м
4 27	N

⁺ Положение аминокислоты Ес в соответствии с нумерацией ЕС

Примеры

Следующие примеры приведены с целью демонстрации и дальнейшей иллюстрации определенных предпочтительных осуществлений и аспектов настоящего изобретения и не предназначены для ограничения объема изобретения.

Пример 1. Скрининг вариантов областей Ес в тестах ЛЭСС

Данный пример описывает, как проводится скрининг вариантов областей Ес в тесте АПСС, в контексте антитела (например, против СП20).

ί. Выделение моноядерных клеток периферической крови (РВМС)

Приблизительно 50 мл периферической крови, полученной от здорового донора, разбавляли в соотношении 1:2 забуференным фосфатом физиологическим раствором (ЗФР) с рН 7,0. Растворы смешивали осторожным вращением пробирки. Приблизительно 12 мл Н^8ΐορа^ие-1077 (§1дта кат. № 1077-1) аккуратно наслаивали под разбавленный образец крови с последующим центрифугированием в центрифуге δοινηΐΐ КТ6000В с качающимся бакет-ротором при 1000 об./мин в течение 10 мин. Верхнюю фазу градиента отбрасывали с помощью аспирации и межфазную часть белого цвета, содержащую РВМС, собирали и промывали 3 раза сбалансированным солевым раствором Хенкса (Όί^ο кат. № 14025-092). Промытый осадок клеток суспендировали приблизительно в 20 мл среды КРМ1 1640, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки (ЭБС) (Отеда §аеп1Шс кат. № ЕВ-01). Ресуспендированные РВМС разносили в два культуральных флакона Т-175 и добавляли в каждый из них 30 мл КРМ1, содержащей 10% ЭБС, с последующей инкубацией в течение ночи при 37°С в инкубаторе с содержанием 5% СО₂. На следующий день неприлипшие РВМС собирали в пробирки Фалкона объемом 50 мл, центрифугировали как описано выше и ресуспендировали в КРМ1, содержащей 1% ЭБС без фенолового красного. Маленькую порцию ресуспендированных клеток разбавляли в 10 раз и подсчитывали с использованием гемоцитометра. Оставшиеся РВМС помещали в инкубатор до использования.

ίί. Линия клеток-мишеней (специфичная для анти-СП20 тестов ЛЭСС) ^νίΐ.2 и 8К\У6.4 СО20-экспрессирующие линии В-клеток получали от АТСС и культивировали в соответствии с инструкциями. За день перед использованием клетки разделяли на 2 части. На следующий день количество клеток доводили до 4х10⁵ клеток/мл и аликвоты 50 мкл (20000 клеток/лунка) добавляли в 96-луночный планшет для культуры тканей.

ϊϊΐ. Разведения 1дС

Перед скринингом 1дС, содержащий вариант Ес настоящего изобретения экспрессировали, очищали и количественно определяли с использованием стандартного ЕЬ18А. Для первичного скрининга ЛЭСС по одной точке варианты 1д6 разбавляли до 40 нг/мл в среде КРМ1, содержащей 1% ЭБС без фенолового красного. Конечную концентрацию 1дС в тесте получают разбавлением в 4 раза (т.е. конечная концен

- 79 012464 трация 10 нг/мл). Аликвоты пятьдесят микролитров 1дС добавляли к клеткам-мишеням и инкубировали в течение 15 мин при 37°С перед добавлением эффекторных клеток к опсонизированным клеткаммишеням.

При проведении титрований 1дС концентрацию 1дС варьировали в интервале от приблизительно 0,0001 до 1 мкг/мл. Готовили разведения 1дС с использованием 96-луночного планшета для микротитрования путем разведения образцов в КРМ1, содержащей 1% ЭБС без фенолового красного. Разбавленные образцы 1дС затем добавляли к тестируемому планшету, содержащему клетки-мишени.

ίν. Эффекторные клетки

Концентрацию РВМС корректировали таким образом, чтобы соотношение эффекторные клетки/клетки-мишени находилось в интервале 10-20:1 (т.е. 2-4х10⁶ клеток/мл). Сто микролитров ресуспендированных РВМС добавляли к каждой лунке опсонизированных клеток-мишеней. Планшеты инкубировали при 37°С в присутствии 5% СО₂ в течение 3-4 ч.

ν. Определение высвобождения лактатдегидрогеназы (ЛДГ)

Лизис клеток-мишеней измеряли определением высвобождения фермента ЛДГ из цитоплазмы поврежденных клеток в супернатант культуры. После инкубации опсонизированных клеток-мишеней с эффекторными клетками тестируемые планшеты центрифугировали при 2000 об./мин в течение 5 мин. Приблизительно 75 мкл супернатанта клеточной культуры осторожно извлекали, избегая осажденных клеток и обломков. Данный супернатант добавляли прямо в планшет для микротитрования и к нему добавляли 75 мкл реактива для определения ЛДГ кат. № 1644793). Затем планшет инкубировали в течение приблизительно 15-30 мин и считывали поглощение при 490 нм с использованием Μο^η1ηγ Эеу|сек Утах Кшейс Мюгор1а1е Кеайег.

νί. Анализ данных

Все тесты по скринингу АОСС проводили в двух повторениях. Каждый тестируемый планшет содержал контроль для определения спонтанного лизиса клеток-мишеней, спонтанного лизиса эффекторных клеток плюс лизиса клеток-мишеней в отсутствие 1дС и общего лизиса клеток-мишеней. Общий лизис клеток мишеней получали добавлением 1% Тритон Х-100 к клеткам-мишеням. Контроли дикого типа включали в каждый тестируемый планшет и сигнал тестируемого АОСС усредняли. Фоновое значение, полученное для контролей спонтанного лизиса, вычитали из каждого образца. Фоновое значение, полученное для разведенного Ι§Ο, вычитали для каждого образца. Данные переводили из значений поглощения в процент специфического лизиса на базе контролей спонтанного и общего лизиса. Процент специфического лизиса рассчитывали на основе следующего уравнения: процент специфического лизиса=(экспериментальное А490 - фоновое А490)/(максимальное А490 - фоновое А490) х 100, где фоновое А490 представляет собой сумму значений А490, полученных для эффекторных клеток и клеток-мишеней в отсутствие 1дС и фонового значения 1дС вследствие загрязнения ЛДГ, присутствующей в сырых супернатантах 1дС. Процент активности варианта Рс нормализовали относительно средних значений контроля дикого типа. Процент нормализованной активности для двух тестируемых планшетов усредняли и для каждого образца рассчитывали стандартное отклонение между индивидуальными тестируемыми планшетами.

νίί. Результаты

Относительная специфическая активность АОСС показана в табл. 9 (одиночные замены) и 10 (комбинированные замены) ниже. Значения СЭС, приведенные в табл. 9, получены, как описано в примере 2 данного описания, и значения связывающего анализа РсКи, приведенные в табл. 9, получены, как описано в примере 3 данного описания. Кроме того, результаты суммируются в табл. 1 и 2 выше. Те комбинированные замены, которые дают более высокое значение АОСС, чем любая одиночная замена одна, представляют собой: 247Р, 339Ό; 247Ι, 339Ό; 247Ь, 339Ό; 247Ь, 339Т; и 247Ι, 3390. Те комбинированные замены, которые дают значение АОСС более чем на 80% ниже, чем АОСС дикого типа, даже если по отдельности они дают значения выше, чем АОСС дикого типа, представляют собой 247А, 339Ό; 247Υ, 339Н; 247Ι, 339Ι; 247Т, 339Ι; 247Ь, 339Ν; 247А, 3390; и 247А, 339К. Те комбинированные замены, которые дают значение АОСС более чем на 10% ниже, чем АОСС дикого типа, даже если по отдельности они дают значения выше, чем АОСС дикого типа, представляют собой 247Ι, 339Ι; 247Т, 339Ι; и 247Ь, 339Ν.

- 80 012464

Таблица 9

ИТ* Положение и АЭСС %СТ РсВп %СУ с ОС %СУ п= варианты* рН6, О

100

Дикий тип

ь	235А	87	23,2	102	11,9	67	7,9	2
ь	2 35Е	80	17,4	87	16,2	48	35,8	2
т	235С	93	30,3	85	21, 2	58	46, 0	2
ъ	2350	86	1,8	81	14,4	98	25,1	2
ь	235К	45	10, 5	93	34,1	110	13, 8	2
ь	2355	92	2,0	85	40, 0	0	262,9	2
5	236Г	0	942,1	88	7,9	0	283,3	2
6	236В	0	228,7	101	20,6	14	110,1	4
3	23 6Υ	8	72,7	76	10, 0	168	0,3	2
6	237Е	0	89,2	93	35, 0	36	28,8	4
6	237К	0	113,3	78	12, 8	12	136,0	4
6	237Ν	0	107,5	91	16, 3	22	31, 5	4
С	237В	0	81,3	56	60, 6	28	10,5	4
Р	238А	О	205,8	90	9,6	29	49, 5	4
Р	238Е	0	20,6	7 6	6,7	24	101,0	4
Р	238С	0	92, 8	66	6, 9	23	120,5	4
Р	23ΘΗ	0	48,9	72	11,4	11	206, 3	4
Р	2381	0	180,4	94	6, 4	18	54,1	4
Р	238Ь	0	37,4	115	13, 6	34	50, 1	4
Р	238ν	46	11,8	102	8, 3	67	19,2	4
Р	238И	0	66,6	87	5,4	23	103,4	4
Р	238Υ	0	34,0	74	15,8	16	288,8	4
Р	2441.	77	23,4	124	9, 6	34	6, 0	2
Р	24 5В	62	15, 0	188	7,2	42	5, 3	2

Р	247А	122	16,2
Р	247ϋ	95	23, 4
Р	247Е	95	10,3
Р	247?	144	18,8
Р	2476	82	16,1
Р	247Н	145	11,2
Р	2471	140	22,9
Р	2471,	144	10,1
Р	247М	127	21,0
Р	247Ν	91	37,2
Р	2470	103	8,5
Р	247К	58	15,5
Р	2475	106	38, 6
Р	247Т	129	11,2
Р	247ν	120	13,5
Р	247И	102	6,5
Р	247Υ	143	8,4
к	248А	100	5,4
к	248Г	107	18,0
к	248Р	103	9,1
к	2480	101	0, 5
к	248И	102	9,4
ϋ	249Е	110	6,7
0	2491	73	1,4
ϋ	249М	101	9,6
ϋ	249Ν	94	15, 9
0	249Р	56	4,0
ϋ	249Υ	110	9,8
τ	250К	38	27,1
τ	250М	78	11,0
τ	250К	84	0,7
ь	251Г	125	6,0
ъ	251Н	59	11,6
ь	2511	84	9,8
ь	251Н	95	2,9

97	0, 3	116	0,9	2
54	2,8	131	1,1	2
52	3,7	118	0, 0	2
6	1258,9	71	34,1	6
75	4,2	137	0,9	2
35	252,4	79	7,5	6
79	30, 7	22	198,3	6
57	33,7	0	722,7	16
18	1599,0	114	7,2	6
41	38,7	109	4,0	2
26	294,3	137	3,7	4
72	1,2	127	4,9	2
81	15,0	130	2,6	2
75	27,5	37	34,8	10
Ца	па	па	па	2
0	1314,2	122	0,5	2
7	па	88	7,1	6
15	179,9	102	2,4	2
0	559,4	202	4,0	2
34	99,4	226	1,3	2
38	89, 3	174	17,9	2
30	54,5	166	8,3	2
7 8	22,4	258	16, 1	4
15	179, 9	214	3,2	2
50	4,5	163	1,2	2
112	14,0	255	10, 9	4
138	21,0	119	0,2	2
41	28,3	170	6,6	2
96	30,1	199	13, 5	6
165	7,4	47	6, 6	4
62	34,0	288	13,9	4
64	47,6	160	16, 6	10
46	5, 6	167	22,7	2
7	333,3	190	18,8	2
0	па	161	17, 3	2

Μ	252Υ	61	5,8	964	27,9	62	46,1	4
I	253Ά	103	6, 1	0	12, 0	81	23,9	4
5	254А	99	20,1	7	733,0	139	11,2	4
3	254Ό	101	14,2	7	113,9	74	31,2	2
3	254Е	102	3, 8	6	107,9	72	35,2	2
5	254 Г	121	11,2	0	1087,4	206	14,4	6
3	2546	100	14,7	Ί	86,8	102	6, 1	2
3	254Н	108	20,0	0	74,3	85	22,0	4
3	2541	99	2,5	25	64,3	80	11,5	4
5	254К	109	14,8	9	77,2	137	6,1	2
5	254Ь	89	9,8	74	12, 6	227	12,1	6
3	254М	89	11,9	0	212,1	248	13,4	6
3	254Ν	90	13, 3	8	5,6	76	34, 6	2
3	254Р	78	17,7	3	141,4	75	25,2	2
3	2540	84	12, 6	9	121,2	74	25,2	2
3	254В	99	1,3	14	128,2	152	4,8	2
3	254Т	54	51,9	32	34,7	75	12,1	2
3	254ν	68	40,5	31	40,5	84	4,4	2
5	254И	98	6, 0	0	116,1	188	7,7	6
5	254Υ	117	9,4	0	129,1	211	15, 7	6
К	255К	96	3, 5	41	65, 9	276	9,3	4
К	255Ν	84	17,7	27	162,7	81	18,1	2
Т	256А	115	16, 5	160	3,0	190	19, 6	2
Т	256ϋ	97	5,3	544	10, 6	86	23,2	6
т	256Е	91	12,9	339	8,4	104	7,2	6
т	256Е	119	3,3	5	435,0	128	26, 6	2
т	2566	95	20, 0	162	8,0	221	24,5	2
т	256Н	103	6,3	26	6,1	91	11,9	2
т	2561	93	11, 5	72	3,7	157	16,2	4
т	256К	100	6, 7	31	20, 6	92	20,2	2
т	2 56Ь	93	3, 9	78	60,5	267	22,7	4
т	256М	122	17,4	35	78,9	200	14,8	10
т	2 5 6Ν	102	7,2	229	6,4	86	23,2	2
т	256Р	109	11,8	190	6, 1	260	11,8	8
т	2560	100	17,2	64	14,2	152	11,3	4

- 83 012464

т	256Ρ	94	8,8	33	60,0	71	47,1	2
т	2563	103	5,3	169	3,1	101	15, 9	2
т	256ν	82	11,1	114	30, 5	109	11,0	2
т	256И	96	8,5	14	84,5	170	14,4	4
т	256Υ	97	7,2	68	18, 6	127	18,0	2
Р	257Α	86	11,5	319	15, 0	34	53,7	4
Р	2571	54	16,4	1022	14,5	46	22, 4	6
Р	257Μ	26	11,0	835	19, 1	48	48,4	4
Р	257Ν	27	13,1	867	15,7	62	31,4	4
Р	2573	28	28,8	184	6,8	46	30, 1	4
Р	257ν	18	97,9	447	41,5	27	143,5	2
Е	258Ρ	115	7,0	361	20, 5	110	9, 6	4
т	2605	93	5,6	124	7,4	171	17,1	2
V	2621,	61	2, 9	525	15,1	30	48,0	2
V	2645	10	39,8	78	20, 0	50	36,7	2
ϋ	2 65Η	8	118,9	79	36,1	81	0, 5	2
ϋ	265Κ	10	146, 2	107	34, 3	84	4 6,4	2
ϋ	2653	9	106,3	66	28, 9	103	13,3	2
ϋ	265Υ	3	7,6	33	88,8	62	21,5	2
3	2676	29	8,6	86	0,9	60	18,1	4
3	267Η	0	48,4	86	16, 8	47	41,1	4
3	2671	0	78,0	83	11,8	50	37,8	4
3	267Κ	0	73,3	102	14,2	26	47,1	4
Η	2680	110	7,8	68	32, 4	122	10,7	6
Η	268Ε	110	8,3	126	17,8	100	8, 4	8
Η	268Κ	98	17,6	86	10,4	24	112,7	4
Ε	269Ν	23	74,0	92	17,0	30	69,4	4
Ε	2690	47	3,6	98	3,5	22	82,8	4
ϋ	270Α	41	35,5	87	6,0	36	66,5	4
Ρ	270С	0	102,2	108	16, 5	37	21,8	4
ϋ	270Κ	15	465,5	122	8,4	0	462,9	4
ϋ	270Μ	49	19,2	81	5,2	25	606,9	4
0	27 ΟΝ	28	1185,2	94	8,2	34	103,7	4
Ρ	271Τ	26	53, 9	96	20, 4	32	89, 1	4
Ε	272Η	73	13, 6	157	23,0	53	34,8	2

Е	272 К	70	8,9	320	20,4	118	28,7	4
Е	2721.	78	21,1	129	3,9	71	3,1	2
Е	272Ν	90	7,5	110	33,0	71	34,6	2
Е	272К	50	2,1	351	3,3	102	1,2	2
V	279А	114	14,6	214	5,0	106	21, 2	2
V	279ϋ	87	12,1	367	0,3	98	8,5	2
V	279Г	81	4,8	ИЗ	14,3	106	10,0	2
V	279С	98	2,4	256	11, 6	109	18,0	2
V	279Н	79	28,1	173	29,6	127	22,7	6
V	2791	101	1,6	83	1, з	100	21, 0	2
V	279К	91	1,5	79	26,1	106	0,7	2
V	279Ъ	96	3,0	78	13,9	100	5, 7	2
V	279М	107	8,3	122	3,5	91	10, 3	2
V	279Ν	102	32,0	204	19,5	85	50,2	6
V	2790	85	28,3	181	8,0	139	8,1	6
V	279В	105	4,8	130	10,7	98	8,7	2
V	2793	94	29,8	242	18,3	122	16,7	6
			Ί С. Е,	265	к а	110	12,8	10
V	27 9Т	9 5	X г		г
V	279И	68	24,8	162	22, 8	125	10,5	6
V	279Υ	82	26,8	139	8, 6	144	13,2	6
ϋ	280А	111	44,9	55	50,1	135	28,7	2
ϋ	280К	137	47, 6	120	27,2	192	33, 5	2
ϋ	2 8 ОТ	108	па	60	12, 6	122	8,7	4
Е	2 8 ЗА	107	2,1	126	0,2	96	17,9	2
Е	283Э	84	8,4	110	4,0	92	10, 3	2
Е	283Г	74	0,1	168	38, 6	127	20, 4	2
Е	283С	93	3,1	137	4,4	135	8,5	2
Е	283Н	87	6,1	206	6, 5	123	15, 9	2
Е	2831	106	1,9	143	5,6	126	12,3	2
Е	283К	109	5, 8	246	5,1	133	8, 0	2
Е	283Ь	92	3,1	126	1, з	120	0, 1	2
Е	233М	112	7,4	95	13, 8	120	2,4	2
Е	233Ν	102	3,8	119	7, 4	135	23, 4	6
Е	233Р	97	И, 9	136	3,9	118	11,8	4
Е	2830	95	5, 3	117	8,0	122	22, 9	2

Е	283В	102	0,3	282	8,1	144	16, 7	2
Е	2833	91	1,5	143	11,1	119	12,3	2
Е	2Θ3Τ	103	3,2	14 3	12, 4	108	11,0	2
Е	283Й	90	2,8	117	2,1	159	1,3	2
Е	283Υ	81	6,7	142	4,1	136	17,2	2
Н	285Ν	93	2,6	202	19,8	из	21,1	4
N	286Г	107	7,1	307	32,3	108	16,1	4
К	288Ν	110	8,7	162	13,2	118	19,1	4
К	288Р	45	1,1	119	3,0	116	15,7	2
К	292А	114	2,9	85	67,5	74	21, 1	4
В	292Е	35	21,4	65	48,5	92	32,1	2
В	292Е	73	16, 4	64	7,6	101	8,3	2
к	2920	94	2,5	60	35, 9	119	32, 8	2
в	2921	79	1,5	56	23,6	106	3,7	2
в	292Ь	96	3,9	68	40,0	123	7,2	2
Е	2935	68	7,4	101	23, 0	98	0,1	2
Е	293ν	73	12,5	127	18,0	107	24,0	2
В	301И	5	105, 4	119	18,1	49	31,1	4
5	304Е	24	32,9	101	8,7	122	11,3	2
Т	307А	87	4,4	233	14,5	115	6,5	4
Т	307Е	88	7,9	492	34, 6	81	2,4	4
т	307М	82	5, 3	302	23,7	150	б, 5	4
<2	ЗИА	106	2,4	139	7,0	89	28,3	2
Ω	31Ю	111	6,0	38	22,2	83	13, 6	2
0	311Е	102	1,7	4 6	17,7	78	0,7	2
<2	ЗИГ	89	б, 9	64	7,5	212	20,7	2
<2	3110	98	1,9	58	21,5	92	9,6	2
0.	3111	87	8,2	437	9, 6	236	11,3	8
<2	ЗИК	80	13, 4	165	5,5	170	9, 3	6
О	зиь	107	6,7	186	9,2	191	8,1	4
	зим	97	7,2	387	15,0	252	16,3	б
<2	311Ν	115	1,9	54	10,5	126	23, 3	2
2	311Р	99	8,0	89	300,5	172	67,9	4
2	зик	96	8,5	14	84,5	170	14,4	2
0	3113	86	8, 8	97	10,5	0	92,8	2

- 86 012464

<2	ЗИТ	111	10,2	131	14,0	168	23,4	2
0	31ΐν	108	1,7	558	19,5	240	23,3	4
0	зии	104	8,2	215	2,8	251	18,7	4
0	311Υ	107	3,0	94	0,3	211	2 5,0	2
0	312Р	97	1,4	546	16, 1	148	И, 6	2
ь	314Г	70	7,8	42	41,2	108	5, 5	2
ь	3141	83	13, 0	8 6	22,7	184	14,2	4
ь	314ν	65	14,0	21	128,8	179	10,9	4
ь	314Н	79	11,0	5	80,2	190	2,0	4
ь	314Υ	87	13,6	64	81, 4	238	3,2	4
N	315Г	83	12,8	51	38, 3	140	15,3	2
N	315К	108	3,5	88	10,2	148	8,2	2
N	315Ь	112	6,2	103	10, 5	145	5,5	2
N	315Р	62	10,2	14	289,1	231	9, 1	4
N	315В	96	24,4	71	38,3	135	0,4	2
6	316Г	54	26, 0	34	72,4	81	10, 0	2
С	316К	77	28,8	131	8,9	143	8, 6	2
К	317Р	54	21,5	14 5	1, 6	190	4, 7	4
к	317Т	99	10, 9	49	4,8	118	4, 0	2
Е	318Ν	123	7,2	216	7,5	120	7,0	4
Е	318Р	120	10,8	75	27,1	79	17,0	4
Е	318Т	109	5,7	304	56,8	118	10,5	4
Е	318ν	116	3,4	114	21,2	95	11,5	4
К	326Н	74	17, 9	93	5, 7	214	9,7	2
А	327Т	4	13,4	54	19,5	7	206, 2	2
ь	328ν	76	3,2	101	6, 3	56	13, 9	4
₽	329Υ	53	41,5	107	13,2	25	90, 3	4
А	ЗЗОК	134	9,3	108	51, 4	43	23,9	6
А	ЗЗОН	103	5,5	121	39, 4	31	36, 6	6
I	332А	100	6,1	96	27,6	130	5, 0	4
I	332ϋ	143	3,1	78	33,7	151	11,5	6
I	332Е	168	10,6	86	22,2	143	9,8	18
I	332Г	97	14,5	108	3,4	149	И, 0	4
I	3326	74	19, 8	94	1,4	121	11,5	2
I	332Н	82	4,3	129	1,1	150	11,5	2

- 87 012464

I	332К	12	114, 5	146	7,0	67	15,5	2
I	332Ь	94	0,9	127	2,6	154	5,1	2
I	332М	98	2,2	128	16, 1	178	6, 6	2
I	332Ν	95	15,3	92	16, 1	137	5,1	4
I	3320	99	8,4	98	7,9	148	3,5	6
I	332В	¹²	135,5	114	7,2	89	30,0	2
I	3325	96	4,9	263	64, 1	177	16, 5	2
I	332Т	112	7,5	100	5,3	124	4,5	4
I	332У	109	1,1	115	19,5	147	25, 1	2
I	332И	81	16,8	123	3,7	150	9,7	2
I	332Υ	93	13,1	93	12,3	152	5,3	2
А	339ϋ	131	10, 4	80	26, 4	183	20, 3	6
А	339Е	100	0,4	75	4,2	91	0,1	2
А	339Г	104	3, 3	120	24,6	217	8, 5	6
А	3396	107	3,7	67	6,5	118	0, 3	2
А	339Н	114	23,4	107	10,0	136	0,5	2
А	3391	136	14,6	80	30, 6	205	22,8	6
ъ	7701?	10 0	0/1 0	О О	о о о	О О 1	91 л	а
		±	ί--1 , ί.	ьг	и	1./ _	£. ? V	и
А	ззэъ	97	8,7	8 3	9,8	104	8,7	2
А	339М	115	6,8	111	7,2	57	8, 8	2
А	339Ν	110	6,3	146	3,5	240	17,5	4
А	3390	128	15,8	102	19, 8	138	11,0	6
А	339В	117	14,4	82	13, 4	128	2,1	2
А	3395	124	13,0	95	23,6	170	22,5	6
А	339Т	142	14,2	138	6,2	220	20,2	10
А	339И	92	13,4	156	11,4	243	10,6	6
А	339Υ	97	17,0	92	19,8	265	21,9	10
С	341β	62	6,9	52	37, 8	172	3,5	2
С	341Е	73	6,9	50	18, 1	161	3, 8	2
С	34 1Г	24	100, 8	52	41, 9	227	14,7	6
с	341Н	54	9,3	65	63, 7	245	16, 0	6
с	3411	44	15, 5	36	17,2	173	5,3	2
с	341К	77	3, 9	67	18, 9	161	2,6	2
б	341Ь	64	24,3	54	19,8	171	4,2	2
б	341М	55	39, 8	79	9,7	232	11, 1	6

- 88 012464

с	341Ν	83	9, 1	53	17,0	162	9,5	2
с	341Р	35	47,2	127	9,9	228	16,2	6
с	3410	59	18, 7	72	1,0	166	7, 7	2
с	341?	59	14, 9	78	7,4	168	7,5	2
6	3413	65	26, 6	55	12,2	224	9,2	6
6	341Т	0	866,0	68	54,0	176	10,0	2
с	341У	65	171,0	69	15,0	213	9,6	4
6	341И	14	25, 8	76	8,9	178	8,7	2
6	341Υ	26	24,5	54	5,2	184	14,3	2
Р	34 ЗА	75	18, б	110	37, 7	143	5,9	2
Р	34 3ϋ	69	11,5	102	7,9	157	18, 3	2
Р	343Е	65	34,9	345	6,4	157	17, 6	2
Р	343Е	74	20,6	89	13, 0	99	1058,4	4
Р	34 36	75	29,1	110	14, 9	244	11, 1	6
Р	343Н	78	33,8	191	1,2	159	3,1	2
Р	3431	92	26, 8	114	16,7	86	10, 5	2
Р	343К	74	37,7	232	2,6	185	9,1	2
Р	3431,	63	17,2	125	3,8	127	5,6	2
Р	343М	60	35, 1	83	13,7	134	18,7	4
Р	343Ν	67	8,9	105	19, 9	196	18,2	2
Р	3430	72	0,5	442	14,0	178	3,0	2
Р	34 ЗК	94	1, 3	198	10,4	179	9,9	4
Р	3435	84	7,5	101	14,3	207	11, 9	6
Р	34 3Т	69	4,2	126	16, 1	151	4,4	2
Р	34 ЗУ	70	1,9	77	5,3	107	12,0	2
Р	343И	48	22,3	56	6,4	194	17,9	2
Р	343Υ	63	9, 9	112	7,2	270	14,4	6
У	37 ЗА	56	3,7	33	15,0	121	28,7	2
Υ	373ϋ	74	17,7	74	32, 5	227	10,2	6
Υ	373Е	41	23, 6	106	20,8	151	19, 5	2
Υ	37 ЗЕ’	76	2,6	110	12,7	117	1,0	2
Υ	3736	39	21, 6	38	25,4	75	33,7	2
Υ	373Н	79	34,2	100	13, 9	169	8,2	4
Υ	3731	65	9,0	73	14,0	154	6,4	2
Υ	37 ЗК	76	12,2	70	2, 9	246	6,9	6

- 89 012464

Υ	373Ь	76	21,4	66	17, 0	189	6,2	6
Υ	373Μ	78	1,2	53	25,8	115	3,2	2
Υ	37 3Ν	64	21,5	61	23,3	148	12,1	2
Υ	3730	63	11,0	55	24,7	158	17,7	2
Υ	373Κ	81	20,5	107	24,1	221	4,0	6
Υ	3735	52	3,7	74	1, 9	72	24,8	2
Υ	373Τ	70	3,0	82	16,6	151	5,7	2
Υ	373ν	73	2,1	69	14,3	115	1,1	2
Υ	373И	77	23,3	75	18,5	237	20,8	6
3	375Κ	69	10, 9	595	15, 9	166	1,1	2
ϋ	376Ά	111	18,2	155	26,7	190	5,2	2
ϋ	376Ε	85	12,3	82	29,5	98	13,5	2
ϋ	376Ρ	84	7,3	116	12, 6	119	8,6	2
ϋ	3766	73	3,1	135	3,9	164	0,6	2
ϋ	376Η	74	16,1	81	18,6	118	5,6	2
ϋ	3761	100	14,1	144	7,2	101	50,5	10
ϋ	3760	88	16,7	78	3, 0	142	3,2	2
ϋ	376Μ	86	21,6	129	1,4	91	15,1	2
ϋ	376Ν	93	14,5	94	24,2	173	14,9	4
υ	376Ρ	85	15,1	203	12,9	153	19,6	6
Ω	3760	88	5, 0	116	22,7	176	19,9	4
ϋ	376Κ	95	6, 0	103	12,3	166	4,6	2
ϋ	37 63	85	21,4	134	27, 3	209	25,3	2
ϋ	376Τ	102	20,0	160	11,2	224	10,1	6
ϋ	37 617	112	8,1	251	15,0	210	11,1	12
Э	376Η	53	22,0	1	1719,9	89	34,8	2
ϋ	376Υ	78	4,2	53	25,8	98	39, 9	2
I	3776	107	2,4	76	28,8	92	7,6	2
I	377Κ	117	10,0	167	27,7	90	11,3	4
I	377Ρ	99	11,3	98	32,4	245	6,5	4
Α	37 8 ϋ	98	6, 6	163	13, 9	19	91,9	6
Α	37 8Ν	101	7,1	180	3,0	90	30,7	2
V	379Ν	96	19,5	74	39, 0	204	5,5	4
V	3790	113	3,2	85	27,3	218	4,1	4
V	3793	80	18,4	86	13,4	137	1,4	2

- 90 012464

379Т

380А

380Ώ

380Ν

3803

ОТ

382А

382ϋ

382?

101

106

102

111

110

100

110

121

16, 6	109	14,9	237	2,2	4
3,2	152	28,8	139	4,2	2
2,1	73	44,2	78	0,7	2
7,7	142	19,0	139	7,3	2
8, 5	230	24,1	131	0,1	2
1,2	172	11,0	115	4,8	2
6,0	103	7,8	82	29, 6	2
0, 8	73	25,7	80	34,2	2
13,8	222	16, 6	67	28,2	6
17,9	135	2,8	84	20,4	2
6,4	131	6,2	219	5,4	6

15,6

382Н

Е

109

3821

Е

Е	382К	96	2,6	153	30,2
Е	382Ь	93	16, 5	126	11,1
Е	382М	89	14,6	135	8,6
Е	382Ν	99	1,1	137	5,2
Е	382Р	85	16, 8	122	22,0
Е	3820	105	12,2	162	12,0
Е	382К	104	8,4	165	2,7
Е	3823	85	2,9	151	10,0
Е	382Т	89	10,2	172	5,2
Е	382У	83	32,5	173	6,2
Е	382К	97	10,5	172	5,2

2 Υ

Е

156

126

140

109

167

385Е

385Р

7,7

20,3

4,5

14,6

19, 3

3, О

4,1

30,0

0,4

386К

423Ν

424Н

424М

424ν

426ϋ

4261,

427Ν

429А

429Г

1,9

105	11,5	188	14,5	78	з,з	4
108	5,5	98	18,8	0	1586,3	2
100	3,2	101	23,2	82	15, 8	2
96	9,5	115	4,8	266	1,6	4
107	8,5	158	2,1	48	27,5	2
116	29, 8	97	7,3	58	9,3	2
91	3,5	60	60,0	75	14,4	2
103	9,3	57	35, 4	115	10,5	4
105	24,3	65	10,0	318	12,7	4
91	35, 3	117	14,3	193	20,4	4
108	5,5	192	5,9	64	23,1	2
44	81,7	61	11,4	147	1,9	2
70	11,1	77	16,5	288	12,8	4

Η	4 2 9Μ	103	0,7	83	12,2	173	3,2	2
Ε	430Α	100	8,3	179	6, 6	204	7,1	2
Ε	430ϋ	96	8,2	44	25, 5	190	4,6	4
Ε	430Ε	111	13, 0	218	19, 4	203	8,1	2
Ε	430С	97	7,8	131	10,6	252	7,5	6
Ε	430Η	91	7,7	192	8,0	22Τ	4,2	6
Ε	4 301	87	19,3	308	6, 6	297	17,2	6
Ε	430Κ	66	9,5	131	12, 6	203	16, 0	4
Ε	4301,	98	33,3	242	8,7	263	10,6	6
Ε	4 30Μ	102	16,1	195	8,7	227	4,6	6
Ε	430Ν	82	24,6	171	13,0	162	2,2	2
Ε	430Ρ	103	13,1	86	16,7	254	23, 5	8
Ε	4300	79	8,3	320	12,8	97	4,9	8
Ε	430Κ	75	7,5	249	6,6	227	7,9	8
Ε	4303	88	30,1	183	3,4	221	18,5	2
Ε	430Τ	82	22,9	137	23,7	249	8,2	6
Ε	430ν	79	35, 6	281	7,0	276	17,5	6
		-, Г,	Ο ο	11	ач η	171	5, 4	2
Ε	430И	! 0	0 г ->		-, — г -
Ε	430Υ	77	44,5	126	12, 5	231	па	2
А	431Η	81	44,0	151	11, 5	236	па	2
Ά	431Κ	98	26, 6	176	4,4	113	25,0	2
А	431Ρ	62	12,0	29	13,8	210	8,0	2
Ь	432Β	58	23, 1	38	15, 6	175	13, 3	2
ь	4325	58	55,4	70	3,6	124	0,2	2
Ν	434Ε	па	па	1008	1,4	па	па	4
Ν	4340	105	17, 9	358	20,2	26	128,9	4
Ν	434Η	90	12, 9	855	20, 4	57	9,1	6
Ν	4341	81	9,3	6	725,4	73	8, 9	2
Ν	434И	108	6, 6	1335	18,8	138	1,7	2
Ν	434Υ	106	7,7	1615	38,8	291	15, 5	4
Υ	4361	119	18, 0	194	24,2	35	8,7	2
Υ	436Ь	112	27,2	172	8,1	90	16, 3	4
Υ	436Τ	90	35,0	115	7,2	48	20, 3	2
0	4386	93	32,1	98	14,4	68	26,2	2
0	438Κ	99	31,7	169	12,3	116	43, 0	2

0	4381.	94	32, 5	200	14, 7	190	5,5	4
0	438Т	96	37,4	126	9, 5	56	26, 8	2
0	438И	93	32, 5	164	8,2	126	1,7	2
к	439Е	103	28, 9	94	9,0	53	40,3	2
к	439Н	91	37, 3	99	0,9	77	17,8	2
к	4 39<2	90	38,2	74	0,9	64	26,5	2
3	440А	79	42,3	82	2,0	85	22,5	2
5	4400	Θ2	18,4	72	4,7	99	9,4	2
5	4 4 0Е	104	4,0	73	2,8	87	35, 3	2
3	440Г	111	16, 1	87	8,2	73	18,5	2
3	4400	106	1,9	101	8,1	83	8,5	2
3	4 4 ОН	108	2,1	110	2,1	96	18, 3	2
3	4401	121	1,9	96	6,2	86	2,6	2
5	4 4 0К	116	16,7	132	7,8	71	26,4	4
3	440Ъ	112	6, 4	126	2, 2	77	4,5	4
Ξ	440М	84	51, 0	80	8, 2	81	20,6	2
3	440Ν	78	34,3	82	25, 4	108	15,8	2
5	44 00	73	43, 1	81	33, 5	132	16,6	2
5	4 4 0В	91	11, 3	88	16,2	85	29,8	2
3	440Т	89	2,1	71	39, 0	115	17,4	2
3	440ν	85	11,3	98	18, 7	110	16, 4	2
3	4 4 ОН	114	17,6	85	13, 8	132	14,8	2
3	440Υ	109	6, 8	100	14,2	224	14,1	16
3	442К	80	51,9	138	4,5	100	11,1	2

*Например, Ь235А указывает на Ес, где лейцин, присутствующий в Ес как аминокислота номер 235 (в соответствии с нумерацией ЕС), заменен на остаток аланина, протестированная здесь: область Ес представляет собой область Ес 1дС1, антитело представляет собой антитело против СЭ20. Иа = данные не доступны или тест не проводился.

- 93 012464

Таблица 10. Комбинированные варианты - ЛЭСС

Вариант	Среднее значение АОСС как % от уровня дикого типа	ον %	п=
Дикий тип	100	2, 42	2
247А, 3390	71, 50	0, 50	2
247Г, 339β	134,95	2, 54	2
247Н, 339ϋ	118,45	8, 46	4
2471, 339ϋ	187,21	20,45	2
247Ь, 339ϋ	156,73	3, 30	2
247Τ, 339ϋ	126, 46	4,71	2
247Υ, 339ϋ	121,93	4,58	2

247Α, 339Η	125,35	0,60	2
247Γ, 339Η	101,54	4,53	2
247Η, 339Η	114,24	4,91	2
2471, 339Η	126,94	5,22	2
247Ъ, 339Η	120,92	2,44	2
247Τ, 339Η	97, 96	5, 71	2
247Υ, 339Η	74,75	2,43	2

247Α, 3391	96, 95	3, 05	2
247Γ, 3391	116,53	5,52	2
247Η, 3391	108,27	2, 97	2
2471, 3391	-4,07	-47,26	2
2471, 3391	109,76	5, 95	2
247Τ, 3391	5, 48	9, 51	2
247Υ, 3391	100,84	9, 58	2

247ή, 339Κ	86, 90	13, 51	2
247Γ, 339Κ	105,85	10, 11	2
247Η, 339Κ	97,59	7,67	2
2471, 339Κ	97,41	14,89	2
247Ъ, 339Κ	104,36	7,07	2 _

- 94 012464

247Т, 339К	83, 02	6,07	2
247Υ, 339К	95, 79	3, 69	2
332 Е	180,96	0,72	2

247А, 339Ν	83,60	9, 91	2
247Г, 339Ν	100,36	8,95	2
247Н, 339Ν	86, 70	7,62	2
2471, 339Ν	119,62	13,07	2

247Т, 339Ν	114,38	4,83	4
247Υ, 339Ν	113,18	1,50	2
332Е	187,19	9, 53	2

247А, 3390	69,94	8,45	2
247Г, 3390	130,42	2,35	2
247Н, 3390	138,96	1,32	2
2471, 3390	146,44	2,27	2
2471,, 3390	140,50	4,58	2
247Т, 3390	119,70	4,03	2
247Υ, 3390	109,40	2, 24	2

247А, 339Е	68,57	8,33	2
247Р, 339К	114,33	11,85	2
247Н, 339Е	105,46	9, 89	2
2471, 339В	124,96	16, 31	2
247Е, 339Е	119,77	12,03	2
247Т, 339В.	109,42	12, 17	2
247Υ, 339В	98,58	13,09	2
2471,, 339Т	148,48	7, 08	4

и! = дикий тип

С\ % = п = количество образцов, для которых проведены измерения и полученные значения усреднены

- 95 012464

Таблица 11. Комбинированные варианты с повышением ΑΟΕί.'

* Значения активности ΑΟΕί.' рассчитывали на основе кривых титрования.

Таблица 12. Комбинированные варианты

Мутация	АОСС	СУ %	РсВпб,0	εν %	СОС	ον %	η=
Дикий тип	100		100		100
247Н3390	118	8,5	Ν/ϋ	Ν/ϋ	Ν/β	Ν/ϋ	4
247Б251Е330К332Е	184	13, 3	50	5,9	43	1, 3	2
247Ь251Е3761	77	29, 7	61	8,7	124	11,3	2
247Б332Е	168	7,3	78	4,9	65	6,2	6
247Ь332Е3761	137	8,1	74	8,0	76	4,3	4
247Τ339Ν	114	4,8	Ν/ϋ	Ν/ϋ	Ν/β	Ν/β	4
251Е332Е	147	12,4	72 ¹ 2,2	196	2, 6	6
251Γ332Ε376Ι	136	15, 9	68 5,0	160	10,9	4
251Ρ376Ι	114	8,1	66	2,9	102	9,4 _	4

- 96 012464

256Ρ311Ι	107	0,2	268	1,2	357	10, 0	2
256Ρ314Υ332Ε440Υ	146	3,1	86	19, 5	190	4,5	2
256Ρ314Υ440Υ	112	22,6	79	3,0	226	9, 4	2
256Р332Е	174	16,3	121	8,2	189	3, 9	4
256Ρ332Ε440Υ	184	25,4	117	6, 5	230	10, 0	2
256Р4302	109	2,6	150	5,3	354	3, 3	4
256Р434Н	105	1,2	342	3,1	299	2, 9	2
256Ρ440Υ	169	19,7	122	0,7	247	26, 6	2
25713111	52	7,7	409	3,9	61	6, 7	2
257Ι311Ι434Η	48	12,2	553	4,9	75	8,8	6
25714300	26	8,1	304	0, 6	55	12,9	4
257Ι434Η	67	7,0	472	6, 3	61	14,0	2
266Ω332Ε	137	12,4	92	13, 7	128	4,1	4
268Е332Е	178	5, 3	88	2,0	160	4,7	4
272Κ279Σ	56	0,2	156	1,2	72	5, 1	2
279Α288Ν	107	3,9	Ν/β	Ν/β	Ν/β	Ν/β	4
279Ά288Ν311Τ318ν	110	9, 0	Ν/β	Ν/β	Ν/β	Ν/β	4
279Α288Ν318Ν	110	5,4	Ν/β	Ν/β	Ν/β	Ν/β	4
279Α288Ν318Τ	116	5, 1	Ν/β	Ν/β	Ν/β	Ν/β	4
279Α288Ν318ν	118	8,8	Ν/β	Ν/ϋ	Ν/β	Ν/β	4
279Α311Τ318Τ	110	7,9	Ν/β	Ν/β	Ν/β	Ν/β	4
288Ν311Τ318Τ	115	9,9	Ν/β	Ν/β	Ν/β	Ν/β	4
311Τ318Τ	107	5,3	Ν/β	Ν/β	Ν/β	Ν/β	4
314Υ332Ε440Υ	156	5,4	82	0,9	155	0, 0	2
314Υ440Υ	125	12,7	78	8,5	108	2,6	2
330Κ332β	179	2,9	88	8,3	43	0,3	2
330Κ332Ε	202	5,6	94	0, 0	42	1,0	2
330Κ332β	152	6, 3	88	6, 3	44	1,5	2
330Κ332Ε	161	4,3	94	2,1	59	4,0	4
332Ε376Ι	132	8, 6	102	7,6	193	5,2	6
332Ε376ν	139	1,9	132	3, 5	261	8, 6	6
332Ε440Υ	203	13,0	94	5,7	159	5, 9	4
343Κ345ϋ	121	16,0	143	1,6	291	3,3	2
376ν4300	92	1,5	212	4,2	256	12,2	4
3767430Κ	84	2,7	188	9,1	191	1,0	2
376У434Н	97	3, 3	382	3,3	95	6,1	4

- 97 012464

Таблица13. Комбинированные варианты

Мутация	ГсНпб,0	ον %	η=
Дикий тип	100
258Р272К	382, 8	8,2	2
258О283К	411, 1	3,7	2
2530285?	445, 0	1,7	2
253О307Е	237,1	4,8	2
25803111	522, 0	7,0	2
258Ω376ν	415, 1	4,3	2
27282838	439, 3	21, 7	2
2728286?	338, 4	8,9	2.
27283111	396, 1	14,4	ο ί.
272Β376ν	368, 7	ε, ι	2
279О307Е	522, 4	8,8	2
283К307Е	400,2	9,1	2
28383111	531, 3	6,1	2
2838376ν	474,8	1,1	2
286Ε307Ε	431,2	3,8	2
286Ε311Ι	412,3	0, 0	2
286Γ376ν	348,9	1,5	2
307Ε376ν	480, 1	4,3	2
311Ι376Υ	413, 5	39,1	2

Пример 2. Характеристика активности вариантов СЭС

Данный пример описывает, как определяли активность различных вариантов области Рс.

Данный тест проводили с использованием комплемента человека (0шйе1 ^гр., кат. № ЛI 13) на клетках Катοк 15 (КА. №1) (АТСС кат. № СКЬ-1596). Клетки Катοк культивировали в среде Οί^ο КРМП640, содержащей 10% ЭБС при 37°С и 5% СО₂. За день до проведения теста клетки засевали в количестве 1х10⁶ клеток в колбу Т175. На следующий день клетки ресуспендировали в количестве 3,57х10⁵клеток/мл в среде КРМП640 без фенолового красного, содержащей 1% ЭБС. Клетки распределяли по 70 мкл на лунку на плоскодонном планшете Сοкίа^ 3917. Для кривой титрования вариант области Ι§Ο готовили с 3-кратным серийным разведением в среде КРМП640. Для теста скрининга библиотеки по одной точке временно экспрессированный вариант Ι§Ο в супернатанте культуры нормализовали до 1 мкг/мл ложной средой. Тридцать микролитров варианта ΙβΟ (т.е. конечная концентрация 200 нг/мл) и 50 мкл комплемента человека (Ошйе1 С-Огр., кат №А113) 1:5 разбавляли средой КРМП640+1% ЭБС, добавляли к клеткам-мишеням и тщательно перемешивали осторожным пипетированием. Планшеты инкубировали при 37°С в присутствии 5% СО₂ в течение 1,5 ч. После добавления 15 мкл/лунку аламара голубого (8егоίес, кат. №ВИР012В) инкубацию продолжали в течение ночи. Затем сигнал флуоресценции измеряли с помощью мультиметочного устройства для считывания РегктЕ1тег' к ЕпУ1кюп 2100 с возбуждением при 560 нм и эмиссией при 590 нм.

ίί. Анализ данных

Все тесты по одной точке проводили в двойном повторении. Каждый тестируемый планшет содержал контроль для определения спонтанного лизиса клеток-мишеней комплементом человека в отсутствие ΙβΟ и максимального лизиса клеток-мишеней в присутствии 1% Тритона Х-100. Три контроля дикого типа включали в каждый тестируемый планшет и тестируемый сигнал АОСС усредняли. Фоновое значение, полученное для контроля спонтанного лизиса, вычитали из каждого образца. Данные переводили из значений сигналов флуоресценции в процент специфического лизиса на основе контролей спонтанного и максимального лизиса. Процент специфического лизиса рассчитывали на основе следующего уравнения: процент специфического лизиса=(экспериментальный сигнал флуоресценции - спонтанный сигнал)/(максимальный сигнал лизиса - спонтанный сигнал) х 100. Затем рассчитывали процент активности варианта Рс относительно средних значений трех контролей дикого типа. Процент активностей для дикого типа для двух паралелльных тестируемых планшетов усредняли и рассчитывали стандартное отклонение между индивидуальными тестируемыми планшетами.

- 98 012464

Пример 3. Характеристика связывания с ЕсЯп

Данный пример описывает тесты по связыванию рецептора Ес новорожденных (ЕсЯп) с 1дС, содержащим область варианта Ес.

96-луночный планшет ЕБ1БА с дном И-образной формы покрывали (ί.'ο5ΐ;·ΐΓ) 50 мкл/лунка 2 мкг/мл нейтравидином (йегсе Β^οΐесЬηο1ο§у, кат. № 31000) в 50 мМ карбонатного буфера (рН 9,3) при 4°С в течение ночи. Несвязанный нейтраавидин удаляли и планшет трижды промывали ЗФРТ (ЗФР, содержащий 0,1% Твина 20). Пятьдесят микролитров меченного биотином растворимого ЕсЯп, 2,5 мкг/мл в ЗФР, наносили на лунку и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем 75 мкл казеинового блокирующего буфера (йегсе Β^οΐесйηο1οду, кат. № 37528) добавляли к планшету на 1 ч. Затем планшет ЕЫ8Л промывали ЗФРТ и инкубировали с 50 мкл/лунка варианта 1дС. Для кривой титрования 1дС, подвергаемый тестированию, готовили путем 3-кратного серийного разведения в буфере для связывания ЕсЯп (100 мМ NаΡΟ₄, 0,05% Твина-20, необязательно при различных рН (от 6,0 до 7,4)). Для скрининга по одной точке, временно экспрессированный вариант 1дС в супернатанте культуры нормализовали до конечной концентрации 50 нг/мл и рН доводили с помощью буфера для связывания ЕсЯп до 6,0. На следующих стадиях буфер для связывания ЕсЯп при соответствующем рН использовали для промывания планшета и разбавления реактивов. Реакцию связывания проводили при комнатной температуре в течение 1 ч. После трех промываний, связанный 1дС определяли с помощью конъюгата НЯР с козьим (ЕаЬ')₂против ЕаЬ человека в течение 1 ч. Активность НЯР развивается в субстрате НЯР Пирса (ΤιιγΕο ТМВЕЫ8Л, кат. № 34022) в течение 5-30 мин. Реакцию останавливали добавлением 50 мкл 2М Н₂§0₄ и измеряли поглощение при 450 нм с помощью устройства для считывания микропланшетов УМАХ (ΜοΠαιΙηΓ Ое\зсе5).

Пример 4. Лечение человека вариантом Ес против СО20-Е332Е

Исследования ίη νίΐτο и на мышиных моделях опухолей (С1упе§ Я.А., е1 а1., №1 Меб. 6:443 (2000)) дают доказательство того, что АЭСС играет роль в противоопухолевых эффектах антител против СЭ20, таких как ритуксан. Больных людей можно лечить вариантом Ес антител против СЭ20-Е332Е или ритуксаном, по способу, сходному с раскрытым в работе Саг1гоп е1 а1., Β1οο6 99:754 (2002). Например, больных со стадией с II по 1У заболевания в соответствии с классификацией Анн-Арбор, которые имеют по меньшей мере один измеряемый патологический участок и низкую опухолевую нагрузку в соответствии с критериями СЕБЕ, можно лечить в целом четырьмя дозами приблизительно 375 мг/м² варианта Ес против СЭ20-Е332Е или ритуксана, которые вводят внутривенной инфузией (в дни 1, 8, 15 и 22). Первичная конечная точка эффективности представляет собой степень объективного ответа, т.е. долю больных, достигших или полной ремиссии (СЯ), неподтвержденной СЯ (Сги) или частичного ответа (РЯ) в соответствии с критериями, недавно предложенными международным экспертным комитетом. Клинический ответ может быть оценен на второй месяц (М2). У больных может быть также оценена прогрессия через 1 год (М 12).

Объективная степень ответа на М2 и М12 для больных, подвергаемых лечению ритуксаном или вариантом Ес против СЭ20, может сравниваться таким образом, что улучшенные значения активности АЭСС, обеспечиваемые вариантом Ес, могут быть оценены количественно. Этот же пример может быть повторен с другими вариантами против СЭ20 (смотри, например, табл. 1-10 данного описания).

Кроме того, увеличенная эффективность вариантов может позволять различные способы введения, меньшую частоту инъекций и/или введение меньших доз. Все публикации и патенты упомянуты в представленном выше описании. Различные модификации и варианты описанного способа и системы изобретения будут очевидны специалистам в данной области техники без выхода за рамки и сущность изобретения. Хотя изобретение было описано в связи с конкретными предпочтительными осуществлениями, изобретение, изложенное в пунктах формулы, не должно чрезмерно ограничиваться такими конкретными осуществлениями.

Действительно, различные модификации описанных способов осуществления изобретения, которые очевидны специалистам в области химии и молекулярной биологии или родственных областях техники, предназначены для охвата объемом следующей формулы изобретения.

- 99 012464

Список последовательностей <110> Применяемая молекулярная разработка (АМЕ) <120-- Вариант областей Ес <130>XI6877 <140=- и8 60/643,718 <141=- 2005-01-13 <150> иЗ 60/638,442 <151> 2004-12-23 <150>и8 60/609,101 <151> 2004-10-09 <150> из 60/604,339 <151> 2004-08-25 <150> из 60/602,953 <151> 2004-08-19 <150> СВ 60/598,855 <151> 2004-04-08 <160>36 <170> Патент версии 3.3 <2101 <211>218 <212=- БЕЛОК <213:· Ното ΒαρίεπΕ <400> 1

Рго 1

А1а

Рго

О1и

Ьеи 5

Ьеи

<31у

С1у

Рго

Зег 10

Уа1

РЬе

Ьеи

РЬе

Рго 15

Рго

Суз

Рго

Ьу®

Азр 20

ТЬг

Ьеи

Ме1

Не

Зег 25

Аг§

ТЬг

Рго

(Ли

Уа1 30

ТЬг

Суз

Уа1

Уа1 35

Азр

Уа1

Зет

Н15

О1и 40

Азр

Рго

С1и

Уа1

Ьуз 45

РЬе

Азп

Тф

Тут

Уа1 50

Азр

О1у

Уа!

(Ли

Уа1 55

Н1з

Азп

А1а

Ьув

ТЬг 60

Ьуз

Рго

Ага

(Ли

С1и 65

С1п

Туг

Азп

Зег

Пи70

Туг

Аге

Уа1

Уа!

Зег 75

Уа!

Ьеи

ТЬг

Уа1

Ьеи 80

ΗΪ5

СГп

Азр

Тф

Ьеи 85

Азп

О1у

Ьуз

(Ли

Туг 90

Ьуз

Су®

Ьуз

Уа!

Зег 95

Азп

Ьуз

А1а

Ьеи

Рго

А1а

Рго

Не

О1и

Ьуз

ТЬг

По

Зег

Ьуз

А1а

Ьуз

(Лу

100 105 110

- 100 012464

61η

Рго

АГ£ 115

О1и

Рго

61п

Уа1

Туг 120

ТЪг

Ьеи

Рго

Зег 125

Аг§

61и

Ме1

Пи- 130

Ьуз

Азп

(}1п

Уа1

Зег 135

Ьеи

ТЪг

Суз

Ьеи

Уа! 140

Ьуз

61у

РЬе

Туг

Рго 145

Зет-

Азр

Не

А1а

Уа1 150

61«

Тгр

61и

Зег

Азп 155

О1у

61п

Рго

61и

Азп 160

Азп

Тут

Ьуз

ТЬг

Пи165

Рго

Уа1

Ьеи

Азр 170

Зег

Азр

61у

Зег

РЬе 175

РЬе

Ьеи

Туг

Зег

Ьуз 180

Ьеи

ТЬг

Уа1

Азр

Ьуз 185

Зег

Ага

Тгр

61п

61п 190

61у

Азп

Уа1

РЬе

Зег 195

Суз

Зег

Уа1

Ме1

Нгз 200

61и

А1а

Ьеи

Из

Азп 205

Н15

Туг

ТЬг

6!п

Ьуз

Зег

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Рго

61у

Ьуз

210 215 <2Ю>2

<211> 217 <212> БЕЛОК

<213>

Ното зар^епз

<400>

2

Γν» _

Т%1. _

Т___

Рго

А1а

Рго

Уа1

А1а

61у

Рго

эег

Уа1

те

Ьеи

те

Рго

ьуз

1

5

10

15

Рго

Ьуз

Азр

ТЬг

Ьеи

Ме1

Пе

Зег

Ага

ТЬг

Рго

61и

Уа1

ТЬг

Суз

Уа1

20

25

30

Уа!

Уа1

Азр

Уа1

Зег

Нгз

61и

Азр

Рго

61и

Уа1

61п

РЬе

Азп

Тгр

Туг

35

40

45

Уа!

Азр

О1у

Уа1

61и

Уа1

Ни

Азп

А1а

Ьуз

ТЬг

Ьуз

Рго

Ага

61и

50

55

60

6!п

РЬе

Азп

Зег

ТЬг

РЬе

Ага

Уа1

Зег

Уа1

Ьеи

ТЬг

Уа1

Уа!

Ηί5

65

70

75

80

61п

Азр

Тгр

Ьеи

Азп

61у

Ьуз

61и

Туг

Ьуз

Суз

Ьуз

Уа!

Зег

Азп

Ьуз

85

90

95

61у

Ьеи

Рго

А1а

Рго

Пе

61и

Ьуз

Пи-

Пе

Зег

Ьуз

Пи-

Ьуз

61у

61п

100

ЮЗ

но

Рго

Аг§

61и

Рго

61п

Уа1

Туг

ТЬг

Ьеи

Рго

Зег

Ага

61и

О1и

Ме£

115

120

125

ТЬг

Ьук

Азп

61п

Уа1

Зег

Ьеи

ТЬг

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

61у

РЬе

Туг

Рго

130

135

140

Зег

Азр

Пе

А1а

Уа1

61и

Тгр

61и

Зег

Азп

61у

С1п

Рго

61и

Азп

- 101 012464

145

150

155

160

Туг

Ьуз

ТЬг

Рго 165

Рго

Ме1

Ьеи

Азр

Зег 170

Азр

О1у

Зег

РЬе

РЬе 175

Ьеи

Туг

Зег

Ьуз

Ьеи 180

ТЬг

Уа1

Азр

Ьуз

Зег 185

Аг§

Тгр

О1п

(Пп

О1у 190

Азп

Уа1

РЬе

Зег

Суз 195

Зег

Уа1

Из

СИи 200

А1а

Ьеи

Н15

Азп

Из 205

Туг

ТЬг

О1п

Ьуз

Зег

Ьеи

8ег

Ьеи

Зег

Рго

С1у

Ьуз

210 215 <210> 3

<211>218 <212>БЕЛОК

<213>

Ното заргепз

<400>

3

Рго 1

А1а

Рго

СИи

Ьеи 5

Ьеи

С1у

Рго

Зег 10

Уа!

РЬе

Ьеи

РЬе

Рго 15

Рго

Ьуз

Рго

Ьуз

Азр 20

ТЬг

Ьеи

Мег

Пе

Зег 25

АГ£

ТЬг

Рго

(Ли

Уа1 30

ТЬг

Суз

Уа1

Уа1 35

Азр

Уа1

Зег

ΗΪ8

(Ли 40

Азр

Рго

(Ни

Уа1

С1п 45

РЬе

Ьуз

Тгр

Туг

Уа1 50

Азр

О1у

Уа1

О1и

Уа1 55

Н15

Азп

А1а

Ьу®

Либо

Ьуз

Рго

Аге;

СИи

СИи 65

О1п

РЬе

Азп

Зег

ТЬг 70

РЬе

Агв

Уа1

Зег 75

Уа1

Ьеи

ТЬг

Уа1

Ьеи 80

Из

С1г>

Азр

Тгр

Ьеи 85

Азп

С1у

Ьуз

(Ни

Туг 90

Ьуз

Суз

Ьуз

Уа!

Зег 95

Азп

Ьуз

А1а

Ьеи

Рго 100

А1а

Рго

Не

(Ли

Ьуз 105

ТЬг

Ие

Зег

Ьуз

ТЬг 110

Ьуз

(Лу

О1п

Рго

Аг§ 115

О1и

Рго

(Лп

Уа1

Тут 120

ТЬг

Ьеи

Рго

Зег 125

Ага

(Ни

(Ли

Ме1

ТЬг 130

Ьуз

Азп

СИп

Уа1

Зег 135

Ьеи

ТЬг

Суз

Ьеи

Уа! 140

Ьуз

С1у

РЬе

Туг

Рго 145

Зег

Азр

Не

А1а

Уа1 150

СИи

Тгр

(Ли

Зег

Зег 155

(Лу

О1п

Рго

(Ли

Азп 160

Азп

Тут

Азп

ТЬг

ТЬг 165

Рго

МеГ

Ьеи

Азр 170

Зег

Азр

С1у

Зег

РЬе 175

РЬе

Ьеи

Тут

Зег

Ьуз 180

Ьеи

ТЬг

Уа1

Азр

Ьуз 185

Зег

Аг§

Тгр

СИп

Сйп 190

О1у

Азп

- 102 012464

Не	РЬе	Бег	Сув	Бег	Уа1	МеГ	ΗΪ5	С1и	А1а Ьеи Ηίκ Акп Аг§ РЬе ТЬг
		195				200		205
(Лп	Ьув	Бег	Ьеи	Бег	Ьеи	Бег	Рго	О1у	Ьув
	210					215

<210>4 <211> 218 <212>БЕЛОК <213> Ното 8ар1еп8 <400> 4

Рго 1

А1а

Рго

61и

РЬе 5

Ьеи

О1у

С1у

Рго

Бег 10

Уа1

РЬе

Ьеи

РЬе

Рго 15

Рго

Ьу8

Рго

ЬуВ

Авр

ТЬг

Ьеи

Ме1

Не

Бег

Агд

ТЬг

Рго

(Ли

Уа1

ТЬг

Сув

20

25

30

Уа1

Авр

Уа1

Бег

(Лп

(Ли

Авр

Рго

СПи

Уа1

(Ип

РЬе

Азп

Тгр

35

40

45

Тут

Уа1

Аар

О1у

Уа1

(Ли

Уа1

Н1в

Авп

А1а

Ьув

ТЬг

Ьув

Рго

Аге

(Ли

50

55

60

(Ни

О!п

РЬе

Авп

Бег

ТЬг

Туг

Аг§

Уа1

Бег

Уа1

Ьеи

ТЬг

Уа1

Ьеи

65

70

75

80

А__

гг__

Г ™

л__

/21..

Т__ч

Τ'.—

т___

Т -

ЗЛчГ

Сч-

А

ί из

лар

*‘Р

лап

члу

Ь^'З

ули

ιγι

\^уз

ьАз

V ш

лет

лай

85

90

95

Ьув

О1у

Ьеи

Рго

Бет

Бег

Пе

(Ли

Ьув

ТЬг

Не

Бег

Ьув

А1а

Ьув

(Лу

100

105

110

(Лп

Рго

Агв

(Ли

Рго

(Лп

Уа1

Туг

ТЬг

Ьеи

Рго

Бег

(Лп

(Ли

(Ии

115

120

125

Ме1

ТЬг

Ьув

Азп

(Лп

Уа1

Бег

Ьеи

ТЬг

Сув

Ьеи

Уа1

Ьув

О1у

РЬе

Туг

130

135

140

Рго

Бег

Аар

Не

А1а

Уа1

С1и

Тгр

(Ли

Бег

Авп

О1у

С1п

Рго

(Ли

Авп

145

150

155

160

Акп

Туг

Ьув

ТЬг

Рго

Уа1

Ьеи

Авр

Бег

Авр

(Лу

Бег

РЬе

165

170

175

Ьеи

Туг

Бег

Аг^

Ьеи

ТЬг

Уа1

Авр

Ьув

Бег

Аг§

Тгр

(Лп

(Ли

61у

Авп

180

185

190

Уа1

РЬе

Бет

Сув

Бег

Уа1

Ме1

Н1з

61и

А1а

Ьеи

ΗΪ5

Авп

Ив

Туг

ТЬг

195

200

205

(Лп

Ьу5

Бег

Ьеи

Бег

Ьеи

Бег

Ьеи

<Э1у

Ьув

210 215 <210>5 <211> 215

- 103 012464 <212> БЕЛОК <213> Ми® зр.

<400> 5

Ли 1

Уа1

Рго

С1и

Уа! 5

Бег

Уа1

РЬе

Пе 10

РЬе

Рго

Ьуз

Рго 15

Ьуз

Анр

Уа1

Ьеи

ТЬг 20

Пе

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Рго 25

Ьуз

Уа1

Пи-

Суз

Уа! 30

Уа!

Азр

Не

Бег 35

Ьуз

Азр

Рго

(Ли 40

Уа1

О1в

РЬе

Бег

Тгр 45

РЬе

Уа1

Азр

Анр

Уа! 50

(Ли

Уа1

Из

ТЫ-

А!а 55

О1п

ТЬг

С1п

Рго

Агд 60

О!и

(Ли

С1п

РЬе

Азп 65

Бег

ТЬг

РЬе

Агд

Бет 70

Уа1

Бег

С1и

Ьеи

Рго 75

Пе

Ме1

Из

С1п

Азр 80

Суз

Ьеи

Азп

С1у

Ьуз 85

(Ли

РЬе

Ьуз

Суз

Агд 90

Уа!

Азп

Бег

А1а

А!а 95

РЬе

Рго

А1а

Рго

Пе 100

(Ли

Ьуз

ТЬг

Пе

Бег 105

Ьуз

ТЬг

Ьун

(Ну

Агд 110

Рго

Ьуз

А1а

Рго

О1п 115

Уа1

Туг

ТЬг

Пе

Рго 120

Рго

Ьуз

(Ли

<Яп 125

Ме1

А 1а

Ьун

Азр

Ьуз 130

Уа1

Бег

Ьеи

ТЬг

Суз 135

Мс1

Пе

ТЬг

Азр

РЬе 140

РЬе

Рго

(Ли

Анр

Не 145

ТЬг

Уа1

(Ли

Τιρ

СИп 150

Тгр

Азп

(Ну

С1п

Рго 155

А1а

(Ли

Азп

Туг

Ьуз 160

Азп

ТЬг

О1п

Рго

Пе 165

Ме1

Азр

ТЬг

Анр

О1у 170

Бег

Туг

РЬе

Уа1

Туг 175

Бег

Ьуз

Ьеи

Анп

Уа1 180

О1п

Ьуз

Бег

Азп

Тгр 185

О1и

А1а

О1у

Аза

ТЬг Ι9Ο

РЬе

ТЬг

Суз

Бег

Уа1 195

Ьеи

Ин

(Ли

О1у

Ьеи 200

Из

Азп

Ин

Из

ТЬг 205

(Ли

Ьуз

Бег

Ьеи

Бег

Н18

Бег

Рго

С1у

Ьуз

210 215 <210> 6 <211> 218 <212> БЕЛОК <21 >> Мин зр.

<400>6 '

Рго А1а Рго Азп Ьеи Ьеи О1у О1у Рго Бег Уа1 РЬе Пе РЬе Рго Рго

10 15

- 104 012464

Туз

Не

Туз

Азр 20

Уа!

Ьеи

Ме1

Пе

Зег 25

Ьеи

Зег

Рго

Пе

Уа! 30

ТЬг

Суз

Уа1

Акр

Уа1

Зег

С1и

Азр

Рго

Азр

Уа1

С1п

Пе

Зег

Тгр

35

40

45

РЬе

Уа1

Азп

Уа!

С!и

Уа!

ΗΪ3

ТЬг

А1а

О1п

Пи-

σΐη

ТЬг

Из

Аг§

50

55

бО

С1и

Азр

Туг

Азп

Зег

ТЬг

Ьеи

Аг§

Уа1

Уа!

Зег

А1а

Теи

Рго

Не

О1п

65

70

75

80

Из

σΐη

Азр

Тгр

Ме1

Зег

СИу

Ьуз

О!и

РЬе

Ьуз

Суз

Ьуз

Уа!

Азп

85

90

95

Туз

Азр

Теи

Рго

А1а

Рго

Пе

О1и

Аг§

Ии-

Пе

Зег

Туз

Рго

Туз

О1у

100

105

ПО

Зег

Уа1

Аг§

А1а

Рго

С1п

Уа1

Туг

Уа!

Теи

Рго

О1и

С1и

О1и

115

120

125

Мег

Пи-

Туз

Ьуз

СИп

Уа!

ТЬг

Теи

ТЬг

Суз

МеГ

Уа1

ТЬг

Азр

РЬе

Ме1

130

135

140

Рго

О1и

Азр

Не

Туг

Уа!

О1и

Тгр

ТЬг

Азп

С1у

Туз

ТЬг

(31 и

Теи

145

150

155

160

Азп

Туг

Ьуз

Азп

ТЬг

О1и

Рго

Уа1

Теи

Азр

Зег

Азр

О1у

Зег

Туг

РЬе

165

170

175

Ме1

Туг

Зег

Ьуз

Ьеи

АГ£

Уа!

61и

Ту5

Туз

Азп

Тгр

Уа1

61и

Агз

Азп

180

185

190

Зег

Туг

Зег

Суз

Зег

Уа1

Уа!

Н18

СИи

С1у

Теи

ΗΪ8

Азп

Из

ТЬг

195

200

205

ТЬг

Туз

Зег

РЬе

Зег

Аг§

ТЬг

Рго

СИу

Туз

210 215 ί210>7 ¢211> 218 '212' БЕЛОК ί213> Μ из »ρ.

ί4Ο0> 7

Рго 1

А1а

Рго

Азп

Теи 5

О1и

С.1у

С!у

Рта

Зег 10

Уа1

РЬе

Пе

РЬе

Рго 15

Рго

Азп

Пе

Туз

Авр 20

Уа!

Теи

Ме1

Пе

Зег 25

Ьеи

ТЬг

Рго

Туз

Уа1 30

ТЬг

Суз

Уа!

Уа1 35

Азр

Уа1

Зег

О1и

Азр 40

Азр

Рго

Азр

Уа!

С!п 45

Пе

Зег

Тгр

РЬе

Уа1 50

Азп

Уа1

(Ии

Уа1 55

Из

ТЬг

А1а

С1п

Пи- бО

(Пп

ТЬг

Из

Аг£

- 105 012464

О1и 65

Азр

Тут

Азп

Зег

ТЬг 70

Пе

Аг®

Уа!

Уа1

Зег 75

Из

Ьеи

Рго

Пе

С1п 80

Из

О1п

Азр

Тгр

Ме1 85

Зег

61у

Ьуз

О1и

РЬе 90

Ьуз

Суз

Ьуз

Уа1

Азп 95

Азп

Ьуз

Азр

Ьеи

Рго 100

Зег

Рго

Пе

О1и

Аг® 105

ТЬг

Пе

Зег

Ьуз

Рго 110

Ьуз

О1у

Ьеи

Уа1

Аг§ 115

А1а

Рго

О1п

Уа1

Туг 120

ТЬг

Ьеи

Рго

Рго 125

А1а

О1и

С1п

Ьеи

Зег 130

Аг®

Ьуз

Азр

Уа1

Зег 135

Ьеи

ТЬг

Суз

Ьеи

Уа1 140

Уа1

О1у

РЬе

Азп

Рго 145

О1у

Азр

Пе

Зег

Уа1 150

<31и

Тгр

ТЬг

Зег

Азп 155

О1у

Из

ТЬг

О1и

О1и 160

Азп

Туг

Ьуз

Азр

ТЬг 165

А1а

Рго

Уа1

Ьеи

Азр 170

Зег

Азр

61у

Зег

Тут 175

РЬе

Пе

Туг

Зег

Ьуз 180

Ьеи

Азп

Μβί

Ьуз

ТЬг 185

Зег

Ьуз

Тгр

О1и

Ьуз 190

Пи-

Азр

Зег

РЬе

Зег 195

Суз

Азп

Уа1

Аг§

Из 200

О1и

О1у

Ьеи

Ьуз

Азп 205

Туг

Тут

Ьеи

Ьуз

ТЬг

Пе

Зег

Аг®

Зег

Рго

С1у

Ьуз

<210> 8 <211> 218 <212>БЕЛОК <213> Миз зр.

<400>8

Рго 1

Рго

О1у

Азп

Пе 5

Ьеи

О1у

Рго

Зег 10

Уа!

РЬе

Пе

РЬе

Рго 15

Рго

Ьуз

Рго

Ьуз

Азр 20

А1а

Ьеи

Ме1

Пе

Зег 25

Ьеи

ТЬг

Рго

Ьуз

Уа! 30

ТЬг

Суз

Уа1

Уа1 35

Азр

Уа1

Зег

61и

Азр 40

Азр

Рго

Азр

Уа!

Из 45

Уа1

Зег

Тгр

РЬе

Уа1 50

Азр

Азп

Ьуз

О1и

Уа1 55

Из

ТЬг

А1а

Тф

ТЬг 60

О1п

Рго

Аг®

С1и

А1а 65

С1п

Туг

Азп

Зег

ПиТО

РЬе

Аг§

Уа1

Зег 75

А1а

Ьеи

Рго

Пе

О1п 80

1115

С1п

Азр

Тгр

Ме1 85

Аг®

С1у

Ьуз

С1и

РЬе 90

Ьуз

Суз

Ьуз

Уа1

Азп 95

Азп

Ьуз

А1а

Ьеи

Рго 100

А1а

Рго

Пе

С1и

АГ£ 105

ТЬг

Пе

Зег

Ьуз

Рго 110

Ьуз

С1у

- 106 012464

АГ£

А1а

О1п 115

Ί11Γ

Рта

О1п

Уа1

Туг 120

ТЬг

Пе

Рго

Рго 125

Аг$

С1и

О1п

Ме1

Бег 130

Ьуя

ЬуЯ

Уа1

Бег 135

Ьеи

Ткг

Суя

Ьеи

Уа1 140

ТЬг

Аяп

Рке

Бег 145

(Ли

А 1а

Пе

Бег

Уа! 150

(Ли

Тгр

О1и

Аг®

Аяп 155

С1у

(Ни

Ьеи

О1и

(Ли 160

Азр

Туг

Ьув

Аяп

Ткг 165

Рго

Пе

Ьеи

Аар 170

Бег

Аяр

О1у

Τΐιτ

Туг 175

РЬе

Ьеи

Туг

Бег

Ьуя 180

Ьеи

ТЬг

Уа!

Азр

Ткг 185

Аяр

Бег

Тгр

Ьеи

С1п 190

(Ну

(Ли

Не

РЬе

Ткг 195

Суя

Бег

Уа1

Н15 200

С1и

А1а

Ьеи

Н15

Аяп 205

Н15

ΗΪ5

Ткг

О1п

Ьуя

Азл

Ьеи

Бег

Аг§

Бег

Рго

С1у

Ьуя

210 215 <210>9 <211> 110 <212> БЕЛОК <213> Ното яаргепя <400> 9

А1а 1

Рго

С1и

Ьеи

Ьеи 5

(Ну

Рго

Бег

Уа1 10

РЬе

Ьеи

РЬе

Рго

Рго 15

Ьуя

Рго

Ьуя

Аяр

Ткг 20

Ьеи

Ме1

Пе

Бег

Аг§ 25

ТЬг

Рго

(Ни

Уа!

Ткг 30

Суя

Уа!

Уа1

Аяр 35

Уа1

Бег

Н15

(Ли

Аяр 40

Рго

С1и

Уа1

Ьуя

РЬе 45

Аяп

Тгр

Туг

Уа1

Аяр 50

С1у

Уа!

(Ли

Уа1

Ня 55

Аяп

А1а

Ьуя

Ткг

Ьуя 60

Рго

Агд

(Ии

(Ли

О1п 65

Туг

Аяп

Бег

Ткг

Туг 70

Аг§

Уа1

Уа!

Бег

Уа1 75

Ьеи

ТЬг

Уа1

Ьеи

Н1я 80

θΐη

Аяр

Тгр

Ьеи

Аяп 85

<Ну

Ьуя

О1и

Тут

Ьуя 90

Суя

Ьуя

Уа1

Бег

Аяп 95

Ьуя

А1а

Ьеи

Рго

А1а 100

Рго

Ле

(Ли

Ьуя

Ткг 105

Пе

Бег

Ьуя

А1а

Ьуя ПО

<2Ю> 10 <211> 107 <212> БЕЛОК <213> Ното зар1спа <400> 10

- 107 012464

61 у 1

О1В

Рго

Аг®

СЛи 5

Рго

О1п

Уа!

Туг

ТЬг 10

Беи

Рго

Зег

Агв 15

О1и

Μβΐ

ТЬг

Ьув 20

Ави

О1п

Уа1

Зег

Беи 25

ТЬг

Суз

Беи

Уа1

Буе 30

О1у

РЬе

Туг

Рго

Зег 35

Авр

Не

А1а

Уа1

СЛи 40

Тгр

СЛи

Зег

Авп

О1у 45

σΐη

Рго

СЛи

Авп

Авп 50

Туг

Бу$

ТЬг

Рго 55

Рго

Уа1

Беи

Авр

Зег 60

Авр

С1у

Зег

РЬе

РЬе 65

Беи

Туг

8ег

Буе

Беи 70

ТЬг

Уа1

Авр

Буз

Зег 75

Ап;

Тгр

С1п

С1л

О1у 80

Авп

Уа1

РЬе

Зег

Сув 85

Зег

Уа1

Ме£

ΗΪ8

СЛи 90

А1а

Беи

ΗΪ8

Авп

Ηίβ 95

Туг

ТЬг

О1п

Буз

Зег

Беи

Зег

Беи

Зег

Рго

О1у

Буе

100 105 <210> 11 <211>330 <212> БЕЛОК <213> Ното вар!епз <400> 11

А1а 1

Зег

ТЬг

Буе

С1у 5

Рго

Зег

Уа1

РЬе

Рго 10

Беи

А1а

Рго

Зег

Зег 15

Буе

Зег

ТЬг

Зег

О1у 20

СЛу

ТЬг

А1а

Беи 25

О1у

Сув

Беи

Уа1

Буе 30

Авр

Туг

РЬе

Рго

СЛи 35

Рго

Уа!

ТЬг

Уа1

Зег 40

Тф

Авп

Зег

СЛу

А1а 45

Беи

ТЬг

Бег

С1у

Уа1 50

Ηίβ

ТЬг

РЬе

Рго

А1а 55

Уа1

Беи

СЛп

Зег

Зег 60

СЛу

Беи

Туг

Зег

Беи 65

Зег

Уа1

ТЬг 70

Уа1

Рго

Зег

Зег 75

Беи

С1у

ТЬг

СЛп

ТЬг 80

Туг

Пе

Сув

Авп

Уа1 85

Авп

Ηίβ

Буе

Рго

Зег 90

Авп

ТЬг

Буе

Уа1

Авр 95

Буе

Агв

Уа1

СЛи

Рго 100

Буе

Зег

Сув

Авр

Буе 105

ТЬг

Ηίβ

ТЬг

Сув

Рго 110

Рго

Сув

Рго

А1а

Рго 115

СЛи

Беи

СЛу

СЛу 120

Рго

Зег

Уа1

РЬе

Беи 125

РЬе

Рго

Буе

Рго 130

Буе

Авр

ТЬг

Беи

Ме1 135

Пе

Зег

Аг§

ТЬг

Рго 140

СЛи

Уа1

ТЬг

Сув

Уа1 145

Уа1

Авр

Уа1

Зег 150

Ηίβ

СЛи

Авр

Рго

СЛи 155

Уа1

Буе

РЬе

Авп

Тгр 160

- 108 012464

Туг

Уа1

Авр

С1у

Уа! 165

(Ли

Уа!

Из

Авп

А!а 170

Ьуз

ТЬг

Ьуз

Рго

Агд 175

(Ли

О1и

О1п

Тут

Азп 180

Зег

ТЬг

Туг

Агц

Уа1 185

Уа!

Зег

Уа1

Ьеи

ТЬг 190

Уа1

Ьеи

ΗΪ8

О1п

Авр 195

Тгр

Ьеи

Авп

С1у

Ьуз 200

С1и

Туг

Суя

Ьуз 205

Уа!

Зег

Азп

Ьу8

А1а 210

Ьеи

Рго

А1а

Рго

Пе 215

61и

Ьув

ТЬг

Пе

Зег 220

Ьуз

А1а

Ьуз

С1у

О1п 225

Рго

Ага

О1и

Рго

О1п 230

Уа1

Туг

ТЬг

Ьеи

Рго 235

Рго

Зег

Аг§

(Ли

С1и 240

Мй

ТЬг

Ьуз

Авп

О1п 245

Уа1

Зег

Ьеи

ТЬг

Суз 250

Ьеи

Уа1

Ьуз

С1у

РЬе 255

Туг

Рго

Зег

Азр

Пе 260

А1а

Уа!

О1и

Тгр

О1и 265

Зег

Авп

С1у

О1п

Рго 270

О1и

Азп

Туг

Ьуз 275

ТЬг

Рго

Уа1 280

Ьеи

Азр

Зег

Азр

С1у 285

Зег

РЬе

Ьеи

Туг 290

Зег

Ьув

Ьеи

ТЬг

Уа! 295

Азр

Ьуз

Зег

АГ£

Тгр 300

С1п

С1в

С1у

Азп

Уа! 305

РЬе

Зег

Суз

Зег

Уа! 310

Ме(

Из

С1ц

А1а

Ьеи 315

Из

Авп

ΗΪ8

Туг

ТЬг 320

(г1п

Ьуз

Зег

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Рго

О1у

Ьуз

325 330 <210> 12 <211> 329 <212>БЕЛОК <213> Ното вар1епв <400> 12

А1а 1

Зег

ТЬг

Ьуз

С1у 5

Рго

Зег

Уа1

РЬе

Рго 10

Ьеи

А1а

Рго

Зег

Зег 15

Ьуз

Зег

ТЬг

Зег

С1у 20

С1у

ТЬг

А1а

Ьеи 25

С1у

Суз

Ьеи

Уа1

Ьув 30

Авр

Туг

РЬе

Рго

О1и 35

Рго

Уа!

ТЬг

Уа1

Зег 40

Тгр

Азп

Зег

О1у

А1а 45

Ьеи

ТЬг

Зег

СК

Уа1 50

Ив

ТЬг

РЬе

Рго

А1а 55

Уа1

Ьеи

О1п

Зег

Зег 60

О1у

Ьеи

Туг

Зег

Ьеи 65

Зег

Уа1

Уа!

ТЬг 70

Уа1

Рго

Зег

Зег 75

Ьеи

С1у

ТЬг

С1п

ТЬг 80

Тут·

Пе

Суз

Авп

Уа!

Авп

Ив

Ьуз

Рго

Зег

Авп

ТЬг

Ьуз

Уа!

Авр

Ьуз

- 109 012464

90 95

Бук

Уа1

С1и

Рго 100

Буе

Бег

Суз

Азр

Буз 105

ТЬг

Из

ТЬг

Суз

Рго 110

Рго

Суз

Рго

А1а

Рго

О1и

Беи

СИу

О1у

Рго

Бег

Уа1

РЬе

Беи

РЬе

Рго

115

120

125

Буз

Рго

Вуз

Акр

ТЬг

Беи

Мег

Не

Бег

Аг£

ТЬг

Рго

СЙи

Уа1

ТЬг

Суз

130

135

140

Уа1

Азр

Уа1

Бег

Из

(Ли

Азр

Рго

СИи

Уа1

Буз

РЬе

Азп

Тгр

145

150

155

160

Туг

Уа1

Акр

О1у

Уа1

О1и

Уа1

Из

Азп

А1а

Буз

ТЬг

Буз

Рго

АГ£

СИи

165

170

175

С1и

Туг

Азп

Бег

ТЬг

Туг

Аг»

Уа1

Бег

Уа1

Беи

ΤΊιγ

Уа1

Беи

180

185

190

Из

С1п

Акр

Тгр

Беи

Азп

О1у

Буз

С1и

Туг

Буз

Суз

Буз

Уа1

Бег

Азп

195

200

205

Вуз

А1а

Беи

Рго

А1а

Рго

Не

(Ли

Буз

•Пи-

Не

Бег

Буз

А1а

Буз

61у

210

215

220

С1п

Рго

Агд

СИи

Рго

О1п

Уа1

Туг

ТЬг

Беи

Рго

Бег

Аг§

Азр

С1и

225

230

235

240

Беи

ТЬг

Вуз

Азп

О1п

Уа1

Бег

Беи

ТЬг

Суз

Беи

Уа1

Буз

СЛу

РЬе

Туг

245

250

255

Рго

Бег

Азр

Не

А1а

Уа1

СИи

Тгр

СЛи

Бег

Азп

С1у

СЛп

Рго

(Ли

Азп

260

265

270

Азп

Тут

Буз

ТЬг

Рго

Уа1

Беи

Азр

Бег

Азр

СИу

Бег

РЬе

275

280

285

Беи

Тут

Бег

Буз

Беи

ТЬг

Уа1

Азр

Буз

Бег

Аг§

Тгр

С1п

Азп

Уа!

290

295

300

РЬе

Бег

Суз

Бег

Уа1

Мег

ΗΪ8

СИи

А1а

Беи

Н15

Азп

Из

Туг

ТЬг

С1п

305

310

315

320

Буз

Зег

Беи

Бег

Беи

Бег

Рго

61У

Буз

325 <210> 13 <211> 97 <212> БЕЛОК <213> Искусственная <220>

<223> Синтетический конструкт <400> 13

- 110 012464

О1и 1

Не

Уа1

Ьеи

ТЬг 5

С1п

Зег

Рго

О1у

ТЪг 10

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Рго 15

О1у

<31 и

Лтд

А1а

ТЬг 20

Ьеи

Зег

Суз

Аг£

А1а 25

Зег

Уа1

Рго 30

Туг

Пе

Н18

Тгр

Туг 35

О1п

С1п

Бук

Рго

С1у 40

С1и

А1а

Рго

АГ£

Ьеи 45

Ьеи

Пе

Туг

А1а

ТЬг 50

Зег

А1а

Ьеи

А1а

Зег 55

О1у

Пе

Рго

Авр

Аг§ 60

РЬе

Зег

С1у

Зег

О1у 65

Зег

О1у

ТЬг

Азр

РЬе 70

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Пе

Зег 75

Аг£

Ьеи

Сг1и

Рго

С1и 80

Авр

РЬе

А1а

Уа1

Туг

Су®

О1п

С1п

Тгр

Ьеи

Зег

А®п

Рго

ТЬг

«5 90 95

РЬе <210> 14 <211> 111 <212>БЕЛОК <213> Искусственная

<220> <223> Синтетический конструкт

<400:>

14

С1и 1

Уа1

О1п

Ьеи

Уа1 5

О1п

Зег

<31 у

А1а

О1и 10

Уа1

Ьуз

Рго

О1у 15

(Ли

Зег

Ьеи

Ьуз

Пе 20

Зег

Су®

Ьув

С1у

Зег 25

С1у

Аг§

ТЬг

РЬе

ТЬг 30

Зег

Туг

Азп

Мс1

Ηί® 35

Тгр

Уа1

Аг§

О1п

Ме( 40

Рго

О1у

Ьуз

<31у

Ьеи 45

О1и

Тгр

Мег

О1у

А1а 50

Пе

Туг

Рго

Ьеи

ТЬг 55

О1у

Азр

ТЬг

Зег

Туг 60

Азв

О1п

Ьуз

Зег

Ьуз 65

Ьеи

О1п

Уа1

Пи-

Пе 70

Зег

А1а

Азр

Ьуз

Зег 75

Пе

Зег

ТЬг

А1а

Туг 80

Ьеи

С1п

Тгр

Зег

Зет 85

Ьеи

Ьуз

А1а

Зег

Азр 90

ТЬг

А1а

Ме1

Туг

Туг 95

Суз

А1а

Аг§

Зег

ТЬг 100

Туг

Уа1

(Пу

О1у

Авр 105

Тгр

(31 η

РЬе

Азр

Уа! 110

Тгр

<210> 15 <211> 97 <212> БЕЛОК <213> Искусственная <220>

- 111 012464 <223> Синтетический конструкт <400> 15

61п 1

Пе

Уа1

Ьеи

Зег 5

О1п

Зет

Рго

А1а

Пе 10

Ьеи

Зег

А1а

Зег

Рго 15

О1у

О1и

Ьуз

Уа1

Пи- 20

Ме!

ТЬг

Суз

Аг§

А1а 25

Зег

Уа1

Зег 30

Туг

Пе

Из

Тгр

РЬе 35

О!п

О1п

Ьуз

Рго

О1у 40

Зег

Рго

Ьуз

Рго 45

Пр

Пе

Туг

А1а

ТЪг 50

Зег

Азп

Ьеи

А1а

Зег 55

О1у

Уа1

Рго

Уа1

Ага 60

РЬе

Зег

О1у

Зег

О1у 65

8ег

С1у

ТЪг

Зег

Туг 70

Зег

Ьеи

П1г

Пе

Зег 75

Аг§

Уа1

О1и

А1а

О1и 80

Азр

А1а

ТЪг

Туг

Суз

О1п

Тгр

ТЪг

Зег

Азп

Рго

ТЬг

90 95

РЬе <210> 16 <211> 111 <212> БЕЛОК <213> Искусственная

<220> <223> Синтетический конструкт

<400 16

О1п 1

Уа1

С1п

Ьеи

61л 5

61п

Рго

О1у

А1а

О1и 10

Ьеи

Уа1

Ьуз

А1а

О1у 15

А1а

Зег

Уа1

Ьуз

Ме! 20

Зег

Суз

Ьуз

А1а

Зег 25

С1у

Туг

Пн

РЬе

Пи 30

Зег

Тут

Азп

Ме!

Н1з 35

Тгр

Уа1

Ьуз

О1п

Пи 40

Рго

О1у

Аг®

О1у

Ьеи 45

Сг1и

Тгр

Де

О1у

А1а 50

Пе

Туг

Рго

С1у

Азп 55

О1у

Азр

Пи

Зег

Туг 60

Азп

С1п

Ьуз

РЬе

Ьуз 65

О1у

Ьуз

А1а

Пи

Ьеи 70

Пи

А1а

Азр

Ьуз

Зег 75

Зег

ТЬг

А1а

Туг 80

Ме!

С1п

Ьеи

Зег

Зег 85

Ьеи

Пп

Зег

61и

Азр 90

Зег

А1а

Уа1

Тут

Туг 95

Суз

А1а

Аг§

Зег

Пи- 100

Туг

С1у

Азр 105

Пр

Туг

РЬе

Азп

Уа! ПО

Тгр

<210> 17 <211> 10

- 112 012464 <212>БЕЛОК <213''- Искусственная <220>

<223?· Синтетический конструкт <400?· 17

Аг§ А1а Бег Бег Бег Уа1 Рго Туг Пе 1 5

Н18 <210?· 18 <211?· 7 <212?· БЕЛОК <213?* Искусственная <220>

<223> Синтетический конструкт <400?* 18

А1а ТЪг Бег А1а Беи А1а Бег

5 <210?* 19 <211>9 <212> БЕЛОК <213> Искусственная <220>

<223> Синтетический конструкт <400> 19

О1п О1п Тгр Ьеи Бег Азп Рго Рго ТЪг

5 <210 20 <211 > 10 <212> БЕЛОК <213> Искусственная <220>

<223> Синтетический конструкт <400> 20

О1у Аг§ ТЪг РЬе ТЪг Бег

5

Туг Авп Ме1 Ηί$ <210> 21 <211> 17 <212>БЕЛОК <213> Искусственная <220 <223> Синтетический конструкт

- 113 012464 <400 21

А1а Пе Тут Рго Ьеи ТЬг

5

Шу

Аяр

ПиЗег Тут Аяп С1п Ьув Зет Буз

15

Беи <210 22 <211> 12 <212>БЕЛОК <213> Искусственная <220 <223> Синтетический конструкт <400> 22

Зег ТЬг Туг Уа1 О1у О1у

5

Авр

Тгр

01п

РЬе Авр Уа!

<210> 23 <211> 10 <212> БЕЛОК <213> Искусственная <220>

<223> Синтетический конструкт <400 23

Ат§ А1а Зег Зет Зег Уа1

5

Зег

Туг

Пе

ΗΪ5 <210> 24 <211> 7 <212>БЕЛОК <213> Искусственная <220 <223 > Синтетический конструкт <400 24

А1а ТЬг Зет Азп Ьеи А1а

5

Зег <210 25 <211> 9 <212>БЕЛОК <213> Искусственная <220 <223> Синтетический конструкт <400 25

О1п О1п Тгр ТЬг Зет Аяп

Рго

ТЬг

- 114 012464 <210>26 <211=- 10 <212>БЕЛОК <213:· Искусственная <220>

<223> Синтетический конструкт <400= 26

О1у Туг ТЬг РЬе ТЬг Зег

5

Туг

Азп

Ме1

Н1з <210> 27 <211> 17 <212-БЕЛОК <213> Искусственная <220>

<223> Синтетический конструкт <400> 27

А1а Не Туг Рго С1у Азп

5

61у

Азр 'ПиЗег

Туг

Азп

С1п

Ьуз

РЬе

Ьуз

С1у <210> 28 <211> 12 <212:>БЕЛОК <213> Искусственная <220>

<223> Синтетический конструкт <400> 28

Зег ТЬг Тут Туг О1у О1у 1 5

Азр

Тгр

Тут

РЬе

Азп

Уа1 <210> 29 <2! 1> 213 <212>БЕЛОК <213> Искусственная <220>

<223> Синтетический конструкт <400> 29

(Ии 1

Не

Уа1

Ьеи

ТЬг 5

С1п

Зег

Рго

С1у

ТЬг 10

Ьеи

Зег

Ьеи

Зет

Рго 15

О1у

О1и

Ага

А1а

ТЬг

Ьеи

Зег

Суз

Аге

А1а

Зег

Уа1

Рго

Туг

Пе

- 115 012464

25 30

Нз

Тгр

Туг 35

О1п

С1п

Ьуз

Рго

61у 40

С1п

А1а

Рго

Агд

Ьеи 45

Ьеи

Пе

Туг

А1а

ТЪг 50

Бег

А1а

Ьеи

А1а

Бег 55

(Пу

Пе

Рго

Азр

Агд 60

РЬе

Бег

О1у

Бег

(Ну 65

Бег

О1у

ТЬг

Азр

РЬе 70

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Пе

Бег 75

Агд

Ьеи

(Ни

Рго

С1и 80

Азр

РЬе

А1а

Уа1

Туг 85

Туг

Суз

б!п

61п

Тгр 90

Ьеи

Бег

Азп

Рго

Рго 95

ТЬг

РЬе

(Ну

О1п

О1У 100

ТЬг

Ьуз

Ьеи

(Ни

Пе 105

Ьуз

Агд

ТЬг

Уа1

А1а НО

А1а

Рго

Бет

Уа1

РЬе 115

Пе

РЬе

Рго

Бег 120

Азр

(Ни

О!п

Ьеи

Ьуз 125

Бег

(Пу

ТЬг

А1а

Бег 130

Уа1

Уа!

Суз

Ьеи

Ьеи 135

Азп

РЬе

Туг

Рго 140

Агд

С!и

А1а

Ьуз

Уа1 145

61п

Тгр

Ьуз

Уа1

Азр 150

Азп

А1а

Ьеи

С1п

Бег 155

(Ну

Азп

Бег

О1п

(Ни 160

Бег

Уа!

ТЬг

(Ни

61п 165

Азр

Бег

Ьуз

Азр

Бег 170

ТЬг

Туг

Бег

Ьеи

Бег 175

Бег

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Ьеи 180

Бег

Ьуз

А1а

Азр

Туг 185

(Ли

Ьуз

Из

Ьуз

Уа1 190

Туг

А1а

Суз

(Ии

Уа! 195

ТЬг

Из

С!1п

(Ну

Ьеи 200

Бег

Рго

Уа!

Пи- 205

Ьуз

Бег

РЬе

Азп Агд Οΐγ (Ни Суз 210 * <210> 30 <211> 642 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Синтетический конструкт <400 30

дааайд1д(	1дасдсад1с	Тссаддсасс	с(д1:сгйд1	скюадддда	аа§а&ссасс	60
с(с1сс1дса	дддссадсФ	аад1д1ассд	ЕасаСссасГ	ддХассадса	§ааасс(§@с	120
саддс1ссса	ддсГссЮа!	сГа(дссаса	1ссдсгс1дд	сйсТддса!	ссса£асд££	180
Нсад1ддса	ЩдддГсГдд	дасадасПс	аскХсасса	1садсадас1	ддадсс!даа	240
даПйдсад	1д1айас1д	1садсад1дд	сХдадТаасс	сасссасйГ	Хддссадддд	300
ассаадс1дд	адаКааасд	аас1д1ддс1	дсасса(с1д	1спса1сй	сссдссак!	360
§а!дадсад1	1дааа1с1дд	аас1дсс(с1	дйдЕдХдсс	1дс1даа1аа	сйсийссс	420
адададдсса	аад1асад(д	даадд1дда!	аасдссскс	ааЬсдддГаа	скссаддад	480
адППсасад	адсаддасад	сааддасадс	ассГасадсс	Юадсадсас	ссхдасдсгд	540

- 116 012464 адсааадсад ас1асдадаа асасааа§1с (асдссН’са адсгсдсссд Гсасааадад сйсааса§д §§а§ад1дй аа§(сассса 1са§§дсс1§ а§

600

642 <210 31 <211> 451 <212>БЕЛОК <213> Искусственная <220>

<223> Синтетический конструкт <400>31

СИи 1

Уа1

СИп

Ьеи

Уа1 5

61п

Зег

(Лу

А1а

(Ли 10

Уа!

Ьуз

Рго

СИу 15

(Ли

Зег

Ьеи

Ьуз

Пе 20

Зег

Суз

Ьуз

61у

Зег 25

С1у

Аг8

ТЬг

РЬе

ТЬг 30

Зег

Туг

Азп

Ме£

Н18 35

Тгр

Уа!

АГ£

СИп

Ме1 40

Рго

СИу

Ьуз

(Лу

Ьеи 45

61и

Ттр

Мег

(Лу

А1а 50

Не

Туг

Рго

Ьеи

ТЬг 55

СИу

Азр

ТЬг

Зег

Туг 60

Азп

СИп

Ьуз

Зег

Бук 65

Ьеи

С1п

Уа1

ТЬг

Пе 70

Зег

А1а

Азр

Ьуз

Зег 75

Пе

Зег

ТЬг

А1а

Туг 80

Ьеи

СИп

Тгр

Зег

Зег 85

Ьеи

Ьуз

А 1а

Зег

Азр 90

ТЬг

А1а

Ме1

Туг

Туг 95

Суз

А1а

Агз

Зег

ТЬг 100

Туг

Уа1

(Ну

С1у

Азр 105

Тгр

СНп

РЬе

Азр

Уа1 110

Тгр

СИу

Ьу8

(Лу

ТЬг 115

ТЬг

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег 120

Зег

А1а

Зег

ТЬг

Ьуз 125

С1у

Рго

Зег

Уа1

РЬе 130

Рго

Ьеи

А1а

Рго

Зег 135

Зег

Ьуз

Зег

ТЬг

Зег 140

СИу

ТЬг

А1а

А1а 145

Ьеи

О1у

Суз

Ьеи

Уа1 150

Ьуз

Азр

Туг

РЬе

Рго 155

О1и

Рго

Уа1

ТЬг

Уа1 160

Зег

Тгр

Азп

Зег

(Лу 165

А1а

Ьеи

ТЬг

Зег

(Лу 170

Уа1

Н18

ТЬг

РЬе

Рго 175

А1а

Уа1

Ьеи

О1п

Зег 180

Зег

С1у

Ьеи

Туг

Зег 185

Ьеи

Зег

Уа1

Уа1 190

ТЬг

Уа!

Рго

Зег

Зег 195

Зег

Ьеи

СИу

ТЬг

С,1п 200

ТЬг

Туг

Пе

Суз

Азп 205

Уа!

Азп

Йз

Ьу*

Рго 210

Зег

Азп

ТЬг

Ьув

Уа1 215

Азр

Ьук

Ьув

Уа1

(Ли 220

Рго

Ьуз

Зег

Суз

Азр

Ьуз

ТЬг

1415

ТЬг

Суз

Рго

Су5

Рго

А1а

Рго

(Ли

1>еи

Ьеи

СИу

225 230 235 240

- 117 012464

О1у

Рго

Бег

Уа1

РЬе 245

Беи

РЬе

Рго

Буз 250

Пе

Буз

Азр

ТЬг

Беи 255

Ме1

Не

Бег

Аг§

ТЬг 260

Рго

С1и

Уа!

ТЬг

Суз 265

Уа!

Азр

Уа! 270

Бег

Нгз

«и

Азр

Рго 275

О1и

Уа1

Буз

РЬе

Азп 280

Тгр

Туг

Уа!

Азр

С.!у 285

Уа1

6!и

Уа1

ΗΪ3

Азп 290

А1а

Буз

ТЬг

Буз

Рго 295

Агв

С1и

ОЬг

σΐη

Туг 300

Азп

Бег

ТЬг

Туг

Аг§ 305

Уа1

Бег

Уа1

Беи 310

ТЬг

Уа!

Беи

Н18

61п 315

Азр

Тгр

Беи

Азп

С1у 320

БуЗ

О1и

Туг

Буз

Суз 325

Буз

Уа1

Бег

Азп

Буз 330

А1а

Беи

Рго

А1а

Рго 335

Пе

О1и

Буз

Пи-

Пе 340

Бег

Буз

С1п

Буз

6!у 345

СИп

Рго

Аг§

СПи

Рго 350

О1п

Уа1

Туг

ТЪг

Беи 355

Рго

Бег

Лг£

Азр 360

СПи

Беи

Пи-

Буз

Азп 365

О1п

Уа1

Бег

Беи

ТЪг 370

Суз

Беи

Уа1

Буз

61у 375

РЬе

Туг

Рго

Бег

Азр 380

Пе

А1а

Уа1

С1и

Тгр 385 ,

О1и

Бег

Азп

О1у

σΐη 390

Рго

О1и

Азп

Туг 395

Буз

ТЬг

Рго

Рго 400

Уа1

Беи

Азр

Бег

Азр 405

О1у

Бег

РЬе

Беи 410

туг

Бег

Буз

Беи

ТЬг 415

Уа1

Азр

Суз

Бег

Аг§ 420

Тгр

О1п

О1и

О1у

Азп 425

Уа1

РЬе

Бег

Суз

Бег 430

Уа1

Ме1

НгЗ

О1и

А!а

Беи

Из

Азп

Из

Туг

ТЬг

<Дп

Буз

Бег

Беи

Бег

Беи

Бег

435 440 445

Рго О1у Буз

450 <210> 32 <211>1356 <212> ДНК <213> Искусственная <220> Синтетический конструкт <400> 32

§а®£всавс	Т£®18са§1с	188авса§ав	§(§ааааа§с	сс§ё§§ав(с	1сГ§аа§а1с	60
1сс1§1аа§в	срйеассо	1асаШасс	а^ЙасааГа	1§сас1в§в1	2с<!СсаваГ8	120
сссг^вааав	£сссзеае,(з	§а1В8ё8ёс1	айШссс!	1§асввв1§а	гасиссгас	180
аакадаагГ.	с§ааас(сса	8§1сасса1с	Гса§сс£:аса	а§Тссагсаз	сасс§сс1ас	240
сГОсаг'Кц'а	ВсадссСдаа	8£сс1с£вас	асс§сса(£1	а!1ас1ц(§с	§а§а1свас1	300

- 118 012464 (асдГ^дсд Гсадсйсса

Гсдгаааасг ГсацдасСсГ ассГасакГ сссаааГсй £§ассйса£ сс1ц£1£§1са 1§ё1ас81§£ аасадсас§1 аа£§а£Гаса Гссааасада £аёс1®асса а£с§<:с81§§ дгдсгддасг Гддсадсадд асдса§аада дГдасГддса ссаа§§§ссс С£ЗССС1££ё садисдссс! асгсссгса§ §саас§1§аа д1дасаааас ССЙССГСЙ сафс^йёХ ас§£с§1£§а асс81§18е1 ад!§саад£1 ааееесаасс адаассаддГ ссдасддсгс ддаасдГсй дсСГСГсССГ дггсдагдгс агс^дГсас С1£СС1££ГС §асса§с£§с са§с81§д1§ Гсасаадссс (сасасаГдс ссссссаааа 881£8ас§1£ §£1£са1аа1 саасдГссГс сГссаасааа ссдздаасса садссГдасс сааГ§£еса§ сйсйссГс сГсаГдсГсс екйхеёе¹ ф^саазз сссс1§Есас аа«йас1ас1 дСдсасассТ асс§1§ссс! а£саасасса ссассдГдсс аГсааддаса а§ссас@аа§ дссаадасаа асс^ГссГдс дсссГсссад сад§1£1аса Г^ссГддГса сс£§а£ааса ГаГадсаадс §1£а1®са1® ааай>а

ддассасдд!	сассдГйсс	360
ссСссГссаа	даесассгсг.	420
1сссс§аасс		480
1ссс£§с1§1	сстасайсс	540
ссадсадсй	8§2сасссад	600
а£§1§£асаа	8аа§®йва§	660
садсассГда	ас1сс1§888	720
сссГсаГдаГ	сГсссддасс	780
асссг§а§£(	саа§йсаас	840
аёсс£с§§§а	«ЗадсадГас	900
асса£§ас1$	§сГ£аа1@>с	960
ссссса!сда	^аааассаГс	1020
ссйдссссс	а1сссдд§ас	1080
аад§сйсГа	гсссадсцас	1140
ас1асаа§ас	сасдссГссс	1200
Гсасс§1§да	саа§адсадд	1260
а§2С1с1§са	саассаоас	1320 1356

<210> 33 <211> 451 <212> БЕЛОК <213> Искусственная <220>

<223> Синтетический конструкт <400> 33

О1и 1

Уа1

О1п

Ьеи

Уа1 5

С1п

Бег

О1у

А1а

С1и 10

Уа1

Ьуз

Рго

О1у 15

С1и

Бег

Ьеи

Ьуз

Пе 20

Бег

Суз

Ьуз

С1у

Бег 25

Сг1у

Ап>

ТЬг

РЬе

ТЬг 30

Бег

Туг

Азп

МеС

Н1з 35

Тгр

Уа1

Аг§

С1п

Мег 40

Рго

<31у

Ьуз

О1у

Ьеи 45

С1и

Тгр

МеГ

О1у

А1а 50

Пе

Туг

Рго

Ьеи

ТЬг 55

С1у

Азр

ТЬг

Бег

Тут 60

Азп

О1п

Ьуз

Бег

Ьуз 65

Ьеи

О1п

Уа1

ТЪг

Пе 70

Бег

А1а

Азр

Ьуз

Бег 75

Пе

Бег

ТЬг

А1а

Туг 80

Ьеи

С1п

Тгр

Бег

Бег 85

Ьеи

Ьуз

А1а

Бег

Азр 90

ТЪг

А1а

Ме!

Тут

Тут 95

Суз

А1а

Агц

Бег

ТЬг 100

Туг

Уа1

О1у

Азр 105

Тгр

О1п

РЬе

Азр

Уа1 110

Тгр

О1у

Ьуз

О1у

ТЬг 115

ТЬг

Уа1

'Пи-

Уа1

Бег 120

Бег

А1а

Бег

ТЬг

Ьуз 125

О1у

Рго

Бег

Уа1

РЬе 130

Рго

Ьеи

А1а

Рто

Бег 135

Бег

Ьуз

Бег

ТЬг

Бег 140

О1у

Пи-

А1а

Ьеи

О1у

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

Азр

Туг

РЬе

Рго

Сг1и

Рго

Уа1

ТЬт

Уа1

- 119 012464

145 150 155 160

Зег

Тгр

Азп

Зег

О1у 165

А1а

Ьеи

ТЬг

Зег

61У 170

Уа!

Н15

ТЬг

РЬе

Рго 175

А!а

Уа1

Ьеи

СЛп

Зег 180

Зег

О1у

Ьеи

Туг

Зег 185

Ьеи

Зег

Уа1

Уа1 190

ТЬг

Уа!

Рго

Зег

Зег 195

Зег

Ьеи

(Лу

ТЬг

(Ли 200

ТЬг

Туг

Пе

Суз

Азп 205

Уа1

Азп

Н1з

Ьуз

Рго 210

Зег

Азп

ТЬг

Ьуз

Уа1 215

Азр

Ьуз

Уа1

(Ли 220

Рго

Ьуз

Бег

Суз

Азр 225

Ьуз

ТЬг

Из

ТЬг

Суз 230

Рго

Суз

Рго

А1а 235

Рго

(Ли

Ьеи

С1у 240

О1у

Рго

Зег

Уа1

РЬе 245

Ьеи

РЬе

Рго

Ьуз 250

Пе

Ьуз

Азр

ТЬг

Ьеи 255

Ме1

Пе

Зег

Аг®

ТЬг 260

Рго

(Ли

Уа!

ТЬг

Суз 265

Уа1

Уа!

Азр

Уа1 270

Бег

ΗΪ5

(Ли

Азр

Рго 275

(Ли

Уа!

Ьуз

РЬе

Азп 280

Тгр

Тут

Уа1

Азр

С1у 285

Уа!

С.1и

Уа1

Нк

Азп 290

А1а

Ьуз

ТЬг

Ьуз

Рго 295

Аг®

С1и

(Ли

(Лп

Туг 300

Азп

Бег

ТЬг

Туг

Аг® 305

Уа!

Уа1

Зег

Уа1

Ьеи 310

ТЬг

Уа1

Ьеи

Из

С1п 315

Азр

Тгр

Ьеи

Азп

(Лу 320

Ьуз

(Ли

Туг

Ьуз

Суз 325

Ьуз

Уа1

Зег

Азп

Ьуз 330

А1а

Ьеи

Рго

А1а

Рго 335

Пе

(Ли

Ьуз

ТЬг

Не 340

Зег

Ьуз

Азр

Ьуз

(Лу 345

(Лп

Рго

Аг§

С11!

Рго 350

(Лп

Уа1

Туг

ТЬг

Ьеи 355

Рго

Зег

Аг®

Азр 360

(Ли

Ьеи

ТЬг

Ьуз

Азп 365

61п

Уа!

Бег

Ьеи

ТЬг 370

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

(Лу 375

РЬе

Туг

Рго

Зег

Азр 380

Пе

А1а

Уа1

(Ли

Тгр 385

(Ли

Зег

Азп

О1у

(Лп 390

Рго

(Ли

Азп

Туг 395

Ьуз

ТЬг

Рго

Рго 400

Уа1

Ьеи

Азр

Зег

Азр 405

(Лу

Зег

РЬе

Ьеи 410

Туг

Бег

Ьуз

Ьеи

ТЬг 415

Уа!

Азр

Ьуз

Зег

Аг® 420

Тгр

(Лп

О1п

(Лу

Азп 425

Уа1

РЬе

Бег

Суз

Бег 430

Уа1

Ме1

Из

(Ли

А1а

Ьеи

Из

Азп

ΗΪ8

Туг

ТЬг

О1п

Ьуз

Бег

Ьеи

Бег

Ьеи

Бет

435 440 445

Рго <31у Ьуз

450 <210> 34

- 120 012464 <21Ι> 1356 <212> ДНК <213'· Искусственная <220>

<223> Синтетический конструкт <400:· 34

§а§£1дса£с	сддтдсади	1д§а£саеа£	§1§ааааа§с	сс222ад1с	ТсфаадаТс	60
1сс1р1аад§	§Нс1£8сс8	ТасаШасс	адпасаай	1£сас1£8§1	8с§сса£а18	120
сссдддааад	2ссГё§ад1ё	ёатддйддс!	ашатсссТ	тдасее^да	Тасйсстас	180
аа1са§аад1	сдааасТсса	ддТсассаТс	Тсадссдаса	адТссаТсад	сассдссис	240
с1§са£1£§а	§са§сс{§аа	£йсс1с£йас	ассдссаТц!	айас(£1§с	йадатсдаст	300
Тасд1вг8с§	§Т§ас1§£са	дПсда^гс	«ееаесааее	^ассас§£(	сасс§тстсс	360
1садсс1сса	ссаадцдссс	а1с§§ТсПс	ссссЦ>§сас	ссТссСссаа	йадсасстст	420
	С§^ССС1§ёё	С1§СС1§#С	ааддас1ас1	1сссс§аасс	ёё&Кё&ё	480
1сд1дцаао1	саддсдссс!	§асса§с§§с	£1§сасасст.	1сссе,дс1£1	сстасадгсс	540
1саддас1сТ	айсссТсац		ассдТдссс!	ссадсадсй	§2§сассса§	600
ассТасаТс!	§саас@1§аа	Тсасаа§ссс	а§саасасса	а£§1£§асаа	§ааедй§аё	660
сссаааГсЙ	§1§асаааас	(сасасаГдс	ссассдГдсс	садсассТда	ас1сс(§£££	720
а®ассц1сад	Тсйсскй	ссссссаааа	аГсааддаса	сссТсаЩд!	с1ссс£§асс	780
сс!даад1са	са1дсд1§д1	2£1£§ас§1§	а§ссас£аа§	ассс(£а££1	сааеДсаас	840
	асддсёХдеа	££и>са(аа1	дссаадасаа	азссдсддда	§(>а£са£1ас	900
ааса§сас§1	асс81§(£81	садсдГсск;	ассдГссСдс	асса§§ас!§	§с(§аа1д§с	960
аа££;адтаса	адгдсааддт	сГссаасааа	дсссТсссад	ссссса1с§а	даааассаТс	1020
тссааадаса	ааеаасаасс	ссдадаасса	садцЦДаса	ссссцссссс	аТсссдддас	1080
дадстдасса	адаассадд!	са§сс(§асс	1§сс1£§1са	аа§§сйс1а	1ссса§сдас	1140
аТсдссдСдд	ад^ёёаёад	сааГ£§£сае	сс§§а§ааса	астасаадас	сасдссТссс	1200
ёТ^сТаеасг	сс§ас8£с1с	спсйссТс	&Ла§саа§с	Тсасс£1£§а	саа^аясаёв	1260
теесадсадд	§ёаасд1си	сТсах§сТсс	§18аТ§сат§	аа£стс1§са	саассасТас	1320
асдса§аа§а	дсстс1ссст	2ТС1СС££§Т	ааа!§а			1356

<210> 35 <211> 451 <212> БЕЛОК <213> Искусственная

<220> <223> Синтетический конструкт

<400> 35

С1и 1

Уа1

С1п

Беи

Уа1 5

С1и

Бег

О1у

А1а

С1и 10

Уа1

Буз

Рго

С1у 15

(Ли

Бег

Беи

Бук

Пе 20

Бег

Суз

Буы

СНу

Бег 25

О1у

Аг§

ТЬг

РЬе

ТЬг 30

Бег

Туг

Аян

Мс1

ΗΪ3 35

Τιρ

Уа1

Агд

61п

Ме1 40

Рго

С1у

Буз

С1у

Беи 45

О1и

Тгр

Ме(

С1у

А1а 50

Пе

Тут

Рго

Беи

Пн- 55

О1у

Акр

ТЬг

Бег

Туг 60

Азп

(Ли

Буз

Бег

Буя 65

Беи

С1п

Уа1

ТЬг

Пе 70

Бег

А1а

Азр

Буз

Бег 75

Пе

Бег

ТЬг

А1а

Туг 80

- 121 012464

Ьеи

61л

Тгр

Бег

Бег 85

Ьеи

Ьуз

А)а

Бег

Аяр 90

Ткг

А1а

Ме1

Туг

Туг 95

Суз

А1а

Аг§

Бег

ТЬг 100

Туг

Уа1

О1у

С1у

Азр 105

Тгр

О1п

РЬе

Аяр

Уа1 110

Тгр

СНу

Ьуя

СНу

Ткг 115

Ткг

Уа1

ТЬг

Уа1

Бег 120

Бег

А1а

Бег

Пи-

Ьуя 125

С1у

Рго

Бег

Уа!

РЬе 130

Рго

Ьеи

А1а

Рго

Бег 135

Бег

Ьуз

Бег

ТЬг

Бег 140

СИу

СНу

Ткг

А1а

А1а 145

Ьеи

61у

Суя

Ьеи

Уа1 150

Ьуз

Азр

Туг

РЬе

Рго 155

СНи

Рго

Уа1

ТЬг

Уа1 160

Бег

Тгр

Азп

Бег

СНу 165

А 1а

Ьеи

ТЬг

Бег

СНу 170

Уа!

Н18

Ткг

Рке

Рго 175

А1а

Уа1

Ьеи

О1п

Бег 180

Бег

СНу

Ьеи

Туг

Бег 185

Ьеи

Бег

Уа1

Уа! 190

ТЬг

Уа1

Рго

Бег

Бег 195

Бег

Ьеи

СНу

ТЬг

СНп 200

ТЬг

Туг

Пе

Суз

Аяп 205

Уа!

Азп

Н15

Ьуя

Рго 210

Бег

Аяп

Ткг

Ьуз

Уа1 215

Азр

Ьуз

Уа1

(Ли 220

Рго

Ьуз

Бег

Суя

Азр 225

Ьуз

Ткг

ΗΪ5

Ткг

Суз 230

Рго

Суз

Рго

А1а 235

Рго

СНи

Ьеи

СНу 240

О1у

Рго

Бег

Уа1

РЬе 245

Ьеи

РЬе

Рго

Ьуз 250

Рго

Ьуз

Аяр

Ткг

Ьеи 255

Ме1

Пе

Бег

Лтд

Ткг 260

Рго

О1и

Уа!

ТЬг

Суз 265

Уа!

Уа1

Азр

Уа1 270

Бег

ΗΪ5

О1и

Азр

Рго 275

С1и

Уа1

Ьуз

РЬе

Азп 280

Тгр

Туг

Уа1

Азр

СИу 285

Уа1

С1и

Уа1

Н1Я

Аяп 290

А1а

Ьуз

ТЬг

Ьуз

Рго 295

Аг£

О1и

СНи

(Нп

Туг 300

Азп

Бег

ТЬг

Туг

Аг® 305

Уа1

Бег

Уа!

Ьеи 310

Ткг

Уа1

Ьеи

Н1я

СНп 315

Азр

Тгр

Ьеи

Аяп

СНу 320

Ьуя

СНи

Туг

Ьуз

Суз 325

Ьуз

Уа1

Бег

Аяп

Ьуз 330

А1а

Ьеи

Рго

А1а

Рго 335

Пе

О1и

Ьуз

Ткг

Не 340

Бег

Ьуз

А1а

Ьуз

СНу 345

О1п

Рго

Аг§

С1и

Рго 350

СНп

Уа1

Туг

ТЬг

Ьеи 355

Рго

Бег

Аг§

Аяр 360

С1и

Ьеи

ТЬг

Ьуз

Аяп 365

СНп

Уа!

Бег

Ьеи

ТЬг

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

СИу

РЬе

Тут

Рго

Бег

Азр

Пе

Азр

Уа1

С1и

370 375 380

- 122 012464

Тгр 385

<31и

Зег

Азп

61 у

С1п 390

Рго

О1и

Азп

Туг 395

Ьуз

ТЬг

Рго

Рго 400

Уа1

Ьеи

Азр

Зег

Азр 405

СИу

Зег

РЬе

Ьеи 410

Туг

Зег

Ьуз

Ьеи

ТЬг 415

Уа1

Азр

Ьуз

Зег

Агд 420

Тгр

С1п

01п

сну

Азп 425

Уа1

РЬе

Зег

Суз

Зег 430

Уа1

Ме1

Из

О1и

А1а

Ьеи

Н13

Азп

Из

Туг

ТЬг

С1п

Ьуз

Зег

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

435 440 445

Рго Сйу Ьуз

450 <210> 36 <211> 1356 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Синтетический конструкт <400 36

дадг-Язсадс	ГддГдсадГс	1ддадсадад	д1дааааадс	ссддддадЮ	1с1даада1с	60
ГсстуГаадд		!асаГВасс	адИасааГа	ЩсасГддд!	дсдссадаГд	120
сссдддааад	§сс1ддад1д	да(§ддддс1	а(йа1ссс1	1§асддд1да	гасИсс1ас	180
аагсапаадг	с§ааас1сса	§^£асса1с	Гсадссдаса	ад1сса1сад	сассасс!ас	240
С(дсад1дда	дсадссГдаа	ддсс1сддас	ассдссаГдг	аПас1д!дс	дадаГсдасС	300
1асд1дддсд	дЩасЦщса	дИсдаШЮ	(8Е§ёсаа§8	ддассасдд!	сассдюгсс	360
(садссгсса	ссаадддссс	а1сдд1сйс	сссйддсас	сс!сс1ссаа	дадсассГс!	420
§ддддсасад	СЙЙСССЩЙЙ	с1дсс1дд1с	ааддас!ас1	Гссссдаасс	281£асдд1д	480
СсдЩдаасГ	саддсдссс!	дассадсддс	дГдсасасс!	1сссддс1д(	ссГасадЬх	540
1саддас(е1	ас[ссс!сад	садсд!дд1д	асс§1дссс{	ссадсадсй	дддсасссад	600
асс(аса(£[	дсаасд(даа	(сасаадссс	адсаасасса	аддГддасаа	дааддйдад	660
сссаааШТ	§1§асаааас	1сасаса!дс	ссассдгдсс	садсассгда	асгсйдддд	720
ддассд(сад	(СЙССГСЙ	ссссссаааа	сссааддаса	ссс(са1да(	с1сссддасс	780
сс1да§д1са	саЩ.С£1ввХ	д§1д§асдГд	адссасдаад	ассс!дадд1	саадПсаас	840
1§д1ас§(дд	асд§сд{дда	8§1§са1аа1	дссаадасаа	адссасдада	ддадсадгас	900
аасадсасд!	ассдГд1дд1	садсд(сс1с	ассд!сс1дс	ассаддас1д	дс(даа1ддс	960
ааддад1аса	ад1§саа§£1	с1<хаасааа	дссйсссад	ссссса!сда	даааассаГс	1020
(ссааадсса	аадддсадсс	ссдадаасса	саддСд!аса	ссйдссссс	аЗсссдддас	1080
дадс\|дасса	адаассадд!	садсс(дасс	1дсс1дд1са	ааддсйсГа	Ссссадсдас	1140
а1сеасд(§д	адтдддадад	саахдддсад	ссддадааса	асхасаадас	сасдсйссс	1200
д1дс1ддас1	ссдасддсХс	сйсисс1с	ГаГадсаадс	ГсассдГдда	саададсадд	1260
	ддаасд(са	сйа1дс1сс	§1да!дса1д	аддсййдса	саассасХас	1320
асдсадаада	дсс1с!ссс1	кСс1сс§дд1	ааагда			1356

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims

1. Антитело против СИ20, содержащее:

(a) аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, состоящую из 8Еф ΙΌ N0:13;

(b) аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, состоящую из 8Еф ΙΌ N0:14; и (c) вариант исходной области Рс ΙβΟ1 человека, где вариант области Рс включает аминокислотные замены, выбранные из группы, состоящей из 247Ι/339Ο и 247Ι/339Ό.

2. Антитело против СИ20 по п.1, где вариант Рс представляет собой 247Ι/339φ.

3. Антитело против СИ20 по п.1, где вариант Рс представляет собой 247Ι/339Ό.

4. Антитело против СИ20 по п.2, включающее аминокислотную последовательность легкой цепи, состоящую из 8Е0 ΙΌ N0:29, и аминокислотную последовательность тяжелой цепи, состоящую из 8Еф ΙΌ N0:31.

5. Антитело против СИ20 по любому из пп.1-4, имеющее две легких цепи и две тяжелых цепи, где аминокислотная последовательность каждой легкой цепи представлена как 8Еф ΙΌ N0:29 и аминокислотная последовательность каждой тяжелой цепи представлена как 8Еф ΙΌ N0:31.

- 123 012464

6. Антитело против С'П20 по п.4, где легкая цепь кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, включающей 8ЕО Ш N0:30, и тяжелая цепь кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, включающей 8Е0 Ш N0:32.

7. Антитело против С'П20 по п.3, включающее последовательность аминокислот легкой цепи, состоящую из 8Е0 Ш N0:29, и последовательность аминокислот тяжелой цепи, состоящую из 8Е0 Ш N0:33.

8. Антитело против С'П20 по п.6, где легкая цепь кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, включающей 8Е0 Ш N0:30, и тяжелая цепь кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, включающей 8Е0 Ш N0:34.

9. Фармацевтическая композиция, включающая антитело против С'П20 по любому из пп.1-8.

10. Фармацевтическая композиция по п.9, дополнительно включающая фармацевтически приемлемый носитель.

11. Применение антитела против С'П20 по любому из пп.1-8 для получения лекарства для лечения лимфомы.