CN101001873A - Fc区变体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了多肽，特别是提供了治疗性抗体，所述多肽和治疗性抗体包含新型Fc区变体。本发明进一步提供了这样的Fc区变体，该变体赋予与其有效连接的多肽改变的效应子功能或改变的血清半寿期。

Description

Fc区变体
发明领域
本发明涉及包含一新型Fc区变体的多肽。具体地，本发明的新型Fc区变体包含至少一处在此描述的氨基酸替换，与不含所述氨基酸替换的免疫球蛋白亲本相比，所述氨基酸替换可使包含Fc区变体的免疫球蛋白的效应子功能或血清半寿期发生改变。此外，本发明提供了用于改变单克隆抗体的效应子功能或延长多肽的血清半寿期的方法，其中的多肽与本发明Fc区变体有效连接。在此公开了包含本发明Fc区变体的多肽、蛋白质特别是单克隆抗体的治疗性用途。
发明背景
目前已有至少17种单克隆抗体在美国获得批准并用于人类治疗。此外，正对几百种单克隆抗体进行临床试验，对几千种单克隆抗体进行临床前试验以用于治疗多种疾病或紊乱，包括如移植排斥、癌症、炎性疾病、败血症、肾炎、老年痴呆症、过敏症、糖尿病、自身免疫性疾病、关节炎、多发性硬化和传染病。未来几年，治疗性单克隆抗体将成为快速发展的领域。继疫苗之后，抗体(或免疫球蛋白“Ig”)成为第二大常用类型的进行临床试验的生物药剂(Stockwin，L.H.等，生物化学社会学报(Biochemical SocietyTransactions)，31：433-436，2003)。
遗传工程已显著促进了治疗性单克隆抗体领域的发展。抗体中蛋白质序列的适度变化通常会改变治疗性单克隆抗体的潜在功效。单克隆抗体可变区单一氨基酸的改变可能会影响到抗体与抗原表位结合的亲和性，并可能改变抗体的特性，如Kon速率或Koff速率。此类氨基酸改变可决定单克隆抗体能否成功成为治疗剂。同样，单克隆抗体Fc区中氨基酸序列的适度变化可能会显著改变抗体的效应子功能特性或与Fc区有效连接的蛋白质的半寿期。
抗体的Fc区(即抗体重链的羧基末端，横跨CH2、CH3区和部分铰链区(参见图1))的变化很小并参与影响抗体所起到的生理作用。由不同种类或亚类抗体的Fc区所引起的效应子功能会有所不同，且效应子功能包括(i)通过Fc区与细胞上的特异Fc受体(“FcR”)结合，并引发多种生物学反应，包括如吞噬和破坏抗体包被颗粒、清除免疫复合物、释放炎性介质、胎盘转运抗体以及调控免疫球蛋白的产生；(ii)补体依赖的细胞毒作用(“CDC”)，其中Fc区结合补体的C1q组份并由此启动经典补体活化通路而导致目标裂解；(iii)抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(“ADCC”)，其中某些人免疫系统细胞(如吞噬细胞和NK细胞)通过Fcγ受体与抗体Fc区结合(通过免疫细胞表面的结合抗体的特异受体)，并随后发出信号清除与抗体结合的实体，以及(iv)与肥大细胞、嗜碱性细胞和嗜酸性细胞结合。Fc区结合特定FcR(例如FcRn)的亲和性或Fc区介导的CDC或ADCC活性的高低，是决定治疗性蛋白质特别是单克隆抗体的功效和半寿期的重要因素。
对人IgG Fc区中氨基酸进行特定修饰是一个活跃的研究领域，该研究领域提供了有关治疗性蛋白质特别是单克隆抗体的结构-功能关系的信息(关于多肽与Fc区有效连接后其血清半寿期发生改变：参见如美国专利6,165,745和PCT公开号WO2004/035752，有关单克隆抗体包含修饰的Fc区后其效应子功能发生改变：参见美国专利6,737,056和PCT公开号WO2004/029207)。
治疗性蛋白质特别是单克隆抗体的研发，将得益于对Fc区进行合理设计的能力，所述合理设计是指对Fc区特定氨基酸进行修饰以赋予目标抗体所需的有益特性。Fc区同一特定氨基酸的修饰并非在所有单克隆抗体中均可预期到疗效的改进。结合一种靶抗原的治疗性单克隆抗体的特定效应子功能可得到提高而有助于提高抗体的疗效，而结合不同种靶抗原的另一治疗性单克隆抗体的另一效应子功能可能会提高，或甚至减低，而有助于提高其疗效。一治疗性单克隆抗体由于其结合特定Fc受体的亲和性较强而有助于其提高疗效，而另一抗体其疗效的提高可能是由于其结合Fc受体的亲和性较低并因此易于以较快速度从体内清除。此外，Fc区的特定氨基酸修饰或替换以及其产生的治疗性抗体功效的改进，将取决于与抗体结合的抗原靶位和/或需经抗体治疗的疾病或紊乱。
改变与抗体Fc区关联的特定效应子功能的方法和组合物，对提高已存在的治疗性抗体的性能以及产生具有所需特性的新型治疗性抗体是必需的。含Fc区变体的单克隆抗体可用于治疗多种疾病或紊乱，包括如炎性疾病、癌症、自体免疫性疾病、细胞信号转导紊乱和传染病。此外，可改变治疗性蛋白质半寿期的方法和组合物将有助于生产治疗性抗体以及其它治疗性蛋白质，所述治疗性蛋白质血清半寿期的变化为延长并因此允许减少施用剂量或缩短并因此可使其从体内以较快速度清除。
为提高治疗性蛋白质特别是单克隆抗体的功效，需要具有改进特性的Fc区变体。
发明概述
本发明提供了Fc区变体，即包含于此描述的氨基酸替换(如表1所示)的Fc区，该替换赋予包含该Fc区变体的多肽以有益的特性。
亲本Fc区中可进行氨基酸替换并生成本发明Fc区变体的部位包括Fc区的第279、341、343和373位，其中的残基编号即其位置数，与用于Kabat中的EU索引一致(参见此处的图2)。本发明提供的Fc区变体，在亲本Fc区第279、341、343或373位或其任意组合处含有氨基酸替换。亲本Fc区在除第279、341、343和373位之外可任选地含有非天然氨基酸残基。在人IgG中这些位置的天然氨基酸残基为缬氨酸(279)、甘氨酸(341)、脯氨酸(343)和酪氨酸(373)。
在本发明的优选的实施方案中，替换存在于亲本Fc区中的氨基酸残基为天然存在的氨基酸残基。除非另作说明，亲本Fc区既可为天然也可为非天然Fc区，优选地为人源或基本为人源的Fc区。亲本Fc区的氨基酸序列优选地如SEQ ID NO：1、2、3或4中所示。优选地，亲本Fc区在需替换部位具有天然氨基酸残基，对该残基进行替换以生成本发明的Fc区变体。此外，至始至终应当理解，Fc区变体为经修饰的亲本Fc区并含有至少一处于此描述的氨基酸替换。此外，应当理解亲本Fc区可为含有待替换的以形成Fc区变体的氨基酸残基的全长Fc或其部分。
本发明进一步提供了多肽，优选地提供了包含Fc区变体(或其功能片段)的单克隆抗体，所述Fc区变体与亲本Fc区相比在其第279、341、343或373位含有至少一处氨基酸替换。与存在于同一类型Fc区变体的天然Fc区的氨基酸相比，包含第279、341、343或373位中至少一处氨基酸替换的Fc区变体，可进一步在Fc区中包含至少一处额外的氨基酸替换。
在一个实施方案中，Fc区变体(即亲本Fc区的变体)中包含的至少1、2、3或多处氨基酸替换选自：235G、235R、236F、236R、236Y、237K、237N、237R、238E、238G、238H、238I、238L、238V、238W、238Y、244L、245R、247A、247D、247E、247F、247M、247N、247Q、247R、247S、247T、247W、247Y、248F、248P、248Q、248W、249L、249M、249N、249P、249Y、251H、251I、251W、254D、254E、254F、254G、254H、254I、254K、254L、254M、254N、254P、254Q、254R、254V、254W、254Y、255K、255N、256H、256I、256K、256L、256V、256W、256Y、257A、257I、257M、257N、257S、258D、260S、262L、264S、265K、265S、267H、267I、267K、268K、269N、269Q、271T、272H、272K、272L、272R、279A、279D、279F、279G、279H、279I、279K、279L、279M、279N、279Q、279R、279S、279T、279W、279Y、280T、283F、283G、283H、283I、283K、283L、283M、283P、283R、283T、283W、283Y、285N、286F、288N、288P、292E、292F、292G、292I、292L、293S、293V、301W、304E、307E、307M、312P、315F、315K、315L、315P、315R、316F、316K、317P、317T、318N、318P、318T、332F、332G、332L、332M、332S、332V、332W、339D、339E、339F、339G、339H、339I、339K、339L、339M、339N、339Q、339R、339S、339W、339Y、341D、341E、341F、341H、341I、341K、341L、341M、341N、341P、341Q、341R、341S、341T、341V、341W、341Y、343A、343D、343E、343F、343G、343H、343I、343K、343L、343M、343N、343Q、343R、343S、343T、343V、343W、343Y、373D、373E、373F、373G、373H、373I、373K、373L、373M、373N、373Q、373R、373S、373T、373V、373W、375R、376E、376F、376G、376H、376I、376L、376M、376N、376P、376Q、376R、376S、376T、376V、376W、376Y、377G、377K、377P、378N、379N、379Q、379S、379T、380D、380N、380S、380T、382D、382F、382H、382I、382K、382L、382M、382N、382P、382Q、382R、382S、382T、382V、382W、382Y、385E、385P、386K、423N、424H、424M、424V、426D、426L、427N、429A、429F、429M、430A、430D、430F、430G、430H、430I、430K、430L、430M、430N、430P、430Q、430R、430S、430T、430V、430W、430Y、431H、431K、431P、432R、432S、438G、438K、438L、438T、438W、439E、439H、439Q、440D、440E、440F、440G、440H、440I、440K、440L、440M、440Q、440T、440V或442K。
在一优选的实施方案中，Fc区变体中包含的至少1、2、3或多处氨基酸替换选自：235G、236F、236R、236Y、237K、237N、237R、238E、238G、238H、238I、238L、238V、238W、238Y、245R、247A、247D、247E、247F、247M、247N、247Q、247R、247T、247W、247Y、248F、248P、248Q、248W、249L、249M、249N、249P、249Y、251H、251I、251W、254D、254E、254F、254G、254H、254I、254K、254L、254M、254N、254P、254Q、254R、254V、254W、254Y、255K、255N、256H、256I、256K、256L、256W、257A、257I、257M、257N、257S、258D、260S、262L、264S、265K、265S、267H、267I、267K、268K、269N、269Q、271T、272H、272K、272R、279A、279D、279G、279H、279N、279Q、279S、279T、279W、279Y、280T、283F、283H、283K、283M、283R、283W、285N、286F、288N、288P、292E、292G、292I、301W、304E、307E、307M、312P、315F、315L、315P、316F、317P、317T、318N、318P、318T、332L、332M、332R、332S、332W、339D、339F、339I、339K、339M、339N、339Q、339R、339S、339W、339Y、341D、341E、341F、341H、341I、341K、341L、341M、341N、341P、341Q、341R、341S、341T、341V、341W、341Y、343D、343E、343G、343H、343K、343N、343Q、343R、343S、343T、343W、343Y、373D、373E、373G、373H、373I、373K、373L、373M、373Q、373R、373S、373T、373W、375R、376G、376N、376P、376Q、376R、376S、376T、376V、376W、376Y、377G、377K、377P、378D、378N、379N、379Q、379T、380N、380S、380T、382D、382F、382I、382K、382L、382Q、382R、382S、382T、382V、382W、382Y、385E、386K、423N、424H、424M、424V、426D、426L、427N、429A、429F、429M、430A、430D、430F、430G、430H、430I、430K、430L、430M、430N、430P、430Q、430R、430S、430T、430V、430W、430Y、431H、431K、431P、432R、432S、438K、438L、438T、438W、439E、440D、440I或440L。
本发明的Fc区变体优选地应用在此描述的一种或多种实验方法进行表征。该Fc区变体的存在可使包含Fc区变体的单克隆抗体的效应子功能或血清半寿期发生改变，或可使与Fc区变体有效连接的多肽的血清半寿期发生改变。
优选地，本发明Fc区变体的亲本Fc区为天然或胚系编码(germline-encoded)的人源Fc区，选自IgG、IgA、IgE、IgM和IgD，或其多态性变体或其功能片段。亲本Fc区优选地为IgG Fc区，且更优选地为IgG1、IgG3或IgG4的Fc区。与天然Fc区相比，亲本Fc区可任选地包含除在此描述的氨基酸替换(即在表1中列出的替换)之外的一处或多处额外的氨基酸替换，特别是本领域公知或在U.S.专利6,165,745、6,737,056或PCT公开号WO2004/035752或WO2004/029207(在此全部引入到本说明书)中描述的一处或多处氨基酸替换；该氨基酸替换如果存在于亲本Fc区中，也将存在于本发明的Fc区变体以及包含本发明Fc区变体的多肽中，除非该部位随后经过替换而生成了Fc区变体。
本发明提供了多肽，优选地提供了单克隆抗体，该多肽和单克隆抗体包含本发明的Fc区变体或其功能片段。在一优选的实施方案中，包含本发明Fc区变体的单克隆抗体为嵌合抗体。在一更为优选的实施方案中，包含本发明Fc区变体的单克隆抗体为下述人源化抗体或人抗体，即存在于该抗体中的构架序列和恒定区序列基本为人源。嵌合、人源化或人抗体优选地为全长抗体或单链抗体。当包含本发明Fc区变体的单克隆抗体用于人类治疗时，Fc区优选地基本为人源。
优选地，包含本发明Fc区变体或与之有效连接的多肽(即“变体多肽”)，与亲本Fc区相比在其Fc区中含有至少一处的氨基酸替换，且与包含该Fc区变体的亲本Fc区的多肽相比其显示出的效应子功能或血清半寿期发生改变，其中“Fc区变体中至少一处的氨基酸替换”为(i)Fc区中第279、341、343或373位中任意一处的氨基酸替换，或(ii)Fc区中至少一处的下列氨基酸替换：235G、235R、236F、236R、236Y、237K、237N、237R、238E、238G、238H、238I、238L、238V、238W、238Y、244L、245R、247A、247D、247E、247F、247M、247N、247Q、247R、247S、247T、247W、247Y、248F、248P、248Q、248W、249L、249M、249N、249P、249Y、251H、251I、251W、254D、254E、254F、254G、254H、254I、254K、254L、254M、254N、254P、254Q、254R、254V、254W、254Y、255K、255N、256H、256I、256K、256L、256V、256W、256Y、257A、257I、257M、257N、257S、258D、260S、262L、264S、265K、265S、267H、267I、267K、268K、269N、269Q、271T、272H、272K、272L、272R、279A、279D、279F、279G、279H、279I、279K、279L、279M、279N、279Q、279R、279S、279T、279W、279Y、280T、283F、283G、283H、283I、283K、283L、283M、283P、283R、283T、283W、283Y、285N、286F、288N、288P、292E、292F、292G、292I、292L、293S、293V、301W、304E、307E、307M、312P、315F、315K、315L、315P、315R、316F、316K、317P、317T、318N、318P、318T、332F、332G、332L、332M、332S、332V、332W、339D、339E、339F、339G、339H、339I、339K、339L、339M、339N、339Q、339R、339S、339W、339Y、341D、341E、341F、341H、341I、341K、341L、341M、341N、341P、341Q、341R、341S、341T、341V、341W、341Y、343A、343D、343E、343F、343G、343H、343I、343K、343L、343M、343N、343Q、343R、343S、343T、343V、343W、343Y、373D、373E、373F、373G、373H、373I、373K、373L、373M、373N、373Q、373R、373S、373T、373V、373W、375R、376E、376F、376G、376H、376I、376L、376M、376N、376P、376Q、376R、376S、376T、376V、376W、376Y、377G、377K、377P、378N、379N、379Q、379S、379T、380D、380N、380S、380T、382D、382F、382H、382I、382K、382L、382M、382N、382P、382Q、382R、382S、382T、382V、382W、382Y、385E、385P、386K、423N、424H、424M、424V、426D、426L、427N、429A、429F、429M、430A、430D、430F、430G、430H、430I、430K、430L、430M、430N、430P、430Q、430R、430S、430T、430V、430W、430Y、431H、431K、431P、432R、432S、438G、438K、438L、438T、438W、439E、439H、439Q、440D、440E、440F、440G、440H、440I、440K、440L、440M、440Q、440T、440V或442K，或(iii)至少两处如以上(i)或(ii)中所列出的氨基酸替换，或(iv)至少1、2或3处如以上(i)或(ii)中所列出的氨基酸替换，以及至少一处未在以上(i)或(ii)中所列出的Fc区氨基酸替换。与Fc区中不含氨基酸替换(即亲本Fc区)的该多肽相比，优选的效应子功能改变为ADCC提高、ADCC降低、CDC提高、CDC降低、C1q结合亲和性提高、C1q结合亲和性降低、FcR(优选地为FcRn)结合亲和性提高或FcR(优选地为FcRn)结合亲和性降低。
本发明提供了包含Fc区变体的单克隆抗体，在其Fc区中包含至少一处下述的氨基酸替换：247A、247F、247M、247T、247V、247Y、249E、249Y、254F、254M、254Y、256A、258D、279A、283A、283I、283K、283M、283R、288N、292A、311A、311D、311N、311T、311V、311Y、315L、318N、318P、318T、318V、332T、332V、339D、339F、339G、339I、339K、339M、339N、339Q、339R、339S、339T、376A、376V、377G、377K、379N、380N、380S、382A、382I、385E、427N、429M、434W、436I、440G、440H、440I或440L、[优选地为247A、247F、247M、247T、247V、247Y、254F、254Y、258D、279A、283M、288N、292A、311D、311N、311T、315L、318N、318P、318T、318V、339D、339I、339K、339M、339N、339Q、339R、339S、376A、376V、377K、379N、380N、382A、440I或440L]，其中包含Fc区变体的单克隆抗体与包含亲本Fc区的单克隆抗体相比显示出增强的ADCC。
本发明提供了包含Fc区变体的单克隆抗体，其Fc区中包含至少一处下述的氨基酸替换：235Q、235R、235S、236F、236R、236Y、237E、237K、237N、237R、238E、238G、238H、238I、238L、238V、238W、238Y、247G、247R、249L、249P、250K、250M、250R、251H、251I、251W、252Y、254L、254P、254Q、254T、254V、256V、257A、257I、257M、257N、257S、257V、260S、262L、264S、265H、265K、265S、267G、267H、267I、267K、269N、269Q、270A、270G、270K、270M、270N、271T、272H、272K、272L、272N、272R、279D、279F、279K、279L、279W、283D、283F、283G、283H、283L、283W、283Y、285N、288P、292E、292F、292G、292I、293S、293V、301W、304E、307A、307E、307M、311F、311I、311K、311S、312P、314F、314I、314V、314W、315F、315P、316F、317P、327T、328V、329Y、332G、332K、332L、332R、332W、341D、341E、341F、341H、341I、341K、341L、341M、341N、341P、341Q、341R、341S、341T、341W、341Y、343A、343D、343E、343F、343G、343H、343L、343M、343N、343Q、343R、343S、343T、343V、343W、343Y、373A、373D、373E、373F、373G、373I、373K、373L、373M、373N、373Q、373R、373S、373T、373V、373W、375R、376A、376E、376F、376G、376H、376W、376Y、379Q、382D、382S、430H、430K、430N、430Q、430R、430W、432R、432S、434I、440D、440T、440V或442K、[优选地为235R、236F、236Y、237E、237K、237N、237R、238E、238G、238H、238I、238L、238V、238W、238Y、247R、250K、251H、254T、257I、257M、257N、257S、257V、265H、265K、265S、267G、267H、267I、267K、269N、269Q、270A、270G、270K、270M、270N、271T、272N、272R、288P、292E、301W、304E、316F、317P、327T、328V、329Y、332K、332R、341F、341I、341M、341P、341Q、341R、341T、341W、341Y、343W、373A、373E、373G、373S、376A、376W、432R或432S]，其中包含Fc区变体的单克隆抗体与包含亲本Fc区的单克隆抗体相比显示出降低的ADCC。
本发明提供了包含Fc区变体的单克隆抗体，其Fc区中包含至少一处下述的氨基酸替换：238L、244L、245R、249P、252Y、256P、257A、257I、257M、257N、257S、257V、258D、260S、262L、270K、272L、272R、279A、279D、279G、279H、279M、279N、279Q、279R、279S、279T、279W、279Y、283A、283D、283F、283G、283H、283I、283K、283L、283N、283P、283Q、283R、283S、283T、283W、283Y、285N、286F、288N、288P、293V、307E、307M、311A、311I、311K、311L、311M、311V、311W、312P、316K、317P、318N、318T、332F、332H、332K、332L、332M、332R、332S、332W、339N、339T、339W、341P、343E、343H、343K、343Q、343R、343T、343Y、375R、376G、376I、376M、376P、376T、376V、377K、378D、378N、380N、380S、380T、382F、382H、382I、382K、382L、382M、382N、382Q、382R、382S、382T、382V、382W、382Y、423N、427N、430A、430F、430G、430H、430I、430K、430L、430M、430N、430Q、430R、430S、430T、430V、430Y、431H、431K、434F、434G、434H、434W、434Y、436I、436L、436T、438K、438L、438T、438W、440K或442K、[优选地为245R、252Y、256P、257A、257I、257M、257N、257S、257V、258D、260S、262L、279A、279D、279G、279H、279N、279Q、279S、279T、279W、279Y、283F、283H、283K、283R、285N、286F、307E、307M、311I、311K、311L、311M、312P、318N、318T、332S、339W、343E、343H、343K、343Q、343R、375R、377K、378D、378N、380S、380T、382F、382K、382Q、382R、382S、382T、382V、382W、382Y、423N、427N、430A、430F、430H、430I、430L、430M、430N、430Q、430R、430S、430V、430Y、431H、431K、434F、434G、434H、434W、434Y、436I、436L、438K、438L或438W]，其中包含Fc区变体的单克隆抗体与包含亲本Fc区的单克隆抗体的相比显示出提高的FcRn结合亲和性。
本发明提供了包含Fc区变体的单克隆抗体，其Fc区中包含至少一处下述的氨基酸替换：235Q、236Y、237K、237R、238E、238G、238H、238W、247A、247D、247E、247F、247G、247H、247I、247L、247M、247N、247Q、247R、247S、247W、247Y、248A、248F、248P、248Q、248W、249E、249L、249M、249Y、251F、251H、251I、251W、254D、254E、254F、254G、254H、254I、254K、254L、254M、254N、254P、254Q、254R、254T、254V、254W、254Y、255K、255N、256F、256H、256I、256K、256M、256R、256W、256Y、264S、265S、265Y、267G、267I、268D、268K、270A、270M、279I、279K、279L、280T、292E、292F、292G、292I、292L、311D、311E、311F、311G、311N、311R、311Y、315F、315K、315P、316F、317T、326W、327T、339E、339G、339L、339R、341D、341E、341F、341I、341K、341L、341M、341N、341Q、341R、341S、341T、341V、341W、341Y、343M、343V、343W、373A、373D、373G、373K、373L、373M、373N、373Q、373S、373T、373V、373W、376H、376L、376W、376Y、424M、424V、426D、429A、429F、429M、430D、430W、431P、432R、432S、439Q、440A、440D、440E、440F或440M、[优选地为237R、247D、247E、247F、247H、247I、247L、247M、247N、247Q、247W、247Y、248A、248F、248P、248Q、248W、249L、249M、249Y、251H、251I、251W、254D、254E、254F、254G、254H、254I、254K、254M、254N、254P、254Q、254R、254T、254V、254W、254Y、255K、255N、256F、256H、256K、256M、256R、256W、265Y、280T、292G、292I、311D、311E、311G、311N、315F、315P、316T、317T、327T、341D、341E、341F、341I、341L、341Y、343W、373A、373G、373M、373Q、376W、376Y、424M、424V、430D、430W、431P或432S]，其中包含Fc区变体的单克隆抗体与包含亲本Fc区的单克隆抗体的相比显示出降低的FcRn结合亲和性。
本发明提供了包含Fc区变体的单克隆抗体，其Fc区中包含至少一处下述的氨基酸替换：236Y、244L、247A、247D、247E、247G、247N、247Q、247R、247S、247W、248F、248P、248Q、248W、249E、249L、249M、249N、249P、249Y、251F、251H、251I、251W、254A、254F、254K、254L、254M、254R、254Y、255K、256A、256G、256I、256L、256M、256P、256Q、256W、256Y、260S、268D、279Q、279S、279W、279Y、280K、280T、283F、283G、283H、283I、283K、283L、283M、283N、283P、283R、283S、283W、292L、307A、307M、311F、311I、311K、311L、311M、311T、3111V、311W、311Y、312P、314F、314I、314V、314W、314Y、315F、315K、315L、315P、315R、316K、317P、317T、318N、318T、332A、332D、332E、332F、332G、332L、332M、332Q、332S、332T、332V、332W、332Y、339D、339F、339G、339H、339I、339K、339N、339Q、339R、339S、339T、339W、339Y、341D、341E、341F、341H、341I、341K、341L、341M、341N、341P、341Q、341R、341S、341T、341V、341W、341Y、343A、343D、343E、343G、343H、343K、343L、343M、343N、343Q、343R、343S、343T、343W、343Y、373D、373E、373F、373H、373I、373K、373L、373M、373N、373Q、373R、373T、373V、373W、375R、376A、376F、376G、376H、376L、376N、376P、376Q、376R、376S、376T、376V、377P、379N、379Q、379S、379T、380A、380N、380S、380T、382I、382L、382Q、382V、386K、426D、426L、429A、429F、429M、430A、430D、430F、430G、430H、430I、430K、430L、430M、430N、430P、430R、430S、430T、430V、430W、430Y、431H、431P、432R、432S、434W、434Y、438L、438W、440Q或440Y、[优选地为236Y、248F、248P、248Q、248W、249E、249L、249M、249N、249Y、251H、251I、251W、254F、254K、254L、254M、254R、254Y、255K、256A、256G、256I、256L、256M、256P、256Q、256W、260S、280K、283W、307M、311F、311I、311K、311L、311M、311T、311V、311W、311Y、314I、314V、314W、314Y、315P、317P、332D、332L、332M、332S、332W、339D、339F、339I、339K、339N、339S、339W、339Y、341D、341E、341F、341H、341I、341K、341L、341M、341N、341P、341Q、341R、341S、341T、341V、341W、341Y、343D、343E、343G、343H、343K、343N、343Q、343R、343S、343T、343W、343Y、373E、373F、373H、373I、373K、373L、373Q、373R、373T、373W、376A、376G、376N、376P、376Q、376R、376S、376T、376V、377P、379N、379Q、379T、382I、382L、386K、426D、426L、429F、429M、430A、430D、430F、430G、430H、430I、430K、430L、430M、430N、430P、430R、430S、430T、430V、430W、430Y、431H、431P、434Y、438L或440Y]，其中包含Fc区变体的单克隆抗体与包含亲本Fc区的单克隆抗体的相比显示出提高的CDC活性。
本发明提供了包含Fc区变体的单克隆抗体，其Fc区中包含至少一处下述的氨基酸替换：235G、235S、236R、237E、237K、237N、237R、238A、238E、238G、238H、238I、238L、238V、238W、238Y、245R、247H、247I、247L、247T、247Y、250M、252Y、254D、254E、254I、254P、254Q、254T、254V、255N、257A、257I、257M、257N、257S、257V、262L、264S、265H、265Y、267G、267H、267I、267K、268K、269N、269Q、270G、270M、270N、271T、272H、272L、272N、292A、293S、301W、307E、311E、311S、316F、318P、327T、328V、329Y、330K、330R、332E、332M、343I、373S、378D、380D、382D、382F、382N、382P、382R、382S、382W、382Y、385E、385P、423N、424H、424M或427N[优选地为235G、235S、236R、237E、237K、237N、237R、238A、238E、238G、238H、238I、238L、238V、238W、238Y、245R、247I、247L、247T、250M、257A、257I、257M、262L、264S、267G、267H、267I、267K、268K、269N、269Q、270G、270M、270N、271T、272H、301W、311S、327T、329Y、330K、378D、385E、423N或424H]，其中包含Fc区变体的单克隆抗体与包含亲本Fc区的单克隆抗体的相比显示出降低的CDC活性。
本发明进一步表述了含有本发明Fc区变体的单克隆抗体，其中该抗体特异结合人类靶抗原。优选的靶抗原选自CD3、CD20、CD25、TNFα、Her2/neu、CD33、CD52、EGFR、EpCAM、MUC1、GD3、CEA、CA125、HLA-DR、TGFβ、VEGF、GDF8、GDF11、生长激素释放激素或其任意前体及或功能片段。
本发明提供了包含Fc区变体的单克隆抗体，其Fc区中包含至少一处下述的氨基酸替换：238L、244L、245R、249P、252Y、256P、257A、257I、257M、257N、257S、257V、258D、260S、262L、270K、272L、272R、279A、279D、279G、279H、279M、279N、279Q、279R、279S、279T、279W、279Y、283A、283D、283F、283G、283H、283I、283K、283L、283N、283P、283Q、283R、283S、283T、283W、283Y、285N、286F、288N、288P、293V、307E、307M、311A、311I、311K、311L、311M、311V、311W、312P、316K、317P、318N、318T、332F、332H、332K、332L、332M、332R、332S、332W、339N、339T、339W、341P、343E、343H、343K、343Q、343R、343T、343Y、375R、376G、376I、376M、376P、376T、376V、377K、378D、378N、380N、380S、380T、382F、382H、382I、382K、382L、382M、382N、382Q、382R、382S、382T、382V、382W、382Y、423N、427N、430A、430F、430G、430H、430I、430K、430L、430M、430N、430Q、430R、430S、430T、430V、430Y、431H、431K、434F、434G、434H、434W、434Y、436I、436L、436T、438K、438L、438T、438W、440K或442K、[优选地为245R、252Y、256P、257A、257I、257M、257N、257S、257V、258D、260S、262L、279A、279D、279G、279H、279N、279Q、279S、279T、279W、279Y、283F、283H、283K、283R、285N、286F、307E、307M、311I、311K、311L、311M、312P、318N、318T、332S、339W、343E、343H、343K、343Q、343R、375R、377K、378D、378N、380S、380T、382F、382K、382Q、382R、382S、382T、382V、382W、382Y、423N、427N、430A、430F、430H、430I、430L、430M、430N、430Q、430R、430S、430V、430Y、431H、431K、434F、434G、434H、434W、434Y、436I、436L、438K、438L或438W]，其中的变体多肽与亲本多肽(即除不合上文列出的氨基酸替换外与变体多肽完全相同的多肽)相比显示出延长的血清半寿期。
本发明提供了包含Fc区变体的单克隆抗体，其Fc区中包含至少一处下述的氨基酸替换：235Q、236Y、237K、237R、238E、238G、238H、238W、247A、247D、247E、247F、247G、247H、247I、247L、247M、247N、247Q、247R、247S、247W、247Y、248A、248F、248P、248Q、248W、249E、249L、249M、249Y、251F、251H、251I、251W、254D、254E、254F、254G、254H、254I、254K、254L、254M、254N、254P、254Q、254R、254T、254V、254W、254Y、255K、255N、256F、256H、256I、256K、256M、256R、256W、256Y、264S、265S、265Y、267G、267I、268D、268K、270A、270M、279I、279K、279L、280T、292E、292F、292G、292I、292L、311D、311E、311F、311G、311N、311R、311Y、315F、315K、315P、316F、317T、326W、327T、339E、339G、339L、339R、341D、341E、341F、341I、341K、341L、341M、341N、341Q、341R、341S、341T、341V、341W、341Y、343M、343V、343W、373A、373D、373G、373K、373L、373M、373N、373Q、373S、373T、373V、373W、376H、376L、376W、376Y、424M、424V、426D、429A、429F、429M、430D、430W、431P、432R、432S、439Q、440D、440E、440F或440M[优选地为237R、247D、247E、247F、247H、247L、247M、247N、247Q、247W、247Y、248A、248F、248P、248Q、248W、249L、249M、249Y、251H、251I、251W、254D、254E、254F、254G、254H、254I、254K、254M、254N、254P、254Q、254R、254T、254V、254W、254Y、255K、255N、256F、256H、256K、256M、256R、256W、265Y、280T、292G、292I、311D、311E、311G、311N、315F、315P、316T、317T、327T、341D、341E、341F、341I、341L、341Y、343W、373A、373G、373M、373Q、376W、376Y、424M、424V、430D、430W、431P或432S]，其中的变体多肽与亲本多肽(即除不含上文列出的氨基酸替换外与变体多肽完全相同的多肽)相比显示出缩短的血清半寿期。
本发明的一个实施方案提供了用于提高单克隆抗体的ADCC活性的方法，所述单克隆抗体优选地为治疗性单克隆抗体(或其功能片段)，该方法包括对核酸进行改造以使其含有编码Fc区变体的核酸，所述变体包含至少一处下列的氨基酸替换：247A、247F、247H、247I、247L、247M、247T、247V、247Y、249E、249Y、251F、254F、254M、254Y、256A、256M、258D、268D、268E、279A、280A、280K、283A、283I、283K、283M、283R、288N、292A、311A、311D、311N、311T、311V、311Y、315L、318N、318P、318T、318V、330K、332T、332V、339D、339F、339G、339I、339K、339M、339N、339Q、339R、339S、339T、376A、376V、377G、377K、379N、380N、380S、382A、382I、385E、427N、429M、434W、436I、440G、440H、440I或440L[优选地为247A、247F、247M、247T、247V、247Y、254F、254Y、258D、279A、283M、288N、292A、311D、311N、311T、315L、318N、318P、318T、318V、339D、339I、339K、339M、339N、339Q、339R、339S、376A、376V、377K、379N、380N、382A、440I或440L]。可对编码Fc区变体的核酸分子(例如来自编码亲本Fc区或天然Fc区的核酸分子)进行改造以使其包含至少一处以上所列的氨基酸替换，并将核酸分子与另外的编码抗体的核酸(例如编码Ig重链剩余部分的核酸序列)有效连接，方法也可进一步包含后继的将编码Fc区变体的核酸(即引入了至少一处如上所列的氨基酸替换之后)与另外的编码抗体的核酸有效连接。方法可进一步包含表达并纯化包含Fc区变体的单克隆抗体。方法可进一步包含表达和纯化包含亲本Fc区的单克隆抗体。方法可进一步包含对含Fc区变体的单克隆抗体以及含亲本Fc区的单克隆抗体的ADCC活性进行检测，所述检测通过本领域可获得或此处描述的方法进行。方法可进一步包含筛选出下述含Fc区变体的单克隆抗体，所述变体的ADCC活性高于含亲本Fc区的单克隆抗体(即活性增强，优选地至少提高5％、10％、12％、14％、16％、18％、20％或更多)。本发明进一步描述了含有由本方法产生的Fc区变体的单克隆抗体或其功能片段。
本发明的一个实施方案提供了用于降低单克隆抗体的ADCC活性的方法，所述单克隆抗体优选地为治疗性单克隆抗体(或其功能片段)，该方法包括对核酸进行改造以使其含有编码Fc区变体的核酸，所述变体包含至少一处下列的氨基酸替换：235Q、235R、235S、236F、236R、236Y、237E、237K、237N、237R、238E、238G、238H、238I、238L、238V、238W、238Y、247G、247R、249L、249P、250K、250M、250R、251H、251I、251W、252Y、254L、254P、S254Q、254T、254V、256V、257A、257I、257M、257N、257S、257V、260S、262L、264S、265H、265K、265S、267G、S267H、267I、267K、269N、269Q、270A、270G、270K、270M、270N、271T、272H、272K、272L、272N、272R、279D、279F、279K、279L、279W、283D、283F、283G、283H、283L、283T、283W、283Y、285N、288P、292E、292F、292G、292I、293S、293V、301W、304E、307A、307E、307M、311F、311I、311K、311S、312P、314F、314I、314V、314W、315F、315P、316F、317P、327T、328V、329Y、332G、332K、332L、332R、332W、341D、341E、341F、341H、341I、341K、341L、341M、341N、341P、341Q、341R、341S、341T、341W、341Y、343A、343D、343E、343F、343G、343H、343L、343M、343N、343Q、343R、343S、343T、343V、343W、343Y、373A、373D、373E、373F、373G、373I、373K、373L、373M、373N、373Q、373R、373S、373T、373V、373W、375R、376A、376E、376F、376G、376H、376W、376Y、379Q、382D、382S、429A、429F、430H、430K、430N、430Q、430R、430W、432R、432S、434I、440D、440T、440V或442K[优选地235R、236F、236R、236Y、237E、237K、237N、237R、238E、238G、238H、238I、238L、238V、238W、238Y、247R、249P、250K、251H、254T、257I、257M、257N、257S、257V、265H、265K、265S、267G、267H、267I、267K、269N、269Q、270A、270G、270K、270M、270N、271T、272R、288P、292E、301W、304E、316F、317P、327T、329Y、332K、332R、341F、341I、341M、341P、341Q、341R、341T、341W、341Y、343W、373A、373E、373G、373S、376W、429A、432R或432S]。可对编码Fc区变体的核酸分子(例如来自编码亲本Fc区或天然Fc区的核酸分子)进行改造以使其包含至少一处以上所列的氨基酸替换，同时将核酸分子与另一编码抗体的核酸(例如编码Ig重链剩余部分的核酸序列)有效连接，方法也可进一步包含后继的将编码Fc区变体的核酸(即引入了至少一处如上所列的氨基酸替换之后)与另一编码抗体的核酸有效连接。方法可进一步包含表达并纯化包含Fc区变体的单克隆抗体。方法可进一步包含表达和纯化包含亲本Fc区的单克隆抗体。方法可进一步包含对含Fc区变体的单克隆抗体以及含亲本Fc区的单克隆抗体的ADCC活性进行检测，所述检测通过本领域可获得或此处描述的方法进行。方法可进一步包含筛选含Fc区变体的单克隆抗体，所述单克隆抗体其ADCC活性低于含亲本Fc区的单克隆抗体(即活性降低，优选地至少降低5％、10％、12％、14％、16％、18％、20％或更多)。本发明进一步描述了由本方法产生的含Fc区变体的单克隆抗体或其功能片段。
本发明的一个实施方案提供了用于提高单克隆抗体的FcRn结合亲和性的方法，所述单克隆抗体优选地为治疗性单克隆抗体(或其功能片段)，该方法包括对核酸进行改造以使其含有编码Fc区变体的核酸，所述变体包含至少一处下列的氨基酸替换：238L、244L、245R、249P、252Y、256P、257A、257I、257M、257N、257S、257V、258D、260S、262L、270K、272L、272R、279A、279D、279G、279H、279M、279N、279Q、279R、279S、279T、279W、279Y、283A、283D、283F、283G、283H、283I、283K、283L、283N、283P、283Q、283R、283S、283T、283W、283Y、285N、286F、288N、288P、293V、307A、307E、307M、311A、311I、311K、311L、311M、311V、311W、312P、316K、317P、318N、318T、332F、332H、332K、332L、332M、332R、332S、332W、339N、339T、339W、341P、343E、343H、343K、343Q、343R、343T、343Y、375R、376G、376I、376M、376P、376T、376V、377K、378D、378N、380N、380S、380T、382F、382H、382I、382K、382L、382M、382N、382Q、382R、382S、382T、382V、382W、382Y、423N、427N、430A、430F、430G、430H、430I、430K、430L、430M、430N、430Q、430R、430S、430T、430V、430Y、431H、431K、434F、434G、434H、434W、434Y、436I、436L、436T、438K、438L、438T、438W、440K或442K[优选地为245R、252Y、256P、257A、257I、257M、257N、257S、257V、258D、262L、279A、279D、279G、279H、279N、279Q、279S、279T、279W、279Y、283F、283H、283K、283R、285N、286F、307A、307E、307M、311I、311K、311L、311M、312P、318N、318T、332S、339W、343E、343H、343K、343Q、343R、375R、377K、378D、378N、380S、380T、382F、382K、382Q、382R、382S、382T、382V、382W、382Y、423N、427N、430A、430F、430H、430I、430L、430M、430N、430Q、430R、430S、430V、430Y、431H、431K、434F、434G、434H、434W、434Y、436I、436L、438K、438L或438W]。可对编码Fc区变体的核酸分子(例如来自编码亲本Fc区或天然Fc区的核酸分子)进行改造以使其包含至少一处以上所列的氨基酸替换，同时将核酸分子与另一编码抗体的核酸(例如编码Ig重链剩余部分的核酸序列)有效连接，方法也可进一步包含后继的将编码Fc区变体的核酸(即引入了至少一处如上所列的氨基酸替换之后)与另一编码抗体的核酸有效连接。方法可进一步包含表达并纯化包含Fc区变体的单克隆抗体。方法可进一步包含表达和纯化包含亲本Fc区的单克隆抗体。方法可进一步包含对含Fc区变体的单克隆抗体以及含亲本Fc区的单克隆抗体的FcRn结合亲和性进行检测，所述检测通过本领域可获得或此处描述的方法进行。方法可进一步包含筛选含Fc区变体的单克隆抗体，所述单克隆抗体其FcRn结合亲和性高于含亲本Fc区的单克隆抗体(即活性增强，优选地至少提高5％、10％、12％、14％、16％、18％、20％或更多)。本发明进一步描述了通过本方法产生的含Fc区变体的单克隆抗体或其功能片段。
本发明的一个实施方案提供了用于延长多肽的体内血清半寿期的方法，所述多肽优选地为治疗性多肽，该方法包括对核酸进行改造以使其含有编码Fc区变体的核酸，所述变体包含至少一处下列的氢基酸替换：238L、244L、245R、249P、252Y、256P、257A、257I、257M、257N、257S、257V、258D、260S、262L、270K、272L、272R、279A、279D、279G、279H、279M、279N、279Q、279R、279S、279T、279W、279Y、283A、283D、283F、283G、283H、283I、283K、283L、283N、283P、283Q、283R、283S、283T、283W、283Y、285N、286F、288N、288P、293V、307A、307E、307M、311A、311I、311K、311L、311M、311V、311W、312P、316K、317P、318N、318T、332F、332H、332K、332L、332M、332R、332S、332W、339N、339T、339W、341P、343E、343H、343K、343Q、343R、343T、343Y、375R、376G、376I、376M、376P、376T、376V、377K、378D、378N、380N、380S、380T、382F、382H、382I、382K、382L、382M、382N、382Q、382R、382S、382T、382V、382W、382Y、423N、427N、430A、430F、430G、430H、430I、430K、430L、430M、430N、430Q、430R、430S、430T、430V、430Y、431H、431K、434F、434G、434H、434W、434Y、436I、436L、436T、438K、438L、438T、438W、440K或442K、[优选地为245R、252Y、256P、257A、257I、257M、257N、257S、257V、258D、262L、279A、279D、279G、279H、279N、279Q、279S、279T、279W、279Y、283F、283H、283K、283R、285N、286F、307A、307E、307M、311I、311K、311L、311M、312P、318N、318T、332S、339W、343E、343H、343K、343Q、343R、375R、377K、378D、378N、380S、380T、382F、382K、382Q、382R、382S、382T、382V、382W、382Y、423N、427N、430A、430F、430H、430I、430L、430M、430N、430Q、430R、430S、430V、430Y、431H、431K、434F、434G、434H、434W、434Y、436I、436L、438K、438L或438W]。编码Fc区变体的核酸分子可与编码治疗性蛋白质的核酸分子有效连接。可对编码Fc区变体的核酸分子(例如来自编码亲本Fc区或天然Fc区的核酸分子)进行改造以使其包含至少一处以上所列的氨基酸替换，同时将核酸分子与另一编码多肽的核酸(例如编码融合蛋白非Fc区的核酸序列)有效连接，方法也可进一步包含后继的将编码Fc区变体的核酸在其引入至少一处如上所列的氨基酸替换之后，与编码非Fc融合部分的核酸有效连接。方法可进一步包含表达并纯化含Fc区变体的多肽。方法可进一步包含表达和纯化含亲本Fc区的多肽。方法可进一步包含筛选含Fc区变体的多肽，其中的多肽与包含亲本Fc区的多肽相比其体内血清半寿期延长(即半寿期延长，优选地至少延长5％、10％、12％、14％、16％、18％、20％或更多)。本发明进一步描述了通过本方法产生的含Fc区变体的多肽(即融合多肽)。
本发明的一个实施方案提供了用于降低单克隆抗体的FcRn结合亲和性的方法，所述单克隆抗体优选地为治疗性单克隆抗体(或其功能片段)，该方法包括对核酸进行改造以使其含有编码Fc区变体的核酸，所述变体包含至少一处下列的氨基酸替换：235Q、236Y、237K、237R、238E、238G、238H、238W、247A、247D、247E、247F、247G、247H、247I、247L、247M、247N、247Q、247R、247S、247W、247Y、248A、248F、248P、248Q、248W、249E、249L、249M、249Y、251F、251H、251I、251W、254D、254E、254F、254G、254H、254I、254K、254L、254M、254N、254P、254Q、254R、254T、254V、254W、254Y、255K、255N、256F、256H、256I、256K、256M、256R、256W、256Y、264S、265S、265Y、S267G、267I、268D、268K、270A、270M、279I、279K、279L、280T、292E、292F、292G、292I、292L、311D、311E、311F、311G、311N、311R、311Y、315F、315K、315P、316F、317T、326W、327T、339E、339G、339L、339R、341D、341E、341F、341I、341K、341L、341M、341N、341Q、341R、341S、341T、341V、341W、341Y、343M、343V、343W、373A、373D、373G、373K、373L、373M、373N、373Q、373S、373T、373V、373W、376H、376L、376W、376Y、424M、424V、426D、429A、429F、429M、430D、430W、431P、432R、432S、434I、439Q、440A、440D、440E、440F或440M[优选地为237R、247D、247E、247F、247H、247L、247M、247N、247Q、247W、247Y、248A、248F、248P、248Q、248Q、249L、249M、249Y、251H、251I、251W、254D、254E、254F、254G、254H、254I、254K、254M、254N、254P、254R、254T、254V、254W、254Y、255K、255N、256F、256H、256K、256M、256R、256W、265Y、280T、292G、292I、311D、311E、311G、311N、315F、315P、316T、317T、327T、341D、341E、341F、341L、341Y、343W、373A、373G、373M、373Q、376W、376Y、424M、424V、430D、430W、431P或432S]。可对编码Fc区变体的核酸分子(例如来自编码亲本Fc区或天然Fc区的核酸分子)进行改造以使其包含至少一处以上所列的氨基酸替换，同时将编码Fc区变体的核酸与另一编码抗体序列的核酸(例如编码Ig重链剩余部分的核酸序列)有效连接，方法也可进一步包含后继的将编码Fc区变体的核酸在其即引入了至少一处如上所列的氨基酸替换之后，与另一编码抗体的核酸有效连接。方法可进一步包含表达并纯化含Fc区变体的单克隆抗体。方法可进一步包含表达和纯化含亲本Fc区的单克隆抗体。方法可进一步包含对含Fc区变体的单克隆抗体以及含亲本Fc区的单克隆抗体的FcRn结合亲和性进行检测，所述检测通过本领域可获得或此处描述的方法进行。方法可进一步包含筛选含Fc区变体的单克隆抗体，所述单克隆抗体的FcRn结合亲和性低于含亲本Fc区的单克隆抗体的FcRn结合亲和性(即活性降低，优选地至少降低5％、10％、12％、14％、16％、18％、20％或更多)。本发明进一步描述了通过本方法生成的单克隆抗体(包含Fc区变体)。
本发明的另一个实施方案提供了用于缩短多肽的体内血清半寿期的方法，所述多肽优选地为治疗性多肽，该方法包括对核酸进行改造以使其含有编码Fc区变体的核酸，所述变体包含至少一处下列的氨基酸替换：235Q、236Y、237K、237R、238E、238G、238H、238W、247A、247D、247E、247F、247G、247H、247I、247L、247M、247N、247Q、247R、247S、247W、247Y、248A、248F、248P、248Q、248W、249E、249L、249M、249Y、251F、251H、251I、251W、254D、254E、254F、254G、254H、254I、254K、254L、254M、254N、254P、254Q、254R、254T、254V、254W、254Y、255K、255N、256F、256H、256I、256K、256M、256R、256W、256Y、264S、265S、265Y、S267G、267I、268D、268K、270A、270M、279I、279K、279L、280T、292E、292F、292G、292I、292L、311D、311E、311F、311G、311N、311R、311Y、315F、315K、315P、316F、317T、326W、327T、339E、339G、339L、339R、341D、341E、341F、341I、341K、341L、341M、341N、341Q、341R、341S、341T、341V、341W、341Y、343M、343V、343W、373A、373D、373G、373K、373L、373M、373N、373Q、373S、373T、373V、373W、376H、376L、376W、376Y、424M、424V、426D、429A、429F、429M、430D、430W、431P、432R、432S、434I、439Q、440A、440D、440E、440F或440M[优选地为237R、247D、247E、247F、247H、247L、247M、247N、247Q、247W、247Y、248A、248F、248P、248Q、248Q、249L、249M、249Y、251H、251I、251W、254D、254E、254F、254G、254H、254I、254K、254M、254N、254P、254R、254T、254V、254W、254Y、255K、255N、256F、256H、256K、256M、256R、256W、265Y、280T、292G、292I、311D、311E、311G、311N、315F、315P、316T、317T、327T、341D、341E、341F、341L、341Y、343W、373A、373G、373M、373Q、376W、376Y、424M、424V、430D、430W、431P或432S]。编码Fc区变体的核酸分子可与编码治疗性蛋白质的核酸分子有效连接。可对编码Fc区变体的核酸分子(例如来自编码亲本Fc区或天然Fc区的核酸分子)进行改造以使其包含至少一处以上所列的氨基酸替换，同时将核酸分子与另一编码多肽的核酸(例如编码融合蛋白非Fc区的核酸序列)有效连接，方法也可进一步包含后继的将编码Fc区变体的核酸在其引入至少一处如上所列的氨基酸替换之后，与编码非Fc融合部分的核酸有效连接。方法可进一步包含表达并纯化包含Fc区变体的多肽。方法可进一步包含表达和纯化含亲本Fc区的多肽。方法可进一步包含筛选含Fc区变体的多肽，其中的多肽与包含亲本Fc区的多肽相比其体内血清半寿期缩短(即半寿期缩短，优选地至少缩短5％、10％、12％、14％、16％、18％、20％或更多)。本发明进一步描述了通过本方法产生的含Fc区变体的多肽(即融合多肽)。
本发明的另一实施方案中提供了用于提高单克隆抗体的CDC反应的方法，所述单克隆抗体优选地为治疗性单克隆抗体，该方法包含构建抗体的Fc区以使其含有至少一处的下列氨基酸替换：236Y、244L、247A、247D、247E、247G、247N、247Q、247R、247S、247W、248F、248P、248Q、248W、249E、249L、249M、249N、249P、249Y、250K、250R、251F、251H、251I、251W、254A、254F、254K、254L、254M、254R、254Y、255K、256A、256G、256I、256L、256M、256P、256Q、256W、256Y、260S、268D、279Q、279S、279W、279Y、280K、280T、283F、283G、283H、283I、283K、283L、283M、283N、283P、283R、283S、283W、292L、307A、307M、311F、311I、311K、311L、311M、311T、311V、311W、311Y、312P、314F、314I、314V、314W、314Y、315F、315K、315L、315P、315R、316K、317P、317T、318N、318T、332A、332D、332E、332F、332G、332H、332L、332M、332N、332Q、332S、332T、332V、332W、332Y、339D、339F、339G、339H、339I、339K、339N、339Q、339R、339S、339T、339W、339Y、341D、341E、341F、341H、341I、341K、341L、341M、341N、341P、341Q、341R、341S、341T、341V、341W、341Y、343A、343D、343E、343G、343H、343K、343L、343M、343N、343Q、343R、343S、343T、343W、343Y、373D、373E、373F、373H、373I、373K、373L、373M、373N、373Q、373R、373T、373V、373W、375R、376A、376F、376G、376H、376L、376N、376P、376Q、376R、376S、376T、376V、377P、379N、379Q、379S、379T、380A、380N、380S、380T、382I、382L、382Q、382V、386K、426D、426L、429A、429F、429M、430A、430D、430F、430G、430H、430I、430K、430L、430M、430N、430P、430R、430S、430T、430V、430W、430Y、431H、431P、432R、432S、434W、434Y、438L、438W、440Q或440Y[优选地为236Y、248F、248P、248Q、248W、249E、249L、249M、249N、249Y、250K、250R、251H、251I、251W、254A、254F、254K、254L、254M、254R、254Y、255K、256A、256G、256I、256L、256M、256P、256Q、256W、260S、280K、283W、307M、311F、311I、311K、311L、311M、311T、311V、311W、311Y、314I、314V、314W、314Y、315P、317P、332D、332L、332M、332S、332W、332Y、339D、339F、339I、339K、339N、339S、339T、339W、339Y、341D、341E、341F、341H、341I、341K、341L、341M、341N、341P、341Q、341R、341S、341T、341V、341W、341Y、343D、343E、343G、343H、343K、343N、343Q、343R、343S、343T、343W、343Y、373D、373E、373H、373I、373K、373L、373Q、373R、373T、373W、376A、376G、376N、376P、376Q、376R、376S、376T、376V、377P、379N、379Q、379T、382I、382L、386K、426D、426L、429F、429M、430A、430D、430F、430G、430H、430I、430K、430L、430M、430N、430P、430R、430S、430T、430V、430W、430Y、431H、431P、432R、434Y、438L或440Y]。可对编码Fc区变体的核酸分子(例如来自编码亲本Fc区或天然Fc区的核酸分子)进行改造以使其包含至少一处以上所列的氨基酸替换，同时将核酸分子与另一编码抗体的核酸(例如编码Ig重链剩余部分的核酸序列)有效连接，方法也可进一步包含后继的将编码Fc区变体的核酸在其引入了至少一处如上所列的氨基酸替换之后，与另一编码抗体的核酸有效连接。方法可进一步包含表达并纯化含Fc区变体的单克隆抗体。方法可进一步包含表达和纯化含亲本Fc区的单克隆抗体。方法可进一步包含对含Fc区变体的单克隆抗体以及含亲本Fc区的单克隆抗体的CDC活性进行检测，所述检测通过本领域可获得或此处描述的方法进行。方法可进一步包含筛选含Fc区变体的单克隆抗体，所述单克隆抗体的CDC活性高于含亲本Fc区的单克隆抗体(即活性增强，优选地至少提高5％、10％、12％、14％、16％、18％、20％或更多)。本发明进一步描述了通过本方法产生的含Fc区变体的单克隆抗体。
本发明的另一实施方案中提供了用于降低单克隆抗体的CDC反应的方法，所述单克隆抗体优选地为治疗性单克隆抗体，该方法包含构建抗体的Fc区以使其含有至少一处的下列氨基酸替换：235G、235S、236R、237E、237K、237N、237R、238A、238E、238G、238H、238I、238L、238V、238W、238Y、245R、247H、247I、247L、247T、247Y、250M、252Y、254D、254E、254I、254P、254Q、254T、254V、255N、257A、257I、257M、257N、257S、257V、262L、264S、265H、265Y、267G、267H、267I、267K、268K、269N、269Q、270G、270M、270N、271T、272H、272L、272N、292A、293S、301W、307E、311E、311S、316F、318P、327T、328V、329Y、330K、330R、332K、339E、339M、343I、373S、378D、380D、382D、382F、382N、382P、382R、382S、382W、382Y、385E、385P、423N、424H、424M或427N[优选地为235G、235S、236R、237E、237K、237N、237R、238A、238E、238G、238H、238I、238L、238V、238W、238Y、245R、247I、247L、247T、250M、257A、257I、257M、262L、264S、267G、267H、267I、267K、268K、269N、269Q、270G、270M、270N、271T、272H、301W、311S、327T、329Y、330K、330R、378D、385E、423N或424H]。可对编码Fc区变体的核酸分子(例如来自编码亲本Fc区或天然Fc区的核酸分子)进行改造以使其包含至少一处以上所列的氨基酸替换，同时将核酸分子与另一编码抗体的核酸(例如编码Ig重链剩余部分的核酸序列)有效连接，方法也可进一步包含后继的将编码Fc区变体的核酸在其引入了至少一处如上所列的氨基酸替换之后，与另一编码抗体的核酸有效连接。方法可进一步包含表达并纯化含Fc区变体的单克隆抗体。方法可进一步包含表达和纯化含亲本Fc区的单克隆抗体。方法可进一步包含对含Fc区变体的单克隆抗体以及含亲本Fc区的单克隆抗体的CDC活性进行检测，所述检测通过本领域可获得或此处描述的方法进行。方法可进一步包含筛选含Fc区变体的单克隆抗体，所述单克隆抗体的CDC反应低于含亲本Fc区的单克隆抗体(即反应降低，优选地至少降低5％、10％、12％、14％、16％、18％、20％或更多)。本发明进一步描述了通过本方法产生的含Fc区变体的单克隆抗体。
在另一实施方案中，本发明提供了下述的分离的核酸分子，即该分子含有编码本发明Fc区变体或其功能片段的核酸分子。更优选的分离核酸分子含有编码包含本发明Fc区变体的多肽的核酸。优选地，由该核酸编码的Fc区多肽变体与变体的亲本Fc区相比含有如表1中所示的一处氨基酸替换。优选地，多肽为单克隆抗体，且更优选地，单克隆抗体为全长抗体或单链抗体。单克隆抗体可为嵌合的、人源化的或人单克隆抗体。
在另一实施方案中，本发明提供了载体，载体优选地(但不限于)为质粒、重组表达载体、酵母表达载体或逆转录病毒载体，前述载体含有编码含本发明Fc区多肽变体的多核苷酸。
在另一实施方案中，本发明提供了包含本发明核酸分子的宿主细胞。本发明的宿主细胞优选地包含一个或多个含本发明核酸分子的载体或构建体。本发明的宿主细胞为导入(例如通过转化、转导、感染、转染、电穿孔等)了本发明载体的细胞，该载体包含编码含本发明Fc区多肽变体的多核苷酸。任选地，可将载体稳定整合到宿主细胞染色体中。宿主细胞类型包括哺乳动物、细菌、植物和酵母细胞。优选的宿主细胞为CHO细胞、COS细胞、SP2/0细胞、NS0细胞、酵母细胞或任何优选细胞类型的衍生物或后代。
在另一实施方案中，本发明提供了包含含有本发明Fc区变体的多肽或其功能片段的药物组合物。多肽优选地为单克隆抗体，更优选地为治疗性单克隆抗体。单克隆抗体可为嵌合的、人源化的或人单克隆抗体。备选地，多肽可为不为抗体的下述多肽，即该多肽与本发明Fc区变体有效连接并共表达时其血清半寿期发生改变并因此可改进多肽的性能。本发明的药物组合物可进一步包含可药用载体。在该药物组合物中，包含Fc区变体的多肽为活性成分。药物组合物优选地包含含有本发明Fc区变体的单克隆抗体的均一或基本均一的群体。用于治疗性使用的药物组合物优选地为无菌并可为冻干体。
本发明提供了抑制哺乳类动物体内蛋白质活性的方法，所述哺乳类动物优选地为人类，其中包含将治疗有效量或预防有效量的包含本发明Fc区变体的多肽(优选地为单克隆抗体)施用给需要治疗的该哺乳类动物。本发明进一步提供了治疗或预防可通过抑制信号转导而得以改善的疾病或紊乱的方法，所述信号转导的抑制由包含本发明Fc区变体的单克隆抗体与抗原表位的结合而实现，该方法包括对需要此治疗或预防的患者(例如人类)施用治疗或预防有效量的本发明的单克隆抗体。
本发明还涉及包含包装材料和多肽的产品，其中在该包装材料中含有包含本发明Fc区多肽变体的多肽。本发明还涉及组合物，所述组合物包含含有此处描述的Fc区变体的单克隆抗体和异源多肽，并包含生理学可接受的或可药用的载体或稀释剂。
在一些实施方案中，本发明提供了多肽，该多肽包含：i)未修饰的人构架区(“FR”)(例如未对天然存在的人构架进行任何修饰)，和ii)Fc区变体。在某些实施方案中，未修饰的人构架为人胚系构架(human germlineframework)。在其它实施方案中，本发明提供了包含多肽的组合物，其中的多肽包含：i)至少一个随机CDR序列和ii)本发明的Fc区变体。在进一步的实施方案中，本发明提供了包含多肽的组合物，其中多肽包含：i)未修饰的人构架(例如人胚系构架)，ii)至少一个随机CDR序列，以及iii)本发明的Fc区变体。
本发明考虑了包含本发明Fc区变体的单克隆抗体异源多肽的治疗性和诊断性用途，并在此公开。
附图说明
图1显示了标记的具有不同区域和片段的IgG分子的图示。
图2显示了多种亲本Fc氨基酸序列的比对，包括人IgG1(含所示的非同种异型和同种异型(SEQ ID NO：1))、人IgG2(SEQ ID NO：2)、人IgG3(SEQ IDNO：3)、人IgG4(SEQ ID NO：4)、鼠IgG1(SEQ ID NO：5)、鼠IgG2A(SEQ IDNO：6)、鼠IgG2B(SEQ ID NO：7)和鼠IgG3(SEQ ID NO：8)。
图3显示了多种氨基酸序列，包括人IgG1的CH2区(SEQ ID NO：9)和CH3区(SEQ ID NO：10)，以及包括CH1、铰链、CH2和CH3区的人IgG1的f同种异型(SEQ ID NO：11)和a，z同种异型(SEQ ID NO：12)的序列。
图4显示了多种氨基酸序列，其中包含：(a)抗CD20抗体(I)的轻链可变区(LCVR)(SEQ ID NO：13)；(b)抗CD20抗体(I)的重链可变区(HCVR)(SEQID NO：14)；(c)抗CD20抗体(II)的LCVR(SEQ ID NO：15)；以及抗CD20抗体(II)的HCVR(SEQ ID NO：16)。图4e显示了包含在抗CD20抗体可变区中的氨基酸序列(参见于2003年5月20日申请的美国临时申请60/471,958和美国专利5,843,439，二者均在此引用)。
图5a显示了抗CD20抗体AME133的轻链的完整氨基酸序列。图5b显示了AME133轻链的完整核酸序列。
图6显示了抗CD20抗体AME133的三个优选变体的完整氨基酸和核酸序列。具体地，图6a显示了247I/339Q变体的重链完整氨基酸序列。图6b显示了247I/339Q变体的重链完整核酸序列。图6c显示了247I/339D变体的重链完整氨基酸序列。图6d显示了247I/339D变体的重链完整核酸序列。图6e显示了378D变体的重链完整氢基酸序列。图6f显示了378D变体的重链完整核酸序列。
发明详述
贯穿本说明书和权利要求书始终，根据如用于Kabat等，Sequences ofProteins of Immunological Interest，第五版，国立卫生院公共健康服务部门，Bethesda，MD(1991)中的EU索引对免疫球蛋白重链(Fc区)中的氨基酸残基进行定位。“如在Kabat中的EU索引”是指人IgG抗体的氨基酸残基编号，且在此处的图2中说明。例如，在438位处，人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和鼠IgG3均为Q氨基酸，而鼠IgG1为I氨基酸，鼠IgG2A为T氨基酸，且鼠IgG2B为K氨基酸。此外，此处所述的替换，其氨基酸位数表示为替换发生的位置，随后的氨基酸是指替换亲本Fc区的同一位置后的氨基酸(例如249G表明甘氨酸残基替换了存在于亲本Fc区249位的氨基酸)。不论亲本Fc区是否为人IgG1，数字均指在人IgG1中的位置；如果亲本Fc区并非人IgG1，则数字指通过与人IgG1比对后该位置在亲本Fc区中的同源位置。
如此处所应用的术语“受试者”和“患者”是指任何可治疗性施用包含本发明Fc区变体的多肽的动物，包括可获益于本治疗的人以及其它哺乳类动物(例如家养动物(如犬、猫)、体育用动物(如马)和食源动物(如牛、猪和绵羊))。
如此处所应用的“治疗或预防”是指与蛋白质水平异常相关的疾病或紊乱通过改变蛋白质的活性或水平而使受试者获益。
术语“分离的”当其用于与核酸相关的情形时，是指从至少一种通常与其天然来源相关的污染核酸中鉴定和分离出的核酸。分离的核酸的存在形式或环境与其天然形式或环境有所不同。分离的核酸因此有别于在天然细胞中存在的核酸分子。分离的核酸分子包括细胞内含有的核酸分子，所述细胞可常规表达该核酸分子所编码的多肽，例如核酸分子存在于质粒中或不同于天然细胞的染色体部位。分离的核酸可以单链或双链形式存在。当应用分离的核酸分子表达蛋白质时，寡核苷酸或多核苷酸可仅含有一条正义或编码链，但也可同时含有正义和反义链(即可为双链)。
对核酸分子进行“有效连接”时，是指将该核酸分子置于另一核酸分子功能性关联中。例如，如果启动子或增强子可影响核酸的编码序列的转录，则前者与后者有效连接；或如果核糖体结合位点定位于可促进翻译的位置，则前者与后者有效连接。编码Fc区变体的核酸分子与编码异源蛋白质(即如同天然存在的不包含Fc区的蛋白质或其功能片段)的核酸分子有效连接时，其位置可使表达的包含异源蛋白质或其功能片段的融合蛋白质毗邻Fc区多肽变体的上游或下游；异源蛋白质可紧邻Fc区多肽变体或可由任意长度和组成的连接体序列与之分隔开来。同样，多肽(此处所用与“蛋白质”同义)分子的“有效连接”是指其置于与另一多肽的功能性关联之中。
如此处所应用的当谈及多肽或蛋白质(如Fc区变体或单克隆抗体)时的术语“功能片段”是指保留了全长多肽的至少一项功能的该蛋白质的片段。片段的长度可在六个氨基酸到全长多肽的完整氨基酸序列减一个氨基酸之间变化。本发明Fc区多肽变体的功能片段保留有至少一处在此定义的“氨基酸替换”。Fc区多肽变体的功能片段保留有至少一种本领域已知的与Fc区关联的功能(例如ADCC、CDC、Fc受体结合、Clq结合、细胞表面受体的下调，或例如与之有效连接的多肽的体内或体外半寿期的延长)。
术语“纯化的”或“纯化”是指从样本中基本移除了至少一种污染物。例如，抗原特异的抗体可通过完全或基本移除(至少90％、91％、92％、93％、94％、95％或更优选地至少96％、97％、98％或99％)至少一种污染的非免疫球蛋白蛋白质而得以纯化；也可通过移除不与同一抗原结合的免疫球蛋白蛋白质而得以纯化。非免疫球蛋白蛋白质的移除和/或不与特定抗原结合的免疫球蛋白的移除可提高样本中抗原特异的免疫球蛋白的比例。在另一实例中，通过完全或基本移除宿主细胞蛋白质而对细菌宿主细胞中表达的多肽(例如免疫球蛋白)进行纯化；样本中多肽的比例因此得以提高。
用于此处的术语“天然的”当其指多肽(例如Fc区)时，表示多肽含有的氨基酸序列由通常存在于自然界中或其天然存在的多态性中的多肽氨酸序列组成。天然多肽(例如天然Fc区)可通过重组方法产生或可从天然存在来源种进行分离。
如此处应用的术语“表达载体”是指包含所需编码序列和下述适宜核酸序列的重组DNA分子，其中适宜核酸序列对于在特定宿主生物体中表达有效连接的编码序列是必需的。
如此处所应用，术语“宿主细胞”是指任何位于体外、原位或体内的真核或原核细胞(例如，细菌细胞如大肠杆菌、CHO细胞、酵母细胞、哺乳细胞、鸟类细胞、两栖类细胞、植物细胞、鱼细胞和昆虫细胞)。例如，宿主细胞可位于转基因动物体内。
如此处所应用的“亲本多肽”为包含下述氨基酸序列的多肽，即该序列可经改变或更改(例如氨基酸替换)以产生变体(即多肽变体)。在优选的实施方案中，亲本多肽包含至少一部分的天然或非天然Fc区，即天然存在的Fc区或具有至少一处氨基酸序列修饰的Fc区。在一些实施方案中，特别考虑了长于或短于亲本多肽的变体。在特别优选的实施方案中，亲本多肽的功能与变体相比有所不同(例如提高或降低的效应子功能、受体结合、体内或体外半寿期等)。
如此处所应用，术语“亲本多肽的变体”是指下述的多肽，即其包含的氨基酸序列与亲本多肽相比存在至少一处氨基酸替换的差异。在某些实施方案中，变体至少包含Fc区的40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％或最优选地至少95％、97％或99％(即Fc区的“部分”)。在优选的实施方案中，亲本多肽的Fc区变体包含至少一处不同于亲本多肽的氨基酸替换，替换位于Fc区。亲本多肽可为或不为天然多肽。
如此处所应用，术语“Fc区”是指免疫球蛋白重链的C末端区(如图1中所示)。“Fc区”可为天然序列Fc区或变体Fc区。尽管通常认为的免疫球蛋白重链Fc区的边界存在差异，但人IgG重链Fc区通常定义为从Cys226或Pro230的氨基酸残基延伸至其羧基端。在一些实施方案为中，变体仅包含部分的Fc区并可包括或不包括羧基末端。免疫球蛋白的Fc区通常包含两个恒定区：CH2和CH3，如在图1其中所显示的。在一些实施方案中，考虑了具有一个或多个恒定区的变体。在其它实施方案中，考虑了不含该恒定区(或仅含部分该恒定区)的变体。
人IgG Fc区的“CH2区”(也称作“Cγ2”区)通常从约第231位氨基酸延伸至约第340位氨基酸(参见图2)。CH2区的独特之处在于其不与其它区密切配对。两个N连接的分支糖链位于完整天然IgG分子的两个CH2区之间。
人IgG Fc区的“CH3区”(也称作“Cγ3”区)通常为从C末端残基延伸至Fc区de CH2区的一段氨基酸残基，从约第341位氨基酸残基延伸至约第447位氨基酸残基(参见图2)。
“功能性Fc区”具有天然序列Fc区的“效应子功能”。与包含天然Fc区或变体的亲本Fc区的多肽相比，包含本发明Fc区变体的多肽的至少一种效应子功能可以得到提高或降低。效应子功能的实例包括但不限于：Clq结合、补体依赖的细胞毒作用(CDC)、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)、吞噬作用、细胞表面受体(例如B细胞受体、BCR)的下调等。该效应子功能的实现可能需要将Fc区与结合结构域(例如抗体可变区)进行有效连接，并可应用多种试验(例如Fc结合试验、ADCC试验、CDC试验、从全血或级分血液样本中的靶细胞消耗等)对其进行测试。
“天然序列的Fc区”或“野生型Fc区”是指其氨基酸序列与通常天然存在的Fc区氨基酸序列完全相同。天然序列人Fc区的示例在图2中显示且其包括天然序列人IgG1 Fc区(f同种异型和a，z同种异型，即非A和A同种异型)、天然序列人IgG2 Fc区、天然序列人IgG3 Fc区和天然序列人IgG4 Fc区及其天然存在的变体。天然序列的鼠Fc区也在图2中显示。
“Fc区变体”包含的氨基酸序列与天然序列Fc区(或其片段)中氨基酸序列的差异在于，前者存在至少一处如此处所定义的“氨基酸替换”。在优选的实施方案中，Fc区变体与天然序列Fc区或多肽亲本Fc区相比存在至少一处氨基酸替换，优选地与天然序列Fc区或多肽亲本Fc区相比存在1、2、3、4或5处氨基酸替换。在一备选实施方案中，Fc区变体可根据此处公开的方法产生，且该Fc区变体可与所选择的异源多肽融合，所述异源多肽如抗体可变区或非抗体多肽，例如受体或配体的结合结构域。
如此处所应用，术语“衍生物”用于与多肽相关的情形时是指多肽包含的氨基酸序列中已经导入了氨基酸残基替换而发生了改变。如此处应用的术语“衍生物”也指已修饰的多肽，所述修饰通过将任何类型的分子与多肽共价连接而实现。例如，但并不限于抗体可通过下述方法进行修饰，如由已知的保护/封闭基团进行糖基化、乙酰化、聚乙二醇修饰、磷酸化、酰胺化、衍生化以及蛋白分解、与细胞配体或其它蛋白质连接等。可应用本领域技术人员公知的方法通过化学修饰产生多肽衍生物，所述修饰包括但不限于特异化学分解、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。此外，多肽衍生物具有与衍生其的多肽相类似或相同的功能。应当理解，包含本发明Fc区变体的多肽可为此处定义的衍生物，衍生优选地发生于Fc区。
如此处应用的谈及多肽(例如Fc区或单克隆抗体)时的“基本为人源”是指多肽含有的氨基酸序列与天然人类多肽的序列的同源性至少为80％、至少为85％，更优选地至少为90％、91％、92％、93％、94％或更优选地至少为95％、95％、97％、98％或99％。
术语“Fc受体”或“FcR”用以描述与Fc区(如抗体的Fc区)结合的受体。优选的FcR为天然序列FcR。此外，优选的FcR为结合IgG抗体的受体(γ受体)且包括FcγRI、FcγRII、FcγRIII受体亚类，包括这些受体的等位变体和备选剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“激活受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，二者具有类似的氨基酸序列，其区别之处主要位于细胞质结构域。在Ravetch和Kinet，年度免疫学综述(Annu.Rev.Immunol).9：457-92(1991)；Capel，等，免疫学方法(Immuno methods)4：25-34(1994)和de Haas等，(实验临床医学杂志)J.Lab.Clin.Med.126：330-41(1995)中对FcR进行了综述。另一优选的FcR包括新生儿受体FcRn，该受体负责将母体IgG转运至胎儿(Guyer等，免疫学杂志(J.Immunol).117：587(1976)和Kim等，免疫学杂志(J.Immunol.)24：249(1994))。包括那些将来鉴定出的其它FcR也包含在此处的术语“FcR”之内。
短语“抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用”和“ADCC”是指下述的细胞介导的反应，其中表达FcR(例如自然杀伤(“NK”)细胞、中性粒细胞和巨噬细胞)的非特异细胞毒性细胞(例如非特异)识别靶细胞上未结合的抗体并随后引起靶细胞的裂解。用于介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。
如此处所应用，短语“效应细胞”是指表达一种或多种FcR并执行效应子功能的白细胞(优选地为人白细胞)。优选的细胞至少表达FcγRIII并行使ADCC效应子功能。介导ADCC的白细胞示例包括PBMC、NK细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和中性粒细胞。效应细胞可分离自天然来源(例如分离自血液或PBMC)。
具有“改变的”FcRn结合亲和性的多肽变体与变体的亲本多肽或包含天然Fc区的多肽相比，其于pH6.0条件下的FcRn结合亲和性增强(即提高的、加强的或更高的)或降低(即减少的、减低的或更小的)。显示与FcRn结合增强或结合亲和性增强的多肽变体与其亲本多肽相比具有更强的FcRn结合亲和性。显示与FcRn结合降低或结合亲和性降低的多肽变体与其亲本多肽相比具有较弱的FcRn结合亲和性。显示与FcRn结合降低的该变体可具有很低的FcRn结合力或检测不到结合，例如具有0-20％的亲本多肽的结合力。与亲本多肽相比以“增强的亲和性”结合FcRn的多肽变体，在应用基本相同数量的多肽变体和亲本多肽且其它条件完全相同的结合试验中，该多肽变体以较亲本多肽更高的结合亲和性结合FcRn。例如，FcRn结合亲和性增强的多肽变体显示出提高的FcRn结合亲和性是亲本多肽相比提高约1.10倍到约100倍(更通常地从约1.2倍到约50倍)，其中FcRn结合亲和性的测定通过如ELISA试验或其它本领域可获得的常用方法实现。
如此处所应用，“氨基酸替换”是指将特定氨基酸序列中至少一个存在的氨基酸残基替换成另一不同的“替换”氨基酸残基。替换残基或残基可为“天然存在的氨基酸残基”(即由遗传密码所编码的)，并选自：丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、蛋氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和缬氨酸(Val)。以一个或多个非天然存在的氨基酸残基替换也包含在此处定义的氨基酸替换之中。“非天然存在的氨基酸残基”是指下述的残基，即其不同于以上列出的天然存在的氨基酸残基，并能够共价结合多肽链中临近的一个或多个氨基酸残基。非天然存在的氨基酸残基的示例包括正亮氨酸、鸟氨酸、正缬氨酸、高丝氨酸以及其它如在Ellman等，酶学方法(Meth.Enzym.)202：301-336(1991)中描述的氨基酸残基类似物。
术语“检测信号”是指从任何检测蛋白质-蛋白质相互作用的方法中输出的信号，包括但不限于，比色试验中的吸光度检测值、荧光强度或每分钟衰变数。检测形式可包括ELISA、facs或其它方法。“检测信号”的改变可反映细胞活力的变化，和/或kinetic off-rate、kinetic on-rate的变化或二者同时发生的变化。“较高试验信号”是指检测的输出值大于另一值(例如与亲本多肽相比变体可具有较高的(较大的)ELISA试验检测值)。“较低”试验信号是指检测的输出值小于另一值(例如与亲本多肽相比变体可具有较低的(较小的)ELISA试验检测值)。
术语“结合亲和性”是指与每一Fc受体-Fc结合相互作用相关联的平衡解离常数(以浓度单位表述)。结合亲和性与动力学解离速率(通常以时间倒数的单位形式报告，例如秒-1)除以动力学结合速率(通常以每单位时间浓度的单位形式报告，例如摩尔/秒)的比值直接相关。除非这些参数均经实验测定(例如通过BIACORE或SAPIDYNE进行检测)，通常并不能清晰阐明平衡解离常数的变化是由于结合速率、解离速率或二者同时存在的差异。
如此处所应用，术语“铰链区”是指人IgG1中从Glu216到Pro230的一段人IgG1氨基酸。其它IgG同种型的铰链区可与IgG1序列进行比对，所述比对通过将组成重链间S-S键的第一个和最后的半胱氨酸残基置于同一位置而实现。
“Clq”为包含用于免疫球蛋白Fc区的结合位点的多肽。C1q连同两个丝氨酸蛋白酶(C1r和C1s)组成CDC通路的第一个成分C1复合体。
如此处所应用，术语“抗体”可与“免疫球蛋白”或“Ig”互换使用，只要其显示所需的生物活性或功能活性，该术语以其广义定义应用并特别地包括单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异抗体(例如双特异抗体)以及抗体片段。包含源自不同物种的部分的单链抗体和嵌合、人、人源化或灵长源化(primatized)(CDR移植的)抗体以及嵌合或CDR移植的单链抗体等也包含在本发明和术语“抗体”之内。可通过常规化学技术、合成技术将抗体的多种部分进行连接，或可应用遗传工程技术制备为连接的蛋白质。例如，可表达编码嵌合或人源化链的核酸以产生连接的蛋白质。参见如U.S.专利号4,816,567、欧洲专利号0,125,023B1、U.S.专利号4,816,397、欧洲专利号0,120,694B1、WO86/01533、欧洲专利号0,194,276B1、U.S.专利号5,225,539、欧洲专利号0,239,400B1和美国专利号5,585,089和5,698,762。另参见，有关灵长源化抗体的Newman，R.等，生物技术(BioTechnology)，10：1455-1460，1993和有关单链抗体的Ladner等，U.S.专利号4,946,778和Bird，R.E.等，科学(Science)，242：423-426，1988。应当理解包含Fc区(或其部分)的所有形式的抗体均包含在此处的术语“抗体”之内。此外，可根据本领域已知的方法将抗体标记以可检测标记、固定在固相表面和/或与异源化合物(例如酶或毒素)共轭连接。
如此处所应用，术语“抗体片段”是指完整抗体的一部分。抗体片段的实例包括但不限于线性抗体；单链抗体分子；Fc或Fc′肽、Fab和Fab片段、以及由抗体片段形成的多特异抗体。抗体片段优选地保留至少部分的铰链并任选地保留IgG重链的CH1区。在其它的优选的实施方案中，抗体片段包含至少部分的CH2区或完整的CH2区。
如此处所应用，术语“功能片段”当其用于与单克隆抗体相关的情形时，意指仍保留功能活性的单克隆抗体的部分。功能活性可为，如抗原结合活性或特异性、受体结合活性或特异性、效应子功能活性等。单克隆抗体功能片段包括，例如，单独的重链或轻链及其片段，如VL、VH和Fd；单价片段，如Fv、Fab和Fab′；双价片段如F(ab′)2；单链Fv(scFv)；和Fc片段。该术语在以下中描述，如Harlowe和Lane，抗体：实验手册(Antibodies：ALaboratory Manual)，冷泉港实验室，纽约(1989)；分子生物学和生物技术：完全参考(Molec.Biology and Biotechnology：A Comprehensive DeskReference)(Myers，R.A.(编辑)，纽约：VCH出版公司；Huston等，细胞生物物理学(Cell Biophysics)，22：189-224(1993)；Pluckthun和Skerra，酶学方法(Meth.Enzymol.)，178：497-515(1989)和Day，E.D.，高级免疫化学(Advanced Immunochemistry)，第二版，Wiley-Liss公司，纽约，NY(1990)。术语功能片段意在包括，例如由蛋白酶消化或还原单克隆抗体而产生的片段，以及由本领域技术人员公知的重组DNA方法产生的片段。
如此处所应用，术语“片段”是指这样的多肽，所述多肽包含另一多肽氨基酸序列中至少5、15、20、25、40、50、70、90、100个或更多连续氨基酸残基的氨基酸序列。在一优选的实施方案中，多肽的片段至少保留全长多肽的一种功能。
如此处所应用，术语“嵌合抗体”包括单价、双价或多价免疫球蛋白。单价嵌合抗体为由嵌合重链和嵌合轻链通过二硫键所形成的双体。双价嵌合抗体为由两个重链-轻链双体通过至少一个二硫键所形成的四聚体。用于人的抗体的嵌合重链包含源自非人抗体重链的抗原结合区，该结合区与至少部分的人重链恒定区连接，所述恒定区如CH1或CH2。用于人的抗体的嵌合轻链包含源自非人抗体轻链的抗原结合区，该结合区与至少部分的人轻链恒定区(CL)连接。也可根据已知的步骤根据单独多肽链的适宜关联制备具有相同或不同可变区结合特异性的嵌合重链和轻链的抗体、片段或衍生物。根据该方法，将表达嵌合重链的宿主与表达嵌合轻链的宿主分开培养，并分别回收免疫球蛋白然后将其连接。备选地，可将宿主共培养并允许链在培养基中自发关联，随后回收可在同一宿主细胞中表达的组装免疫球蛋白或片段或重链和轻链。用于产生嵌合抗体的方法为本领域公知(参见如美国专利号：6,284,471；5,807,715；4,816,567和4,816,397)。
如此处所应用，非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式(即人源化抗体)为包含最少或不包含源自非人免疫球蛋白序列的抗体。最重要的是，人源化抗体为下述的人免疫球蛋白(受者抗体)，其中来自受者高度可变区的残基替换以具有所需特异性、亲和性和接受力的来自非人物种(供者抗体)高度可变区的残基，其中所述非人物种如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类。在一些实例中，人免疫球蛋白的构架区(FR)残基替换以相应的非人类残基。此外，人源化抗体可包含不在受者抗体或供者抗体中存在的残基。通常进行这些修饰以进一步改进抗体性能。通常，人源化抗体将基本包含完整的至少一个且通常为两个的可变区，其中完整或基本完整的高度可变环(CDR)与非人免疫球蛋白的相应部分对应且完整或基本完整的FR残基为人免疫球蛋白序列。人源化抗体也可包含至少一部分的免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常为人免疫球蛋白的恒定区。用于产生人源化抗体的示例性方法在U.S.专利5,225,539中描述。
如此处所应用，术语“免疫粘附素”是指下述抗体样分子，该分子将异种“粘附素”蛋白质(例如受体、配体或酶)的结合结构域与免疫球蛋白的恒定区结合。在结构上，免疫粘附素包含将抗体(即“异种的”)中除抗原识别和结合位点(抗原组合位点)外的具有所需结合特异性的粘附素氨基酸序列与免疫球蛋白的恒定区序列进行的融合。
如此处所应用，术语“配体结合结构域”是指保留有至少性质上的天然受体配体结合能力的任何天然受体或其任何区域或衍生物。在某些实施方案中，受体源自下述的细胞表面多肽，该多肽含有与免疫球蛋白超家族的一个成员同源的胞外结构域。非免疫球蛋白超家族成员但也特异地包含在此处定义内的其它受体，为细胞因子特别是具有酪氨酸激酶活性的(受体酪氨酸激酶)的细胞因子受体，促红细胞生成素受体和神经生长因子受体超家族成员以及细胞黏附分子(例如E-、L-和P-选凝素)受体。
如此处所应用，术语“受体结合结构域”是指用于受体的任何天然配体，包括如细胞黏附分子，或至少性质上保留有相应天然配体受体结合能力的该天然配体的任何区域或衍生物。
如此处所应用，术语“抗体免疫粘附素嵌合体”包含下述分子，即分子中至少一个抗体结合结构域结合有至少一种免疫粘附素。示例包括但不限于，在Berg等，PNAS(USA)88：4723-4727(1991)和Charnow等，酶学方法(J.Immunol.)，153：4268(1994)中描述的双特异CD4-IgG嵌合体。
如此处所应用，“分离的”多肽为从其天然环境组分中鉴定并分离和/或回收的多肽。其天然环境的污染成分为可干扰多肽的诊断或治疗性应用的材料，并可包括酶、激素和其它蛋白性或非蛋白性溶质。在某些实施方案中，分离的多肽经过纯化，(1)其重量高于由Lowry法测定的多肽重量的95％，且优选地高于重量的99％，(2)其纯化程度足以在自旋杯(spinningcup)序列分析仪检测时获得N端或中间氨基酸序列的至少15个残基，或(3)应用考马斯蓝或银染在还原或非还原条件下进行SDS胶电泳时达到同质。分离的多肽包括重组细胞内的原位多肽，这是因为多肽天然环境中的至少一种组分并不存在于细胞内。但通常，需经过至少一个纯化步骤制备分离的多肽。
如此处所应用，术语“治疗”既指治疗性治疗也指预防性或防治性措施。需要治疗的那些受试者或患者包括那些已显现紊乱以及需预防其发生紊乱的个体。
如此处所应用，术语“紊乱”和“疾病”可互换使用并意指任何可获益于多肽变体(包含本发明Fc区变体的多肽)治疗的任何病症，包括慢性和急性紊乱或疾病(如使病人对特定紊乱易感的病理疾病)。在某些实施方案中，紊乱为癌症。在某些实施方案中，术语“自体免疫性疾病”与术语“自体免疫性紊乱”互换施用，并意指受试者中因受试者对其自身的细胞、组织和/或器官的免疫反应而导致的以细胞、组织和/或器官的损伤为特征的病症。术语“炎性疾病”与术语“炎性紊乱”互换使用，意指受试者中以炎症为特征的病症。自体免疫紊乱可与也可不与炎症相关联。此外，自体免疫紊乱可引起也可不引起炎症。某些紊乱可以表征为自体免疫和炎性紊乱二者。
如此处所应用，术语“癌症”和“癌性的”意指或描述哺乳类动物中的一种生理病症，该病症通常以细胞生长失控为特征。癌症的实例包括但不限于，恶性肿瘤、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。此类癌症的更为特定的示例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、恶性胶质瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液管癌、肾癌、肝癌、前列腺癌、阴道癌、甲状腺癌、肝细胞瘤和多种类型的头和颈癌。如此处所应用，术语“标记”是指与多肽直接或间接共轭连接的可检测化合物或组合物。标记可为自身可检测的标记(例如放射性同位素标记或荧光标记)，或在酶性标记的例子中，可对标记催化的底物化合物或组合物的化学改变进行检测。
如此处所应用，术语“受体”是指能够结合至少一个配体的多肽。优选的受体为含有胞外配体-结合结构域并任选地含有其它结构域(例如跨膜结构域、胞内结构域和/或膜锚)的细胞表面或可溶性受体。在此处描述的试验中评估的受体可为完整受体或其片段或衍生物(例如与一个或多个异源多肽融合的包含受体结合结构域的融合蛋白质)。此外，其结合特性待评估的受体可存在于细胞内或可为分离的受体，并任选地可包被在试验平板或其它一些固相表面，或可直接进行标记并用作探针。
如此处所应用，术语“抗体反应性疾病”是指已显示可应用抗体对其进行至少部分性治疗的任何疾病或医学病症。此类疾病和医学病症的示例包括但不限于，淋巴瘤(已显示可应用RITUXAN进行治疗)、感染性疾病(已显示可应用SYNAGIS对呼吸道合胞病毒进行治疗)、肾移植(已显示ZENAPAX对其有效)、节段性回肠炎和类风湿性关节炎(已显示可应用REMICADE对其进行治疗)、乳腺癌(已显示可应用HERCEPTIN对其进行治疗)和结肠癌(已显示可应用EDRECOLOMAB对其进行治疗)。如此处所应用，术语“免疫粘附素反应性疾病”是指已显示可应用免疫粘附素对其进行至少部分性治疗的任何疾病或医学病症。
如此处所应用的与亲本抗体相比“在人效应细胞存在时更有效地介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)”的多肽变体，当试验中应用基本等量的多肽变体和抗体亲本时多肽变体明显可更为有效地在体外或体内介导ADCC。例如，在同一ADCC试验中与亲本多肽相比该变体可引起特定ADCC试验中的更多数量的靶细胞裂解。可应用如ADCC试验对该变体进行鉴定，但也可应用用于测定ADCC活性的其它试验或方法(例如动物模型)。在优选的实施方案中，多肽变体介导ADCC的有效性为亲本多肽的约1.2、1.3或1.4倍、1.5倍、50倍、100倍，约500倍，或约1000倍。
术语“抗体或免疫粘附素反应性疾病的症状”是指那些通常与特定疾病相关联的症状。例如，通常与节段性回肠炎相关的症状，包括腹痛、腹泻、直肠出血、体重减轻、发热、食欲下降、脱水、贫血、肿胀、纤维症、肠炎和营养不良。短语“在该条件下症状得以减轻”是指任何抗体或免疫粘附素反应性疾病中可检测症状的任何程度的数量或质量上的减轻，包括但不限于，对疾病痊愈速度的可检测的影响(例如重量增加的速度)，或至少一种通常与特定疾病相关的症状的减轻(例如如果抗体或免疫粘附素反应性疾病为节段性回肠炎，至少一种以下的症状得以减轻：腹痛、腹泻、直肠出血、体重减轻、发热、食欲下降、脱水、贫血、肿胀、纤维症、肠炎和营养不良)。
单克隆抗体和受体
天然存在的全长抗体(“免疫球蛋白”或“Ig”)为由四条肽链组成的免疫球蛋白分子，其中的两条重(H)链(全长时约为50-70kDa)和两条(L)链(全长时约为25kDa)通过二硫键相互连接。每条链的氨基末端部分包括主要负责抗原识别的约100-110或更多个氨基酸的可变区。每条链的羧基末端部分为主要负责效应子功能的恒定区。
根据特定恒定区的特征将轻链分为κ或λ链。重链分为γ、μ、α、δ或ε链，并分别定义抗体的IgG、IgM、IgA、IgD和IgE同种型。每一重链类型的特征由特定恒定区表征。
每条重链由一重链可变区(此处称作“HCVR”)和一重链恒定区组成。重链恒定区由用于IgG、IgD和IgA的3个结构域(CH1、CH2和CH3)，或用于IgM和IgE的4个结构域(CH1、CH2、CH3和CH4)组成。每条轻链由轻链可变区(此处称作“LCVR”)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由至少一个结构域CL组成。HCVR和LCVR区可进一步再分为称作互补决定区(CDR)的高度可变区，间隔以称作构架区(FR)的更为保守的区域。每一HCVR和LCVR由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。每一结构域中氨基酸的排列与公知的惯例一致[例如Kabat，“Sequences ofProteins of Immunological Interest”国立卫生院，Bethesda，Md.(1991)]。抗体与特定抗原结合的功能性由六个CDR共同决定。但是，仅包含三个抗原特异CDR的单一可变区也可具有识别和结合抗原的能力，但其亲和性要低于完整的Fab。
可应用本领域公知的杂交瘤技术生产本发明的单克隆抗体，也可应用重组技术、噬菌体展示技术、合成技术或本领域已知的此类技术的组合进行生产。用于此处的术语“单克隆抗体”并不仅限于由杂交瘤技术产生的抗体。“单克隆抗体”是指源自单一拷贝或克隆的抗体，而并非根据其产生的方法而得以命名，所述拷贝或克隆包括如任意的原核、真核或噬菌体克隆。“单克隆抗体”可为完整(全部或全长)抗体、基本完整的抗体、抗体的功能片段，或可为嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。
“单克隆抗体”的群体，是指均一或基本均一的(或纯的)抗体群体(即至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％更优选地至少约97％或98％或最优选地至少99％的抗体群体完全相同，并可在ELISA试验中竞争同一抗原或表位)。
此处应用的术语“特异结合”或“优选结合”是指下述的情形，即除其特异结合对应物外，特异结合对的成员并不明显地与其它分子结合。术语也可用于下述的情形，其中如本发明抗体的抗原结合区特异结合由多种抗原所携带的某一特定抗原表位，在此情况下携带抗原结合区的特异抗体将能够与携带抗原表位的多种抗原结合。
Fc区是指完整抗体(例如IgG)的一部分，该部分可通过木瓜蛋白酶的酶消化而产生(参见图1)。Fc区为一同型二聚体，其中的每一链均由部分铰链区以及CH2和CH3区组成。Fc区的二聚体形式归于铰链区间形成的链间二硫键和CH3结构域间的多个非共价键。IgG是体内含量最多的一类Ig，构成约75％的总免疫球蛋白且其在血管内池和血管外池中均衡分布。在对抗原反应的初级反应阶段仅产生很少量的IgG，但在二级反应中IgG为主要形式的生成抗体。
如上所述，抗体含有参与非抗原结合功能的区域，主要为CH2和CH3区。这些区域和部分连接序列一起通常称作Fc区，并具有由结合效应分子所介导的几种效应子功能。
抗体Fc区介导的效应子功能可分为两类：(1)在抗体结合抗原之后所执行的效应子功能(这些功能包括如参与补体级联反应或具有Fc受体(FcR)的细胞)；和(2)不依赖抗原结合而执行的效应子功能(这些功能赋予例如，在血循环中持续存在以及由细胞转运介导的跨细胞屏障的能力)。例如，补体的C1q组分与抗体的结合激活补体系统。在调理作用发生后，补体在参与裂解细胞病原中起到重要作用。补体活化也激发炎性反应并可参与自体免疫超敏状态。此外，抗体通过Fc区与细胞结合，即通过抗体上的Fc受体结合位点与细胞的FcR结合。存在对不同类型抗体特异的多种FcR，所述抗体包括IgG、IgE、IgA和IgM。而本发明并不限于任何特定的机制，抗体与细胞表面的FcR结合引发一系列重要的且多样的生物反应，包括对抗体包被颗粒的吞噬和破坏、免疫复合物的清除、由杀伤细胞执行的对抗体包被靶细胞的裂解(ADCC)、炎性介质的释放、胎盘转运以及免疫球蛋白的生成调控。
与抗体Fc区结合的FcR介导多种抗体效应子功能。根据FcR对免疫球蛋白同种型的特异性对FcR进行定义；用于IgG抗体的Fc受体称作FcγR，用于IgE的Fc受体为FcεR，用于IgA的Fc受体为FcαR，等等。已鉴定出三个亚类的Fcγ：FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)。
由于每一亚类的FcγR由两个或三个基因编码，且备选的RNA剪接可导致产生多种转录物，因此在FcγR同种型中存在显著的多样性。编码FcγRI亚类(FcγRIA、FcγRIB和FcγRIC)的三个基因聚簇于1号染色体长臂的Iq21.1区；编码FcγRII同种型(FcγRIIA、FcγRIlB和FcγRIIC)的基因和编码FcγRIII(FcγRIIIA和FcγRIIIB)的两个基因均聚簇于1q22区。这些不同FcR亚型在不同的细胞类型表面表达(例如Ravetch和Kinet，年度免疫学综述(Annu.Rev.Immunol).9：457-492(1991))。例如，在人类，FcγRIIIB仅存在于中性粒细胞表面，而FcγRIIIA存在于巨噬细胞、单核细胞、NK细胞和T细胞亚群的表面。特别地，FcγRIIIA存在于NK细胞表面，该细胞为参与ADCC的细胞类型中的一种。
人FcγRIIIA(CD16)受体通常在其胞外结构域的第158位具有多态性，该部位可编码苯丙氨酸或可编码缬氨酸。FcγRIIIA的V等位基因与F等位基因相比具有更高的人IgG1亲和性。V158等位基因也可更有效地介导ADCC。临床数据已显示在接受Rituxan治疗的患者的FcγRIIIA受体基因型与治疗反应之间存在关联。临床、分子学反应以及康复时间均显示FcγRIIIA-158V基因型为纯合子(约占群体的20％)的患者具有较好的治疗反应。反之，杂合子或亲和性较低的FcγRIIIA-158F基因型纯合子患者(约占群体的80％)对治疗的反应不佳。这些数据提示增强158F携带者ADCC活性的Fc突变可提高基于抗体的癌症治疗的临床功效。人FcγRIIA(CD32)受体胞外结构域中第131位也存在遗传多态性，在该位置可编码组氨酸(H)或可编码精氨酸(R)。已发现131位多态性可影响受体与人IgG结合的能力。最近的数据显示FcγRIIA第131位多态性与对Rituxan的临床反应之间存在关联。H131等位基因为纯合子的患者的反应速度明显高于其它两组患者。
FcγRI、FcγRII和FcγRIII为免疫球蛋白超家族(IgSF)受体；FcγRI在其胞外结构域中含有三个IgSF结构域，而FcγRII和FcγRIII在其胞外结构域中仅含有两个IgSF结构域。Fc受体的其它类型为新生儿Fc受体(FcRn)。FcRn的结构与主要组织相容性复合体(MHC)类似，且其由与β2-微球蛋白非共价结合的α链组成。
Fc区变体
本发明提供了多肽变体、编码多肽变体的核酸序列以及用于产生多肽变体的方法。优选地，本发明的多肽变体区别于亲本多肽之处在于多肽变体中含有至少一处氨基酸修饰，修饰优选地为氨基酸替换。“亲本”、“野生型”、“起始的”或“非变体”多肽优选包含至少部分的抗体Fc区且多肽变体中的氨基酸替换发生于Fc区内。可应用本领域可获得的用于产生含Fc区或其部分的多肽的技术制备包含Fc区的亲本多肽。在优选的实施方案中，亲本多肽为抗体。但是，亲本多肽可为包含至少部分Fc区的任何其它多肽(例如免疫粘附素)。亲本多肽中的Fc区部分可为源自天然或非天然的序列，优选地为人源的天然序列。在某些实施方案中，可产生Fc区变体(例如根据此处公开的方法)，也可将变体与选择的异源多肽多进行融合，所述异源多肽如受体或配体的抗体可变区或结合结构域，或任意的治疗性多肽。
在优选的实施方案中，亲本多肽包含Fc区或其功能性部分。一般而言，亲本多肽的Fc区包含Fc区的天然序列，并优选地为人Fc区的天然序列。但是，亲本多肽的Fc区也可含有一个或多个来自Fc区天然序列中已存在的氨基酸序列改变或修饰(例如氨基酸替换)。例如，Fc区的Clq结合活性可能已预先发生了改变或Fc区的FcγR结合亲和性可能已经发生了改变。可构建所需的Fc区变体或编码目标Fc区变体的核酸但并不将其与所需的Fc区变体的融合对应物(例如抗体可变区、异源蛋白质)有效连接，而是随后再进行有效连接。在进一步的实施方案中，多肽亲本Fc区可为概念性Fc区(例如一个构思或计算机或文件中的视觉显示)而非实际存在，可根据所需Fc区变体氨基酸序列实施抗体遗传工程并产生包含该序列的多肽，或产生包含编码所需Fc区变体氨基酸序列的DNA的多肽。但在优选的实施方案中，可获得编码多肽亲本Fc区的核酸并将此核酸序列进行改变以产生编码Fc区变体的核酸序列变体。
可通过本领域公知的方法制备编码亲本多肽的变体(或简称Fc区变体)的核酸，制备时根据当前用于特定序列的说明书的指导而进行。这些方法包括但不限于，对先期制备的编码多肽的核酸进行定点(或寡核苷酸介导的)突变、PCR突变(例如Vallette等，核酸研究(Nuc.Acids Res).17：723-733(1989)和盒式诱变(例如Wells等，基因(Gene)34：315-323(1985)来制备Fc区变体核酸。定点突变为用于变体制备的优选方法。该技术为本领域公知(参见如Carter等，核酸研究(Nucleic Acids Res).13：4431-4443(1985)和Kunkel等，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci).USA 82：488(1987))。
备选地或额外地，可确定编码多肽变体的目的氨基酸序列，并通过合成方法产生编码该多肽变体氨基酸序列的核酸序列(即多肽为包含Fc区变体的多肽，所述Fc区变体包含此处描述的氨基酸替换)。仍将此方法产生的序列视为亲本Fc区的Fc区变体，尽管亲本Fc区并未用作Fc区变体的分子前体，而是应用不含目的氨基酸替换的存在于亲本中的Fc区氨基酸序列。
可对亲本多肽的氨基酸序列进行修饰以产生下述的Fc区变体，其中所述变体的体外和/或体内Fc受体结合亲和性或活性发生改变；和/或其体外和/或体内ADCC活性发生改变；和/或其体外和/或体内CDC活性发生改变。可对亲本多肽的氨基酸序列进行修饰以产生补体结合特性和/或循环半寿期发生改变的Fc区变体。
可通过选择氨基酸替换以实现对Fc区生物特性的显著修饰，所述替换对改变下述效应存在显著差异，(a)替换区多肽骨架的结构，如片层或螺旋构象，(b)靶位点分子的电荷或疏水性，或侧链的大小(d)与碳水化合物的相互作用，或(e)结构域运动的灵活性。基于侧链通常的特征将天然存在的残基分为以下几类：
(1)疏水性：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；
(2)中性亲水性：cys、ser、thr；
(3)酸性：asp、glu；
(4)碱性：asn、gln、his、lys、arg；
(5)影响链方向的残基：gly、pro；以及
(6)芳香的：trp、tyr、phe。
非保守替换是指这些类别残基中的一个成员与其它类别的成员进行交换。保守替换是指这些类别残基中的一个成员与同一类别的其它成员进行交换。
如在以下实施例中所显示的，可改造Fc区变体以使其活性(一种或多种效应子功能和/或药物动力学)发生改变。例如在一个方法中，对Fc区的一个或多个氨基酸残基进行修饰以改变(例如提高或降低)ADCC活性、CDC活性或FcRn结合亲和性。在优选的实施方案中，修饰为如此处表1中所列出的替换。一般而言，需对此处鉴定的影响ADCC活性的一个或多个Fc区残基进行氨基酸替换以产生该Fc区变体。在优选的实施方案中，将替换不超过一个到约十个Fc区残基。此处包含一个或多个氨基酸替换的Fc区将优选地保留亲本Fc区序列或天然人Fc区序列的约至少80％，并优选地保留至少约90％，且最优选地保留至少约95％。
可通过将一个或多个适宜氨基酸序列修饰导入亲本Fc区产生下述Fc变体，即其(与亲本Fc区相比时)(a)在人效应细胞存在时介导ADCC的效率提高或降低，和/或(b)在人类补体存在时介导CDC的效率提高或降低，和/或(c)以所需亲和性结合C1q，和/或(d)以所需的亲和性结合Fcγ受体(FcγR)或Fc新生儿受体(FcRn)。该Fc区变体通常在Fc区中包含至少一处氨基酸修饰。修饰优选地为氨基酸替换，更优选地为如此处表1-9中所列出的氨基酸替换。
在优选的实施方案中，多肽亲本Fc区为人Fc区或其功能片段，例如人IgG1(f和a，z同种异型)、IgG2、IgG3、IgG4的天然人Fc区，以及任何物种中已知或已发现的所有同种异型。该区域含有那些如此处图2(SEQ IDNO：1-8)和图3(SEQ ID NO：9-12)中所示的天然序列。
在某些实施方案中，为产生ADCC活性增强的Fc区变体，亲本多肽优选地具有已存在的ADCC活性(例如亲本多肽包含人IgG1或人IgG3 Fc区)。在一些实施方案中，变体的ADCC活性高于亲本多肽(例如根据此处描述ADCC试验与亲本多肽相比其具有更高的活性水平)，即包含Fc区变体的单克隆抗体在相同的环境下与包含亲本Fc区或天然IgG1、IgG3 Fc区序列的单克隆抗体相比其ADCC活性提高，其中所比较的抗体的其余部分完全相同。
在优选的实施方案中，将一处或多处氨基酸替换导入Fc区的CH2和/或CH3结构域。在优选的实施方案中，以亲本Fc区为模板产生包含人IgG Fc区的此类变体。
在某些实施方案中，为产生CDC活性提高的Fc区变体，亲本多肽优选地具有已存在的CDC活性。在一些实施方案中，变体的CDC活性高于亲本多肽(例如根据此处描述的CDC试验与亲本多肽相比其具有更高的活性水平)，即包含Fc区变体的单克隆抗体在相同的环境下与包含亲本Fc区或天然IgG1、IgG3 Fc区序列的单克隆抗体相比其CDC活性提高，其中所比较的抗体的其余部分完全相同。
根据多肽的所需或预期的用途，可对此处描述的多肽变体进行进一步的修饰。该修饰可包括，如氨基酸序列的进一步改变(一处或多处氨基酸残基替换、插入和/或缺失)、碳水化合物修饰、一个或多个异源多肽的融合和/或共价修饰。与此处公开的可改变Fc受体结合和/或ADCC活性和/或CDC活性的一处或多处氨基酸修饰相比，该进一步修饰可早于其、与其同时或随之后进行。
备选或额外地，将氨基酸修饰与改变Fc区Clq结合和/或CDC功能的一个或多个的进一步氨基酸修饰进行组合是有益的。例如，起始多肽可能不能结合Clq和/或介导CDC，可根据此处的方法进行修饰以使其获得这些进一步的效应子功能。此外，已具有Clq结合活性的多肽，为使其任选地具有介导CDC的能力，可对其进行修饰以使这些活性中的一个或两个均得以提高(或备选地使其降低)。改变Clq结合和/或修饰CDC活性的特定Fc区氨基酸修饰在此处描述(参见表2、7、8和10)，以及如在WO0042072中描述。
如上所公开的，可设计具有增强的效应子功能的Fc区或其部分，例如通过修饰CDC活性和/或ADCC活性而实现。例如，可产生其CDC活性和ADCC活性提高的Fc区变体。备选地，需要降低或缺失其效应子功能时，可将Fc变体进行改造以使其CDC活性降低和/或ADCC活性降低。在其它实施方案中，可仅提高这些活性中的一种，并任选地也可降低其它活性，例如产生ADCC活性提高但CDC活性降低的Fc区变体，反之亦然。此外，可改造Fc区变体以对其与FcRn、蛋白质A和/或其它Fc结合蛋白质的结合亲和性进行修饰。
在一些实施方案中，本发明提供了包含亲本多肽的变体的组合物，其中亲本包含Fc区(或其部分)，且其中的变体在Fc区中包含至少一处表面残基氨基酸修饰(参见如Deisenhofer，生物化学(Biochemistry)，20：2361-70，1981年四月和WO0042072)。在其它实施方案中，本发明提供了包含亲本多肽的变体的组合物，所述亲本多肽含有Fc区，其中的变体在Fc区中包含至少一处非表面残基氨基酸修饰。在进一步的实施方案中，本发明提供了包含亲本多肽的变体的组合物，所述亲本多肽含有Fc区，其中的变体包含至少一处表面残基氨基酸修饰和至少一处非表面残基氨基酸修饰，其中所述表面和非表面残基氨基酸修饰均位于Fc区。
组合变体
在一些实施方案中，本发明的Fc区变体包含两处或多处氨基酸修饰(例如替换)。可通过下述方法产生该组合变体，例如通过筛选出如以上祥列的两处或多处氨基酸替换(例如参见表1)或除本领域已知的一处替换外筛选出如表1中所列的一处或多处氨基酸替换。
可在一系列的试验中(参见以下的实施例)测试表10中所示的组合变体以及其它组合变体(如将WO0042072中公开的那些替换用于此处公开的那些组合中)的特定活性(如FcRn结合活性、ADCC活性和CDC活性)。在此方面，可鉴定有用的组合。
在某些优选的实施方案中，本发明Fc区变体中存在多处氨基酸替换，其中的一处氨基酸替换提高了包含Fc区变体的多肽的ADCC活性，且一处氨基酸修饰提高了包含Fc区变体的多肽的新生儿Fc受体(FcRn)结合亲和性(例如在pH6.0时)。在其它实施方案中，本发明的组合变体在本发明Fc区变体中含有一处表面氨基酸和一处非表面氨基酸修饰。可通过下述方法产生本发明Fc区变体中的其它组合变体，即通过将此处描述的两处或多处氨基酸替换组合，或通过将至少一处的此处描述的氨基酸替换与如在WO0042072中描述的替换进行组合。
测试多肽变体
本发明提供了用于筛选Fc区变体或包含本发明Fc区变体的多肽的试验。筛选试验可用于发现或确认有用的变体。例如，可对组合变体(参见如表10)进行筛选以发现下述变体，即该变体的FcR结合发生改变和/或ADCC和/或CDC活性发生改变(例如ADCC或CDC活性提高或降低)和/或其耗损靶细胞(如B细胞)的能力发生改变。另，如下所述，可应用本发明的试验发现或确认在受试者(例如显示出抗体或免疫粘附素反应性疾病的症状的人)中具有益治疗活性的变体。可应用多种试验类型评估变体中存在的与亲本多肽相比的任何改变(如在WO0042072中提供的筛选试验)。进一步的示例性试验在以下描述。
在优选的实施方案中，多肽变体(即包含本发明Fc区变体或其功能部分的多肽)为下述的单克隆抗体，即该抗体与亲本多肽相比基本上保留有特异结合抗原(通过未修饰的抗原结合区或修饰的抗原结合区)的能力(例如其结合能力优选地低于亲本多肽结合能力的20倍、10倍、7倍或低于约5倍)。可应用下述技术测定多肽变体与抗原的结合能力，如ELISA、荧光激活的细胞分选(FACS)分析或放射免疫沉淀(RIA)，例如可应用FcR结合试验评估本发明的变体。例如，可应用ELISA试验中结合多肽变体的抗体滴定多肽变体并检测未结合的多肽变体来检测如FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIII、FcRn等的Fc受体的结合(参见以下的实施例)。例如，可在标准ELISA试验中筛选包含抗体的变体以测定其在pH6.0、pH7.0或pH7.4条件下与FcRn的结合。可应用包被以链亲和素或中性亲和素(neutravidin)的固相表面从任何物种中捕获生物素标记的FcRn，所述物种如小鼠或人。封闭后，将捕获的受体与pH6.0或pH7.0的缓冲液中稀释的多肽变体(例如抗体)孵育。在下一步骤中加入人抗体特异的分子(例如与酶连接的山羊(Fab′)2抗人-Fab)。之后可加入底物以测定在pH6.0、pH7.0或pH7.4时与固定的FcRn结合的多肽变体的数量。可将该试验的结果与亲本(非变体)多肽结合同一FcR的能力进行比较。在其它优选的实施方案中，进行变体筛选的ELISA试验的组合物(例如含FcRn)包装于试剂盒内(例如含使用说明书)。
也可应用ADCC试验筛选本发明的变体。ADCC试验可于体外或体内进行。为评价多肽变体的ADCC活性，可应用不同的效/靶比进行体外ADCC试验。在一示例性ADCC试验中可应用表达以下任何靶抗原的靶细胞系：CD20、CD22、CD33、CD40、CD63、EGF受体、her-2受体、前列腺特异的膜抗原、LewisY糖、GD2和GD3神经节苷脂、lamp-i、CO-029、L6和ephA2。效应细胞可获自健康供者(例如在实验当天获得)以及应用Histopaque(Sigma)纯化的PBMC。然后将靶细胞与包含本发明Fc区变体的IgG预孵育，例如以0.1-1,000ng/ml浓度孵育约30分钟随后与效应细胞以特定效/靶比混合，所述效/靶比如40∶1、20∶1和10∶1。然后可应用细胞毒性检测试剂盒(Roche Molecular Biochemicals)以比色法检测ADCC活性，前述试剂盒根据从损伤细胞胞液中释放到上清中的乳酸脱氢酶(LDH)的活性对细胞死亡和裂解进行定量。也可应用铬包被的靶细胞试验测定ADCC活性，所述试验通过检测产生的铬51释放而实现。也可通过检测抗体存在条件下从靶细胞和效应细胞中释放的LDH活性来测定非抗体依赖的细胞毒性。在靶细胞和效应细胞混合物中加入1％Triton X-100后可对完全释放进行测定。可将靶细胞和效应细胞于37℃及5.0％CO2环境中以优化的时间(0.54-18小时)进行孵育，且然后离心试验平板。然后可将上清转移到96孔板中并与LDH检测试剂于25℃孵育30分钟。然后可应用微板读取器检测490nm处的吸光值。然后应用以下公式计算细胞毒性百分比：％细胞毒性＝实验值-低对照/高对照-低对照×100％。然后可将抗CD20和变体的细胞毒性百分比与等量RITUXAN的百分比直接进行比较以提供相对有效性的检测值。一示例性ADCC试验可应用CD20抗原过表达的SKW6.4细胞(例如购自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection))作为靶细胞源。该试验的多种改变形式为本领域公知(例如Zuckerman等，CRC CritRev Microbiol 1978；7(1)：1-26)。
用于该试验的有用效应细胞包括但不限于，NK细胞、巨噬细胞和其它PBMC。备选或额外地，可体内评估本发明多肽变体的ADCC活性，例如在Clynes等，PNAS(USA)95：652-656(1998)中公开的动物模型中进行。
也可用补体活化筛选本发明的变体。为评价补体活化，可进行CDC试验(参见如Gazzano-Santoro等，免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)，202：163(1996))。例如，可以缓冲液将多肽变体和人类补体稀释成多种浓度。可将表达结合多肽变体的抗原的细胞稀释为1×106个细胞/ml的密度。将变体多肽化合物、稀释的人类补体和表达抗原的细胞加到组织培养96孔平底板并于37℃和5％CO2条件下孵育2小时以促进补体介导的细胞裂解。然后在每孔中加入50微升alamar blue(Accumed International)并于37℃过夜孵育。应用96孔荧光计以530nm处激发和590nm处发射检测吸光值。可以相对荧光单位(RFU)表述结果。可根据标准曲线计算样本浓度并报告目标多肽变体与非多肽变体相比的活性百分比。
在某些实施方案中，本发明的多肽变体并不活化补体或补体活化能力很低。例如，在此试验中与不含IgG1 Fc区突变的对照抗体相比多肽变体显示出约0-10％的CDC活性。优选地，变体在以上CDC试验中并不显示出任何CDC活性(例如高于背景值)。在其它实施方案中，发现本发明的多肽变体与亲本多肽相比其CDC提高(例如当比较IC50值时其显示出的体外或体内CDC活性优选地约提高1.1、1.5、1.7或2倍到约100倍(或更高))。
也可用全血试验中的靶细胞耗损筛选本发明的多肽变体。例如，可在全血试验中应用facs筛选具有CD20靶特异性的多种浓度的多肽变体的B细胞耗损(Vugmeyster等，2003血细胞计数(Cytometry)52A，101-109)。将新鲜抽取的血液与多种浓度的多肽变体于37℃和5％CO2条件下孵育4小时(孵育时间可以变化)。孵育过后，应用氯化铵试剂(Beckton-Dickinson目录号555899)根据说明书裂解血红细胞并应用荧光标记的B细胞特异抗体(如抗CD19)通过facs检测B细胞。结果可表述为相对于未处理样本或相对于与不相关(非耗损)抗体孵育样本的B细胞耗损百分比。
在优选的实施方案中，多肽变体耗损B细胞的效率高于亲本多肽。多肽变体对B细胞的耗损可为亲本多肽的如约2倍或更高，并优选地约5倍或更多。另外，变体可显示出更大的B细胞耗损潜能。例如，耗损相同比例的B细胞时，所应用的变体小于所应用亲本多肽抗体的约5倍，且优选地小于约10倍。变体所介导的靶细胞耗损能力与亲本多肽相比可提高约2倍、3倍、5倍到约1000倍或更多，并优选地提高从约5倍到约1000倍。
也可体内筛选本发明的变体。可应用任何类型的体内试验。以下提供了一种试验类型的特定实施例。该示例性试验允许在体内对Fc变体进行临床前评价。可将受试变体引入已知具有某些活性的特定抗体的Fc区中。例如，可通过突变将变体引入到抗CD20 IgG的Fc区。该操作允许应用RITUXAN(已知可促进肿瘤的衰退)对亲本IgG和Fc变体IgG直接进行比较。临床前评估可于2期进行(药物动力学和药效期)。I期药物动力学研究的目标是确定Fc变体IgG和具有已知体内活性的抗体(例如RITUXAN)间在清除速率方面是否存在差异。清除速率的差异可导致产生血清中IgG的稳定期水平的差异。如此，如果检测到稳定期浓度存在差异的话，应对其进行标准化以保证所实施比较的准确性。在此情况下，II期药物动力学研究的目标是确定Fc变体对肿瘤生长的影响。先期对RITUXAN的研究应用可完全抑制肿瘤生长的单一剂量。由于单一剂量不能够检测出定量性差异，所以应该使用一剂量范围进行试验。
可应用如以下的方法对Fc变体、野生型亲本Fc和RITUXAN进行I期药物动力学比较。首先，可将每只动物静脉内注射40μg(或其它受试剂量)并在0、0.25、0.5、1、24、48、72、96、120、168和336小时时对血浆IgG的水平进行定量。可对数据进行分析，例如应用药物动力学程序(WinNonLin)中应用的零位延迟两室药物动力学模型来获得清除速率。根据以下的公式应用清除速率定义稳定期血浆水平：C＝剂量/(清除数率×t)，其中T为用药间隔且C为稳定期血浆水平。药物动力学实验可在非荷瘤的小鼠上进行，例如，每时间点至少应用5只小鼠。
可应用示例性动物模型以下列方法进行下一期实验。在CB17-SCID小鼠的右侧腰窝处皮下接种106个Raji细胞。接种细胞后立即静脉施用变体Fc抗体、野生型Fc抗体和RITUXAN并持续施用直到肿瘤的直径大于2cm。每周一、周三和周五应用卡钳测量肿瘤的长、宽和高并计算肿瘤的体积(肿瘤体积＝长×宽×高)。肿瘤体积对时间作图以得出肿瘤生长速度并用于药物动力学计算。每组应应用至少10只动物。
应用下述方法对变体Fc抗体、野生型Fc抗体和RITUXAN进行II期药物动力学比较。基于已发表数据，RITUXAN在10μg/g每周剂量时完全抑制肿瘤在体内的生长(Clynes等，天然药物(Nat.Med).6：443-6，2000)。因此，可应用从10μg/g、5μg/g、1μg/g、0.5μg/g到0μg/g的每周剂量范围进行试验。根据稳定期血浆水平与效力间的关系通过绘图计算出可将肿瘤生长速度抑制50％的稳定期血浆水平。也可根据以上所述计算稳定期血浆水平。如果需要，可对根据各自的药物动力学特性对用于每一变体Fc抗体和野生型Fc抗体的τ值作出相应调整以获得与RITUXAN可比较的稳定期血浆水平。与亲本多肽(例如野生型Fc抗体)和RITUXAN相比，变体Fc抗体具有统计学意义的药物动力学水平的提高，通常表明该变体Fc抗体具有改进的体内活性。
也可根据如前所述的方法在猕猴中对变体Fc抗体、野生型Fc抗体和RITUXAN进行进一步的药物动力学比较(Reff等，血液(Blood)83，435-445，1994)。也可应用对外周B细胞和淋巴结B细胞耗损的剂量反应比较Fc变体对野生型Fc和RITUXAN的相对效能，所述比较通过静脉内和/或皮下施用进行。与亲本多肽(例如Fc野生型)和RITUXAN相比，Fc变体其具有统计学意义的药物动力学水平的提高，通常表明变体Fc抗体具有改进的体内活性。
在进一步的实施方案中，对本发明的变体(即包含本发明Fc区变体或其功能部分的多肽)进行筛选以鉴定出可用于至少两个物种的治疗性应用的该变体。此处将此类变体称作“双物种改进变体(dual-species improvedvariants)”，并特别可用于鉴定出在人类中具有疗效并也在动物模型中显示(或可能显示)出功效的变体。在此方面，本发明提供了用于鉴定很有可能获得批准并进行人的临床试验的变体的方法，这是由于此处的动物模型数据将可能支持由政府管理机构(例如美国食品和药品管理局(U.S.Foodand Drug Administration))所制定的用于人的试验用途。
在某些实施方案中，双物种改进变体的鉴定通过以下方法进行，首先应用人效应细胞进行ADCC试验以发现改进变体，且然后应用小鼠、大鼠或非人灵长类效应细胞进行第二次ADCC试验以鉴定出改进变体的亚类，即双物种改进变体。在一些实施方案中，本发明提供了用于鉴定双物种改进变体的方法，包括：a)提供：i)靶细胞，ii)包含具有至少部分Fc区的亲本多肽的候选变体的组合物，其中候选变体的Fc区中包含至少一处氨基酸替换，且其中候选变体在第一物种(例如人)效应细胞存在时所介导的靶细胞细胞毒性的效率高于亲本多肽，以及iii)第二物种(例如小鼠、大鼠或非人灵长类)效应细胞，和b)在特定条件下将组合物与靶细胞孵育以使候选变体与靶细胞结合并由此产生结合有候选变体的靶细胞，c)将第二物种效应细胞与结合候选变体的靶细胞混合，以及d)检测由候选变体介导的靶细胞细胞毒性。
在某些实施方案中，方法进一步包括步骤e)，确定在第二物种效应细胞存在时候选变体介导的靶细胞细胞毒性的效率是否高于亲本多肽。在一些实施方案中，方法进一步包括步骤f)，从候选变体中鉴定出双物种改进变体，所述双物种改进变体在第二物种效应细胞存在时所介导的靶细胞细胞毒性的效率高于亲本多肽。在优选的实施方案中，随后将鉴定的双物种变体在一种或多种动物试验中进行体内筛选。
在某些实施方案中，通过以下步骤鉴定双物种改进变体，首先应用人血液进行全血试验以发现改进的变体，且然后应用小鼠、大鼠或非人灵长类血液进行第二次全血试验以鉴定出改进变体的亚类，即双物种改进变体。在一些实施方案中，本发明提供了用于鉴定双物种改进变体的方法，包括：a)提供：i)靶细胞，ii)包含具有至少部分Fc区的亲本多肽的候选变体组合物，其中候选变体Fc中包含至少一处氨基酸替换，且其中候选变体在第一物种(例如人)效应细胞存在时所介导的靶细胞耗损的效率高于亲本多肽，和iii)第二物种(例如小鼠、大鼠或非人灵长类)血液，和b)在特定条件下将组合物与靶细胞孵育以使候选变体与靶细胞结合并由此产生结合候选变体的靶细胞，c)将第二物种血液与结合有候选变体的靶细胞混合，以及d)检测由候选变体介导的靶细胞耗损。在某些实施方案中，方法进一步包括步骤e)，确定在第二物种血液存在时候选变体所介导的靶细胞耗损的效率是否高于亲本多肽。在一些实施方案中，方法进一步包括步骤f)，从候选变体中鉴定出双物种改进变体，所述双物种改进变体在第二物种血液存在时所介导的靶细胞耗损的效率高于亲本多肽。在优选的实施方案中，随后将鉴定的双物种变体在一种或多种动物试验中进行体内筛选。
在某些实施方案中，通过任意的上述试验鉴定双物种改进变体，所述试验应用人组分(例如人细胞、人FcR等)鉴定出改进变体，且然后应用非人动物组分(例如小鼠细胞、小鼠FcR等)进行相同试验(或不同的试验)。在此方面，可鉴定出下述变体亚类，即根据特定标准该变体亚类在基于人的试验和基于第二物种的试验中均有良好表现。
用于鉴定双物种改进变体的示例性方法如下所述。首先，对编码至少部分IgG Fc区的核酸序列进行突变，以使表达的氨基酸序列中含有至少一处氨基酸改变，由此产生变体。然后应用人PBMC或亚类(例如NK细胞或巨噬细胞)在ADCC试验中对表达的该IgG变体进行表征。如果发现其ADCC活性增强，则应用小鼠或大鼠PBMC进行第二次ADCC试验以对变体进行筛选。备选或额外地，可试验变体与克隆的啮齿动物受体或细胞系的结合。最后，如果在第二次试验中发现变体的性能得到改进，则将其作为双改进变体(dual-improved variant)，然后在小鼠或大鼠中体内筛选变体。
示例性的含Fc区变体的分子
本发明的Fc区变体可为较大分子的一部分。较大的分子可为如单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、双特异抗体、免疫粘附素等。此外，本发明的Fc区变体可与非抗体多肽有效连接，以使该多肽的半寿期发生改变(延长或缩短)。如此，本发明的Fc区变体显而易见地具有广泛的用途。
包含Fc区变体的抗体
在优选的实施方案中，含Fc区变体的分子(例如多肽)为抗体。用于产生抗体的技术在以下描述。
(i)抗原筛选和制备
一般而言，当包含Fc区变体的分子为抗体时，抗体可靶向目标抗原。优选地，抗原为多肽，且将抗体施用给罹患下述疾病或紊乱的哺乳类动物后可在该哺乳类动物中产生疗效，其中所述的疾病或紊乱可获益于抗原性分子数量或活性的降低。但是，也可应用靶向非多肽抗原(如肿瘤相关的糖脂类抗原；参见美国专利5,091,178)的抗体。
抗原的示例包括但不限于分子如肾素、生长激素(包括人生长激素和牛生长激素)、生长激素释放因子、甲状旁腺激素、促甲状腺激素、脂蛋白、α-i-抗胰蛋白酶、胰岛素A链、胰岛素B链、胰岛素原、促卵泡激素、降钙素、促黄体激素、胰高血糖素、凝血因子(如因子VIIIC、因子IX、组织因子(TF)和病毒胞吞因子(von Willebrands factor))、抗凝血因子(如蛋白质C)、心房钠利尿因子、肺表面活性剂、纤溶酶原激活物(如尿激酶或人尿或组织类型纤溶酶原激活物(t-PA))、铃蟾肽、凝血酶、造血生长因子、肿瘤坏死因子-α和-β、脑啡肽酶、RANTES(对激活T细胞正常表达和分泌的调控)、人巨噬细胞炎性蛋白质(MIP-1-α)、血清白蛋白(如人血清白蛋白)、Muellerian抑制物、松弛素A链、松弛素B链、松弛素原、小鼠促性腺激素相关肽、微生物蛋白质(如β-内酰胺酶)、DNA酶、IgE、细胞毒性T淋病细胞相关的抗原(CTLA)(如CTLA-4)、抑制素、激动素、血管内皮生长因子(VEGF)、激素或生长因子受体、蛋白质A或D、风湿因子、神经营养因子(如骨源神经营养因子(BDNF)、神经营养因子-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5、或NT-6)或神经生长因子)、血小板源生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(如FGF和FGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子(TGF)(如TGF-α和TGF-β，包括TGF-1、TGF-2、TGF-3、TGF-4或TGF-5、胰岛素样生长因子I和I1(IGF-I和IGF-II)、des(1-3)-IGF-I(brain IGF-I)、胰岛素样生长因子结合蛋白质、CD蛋白(如CD3、CD4、CD8、CD19和CD20)、促红细胞生成素、骨诱导因子(osteoinductive factors)、免疫毒素、骨形态生成蛋白(BMP)、生长分化因子(例如GDF8)、干扰素(如干扰素-α、-β和-γ)、集落刺激因子(CSFs)，如M-CSF、GM-CSF和G-CSF、白介素(ILs)，例如IL-I到IL-25、过氧化物歧化酶、T-25细胞受体、表面膜蛋白质、促衰变因子、病毒抗原，如AIDS的部分膜、转运蛋白、归巢受体、定居素、调控蛋白、整联蛋白(如CD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA4和VCAM)、肿瘤相关抗原(如HER2、HER3或HER4受体)、生长激素释放激素、凋亡通路的成员以及任何以上所列多肽的片段或前体。
优选的抗原包括但不限于，CD蛋白质(如CD3、CD4、CD8、CD19、CD20和CD34)；ErbB受体家族的成员(如EGF受体、HER2、HER3或HER4受体)；细胞黏附分子(如LFA-1、Macl、pI50.95、VLA-4、ICAM-1VCAM、a4/p7整联蛋白和(Xv/p3整联蛋白，包括5或其亚单位(例如抗CDI Ia、抗CD18或抗CDI lb抗体))；生长因子(如VEGF)；组织因子(TF)；α干扰素(α-IFN)；生长分化因子(如GDF-8)；白介素(如IL-8)；IgE；血型抗原；flk2/flt3受体；肥胖(OB)受体；mpl受体；CTLA-4；蛋白质C和生长激素释放激素。
任选地与其它分子连接的可溶性抗原或其片段可用作免疫原以产生抗体。对于如受体的跨膜分子，可将该分子的片段(例如受体的胞外结构域)用作免疫原。备选地，可将表达跨膜分子的细胞用作免疫原。此类细胞可来自天然来源(例如癌症细胞系)或可为经重组技术转染并表达跨膜分子的细胞。用于制备抗体的其它抗原及其形式为本领域的技术人员公知。
(ii)多克隆抗体
本发明提供了具Fc区变体的多克隆抗体。例如，可将含修饰的IgGl恒定区的全套人免疫球蛋白移植到免疫球蛋白失活的小鼠体内，以产生表达含修饰Fc区的全套IgG的小鼠(参见如Mendez，MJ等，自然遗传学(NatureGenetics)15：146(1997))。优选地将相关抗原和佐剂多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射动物以生成多克隆抗体。将相关抗原与对待免疫动物具有免疫原性的蛋白质(例如钥孔血蓝素、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂)进行连接可能是有益的，所述连接应用双功能或衍生制剂进行(例如用于通过半胱氨酸残基连接的马来酰亚胺苯甲酰基磺基琥珀酰亚胺酯(maleimidobenzoyl sulfosuccinimide ester)，用于通过赖氨酸残基连接的N-羟基琥珀酰亚胺，以及戊二醛、琥珀酸酐、SOC12或R1N＝C＝NR，其中的R和R1为不同的烷基基团)。
用于免疫兔和小鼠的常用方法的示例如下所述。用抗原、免疫佐剂或通过组合产生的衍生物免疫动物，例如，将100μg或5μg的蛋白质或缀合物(例如分别用于兔或小鼠)加以3倍体积的弗氏完全佐剂并将溶液以多点皮内注射动物。一个月后应用1/5或1/10初始量的溶于完全佐剂中的肽或缀合物多点皮下注射动物进行加强免疫。七到十四天后，采取动物的血液并测试血清的抗体滴度。对动物进行加强免疫直至滴度达到平台期。优选地，应用与不同蛋白质缀合和/或通过不同交联剂缀合的同一抗原的缀合物对动物进行加强免疫。也从重组细胞培养物中以融合蛋白质形式制备缀合物。此外，如明矾这样的聚集剂也适用于增强免疫反应。
(iii)单克隆抗体
本发明提供了含Fc区变体的单克隆抗体。可通过多种方法制备单克隆抗体，包括应用杂交瘤技术(如由Kohler等，自然(Nature)，256：495，1975所描述的)或通过重组DNA方法(如U.S.专利号4,816,567)制备。
应用杂交瘤技术时，免疫小鼠或其它的适宜宿主动物如仓鼠或猕猴，以诱导产生产生淋巴细胞，所述淋巴细胞产生或能够产生与免疫的蛋白质特异结合的抗体。备选地，可体外免疫淋巴细胞。然后应用适宜的融合剂将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞，所述融合剂如聚乙二醇。将此方法制备的杂交瘤细胞接种在适宜的培养基中培养，所述培养基优选地包含一种或多种可抑制未融合亲本骨髓瘤细胞的生长或存活的物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，杂交瘤细胞培养基中通常包含次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶(HAT培养基)，这些物质可抑制HGPRT缺陷细胞的生长。
优选的骨髓瘤细胞为下述细胞，即可高效融合、支持由所筛选的抗体产生细胞中稳定并高水平地产生抗体并对如HAT的培养基敏感。其中，优选的骨髓瘤细胞系为鼠骨髓瘤系，如可从索尔克研究院细胞发送中心(SalkInstitute Cell Distribution Center)，San Diego，California USA获得的源自MOPC-21和MPC-1 I小鼠肿瘤的细胞系，以及可从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)，Rockville，Maryland USA获得的SP-2或X63-Ag8-653细胞。也有报道应用人骨髓瘤和小鼠-人杂交骨髓瘤细胞系生产人单克隆抗体(例如Kozbor，免疫学杂志(J.Immunol.)，133：3001(1984))。
对培养杂交瘤细胞的培养基中产生的针对抗原的单克隆抗体进行测定。优选地，通过免疫沉淀或通过如RIA或ELISA的体外结合试验测定由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。在鉴定出可产生具有所需特异性、亲和性和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，可将克隆通过有限稀释方法进行亚克隆并用标准方法培养。用于此目的的适宜培养基包括，如D-MEM或RPMI-1640培养基。此外，也可将杂交瘤细胞以动物的腹水瘤形式进行体内培养。通过适宜的常规免疫球蛋白纯化方法从培养基、腹水或血清中分离出由亚克隆分泌的单克隆抗体，所述纯化方法如蛋白质A-琼脂糖凝胶、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析、或亲和层析。
可容易地应用常规方法对编码单克隆抗体的DNA进行分离并测定其序列(例如通过应用能够与编码单克隆抗体重链和轻链的基因特异结合的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞可用作该DNA的优选来源。分离后，可将DNA置于表达载体中，将其转染并不产生免疫球蛋白的宿主细胞，以使其在重组细胞中合成单克隆抗体，其中所述宿主细胞如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞。抗体的重组生产方法在以下详述。
在一些实施方案中，应用在如McCafferty等，自然(Nature)，348：552554(1990)中所描述的技术从抗体噬菌体文库中分离抗体或抗体片段。在Clackson等，自然(Nature)，352：624-628(1991)和Marks等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)，222：581-597(1991)中分别描述了应用噬菌体文库分离鼠和人抗体。随后的出版物描述了应用链改组产生高亲和性(nM范围)的人抗体(Marks等，生物技术(BioTechnology)，10：779-783(1992))，以及应用组合感染和重组策略构建巨大噬菌体文库(例如Waterhouse等，核酸研究(Nuc.Acids.Res.)，21：2265-2266(1993))。因此，这些技术以及类似技术可作为杂交瘤技术的可行性备选，所述杂交瘤技术为本领域公知的用于单克隆抗体分离的技术。另外，可对DNA进行修饰，如用人重链和轻链恒定区的编码序列替换鼠同源序列(例如U.S.专利号4,816,567和Morrison，等，Proc.Nat.Acad.Sci USA，81：6851(1984)或将免疫球蛋白的编码序列与全部或部分的非免疫球蛋白多肽的编码序列共价连接。
通常以非免疫球蛋白多肽替换抗体的恒定区，或替换抗体中抗原结合位点的可变区，以产生嵌合双价抗体，该双价抗体包含对一种抗原特异的一个抗原结合位点和对另一抗原特异的另一抗原结合位点。
(iv)人源化抗体和人抗体
本发明提供了含有本发明Fc区变体的人源化抗体和人抗体。在优选的实施方案中，人源化抗体包含人抗体的氨基酸序列以及来自非人抗体的氨基酸残基。在一些实施方案中，人源化抗体中的人序列包含构架区(“FR”)以及包含一个或多个CDR的来自非人抗体的序列或残基。需指出的是，可根据重链和VL区中氨基酸残基的编号对FR和CDR进行定义。术语CDR意指存在于多肽重链和轻链可变区中的非连续的抗原结合位点。这些区域在以下定义，Kabat等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)252：6609-6616(1977)和Kabat等，目标免疫球蛋白的序列(sequence of proteins of ImmunologicalInterest)(1991)；“Kabat”，Chothia等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)196：901-917(1987)；“Chothia”和MacCallum等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol)262：732-745(1996)；“MacCallum”，其中的定义在互相比较时包括氨基酸残基的重叠和亚集。然而，这些定义单独(如Kabat定义)或组合(仅为示例方法，Kabat和Chothia组合定义)的任何用于表示抗体(包括人源化抗体)CDR的应用也意在包括于此处定义和应用的术语的范围之内。
另外，术语“构架”当其用于与抗体可变区相关的情形时意指抗体可变区中CDR区之外的所有氨基酸残基。因此，可变区构架的长度在约100-120个氨基酸之间，但仅意指那些位于CDR之外的氨基酸。术语“构架区”意指由CDR分隔的每一个构架区域。因此，对于由Kabat定义的VH区和DCR的特定示例，构架区1(FRI)对应于包含1-30位氨基酸的可变区区域；构架区2(FR2)对应于包含36-49位氨基酸的可变区区域；构架区3(FR3)对应于包含66-94位氨基酸的可变区区域；以及构架区4(FR4)对应于从第103位氨基酸到其末端的可变区区域。轻链的FR也类似地由每一个轻链可变区CDR分隔。类似地，应用Chothia或MacCallum的CDR定义，或DCR定义的任何组合，构架边界由以上描述的各自CDR末端分隔。尽管存在多种CDR定义，在一些实施方案中，优选地应用Kabat定义来定义CDR。
并非来自人抗体的人源化抗体中的残基可为源自或取自其它物种(包括但不限于小鼠)的残基或序列，或这些序列可为插入人源化抗体序列中的随机氨基酸序列(例如由随机化核酸序列产生)。如上所指出，人源化抗体中人氨基酸序列优选地为FR，而来自非人抗体(无论其源自另一物种还是源自随机氨基酸序列)的残基优选地与CDR对应。但在一些实施方案中，一个或多个FR中可包含一个或多个非人氨基酸残基。而在对人构架进行改变或修饰(例如通过导入非人残基)的例子中，改变或修饰的FR可能紧邻来自其它物种的修饰CDR或随机CDR序列，而在其它实施方案中，改变的FR并非紧邻来自其它物种的改变的CDR序列或随机CDR序列。在一些实施方案中，人源化抗体的构架序列完全为人序列(即并不对人构架进行构架改变)。在优选的实施方案中，人源化抗体的构架序列完全为人胚系序列(即并不对人胚系构架进行构架改变)。
来自其它物种的非人氨基酸残基或随机序列，通常称为“引入”残基，这些残基一般取自“引入”的可变区。可基本根据Winter及其合作者的方法进行人源化(例如Jones等，自然(Nature)，321：522-525(1986)；Riechmann等，自然(Nature)，332：323-327(1988)；Verhoeyen等，科学(Science)，239：1534-1536(1988))，所述人源化操作通过用啮齿动物(或其它哺乳动物)CDR或CDR序列替换人抗体的相应序列而实现。另，也可产生下述抗体，其中将几乎完整的人可变区被替换为非人物种的相应序列(例如美国专利4,816,567)。实践中，人源化抗体通常为下述人抗体，即将其中的一些CDR残基并可能将一些FR残基替换成啮齿动物抗体中类似位点的残基，或如上所描述，将其中的CDR序列替换以随机序列。以下仅为非限定性实施例，用于将供者CDR结合亲和性赋予抗体受者可变区构架的方法在WO01/27160A1和美国专利申请序列号09/434,870和09/982,464中描述。
用于人源化抗体制备的人可变区的选择对于降低抗原性至关重要，对轻链和重链而言均为如此。根据所谓“最适”方法，应用已知人可变区序列的完整文库筛选待人源化的啮齿动物抗体可变区序列。然后选择与啮齿动物相应序列最为接近的人序列作为人源化抗体的人构架(例如Sims等，免疫学杂志(J.Immnunol.)，151：2296(1993)和Chothia等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)，196：901(1987))。另一方法中应用源自轻链或重链特定亚组的所有人抗体共有序列的特定构架。同一构架可用于多种不同的人源化抗体(例如Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285(1992)；Presta等，免疫学杂志(J.Immunol.)，151：2623(1993))。
在其它实施方案中，并不需要“预选择”特定的人抗体构架(即不需要选择与待人源化的特定候选抗体的同源性或序列一致性最为接近的人构架)。在这些实施方案中，可应用共同或通用的人构架以接受一个或多个非人CDR。在优选的实施方案中，将单一的通用完整人构架用作待人源化的所有抗体的构架，而不考虑其与候选抗体构架的序列同源性。基于此，可不对构架区进行任何改变而产生人源化抗体。该通用的完整人构架可接受一个或多个CDR序列。在一个实施方案中，一个或多个CDR序列为来自其它物种(例如小鼠或大鼠)抗体的CDR序列，所述序列与其它物种完整抗体中的相应CDR相比经过了修饰(即将CDR导入通用人构架的同时对其进行了修饰)。与其它物种完整抗体中相应CDR相比，修饰与一处或多处氨基酸修饰(在修饰的CDR中)对应。在一个实施方案中，CDR中的所有氨基酸残基均包括在文库内，而在其它实施方案中，并非所有的CDR氨基酸残基均包括在文库内。在另一实施方案中，替换CDR序列的一个或多个CDR序列为随机序列。
在优选的实施方案中，抗体经过人源化以使其保留高抗原亲和性以及其它有益的生物特性。在一些实施方案中，人源化抗体的抗原亲和性高于相应非人源化、完整抗体或其片段及部分(例如候选啮齿动物抗体)的亲和性。在此方面，在一些实施方案中，通过分析亲本序列多种概念性人源化产物制备人源化抗体，其中所述的分析方法应用亲本和人源化序列的三维模型实现。三维免疫球蛋白模型易于获得并为本领域技术人员熟知。可获得下述计算机程序，所述程序阐明并展示筛选的候选免疫球蛋白序列的可能三维构像结构。对这些展示的观察允许对残基在候选免疫球蛋白序列的功能中所起到的可能作用进行分析。据此方法，可从受者中筛选、组合FR残基并输入序列以获得所需的抗体特征，如增强的靶抗原亲和性。通常，CDR残基直接并最显著地参与对抗原结合的影响。
可应用本领域技术人员公知的多种特定方法将抗体CDR(或替换抗体CDR的随机序列)导入抗体构架中(参见如，U.S.申请09/434,879和09/982,464)。在一些实施方案中，可应用重叠的寡核苷酸合成抗体基因或其部分(如编码人源化抗体的基因)。在其它实施方案中，可应用Kunkel(见下文)方法对抗体模板进行突变，例如导入修饰的CDR或随机序列以替换CDR。在一些实施方案中，对轻链和重链可变区分别进行人源化，且然后共表达为人源化可变区。在其它实施方案中，人源化可变区组成完整抗体的可变区。在一些实施方案中，已对包含人源化可变区的完整抗体的Fc区进行了修饰(例如已在Fc区进行了至少一处氨基酸修饰)。例如，以随机CDR进行人源化且构架未改变的抗体可在其Fc区中包含至少一处的氨基酸修饰。
在其它实施方案中，应用下述转基因动物(例如小鼠)，即对该动物进行免疫时能够产生完整人抗体库而不产生任何内源性免疫球蛋白。例如，已有报道嵌合和胚系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合型缺失可完全抑制内源性抗体的产生。将人胚系免疫球蛋白基因阵列转移到胚系突变小鼠中，在抗原免疫时将导致产生人抗体(参见如Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：2551(1993)和Jakobovits等，自然(Nature)，362：255-258(1993))。人抗体也可源自噬菌体展示文库(例如Hoogenboom等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)，227：381(1991)和Vaughan等，自然生物技术(Nature Biotech)14：309(1996))。
本发明提供了用于产生下述人源化抗体(和抗体片段)的方法，所述抗体的Fc区中包含至少一处如此处表1中所列的氨基酸替换(与包含无氨基酸替换的Fc区的亲本多肽相比)。以下讨论了用于产生此类人源化抗体的其它方法。本发明也提供了包含由这些方法产生的抗体和抗体片段的组合物。重要的是，以下讨论的人源化方法可与其它人源化方法(如以上所讨论的)进行组合，以用于本发明的Fc区变体。在此方面，可根据本发明构建包含具有改变了的且独特的Fc区的人源化抗体。
在一些实施方案中，提供了构建改变的VH区编码核酸群体的方法，包括：a)提供第一和第二参考氨基酸序列的代表，第一参考序列包含供者VH区序列，供者可变区包含由Kabat和Chothia联合定义的i)FR和ii)三个CDR；第二参考序列包含含有FR的受者VH区序列；b)合成编码受者VH区FR部分的第一寡核苷酸，其中的FR部分与第二参考序列相比较为未修饰序列；以及合成第二寡核苷酸群体，每一寡核苷酸编码i)至少一部分的经修饰的第一CDR，第一CDR选自HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中修饰的第一CDR与第一参考序列的相应供者CDR相比在一个或多个位点包含不同的氨基酸，以及编码ii)能够与第一寡核苷酸杂交的未修饰FR的一个或多个部分；c)将第一寡核苷酸与第二寡核苷酸群体混合以生成重叠的寡核苷酸；和d)在特定条件下处理重叠的寡核苷酸以构建改变的VH区编码核酸群体，其中由改变的VH区编码核酸所编码的FR与第二参考序列相比为未修饰序列。
在其它实施方案中，提供了构建改变的VL区编码核酸群体的方法，包括：a)提供第一和第二参考氨基酸序列的代表，第一参考序列包含供者VL区序列，供者可变区包含由Kabat和Chothia联合定义的i)FR和ii)三个CDR；第二参考序列包含含有FR的受者VL区序列；b)合成编码受者VL区FR部分的第一寡核苷酸，其中的FR部分与第二参考序列相比为未修饰序列；以及合成第二寡核苷酸群体，每一核苷酸编码i)至少一部分的经修饰的第一CDR，第一CDR选自LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中修饰的第一CDR与第一参考序列的相应供者CDR相比在一个或多个位点包含不同的氨基酸，以及编码ii)能够与第一寡核苷酸杂交的未修饰FR的一个或多个部分；c)将第一寡核苷酸与第二寡核苷酸群体混合以生成重叠寡核苷酸；和d)在特定条件下处理重叠的寡核苷酸以构建改变的VL区编码核酸群体，其中由改变的VL区编码核酸所编码的FR与第二参考序列相比为未修饰序列。
在一些实施方案中，考虑了构建改变的VH区编码核酸群体的方法，包括：A)提供第一和第二参考氨基酸序列的代表，第一参考序列包含供者VH区序列，供者可变区包含由Kabat和Chothia联合定义的i)FR和ii)三个CDR；第二参考序列包含含有FR的受者VH区序列；B)合成第一寡核苷酸群体，每一寡核苷酸编码至少一部分的第一CDR，第一CDR选自HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中修饰的第一CDR与第一参考序列的相应供者CDR相比在一个或多个位点包含不同的氨基酸；以及合成第二寡核苷酸，其编码i)受者VH区FR的部分，其中的FR部分与参考序列相比为未修饰序列，以及编码ii)能够与第一寡核苷酸群体杂交的CDR的一个或多个部分；C)将第一寡核苷酸群体与第二寡核苷酸混合以生成重叠寡核苷酸；和D)在特定条件下处理重叠的寡核苷酸以构建改变的VH区编码核酸群体，其中由改变的VH区编码核酸所编码的FR与第二参考序列相比为未修饰序列。
在其它实施方案中，提供了构建改变的VL区编码核酸群体的方法，包括：A)提供第一和第二参考氨基酸序列的代表，第一参考序列包含供者VL区序列，供者可变区包含由Kabat和Chothia联合定义的i)FR和ii)三个CDR；第二参考序列包含含有FR的受者VL区序列；B)合成a)第一寡核苷酸群体，每一核苷酸编码至少一部分的第一CDR，第一CDR选自LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中修饰的第一CDR与第一参考序列的相应供者CDR相比在一个或多个位点包含不同的氨基酸；以及合成b)第二寡核苷酸，其编码i)受者VL区FR的部分，其中的FR部分与参考序列相比为未修饰序列，以及ii)能够与第一寡核苷酸群体杂交的CDR的一个或多个部分；C)将第一寡核苷酸与第二寡核苷酸群体混合以生成重叠寡核苷酸；和D)在特定条件下处理重叠的寡核苷酸以构建改变的VL区编码核酸群体，其中由改变的VL区编码核酸所编码的FR与第二参考序列相比为未修饰序列。
在一些实施方案中，第一和第二参考序列以电子形式展示。在一些实施方案中，方法进一步包括以下的步骤，(e)将改变的VH区编码核酸群体与轻链可变区编码核酸共表达，以产生改变的异聚体可变区的多样性群体。在一些实施方案中，合成包括化学合成步骤。在一些实施方案中，受者为人。在一些实施方案中，处理步骤(d)包括由聚合酶进行的延伸。
在其它实施方案中，考虑了构建改变的VH区编码核酸群体的方法，包括：a)提供第一和第二参考氨基酸序列的代表，第一参考序列包含供者VH区序列，供者可变区包含由Kabat和Chothia联合定义的i)FR和ii)三个CDR；第二参考序列包含VH区；b)合成改变的VH区抗体基因序列群体，其中改变的VH区的FR与第二参考序列的FR完全相同，且改变的抗体的可变区中至少第一CDR经过了修饰，其中修饰的第一CDR与第一参考序列的相应供者CDR相比在一个或多个位点包含不同的氨基酸。
在其它实施方案中，考虑了构建改变的VL区编码核酸群体的方法，包括：a)提供第一和第二参考氨基酸序列的代表，第一参考序列包含供者VL区序列，供者可变区包含由Kabat和Chothia联合定义的i)FR和ii)三个CDR；第二参考序列包含含有FR的受者VL区序列；b)合成改变的VL区抗体基因序列群体，其中改变的VL区的FR与第二参考序列的FR完全相同，且改变的抗体的VL区中至少第一CDR经过了修饰，其中修饰的第一CDR与第一参考序列的相应供者CDR相比在一个或多个位点包含不同的氨基酸。
在一些实施方案中，第一和第二参考序列以电子形式展示。在一些实施方案中，方法进一步包括将改变的VL区编码核酸群体与VH区编码核酸进行共表达的步骤，以产生改变的异聚体可变区的多样性群体。在一些实施方案中，受者为人。在一些实施方案中，合成步骤包括应用重叠的寡核苷酸。
而在其它实施方案中，考虑了构建改变的VH区编码核酸群体的方法，包括：a)提供参考氨基酸序列的代表，参考序列包含含有FR的受者VH区序列；b)合成改变的VH区抗体基因序列群体，其中改变的VH区的FR与参考序列的FR完全相同，且改变的抗体的可变区中至少第一CDR中包含随机氨基酸序列。
在其它实施方案中，考虑了构建改变的VL区编码核酸群体的方法，包括：a)提供参考氨基酸序列的代表，参考序列包含含有FR的受者VL区序列；b)合成改变的VL区抗体基因序列群体，其中改变的VL区的FR与参考序列的FR完全相同，且改变的抗体的VL区中至少第一CDR中包含随机氨基酸序列。
而在其它实施方案中，考虑了构建改变的VH区编码核酸群体的方法，包括：a)提供参考氨基酸序列的代表，参考序列包含含有FR的人受者VH区序列；b)合成改变的VH区抗体基因序列群体，其中改变的VH区的FR与人参考序列的FR完全相同，且改变的抗体的可变区中至少第一CDR中包含随机氨基酸序列。在一些实施方案中，人参考序列以电子形式展示。
在其它实施方案中，考虑了构建改变的VL区编码核酸群体的方法，包括：a)提供参考氨基酸序列的代表，参考序列包含含有FR的人受者VL区序列；b)合成改变的VL区抗体基因序列群体，其中改变的VL区的FR与人参考序列的FR完全相同，且改变的抗体的VL区中至少第一CDR包含随机氨基酸序列。
在一些实施方案中，参考序列以电子形式展示。在一些实施方案中，方法进一步包括将改变的VL区编码核酸群体与VH区编码核酸进行共表达的步骤，以产生改变的异聚体可变区的多样性群体。在一些实施方案中，合成步骤包括应用重叠的寡核苷酸。在一些实施方案中，CDR由Kabat定义所限定。
在一些实施方案中，通过导入一个或多个修饰CDR并对一个或多个FR同时进行修饰。在其它实施方案中，修饰的构架与修饰的CDR毗临。
在一些实施方案中，本发明提供了构建改变的VH区编码核酸群体的方法，包括：a)提供第一和第二参考氨基酸序列的代表，第一参考序列包含供者VH区序列，供者可变区包含由Kabat和Chothia联合定义的i)FR和ii)三个CDR；第二参考氨基酸序列包含含有FR的受者VH区序列；b)合成a)包含编码修饰的VH区FR或其部分的寡核苷酸的寡核苷酸第一群体，其中VH区FR或其部分与受者构架区参考序列相比在一个或多个位点含有多个改变的氨基酸，其中改变的构架部位选自第二参考序列的受者构架部位，所述受者构架部位与第一参考序列的供者构架部位的相应部位相比存在差异；和b)寡核苷酸第二群体，其每一寡核苷酸编码i)至少一个修饰的CDR或其部分，其中修饰的CDR或其部分与相应供者CDR氨基酸参考序列相比，在一个或多个部位含有不同的氨基酸，以及编码ii)能够与寡核苷酸第一群体杂交的临近FR的一个或多个部分；和c)将寡核苷酸的第一和第二群体混合以产生重叠的寡核苷酸；和d)在特定条件下处理重叠的寡核苷酸以构建改变的VH区编码核酸群体。在某些实施方案中，第一和第二参考序列以电子形式展示。在其它实施方案中，方法进一步包括以下步骤，(e)将改变的VH区编码核酸与VL区编码核酸共表达以产生改变的异聚体可变区的多样性群体。在额外的实施方案中，合成步骤包括化学合成。在一些实施方案中，受者为人。在优选的实施方案中，改变的异聚体可变区的一个或多个多样性群体为包含Fc区的抗体部分，其中与含Fc区的亲本多肽相比Fc区包含至少一处氨基酸替换。
在其它实施方案中，本发明提供了构建改变的VL区编码核酸群体的方法，包括：a)提供第一和第二参考氨基酸序列的代表，第一参考氨基酸序列包含供者VL区序列，供者可变区包含由Kabat和Chothia联合定义的i)FR和ii)三个CDR；第二参考氨基酸序列包含含有FR的受者VL区序列；b)合成a)包含编码修饰的VL区FR或其部分的寡核苷酸的寡核苷酸第一群体，其中VL区构架区或其部分与受者构架区参考序列相比在一个或多个位点含有多个改变的氨基酸，其中改变的构架部位选自第二参考序列的受者构架部位，所述第第二参考序列受者构架部位与第一参考序列供者构架部位的相应部位相比存在差异；和b)寡核苷酸第二群体，其每一寡核苷酸编码i)至少一个修饰的CDR或其部分，其中修饰的CDR或其部分与相应供者CDR氨基酸参考序列相比，在一个或多个部位含有不同的氨基酸，以及编码ii)能够与寡核苷酸第一群体杂交的临近FR的一个或多个部分；和c)将寡核苷酸的第一和第二群体混合以产生重叠的寡核苷酸；和d)在特定条件下处理重叠的寡核苷酸以构建改变的VL区编码核酸群体。在某些实施方案中，第一和第二参考序列以电子形式展示。在其它实施方案中，方法进一步包括以下步骤，(e)将改变的VL区编码核酸与重链可变区编码核酸共表达以产生改变的异聚体可变区的多样性群体。
在一些实施方案中，方法包括：a)提供第一和第二参考氨基酸序列的代表，第一参考氨基酸序列包含供者VH区序列，供者可变区包含由Kabat和Chothia联合定义的i)FR和ii)三个CDR；第二参考氨基酸序列包含含有FR的受者VH区序列；b)合成a)包含编码修饰的VH区构架区或其部分的寡核苷酸的寡核苷酸第一群体，其中VH区FR或其部分与受者FR参考序列相比在一个或多个位点含有多个改变的氨基酸，其中改变的构架部位选自第二参考序列的受者构架部位，所述第第二参考序列受者构架部位与第一参考序列供者构架部位的相应部位相比存在差异；和b)寡核苷酸第二群体，其每一寡核苷酸编码i)至少一个修饰的CDR或其部分，其中修饰的CDR或其部分与相应供者CDR氨基酸参考序列相比，在一个或多个部位含有不同的氨基酸，以及编码ii)能够与寡核苷酸第一群体杂交的临近FR的一个或多个部分；和c)将寡核苷酸的第一和第二群体混合以产生重叠的寡核苷酸；和d)在特定条件下用DNA聚合酶延伸重叠的寡核苷酸以构建改变的VH区编码核酸的群体。
而在其它实施方案中，本发明提供了构建改变的VL区编码核酸群体的方法，包括：a)提供第一和第二参考氨基酸序列的代表，第一参考氨基酸序列包含供者VL区序列，供者可变区包含由Kabat和Chothia联合定义的i)FR和ii)三个CDR；第二参考氨基酸序列包含含有FR的受者VL区序列；b)合成a)包含编码修饰的VL区FR或其部分的寡核苷酸的寡核苷酸第一群体，其中VL区FR或其部分与受者FR参考序列相比在一个或多个位点含有多个改变的氨基酸，其中改变的构架部位选自第二参考序列的受者构架部位，所述第第二参考序列受者构架部位与第一参考序列供者构架部位的相应部位相比存在差异；和b)寡核苷酸第二群体，其每一寡核苷酸编码i)至少一个修饰的CDR或其部分，其中修饰的CDR或其部分与相应供者CDR氨基酸参考序列相比，在一个或多个部位含有不同的氨基酸，以及编码ii)能够与寡核苷酸第一群体杂交的临近FR的一个或多个部分；和c)将寡核苷酸的第一和第二群体混合以产生重叠的寡核苷酸；和d)在特定条件下用DNA聚合酶延伸重叠的寡核苷酸以构建改变的VL区编码核酸的群体。
在一些实施方案中，将一个或多个修饰导入构架的同时导入一个或多个修饰的CDR。修饰的CDR与参考序列的相应CDR相比可包含一处或多处氨基酸改变。在某些实施方案中，构建改变的VH区编码核酸群体的方法包括：a)提供第一和第二参考氨基酸序列的代表，第一参考氨基酸序列包含供者VH区序列，供者可变区包含由Kabat和Chothia联合定义的i)FR和ii)三个CDR；第二参考氨基酸序列包含含有FR的受者VH区序列；b)合成i)寡核苷酸的第一群体，每一核酸编码至少一个修饰的CDR，其中修饰的CDR与相应供者CDR氨基酸参考序列相比在一个或多个部位含有不同的氨基酸；和ii)寡核苷酸第二群体，其包含编码修饰VH区构架部分的寡核苷酸，其中的构架部位与受者构架区参考序列相比在一个或多个部位含有多个改变的氨基酸，其中的改变的构架部位选自第二参考序列的受者构架部位，前述第二参考序列受者构架部位与第一参考序列供者构架部位的相应部位相比存在差异；和c)将寡核苷酸的第一和第二群体在特定条件下混合以使至少部分的寡核苷酸杂交并产生重叠的寡核苷酸；和d)在特定条件下处理重叠的寡核苷酸以构建改变的VH区编码核酸的群体。在特定条件下用DNA聚合酶延伸重叠的寡核苷酸以构建改变的VH区编码核酸的群体。在进一步的实施方案中，方法进一步包括以下步骤，(e)将改变的VH区编码核酸群体与VL区编码核酸共表达以产生改变的异聚体可变区的多样性群体。在其它实施方案中，受者为人。
在其它实施方案中，本发明提供了构建改变的VL区编码核酸群体的方法，包括：a)提供第一和第二参考氨基酸序列的代表，第一参考氨基酸序列包含供者VL区序列，供者可变区包含由Kabat和Chothia联合定义的i)FR和ii)三个CDR；第二参考氨基酸序列包含含有FR的受者VL区序列；b)合成i)寡核苷酸的第一群体，每一核酸编码至少一个修饰CDR，其中修饰的CDR与相应供者CDR氨基酸参考序列相比在一个或多个部位含有不同的氨基酸；和ii)寡核苷酸第二群体，其包含编码修饰VL区构架部分的寡核苷酸，其中的构架部位与受者FR参考序列相比在一个或多个部位含有多个改变的氨基酸，其中的改变的构架部位选自第二参考序列的受者构架部位，所述第二参考序列的受者构架部位与第一参考序列供者构架部位的相应部位相比存在差异；c)将寡核苷酸的第一和第二群体在特定条件下混合以使至少部分的寡核苷酸杂交并产生重叠的寡核苷酸；和d)在特定条件下处理重叠的寡核苷酸以构建改变的VL区编码核酸的群体。
在某些实施方案中，可产生包含Fc区变体和改变的重链可变区的抗体或抗体片段。例如，在一些实施方案中，本发明提供了构建改变的VH区编码核酸的群体的方法，包括：a)提供第一和第二参考氨基酸序列的代表，第一参考序列包含供者VH区序列，供者可变区包含由Kabat和Chothia联合定义的i)FRs和ii)三个CDR；第二参考氨基酸序列包含含有FR的受者VH区序列；b)合成A)编码受者VH区FR部分的第一寡核苷酸，其中FR部分与第二参考序列相比为未修饰的，和B)第二寡核苷酸群体，每一核苷酸编码i)至少一部分的经修饰的第一CDR，第一CDR选自HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中修饰的第一CDR与第一参考序列的相应供者CDR相比在一个或多个部位包含不同的氨基酸，和ii)能够与第一寡核苷酸杂交的未修饰FR的一个或多个部分；c)将第一寡核苷酸与第二寡核苷酸群体混合以产生重叠的寡核苷酸；和d)在特定条件下处理重叠的寡核苷酸以构建改变的VH区编码核酸的群体，其中由改变的VH区编码核酸所编码的FR与第二参考序列相比为未修饰的。在一些实施方案中，方法进一步包括下述步骤，即将改变的VH区编码核酸与VL区编码核酸共表达以产生改变的异聚体可变区的多样性群体。
在其它实施方案中，本发明提供了构建改变的VL区编码核酸的群体的方法，包括：a)提供第一和第二参考氨基酸序列的代表，第一参考序列包含供者VL区序列，供者可变区包含由Kabat和Chothia联合定义的i)FR和ii)三个CDR；第二参考序列包含含有FR的受者VL区序列；b)合成a)编码受者VL区FR部分的第一寡核苷酸，其中FR部分与第二参考序列相比为未修饰的，和b)第二寡核苷酸群体，每一核苷酸编码i)至少一部分的经修饰的第一CDR，第一CDR选自LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中修饰的第一CDR与第一参考序列的相应供者CDR相比在一个或多个部位包含不同的氨基酸，和编码ii)能够与第一寡核苷酸杂交的未修饰FR的一个或多个部分；c)将第一寡核苷酸与第二寡核苷酸群体混合以产生重叠的寡核苷酸；和d)在特定条件下处理重叠的寡核苷酸以构建改变的VL区编码核酸的群体，其中由改变的VL区编码核酸所编码的FR与第二参考序列相比为未修饰的。
在其它实施方案中，本发明提供了构建改变的VH区编码核酸的群体的方法，包括：A)提供第一和第二参考氨基酸序列的代表，第一参考序列包含供者VH区序列，供者可变区包含由Kabat和Chothia联合定义的i)FR和ii)三个CDR；第二参考序列包含含有FR的受者VH区序列；B)合成a)第一寡核苷酸群体，其中每一核苷酸编码至少一部分的第一CDR，所述CDR选自HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中修饰的第一CDR与第一参考序列的相应供者CDR相比在一个或多个部位包含不同的氨基酸，和b)第二寡核苷酸，其编码i)受者VH区的FR部分，其中的FR部分与参考序列相比为未修饰的，以及编码ii)能够与第一寡核苷酸杂交的CDR的一个或多个部分；C)将第一寡核苷酸群体与第二寡核苷酸混合以产生重叠的寡核苷酸；和D)在特定条件下处理重叠的寡核苷酸以构建改变的VH区编码核酸的群体，其中由改变的VH区编码核酸所编码的FR与第二参考序列相比为未修饰的。
在某些实施方案中，方法进一步包括以下步骤，即将改变的VH区编码核酸群体与VL区编码核酸共表达以产生改变的异聚体可变区的多样性群体。
在其它实施方案中，本发明提供了构建改变的VL区编码核酸的群体的方法，包括：A)提供第一和第二参考氨基酸序列的代表，第一参考序列包含供者VL区序列，供者可变区包含由Kabat和Chothia联合定义的i)FR和ii)三个CDR；第二参考序列包含含有FR的受者VL区序列；B)合成a)第一寡核苷酸群体，其中每一核苷酸编码至少一部分的第一CDR，所述CDR选自LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中修饰的第一CDR与第一参考序列的相应供者CDR相比在一个或多个部位包含不同的氨基酸，和b)第二寡核苷酸，其编码i)受者VL区的FR的部分，其中的FR部分与参考序列相比为未修饰的，以及编码ii)能够与第一寡核苷酸杂交的CDR的一个或多个部分；C)将第一寡核苷酸群体与第二寡核苷酸混合以产生重叠的寡核苷酸；和D)在特定条件下处理重叠的寡核苷酸以构建改变的VL区编码核酸的群体，其中由改变的VL区编码核酸所编码的FR与第二参考序列相比为未修饰的。
在其它实施方案中，本发明提供了改进突变的人源化抗体可变区的结合亲和性的方法，包括：a)提供编码突变人源化抗体可变区的第一核酸序列，突变的可变区包含(i)野生型人抗体构架，(ii)三个非人重链CDR，和(iii)三个非人轻链CDR，其中的CDR由Kabat和Chothia联合定义，其中至少一个轻链CDR为含突变的轻链CDR，其与相应野生型非人CDR相比在至少一个部位含有至少一个不同的氨基酸，且其中第一突变抗体可变区与相应非突变抗体可变区相比具有更高的结合亲和性；b)在特定条件下突变编码第一突变抗体可变区的核酸序列，以编码第二突变抗体可变区，第二突变人源化抗体可变区在含突变的轻链CDR的至少一个部位中包含一个额外的不同氨基酸，额外的突变与第一突变组合导致结合亲和性的增强。在一些实施方案中，第一突变人源化抗体可变区的含突变的轻链CDR为CDR3(LCDR3)。
在其它实施方案中，第一突变人源化抗体可变区的至少一个非人重链CDR包含突变，以在至少一个部位编码不同于相应野生型非人CDR的不同的氨基酸。在其它实施方案中，重链CDR突变为HCDR3。
在一些实施方案中，本发明提供了在构建改变的VH区编码核酸的同时对至少一个CDR和至少一个FR进行修饰的方法，包括：a)提供第一和第二参考氨基酸序列的代表，第一参考氨基酸序列包含供者VH区序列，供者可变区包含由Kabat和Chothia联合定义的i)四个FR和ii)三个CDR；第二参考氨基酸序列包含含有四个FR的受者VH区序列，如由Kabat和Chothia联合定义所定义的；b)合成i)用于待修饰的每一个FR的寡核苷酸群体，其中每一核苷酸编码一个修饰的FR或其部分，与受者VH区参考序列的相应构架区相比在一个或多个部位含有多个改变的氨基酸，其中改变的FR部位选自第二参考序列的受者构架部位，所述第二参考序列的受者构架部位与第一参考序列的供者构架区部位相比在相应部位存在差异；和ii)用于每一待修饰CDR的寡核苷酸群体，每一核苷酸编码一个修饰的CDR或其部分，其中修饰的CDR与相应供者CDR氨基酸参考序列相比在一个或多个部位含有不同的氨基酸；和iii)用于任意的每个剩余和未修饰FR的编码FR或其部分的寡核苷酸，该寡核苷酸与第二参考受者序列的相应FR具有相同的序列；和iv)用于任意的每一剩余和未修饰CDR的编码CDR或其部分的寡核苷酸，其具有与第一参考供者序列相同的序列，其中编码VH区邻近部分的从(i)到(iv)中的单独寡核苷酸在其末端具有相互重叠的序列；和c)在特定条件下将寡核苷酸和步骤b)中合成的寡核苷酸群体混合以使单独寡核苷酸的重叠序列发生杂交并生成重叠的寡核苷酸；和d)在特定条件下处理重叠的寡核苷酸以形成改变的VH区编码核酸群体。在某些实施方案中，第一和第二参考序列以电子形式展示。在进一步的实施方案中，待修饰的构架区选自HFR1、HFR2和HFR3。在其它实施方案中，待修饰的CDR为HCDR3。在其它实施方案中，方法进一步包括以下步骤，即e)将VH区编码核酸群体与VL区编码核酸共表达，以产生改变的异聚体可变区的多样性群体。在不同的实施方案中，方法进一步包括步骤e)，即将VH区编码核酸群体与VL区编码核酸群体共表达以产生改变的异聚体可变区的多样性群体。
在其它实施方案中，应用在构建改变的VL区编码核酸的同时对至少一个CDR和至少一个FR进行修饰的方法，包括：a)提供第一和第二参考氨基酸序列的代表，第一参考氨基酸序列包含供者VL区序列，供者可变区包含由Kabat和Chothia联合定义的i)四个FR和ii)三个CDR；第二参考氨基酸序列包含含有四个FR的受者VL区序列，如由Kabat和Chothia联合定义所定义的；b)合成i)用于待修饰的每一个FR的寡核苷酸群体，其中每一核苷酸编码一个修饰的FR或其部分，与受者VL区参考序列的相应构架区相比在一个或多个部位含有多个改变的氨基酸，其中改变的FR部位选自与第一参考序列的供者构架区部位相比在相应部位存在差异的第二参考序列的受者FR部位；和ii)用于每一待修饰CDR的寡核苷酸群体，每一核苷酸编码一个修饰的CDR或其部分，其中修饰的CDR与相应供者CDR氨基酸参考序列相比在一个或多个部位含有不同的氨基酸；和iii)用于任意的每个剩余和未修饰FR的编码FR或其部分的寡核苷酸，该核苷酸与第二参考受者序列的相应FR具有相同的序列；和iv)用于任意的每一剩余和未修饰CDR的编码CDR或其部分的寡核苷酸，具有与第一参考供者序列相同的序列，其中，编码VH区邻近部分的从(i)到(iv)中的单独寡核苷酸在其末端具有相互重叠的序列；和c)在特定条件下将寡核苷酸和步骤b)中合成的寡核苷酸群体混合以使单独寡核苷酸的重叠序列发生杂交并生成重叠的寡核苷酸；和d)在特定条件下处理重叠的寡核苷酸以形成改变的VL区编码核酸群体。在某些实施方案中，方法进一步包括以下步骤，即e)将VL区编码核酸群体与VH区编码核酸群体共表达，以产生改变的异聚体可变区的多样性群体。
(v)多特异抗体
本发明提供了包含Fc区变体的多特异抗体。多特异抗体对至少两种不同的抗原具有结合特异性。虽然此类分子通常仅结合两种抗原(即双特异抗体，BsAbs)，但文中此表达将含具额外特异性的抗体(如三特异抗体)。BsAbs的示例包括但不限于，那些一个臂抗肿瘤抗原且另一个臂抗引发细胞毒的分子的BsAbs，如抗FcγRI/抗CD15、抗pl 85HER2/FcγRIII(CD16)、抗CD3/抗恶性B细胞(D1D0)、抗CD3/抗pl 85HER2、抗CD3/抗p97、抗CD3/抗肾细胞癌、抗CD3/抗OVCAR-3、抗CD3/L-DI(抗结肠癌)、抗CD3/抗黑素细胞刺激激素类似物、抗EGF受体/抗CD3、抗CD3/抗CAMAI、抗CD3/抗CD19、抗CD3/MoV18、抗神经细胞黏附分子(NCAM)/抗CD3、抗叶酸结合蛋白(FBP)/抗CD3、抗pan癌相关抗原(AMOC-31)/抗CD3；一个臂特异结合肿瘤抗原且另一个臂结合毒素的BsAbs，如抗皂草素/抗id-1、抗CD22/抗皂草素、抗CD7/抗皂草素、抗CD38/抗皂草素、抗CEA/抗蓖麻毒素A链、抗干扰素-α(IFN-α)/抗杂交瘤独特型、抗CEA/抗长春花属生物碱；用于转化酶激活的药物前体的BsAbs，如抗CD30/抗碱性磷酸酶(该酶催化丝裂霉素磷酸盐药物前体转化为丝裂霉素)；可用作纤维蛋白溶解剂的BsAbs，如抗纤维蛋白/抗组织纤溶酶原激活剂(tPA)、抗纤维蛋白/抗尿激酶纤溶酶原激活剂(uPA)；用于将免疫复合体靶向到细胞表面受体的BsAbs，如抗低密度脂蛋白(LDL)/抗FcR(例如FcγRI、FcγRII或FcγRIII)；用于治疗传染病的BsAbs，如抗CD3/抗单纯疱疹病毒(HSV)、抗T细胞受体：CD3复合物/抗流行性感冒、抗FcyR/抗HIV；用于体外或体内检测肿瘤的BsAbs，如抗CEA/抗EOTUBE、抗CEA/抗DPTA、抗p185HER2/抗半抗原；用作疫苗佐剂的BsAbs；以及用作诊断工具的BsAbs，如抗兔IgG/抗铁蛋白、抗马辣根过氧化物酶(HRP)/抗激素、抗生长激素抑制素/抗P物质、抗HRP/抗FITC、抗CEA/抗p-半乳糖苷酶。
三特异抗体的示例包括但不限于，抗CD3/抗CD4/抗CD37、抗CD3/抗CD5/抗CD37和抗CD3/抗CD8/抗CD37。双特异抗体可以全长抗体或抗体片段(例如F(ab′)2双特异抗体)形式进行制备。用于制备双特异抗体的方法为本领域公知。全长双特异抗体的常规生产基于对两个免疫球蛋白重链-轻链对进行共表达，其中的两条链具有不同的特异性(例如Millstein等，自然(Nature)，305：537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链进行随机分配，这些杂交瘤细胞(quadromas)可产生十种不同抗体分子的潜在化合物，其中仅有一种分子具有正确的双特异结构。可通过亲和层析步骤纯化正确的分子。类似的方法在WO93/08829和Traunecker等，，EMBO J.，10：3655-3659(1991)中公开。
在另一方法中，将具有所需结合特异性的抗体可变区(抗体-抗原结合位点)与免疫球蛋白恒定区序列进行融合。优选地与包含至少部分铰链、CH2和CH3区的免疫球蛋白重链恒定区进行融合。优选地在至少一个融合中，包含对轻链结合所必需的位点的第一重链恒定区(CH1)。将编码免疫球蛋白重链融合体的DNA，且如果需要，也同时将编码编码免疫球蛋白轻链的DNA插入到表达载体中，并在适宜的宿主中共表达。当用于构建的三个多肽链的比例不相等时可提供最佳产量的情况下，该方法为调整实施方案中三个多肽片段的相互比例提供了极大的灵活性。但当至少两条多肽链以相同比例表达可导致高产量或比例对产量并无特别影响时，也有可能将两条或全部三条多肽链的编码序列插入到一个表达载体中。在本方法的一个优选的实施方案中，双特异抗体由杂合体免疫球蛋白重链和杂合体免疫球蛋白重链轻链对组成，其中前一杂合体在其一个臂中具有第一结合特异性，第二个杂合体在另一臂中提供第二结合特异性(参见如WO94/04690)。根据WO96/27011中描述的另一方法中，可对抗体分子对间的接触面进行改造，以使从重组细胞培养物中回收的异二聚体的比例达到最大化。特异抗体也包括交联或“异缀合物(heteroconjugate)”抗体。例如，异缀合物中的一个抗体可与抗生物素蛋白偶联，而另一抗体与生物素偶联。
B.免疫粘附素分子
本发明也提供了包含Fc区变体的免疫粘附素分子。一种类型的免疫粘附素设计为将粘附素的结合结构域(例如受体的胞外结构域(ECD))与免疫球蛋白重链的Fc区(如Fc区变体)结合。通常，制备本发明的免疫粘附素时，将编码粘附素结合结构域的核酸的C端与编码免疫球蛋白恒定区序列的N端的核酸进行融合，但也可能进行粘附素的N端融合。
通常，在此融合体中编码的嵌合多肽将至少功能性保留免疫球蛋白重链恒定区的活性铰链、CH2和CH3区。也可在恒定区Fc部分的C端进行融合，或融合到紧邻重链CH1的N端或轻链的相应区域。进行融合的确定位点并非至关重要；一些特定融合位点为本领域公知并可选择这些位点以优化免疫粘附素的生物活性、分泌或结合特性。
在一些实施方案中，将粘附素序列与免疫球蛋白G1的Fc区变体的N端进行融合。有可能将整个重链恒定区与粘附素序列融合。但在优选的实施方案中，应用起始于铰链区并近邻木瓜蛋白酶切割位点上游的序列(该序列化学性切割IgG Fc(即第216位残基，以重链恒定区的第一位残基为114位))或应用其它免疫球蛋白的类似位点进行融合。在某些优选的实施方案中，将粘附素氨基酸序列与IgG重链的(a)铰链区、CH2和CH3，或(b)CH1、铰链、CH2和CH3区进行融合。在一些实施方案中，免疫粘附素为双特异。备选地，可将粘附素序列插入免疫球蛋白重链和轻链序列之间，以获得含有嵌合重链的免疫球蛋白。在此类实施例中，可将粘附素序列融合到免疫球蛋白每一臂中免疫球蛋白重链的3′端，或融合到铰链区和CH2区之间，或CH2区和CH3区之间(参见如Hoogenboom等，分子免疫学(Mol.Immunol.)28：1027-1037(1991)。
尽管本发明的免疫粘附素中并不要求含有免疫球蛋白轻链，但免疫球蛋白轻链可与粘附素-免疫球蛋白重链融合多肽共价连接或直接与粘附素融合的形式存在于免疫粘附素中。在前面的例子中，编码免疫球蛋白轻链的DNA通常与编码粘附素-免疫球蛋白重链融合蛋白的DNA进行共表达。进行分泌时，重链和轻链杂合体将进行共价连接以形成免疫球蛋白样结构，所述结构中包含由两个二硫键连接的免疫球蛋白重链-轻链对。用于制备此类结构的适宜方法，为如在U.S.专利号4,816,567中所公开的。
在优选的实施方案中，免疫粘附素的构建通过将编码粘附素部分的cDNA序列与免疫球蛋白cDNA序列进行读框内(in-frame)融合而实现。但是，也可应用基因组免疫球蛋白片段进行融合。一般而言，后一类型的融合需要用于表达的Ig调节序列的存在。可根据已发表的序列通过杂交或通过PCR技术从cDNA文库中分离出编码IgG重链恒定区的cDNA，所述文库源自脾脏或外周血淋巴细胞。可将编码“粘附素”和免疫粘附素中免疫球蛋白部分的cDNA以前后串连顺序插入到质粒载体，所述载体可指导其在选择的宿主细胞内进行有效表达。
变体多肽改变的半寿期
新生儿Fc受体“FcRn”为一主要组织相容性复合体(MHC)类似物，其不仅在怀孕期递送IgG通过母婴屏障，也参与调节IgG血清半寿期。FcRn的最新综述参见Ghetie，V和E.S.Ward，年度免疫学综述(Annu.Rev.Immunol.)18：739-766，2000。FcRn以pH-依赖方式与IgG结合，在微酸pH条件下发生结合而在pH7.4时很少发生或检测不到结合。有推测认为IgG由表达FcRn的细胞摄入并进入酸性内涵体中，并于此发生FcRn-IgG相互作用。然后IgG被转运至细胞表面并在近中性pH时释放。摄入细胞后未结合FcRn的IgG进入溶酶体区室并发生降解。与此模式一致的假说认为，与FcRn具有较高结合亲和性的含Fc区变体的多肽与那些具有较低亲和性的多肽相比其血清半寿期延长。
FcRn具有IgG转运体的功能，表明在单克隆抗体中的或与异源蛋白质(即非抗体)有效连接的改变FcRn亲和性的Fc区变体可产生治疗功效。那些获益于从受试者或患者中快速清除或不能跨胎盘膜运送的治疗性多肽(例如放射性标记多肽)，将获益于通过与具有减低FcRn结合亲和性的Fc区的有效连接。备选地，将获益于具有较长的血清半寿期并因此仅需较少次数的施用或获益于跨胎盘膜运送的多肽，将优选地与具有增强的FcRn结合亲和性的Fc区连接(参见表2、5和6)。考虑了Fc特征的多种组合，例如FcRn结合亲和性提高但具有较低或不具有CDC或ADCC活性的Fc区，可通过下述方法产生，即在IgG4母本Fc区或IgG1母本Fc区加入一处或多处可提高FcRn结合亲和性的Fc氨基酸替换(如表2中所列出)，同时联合加入可降低CDC和ADCC活性的氨基酸替换。
通过与亲本多肽相比具增强的FcRn结合亲和性的本发明Fc区变体有效连接，而使其血清半寿期延长并因此获益的优选多肽为，哺乳动物治疗性多肽，包括如下的分子，如血管紧张肽原酶、生长素、人生长素、牛生长素、生长激素释放因子、生长激素释放激素、甲状旁腺激素、促甲状腺激素、脂蛋白、胰岛素A-链、胰岛素B-链、α1-抗胰蛋白酶、PAI-1、胰岛素原、血小板生成素、促卵泡激素、降钙素、促黄体激素、胰高血糖素、凝血因子如因子VIIIC，因子IX，组织因子和病毒胞吞因子、抗凝血因子如蛋白质C、心钠素、肺表面活性剂、纤溶酶原激活剂，如尿激酶或人类尿液或组织类型纤溶酶原激活剂(t-PA)、铃蟾肽、凝血酶、造血生长因子、白介素如IL-1至IL-10、IL-20、肿瘤坏死因子-α和-β、脑啡肽酶、血清白蛋白如人血清白蛋白、穆勒管抑制物质、松弛素A-链、松弛素B-链、松弛素原、鼠促性腺激素相关肽、微生物蛋白质如β-内酰胺酶、DNA酶、抑制素、激活素、血管内皮生长因子(VEGF)、激素或生长因子受体、整联蛋白、A蛋白或D蛋白、类风湿因子、嗜神经因子(如脑源嗜神经因子(BDNF)、神经营养因子-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)或神经生长因子如NGF-β、心肌营养素如心肌营养素-1(CT-1))、血小板源性生长因子(PDGR)、成纤维细胞生长因子如aFGF和bFGF、内皮生长因子(EGF)或其受体、转化生长因子(TGF)如TGF-α和TGF-β(包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5)、胰岛素样生长因子-I和-II、des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)、胰岛素样生长因子结合蛋白质、CD蛋白质(如CD-3、CD-4、CD-8和CD-19)、促红细胞生成素、骨诱导因子、免疫毒素、骨形态生成蛋白、生长分化因子(例如GDF-8)、干扰素(如干扰素-α、-β和-γ)、集落刺激因子(CSFs)例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF、不含天然IgG Fc区的抗HER-2、不含天然IgG Fc区的抗RSV抗体、过氧化物歧化酶、T细胞受体、表面膜蛋白质、促衰变因子、病毒抗原如HIV-1膜的部分、转运蛋白、归巢受体、定居素、调节蛋白质、不含I天然IgG Fc区的抗体，以及任何以上所列多肽的片段或前体。
包含本发明氨基酸替换的Fc区变体可改变与其有效连接的多肽的血清半寿期(即FcRn结合亲和性增强)，Fc区优选地与目标多肽的羧基端或氨基端有效连接由此产生融合蛋白。
编码Fc区变体的核酸序列
本发明也提供了编码Fc区变体的核酸序列，以及提供了包含编码Fc区变体的核酸序列的组合物、载体和宿主细胞。本发明也提供了用于产生Fc区变体的重组方法。
用于重组产生变体时，通常将编码变体的核酸分离并插入到载体中。可将载体转化宿主细胞，由此允许扩增核酸序列和/或产生变体。可应用常规方法分离编码本发明变体肽的核酸序列并对其进行序列测定(例如应用能够与编码变体的核酸特异结合的寡核苷酸探针)。通常，将编码变体的核酸序列有效连接到其它元件，如信号序列(例如分泌信号序列)、复制起点、至少一个标记基因、增强子、启动子或转录终止子。在某些实施方案中，将编码变体的核酸稳定转染宿主细胞以产生表达特定抗体的细胞系。在优选的实施方案中，变体在CHO、NSO、Sp2/0、PER.C6或HEK293细胞中表达。所用重组方法为本领域公知。
可对核酸序列进行突变以产生Fc区变体。例如，可对编码亲本Fc区的核酸序列(例如SEQ ID NO：1-12)进行突变以在表达核酸序列时产生至少一处的氨基酸改变。另，可对编码亲本Fc区的至少部分核酸序列进行突变以产生包含至少部分Fc区变体的氨基酸序列。
在某些实施方案中，应用基于密码子的合成方法来产生突变序列。基于密码子合成方法的示例包括，例如在U.S.专利5,264,563、5,523,388和5,808,022中所描述的。简言之，基于密码子的合成方法可通过将单体依次偶联到支持物上以形成至少两种不同的tuplets而得以实现。可在不同的反应管中进行偶联反应，然后将不同反应管中的支持物混合，并将混合的支持物分装到两个或多个不同反应管中，并在反应管中重复一次或多次偶联、混合和分装步骤，最后终止于混合或分装步骤。另外，可从支持物上分离出寡核苷酸。
治疗用途和制剂
在一些实施方案中，本发明提供了包含此处描述变体的治疗用制剂。本发明并非意在限定治疗性组合物的特定性质。例如，该组合物可包括多肽变体(或其部分)，并与生理可耐受的液体、凝胶、固相载体、稀释剂、佐剂、赋形剂以及它们的组合(参见，如Remington药物科学(Remington’sPharmaceutical Sciences)第16版，Osol A.编辑(1980))一同提供。
此外，多肽变体可在其它治疗剂施用前或施用后一同应用，所述其它治疗剂包括但不限于水杨酸、类固醇、免疫抑制剂、抗体或抗生素。可与本发明的变体一同应用的特定治疗剂包括但不限于下述的制剂：偶氮苯化合物(U.S.专利号4,312,806)、苯甲代若丹明衍生物(U.S.专利号5,216,002)、锌L-肌肽盐(U.S.专利号5,238,931)、3-苯基-5-羧基吡唑和异噻唑(U.S.专利号5,294,630)、IL-10(U.S.专利号5,368,854)、喹啉白三烯合成抑制剂(U.S.专利号5,391,555)、2′-卤代-2′-脱氧腺苷(U.S.专利号5,506,213)、酚和苯甲酰胺化合物(U.S.专利号5,552,439)、三丁酸甘油酯(U.S.专利号5,569,680)、某些肽类(U.S.专利号5,756,449)、ω-3多不饱和酸(U.S.专利号5,792,795)、VLA-4阻断剂(U.S.专利号5,932,214)、间硫苯甲酸泼尼松龙(U.S.专利号5,834,021)、细胞因子抑制剂(U.S.专利号5,888,969)和尼古丁(U.S.专利号5,889,028)。
多肽变体可与降低细胞活力或增殖潜能的制剂一同施用。降低细胞活力或增殖潜能的制剂可以多种方式发挥作用，包括如抑制DNA合成、抑制细胞分裂、诱导凋亡或诱导非凋亡性细胞杀伤。细胞毒性剂和细胞抑制剂的特定示例包括但不限于，美洲商陆抗病毒蛋白、相思豆毒素、蓖麻毒素和其所有A链、阿霉素、顺铂、碘-131、钇-90、铼-188、铋-212、紫杉酚、5-氟尿嘧啶VP-16、博来霉素、氨甲蝶呤、去乙酰长春酰胺、阿霉素、长春新碱、长春碱、BCNU、丝裂霉素和磷酰胺，以及某些细胞因子如TNF-α和TNF-β。因此，细胞毒性剂或细胞抑制剂可包括，如放射性核素、化疗药物、蛋白质和凝集素。
治疗组合物可包含如通常使用的添加剂，如粘合剂、填料、载体、防腐剂、稳定剂、乳化剂、缓冲剂和赋形剂，如药物级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。这些组合物通常包含1％-95％的活性成分，优选地包含2％-70％的活性成分。
本发明的多肽变体也可与相容的或生理可耐受的稀释剂或赋形剂混合。适宜的稀释剂和赋形剂为如水、盐、葡萄糖、甘油等，以及它们的组合。此外，如果需要，组合物可包含少量的辅助剂，如加湿或乳化剂、稳定剂或pH缓冲剂。
在一些实施方案中，将本发明的治疗组合物制备成液体溶液或悬液，如喷剂，或制备成固体形式。口服制剂通常包括此类常规使用的添加剂如黏合剂、填料、载体、防腐剂、稳定剂、乳化剂，缓冲剂和赋形剂，如药物级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。这些组合物制备成溶液剂、悬液剂、片剂、丸剂、胶囊剂、持续释放制剂或粉剂，且通常包含1％-95％的活性成分，优选地包含2％-70％的活性成分。用于递送本发明治疗组合物的口服组合物的一个示例在U.S.专利号5,643,602中描述。
适用于其它施用方式(如局部施用)的其它制剂包括药膏、酊剂、乳膏、洗剂、皮肤贴片和栓剂。用于药膏和乳剂的常规黏合剂、载体和赋形剂可包括如聚亚烷基二醇或甘油三酸酯。局部递送方法的一个示例在U.S.专利号5,834,016中描述。也可采用其它的脂质体递送方法(参见如U.S.专利号5,851,548和5,711,964)。
但需要用于治疗定适应症时，制剂也可包含多于一种活性化合物，优选地包含那些具有互补活性且并不互相干扰的化合物。此类分子适于以对特定治疗目的有效的组合剂量形式存在。
也可制备持续释放的制备物。持续释放制备物的适宜示例包括含有多肽变体的固体疏水聚合物的半透性基质，其中基质为成型物品形式，如膜或微胶囊。持续释放基质的示例包括但不限于聚酯、水凝胶(如聚乙烯(2-羟基-异丁烯酸盐)或聚(乙烯醇))、聚交酯、L-谷氨酸和γ-乙醛基-L-谷氨酸盐的共聚物、不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如LUPRON DEPOT(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球)和聚乙烯-D-(-)-3-羟基丁酸。如乙烯-醋酸乙烯酯和乳酸乙醇酸的聚合物其释放分离核酸的时间可超过100天，而某些水凝胶以较短的时间释放蛋白质。
本发明的多肽变体可用于治疗受试者。此类治疗可施用给患病的受试者，也可对受试者进行预防性施用(如对疾病易感的受试者)。可进行治疗的病症的示例包括但不限于，癌症(例如其中多肽变体结合HER2受体、CD20或血管内皮生长因子(VEGF))；过敏症如哮喘(具有抗IgE抗体)和LFA-1-介导的疾病(例如其中的多肽变体为抗LFA-I或抗ICAM-I抗体)等。
在优选的实施方案中，用于治疗受试者的多肽变体包含抗体或免疫粘附素。另在优选的实施方案中，治疗的疾病为对抗体或免疫粘附素敏感的疾病。抗体敏感疾病的示例包括如以下的疾病和病症：淋巴瘤(已表明抗CD20抗体RITUXAN对其治疗有效)、传染病(已表明导向呼吸合胞病毒F蛋白的抗体SYNAGIS对其治疗有效)、肾脏移植(显示抗IL-2受体抗体ZENAPAX对其有帮助)、类风湿性关节炎(已显示抗TNFα抗体REMICADE对其治疗有效)、乳腺癌(已显示抗20 HER2抗体HERCEPTIN对其治疗有效)和结肠癌(已显示抗17-1A抗体EDRECOLOMAB对其治疗有效)。用于癌症治疗的多肽变体优选地包含本发明的Fc区氨基酸替换，所述氨基酸替换使多肽的ADCC活性或CDC活性提高。
在一些实施方案中，应用具有改进ADCC活性的多肽变体治疗需要破坏或消除组织或外源微生物的疾病或紊乱。例如，变体可用于治疗癌症；感染(如细菌、病毒、真菌或酵母感染)和其它需要移除组织的病症(如甲状腺肿)。在其它实施方案中，多肽变体具有减低的ADCC活性。可应用该变体治疗需要应用具有长半寿期的含Fc区的多肽的疾病或紊乱，但多肽优选地不具有不需要的效应子功能。例如，含Fc区的多肽可为抗组织因子(TF)抗体；抗IgE抗体和抗整联蛋白抗体(如抗437抗体)。此类含多肽的Fc区所需的作用机制可为阻断配体-受体结合对。此外，含有Fc区的具有减低的ADCC活性的多肽可为激动剂抗体。
用于治疗癌症的多肽变体优选地包含本发明的Fc区氨基酸替换(参见如此处的表2)，该替换赋予多肽增强的ADCC活性和/或增强的CDC活性。
本发明的多肽变体可通过任何适宜的方式进行施用，包括肠胃外、皮下、局部、腹膜内、肺内以及鼻内和病灶内施用(例如用于局部免疫抑制的治疗)。肠胃外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。此外，多肽变体适于经脉动输注施用，特别是施用渐减剂量的多肽变体。优选地，通过注射施用给药，最优选地经静脉内或皮下注射施用，施用方式部分取决于是短期还是长期施用。
用于疾病的预防或治疗时，多肽变体的适宜剂量取决于待治疗疾病的类型、严重程度和病程，多肽变体的施用是用于预防还是治疗目的，先期的治疗，患者的临床病史，对多肽变体的反应以及主治医师的判断。多肽变体适宜于一次施用给患者或经系列治疗而多次施用。
例如，根据疾病的类型和严重程度，将约0.1μg/kg到15mg/kg(例如0.120mg/kg)的多肽变体作为起始候选剂量，经一次或多次单独施用或经连续输注施用给患者。常规的日剂量可在约1μg/kg到100mg/kg范围内，也可施用更多，这取决于以上提及的因素。根据病症，用于超过数天或更长时间的重复施用时，治疗应持续到症状完全减轻或消除为止。可通过常规技术和试验方便地监控治疗进程，且可用于调整剂量以达到治疗效果。
上述多肽变体的建议施用剂量很大程度上决定于对治疗的判断。选定适宜剂量和时间安排的关键因素是所获得的治疗结果。需考虑于此的因素包括待治疗的特定疾病，待治疗的特定动物，个体患者的临床病症，疾病的原因，递送抗体的部位，抗体的特定类型，施用方法，施用的时间安排和其它对医学从业者已知的因素。
所施用多肽变体的治疗有效量是下述的需要用于患者的剂量水平，即应用时可使治疗疾病的症状减轻。此外，治疗有效量也可指足以延缓、减小或预防疾病发生的治疗制剂的用量，例如延缓、减小或预防癌症的转移。治疗有效量也可指治疗制剂(例如多肽变体)在治疗或处置受试者的疾病时可提供治疗效益的治疗制剂的用量。此外，与本发明有关的治疗有效量是指单独应用和与其它治疗联合应用时的治疗制剂的用量，所述用量可为治疗或处置受试者的疾病提供疗效。多肽变体并不必需与但可任选地与目前用于预防或治疗疑难病症的一种或多种药剂联合配方。此类其它药剂的有效量取决于制剂中存在的多肽变体的剂量、疾病或治疗的类型，以及其它以上讨论的因素。首个预防或治疗性制剂(例如包含本发明Fc区变体或其功能片段多肽变体或多肽)可在第二个预防或治疗性制剂施用前、施用同时或施用后施用给疾病受试者。
本发明的治疗性制剂可经冷冻或冻干以用于储藏并在应用前在适宜的无菌载体中重建。冻干和复建可不同程度导致抗体活性降低。可能必须调整剂量以进行弥补。通常，优选的pH在6和8之间。
在此考虑了应用包含本发明Fc区变体的单克隆抗体治疗或预防至少一种以上提及的紊乱(例如癌症)时，与单克隆抗体结合的抗原是有害的或患者可获益于抗原水平的降低。此外，考虑了应用包含本发明Fc区变体的抗体进行药物生产，以用于治疗至少一种以上提及的疾病的治疗。
如此处所应用，术语“治疗”、“处置”等是指获得所需的药理和/或生理效应。效应可为预防性效应，即完全或部分预防疾病或其症状，和/或效应可为治疗性效应，即部分或完全治愈疾病和/或疾病引起的副作用。如此处所应用的“治疗”，包括施用本发明的化合物用以治疗哺乳类动物特别是人类的疾病或病症，同时也包括(a)预防受试者发生疾病，所述受试者可为对疾病易感但尚未检测到发病；(b)抑制疾病，即阻止疾病发展；和(c)减轻疾病，即使疾病或紊乱恢复，或减轻其症状或并发症。可对剂量服法作出调整以提供最佳的所需反应(例如治疗性或预防性反应)。例如，可以单次施用大丸剂，也可一段时间内分开剂量多次施用，或由治疗病症的紧急程度而按比例减少或增加剂量。
抗CD20抗体
认为包含本发明Fc区变体的抗CD20抗体位于本发明的范围之内(参见如此处的实施例4和图4)。在一个实施方案中，包含本发明Fc区变体的抗CD20抗体或其部分含有氨基酸替换，如此处表1-10中所列出，抗CD20抗体可进一步包含具有SEQ ID NO：13、14、15或16中所示序列的多肽。在另一实施方案中，抗CD20抗体包含的本发明Fc区变体或其部分含有如此处表1-10中所列出的氨基酸替换，且进一步包含具有如下显示序列的肽：
a)SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14；
b)SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16；
c)SEQ ID NO：17、18、19、20、21和22；或
d)SEQ ID NO：23、24、25、26、27和28。
更优选地，本发明的抗CD20抗体所包含的Fc区变体或其部分，含有选自下列的一处或多处氨基酸替换，包括：
a)247I和339D；
b)247I和339Q；以及
c)378D；
且进一步包含含可变区的多肽，其序列选自：
a)SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14；
b)SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16；
c)SEQ ID NO：17、18、19、20、21和22；以及
d)SEQ ID NO：23、24、25、26、27和28。
Fc区变体的其它用途
本发明的变体和编码变体的核酸序列可用于多个方面。例如，本发明的变体可用于药物筛选试验。例如，可评估候选化合物对Fc效应子功能的改变或影响，所述评估通过将变体与候选化合物接触并测定候选化合物与变体的结合而实现。可应用本领域公知的方法将变体固定，所述方法如将GST-变体融合蛋白与含谷胱甘肽的聚合小珠结合。编码GST融合蛋白的嵌合基因的构建通过将编码变体的目标DNA与编码GST羧基端的DNA融合而实现(参见如Smith等，基因(Gene)67：31[1988])。然后将融合构建体转染到适宜的表达系统中(如大肠杆菌XA90)，所述系统可应用异丙基-f-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)诱导表达GST融合蛋白。IPTG诱导产生以可溶性细胞蛋白质为主要成分的融合蛋白。可应用本领域公知的方法纯化融合蛋白，包括以谷胱甘肽亲和层析进行纯化。候选化合物与变体的结合与化合物破坏一种或多种效应子功能的能力相关联。
在另一筛选方法中，应用本领域公知的方法将变体或所选择的FcR进行固定，所述方法如将GST融合蛋白吸附到塑料微滴定平板或特异结合到含谷胱甘肽的聚合小珠。例如，将GST-变体结合到谷胱甘肽-琼脂糖凝胶小珠上。然后将固定化的变体与FcR和候选化合物接触。然后移除未结合的肽，溶解复合物并分析测定结合的标记肽的含量。结合的降低是候选化合物抑制变体与FcR相互作用的一个指标。本筛选方法特别适用于本发明的变体。本方法的一个变更允许用于筛选下述化合物，即该化合物能够破坏前期形成的变体/Fc受体复合体。例如，在一些实施方案中，包含与FcR结合的变体的复合体用以上所描述的方法进行固定并与候选化合物进行接触。候选化合物离散复合体的能力与化合物破坏或抑制受试变体与FcR间的结合能力相互关联。用此方法，可鉴定出具有治疗潜能(如用于人类)的化合物(例如用于治疗人类疾病如自身免疫性疾病的化合物)。
用于药物筛选的另一技术提供了对具有适宜的与变体肽结合能力的化合物进行高通量筛选的方法，并在WO84/03564中详细描述。简言之，在固相基质上合成大量不同的小肽受试化合物，所述固相基质如塑料针或一些其它平面。然后用肽变体与受试化合物进行反应并洗涤。然后通用本领域公知的方法检测结合的变体肽。
另一技术应用针对变体肽的抗体。能够特异结合到变体肽的此类抗体将与受试化合物竞争结合到特定变体。在此方法中，可应用抗体检测出与变体肽共享一个或多个抗原决定簇的任何肽类的存在。
本发明考虑了筛选化合物的多种其它方法。以上提供的实施例仅用于说明一系列可获得的技术。本领域的普通技术人将会理解也可应用多种其它的筛选方法。
特别是，本发明考虑了应用转染以编码至少一种Fc区变体的核酸的细胞系进行化合物的活性筛选，特别是从组合文库中(例如含多于104个化合物的文库)高通量筛选化合物。本发明的细胞系可用于多种筛选方法。
本发明的变体可用作亲和纯化试剂。例如，可应用本领域公知的方法将变体固定于如Sephadex树脂或滤纸的固相表面。然后应用含待纯化抗原的样本与固定的变体接触，且之后用适宜的溶剂洗涤支持物，所述溶剂将充分移除样本中除与固定的多肽变体相结合的待纯化抗原之外的所有物质。最后，用另一适宜溶剂洗涤支持物(如甘氨酸缓冲液，pH5.0)使抗原自多肽变体脱离。
多肽变体也可用于诊断试验(例如用于检测目的抗原在特定细胞、组织或血清中的表达)。用于诊断时，通常将变体标记以可检测部分(该标记也用于以上描述的Fc区试验)。有多种标记可供选择使用，包括但不限于，放射性同位素(如35S、14C、125I、3H和131I)、荧光标记(如稀土螯合物(螯合铕)或荧光素和其衍生物、若丹明和其衍生物、丹酰(dansyl)、丽丝胺(Lissamine)、藻红蛋白和德州红(Texas Red))和多种酶底物标记(参见如U.S.专利号4,275,149)和萤光素酶、虫萤光素、2，3-二氢二氮杂萘二酮、苹果酸脱氢酶、脲酶、过氧化物酶如辣根过氧化物酶(HRPO)、碱性磷酸酶、3-半乳糖苷酶、葡糖糖化酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶和其它)。酶底物组合的示例包括，例如：(i)辣根过氧化物酶(HRPO)以过氧化氢酶作为底物，其中过氧化氢酶氧化染料前体(例如邻苯二胺(OPD)或3，3′，5，5-四甲基联苯胺盐酸盐(TMB))；(ii)碱性磷酸酶(AP)以对硝基苯磷酸盐作为显色底物；和(iii)-D-半乳糖苷酶(R-D-Gai)联以显色底物或荧光底物。
本发明的变体也可用于体内诊断试验。例如，可应用放射性核素标记多肽变体，以利于应用免疫闪烁扫描技术对抗原或表达该抗原的细胞进行定位。
表1 Fc变体
位置+氨基酸替换*
235    G，R
236    F，R，Y
237    K，N，R
238    E，G，H，I，L，V，W，Y
244    L
245    R
247    A，D，E，F，M，N，Q，R，S，T，W，Y
248    F，P，Q，W
249    L，M，N，P，Y
251    H，I，W
254    D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，V，W，Y
255    K，N
256    H，I，K，L，V，W，Y
257    A，I，M，N，S
258    D
260    S
262    L
264    S
265    K，S
267    H，I，K
268    K
269    N，Q
271    T
272    H，K，L，R
279    A，D，F，G，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，W，Y
280    T
283    F，G，H，I，K，L，M，P，R，T，W，Y
286    F
288    N，P
292    E，F，G，I，L
293    S，V
301    W
304    E
307    E，M
312    P
315    F，K，L，P，R
316    F，K
317    P，T
318    N，P，T
332    F，G，L，M，S，V，W
339    D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，W，Y
341    D，E，F，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y
343    A，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W，Y
373    D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W
375    R
376    E，F，G，H，I，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y
377    G，K，P
378    D，N
379    N，Q，S，T
380    D，N，S，T
382    D，F，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y
385    E，P
386    K
423    N
424    H，M，V
426    D，L
427    N
429    A，F，M
430    A，D，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y
431    H，K，P
432    R，S
438    G，K，L，T，W
439    E，H，Q
440    D，E，F，G，H，I，K，L，M，Q，T，V
442    K                                              
+根据EU编号的Fc氨基酸位置
*例如在第249位：249L、249M、249N或249Y
表2 Fc变体：效应子功能变化
变体* ADCC提高  ADCC降低   FcRn结合增强   FcRn结合减弱   CDC提高   CDC降低
235G235Q235R235S236F236R236Y237E237K237N237R238A238E238G238H238I238L238V238W238Y244L XXXXXXXXXXXXXXXXXXX XX XXXXXXXXX XX   XXXXXXXXXXXXXXXX
变体*  ADCC提高  ADCC降低   FcRn结合增强   FcRn结合减弱   CDC提高   CDC降低
245R247A247D247E247F247G247H247I247L247M247N247Q247R247S247T247V247W247Y248A248F248P248Q248W249E249L XXXXXXXXXX  XXXX   X XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX XXXXXXXXXXXXXXX   XXXXXX
变体*  ADCC提高   ADCC降低   FcRn结合增强   FcRn结合减弱   CDC提高   CDC降低
249M249N249P249Y250K250M250R251F251H251I251W252Y254A254D254E254F254G254H254I254K254L254M254N254P254Q XXXX XXXXXXXXXXX XXX   XXXXXXXXXXXXXXXXXXXX   XXXXXXXXXXXXXXX XXXXXXX
变体*   ADCC提高   ADCC降低   FcRn结合增强   FcRn结合减弱   CDC提高   CDC降低
254R254T254V254W254Y255K255N256A256F256G256H256I256K256L256M256P256Q256R256V256W256Y257A257I257M257N XXXX XXXXXXX XXXXXXX   XXXXXXXXXXXXXXXX   XXXXXXXXXXXXX XXXXXXX
变体*  ADCC提高  ADCC降低  FcRn结合增强   FcRn结合减弱   CDC提高   CDC降低
257S257V258D260S262L264S265H265K265S265Y267G267H267I267K268D268E268K269N269Q270A270G270K270M270N271T XXX  XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX  XXXXXXX XXXXXXXXX XX   XXXXXXXXXXXXXXXXXXX
变体*   ADCC提高   ADCC降低   FcRn结合增强     FcRn结合减弱     CDC提高   CDC降低
272H272K272L272N272R279A279D279F279G279H279I279K279L279M279N279Q279R279S279T279W279Y280A280K280T283A XXXX   XXXXXXXXXX   XXXXXXXXXXXXXXXXX XXXXX XXXXXX   XXX
 变体*  ADCC提高   ADCC降低   FcRn结合增强   FcRn结合减弱   CDC提高   CDC降低
 283D283F283G283H283I283K283L283M283N283P283Q283R283S283T283W283Y285N286F288N288P292A292E292F292G292I XXXXXX   XXXXXXXXXXXXX   XXXXXXXXXXXXXXXXXXX XXXX XXXXXXXXXXXX X
变体*  ADCC提高  ADCC降低  FcRn结合增强   FcRn结合减弱   CDC提高   CDC降低
292L293S293V301W304E307A307E307M311A311D311E311F311G311I311K311L311M311R311N311S311T311V311W311Y312P XXXXXX XXXXXXXXXXXX XXXXXXXXXXXX   XXXXXXXX   XXXXXXXXXXXXXX XXXXX
 变体*  ADCC提高     ADCC降低   FcRn结合增强   FcRn结合减弱   CDC提高   CDC降低
 314F314I314V314W314Y315F315K315L315P315R316F316K317P317T318N318P318T318V326W327T328V329Y330K330R332A XXXXXX     XXXXXXXXXXXX XXXX   XXXXXXXXXX   XXXXXXXXXXXXXXXXX XXXXXXX
 变体*  ADCC提高  ADCC降低   FcRn结合增强   FcRn结合减弱   CDC提高   CDC降低
 332D332E332F332G332H332K332L332M332N332Q332R332S332T332V332W332Y339D339E339F339G339H339I339K339L339M  XXXXXXXXXX XXXXX XXXXXXXX XXX   XXXXXXXXXXXXXXXXXXXX XXX
变体*  ADCC提高   ADCC降低   FcRn结合增强   FcRn结合减弱   CDC提高   CDC降低
339N339Q339R339S339T339W339Y341D341E341F341H341I341K341L341M341N341P341Q341R341S341T341V341W341Y343A  XXXXX XXXXXXXXXXXXXXXXX   XXXX XXXXXXXXXXXXXXXX   XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
变体* ADCC提高   ADCC降低   FcRn结合增强   FcRn结合减弱   CDC提高   CDC降低
343D343E343F343G343H343I343K343L343M343N343Q343R343S343T343V343W343Y373A373D373E373F373G373H373I373K   XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX XXXXXXX XXXXXXX   XXXXXXXXXXXXXXXXXXXX X
变体*  ADCC提高   ADCC降低   FcRn结合增强   FcRn结合减弱   CDC提高   CDC降低
373L373M373N373Q373R373S373T373V373W375R376A376E376F376G376H376I376L376M376N376P376Q376R376S376T376V XX   XXXXXXXXXXXXXX XXXXXXXX   XXXXXXXXXX   XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX X
变体*   ADCC提高   ADCC降低   FcRn结合增强   FcRn结合减弱   CDC提高   CDC降低
376W376Y377G377K377P378D378N379N379Q379S379T380A380D380N380S380T382A382D382F382H382I382K382L382M382N XXXXXXXX   XXXX XXXXXXXXXXXXXX   XX XXXXXXXXXXX XXXXX
 变体*  ADCC提高  ADCC降低     FcRn结合增强   FcRn结合减弱   CDC提高   CDC降低
 382P382Q382R382S382T382V382W382Y385E385P386K423N424H424M424V426D426L427N429A429F429M430A430D430F430G XXX XXXX XXXXXXXXXXXX XXXXXXX XXXXXXXXXXXX   XXXXXXXXXXX
变体*  ADCC提高   ADCC降低   FcRn结合增强  FcRn结合减弱     CDC提高   CDC降低
430H430I430K430L430M430N430P430Q430R430S430T430V430W430Y431H431K431P432R432S434G434H434I434W434Y436I XX   XXXXXXXXX   XXXXXXXXXXXXXXXXXXX XXXXX     XXXXXXXXXXXXXXXXXXX XXXX
 变体*  ADCC提高  ADCC降低  FcRn结合增强     FcRn结合减弱     CDC提高   CDC降低
 436L436T438G438K438L438T438W439E439H439Q440A440D440E440F440G440H440I440K440L440M440N440Q440R440T440V XXXX XXX  XXXXXXXXX XXXXXX XXX XXXXXXXXXXXXX
变体* ADCC提高   ADCC降低   FcRn结合增强   FcRn结合减弱   CDC提高   CDC降低
440W440Y442K X X X
*抗CD20抗体中测试的变体，IgG1 Fc区
表3    提高的ADCC
位置+  氨基酸替换*
247    A，F，H，I，L，M，T，V，Y
249    E，Y
251    F
254    F，M，Y
256    A，M
258    D
268    D，E
279    A
280    A，K
283    A，I，K，M，R
288    N
292    A
311    A，D，N，T，V，Y
315    L
318    N，P，T，V
330    K
332    T，V
339    D，F，G，I，K，M，N，Q，R，S，T
376    A，V
377    G，K
379    N
380    N，S
382    A，I
385    E
427    N
429    M
434    W
436    I
440    G，H，I，L            
+根据EU编号的Fc氨基酸位置
*例如在第249位：249E或249Y
表4    降低的ADCC
位置+   氨基酸替换
235    Q，R，S
236    F，R，Y
237    E，K，N，R
238    E，G，H，I，L，V，W，Y
247    G，R
249    L，P
250    K，M，R
251    H，I，W
252    Y
254    L，P，Q，T，V
256    V
257    A，I，M，N，S，V
260    S
262    L
264    S
265    H，K，S
267    G，H，I，K
269    N，Q
270    A，G，K，M，N
271    T
272    H，K，L，N，R
279    D，F，K，L，W
283    D，F，G，H，L，T，W，Y
285    N
288    P
292    E，F，G，I
293    S，V
301    W
304    E
307    A，E，M
311    F，I，K，S
312    P
314    F，I，V，W
315    F，  P
316    F
317    P
327    T
328    V
329    Y
332    G，K，L，R，W
341    D，E，F，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，W，Y
343    A，D，E，F，G，H，L，M，N，Q，R，S，T，V，W，Y
373    A，D，E，F，G，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W
375    R
376    A，E，F，G，H，W，Y
379    Q
382    D，S
429    A，F
430    H，K，N，Q，R，W
432    R，S
434    I
440    D，T，V
442    K                  
+根据EU编号的Fc氨基酸位置
表5    增强的FcRn结合亲和性
位置+   氨基酸替换
238    L
244    L
245    R
249    P
252    Y
256    P
257    A，I，M，N，S，V
258    D
260    S
262    L
270    K
272    L，R
279    A，D，G，H，M，N，Q，R，S，T，W，Y
283    A，D，F，G，H，I，K，L，N，P，Q，R，S，T，W，Y
285    N
286    F
288    N，P
293    V
307    A，E，M
311    A，I，K，L，M，V，W
312    P
316    K
317    P
318    N，T
332    F，H，K，L，M，R，S，W
339    N，T，W
341    P
343    E，H，K，Q，R，T，Y
375    R
376    G，I，M，P，T，V
377    K
378    D，N
380    N，S，T
382    F，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W，Y
423    N
427    N
430    A，F，G，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，Y
431    H，K
434    F，G，H，W，Y
436    I，L，T
438    K，L，T，W
440    K
442    K                    
+根据EU编号的Fc氨基酸位置
表6    减弱的FcRn结合亲和性
位置+   氨基酸替换
235    Q
236    Y
237    K，R
238    E，G，H，W
247    A，D，E，F，G，H，I，L，M，N，Q，R，S，W，Y
248    A，F，P，Q，W
249    E，L，M，Y
251    F，H，I，W
254    D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，W，Y
255    K，N
256    F，H，I，K，M，R，W，Y
264    S
265    S，Y
267    G，I
268    D，K
270    A，M
279    I，K，L
280    T
292    E，F，G，I，L
311    D，E，F，G，N，R，Y
315    F，K，P
316    F
317    T
326    W
327    T
339    E，G，L，R
341    D，E，F，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W，Y
343    M，V，W
373    A，D，G，K，L，M，N，Q，S，T，V，W
376    H，L，W，Y
424    M，V
426    D
429    A，F，M
430    D，W
431    P
432    R，S
434    I
439    Q
440    A，D，E，F，M           
+根据EU编号的Fc氨基酸位置
表7    提高的CDC
位置+   氨基酸替换
236    Y
244    L
247    A，D，E，G，N，Q，R，S，W
248    F，P，Q，W
249    E，L，M，N，P，Y
250    K，R
251    F，H，I，W
254    A，F，K，L，M，R，Y
255    K
256    A，G，I，L，M，P，Q，W，Y
260    S
268    D
279    Q，S，W，Y
280    K，T
283    F，G，H，I，K，L，M，N，P，R，S，W
292    L
307    A，M
311    F，I，K，L，M，T，V，W，Y
312    P
314    F，I，V，W，Y
315    F，K，L，P，R
316    K
317    P，T
318    N，T
332    A，D，E，F，G，H，L，M，N，Q，S，T，V，W，Y
339    D，F，G，H，I，K，N，Q，R，S，T，W，Y
341    D，E，F，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，Y
343    A，D，E，G，H，K，L，M，N，Q，R，S，T，W，Y
373    D，E，F，H，I，K，L，M，N，Q，R，T，V，W
375    R
376    A，F，G，H，L，N，P，Q，R，S，T，V
377    P
379    N，Q，S，T
380    A，N，S，T
382    I，L，Q，V
386    K
426    D，L
429    A，F，M
430    A，D，F，G，H，I，K，L，M，N，P，R，S，T，V，W，Y
431    H，P
432    R，S
434    W，Y
438    L，W
440    Q，Y                     
+根据EU编号的Fc氨基酸位置
表8    降低的CDC
位置+   氨基酸替换
235    G，S
236    R
237    E，K，N，R
238    A，E，G，H，I，L，V，W，Y
245    R
247    H，I，L，T，Y
250    M
252    Y
254    D，E，I，P，Q，T，V
255    N
257    A，I，M，N，S，V
262    L
264    S
265    H，Y
267    G，H，I，K
268    K
269    N，Q
270    G，M，N
271    T
272    H，L，N
292    A
293    S
301    W
307    E
311    E，S
316    F
318    P
327    T
328    V
329    Y
330    K，R
332    E，M
343    I
373    S
378    D
380    D
382    D，F，N，P，R，S，W，Y
385    E，P
423    N
424    H，M
427    N          
+根据EU编号的Fc氨基酸位置
实施例
以下提供的实施例意在示例并进一步阐明本发明的某些优选实施方案和方面，且不应视为对本发明范围的限制。
实施例I-应用ADCC试验筛选Fc区变体
本实施例描述了如何在ADCC试验中筛选抗体(如抗CD20)中的Fc区变体。
i.外周血单核细胞(PBMC)的分离
从健康供体获取约50ml的外周血，并以pH7.0的磷酸盐缓冲液(PBS)进行1∶2稀释。轻轻涡旋试管将溶液混合。取约12ml的Histopaque-1077(Sigma目录号1077-1)小心置于稀释血液样本的底层，随后在Sorvall RT6000B离心机中用转桶转子以1000转/分钟离心10分钟，离心中关闭制动器。吸取并弃去斜面的上层，然后收取白色的含PBMC的间层并用Hanks’平衡盐溶液(Gibco目录号14025-092)洗涤3次。将洗过的细胞团悬于约20ml的含10％胎牛血清(FBS)(Omega Scientific目录号FB-01)的RPMI1640培养基中。将重悬的PBMC分装到两个T-175培养瓶中，并在每瓶中加入30ml含10％FBS的RPMI，随后在含5％CO2的培养箱中37℃过夜培养。第二天将未贴壁的PBMC收集到50mL Falcon试管中，用前述方法离心并悬浮在含1％FBS且不含酚红的RPMI中。将小量的重悬细胞10倍稀释并用血球计数器计数。将剩余PBMC置于培养箱中待用。
ii.靶细胞系(特用于抗CD20 ADCC试验)
从ATCC获取表达CD20的B细胞系Wil.2和SKW6.4并以推荐的方法培养。试验用前一天，将细胞传代2次。第二天将细胞数调整到4×105个细胞/ml，并取50μl(20,000个细胞/孔)加入96孔组织培养板中。
iii.IgG稀释
筛选前，将本发明的含Fc变体的IgG进行表达、纯化并以标准ELISA定量。用于初级单点ADCC筛选时，将IgG变体用含1％FBS且无酚红的RPMI培养基稀释到40ng/ml。试验中的IgG终浓度为4倍稀释液(即终浓度为10ng/ml)。将50微升IgG加到靶细胞并于37℃孵育约15分钟，之后将效应细胞加到经调理的靶细胞。
进行IgG滴定时，IgG浓度在约0.0001到1μg/ml的范围内变化。应用96孔微滴定板制备IgG稀释液，所述制备通过将样本稀释于含1％FBS且无酚红的RPMI中实现。然后将稀释的IgG样本加到含靶细胞的试验平板。
iv.效应细胞
调整PBMC的浓度以使效应/靶细胞比值位于10-20∶1(即2-4×106个细胞/ml)的范围内。在每孔的经调理的靶细胞中加入重悬的100微升PBMC。将平板在5％CO2缺乏时37℃孵育3-4个小时。
v.乳酸脱氢酶(LDH)释放检测
通过测定从损伤细胞的胞浆释放到培养液上清中的LDH酶对靶细胞的裂解进行检测。经调理的靶细胞与效应细胞孵育后，将试验板以2000转/分钟离心5分钟。小心移出约75μl的细胞培养上清并避免存在细胞沉淀和碎片。将此上清直接加入微滴定平板中，并向此上清中加入75μl的LDH检测试剂(Roche目录号1 644 793)。然后将平板孵育约15-30分钟并应用Molecular Devices Vmax动态微板读取器(Kinetic Microplate Reader)读取490nm处的吸光值。
vi.数据分析
所有ADCC筛选试验均重复两次。每一试验平板包含自发靶细胞裂解、IgG缺乏下自发效应细胞和靶细胞的裂解以及靶细胞全部裂解的对照。将1％Triton X-100加到靶细胞实现靶细胞全部裂解。在每一试验平板中设置野生型对照，并取ADCC试验信号的均值。从每一样本中减去由自发裂解对照获取的背景值。从每一样本中减去由稀释的IgG获取的背景值。将吸光值转换成特异裂解对自发和全部裂解对照的百分比。由以下公式计算特异裂解百分比：特异裂解百分比＝(A490实验值-A490背景值)/(A490最大值-A490背景值)×100，其中A490背景值为不存在IgG时由效应细胞和靶细胞以及IgG背景获取的A490总值，其中所述IgG背景由存在于天然IgG上清中的污染LDH产生。根据野生型对照的均值将Fc变体活性百分比进行标准化。将重复试验平板的标准化活性百分比进行平均，并计算每一样本的试验平板个体间的标准差。
vii.结果
相对ADCC特异活性在下面的表9(单一替换)和10(组合替换)中显示。表9中报告的CDC值由此处实施例2中描述的方法产生，且表9中报告的FcRn结合试验值由此处实施例3中描述的方法产生。结果在以上的表1和表2中进行进一步总结。与单一替换相比产生较高ADCC值的那些组合替换为：247F、339D；247I、339D；247L、339D；247L、339T和247I、339Q。有些组合替换产生的ADCC值低于野生型ADCC的80％，尽管当单独替换试验时所产生的ADCC值要高于野生型ADCC值，这些组合替换为：247A、339D；247Y、339H；247I、339I；247T、339I；247L、339N；247A、339Q；和247A、339R。有些组合替换产生的ADCC值低于野生型ADCC的10％，尽管当单独替换试验时所产生的ADCC值要高于野生型ADCC值，这些组合替换为：247I、339I；247T、339I和247L、339N。
表9
WT*   位置和变体* ADCC ％CV   FcRnpH6.0 ％CV CDC ％CV n＝
LL   WT(a，z)235A235E   1008780 23.217.4   10010287 11.916.2   1006748 7.935.8 22
WT*  位置和变体* ADCC ％CV   FcRnpH6.0 ％CV CDC ％CV n＝
LLLLGGGGGGGPPPPPPPPPPPPPP  235G235Q235R235S236F236R236Y237E237K237N237R238A238E238G238H238I238L238V238W238Y244L245R247A247D247E  938645920080000000000460077621229595   30.31.810.52.0942.1228.772.789.2113.3107.581.3205.820.692.848.9180.437.411.866.634.023.415.016.223.410.3   8581938588101769378915690766672941151028774124188975452  21.214.434.140.07.920.610.035.012.816.360.69.66.76.911.46.413.68.35.415.89.67.20.32.88.7  589811000141683612222829242311183467231613442116131118   46.025.113.8262.9283.3110.10.328.8136.031.510.549.5101.0120.5206.354.150.119.2103.4288.86.05.30.91.10.0   2222242444444444444422222
WT*  位置和变体* ADCC ％CV   FcRnpH6.0 ％CV CDC ％CV n＝
  PPPPPPPPPPPPPPKKKKKDDDDDD  247F247G247H247I247L247M247N247Q247R247S247T247V247W247Y248A248F248P248Q248W249E249L249M249N249P249Y  144821451401441279110358106129120102143100107103101102110731019456110     18.816.111.222.910.121.037.28.515.538.611.213.56.58.45.418.09.10.59.46.71.49.615.94.08.8   675357957184126728175Na0715034383078155011213841   1258.94.2252.430.733.71599.038.7294.31.215.027.5na1314.2na179.9559.499.489.354.522.4179.94.514.021.028.3   711377922011410913712713037na12288102202226174166258214163255119170   34.10.97.5198.3722.77.24.03.74.92.634.8na0.57.12.44.01.317.98.316.13.21.210.90.26.6     626616624221022622222422422
WT*  位置和变体* ADCC ％CV  FcRnpH6.0 ％CV CDC ％CV n＝
 TTTLLLLMISSSSSSSSSSSSSSSS  250K250M250R251F251H251I251W252Y253A254A254D254E254F254G254H254I254K254L254M254N254P254Q254R254T254V  3878841255984956110399101102121100108991098989907884995468  27.111.00.76.011.69.82.95.86.120.114.23.811.214.720.02.514.89.811.913.317.712.61.351.940.5  96165626446709640776070259740839143231   30.17.434.047.65.6333.3na27.912.0733.0113.9107.91087.486.874.364.377.212.6212.15.6141.4121.2128.234.740.5   199472881601671901616281139747220610285801372272487675741527584   13.56.613.916.622.718.817.346.123.911.231.235.214.46.122.011.56.112.113.434.625.225.24.812.14.4   64410222444226244266222222
WT*  位置和变体* ADCC ％CV  FcRnpH6.0 ％CV CDC ％CV n＝
SSRRTTTTTTTTTTTTTTTTTTPPP  254W254Y255K255N256A256D256E256F256G256H256I256K256L256M256N256P256Q256R256S256V256W256Y257A257I257M  981179684115979111995103931009312210210910094103829697865426  6.09.43.517.716.55.312.93.320.06.311.56.73.917.47.211.817.28.85.311.18.57.211.516.411.0  00412716054433951622672317835229190643316911414683191022835     116.1129.165.9162.73.010.68.4435.08.06.13.720.660.578.96.46.114.260.03.130.584.518.615.014.519.1   188211276811908610412822191157922672008626015271101109170127344648  7.715.79.318.119.623.27.226.624.511.916.220.222.714.823.211.811.347.115.911.014.418.053.722.448.4     66422662224241028422242464
WT*  位置和变体* ADCC ％CV  FcRnpH6.0 ％CV CDC ％CV n＝
PPPETVVDDDDSSSSHHHEEDDDDD  257N257S257V258D260S262L264S265H265K265S265Y267G267H267I267K268D268E268K269N269Q270A270G270K270M270N  2728181159361108109329000110110982347410154928  13.128.897.97.05.62.939.8118.9146.2106.37.68.648.478.073.37.88.317.674.03.635.5102.2465.519.21185.2  8671844473611245257879107663386868310268126869298871081228194     15.76.841.520.57.415.120.036.134.328.988.80.916.811.814.232.417.810.417.03.56.016.58.45.28.2     624627110171305081841036260475026122100243022363702534   31.430.1143.59.617.148.036.70.546.413.321.518.141.137.847.110.78.4112.769.482.866.521.8462.9606.9103.7  4424222222244446844444444
WT*  位置和变体* ADCC ％CV  FcRnpH6.0 ％CV CDC ％CV n＝
 PEEEEEVVVVVVVVVVVVVVVVDDD  271T272H272K272L272N272R279A279D279F279G279H279I279K279L279M279N279Q279R279S279T279W279Y280A280K280T  2673707890501148781987910191961071028510594956882111137108  53.913.68.921.17.52.114.612.14.82.428.11.61.53.08.332.028.34.829.815.524.826.844.947.6na  961573201291103512143671132561738379781222041811302422651621395512060   20.423.020.43.933.03.35.00.314.311.629.61.326.113.93.519.58.010.718.36.922.88.650.127.212.6   3253118717110210698106109127100106100918513998122110125144135192122   89.134.828.73.134.61.221.28.510.018.022.721.00.75.710.350.28.18.716.712.810.513.228.733.58.7   42422222226222266261066224
WT* 位置和变体* ADCC ％CV   FcRnpH6.0 ％CV CDC ％CV n＝
EEEEEEEEEEEEEEEEEHNKKRRRR 283A283D283F283G283H283I283K283L283M283N283P283Q283R283S283T283W283Y285N286F288N288P292A292E292F292G  107847493871061099211210297951029110390819310711045114357394  2.18.40.13.16.11.95.83.17.43.811.95.30.31.53.22.86.72.67.18.71.12.921.416.42.5   1261101681372061432461269511913611728214314311714220230716211985656460     0.24.038.64.46.55.65.11.313.87.43.98.08.111.112.42.14.119.832.313.23.067.548.57.635.9     96921271351231261331201201351181221441191081591361131081181167492101119   17.910.320.48.515.912.38.00.12.423.411.822.916.712.311.01.317.221.116.119.115.721.132.18.332.8   2222222226422222244424222
WT*  位置和变体* ADCC ％CV  FcRnpH6.0 ％CV CDC ％CV n＝
RREERSTTTQQQQQQQQQQQQQQQQ  292I292L293S293V301W304E307A307E307M311A311D311E311F311G311I311K311L311M311N311P311R311S311T311V311W  799668735248788821061111028998878010797115999686111108104  1.53.97.412.5105.432.94.47.95.32.46.01.76.91.98.213.46.77.21.98.08.58.810.21.78.2  56681011271191012334923021393846645843716518638754891497131558215   23.640.023.018.018.18.714.534.623.77.022.217.77.521.59.65.59.215.010.5300.584.510.514.019.52.8   106123981074912211581150898378212922361701912521261721700168240251   3.77.20.124.031.111.36.52.46.528.313.60.720.79.611.39.38.116.323.367.914.492.823.423.318.7   2222424442222286462422244
WT*  位置和变体* ADCC ％CV   FcRnpH6.0 ％CV CDC ％CV n＝
 QDLLLLLNNNNNGGKKEEEEKALPA  311Y312P314F314I314V314W314Y315F315K315L315P315R316F316K317P317T318N318P318T318V326W327T328V329Y330K   107977083657987831081126296547754991231201091167447653134   3.01.47.813.014.011.013.612.83.56.210.224.426.028.821.510.97.210.85.73.417.913.43.241.59.3   94546428621564518810314713413114549216753041149354101107108   0.316.141.222.7128.880.281.438.310.210.5289.138.372.48.91.64.87.527.156.821.25.719.56.313.251.4  2111481081841791902381401481452311358114319011812079118952147562543     25.011.65.514.210.92.03.215.38.25.59.10.410.08.64.74.07.017.010.511.59.7206.213.990.323.9   2224444222422242444422446
WT*  位置和变体* ADCC ％CV  FcRnpH6.0 ％CV CDC ％CV n＝
 AIIIIIIIIIIIIIIIIIAAAAAAA  330R332A332D332E332F332G332H332K332L332M332N332Q332R332S332T332V332W332Y339D339E339F339G339H339I339K  103100143168977482129498959912961121098193131100104107114136129  5.56.13.110.614.519.84.3114.50.92.215.38.4135.54.97.51.116.813.110.40.43.33.723.414.624.2  121967886108941291461271289298114263100115123938075120671078083  39.427.633.722.23.41.41.17.02.616.116.17.97.264.15.319.53.712.326.44.224.66.510.030.629.0  31130151143149121150671541781371488817712414715015218391217118136205201   36.65.011.59.811.011.511.515.55.16.65.18.530.016.54.525.19.75.320.30.18.50.30.522.821.0   64618422222462242226262266
WT* 位置和变体* ADCC ％CV   FcRnpH6.0 ％CV CDC ％CV n＝
AAAAAAAAAGGGGGGGGGGGGGGGG  339L339M339N339Q339R339S339T339W339Y341D341E341F341H341I341K341L341M341N341P341Q341R341S341T341V341W     9711511012811712414292976273245444776455833559596506514     8.76.86.315.814.413.014.213.417.06.96.9100.89.315.53.924.339.89.147.218.714.926.6866.0171.025.8   83111146102829513815692525052653667547953127727855686976     9.87.23.519.813.423.66.211.419.837.818.141.963.717.218.919.89.717.09.91.07.412.254.015.08.9   10457240138128170220243265172161227245173161171232162228166168224176213178     8.78.817.511.02.122.520.210.621.93.53.814.716.05.32.64.211.19.516.27.77.59.210.09.68.7   224626106102266222626226242
WT* 位置和变体* ADCC ％CV  FcRnpH6.0 ％CV CDC ％CV n＝
GPPPPPPPPPPPPPPPPPPYYYYYY 341Y343A343D343E343F343G343H343I343K343L343M343N343Q343R343S343T343V343W343Y373A373D373E373F373G373H  26756965747578927463606772948469704863567441763979  24.518.611.534.920.629.133.826.837.717.235.18.90.51.37.54.21.922.39.93.717.723.62.621.634.2  5411010234589110191114232125831054421981011267756112337410611038100  5.237.77.96.413.014.91.216.72.63.813.719.914.010.414.316.15.36.47.215.032.520.812.725.413.9   184143157157992441598618512713419617817920715110719427012122715111775169   14.35.918.317.61058.411.13.110.59.15.618.718.23.09.911.94.412.017.914.428.710.219.51.033.78.2  2222462222422462226262224
WT*  位置和变体* ADCC ％CV   FcRnpH6.0 ％CV CDC ％CV n＝
 YYYYYYYYYYYSDDDDDDDDDDDDD  373I373K373L373M373N373Q373R373S373T373V373W375R376A376E376F376G376H376I376L376M376N376P376Q376R376S  6576767864638152707377691118584737410088869385889585   9.012.221.41.221.511.020.53.73.02.123.310.918.212.37.33.116.114.116.721.614.515.15.06.021.4   7370665361551077482697559515582116135811447812994203116103134     14.02.917.025.823.324.724.11.916.614.318.515.926.729.512.63.918.67.23.01.424.212.922.712.327.3   154246189115148158221721511152371661809811916411810114291173153176166209     6.46.96.23.212.117.74.024.85.71.120.81.15.213.58.60.65.650.53.215.114.919.619.94.625.3     26622262226222222102246422
WT*  位置和变体* ADCC ％CV   FcRnpH6.0 ％CV CDC ％CV n＝
 DDDDIIIAAVVVVEEEEEEEEEEEE  376T376V376W376Y377G377K377P378D378N379N379Q379S379T380A380D380N380S380T382A382D382F382H382I382K382L  10211253781071179998101961138010110610211111010011095121891099693   20.08.122.04.22.410.011.36.67.119.53.218.416.63.22.17.78.51.26.00.813.817.96.42.616.5   16025115376167981631807485861091527314223017210373222135131153126   11.215.01719.925.828.827.732.413.93.039.027.313.414.928.844.219.024.111.07.825.716.62.86.230.211.1   224210899892902451990204218137237139781391311158280678421992156   10.111.134.839.97.611.36.591.930.75.54.11.42.24.20.77.30.14.829.634.228.220.45.415.67.7   61222244624424222222262642
WT* 位置和变体* ADCC ％CV  FcRnpH6.0 ％CV CDC ％CV n＝
EEEEEEEEEEGGQFSSSSSVHHHEE 382M382N382P382Q382R382S382T382V382W382Y385E385P386K423N424H424M424V426D426L427N429A429F429M430A430D  89998510510485898397105108100961071169110310591108447010310096  14.61.116.812.28.42.910.232.510.511.55.53.29.58.529.83.59.324.335.35.581.711.10.78.38.2  135137122162165151172173172188981011151589760576511719261778317944   8.65.222.012.02.710.05.26.25.214.518.823.24.82.17.360.035.410.014.35.911.416.512.26.625.5   12669691408575109167737808226648587511531819364147288173204190   20.34.514.619.33.04.130.00.41.93.31586.315.81.627.59.314.410.512.720.423.11.912.83.27.14.6   2222422224224222444224224
WT*  位置和变体* ADCC ％CV   FcRnpH6.0 ％CV CDC ％CV n＝
EEEEEEEEEEEEEEEEAAALLNNNN  430F430G430H430I430K430L430M430N430P430Q430R430S430T430V430W430Y431H431K431P432R432S434F434G434H434I     111979187669810282103797588827978778198625858na1059081   13.07.87.719.39.533.316.124.613.18.37.530.122.935.68.344.544.026.612.023.155.4na17.912.99.3   218131192308131242195171863202491831372811112615117629387010083588556   19.410.68.06.612.68.78.713.016.712.86.63.423.77.095.012.511.54.413.815.63.61.420.220.4725.4   20325222729720326322716225497227221249276171231236113210175124na265773   8.17.54.217.216.010.64.62.223.54.97.918.58.217.55.4nana25.08.013.30.2na128.99.18.9  2666466288826622222224462
WT* 位置和变体* ADCC ％CV     FcRnpH6.0 ％CV CDC ％CV n＝
NNYYYQQQQQKKKSSSSSSSSSSSS 434W434Y436I436L436T438G438K438L438T438W439E439H439Q440A440D440E440F440G440H440I440K440L440M440N440Q  10810611911290939994969310391907982104111106108121116112847873  6.67.718.027.235.032.131.732.537.432.528.937.338.242.318.44.016.11.92.11.916.76.451.034.343.1     13351615194172115981692001261649499748272738710111096132126808281   18.838.824.28.17.214.412.314.79.58.29.00.90.92.04.72.88.28.12.16.27.82.28.225.433.5     138291359048681161905612653776485998773839686717781108132     1.715.58.716.320.326.243.05.526.81.740.317.826.522.59.435.318.58.518.32.626.44.520.615.816.6   2424222422222222222244222
WT* 位置和变体* ADCC ％CV     FcRnpH6.0 ％CV CDC ％CV n＝
  SSSSSS 440R440T440V440W440Y442K   91898511410980   11.32.111.317.66.851.9     88719885100138     16.239.018.713.814.24.5     85115110132224100     29.817.416.414.814.111.1     2222162
Na＝未获得数据或未进行试验
*例如L235A表示Fc235位氨基酸(根据EU编号)处存在的亮氨酸已经替换为丙氨酸残基
此处试验：Fc区为IgG1 Fc，抗体为抗CD20抗体
表10组合变体-ADCC
变体   ADCC均值，表示为相对wt的百分比 CV％ n＝
    野生型   100     2.42     2
    247A，339D   71.50     0.50     2
    247F，339D   134.95     2.54     2
    247H，339D   118.45     8.46     4
    247I，339D   187.21     20.45     2
    247L，339D   156.73     3.30     2
    247T，339D   126.46     4.71     2
    247Y，339D   121.93     4.58     2
    247A，339H   125.35     0.60     2
    247F，339H   101.54     4.53     2
变体   ADCC均值，表示为相对wt的百分比 CV％ n＝
    247H，339H   114.24     4.91     2
    247I，339H   126.94     5.22     2
    247L，339H   120.92     2.44     2
    247T，339H   97.96     5.71     2
    247Y，339H   74.75     2.43     2
    247A，339I   96.95     3.05     2
    247F，339I   116.53     5.52     2
    247H，339I   108.27     2.97     2
    247I，339I   -4.07     -47.26     2
    247L，339I   109.76     5.95     2
    247T，339I   5.48     9.51     2
    247Y，339I   100.84     9.58     2
    247A，339K   86.90     13.51     2
    247F，339K   105.85     10.11     2
    247H，339K   97.59     7.67     2
    247I，339K   97.41     14.89     2
    247L，339K   104.36     7.07     2
    247T，339K   83.02     6.07     2
    247Y，339K   95.79     3.69     2
    332E   180.96     0.72     2
    247A，339N   83.60     9.91     2
    247F，339N   100.36     8.95     2
变体   ADCC均值，表示为相对wt的百分比 CV％ n＝
    247H，339N   86.70     7.62     2
    247I，339N   119.62     13.07     2
    247T，339N   114.38     4.83     4
    247Y，339N   113.18     1.50     2
    332E   187.19     9.53     2
    247A，339Q   69.94     8.45     2
    247F，339Q   130.42     2.35     2
    247H，339Q   138.96     1.32     2
    247I，339Q   146.44     2.27     2
    247L，339Q   140.50     4.58     2
    247T，339Q   119.70     4.03     2
    247Y，339Q   109.40     2.24     2
    247A，339R   68.57     8.33     2
    247F，339R   114.38     11.85     2
    247H，339R   105.46     9.89     2
    247I，339R   124.96     16.31     2
    247L，339R   119.77     12.03     2
    247T，339R   109.42     12.17     2
    247Y，339R   98.58     13.09     2
    247L，339T   148.48     7.08     4
wt＝野生型
CV％＝
n＝检测并进行均值化的样本数
表11ADCC增强的组合变体
 Fc变体  ADCCEC50(ng/ml)
 野生型  6.8
 247L  2.2
 330K  3.1
 332E  1.5
 339T  3.8
 247L，330K  1.5
 247L，332E  0.73
 247L，339T  2.0
 330K，332E  0.73
 330K，339T  2.0
 332E，339T  1.0
 247L，332E，339T  0.75
 247L，330K，332E  0.25
 247L，330K，339T  1.5
 330K，332E，339T  0.25
 247L，330K，332E，339T  0.25
*ADCC活性根据滴定曲线计算
表12组合变体
突变 ADCC CV％   FcRn6.0 CV％ CDC CV％ n＝
 野生型247H339D247L251F330R332E247L251F376I247L332E247L332E376I247T339N251F332E251F332E376I251F376I256P311I256P314Y332E440Y256P314Y440Y256P332E256P332E440Y256P430Q256P434H256P440Y257I311I257I311I434H257I430Q257I434H268D332E268E332E   1001181847716813711414713611410714611217418410910516952482667137178 8.513.329.77.38.14.812.415.98.10.23.122.616.325.42.61.219.77.712.28.17.012.45.3   100N/D50617874N/D72686626886791211171503421224095533044729288 N/D5.98.74.98.0N/D2.25.02.91.219.53.08.26.55.33.10.73.94.90.66.313.72.0  100N/D431246576N/D19616010235719022618923035429924761755561128160 N/D1.311.36.24.3N/D2.610.99.410.04.59.43.910.03.32.926.66.78.812.914.04.14.7 42264464422242422264244
 272R279L279A288N279A288N311T318V279A288N318N279A288N318T279A288N318V279A311T318T288N311T318T311T318T314Y332E440Y314Y440Y330K332D330K332E330R332D330R332E332E376I332E376V332E440Y343R345D376V430Q376V430R376V434H  56107110110116118110115107156125179202152161132139203121928497  0.23.99.05.45.18.87.99.95.35.412.72.95.66.34.38.61.913.016.01.52.73.3  156N/DN/DN/DN/DN/DN/DN/DN/D82788894889410213294143212188382   1.2N/DN/DN/DN/DN/DN/DN/DN/D0.98.58.30.06.32.17.63.55.71.64.29.13.3   72N/DN/DN/DN/DN/DN/DN/DN/D1551084342445919326115929125619195   5.1N/DN/DN/DN/DN/DN/DN/DN/D0.02.60.31.01.54.05.28.65.93.312.21.06.1     2444444442222246642424
表13组合变体
突变  FcRn6.0  CV％  n＝
野生型258D272R  100382.8 8.2 2
 258D283R258D286F258D307E258D311I258D376V272R283R272R286F272R311I272R376V279D307E283R307E283R311I283R376V286F307E286F311I286F376V307E376V311I376V  411.1445.0237.1522.0415.1439.3338.4396.1368.7522.4400.2531.3474.8431.2412.3348.9480.1413.5  3.71.74.87.04.321.78.914.48.18.89.16.11.13.80.01.54.339.1  222222222222222222
实施例2-变体CDC活性的表征
本实施例描述了如何测定不同Fc区变体的CDC活性。
本试验应用人类补体(Quidel Corp.，目录号AI 13)在15 Ramos(RA#1)细胞(ATCC目录号CRL-1596)上进行。在含10％FBS的Gibco RPMI 1640培养基中于37℃和5％CO2条件下培养Ramos细胞。试验前一天，将1×106个细胞接种到T175培养瓶中。第二天，将细胞以3.57×105个细胞/ml重悬于含1％FBS且无酚红的RPM1 1640中。将细胞以70μl细胞/孔接到Costar3917平底培养板。用于滴定曲线试验时，以RPMI 1640三倍稀释制备含Fc区变体的IgG。用于单点文库筛选试验时，应用mock培养基将培养上清中瞬时表达的IgG变体标准化为1μg/ml。将1∶5稀释于RPMI 1640+1％FBS中的30μl IgG变体(即200ng/ml的终浓度)和50μl的人类补体(QuidelCorp.，目录号A113)加到靶细胞，并小心吹吸充分混匀。将平板于5％CO2缺乏时37℃孵育1.5小时。以15μl/孔加入Alamar Blue(Serotec，目录号BUF012B)后继续孵育过夜。然后通过PerkinElmer’s EnVision 2100多标读取器测定560nm处激发和590nm处发射的荧光信号。
ii.数据分析，
所有单点试验均进行两次。每一试验平板均包含由人类补体在IgG缺乏时产生的自发靶细胞裂解对照和1％Triton X-100缺乏时的靶细胞最大裂解对照。每一试验平板中均包括3个野生型对照，并计算CDC试验的平均值。从每一样本中减去由自发裂解对照获取的背景值。将荧光信号转换成基于自发和最大裂解对照的特异裂解百分比。由以下公式计算特异裂解百分比：特异裂解百分比＝(实验荧光信号-自发信号)/(最大裂解信号-自发信号)×100。然后计算Fc变体活性对3个野生型对照均值的百分比。将重复试验平板的对野生型活性的百分比进行平均，并计算每一试验平板间的标准差。
实施例3-对FcRn结合的表征
本实施例描述了用于测定Fc新生儿受体(FcRn)与含Fc区变体的IgG结合的试验。
将一U型底的96孔ELISA平板(Costar)用2μg/ml的中性亲和素(Neutravidin)(Pierce BioTechnology，目录号31000)以50μl/孔进行4℃过夜包被，所述中性亲和素以50mM碳酸盐缓冲液(pH9.3)制备。移去未结合的中性亲和素并用PBST(含0.1％吐温20的PBS)洗涤平板3次。每孔中加入50μl生物素标记的可溶FcRn(2.5μg/ml，PBS制备)，并于室温孵育1小时。然后将75μl的酪蛋白封闭缓冲液(Pierce Bio Technology，目录号37528)加入平板进行1小时封闭。然后用PBST洗涤ELISA平板，并与50μl/孔的IgG变体进行孵育。用于滴定曲线试验时，以FcRn结合缓冲液(100mM NaPO4，0.05％吐温-20，任选不同的pH值(从6.0到7.4))中3倍系列稀释制备试验用IgG。用于单点筛选试验时，将培养上清中瞬时表达的IgG变体标准化为50ng/ml的终浓度并以FeRn结合缓冲液将其pH调整到6.0。在以下步骤中，应用相应pH的FcRn结合缓冲液洗涤平板以及稀释试剂。在室温进行结合反应1小时。洗涤3次后，与山羊(Fab′)2抗人-Fab-HRP连接物反应1小时以检测结合的IgG。在Pierce’s HRP底物(Turbo TMB-ELISA，目录号34022)中反应5-30分钟以显示HRP活性。加入50μl的2M H2SO4终止反应并以VMAX微板读取器(Molecular Devices)读取450nm处的吸光值。
实施例4-抗CD20-I332E Fc变体的人类治疗
体外研究和鼠肿瘤模型(Clynes RA等，Nat Med.6：443(2000))提供的证据显示，ADCC在抗CD20抗体(如RITUXAN)的抗肿瘤效应中发挥作用。可应用抗CD20-I332E Fc变体抗体或RITUXAN对人类患者进行治疗，前述方法与在Cartron等，血液(Blood)99：754(2002)中公开的方法类似。例如，对于II期到IV期疾病(根据Ann-Arbor分类)并具有至少一处可测定的疾病部位以及低肿瘤负荷(根据GELF标准)的患者，可应用总计4个约375mg/m2剂量的抗CD20-Fc变体或应用RITUXAN通过静脉输注(第1、8、15和22天)进行治疗。初期效应的终点是客观反应率(objective response rate)，即根据由国际专家委员会新近提交的标准而达到完全好转(CR)、不确定CR(Cru)或部分反应(PR)的患者的比例。临床反应可在第二个月(M2)进行评估。也可在1年(M12)后对患者的疾病进展进行评估。
可对经RITUXAN或抗CD20-Fc变体治疗的患者，将M2和M12客观反应率进行比较，以对由Fc变体提供的ADCC活性改进进行定量。同一样本可重复实施以其它抗CD20变体(参见如此处的表1-10)。
此外，具改进效能的变体可允许不同的施用途径、较少的次数注射和/或更小的施用剂量。在上述说明书中提及了所有的公开物和专利。对本领域的技术人员显而易见的是，本发明所描述方法和系统的多种修改和变通并不背离本发明的范围和精神。尽管仅在与本发明关联的特定优选实施方案中对本发明进行了描述，本发明的权利要求不应仅限于此类特定实施方案。实际上，此处所描述的实施本发明的方法的多种修改，对化学、分子生物学或相关领域的技术人员而言，显而易见地应该包含在下列权利要求的范围之内。
序列表
<110>应用分子进化公司(AME)
<120>Fc区变体
<130>X16877
<140>US60/643,718
<141>2005-01-13
<150>US60/638,442
<151>2004-12-23
<150>US60/609,101
<151>2004-10-09
<150>US60/604,339
<151>2004-08-25
<150>US60/602,953
<151>2004-08-19
<150>US60/598,855
<151>2004-04-08
<160>36
<170>PatentIn版本3.3
<210>1
<211>218
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>1
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
1               5                   10                  15
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
            20                  25                  30
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
        35                  40                  45
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
    50                  55                  60
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
65                  70                  75                  80
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
                85                  90                  95
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
            100                 105                 110
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
        115                 120                 125
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
    130                 135                 140
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
145                 150                 155                 160
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
                165                 170                 175
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
            180                 185                 190
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
        195                 200                 205
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
    210                 215
<210>2
<211>217
<212>PRT
<213>人
<400>2
Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1               5                   10                  15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
            20                  25                  30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
        35                  40                  45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
    50                  55                  60
Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His
65                  70                  75                  80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
                85                  90                  95
Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln
            100                 105                 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
        115                 120                 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
    130                135                  140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145                 150                 155                 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
                165                 170                 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
            180                 185                 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
        195                 200                 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
    210                 215
<210>3
<211>218
<212>PRT
<213>人
<400>3
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
1               5                   10                  15
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
            20                  25                  30
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp
        35                  40                  45
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
    50                  55                  60
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
65                  70                  75                  80
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
                85                  90                  95
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly
            100                105                  110
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
        115                 120                 125
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
    130                 135                 140
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn
145                 150                 155                 160
Asn Tyr ASn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
                16                  170                 175
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
            180                 185                 190
Ile Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr
        195                 200                 205
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
    210                 215
<210>4
<211>218
<212>PRT
<213>人
<400>4
Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
1               5                   10                  15
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
            20                  25                 30
Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp
        35                  40                  45
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
    50                  55                  60
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
65                  70                  75                  80
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
                85                  90                  95
Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
            100                 105                 110
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu
        115                 120                 125
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
    130                 135                 140
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
145                 150                 155                 160
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
                165                 170                 175
Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn
            180                 185                 190
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
        195                 200                 205
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
    210                 215
<210>5
<211>215
<212>PRT
<213>鼠(Mus sp.)
<400>5
Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys
1               5                   10                  15
Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val
            20                  25                  30
Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp
        35                  40                  45
Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe
    50                  55                  60
Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp
65                  70                  75                  80
Cys Leu ASn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe
                85                  90                  95
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys
            100                 105                 110
Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys
        115                 120                 125
Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp
    130                 135                 140
Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys
145                 150                 155                 160
Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser
                165                 170                 175
Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr
           180                  185                 190
Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser
        195                 200                 205
Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
    210             215
<210>6
<211>218
<212>PRT
<213>鼠
<400>6
Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
1               5                   10                  15
Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys
            20                  25                  30
Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp
        35                  40                  45
Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg
    50                  55                  60
Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln
65                  70                  75                  80
His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn
                85                  90                  95
Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly
            100                 105                 110
Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu
        115                 120                 125
Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met
    130                 135                 140
Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu
145                 150                 155                 160
Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe
                165                 170                 175
Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn
            180                 185                 190
Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr
        195                 200                 205
Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
    210                 215
<210>7
<211>218
<212>PRT
<213>鼠
<400>7
Pro Ala Pro Asn Leu Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
1               5                   10                  15
Asn Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys
            20                  25                  30
Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp
        35                  40                  45
Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg
    50                  55                  60
Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Ile Arg Val Val Ser His Leu Pro Ile Gln
65                  70                  75                  80
His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn
                85                  90                  95
Lys Asp Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly
            100                 105                 110
Leu Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Pro Ala Glu Gln
        115                 120                 125
Leu Ser Arg Lys Asp Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Val Gly Phe Asn
    130                 135                 140
Pro Gly Asp Ile Ser Val Glu Trp Thr Ser Asn Gly His Thr Glu Glu
145                 150                 155                 160
Asn Tyr Lys Asp Thr Ala Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe
                165                 170                 175
Ile Tyr Ser Lys Leu Asn Met Lys Thr Ser Lys Trp Glu Lys Thr Asp
            180                 185                 190
Ser Phe Ser Cys Asn Val Arg His Glu Gly Leu Lys Asn Tyr Tyr Leu
        195                 200                 205
Lys Lys Thr Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys
    210                 215
<210>8
<211>218
<212>PRT
<213>鼠
<400>8
Pro Pro Gly Asn Ile Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
1               5                   10                  15
Lys Pro Lys Asp Ala Leu Met Ile Ser Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys
            20                  25                  30
Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val His Val Ser Trp
        35                  40                  45
Phe Val Asp Asn Lys Glu Val His Thr Ala Trp Thr Gln Pro Arg Glu
    50                  55                  60
Ala Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln
65                  70                  75                  80
His Gln Asp Trp Met Arg Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn
                85                  90                  95
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly
            100                 105                 110
Arg Ala Gln Thr Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Arg Glu Gln
        115                 120                 125
Met Ser Lys Lys Lys Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Thr Asn Phe Phe
    130                 135                 140
Ser Glu Ala Ile Ser Val Glu Trp Glu Arg Asn Gly Glu Leu Glu Gln
145                 150                 155                 160
Asp Tyr Lys Asn Thr Pro Pro Ile Leu Asp Ser Asp Gly Thr Tyr Phe
                165                 170                 175
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Thr Asp Ser Trp Leu Gln Gly Glu
            180                 185                 190
Ile Phe Thr Cys Ser Val Val His Glu Ala Leu His Asn His His Thr
        195                 200                 205
Gln Lys Asn Leu Ser Arg Ser Pro Gly Lys
    210                 215
<210>9
<211>110
<212>PRT
<213>人
<400>9
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1               5                   10                  15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
            20                  25                  30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
        35                  40                  45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
    50                  55                  60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65                  70                  75                  80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
                85                  90                  95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
            100                 105                 110
<210>10
<211>107
<212>PRT
<213>人
<400>10
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
1               5                   10                  15
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
            20                  25                  30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
        35                  40                  45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
    50                  55                  60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65                  70                  75                  80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
                85                  90                  95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
            100                 105
<210>11
<211>330
<212>PRT
<213>人
<400>11
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                   40                 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65                   70                 75                  80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
            100                 105                 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
        115                 120                 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
    130                 135                 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145                 150                 155                 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
                165                 170                 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
            180                 185                 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Tyr Cys Lys Val Ser Asn
        195                 200                 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
    210                 215                 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225                 230                 235                 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
                245                 250                 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
            260                 265                 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
        275                 280                 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
    290                 295                 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305                 310                 315                 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
                325                 330
<210>12
<211>329
<212>PRT
<213>人
<400>12
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
            100                 105                 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
        115                 120                 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
    130                 135                 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145                 150                 155                 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
                165                 170                 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
            180                 185                 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
        195                 200                 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
    210                 215                 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln ValTyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225                 230                235                  240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
                245                 250                 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
            260                 265                 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
        275                 280                 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Asn Val
    290                 295                 300
Phe Ser Cys Ser Val Mer His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
305                 310                 315                 320
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
                325
<210>13
<211>97
<212>RRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工构建体
<400>13
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Pro Tyr Ile
            20                  25                  30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
        35                  40                  45
Ala Thr Ser Ala Leu Ala Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu
65                  70                  75                  80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Leu Ser Asn Pro Pro Thr
                85                  90                  95
Phe
<210>14
<211>111
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工构建体
<400>14
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Arg Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Ala Ile Tyr Pro Leu Thr Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Ser
    50                  55                  60
Lys Leu Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Ser Thr Tyr Val Gly Gly Asp Trp Gln Phe Asp Val Trp
            100                 105                 110
<210>15
<211>97
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工构建体
<400>15
Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile
            20                  25                  30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
        35                  40                  45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
65                  70                  75                  80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr
                85                  90                  95
Phe
<210>16
<211>111
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工构建体
<400>16
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Ala Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp
            100                 105                 110
<210>17
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工构建体
<400>17
Arg Ala Ser Ser Ser Val Pro Tyr Ile His
1               5                   10
<210>18
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工构建体
<400>18
Ala Thr Ser Ala Leu Ala Ser
1               5
<210>19
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工构建体
<400>19
Gln Gln Trp Leu Ser Asn Pro Pro Thr
1               5
<210>20
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工构建体
<400>20
Gly Arg Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His
1               5                   10
<210>21
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工构建体
<400>21
Ala Ile Tyr Pro Leu Thr Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Ser Lys
1               5                   10                  15
Leu
<210>22
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工构建体
<400>22
Ser Thr Tyr Val Gly Gly Asp Trp Gln Phe Asp Val
1               5                   10
<210>23
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工构建体
<400>23
 Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile His
 1               5                   10
<210>24
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工构建体
<400>24
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1               5
<210>25
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工构建体
<400>25
Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr
1               5
<210>26
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工构建体
<400>26
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His
1               5                   10
<210>27
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工构建体
<400>27
Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>28
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工构建体
<400>28
Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val
1               5                   10
<210>29
<211>213
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工构建体
<400>29
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Pro Tyr Ile
            20                  25                  30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
        35                  40                  45
Ala Thr Ser Ala Leu Ala Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu
65                  70                  75                  80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Leu Ser Asn Pro Pro Thr
                85                  90                  95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu lle Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
            100                 105                 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
        115                 120                 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
    130                 135                 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145                 150                 155                 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
                165                 170                 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
            180                 185                 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
        195                 200                 205
Asn Arg Gly Glu Cys
    210
<210>30
<211>642
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工构建体
<400>30
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc     60
ctctcctgca gggccagctc aagtgtaccg tacatccact ggtaccagca gaaacctggc    120
caggctccca ggctcctcat ctatgccaca tccgctctgg cttctggcat cccagacagg    180
ttcagtggca gtgggtctgg gacagacttc actctcacca tcagcagact ggagcctgaa    240
gattttgcag tgtattactg tcagcagtgg ctgagtaacc cacccacttt tggccagggg    300
accaagctgg agatcaaacg aactgtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct    360
gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc    420
agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag    480
agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg    540
agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg    600
agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt ag                       642
<210>31
<211>451
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工构建体
<400>31
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Arg Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Ala Ile Tyr Pro Leu Thr Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Ser
    50                  55                  60
Lys Leu Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Ser Thr Tyr Val Gly Gly Asp Trp Gln Phe Asp Val Trp Gly
            100                 105                 110
Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
        115                 120                 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
    130                 135                 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145                 150                 155                 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
                165                 170                 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
            180                 185                 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
        195                 200                 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
    210                 215                 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225                 230                 235                 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Thr Leu Met
                245                 250                 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
            260                 265                 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
        275                 280                 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
    290                 295                 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305                 310                 315                 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
                325                 330                 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Gln Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
            340                 345                 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
        355                 360                 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
    370                 375                 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385                 390                 395                 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
                405                 410                 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
            420                 425                 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
        435                 440                 445
Pro Gly Lys
    450
<210>32
<211>1356
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工构建体
<400>32
gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc     60
tcctgtaagg gttctggccg tacatttacc agttacaata tgcactgggt gcgccagatg    120
cccgggaaag gcctggagtg gatgggggct atttatccct tgacgggtga tacttcctac    180
aatcagaagt cgaaactcca ggtcaccatc tcagccgaca agtccatcag caccgcctac    240
ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc gagatcgact    300
tacgtgggcg gtgactggca gttcgatgtc tggggcaagg ggaccacggt caccgtctcc    360
tcagcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct    420
gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg    480
tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc    540
tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag    600
acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaggttgag    660
cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg    720
ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa atcaaggaca ccctcatgat ctcccggacc    780
cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac    840
tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac    900
aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc    960
aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc   1020
tccaaacaga aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggac   1080
gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac   1140
atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc   1200
gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tatagcaagc tcaccgtgga caagagcagg   1260
tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac   1320
acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaatga                             1356
<210>33
<211>451
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工构建体
<400>33
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Arg Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Ala Ile Tyr Pro Leu Thr Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Ser
    50                  55                  60
Lys Leu Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Ser Thr Tyr Val Gly Gly Asp Trp Gln Phe Asp Val Trp Gly
            100                 105                 110
Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
        115                 120                 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
    130                 135                 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145                 150                 155                 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
                165                 170                 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
            180                 185                 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
        195                 200                 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
    210                 215                 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225                 230                 235                 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Thr Leu Met
                245                 250                 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
            260                 265                  270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
        275                 280                 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
    290                 295                 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305                 310                 315                 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
                325                 330                 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Asp Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
            340                 345                 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
        355                 360                 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
    370                 375                 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385                 390                 395                 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
                405                 410                 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
            420                 425                 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
        435                 440                 445
Pro Gly Lys
    450
<210>34
<211>1356
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工构建体
<400>34
gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc     60
tcctgtaagg gttctggccg tacatttacc agttacaata tgcactgggt gcgccagatg    120
cccgggaaag gcctggagtg gatgggggct atttatccct tgacgggtga tacttcctac    180
aatcagaagt cgaaactcca ggtcaccatc tcagccgaca agtccatcag caccgcctac    240
ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc gagatcgact    300
tacgtgggcg gtgactggca gttcgatgtc tggggcaagg ggaccacggt caccgtctcc    360
tcagcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct    420
gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg    480
tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc    540
tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag    600
acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaggttgag    660
cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg    720
ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa atcaaggaca ccctcatgat ctcccggacc    780
cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac    840
tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac    900
aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc    960
aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc   1020
tccaaagaca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggac   1080
gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac   1140
atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc   1200
gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tatagcaagc tcaccgtgga caagagcagg   1260
tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac   1320
acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaatga                             1356
<210>35
<211>451
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工构建体
<400>35
Glu Val Gln Leu Val Gln Set Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Ile Set Cys hys Gly Set Gly Arg Thr Phe Thr Set Tyr
            20                  25                  30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu alu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Ala Ile Tyr Pro Leu Thr Gly Asp Thr Set Tyr Ash Gln Lys Ser
    50                  55                  60
Lys Leu Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Ser Thr Tyr Val Gly Gly Asp Trp Gln Phe Asp Val Trp Gly
           100                 105                 110
Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
        115                 120                 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
    130                 135                 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145                 150                 155                 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
                165                 170                 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
            180                 185                 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
        195                 200                 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
    210                 215                 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225                 230                 235                 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
                245                 250                 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
            260                 265                 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
        275                 280                 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
    290                 295                 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305                 310                 315                 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
                325                 330                 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
            340                 345                 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
        355                 360                 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Asp Val Glu
    370                 375                 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385                 390                 395                 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
                405                 410                 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
           420                  425                 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
        435                 440                 445
Pro Gly Lys
    450
<210>36
<211>1356
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工构建体
<400>36
gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc     60
tcctgtaagg gttctggccg tacatttacc agttacaata tgcactgggt gcgccagatg    120
cccgggaaag gcctggagtg gatgggggct atttatccct tgacgggtga tacttcctac    180
aatcagaagt cgaaactcca ggtcaccatc tcagccgaca agtccatcag caccgcctac    240
ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc gagatcgact    300
tacgtgggcg gtgactggca gttcgatgtc tggggcaagg ggaccacggt caccgtctcc    360
tcagcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct    420
gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg    480
tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc    540
tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag    600
acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaggttgag    660
cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg    720
ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc    780
cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac    840
tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac    900
aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc    960
aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc   1020
tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggac   1080
gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac   1140
atcgacgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc   1200
gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tatagcaagc tcaccgtgga caagagcagg   1260
tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac   1320
acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaatga                             1356

Claims (59)

1.包含亲本Fc区的变体或其部分的多肽，所述Fc区变体或其部分与亲本Fc区相比在Fc区的第279、341、343或373的氨基酸位置处含有一处或多处氨基酸替换。
2.包含亲本Fc区的变体的多肽，其中Fc区变体包含至少一处下述的氨基酸替换：235G、235R、236F、236R、236Y、237K、237N、237R、238E、238G、238H、238I、238L、238V、238W、238Y、244L、245R、247A、247D、247E、247F、247M、247N、247Q、247R、247S、247T、247W、247Y、248F、248P、248Q、248W、249L、249M、249N、249P、249Y、251H、251I、251W、254D、254E、254F、254G、254H、254I、254K、254L、254M、254N、254P、254Q、254R、254V、254W、254Y、255K、255N、256H、256I、256K、256L、256V、256W、256Y、257A、257I、257M、257N、257S、258D、260S、262L、264S、265K、265S、267H、267I、267K、268K、269N、269Q、271T、272H、272K、272L、272R、279A、279D、279F、279G、279H、279I、279K、279L、279M、279N、279Q、279R、279S、279T、279W、279Y、280T、283F、283G、283H、283I、283K、283L、283M、283P、283R、283T、283W、283Y、285N、286F、288N、288P、292E、292F、292G、292I、292L、293S、293V、301W、304E、307E、307M、312P、315F、315K、315L、315P、315R、316F、316K、317P、317T、318N、318P、318T、332F、332G、332L、332M、332S、332V、332W、339D、339E、339F、339G、339H、339I、339K、339L、339M、339N、339Q、339R、339S、339W、339Y、341D、341E、341F、341H、341I、341K、341L、341M、341N、341P、341Q、341R、341S、341T、341V、341W、341Y、343A、343D、343E、343F、343G、343H、343I、343K、343L、343M、343N、343Q、343R、343S、343T、343V、343W、343Y、373D、373E、373F、373G、373H、373I、373K、373L、373M、373N、373Q、373R、373S、373T、373V、373W、375R、376E、376F、376G、376H、376I、376L、376M、376N、376P、376Q、376R、376S、376T、376V、376W、376Y、377G、377K、377P、378N、379N、379Q、379S、379T、380D、380N、380S、380T、382D、382F、382H、382I、382K、382L、382M、382N、382P、382Q、382R、382S、382T、382V、382W、382Y、385E、385P、386K、423N、424H、424M、424V、426D、426L、427N、429A、429F、429M、430A、430D、430F、430G、430H、430I、430K、430L、430M、430N、430P、430Q、430R、430S、430T、430V、430W、430Y、431H、431K、431P、432R、432S、438G、438K、438L、438T、438W、439E、439H、439Q、440D、440E、440F、440G、440H、440I、440K、440L、440M、440Q、440T、440V或442K。
3.权利要求2的多肽，其中Fc区变体包含至少一处下述的氨基酸替换：235G、236F、236R、236Y、237K、237N、237R、238E、238G、238H、238I、238L、238V、238W、238Y、245R、247A、247D、247E、247F、247M、247N、247Q、247R、247T、247W、247Y、248F、248P、248Q、248W、249L、249M、249N、249P、249Y、251H、251I、251W、254D、254E、254F、254G、254H、254I、254K、254L、254M、254N、254P、254Q、254R、254V、254W、254Y、255K、255N、256H、256I、256K、256L、256W、257A、257I、257M、257N、257S、258D、260S、262L、264S、265K、265S、267H、267I、267K、268K、269N、269Q、271T、272H、272K、272R、279A、279D、279G、279H、279N、279Q、279S、279T、279W、279Y、280T、283F、283H、283K、283M、283R、283W、285N、286F、288N、288P、292E、292G、292I、301W、304E、307E、307M、312P、315F、315L、315P、316F、317P、317T、318N、318P、318T、332L、332M、332R、332S、332W、339D、339F、339I、339K、339M、339N、339Q、339R、339S、339W、339Y、341D、341E、341F、341H、341I、341K、341L、341M、341N、341P、341Q、341R、341S、341T、341V、341W、341Y、343D、343E、343G、343H、343K、343N、343Q、343R、343S、343T、343W、343Y、373D、373E、373G、373H、373I、373K、373L、373M、373Q、373R、373S、373T、373W、375R、376G、376N、376P、376Q、376R、376S、376T、376V、376W、376Y、377G、377K、377P、378D、378N、379N、379Q、379T、380N、380S、380T、382D、382F、382I、382K、382L、382Q、382R、382S、382T、382V、382W、382Y、385E、386K、423N、424H、424M、424V、426D、426L、427N、429A、429F、429M、430A、430D、430F、430G、430H、430I、430K、430L、430M、430N、430P、430Q、430R、430S、430T、430V、430W、430Y、431H、431K、431P、432R、432S、438K、438L、438T、438W、439E、440D、440I或440L。
4.权利要求1到3中任意一项所述的多肽，其中亲本Fc区为天然Fc区。
5.权利要求1到4中任意一项所述的多肽，其中亲本Fc区为IgG Fc区、基本为IgG Fc区或其部分。
6.权利要求5的多肽，其中亲本Fc区为IgG1、IgG3或IgG4的Fc区，基本为IgG1、IgG3或IgG4 Fc区、或其部分。
7.权利要求1到6中任意一项所述的多肽，其中多肽为单克隆抗体。
8.权利要求12的单克隆抗体，其中单克隆抗体为嵌合的、人源化的或人单克隆抗体。
9.权利要求12或13的单克隆抗体，其中单克隆抗体为全长抗体或单链单克隆抗体。
10.包含亲本Fc区的变体的单克隆抗体，其中单克隆抗体在Fc区中包含至少一处下述的氨基酸替换：247A、247F、247M、247T、247V、247Y、249E、249Y、254F、254M、254Y、256A、258D、279A、283A、283I、283K、283M、283R、288N、292A、311A、311D、311N、311T、311V、311Y、315L、318N、318P、318T、318V、332T、332V、339D、339F、339G、339I、339K、339M、339N、339Q、339R、339S、339T、376A、376V、377G、377K、379N、380N、380S、382A、382I、385E、427N、429M、434W、436I、440G、440H、440I或440L，其中包含Fc区变体的单克隆抗体与包含亲本Fc区的单克隆抗体相比，显示出增强的ADCC。
11.权利要求10的单克隆抗体，其Fc区包含至少一处下述的氨基酸替换：247A、247F、247M、247T、247V、247Y、254F、254Y、258D、279A、283M、288N、292A、311D、311N、311T、315L、318N、318P、318T、318V、339D、339I、339K、339M、339N、339Q、339R、339S、376A、376V、377K、379N、380N、382A、440I或440L。
12.包含亲本Fc区的变体的单克隆抗体，其中单克隆抗体在Fc区包含至少一处的下述氨基酸替换：235Q、235R、235S、236F、236R、236Y、237E、237K、237N、237R、238E、238G、238H、238I、238L、238V、238W、238Y、247G、247R、249L、249P、250K、250M、250R、251H、251I、251W、252Y、254L、254P、254Q、254T、254V、256V、257A、257I、257M、257N、257S、257V、260S、262L、264S、265H、265K、265S、267G、267H、267I、267K、269N、269Q、270A、270G、270K、270N、271T、272H、272K、272L、272N、272R、279D、279F、279K、279L、279W、283D、283F、283G、283H、283L、283T、283W、283Y、285N、288P、292E、292F、292G、292I、293S、293V、301W、304E、307A、307E、307M、311F、311I、311K、311S、312P、314F、314I、314V、314W、315F、315P、316F、317P、327T、328V、329Y、332G、332K、332L、332R、332W、341D、341E、341F、341H、341I、341K、341L、341M、341N、341P、341Q、341R、341S、341T、341W、341Y、343A、343D、343E、343F、343G、343H、343L、343M、343N、343Q、343R、343S、343T、343V、343W、343Y、373A、373D、373E、373F、373G、373I、373K、373L、373M、373N、373Q、373R、373S、373T、373V、373W、375R、376A、376E、376F、376G、376H、376W、376Y、379Q、382D、382S、430H、430K、430N、430Q、430R、430W、432R、432S、434I、440D、440T、440V或442K，其中包含Fc区变体的单克隆抗体与包含亲本Fc区的单克隆抗体相比，显示出降低的ADCC。
13.权利要求12的单克隆抗体，其Fc区包含至少一处的下述氨基酸替换：235R、236F、236Y、237E、237K、237N、237R、238E、238G、238H、238I、238L、238V、238W、238Y、247R、250K、251H、254T、257I、257M、257N、257S、257V、265H、265K、265S、267G、267H、267I、267K、269N、269Q、270A、270G、270K、270M、270N、271T、272N、272R、288P、292E、301W、304E、316F、317P、327T、328V、329Y、332K、332R、341F、341I、341M、341P、341Q、341R、341T、341W、341Y、343W、373A、373E、373G、373S、376W、432R或432S。
14.包含亲本Fc区的变体的单克隆抗体，其中在Fc区包含至少一处下述的氨基酸替换：238L、244L、245R、249P、252Y、256P、257A、257I、257M、257N、257S、258D、260S、262L、270K、272L、272R、279A、279D、279G、279H、279M、279N、279Q、279R、279S、279T、279W、279Y、283A、283D、283F、283G、283H、283I、283K、283L、283N、283P、283Q、283R、283S、283T、283W、283Y、285N、286F、288N、288P、293V、307E、307M、311A、311I、311K、311L、311M、311V、311W、312P、316K、317P、318N、318T、332F、332H、332K、332L、332M、332R、332S、332W、339N、339T、339W、341P、343E、343H、343K、343Q、343R、343T、343Y、375R、376G、376I、376M、376P、376T、376V、377K、378D、378N、380N、380S、380T、382F、382H、382I、382K、382L、382M、382N、382Q、382R、382S、382T、382V、382W、382Y、423N、427N、430A、430F、430G、430H、430I、430K、430L、430M、430N、430Q、430R、430S、430T、430V、430Y、431H、431K、434F、434G、434H、434W、434Y、436I、436L、436T、438K、438L、438T、438W、440K或442K，其中包含Fc区变体的单克隆抗体与包含亲本Fc区的单克隆抗体相比，显示出增强的FcRn结合亲和性。
15.权利要求14的单克隆抗体，其在Fc区包含至少一处下述的氨基酸替换：245R、252Y、256P、257A、257I、257M、257N、257S、257V、258D、260S、262L、279A、279D、279G、279H、279N、279Q、279S、279T、279W、279Y、283F、283H、283K、283R、285N、286F、307E、307M、311I、311K、311M、312P、318N、318T、332S、339W、343E、343H、343K、343Q、343R、375R、377K、378D、378N、380S、380T、382F、382K、382Q、382R、382S、382T、382V、382W、382Y、423N、427N、430A、430F、430H、430I、430L、430M、430N、430Q、430R、430S、430V、430Y、431H、431K、434F、434G、434H、4342、434Y、436I、436L、438K、438L或438W。
16.包含亲本Fc区的变体的单克隆抗体，其中单克隆抗体在Fc区包含至少一处下述的氨基酸替换：235Q、236Y、237K、237R、238E、238G、238H、238W、247A、247D、247E、247F、247G、247H、247I、247L、247M、247N、247Q、247R、247S、247W、247Y、248A、248F、248P、248Q、248W、249E、249L、249M、249Y、251F、251H、251I、251W、254D、254E、254F、254G、254H、254I、254K、254L、254M、254N、254P、254Q、254R、254T、254V、254W、254Y、255K、255N、256F、256H、256I、256K、256M、256R、256W、256Y、264S、265S、265Y、267G、267I、268D、268K、270A、270M、279I、279K、279L、280T、292E、292F、292G、292I、292L、311D、311E、311F、311G、311N、311R、311Y、315F、315K、315P、316F、317T、326W、327T、339E、339G、339L、339R、341D、341E、341F、341I、341K、341L、341M、341N、341Q、341R、341S、341T、341V、341W、341Y、343M、343V、343W、373D、373G、373A、373D、373G、373K、373L、373M、373N、373Q、373S、373T、373V、373W、376H、376L、376W、376Y、424M、424V、426D、429A、429F、429M、430D、430W、431P、432R、432S、439Q、440A、440D、440E、440F或440M，其中包含Fc区变体的单克隆抗体与包含亲本Fc区的单克隆抗体相比，显示出降低的RcRn结合亲和性。
17.权利要求16的单克隆抗体，所述抗体在其Fc区包含至少一处下述的氨基酸替换：237R、247D、247E、247F、247H、247I、247L、247M、247N、247Q、247W、247Y、248A、248F、248P、248Q、248W、249L、249M、249Y、251H、251I、251W、254D、254E、254F、254G、254H、254I、254K、254M、254N、254P、254Q、254R、254T、254V、254W、254Y、255K、255N、256F、256H、256K、256M、256R、256W、265Y、280T、292G、292I、311D、311E、311G、311N、315F、315P、316T、317T、327T、341D、341E、341F、341I、341L、341Y、343W、373A、373G、373M、373Q、376W、376Y、424M、424V、430D、430W、431P或432S。
18.包含亲本Fc区的变体的单克隆抗体，其中单克隆抗体在Fc区包含至少一处下述的氨基酸替换：236Y、244L、247A、247D、247E、247G、247N、247Q、247R、247S、247W、248F、248P、248Q、248W、249E、249L、249M、249N、249P、249Y、251F、251H、251I、251W、254A、254F、254K、254L、254M、254R、254Y、255K、256A、256G、256I、256L、256M、256P、256Q、256W、256Y、260S、268D、279Q、279S、279W、279Y、280K、280T、283F、283G、283H、283I、283K、283L、283M、283N、283P、283R、283S、283W、292L、307A、307M、311F、311I、311K、311L、311M、311T、311V、311W、311Y、312P、314F、314I、314V、314W、314Y、315F、315K、315L、315P、315R、316K、317P、317T、318N、318T、332A、332D、332E、332F、332G、332L、332M、332Q、332S、332T、332V、332W、332Y、339D、339F、339G、339H、339I、339K、339N、339Q、339R、339S、339T、339W、339Y、341D、341E、341F、341H、341I、341K、341L、341M、341N、341P、341Q、341R、341S、341T、341V、341W、341Y、343A、343D、343E、343G、343H、343K、343L、343M、343N、343Q、343R、343S、343T、343W、343Y、373D、373E、373F、373H、373I、373K、373L、373M、373N、373Q、373R、373T、373V、373W、375R、376A、376F、376G、376H、376L、376N、376P、376Q、376R、376S、376T、376V、377P、379N、379Q、379S、379T、380A、380N、380S、380T、382I、382L、382Q、382V、386K、426D、426L、429A、429F、429M、430A、430D、430F、430G、430H、430I、430K、430L、430M、430N、430P、430R、430S、430T、430V、430W、430Y、431H、431P、432R、432S、438L、438W、434Y、438L、438W、440Q或440Y，其中包含Fc区变体的单克隆抗体与包含亲本Fc区的单克隆抗体相比，显示出增强的CDC活性。
19.权利要求18的单克隆抗体，在其Fc区包含至少一处下述的氨基酸替换：236Y、248F、248P、248Q、248W、249E、249L、249M、249N、249Y、251H、251I、251W、254F、254K、254L、254M、254R、254Y、255K、256A、256G、256I、256L、256M、256P、256Q、256W、260S、280K、283W、307M、311F、311I、311K、311L、311M、311T、311V、311W、311Y、314I、314V、314W、314Y、315P、317P、332D、332L、332M、332S、332W、339D、339F、339I、339K、339N、339S、339W、339Y、341D、341E、341F、341H、341I、341K、341L、341M、341N、341P、341Q、341R、341S、341T、341V、341W、341Y、343D、343E、343G、343H、343K、343N、343Q、343R、343S、343T、343W、343Y、373E、373F、373H、373I、373K、373L、373Q、373R、373T、373W、376A、376G、376N、376P、376Q、376R、376S、376T、376V、377P、379N、379Q、379T、382I、382L、386K、426D、426L、429F、429M、430A、430D、430F、430G、430H、430I、430K、430L、430M、430N、430P、430R、430S、430T、430V、430W、430Y、431H、431P、434Y、438L或440Y。
20.包含亲本Fc区的变体的单克隆抗体，其中单克隆抗体在Fc区包含至少一处下述的氨基酸替换：235G、236R、235S、237K、237E、237K、237N、237R、238A、238E、238G、238H、238I、238L、238V、238W、238Y、245R、247H、247I、247L、247T、247Y、250M、252Y、254D、254E、254I、254P、254Q、254T、254V、255N、257A、257I、257M、257N、257S、257V、262L、264S、265H、265Y、267G、267H、267I、267K、268K、269N、269Q、270G、270M、270N、271T、272H、272L、272N、292A、293S、301W、307E、311E、311S、316F、318P、327T、328V、329Y、330K、330R、332E、332M、343I、373S、378D、380D、382D、382F、382N、382P、382R、382S、382W、382Y、385E、385P、423N、424H、424M或427N，其中包含Fc区变体的单克隆抗体与包含亲本Fc区的单克隆抗体相比，显示出降低的CDC活性。
21.权利要求20的单克隆抗体，该抗体在Fc区包含至少一处下述的氨基酸替换：235G、235S、236R、237E、237K、237N、237R、238A、238E、238G、238H、238I、238L、238V、238W、238Y、245R、247I、247L、247T、250M、257A、257I、257M、262L、264S、267G、267H、267I、267K、268K、269N、269Q、270G、270M、270N、271T、272H、301W、311S、327T、329Y、330K、378D、385E、423N或424H。
22.权利要求10到21中任意一项所述的单克隆抗体，其中单克隆抗体为嵌合的、人源化的或人单克隆抗体。
23.权利要求10到22中任意一项所述的单克隆抗体，其中单克隆抗体为全长抗体或单链单克隆抗体。
24.权利要求7到23中任意一项所述的单克隆抗体，其中所述抗体特异结合选自下述的人类靶抗原：CD3、CD20、CD25、TNFα、Her2/neu、CD33、CD52、EGFR、EpCAM、MUC1、GD3、CEA、CA125、HLA-DR、TGFβ、VEGF、GDF8、GDF11、生长激素释放激素或其任何前体或功能片段。
25.权利要求1到7中任意一项所述的多肽，该多肽在其Fc区包含至少一处下述的氨基酸替换：238L、244L、245R、249P、252Y、256P、257A、257I、257M、257N、257S、257V、258D、260S、262L、270K、272L、272R、279A、279D、279G、279H、279M、279N、279Q、279R、279S、279T、279W、279Y、283A、283D、283F、283G、283H、283I、283K、283L、283N、283P、283Q、283R、283S、283T、283W、283Y、285N、286F、288N、288P、293V、307E、307M、311A、311I、311K、311L、311M、311V、311W、312P、316K、317P、318N、318T、332F、332H、332K、332L、332M、332R、332S、332W、339N、339T、339W、341P、343E、343H、343K、343Q、343R、343T、343Y、375R、376G、376I、376M、376P、376T、376V、377K、378D、378N、380N、380S、380T、382F、382H、382I、382K、382L、382M、382N、382Q、382R、382S、382T、382V、382W、382Y、423N、427N、430A、430F、430G、430H、430I、430K、430L、430M、430N、430Q、430R、430S、430T、430V、430Y、431H、431K、434F、434G、434H、434W、434Y、436I、436L、436T、438K、438L、438T、438W、440K或442K，其中包含Fc区变体的多肽与包含亲本Fc区的多肽相比，显示出延长的血清半寿期。
26.权利要求25的多肽，所述多肽在其Fc区包含至少一处下述的氨基酸替换：245R、252Y、256P、257A、257I、257M、257N、257S、257V、258D、260S、262L、279A、279D、279G、279H、279N、279Q、279S、279T、279W、279Y、283F、283H、283K、283R、285N、286F、307E、307M、311I、311K、311L、311M、312P、318N、318T、332S、339W、343E、343H、343K、343Q、343R、375R、377K、378D、378N、380S、380T、382F、382K、382Q、382R、382S、382T、382V、382W、382Y、423N、427N、430A、430F、430H、430I、430L、430M、430N、430Q、430R、430S、430V、430Y、431H、431K、434F、434G、434H、434W、434Y、436I、436L、438K、438L或438W。
27.权利要求1到7中任意一项所述的多肽，所述多肽在其Fc区包含至少一处下述的氨基酸替换：235Q、236Y、237K、237R、238E、238G、238H、238W、247A、247D、247E、247F、247G、247H、247I、247L、247M、247N、247Q、247R、247S、247W、247Y、248A、248F、248P、248Q、248W、249E、249L、249M、249Y、251F、251H、251I、251W、254D、254E、254F、254G、254H、254I、254K、254L、254M、254N、254P、254Q、254R、254T、254V、254W、254Y、255K、255N、256F、256H、256I、256K、256M、246R、256W、256Y、264S、265S、265Y、267G、267I、268D、268K、270A、270M、279I、279K、279L、280T、292E、292F、292G、292I、292L、311D、311E、311F、311G、311N、311R、311Y、315F、315K、315P、316F、317T、326W、327T、339E、339G、339L、339R、341D、341E、341F、341I、341K、341L、341M、341N、341Q、341R、341S、341T、341V、341W、341Y、343M、343V、343W、373A、373D、373G、373K、373L、373M、373N、373Q、373S、373T、373V、373W、376H、376L、376W、376Y、424M、424V、426D、429A、429F、429M、430D、430W、431P、432R、432S、439Q、440D、440E、440F或440M，其中包含Fc区变体的多肽与包含亲本Fc区的多肽相比，其显示出缩短的血清半寿期。
28.权利要求27的多肽，所述多肽在其Fc区包含至少一处下述的氨基酸替换：237R、247D、247E、247F、247H、247L、247M、247N、247Q、247W、247Y、248A、248F、248P、248Q、248W、249L、249M、249Y、251H、251I、251W、254D、254E、254F、254G、254H、254I、254K、254M、254N、254P、254Q、254R、254T、254V、254W、254Y、255K、255N、256F、256H、256K、256M、256R、256W、265Y、280T、292G、292I、311D、311E、311G、311N、315F、315P、316T、317T、327T、341D、341E、341F、341I、341L、341Y、343W、373A、373G、373M、373Q、376W、376Y、424M、424V、430D、430W、431P或432S。
29.产生变体单克隆抗体的方法，所述变体单克隆抗体与其亲本单克隆抗体相比ADCC反应增强，方法包括对亲本单克隆抗体的Fc区进行改造以使其包含至少一处下述的氨基酸替换：247A、247F、247H、247I、247L、247M、247T、247Y、249E、249Y、251F、254F、254M、254Y、256A、256M、258D、268D、268E、279A、280A、280K、283A、283I、283K、283M、283R、288N、292A、311A、311D、311N、311T、311V、311Y、315L、318N、318P、318T、318V、330K、332T、332V、339D、339F、339G、339I、339K、339M、339N、339Q、339R、339S、339T、376A、376V、377G、377K、379N、380N、380S、382A、382I、385E、427N、429M、434W、436I、440G、440H、440I或440L。
30.由权利要求29的方法所产生的变体单克隆抗体。
31.产生变体单克隆抗体的方法，所述变体单克隆抗体与其亲本单克隆抗体相比ADCC反应降低，方法包括对亲本单克隆抗体的Fc区进行改造以使其包含至少一处下述的氨基酸替换：235Q、235R、235S、236F、236R、236Y、237E、237K、237N、237R、238E、238G、238H、238I、238L、238V、238W、238Y、247G、247R、249L、249P、250K、250M、250R、251H、251I、251W、252Y、254L、254P、254Q、254T、254V、256V、257A、257I、257M、257N、257S、257V、260S、262L、264S、265K、265S、267G、267H、267I、267K、269N、269Q、270A、270G、270K、270M、270N、271T、272H、272K、272L、272N、272R、279D、279F、279K、279L、279W、283D、283F、283G、283H、283L、283T、283W、283Y、285N、288P、292E、292F、292G、292I、293S、293V、301W、304E、307A、307E、307M、311F、311I、311K、311S、312P、314F、314I、314V、314W、315F、315P、316F、317P、327T、328V、329Y、332G、332K、332L、332R、332W、341D、341E、341F、341H、341I、341K、341L、341M、341N、341P、341Q、341R、341S、341T、341W、341Y、343A、343D、343E、343F、343G、343H、343L、343M、343N、343Q、343R、343S、343T、343V、343W、343Y、373A、373D、373E、373F、373G、373I、373K、373L、373M、373N、373Q、373R、373S、373T、373V、373W、375R、376A、376E、376F、376G、376H、376W、376Y、379Q、382D、382S、429A、429F、430H、430K、430N、430Q、430R、430W、432R、432S、434I、440D、440T、440V或442K。
32.由权利要求31的方法所产生的变体单克隆抗体。
33.产生变体单克隆抗体的方法，所述变体单克隆抗体与其亲本单克隆抗体相比FcRn结合亲和性提高，该方法包括对亲本单克隆抗体的Fc区进行改造以使其包含至少一处下述的氨基酸替换：238L、244L、245R、249P、252Y、256P、257A、257I、257M、257N、257S、257V、258D、260S、262L、270K、272L、272R、279A、279D、279G、279H、279M、279N、279Q、279R、279S、279T、279W、279Y、283A、283D、283F、283G、283H、283I、283K、283L、283N、283P、283Q、283R、283S、283T、283W、283Y、285N、286F、288N、288P、293V、307A、307E、307M、311A、311I、311K、311L、311M、311V、311W、312P、316K、317P、318N、318T、332F、332H、332K、332L、332M、332R、332S、332W、339N、339T、339W、341P、343E、343H、343K、343Q、343R、343T、343Y、375R、376G、376I、376M、376P、376T、376V、377K、378D、378N、380N、380S、380T、382F、382H、382I、382K、382L、382M、382N、382Q、382R、382S、382T、382V、382W、382Y、423N、427N、430A、430F、430G、430H、430I、430K、430L、430M、430N、430Q、430R、430S、430T、430V、430Y、431H、431K、434F、434G、434H、434W、434Y、436I、436L、436T、438K、438L、438T、438W、440K或442K。
34。由权利要求33的方法所产生的变体单克隆抗体。
35.产生变体单克隆抗体的方法，所述变体单克隆抗体与其亲本单克隆抗体相比FcRn结合亲和性降低，该方法包括对亲本单克隆抗体的Fc区进行改造以使其包含至少一处下述的氨基酸替换：238L、244L、245R、249P、252Y、256P、257A、257I、257M、257N、257S、257V、258D、260S、262L、270K、272L、272R、279A、279D、279G、279H、279M、279N、279Q、279R、279S、279T、279W、279Y、283A、283D、283F、283G、283H、283I、283K、283L、283N、283P、283Q、283R、283S、283T、283W、283Y、285N、286F、288N、288P、293V、307A、307E、307M、311A、311I、311K、311L、311M、311V、311W、312P、316K、317P、318N、318T、332F、332H、332K、332L、332M、332R、332S、332W、339N、339T、339W、341P、343E、343H、343K、343Q、343R、343T、343Y、375R、376G、376I、376M、376P、376T、376V、377K、378D、378N、380N、380S、380T、382F、382H、382I、382K、382L、382M、382N、382Q、382R、382S、382T、382V、382W、382Y、423N、427N、430A、430F、430G、430H、430I、430K、430L、430M、430N、430Q、430R、430S、430T、430V、430Y、431H、431K、434F、434G、434H、434W、434Y、436I、436L、436T、438K、438L、438T、438W、440K或442K。
36.由权利要求35的方法所产生的变体单克隆抗体。
37.产生变体单克隆抗体的方法，所述变体单克隆抗体与其亲本单克隆抗体相比CDC反应提高，该方法包括对亲本单克隆抗体的Fc区进行改造以使其包含至少一处下述的氨基酸替换：236Y、244L、247A、247D、247E、247g、247N、247Q、247R、247S、247W、248F、248P、248Q、248W、249E、249L、249M、249N、249P、249Y、250K、250R、251F、251H、251I、251W、254A、254F、254K、254L、254M、254R、254Y、255K、256A、256G、256I、256L、256M、256P、256Q、256W、256Y、260S、268D、279Q、279S、279W、279Y、280K、280T、283F、283G、283H、283I、283K、283L、283M、283N、283P、283R、283S、283W、292L、307A、307M、311F、311I、311K、311L、311M、311T、311V、311W、311Y、312P、314F、314I、314V、314W、315F、315K、315L、315P、315R、316K、317P、317T、318N、318T、332A、332D、332E、332F、332G、332H、332L、332M、332N、332Q、332S、332T、332V、332W、332Y、339D、339F、339G、339H、339I、339K、339N、339Q、339R、339S、339W、339Y、341D、341E、341F、341H、341I、341K、341L、341M、341N、341P、341Q、341R、341S、341T、341V、341W、341Y、343A、343D、343E、343G、343H、343K、343L、343M、343N、343Q、343R、343S、343T、343W、343Y、373D、373E、373F、373H、373I、373K、373L、373M、373N、373Q、373R、373T、373V、373W、375R、376A、376F、376G、376H、376L、376N、376P、376Q、376R、376S、376T、376V、377P、379N、379Q、379S、379T、380A、380N、380S、380T、382I、382L、382Q、382V、386K、426D、426L、429A、429F、429M、430A、430D、430F、430G、430H、430I、430K、430L、430M、430N、430P、430R、430S、430T、430V、430W、430Y、431H、431P、432R、432S、434W、434Y、438L、438W、440Q或440Y。
38.由权利要求37的方法所产生的变体单克隆抗体。
39.产生变体单克隆抗体的方法，所述变体单克隆抗体与其亲本单克隆抗体相比CDC反应降低，该方法包括对亲本单克隆抗体的Fc区进行改造以使其包含至少一处下述的氨基酸替换：235G、235S、236R、237E、237K、237N、237R、238A、238E、238G、238H、238I、238L、238V、238W、238Y、245R、247H、247I、247L、247T、247Y、250M、252Y、254D、254E、254I、254P、254Q、254T、254V、255N、257A、257I、257M、257N、257S、257V、262L、264S、265H、265Y、267G、267H、267I、267K、268K、269N、269Q、270G、270M、270N、271T、272H、272L、272N、292A、293S、301W、307E、311E、311S、316F、318P、327T、328V、329Y、330K、330R、332K、339E、339M、343I、373S、378D、380D、382D、382F、382N、382P、382R、382S、382W、382Y、385E、385P、423N、424H、424M或427N。
40.由权利要求39的方法所产生的变体单克隆抗体。
41.产生变体多肽的方法，该变体多肽与亲本多肽相比血清半寿期延长，所述方法包括：a)由与编码Fc区的包含至少一处下述氨基酸替换的核酸分子有效连接的编码亲本多肽的核酸分子表达变体多肽：238L、244L、245R、249P、252Y、256P、257A、257I、257M、257N、257S、257V、258D、260S、262L、270K、272L、272R、279A、279D、279G、279H、279M、279N、279Q、279R、279S、279T、279W、279Y、283A、283D、283F、283G、283H、283I、283K、283L、283N、283P、283Q、283R、283S、283T、283W、283Y、285N、286F、288N、288P、293V、307A、307E、307M、311A、311I、311K、311L、311M、311V、311W、312P、316K、317P、318N、318T、332F、332H、332K、332L、332M、332R、332S、332W、339N、339T、339W、341P、343E、343H、343K、343Q、343R、343T、343Y、375R、376G、376I、376M、376P、376T、376V、377K、378D、378N、380N、380S、380T、382F、382H、382I、382K、382L、382M、382N、382Q、382R、382S、382T、382V、382W、382Y、423N、427N、430A、430F、430G、430H、430I、430K、430L、430M、430N、430Q、430R、430S、430T、430V、430Y、431H、431K、434F、434G、434H、434W、434Y、436I、436L、436T、438K、438L、438T、438W、440K或442K；b)分离并纯化变体多肽。
42.由权利要求41的方法所产生的变体多肽。
43.产生变体多肽的方法，该变体多肽与亲本多肽相比血清半寿期缩短，所述方法包括：a)由与编码Fc区的包含至少一处下述氨基酸替换的核酸分子有效连接的编码亲本多肽的核酸分子表达变体多肽：：238L、244L、245R、249P、252Y、256P、257A、257I、257M、257N、257S、257V、258D、260S、262L、270K、272L、272R、279A、279D、279G、279H、279M、279N、279Q、279R、279S、279T、279W、279Y、283A、283D、283F、283G、283H、283I、283K、283L、283N、283P、283Q、283R、283S、283T、283W、283Y、285N、286F、288N、288P、293V、307A、307E、307M、311A、311I、311K、311L、311M、311V、311W、312P、316K、317P、318N、318T、332F、332H、332K、332L、332M、332R、332S、332W、339N、339T、339W、341P、343E、343H、343K、343Q、343R、343T、343Y、375R、376G、376I、376M、376P、376T、376V、377K、378D、378N、380N、380S、380T、382F、382H、382I、382K、382L、382M、382N、382Q、382R、382S、382T、382V、382W、382Y、423N、427N、430A、430F、430G、430H、430I、430K、430L、430M、430N、430Q、430R、430S、430T、430V、430Y、431H、431K、434F、434G、434H、434W、434Y、436I、436L、436T、438K、438L、438T、438W、440K或442；以及b)分离并纯化变体多肽。
44.由权利要求43的方法所产生的变体多肽。
45.分离的核酸分子，该分子包含编码变体Fc区的核酸分子，所述变体Fc区在Fc区包含至少一处下述的氨基酸替换：235G、235R、236F、236R、236Y、237K、237N、237R、238E、238G、238H、238I、238L、238V、238W、238Y、244L、245R、247A、247D、247E、247F、247M、247N、247Q、247R、247S、247T、247W、247Y、248F、248P、248Q、248W、249L、249M、249N、249P、249Y、251H、251I、251W、254D、254E、254F、254G、254H、254I、254K、254L、254M、254N、254P、254Q、254R、254V、254W、254Y、255K、255N、256H、256I、256K、256L、256V、256W、256Y、257A、257I、257M、257N、257S、258D、260S、262L、264S、265K、265S、267H、267I、267K、268K、269N、269Q、271T、272H、272K、272L、272R、279A、279D、279F、279G、279H、279I、279K、279L、279M、279N、279Q、279R、279S、279T、279W、279Y、280T、283F、283G、283H、283I、283K、283L、283M、283P、283R、283T、283W、283Y、285N、286F、288N、288P、292E、292F、292G、292I、292L、293S、293V、301W、304E、307E、307M、312P、315F、315K、315L、315P、315R、316F、316K、317P、317T、318N、318P、318T、332F、332G、332L、332M、332S、332V、332W、339D、339E、339F、339G、339H、339I、339K、339L、339M、339N、339Q、339R、339S、339W、339Y、341D、341E、341F、341H、341I、341K、341L、341M、341N、341P、341Q、341R、341S、341T、341V、341W、341Y、343A、343D、343E、343F、343G、343H、343I、343K、343L、343M、343N、343Q、343R、343S、343T、343V、343W、343Y、373D、373E、373F、373G、373H、373I、373K、373L、373M、373N、373Q、373R、373S、373T、373V、373W、375R、376E、376F、376G、376H、376I、376L、376M、376N、376P、376Q、376R、376S、376T、376V、376W、376Y、377G、377K、377P、378N、379N、379Q、379S、379T、380D、380N、380S、380T、382D、382F、382H、382I、382K、382L、382M、382N、382P、382Q、382R、382S、382T、382V、382W、382Y、385E、385P、386K、423N、424H、424M、424V、426D、426L、427N、429A、429F、429M、430A、430D、430F、430G、430H、430I、430K、430L、430M、430N、430P、430Q、430R、430S、430T、430V、430W、430Y、431H、431K、431P、432R、432S、438G、438K、438L、438T、438W、439E、439H、439Q、440D、440E、440F、440G、440H、440I、440K、440L、440M、440Q、440T、440V或442K。
46.包含权利要求45的分离核酸分子的载体。
47.权利要求46的载体，其中载体为表达载体。
48.包含权利要求47的载体的宿主细胞。
49.权利要求48中的宿主细胞，其中宿主细胞类型选自CHO、COS、SP2/0、NSO、酵母、大肠杆菌或任何优选细胞类型的衍生物或后代。
50.药物组合物，其包含权利要求1-7、25-28、42或44中任意一项所述变体多肽。
51.药物组合物，其包含权利要求8-24、30、32、35、36或38中任意一项所述变体单克隆抗体。
52.抗CD20抗体，该抗体包含：
(a)由SEQ ID NO：13组成的轻链可变区氨基酸序列；
(b)由SEQ ID NO：14组成的重链可变区氨基酸序列；以及
(c)亲本Fc区的变体，其中变体Fc区包含选自247I/339Q、247I/339D和378D的氨基酸替换。
53.权利要求52的抗CD20抗体，其中Fc变体为247I/339Q。
54.权利要求52的抗CD20抗体，其中Fc变体为247I/339D。
55.权利要求52的抗CD20抗体，其中Fc变体为378D。
56.权利要求53的抗CD20抗体，该抗体包含由SEQ ID NO：29组成的轻链氨基酸序列和由SEQ ID NO：31组成的重链氨基酸序列。
57.权利要求54的抗CD20抗体，该抗体包含由SEQ ID NO：29组成的轻链氨基酸序列和由SEQ ID NO：33组成的重链氨基酸序列。
58.权利要求55的抗CD20抗体，该抗体包含由SEQ ID NO：29组成的轻链氨基酸序列和由SEQ ID NO：35组成的重链氨基酸序列。
59.药物组合物，其包含权利要求52-58中任意一项所述的抗CD20抗体。
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