BR112021014106A2

BR112021014106A2 - Anticorpos contra subunidade alfa de il-7r e usos dos mesmos

Info

Publication number: BR112021014106A2
Application number: BR112021014106-5A
Authority: BR
Inventors: Aaron Paul YAMNIUK; Achal Mukundrao PASHINE; Lin Hui Su; Scott Ronald BRODEUR; Ekaterina DEYANOVA; Richard Yu-Cheng HUANG; Yun Wang; Alfred Robert LANGISH; Guodong Chen; Stephen Michael CARL; Hong Shen
Original assignee: Bristol-Myers Squibb Company
Priority date: 2019-01-22
Filing date: 2020-01-21
Publication date: 2021-10-13
Also published as: KR20230128134A; US20200231687A1; US20220017627A1; KR20210131336A; JP2022518770A; AU2020210635A1; JP2023103456A; CL2021001920A1; CN113396162A; CA3127236A1; US11919962B2; US11008395B2; PE20212305A1; JP7285936B2; MX2021008796A; SG11202107951YA; EP3914622A1; TW202043279A; CO2021010945A2; WO2020154293A1

Abstract

anticorpos contra subunidade alfa de il-7r e usos dos mesmos. a presente invenção refere-se a anticorpos que se ligam à subunidade alfa de um receptor de il-7 (il-7ra). além disso, são fornecidos usos desses anticorpos em aplicações terapêuticas, tais como tratamento de doenças inflamatórias. são fornecidas ainda células que produzem anticorpos, polinucleotídeos que codificam as regiões de cadeia pesada e/ou leve dos anticorpos e vetores que compreendem os polinucleotídeos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “ANTICORPOS CONTRA SUBUNIDADE ALFA DE IL-7R E USOS DOS MESMOS”.

REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIA ELETRONICAMENTE SUBMETIDA ATRAVÉS DE EFS-WEB

[001] O conteúdo da listagem de sequências eletronicamente enviada em arquivo de texto ASCII (Nome:

4521.001PC02_Seqlisting_ST25.txt; Tamanho: 100565 bytes; e Data de Criação: 17 de janeiro de 2020) depositado com o pedido é aqui incorporado a título de referência em sua totalidade.

FUNDAMENTOS DA DIVULGAÇÃO

[002] A interleucina 7 (IL-7) é um membro da família de citocinas de cadeia γ comum (γc) que também inclui IL-2, IL-4, IL-9, IL-15 e IL-21. Nguyen V., et al., J Immunol Res 2017: 4807853 (2017). Como outros membros, IL-7 sinaliza através de um complexo ternário formado com seu único c/.-receptor. IL-7Rɑ (CD127), e o receptor y comum. Carrette, F., et al., Semin Immunol 24(3): 209-17 (2012). Essa interação estimula a Janus quinase (JAK) e proteínas de transdutor de sinal e ativador de transcrição (STAT) com ativação subsequente da fosfoinositol 3- quinase (PI3K)/Akt ou vias de Src para facilitar transcrição de gene alvo. IL-7 Rɑ também é usada por linfopoietina derivada de estroma tímico (TSLP) como parte de um complexo que contém uma segunda cadeia de receptor, TSLPR. Durum, S.K., Blood 124(1):4-5 (2014).

[003] IL-7 desempenha um papel crítico no desenvolvimento de um sistema imunológico normal, pois é essencial para o desenvolvimento tímico, manutenção periférica e sobrevivência de linfócitos. Maraskovsky, E., et al., J Immunol 157(12): 5315-5323 (1996). Os precursores de célula T tímica exigem IL-7 para proliferação, diferenciação e sobrevivência. Na periferia, IL-7 regula hemóstase de célula T ao melhorar a sobrevivência e proliferação de células T virgens e de memória.

[004] IL-7 é uma citocina derivada de tecido e é produzida principalmente a partir de células de estroma e epiteliais em vários tecidos. Por exemplo, nos intestinos delgado e grosso, IL-7 é produzida pelas células epiteliais goblet intestinais e foi descrita como sendo essencial para a persistência de colite crônica em modelos animais. Tomita, T., et al., J Immunol 180(1): 383-390 (2008). IL-7 também foi mostrado como interferindo com as capacidades imunossupressoras de células T reguladoras (Tregs). Heninger, A.K., et al., J Immunol 189(12): 5649-5658 (2012). Assim, agentes que podem modular a atividade de IL-7 in vivo e, desse modo, diminuem a sobrevivência/função de células T patogênicas e/ou aumentam a indução de células T reguladoras são altamente desejáveis para o tratamento de doenças inflamatórias, como doença intestinal inflamatória.

SUMÁRIO DA DIVULGAÇÃO

[005] É fornecido no presente documento um anticorpo isolado ou porção de ligação a antígeno do mesmo, que se liga especificamente a uma cadeia alfa de um receptor de IL-7 humana ("anticorpo anti-IL-7R") compreendendo uma CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada e uma CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve, em que o anticorpo

[006] (a) tem capacidade para se ligar às células T (CD4+CD45RA+, CD4+CD45RA-, CD8+CD45RA+ e/ou CD8+CD45RA-) no sangue total com uma EC50 de aproximadamente 5 nM ou menos (por exemplo, menos de aproximadamente 3 nM);

[007] (b) não tem capacidade para se ligar às células não T no sangue total;

[008] (c) não tem capacidade para bloquear de maneira eficaz a ativação mediada por linfopoietina estromal tímica (TSLP) de monócitos;

[009] (d) não antagoniza a sinalização de receptor de IL-7 mediante a ligação ao receptor de IL-7, por exemplo, ativação mínima de pSTAT5; ou

[010] (e) qualquer combinação dos mesmos.

[011] Em algumas modalidades, uma CDR3 de cadeia pesada de um anticorpo anti-IL-7R (por exemplo, revelada no presente documento) compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 15 (DEYSRGYYVLDV).

[012] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-IL-7R da presente revelação tem uma ou mais propriedades selecionadas do grupo que consiste em:

[013] (a) ter capacidade para se ligar seletivamente a uma cadeia alfa de um receptor de IL-7 (IL- 7R) humana ou de cinomolgo;

[014] (b) ter capacidade para se ligar a uma cadeia alfa de IL-7R solúvel e ligada a uma membrana;

[015] (c) ter capacidade para bloquear uma expansão e/ou sobrevivência de células T patogênicas quando administrado a um indivíduo em necessidade do mesmo;

[016] (d) ter capacidade para restaurar uma função de célula T reguladora (Treg) e/ou promover uma sobrevivência de Treg quando administrado a um indivíduo em necessidade do mesmo;

[017] (e) ter capacidade para manter uma remissão livre de fármaco mais longe que por meio de CTLA4-Ig (ORENCIA®);

[018] (f) ter capacidade para bloquear inflamação e danos à mucosa, por exemplo, induzidos por células T patogênicas, dentro de um tecido intestinal de um indivíduo em necessidade do mesmo;

[019] (g) ter capacidade para diminuir uma frequência de células T efetoras nos nodos linfáticos mesentéricos (MLN) e/ou lâmina própria (LP) em um indivíduo em necessidade do mesmo;

[020] (h) ter capacidade para reduzir ou inibir ativação de pSTAT mediada por IL-7 em células T (por exemplo, CD4+CD45RA+);

[021] (i) ter capacidade para bloquear a expansão de células produtoras de IL-17 e/ou IFN-gama;

[022] (j) ter capacidade para tratar um indivíduo com uma doença inflamatória (por exemplo, doença intestinal inflamatória); e

[023] (k) qualquer combinação das mesmas.

[024] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-IL-7R compreende uma CDR1 de cadeia pesada, em que a CDR1 de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 13 (DHAMH). Em algumas modalidades, um anticorpo anti-IL- 7R compreende uma CDR2 de cadeia pesada, em que a CDR2 de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 14 (GISWNSRGIGYADSVKG). Em algumas modalidades, um anticorpo anti-IL-7R compreende uma CDR1 de cadeia leve, em que a CDR1 de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 16 (RASQGISSALA). Em algumas modalidades, um anticorpo anti-IL-7R compreende uma CDR2 de cadeia leve, em que a CDR2 de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 17 (DASSLES). Em algumas modalidades, um anticorpo anti-IL-7R compreende uma CDR3 de cadeia leve, em que a CDR3 de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 18 (QQFNSYPLWIT).

[025] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-IL-7R compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) e uma região variável de cadeia leve (VL), em que a VH compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos aproximadamente 80%, pelo menos aproximadamente 85%, pelo menos aproximadamente 90%, pelo menos aproximadamente 95%, pelo menos aproximadamente 96%, pelo menos aproximadamente 97%, pelo menos aproximadamente 98%, pelo menos aproximadamente 99% ou aproximadamente 100% idêntica à sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 19.

Em certas modalidades, a VL compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos aproximadamente 80%, pelo menos aproximadamente 85%, pelo menos aproximadamente 90%, pelo menos aproximadamente 95%, pelo menos aproximadamente 96%, pelo menos aproximadamente 97%, pelo menos aproximadamente 98%, pelo menos aproximadamente 99% ou aproximadamente 100% idêntica à sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 20.

[026] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-IL-7R revelado no presente documento se liga especificamente à cadeia alfa do receptor de IL-7 humana em um epítopo selecionado do grupo que consiste em: 24SQLEVNGSQHSLTCAF39 (SEQ ID NO: 8); 73FIETKKFLLIGKSNIC88 (SEQ ID NO: 9); 89VKVGEKSLTCKKIDLTT105 (SEQ ID NO: 10); 136QKKYVKVLMHDVAY149 (SEQ ID NO: 11); 181YEIKVRSIPDHYFKGF196 (SEQ ID NO: 12); e combinações dos mesmos. Em certas modalidades, um anticorpo anti-IL-7R se liga especificamente à cadeia alfa do receptor de IL-7 humana em um epítopo compreendendo um ou mais resíduos de aminoácido selecionados do grupo que consiste em H33, E75, F79, I82, K84, M144, R186, H191, Y192 e combinações dos mesmos.

[027] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-IL-7R da presente revelação é selecionado do grupo que consiste em uma IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 e uma variante das mesmas. Em certas modalidades, um anticorpo IL-7R é um anticorpo de IgG1. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-IL-7R compreende um IgG1 Fc sem função efetora.

[028] Ademais, é revelado no presente documento um anticorpo isolado ou porção de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a uma cadeia alfa de um receptor de IL-7 humana ("anticorpo anti-IL-7R") que compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 21 e em que a cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 22.

[029] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-IL-7R se liga à cadeia alfa do receptor de IL-7 humana com uma KD inferior a 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM ou 1 nM (por exemplo, 1,3 nM), conforme medido por ressonância de plasmon de superfície. Em certas modalidades, um anticorpo anti-IL-7R se liga à cadeia alfa do receptor de IL-7 de cinomolgo com uma KD inferior a 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM ou 1 nM (por exemplo, 1,7 nM) conforme medido por ressonância de plasmon de superfície. Em algumas modalidades, a ligação à cadeia alfa do receptor de IL-7 humana ou à cadeia alfa do receptor de IL-7 de cinomolgo é dependente de pH. Em certas modalidades, um anticorpo anti-IL-7R se liga à cadeia alfa do receptor de IL-7 humana com uma KD de aproximadamente 1,3 nM em pH 7,4 e com uma KD de aproximadamente 5,3 nM em pH 6. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-IL-7R se liga à cadeia alfa do receptor de IL-7 de cinomolgo com uma KD de aproximadamente 1,7 nM em pH 7,4 e com uma KD de aproximadamente 7,0 nM em pH 6.

[030] É fornecido no presente documento um anticorpo isolado ou porção de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a uma cadeia alfa de um receptor de IL-7 humana (“anticorpo anti-IL-7R”) compreendendo uma CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada (HC) e uma CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve (LC), em que a CDR1 de HC compreende a sequência de aminoácidos GX1X2FDDHAX3H (SEQ ID NO: 260), em que X1 é F ou Y; X2 é T, P, A, S, V, L, I, M, H, F, Y, N, D, E ou Q; e X3 é L ou M. Em certos aspectos, X2 é D ou E.

[031] Em alguns aspectos, a CDR2 de HC compreende a sequência de aminoácidos GIX1WX2SRGX3GYX4X5X6X7X8X9 (SEQ ID NO: 261), em que X1 é S ou T; X2 é H ou N; X3 é I ou V; X4 é G, A, S, T, V, L, I, R, H ou N; X5 é P, T, N, D, E, Q, S, H ou Y; X6 é P, G, A, S,

T, V, R, H, F. Y, N, D ou E; X7 é V ou I; X8 é A, S, T, V, L, I, M, K, R, H, F, Y, N, D, E ou Q; e X9 é G, H, D ou Q. Em certos aspectos, X1 é T.

[032] Em alguns aspectos, a CDR3 de HC compreende a sequência de aminoácidos DEYX1X2GYYX3LDX4 (SEQ ID NO: 262), em que X1 é S, T, N, D ou E; X2 é L, M, R ou S; X3 é G, A, S, T, V, M, N, E ou Q; e X4 é A, S, T, V, R, H, Y, W, N, E, Q ou M. Em certos aspectos, X3 é A, S ou T. Em alguns aspectos, X4 é E.

[033] Em alguns aspectos, a CDR1 de LC compreende a sequência de aminoácidos X1X2X3X4X5X6X7SX8X9A (SEQ ID NO: 263), em que X1 é S, T, V, K, R, H, Y ou I; X2 é A, S, T ou V; X3 é P, G, A, S, T, V, L, I, M, K, R, H, N, E ou Q; X4 é P, G, A, S, T, V, L, I, M, H, F, Y, N, D, E ou Q; X5 é P, G, A, S, T, H, E, Q, M, N ou D; X6 é P, G, A, S, T, V, L, I ou N; X7 é S, T, V, L, I, M, H, F, Y, N, D, E ou Q; X8 é P ou A; e X9 é A, L ou V. Em certos aspectos, X6 é P. Em aspectos adicionais, X8 é P. Em alguns aspectos, X7 é D ou E.

[034] Em alguns aspectos, a CDR2 de LC compreende a sequência de aminoácidos DX1X2X3X4X3X6 (SEQ ID NO: 264), em que X1 é G, A, S, M, H, N, D, E ou Q; X2 é G, A, S, T, V, M, H, F, Y, N, D, E ou Q; X3 é A, S, F, Y, W, N, D, E ou L; X4 é P, S, T, L, K, H ou N; X5 é D, E ou Q; e X6 é G, S, T, N, D, Q, P ou E.

[035] Em alguns aspectos, a CDR3 de LC compreende a sequência de aminoácidos X1X2FX3X4YPLX5X6X7 (SEQ ID NO: 265), em que X1 é M ou Q; X2 é G, A, D, E ou Q; X3 é N ou E; X4 é P, A ou S; X5 é T, I, M, K, W, N, E ou Q; X6 é L ou I; e X7 é T, M, K, H, Y, E ou Q. Em certos aspectos, X2 é A. Em aspectos adicionais, X4 é P ou A.

[036] Em alguns aspectos, a CDR1 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NOs: 31 e 46. Em certos aspectos, a CDR1 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 43 ou SEQ ID NO: 44. Em alguns aspectos, a CDR2 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NOs: 47 e 96. Em certos aspectos, a CDR2 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 47. Em aspectos adicionais, a CDR3 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NOs: 97 e 122. Em certos aspectos, a CDR3 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107 ou SEQ ID NO: 120. Em alguns aspectos, a CDR1 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NOs: 123 e 194. Em certos aspectos, a CDR1 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 190 ou SEQ ID NO: 192. Em alguns aspectos, a CDR2 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NOs: 195 e 237. Em alguns aspectos, a CDR3 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NOs: 238 e 259. Em certos aspectos, a CDR3 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 240, SEQ ID NO: 244 ou SEQ ID NO: 245.

[037] É fornecido no presente documento um anticorpo isolado ou porção de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a uma cadeia alfa de um receptor de IL-7 humana (“anticorpo anti-IL-7R”) que compreende uma CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada (HC) e uma CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve (LC), em que: (i) a CDR1 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NOs: 31 a 46; (ii) a CDR2 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 14; (iii) a CDR3 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 15; (iv) a CDR1 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ

ID NO: 16; (v) a CDR2 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 17; e (vi) a CDR3 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 18. Em certos aspectos, a CDR1 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 43 ou SEQ ID NO: 44.

[038] Também é fornecido no presente documento um anticorpo isolado ou porção de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a uma cadeia alfa de um receptor de IL-7 humana (“anticorpo anti-IL-7R”) que compreende uma CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada (HC), e uma CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve (LC), em que: (i) a CDR1 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 13; (ii) a CDR2 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NOs: 47 a 96; (iii) a CDR3 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 15; (iv) a CDR1 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 16; (v) a CDR2 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 17; e (vi) a CDR3 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 18. Em certos aspectos, a CDR2 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 47.

[039] A presente revelação fornece um anticorpo isolado ou porção de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a uma cadeia alfa de um receptor de IL-7 humana (“anticorpo anti-IL-7R”) compreendendo uma CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada (HC) e uma CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve (LC), em que: (i) a CDR1 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 13; (ii) a CDR2 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 14; (iii) a CDR3 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NOs: 97 a 122; (iv) a CDR1 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 16; (v) a CDR2 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 17; e (vi) a CDR3 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 18. Em alguns aspectos, a CDR3 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107 ou SEQ ID NO:

120.

[040] É fornecido no presente documento um anticorpo isolado ou porção de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a uma cadeia alfa de um receptor de IL-7 humana (“anticorpo anti-IL-7R”) que compreende uma CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada (HC) e uma CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve (LC), em que: (i) a CDR1 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 13; (ii) a CDR2 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 14; (iii) a CDR3 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 15; (iv) a CDR1 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NOs: 123 a 194; (v) a CDR2 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 17; e (vi) a CDR3 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 18. Em certos aspectos, a CDR1 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 190 ou SEQ ID NO: 192.

[041] Também é fornecido no presente documento um anticorpo isolado ou porção de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a uma cadeia alfa de um receptor de IL-7 humana (“anticorpo anti-IL-7R”) que compreende uma CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada (HC), e uma CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve (LC), em que: (i) a CDR1 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 13; (ii) a CDR2 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 14; (iii) a CDR3 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 15; (iv) a CDR1 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 16; (v) a CDR2 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NOs: 195 a 237; e (vi) a CDR3 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 18.

[042] É fornecido no presente documento um anticorpo isolado ou porção de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a uma cadeia alfa de um receptor de IL-7 humana (“anticorpo anti-IL-7R”) que compreende uma CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada (HC) e uma CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve (LC), em que: (i) a CDR1 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 13; (ii) a CDR2 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 14; (iii) a CDR3 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 15; (iv) a CDR1 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 16; (v) a CDR2 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 17; e (vi) a CDR3 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NOs: 238 e 259. Em certos aspectos, a CDR3 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 240, SEQ ID NO: 244 ou SEQ ID NO: 245.

[043] A presente revelação também fornece ácidos nucleicos que codifica um anticorpo anti-IL-7R da presente revelação, vetores compreendendo os ácidos nucleicos e células compreendendo os vetores. Em algumas modalidades, a célula é células CHO, células HEK293, células HBK, células COS, células NSO ou células HT1080.

[044] Também são fornecidos no presente documento imunoconjugados que compreendem um anticorpo anti-IL-7R, conforme as revelado no presente documento, ligado a um agente.

[045] A presente revelação fornece adicionalmente composições que compreendem um anticorpo anti-IL-7R, ácido nucleico, vetor, célula ou imunoconjugado conforme revelado no presente documento e um veículo.

[046] Também são fornecidos na presente revelação kits compreendendo um anticorpo anti-IL-7R, ácido nucleico, vetor, célula ou imunoconjugado conforme revelado no presente documento e uma instrução para uso.

[047] É fornecido no presente documento um método de inibição de atividade de IL-7 em um indivíduo em necessidade do mesmo que compreende administrar um anticorpo anti-IL-7R, ácido nucleico, vetor, célula ou imunoconjugado conforme revelado no presente documento ao indivíduo.

[048] É fornecido no presente documento um método de inibição de proliferação de células T efetoras e/ou indução de geração e/ou sobrevivência de células T reguladoras em um indivíduo em necessidade do mesmo que compreende administrar um anticorpo anti- IL-7R, ácido nucleico, vetor, célula ou imunoconjugado conforme revelado no presente documento, ao indivíduo.

[049] Também é fornecido no presente documento um método de tratamento de uma doença inflamatória ou uma doença autoimune em um indivíduo em necessidade do mesmo que compreende administrar um anticorpo anti-IL-7R, ácido nucleico, vetor, célula ou imunoconjugado conforme revelado no presente documento ao indivíduo. Em certas modalidades, a doença inflamatória ou a doença autoimune é selecionada do grupo que consiste em uma doença intestinal inflamatória (DII), síndrome do intestino irritável, artrite reumatoide (AR), psoríase, artrite psoriática, lúpus eritematoso sistêmico (LES), nefrite lúpica, vasculite, sepse, síndrome da resposta inflamatória sistêmica (SIRS), diabetes tipo I, doença de Grave, esclerose múltipla (EM), miocardite autoimune, doença de Kawasaki, doença arterial coronariana, doença pulmonar obstrutiva crônica, doença pulmonar intersticial, tireoidite autoimune, esclerodermia, esclerose sistêmica, osteoartrite, dermatite atópica, vitiligo, doença do enxerto contra o hospedeiro, síndrome de Sjögren, nefrite autoimune, síndrome de Goodpasture, polineuropatia desmielinizante inflamatória crônica, alergia, asma, outras doenças autoimunes que são um resultado de inflamação ou aguda ou crônica e quaisquer combinações das mesmas Em algumas modalidades, a doença inflamatória ou a doença autoimune é doença intestinal inflamatória. Em modalidades adicionais, a doença intestinal inflamatória é colite ulcerativa ou doença de Crohn.

[050] Em algumas modalidades, um indivíduo (por exemplo, descrito no presente documento) não responde adequadamente à terapia anterior com o inibidor de TNF-α (respondedor inadequado anti- TNF-α).

[051] Em algumas modalidades, um método revelado no presente documento pode compreender adicionalmente administrar um ou mais produtos terapêuticos adicionais. Em certas modalidades, os produtos terapêuticos adicionais compreendem um anticorpo anti-TNF-α.

[052] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-IL-7R revelado no presente documento é administrado ao indivíduo em uma dose fixa ou uma dose com base no peso corporal. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-IL-7R é administrado intravenosa, subcutânea, intramuscular, intradérmica ou intraperitonealmente. Em certas modalidades, um anticorpo anti-IL-7R é administrado intravenosa ou subcutaneamente.

[053] Também é fornecido no presente documento um método de produção de um anticorpo que se liga especificamente a uma cadeia alfa de um receptor de IL-7 humana ("anticorpo anti-IL-7R) que compreende cultivar uma célula descrita no presente documento sob condições adequadas e isolar o anticorpo. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS/FIGURAS

[054] A Figura 1 mostra a curva de ligação do anticorpo anti-IL-7R a células CD3 (isto é, células não T) conforme medido por citometria de fluxo. O eixo geométrico x mostra a concentração (µg/ml) do anticorpo anti-IL-7R e o eixo geométrico y mostra a intensidade de fluorescência média (MFI) da ligação.

[055] As Figuras 2A e 2B mostram a reatividade cruzada do anticorpo anti-IL-7R para IL-7Rɑ de cinomolgo após uma única administração intravenosa do anticorpo em macacos cinomolgos. A Figura 2A mostra a porcentagem da IL-7Rɑ total expressa em célula T CD4+CD45RA+ que é ocupada como uma função de concentração sérica de anticorpo anti-IL-7R (ng/ml). A Figura 2B mostra ativação de pSTAT5 in CD4+CD45RA+ células T como uma concentração de função de anticorpo anti-IL-7R (nM) no soro. A ativação de pSTAT5 é mostrada como uma porcentagem de STAT5 total que é fosforilada. Em ambas as Figuras 2A e 2B, pretende-se que a concentração de anticorpo no soro represente a exposição medida das células T CD4+CD45RA+ ao anticorpo anti-IL-7R.

[056] A Figura 3 mostra a farmacocinética (concentração sérica) do anticorpo anti-IL-7R após uma única administração intravenosa em camundongos de transferência de PBMC humana de NOD SCID gama (NSG). Os camundongos receberam uma das duas doses do anticorpo anti-IL-7R: 0,5 mg/kg (quadrado fechado com linha contínua) ou 5 mg/kg (quadrado aberto com linha tracejada). Os camundongos de controle receberam o anticorpo A3312F: 0,5 mg/kg (círculo fechado com linha contínua) ou 5 mg/kg (círculo aberto com linha tracejada). Dados são mostrados como média ± desvio padrão.

[057] A Figura 4 mostra tanto a farmacocinética (concentração sérica) quanto a formação de anticorpo antifármaco (ADA) após uma única administração intravenosa do anticorpo anti-IL-7R em macacos cinomolgos. Os animais receberam uma das três doses do anticorpo: 0,1 mg/kg (quadrado), 0,5 mg/kg (círculo) ou 3 mg/kg (triângulo). As concentrações séricas (eixo geométrico y esquerdo) do anticorpo nas diferentes doses são mostradas como linhas contínuas. A formação de anticorpo antifármaco (isto é, contra o anticorpo anti-IL-7R administrado) (eixo geométrico y direito) é mostrada como linhas tracejadas. Dados são mostrados como média ± desvio padrão.

[058] A Figura 5 mostra uma comparação da farmacocinética (concentração sérica) do anticorpo anti-IL-7R e do anticorpo A3312F após uma única administração intravenosa em macacos cinomolgos. Os animais receberam uma das duas doses do anticorpo anti-IL-7R: 0,1 mg/kg (quadrado fechado com linha contínua), 0,5 mg/kg (círculo fechado com linha contínua) ou 3 mg/kg (triângulo fechado com linha contínua). Os animais de controle receberam o anticorpo A3312F em uma das seguintes doses: 0,1 mg/kg (quadrado aberto com linha tracejada), 0,5 mg/kg (círculo aberto com linha tracejada) ou 3 mg/kg (triângulo aberto com linha tracejada). Dados são mostrados como média ± desvio padrão.

[059] A Figura 6 mostra a ativação de pSTAT5 em células T CD4+CD45RA+ após uma única administração intravenosa do anticorpo anti-IL-7R (quadrado) ou do anticorpo A3312F (triângulo) em macacos cinomolgos. A ativação de pSTAT5 é mostrada como uma porcentagem de STAT5 total que é fosforilada. Pretende-se que a concentração de anticorpo no soro represente a exposição medida das células T CD4+CD45RA+ ao anticorpo.

[060] As Figuras 7A, 7B e 7C mostras a frequência de diferentes populações de célula T observadas em sangue periférico após única administração intravenosa do anticorpo anti-IL-7R (3 mg/kg) em diferentes macacos cinomolgos. A Figura 7A mostra a frequência de células T CD3+ como uma porcentagem dos linfócitos totais. A Figura 7B e a Figura 7C mostram a frequência de células T CD4+ e células T CD8+, respectivamente, como uma porcentagem da população de célula T CD3+ total. Nas Figuras 7A, 7B e 7C, a frequência das diferentes populações de célula T foi observada na pré-administração (a primeira barra da esquerda em cada conjunto de barras para um macaco individual) e nos dias 4 (a segunda barra da esquerda em cada conjunto de barras para um macaco individual), 8 (a terceira barra da esquerda em cada conjunto de barras para um macaco individual) e 15 (a quarta barra da esquerda em cada conjunto de barras para um macaco individual) após a administração de anticorpo. O eixo geométrico x fornece o número de identificação para cada um dos macacos.

[061] A Figura 8 mostra o risco potencial de imunogenicidade de diferentes lotes de produção do anticorpo anti-IL-7R conforme medido in vitro usando um ensaio de proliferação de célula dendrítica:célula T. Os diferentes anticorpos anti-IL-7R testados incluem: (i) Pl-061895-2, (ii) Pl-066930-3, (iii) Pl-066930-9 e (iv) Anticorpo A RACIR. Avastina e anticorpo anti-IL-21R (IL-21R mAb) são mostrados respectivamente como controles negativo e positivo.

[062] A Figura 9 mostra a cobertura de sequência do IL-7Rɑ humano usando a análise de mapeamento de epítopo HDX-MS. Cada barra indica um peptídeo péptico.

[063] A Figura 10 mostra as diferenças de absorção de deutério para os cinco epítopos do anticorpo anti-IL-7R identificados usando análise de mapeamento de epítopo HDX-MS. Os cinco epítopos 24 mostrados incluem: (i) SQLEVNGSQHSLTCAF39; (ii) 73 FIETKKFLLIGKSNIC88; (iii) 89 VKVGEKSLTCKKIDLTT105; (iv) 136 QKKYVKVLMHDVAY149 e (v) 181 YEIKVRSIPDHYFKGF196. As barras verticais pretas indicam as diferenças somadas em deuteração para cada peptídeo. As linhas representam diferenças para cada em diferentes pontos de tempo, isto é, 1 minuto (“(2)”), 10 minutos (“(3)”) e 240 minutos (“(1)”).

[064] As Figuras 11A e 11B mostram um sumário da análise de mapeamento de epítopo para o anticorpo anti-IL-7R. Na Figura 11A, os epítopos foram mapeados para uma sequência linear de IL-7Rɑ humano. Os epítopos identificados usando a análise HDX-MS são indicados pela linha contínua. Os epítopos identificados usando a análise FPOP/GEE são indicados pela linha tracejada. Os resíduos mais protegidos dos epítopos identificados usando análise FPOP dão indicados por círculos. Os resíduos mais protegidos dos epítopos identificados usando análise GEE são indicados por triângulos. A numeração mostrada corresponde à sequência madura de IL-7Rɑ humano. Na Figura 11B, os epítopos são mapeados para a estrutura cristalina de IL-7Rɑ humano. A estrutura cristalina na esquerda mostra os epítopos identificados usando a análise HDX-MS. A estrutura cristalina na direita mostra os epítopos identificados usando análise FPOP/GEE. As sequências dos epítopos são fornecidas abaixo das estruturas cristalinas.

[065] As Figuras 12A e 12B mostram o diagrama esquemático do modelo de PK de anticorpo anti-IL-7R (Figura 12A) e do modelo de

PK/OD mecanístico (Figura 12B) usado para caracterizar os dados de PK e PD em macacos e seres humanos.

[066] A Figura 13 mostra a farmacocinética humana prevista (com base na curva de concentração sérica do anticorpo anti-IL-7R) (eixo geométrico y esquerdo) e ocupação de receptor (eixo geométrico y direito) na dose humana projetada (110 mg a cada duas semanas subcutaneamente para um adulto de 70 kg) do anticorpo anti-IL-7R. A linha superior (“RO”) mostra dados de ocupação de receptor. A linha inferior (“PK”) mostra os dados de farmacocinética.

[067] As Figuras 14A e 14B mostram a ligação do anticorpo 18B1 (Anticorpo A) ao IL-7R humano após ser reformatada como scFv. A Figura 14A fornece uma comparação de ligação do scFv de 18B1 em diferentes concentrações. A Figura 14B fornece os valores de ka, kd e KD.

[068] A Figura 15 mostra os resíduos de aminoácido específicos dentro das CDRs de cadeia pesada e leve que foram mutados individualmente para a análise de varredura mutacional descrita no Exemplo 11.

[069] A Figura 16 mostra os resultados de uma única rodada de seleção para scFv de 18B1. O percentual de ligação da cadeia pesada e cadeia leve de 18B1 ao IL-7R humano é mostrado quando em comparação à biotina-IL-7R. A cadeia pesada e a cadeia leve de 18B1 foram testadas em duas diferentes concentrações (0,2 nM e 1 nM).

[070] As Figuras 17A e 17B fornecem um esquema do processo geral envolvido na construção da biblioteca de varredura de mutação descrita no Exemplo 11 e usando sequenciamento de próxima geração (NGS) para identificar 1) posições de CDR críticas para ligação, 2) posições de CDR em que mutações são toleradas, e 3) mutações que podem aprimorar a ligação do anticorpo a hIL-7R. A Figura 17A ilustra os diferentes aspectos do próprio processo. A Figura 17B fornece uma breve descrição de interpretação dos resultados dos mapas de calor.

[071] As Figuras 18A, 18B, 18C, 18D, 18E e 18F fornecem os resultados de mapa de calor para variantes de anticorpo 18B1 com uma mutação em CDR3 de LC, CDR3 de HC, CDR1 de LC, CDR2 de LC, CDR1 de HC e CDR2 de HC, respectivamente. Para cada uma das figuras, as variantes de anticorpo foram testadas em duas diferentes concentrações (0,2 nM e 1 nM). Em cada uma das figuras, a coluna mais à esquerda fornece a mutação específica feita em um resíduo de aminoácido particular. A pontuação de enriquecimento para diferentes mutações é fornecida nas caixas relevantes. Conforme explicado na Figura 17B, uma pontuação de enriquecimento de >1 sugere uma mutação favorável (isto é, aprimora a ligação) com uma pontuação de enriquecimento superior que sugere uma mutação mais favorável. Uma pontuação de enriquecimento de 1 sugere uma mutação neutra (isto é, não afeta significativamente a ligação). Uma pontuação de enriquecimento de < 1 sugere uma mutação desfavorável (isto é, prejudica a ligação).

[072] A Figura 19 fornece (i) o valor de KD (mostrado como uma razão do anticorpo 18B1 parenteral para o anticorpo variante), e (ii) a razão de enriquecimento obtida através de análise de mapa de calor de NGS para diferentes variantes de anticorpo 18B1.

[073] As Figuras 20A e 20B fornecem uma visão geral do formato de cinética Biacore usado para avaliar a ligação de variantes de 18B1 (Anticorpo A) e alanina de 18B1 descritas no Exemplo 11. As condições específicas usadas são fornecidas na porção esquerda da Figura 20A. O sensorgrama Biacore para o anticorpo 18B1 é fornecido na porção direita da Figura 20A. A Figura 20B mostra um esquema do ensaio Biacore usado.

[074] A Figura 21 fornece os dados de ligação para as diferentes variantes de anticorpo 18B1 ao IL-7R humano conforme medido por análise Biacore.

[075] A Figura 22 fornece perfil de ressonância de plasmon de superfície (SPR) de variantes de anticorpo 18B1 exemplificativas. Para cada uma das variantes de anticorpo, os valores de ka, kd e KD são fornecidos abaixo do perfil de SPR.

[076] A Figura 23 fornece um sumário gráfico da distribuição de valores de KD para diferentes variantes de anticorpo 18B1. Cada uma das variantes de anticorpo é dividida com base em qual das CDRs foi mutada. Cada círculo representa um anticorpo individual.

[077] A Figura 24 mostra a correlação entre valores de KD (quadrado) e os resultados de mapa de calor gerados usando NGS (círculo aberto) para diferentes variantes de alanina. As mutações específicas (nas CDRs de cadeia leve ou nas CDRs de HC) são fornecidas ao longo do eixo geométrico X.

[078] As Figuras 25A e 25B fornecem uma estrutura cristalina do fragmento Fab do anticorpo 18B1. Na Figura 25 A, as cadeias pesadas (cinza escuro) e leves (cinza claro) do anticorpo 18B1 são denotadas. Na Figura 25B, os resíduos que são importantes para ligar à IL-7Rɑ são mostrados em cinza escuro. Os resíduos que poderiam ser modificados para aprimorar a ligação são mostrados em preto.

[079] A Figura 26 fornece uma comparação de expressão de IL- 7Rɑ em leucócitos CD3+ isolados de macacos que receberam uma administração subcutânea do anticorpo 18B1 em uma das seguintes doses: (i) 2 mg/kg (“quadrado”), (ii) 10 mg/kg (“triângulo”) (iii) 50 mg/kg (“diamante”). Os animais que não receberam o anticorpo 18B1 foram usados como controles (“círculo”). A expressão de IL-7Rɑ é mostrada como intensidade de fluorescência média (MFI) conforme medido usando citometria de fluxo. A expressão de IL-7Rɑ foi medida nos dias seguintes após a administração de anticorpo: dia 1, 4 horas; dia 5; dia 8; dia 22; dia 36; dia 36, 4 horas; dia 40; dia 43; dia 64; e dia 99.

[080] As Figuras 27A e 27B fornecem uma comparação das respostas de anticorpo de IgM (Figura 27A) e IgG (Figura 27B) induzidas por hemocianina de lapa de fechadura (KLH) em macacos que receberam uma administração subcutânea do anticorpo 18B1 em uma das seguintes doses: (i) 2 mg/kg (“quadrado”), (ii) 10 mg/kg (“triângulo”) (iii) 50 mg/kg (“diamante”). Os animais que não receberam o anticorpo 18B1 foram usados como controles (“círculo”). As respostas de IgM e IgG induzidas por KLH são mostradas ao fornecer o anticorpo de IgM e IgG específicas de KLH de tituladores de ponto final medido nos soros dos animais usando ELISA. Conforme mostrado na Figura 27A, a IgM específica de KLH foi medida nos dias 15, 22 e 29 após a administração de anticorpo 18B1 (isto é, dias 0, 7 e 14 após imunização de KLH, respectivamente). Conforme mostrado na Figura 27B, IgG específica de KLH foi medida nos dias 15, 29, 36 e 43 após a administração de anticorpo 18B1 (isto é, dias 0, 14, 21 e 28 após imunização de KLH, respectivamente).

[081] As Figuras 28A, 28B e 28C mostram as diferenças de absorção de deutério para os diferentes epítopos de três anticorpos anti- IL-7R de referência (4A8, 13A10 e PFE A3312F, respectivamente) identificados usando a análise de mapeamento de epítopo HDX-MS. Os epítopos mostrados na Figura 28A para o anticorpo 4A8 incluem: (i) 57 LVEVKCLNF65, (ii) 73FIETKKFLLIGKSNIC88, (iii) 136 QKKYVKVLMHDVAY149 e (iv) 181 YEIKVRSIPDHYFKGF196. Os epítopos mostrados na Figura 28B para o anticorpo 13A10 incluem: (i) 73 FIETKKFLLIGKSNIC88, (ii) 89 VKVGEKSLTCKKIDLTT105, (iii) 136 QKKYVKVLMHDVAY149 e (iv) 181 YEIKVRSIPDHYFKGF196. Os epítopos mostrados na Figura 28C para PFE A3312F incluem: (i) 24 SQLEVNGSQHSLTCA38, (ii) 52 EICGALVEVKCLNF65, (iii) 73 FIETKKFLLIGKSNIC88, (iv) 89 VKVGEKSLTCKKIDLTT105, (v) 104 TTIVKPEAPFDLSV117, (vi) 109 PEAPFDLSVIYRE121, (vii)

QKKYVKVLMHDVAY149, (viii) 169 TLLQRKLQPAAM180 e (ix) 181 YEIKVRSIPDHYFKGF196. As barras verticais pretas indicam as diferenças somadas em deuteração para cada peptídeo. As linhas representam diferenças para cada em diferentes pontos de tempo, isto é, 1 minuto (“(2)”), 10 minutos (“(3)”) e 240 minutos (“(1)”).

[082] As Figuras 29A, 29B e 29C mostram os epítopos de três anticorpos anti-IL-7R de referência (4A8, 13A10 e PFE A3312F, respectivamente) mapeados para a estrutura cristalina da proteína de IL-7Rɑ humano.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[083] Para que a presente descrição possa ser entendida prontamente, certos termos são definidos primeiramente. As definições adicionais são estabelecidas ao longo da descrição detalhada.

[084] Deve ser observado que o termo "um" ou "uma" entidade se refere a uma ou mais daquela entidade; por exemplo, entende-se que "uma sequência de nucleotídeos” represente uma ou mais sequências de nucleotídeos. Como tal, os termos "um" (ou "uma"), "um ou mais" e "pelo menos um" podem ser usados de modo intercambiável no presente documento.

[085] Adicionalmente, "e/ou", quando usado no presente documento, deve ser considerado como uma divulgação específica de cada um dos dois recursos ou componentes especificados com ou sem o outro. Deste modo, o termo "e/ou", conforme usado numa expressão, como "A e/ou B", no presente documento, é destinado a incluir "A e B", "A ou B", "A" (sozinho) e "B" (sozinho). Similarmente, o termo "e/ou" conforme usado numa expressão, como "A, B, e/ou C" é destinado a abranger cada um dos aspectos a seguir: A, B e C; A, B ou C; A ou C; A ou B; B ou C; A e C; A e B; B e C; A (sozinho); B (sozinho); e C (sozinho).

[086] Deve ser entendido que sempre que aspectos são descritos no presente documento com a linguagem “compreendendo", de outro modo, aspectos análogos descritos em termos de "consistindo em" e/ou "consistindo essencialmente em" também são fornecidos.

[087] A menos que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado conforme comumente entendido por uma pessoa com habilidade comum na técnica à qual esta invenção é relacionada. Por exemplo, o Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2a ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3a ed., 1999, Academic Press; e o Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press, capacita alguém versado em um dicionário geral de muitos dos termos usados na presente divulgação.

[088] Unidades, prefixos e símbolos são denotados em sua forma aceita pelo Sistema Internacional de Unidades (SI). As faixas numéricas são inclusivas dos números que definem a faixa. Salvo se indicado de outro modo, as sequências de nucleotídeos são escritas da esquerda para a direita na orientação 5' para 3'. As sequências de aminoácidos são escritas da esquerda par a direita em orientação amino para carbóxi. Os títulos fornecidos no presente documento não são limitações dos vários aspectos da revelação que podem ser tidos como referência ao relatório descritivo como um todo. Consequentemente, os termos definidos imediatamente abaixo são mais completamente definidos a título de referência ao relatório descritivo, em sua totalidade.

[089] O termo "aproximadamente" é usado no presente documento para significar aproximadamente, quase, cerca de ou nas regiões. Quando o termo “cerca de” é usado em conjunto com um intervalo numérico, o mesmo modifica esta escala estendendo os limites acima e abaixo dos valores numéricos apresentados. Em geral, o termo "aproximadamente" pode modificar um valor numérico acima e abaixo do valor apresentado por uma variância de, por exemplo, 10 por cento, para cima ou para baixo (superior ou inferior).

[090] Conforme usado no presente documento, os termos "IL-7R" e "receptor de IL-7" se referem a qualquer forma de IL-7R, incluindo variantes do mesmo que retém pelo menos parte da atividade de um IL- 7R. O IL-7R é um heterodímero que consiste em uma subunidade (IL- 7Rɑ ou CD 127) e na cadeia γ (γc) comum de receptor de citocina. A subunidade de IL-7Rɑ é expressa em vários tipos de células, incluindo células T virgens e de memória e células B em desenvolvimento. Conforme usado no presente documento, em alguns aspectos, o termo IL-7R se refere a uma subunidade e é usado de modo intercambiável com IL-7Rɑ.

[091] Quatro isoformas de IL-7Rɑ humano foram identificadas. A Isoforma 1 (n° de Acesso. NP_002176.2; SEQ ID NO: 1) consiste em 459 aminoácidos e representa a sequência canônica. A Isoforma 2 (n° de Acesso. P16871-4; SEQ ID NO: 2) consiste em 252 aminoácidos e é solúvel. A mesma não apresenta resíduos de aminoácido 253 a 459, o que codifica parte do domínio transmembranar e todo o domínio citoplásmico. Os aminoácidos 237 a 252 também diferem da sequência canônica (isto é, Isoforma 1). A Isoforma 3 (n° de Acesso. P16871-2, SEQ ID NO: 3) consiste em 298 aminoácidos e tem um domínio citoplásmico truncado. A mesma difere da sequência canônica nos resíduos de aminoácido 293 a 459. A Isoforma 4 (n° de Acesso. P16871 -3; SEQ ID NO: 4) consiste em 261 aminoácidos e é solúvel. A mesma difere da sequência canônica nos resíduos de aminoácido 237 a 459.

[092] Estão abaixo as sequências de aminoácidos das quatro isoformas de IL-7Rɑ humano conhecidas. (A) Isoforma 1 de IL-7Rɑ Humano (n° de Acesso. NP_002176.2; SEQ ID NO: 1, codificada pela sequência de nucleotídeos que tem n° de Acesso. NM_002185.4; SEQ ID NO: 5):

(B) Isoforma 2 de IL-7Rɑ Humano (n° de Acesso. P16871-4; SEQ ID NO: 2): (C) Isoforma 3 de IL-7Rɑ Humano (n° de Acesso. P16871-2; SEQ ID NO: 3): (D) Isoforma 4 de IL-7Rɑ Humano (n° de Acesso. P16871-3; SEQ ID NO: 4):

[093] A sequência de sinais de Isoformas 1 a 4 corresponde aos resíduos de aminoácido 1 a 20 (sublinhadas). Assim, a forma madura, por exemplo, da sequência canônica (Isoforma 1) consiste em aminoácidos 21 a 459. O domínio extracelular de IL-7Rɑhumano (por exemplo, Isoforma 1) consiste em resíduos de aminoácido 21 a 239 e tem a seguinte sequência de aminoácidos:

[094] A proteína de IL-7Rɑ de cinomolgo consiste na seguinte sequência de aminoácidos (incluindo uma sequência de sinais, que está sublinhada):

[095] Conforme usado no presente documento, "TSLP" se refere a um fator de crescimento que remonta proximamente a IL-7 e desempenha um papel na maturação e ativação de células mieloides (por exemplo, monócitos e células dendríticas). TSLP é produzida por vários tipos de célula, como fibroblastos, células epiteliais e células estromais. Níveis elevados de TSLP foram associados a doenças, como asma, dermatite atópica e artrite inflamatória, que também são conhecidas por serem associadas à regulação anormal de IL-7. Nguyen V., et al., J Immunol Res 2017: 4807853 (2017).

[096] Conforme usado no presente documento, o termo "anticorpo" se refere a uma proteína compreendendo pelo menos duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interconectadas por ligações de dissulfeto. Cada cadeia pesada é compreendida de uma região variável de cadeia pesada (abreviada como VH no presente documento) e uma região constante de cadeia pesada (abreviada como CH no presente documento). Em certos anticorpos, por exemplo, anticorpos de IgG de ocorrência natural, a região constante de cadeia pesada é compreendida de uma dobradiça e três domínios, CH1, CH2 e CH3. Em certos anticorpos, por exemplo, anticorpos de IgG de ocorrência natural, cada cadeia leve é compreendida de uma região variável de cadeia leve (abreviada como VL no presente documento) e uma cadeia leve região constante. A cadeia leve região constante é compreendida de um domínio (abreviado como CL no presente documento). As regiões VH e VL podem ser adicionalmente subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas Regiões Determinantes de Complementaridade (CDR), intercaladas com as regiões que são mais conservadas, denominadas regiões de framework (FR). Cada VH e VL é composta por três CDRs e quatro FRs, dispostas a partir do terminal amino até ao terminal carbóxi na seguinte ordem: PR1, CDR1, PR2, CDR2, PR3, CDR3, PR4. As regiões variáveis das cadeias pesadas e leves contêm um domínio de ligação que interage com um antígeno. As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglobulina aos tecidos ou fatores hospedeiros, incluindo várias células do sistema imunológico (por exemplo, células efetoras) e o primeiro componente (Clq) do sistema de complemento clássico. Uma cadeia pesada pode ter ou não a lisina de terminal C. Salvo se especificado de outro modo no presente documento, os aminoácidos nas regiões variáveis são enumerados usando o sistema de numeração Rabat e aqueles nas regiões constantes são enumerados pelo sistema EU. "Anticorpo" inclui, a título de exemplo, anticorpos tanto de ocorrência natural quanto de ocorrência não natural; anticorpos monoclonais e policlonais; anticorpos quiméricos e humanizados; anticorpos humanos e não humanos e anticorpos completamente sintéticos.

[097] Um “anticorpo de IgG", por exemplo, um anticorpo de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 humana conforme usado no presente documento tem, em certas modalidades, a estrutura de um anticorpo de IgG de ocorrência natural, isto é, tem o mesmo número de cadeias pesadas e leves e ligações de dissulfeto como um anticorpo de IgG de ocorrência natural da mesma subclasse. Por exemplo, um anticorpo de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 anti-IL-7R consiste em duas cadeias pesadas (HCs) e duas cadeias leves (LCs), em que as duas cadeias pesadas e cadeias leves são ligadas pelo mesmo número e localização de pontes de dissulfeto que ocorrem em anticorpos de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 de ocorrência natural, respectivamente (salvo se o anticorpo tiver mutado para modificar as pontes de dissulfeto).

[098] Anticorpos tipicamente se ligam especificamente ao seu antígeno cognato com alta afinidade, refletida por uma constante de dissociação (KD) de 10’5 a 10’11 M ou menos. Qualquer K D maior que aproximadamente 10’4 M é, em geral, considerada como indicando ligação não específica. Conforme usado no presente documento, um anticorpo que "se liga especificamente" a um antígeno se refere a um anticorpo que se liga ao antígeno e a antígenos substancialmente idênticos com alta afinidade, o que significa ter uma K D de 10-7 M ou menos, 10-8 M ou menos, 5 x 10-9 M ou menos ou entre 10-’8 M e 10_-10 M ou menos, mas não se liga com alta afinidade a antígenos não relacionados. Um antígeno é "substancialmente idêntico" a um determinado antígeno se o mesmo exibe um alto grau de identidade de sequência com o determinado antígeno, por exemplo, se o mesmo exibe pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência do determinado antígeno. A título de exemplo, um anticorpo que se liga especificamente ao IL-7Rɑ humano também pode, em certas modalidades, ter reatividade cruzada com antígenos de IL- 7Rɑ de certas espécies primata (por exemplo, IL-7Rɑ de cinomolgo), mas não pode reagir de modo cruzado com antígenos de IL-7Rɑ de outras espécies ou com um antígeno diferente de IL-7Rɑ.

[099] Conforme usado no presente documento, "isótipo" se refere à classe de anticorpo (por exemplo, anticorpo de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgAl, IgA2, IgD e IgE) que é codificada pelos genes de região constante de cadeia pesada. O isótipo de IgG é dividido em subclasses em certas espécies: IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 em seres humanos, e IgG1, IgG2a, IgG2b e IgG3 em camundongos. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-IL-7R descritos no presente documento são do isótipo de IgG1. Imunoglobulinas, por exemplo, IgG1, existem em vários alótipos, que diferem entre si em, no máximo, alguns aminoácidos.

[100] Conforme usado no presente documento, o termo "alótipo" se refere a variantes de ocorrência natural dentro de um grupo de isótipos específico, em que as variantes diferem em alguns aminoácidos (consulte, por exemplo, Jefferis et al. (2009) mAbs 1:1). Anticorpos anti-IL-7R descritos no presente documento podem ser de qualquer alótipo. Conforme usado no presente documento, os anticorpos referidos como isótipo "IgG1f”, "IgG1.1If" ou "IgG1.3f” são anticorpos de IgG1, IgG1.1 sem função efetora e IgG1.3 sem função efetora, respectivamente, do alótipo "f," isto é, que tem 214R, 356E e 358M de acordo com o índice EU como em Kabat, conforme mostrado, por exemplo, na SEQ ID NO: 21.

[101] O termo "porção de ligação a antígeno" de um anticorpo conforme usado no presente documento se refere a um ou mais fragmentos de um anticorpo que retêm a capacidade para se ligar especificamente a um antígeno (por exemplo, IL-7Rɑ humano). Foi mostrado que a função de ligação a antígeno de um anticorpo pode ser realizada por fragmentos de um anticorpo de comprimento total. Exemplos de fragmentos de ligação abrangidos no termo "porção de ligação a antígeno" de um anticorpo, por exemplo, um anticorpo anti-IL- 7R descrito no presente documento, incluem (i) um fragmento Fab (fragmento de clivagem de papaína) ou um fragmento monovalente similar que consiste nos domínios V L, VH, LC e CH1; (ii) um fragmento F(ab')2 (fragmento de clivagem de pepsina) ou um fragmento bivalente similar compreendendo dois fragmentos de Fab ligados por uma ponte de dissulfeto na região de dobradiça; (iii) um fragmento Fd que consiste nos domínios VH e CH1; (iv) um fragmento Fv que consiste nos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo, (v) um fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), que consiste em um domínio VH; (vi) uma região determinante de complementaridade (CDR) isolada e (vii) uma combinação de duas ou mais CDRs isoladas que podem ser unidas opcionalmente por um ligante sintético. Adicionalmente, embora os dois domínios do fragmento Fv, V L e VH, sejam codificados por genes separados, os mesmos podem ser unidos, usando métodos recombinantes, por um ligante sintético que possibilita que sejam feitos como uma única cadeia proteica em que o par de regiões VL e VH para formar moléculas monovalentes (conhecida como Fv de cadeia única (scFv); consulte, por exemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; e Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:5879-5883). Também se pretende que tais anticorpos de cadeia única sejam abrangidos no termo "porção de ligação a antígeno" de um anticorpo. Esses fragmentos de anticorpo são obtidos usando técnicas convencionais conhecidas para aqueles técnicos no assunto, e os fragmentos são triados quanto à utilidade da mesma maneira que anticorpos intactos. Porções de ligação a antígeno podem ser produzidas por técnicas de DNA recombinante ou por clivagem enzimática ou química de imunoglobulinas intactas.

[102] Um “anticorpo bifuncional" ou "biespecífico” é um anticorpo híbrido artificial que tem dois diferentes pares de cadeias pesada/leve e dois diferentes sítios de ligação. Anticorpos biespecíficos podem ser produzidos por uma variedade de métodos incluindo fusionamento de hibridomas ou ligação de fragmentos Fab'. Consulte, por exemplo, Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992)).

[103] O termo "anticorpo monoclonal", conforme usado no presente documento, se refere a um anticorpo de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais compreendidos na população são substancialmente similares e se ligam ao mesmo epítopo (ou epítopos) (por exemplo, os anticorpos exibem uma especificidade e uma afinidade de ligação únicas), exceto possíveis variantes que podem surgir durante a produção do anticorpo monoclonal, como estando, em geral, presentes em menores quantidade. O modificador “monoclonal” indica o caráter do anticorpo como sendo obtido de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, e não deve ser interpretado como exigindo a produção do anticorpo por nenhum método particular. O termo “anticorpo monoclonal humano" se refere a um anticorpo de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos que exibe uma especificidade de ligação única e que tem regiões constantes variáveis e opcionais derivadas de sequências de imunoglobulinas de linha germinativa humana. Em uma modalidade, anticorpos monoclonais humanos são produzidos por um hibridoma que inclui uma célula B obtida a partir de um animal não humano transgênico, por exemplo, um camundongo transgênico, que tem um genoma que compreende um transgene de cadeia pesada humano e um transgene de cadeia leve fusionado em uma célula imortalizada.

[104] O termo "anticorpo humano recombinante” conforme usado no presente documento inclui todos os anticorpos humanos que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, como (a) anticorpos isolados de um animal (por exemplo, um camundongo) que é transgênico ou transcromossômico para genes de imunoglobulina humanos ou um hibridoma preparada a partir dos mesmos, (b) anticorpos isolados de uma célula hospedeira transformada para expressar o anticorpo, por exemplo, de um transfectoma, (c) anticorpos isolados de uma biblioteca de anticorpos humanos combinatórios recombinantes, e (d) anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por quaisquer outros meios que envolvem a divisão de sequências de genes de imunoglobulina humanos em outras sequências de DNA. Tais anticorpos humanos recombinantes compreendem regiões variáveis e constantes que utilizam sequências de imunoglobulinas de linha germinativa humana particular são codificados por genes de linha germinativa, mas incluem redisposições e mutações subsequentes que ocorrem, por exemplo, durante a maturação de anticorpo. Conforme conhecido na técnica (consulte, por exemplo, Lonberg (2005) Nature Biotech. 23(9): 1117- 1125), a região variável contém o domínio de ligação a antígeno, que é codificado por vários genes que se redispõe para formar um anticorpo específico para um antígeno estranho. Além da redisposição, a região variável pode ser modificada adicionalmente por múltiplas alterações de aminoácidos únicos (referidas como mutação somática ou hipermutação) para aumentar a afinidade do anticorpo com o antígeno estranho. A região constante se alterará em resposta adicional a um antígeno (isto é, comutação de isótipo). Portanto, as moléculas de ácido nucleico redispostas e somaticamente mutadas que codificam os polipeptídeos de imunoglobulina de cadeia leve e cadeia pesada em resposta a um antígeno não podem ter identidade de sequência com as moléculas de ácido nucleico originais, mas, em vez disso, será substancialmente idêntica ou similar (isto é, tem pelo menos 80% de identidade).

[105] Um anticorpo "humano" (HuMAb) se refere a um anticorpo que tem regiões variáveis em que tanto a estrutura quanto regiões CDR são derivados de sequências de imunoglobulinas de linha germinativa humana. Adicionalmente, se o anticorpo contiver uma região constante, a região constante também é derivada de sequências de imunoglobulinas de linha germinativa humana. Os anticorpos anti-IL-7R descritos no presente documento podem incluir resíduos de aminoácido não codificados por sequências de imunoglobulinas de linha germinativa humana (por exemplo, mutações introduzidas por mutagênese aleatória ou específica de sítio in vitro ou por mutação somática in vivo). Entretanto, não se pretende que o termo “anticorpo humano", conforme usado no presente documento, inclua anticorpos em que sequências de CDR derivadas da linha germinativa de outras espécies mamíferas, como um camundongo, foram enxertadas em sequências de estruturas humanas. Os termos anticorpos "humanos" e anticorpos "totalmente humanos" são usados como sinônimos.

[106] Um anticorpo "humanizado" se refere a um anticorpo em que alguns, a maioria ou todos os aminoácidos fora dos domínios de CDR de um anticorpo não humano são substituídos com aminoácidos correspondentes derivados de imunoglobulinas humanas. Em uma modalidade de uma forma humanizada de um anticorpo, alguns, a maioria ou todos os aminoácidos fora dos domínios de CDR foram substituídos com aminoácidos de imunoglobulinas humanas, enquanto alguns, a maioria ou todos os aminoácidos contidos em uma ou mais regiões CDR são inalterados. Pequenas adições, deleções, inserções, substituições ou modificações de aminoácidos são permissíveis desde que não anulem a capacidade do anticorpo para se ligar a um antígeno particular. Um anticorpo "humanizado" retém uma especificidade antigênica similar àquela do anticorpo parenteral.

[107] Um "anticorpo quimérico" se refere a um anticorpo em que as regiões variáveis são derivadas de uma espécie e as regiões constantes são derivadas de outras espécies, como um anticorpo em que as regiões variáveis são derivadas de um anticorpo murino e as regiões constantes são derivadas de um anticorpo humano.

[108] As expressões "um anticorpo que reconhece um antígeno" e "um anticorpo específico para um antígeno" são usadas de modo intercambiável no presente documento com o termo "um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno".

[109] Pretende-se que um "anticorpo isolado" conforme usado no presente documento se refira a um anticorpo que é substancialmente livre de outras proteínas e material celular.

[110] Conforme usado no presente documento, pretende-se que um anticorpo que "inibe a ligação de IL-7 ao IL-7Rɑ" se refira a um anticorpo que inibe a ligação de IL-7Rɑ ao seu ligante, por exemplo, interleucina 7 (IL-7), por exemplo, em ensaios de ligação usando células T do sangue total que expressa IL-7Rɑ, com uma EC50 de aproximadamente 1 pg/ml ou menos, como aproximadamente 0,9 pg/ml ou menos, aproximadamente 0,85 pg/ml ou menos, aproximadamente 0,8 pg/ml ou menos, aproximadamente 0,75 pg/ml ou menos, aproximadamente 0,7 pg/ml ou menos, aproximadamente 0,65 pg/ml ou menos, aproximadamente 0,6 pg/ml ou menos, aproximadamente 0,55pg/ml ou menos, aproximadamente 0,5 pg/ml ou menos, aproximadamente 0,45 pg/ml ou menos, aproximadamente 0,4 pg/ml ou menos, aproximadamente 0,35 pg/ml ou menos, aproximadamente 0,3 pg/ml ou menos, aproximadamente 0,25 pg/ml ou menos, aproximadamente 0,2 pg/ml ou menos, aproximadamente 0,15 pg/ml ou menos, aproximadamente 0,1 pg/ml ou menos ou aproximadamente 0,05 pg/ml ou menos, em métodos reconhecidos pela técnica, por exemplo, os ensaios de ligação com base em FACS descritos no presente documento.

[111] Uma "função efetora" se refere à interação de uma região de Fc de anticorpo com um receptor ou ligante de Fc ou um evento bioquímico que resulta da mesma. “Funções efetoras" exemplificativas incluem ligação de Clq, citotoxicidade dependente de complemento (CDC), ligação de receptor de Fc, funções efetoras mediadas por FcγR, como ADCC e fagocitose mediada por célula dependente de anticorpo (ADCP) e regulação negativa de um receptor de superfície celular (por exemplo, o receptor de célula B; BCR). Tais funções efetoras exigem, em geral, que a região de Fc seja combinada com um domínio de ligação (por exemplo, um domínio variável de anticorpo).

[112] Um “receptor de Fc" ou "FcR" é um receptor que se liga à região de Fc de uma imunoglobulina. FcRs que se ligam a um anticorpo de IgG compreendem receptores da família FcγR, incluindo variantes alélicas e, alternativamente, formas divididas desses receptores. A família FcγR consiste em três receptores de ativação (FcγRI, FcγRIII e FcγRIV em camundongos; FcγRIA, FcγRIIA e FcγRIIIA em seres humanos) um receptor inibitório (FcγRIIB). Várias propriedades de FcγRs humanos são conhecidas na técnica. A maioria de tipos de células efetoras inatas coexpressa um ou mais FcγR de ativação o FcγRIIB inibitório, enquanto células exterminadoras naturais (NK) expressam seletivamente um receptor de Fc de ativação (FcγRIII em camundongos e FcγRIIIA em seres humanos), mas não o FcγRIIB inibitório em camundongos e seres humanos. A IgG1 humana se liga a maioria dos receptores de Fc humanos e é considerada equivalente à IgG2a murina em relação aos tipos de receptores de Fc de ativação que se liga.

[113] Uma "região de Fc" (região cristalizável de fragmento) ou "domínio de Fc" ou "Fc" se refere à região de terminal C da cadeia pesada de um anticorpo que media a ligação da imunoglobulina a tecidos ou fatores hospedeiros, incluindo a ligação a receptores de Fc localizados em várias células do sistema imunológico (por exemplo, células efetoras) ou ao primeiro componente (Clq) do sistema de complemento clássico. Assim, uma região de Fc compreende a região constante de um anticorpo excluindo o primeiro domínio de imunoglobulina de região constante (por exemplo, CH1 ou CL). Em isótipos de anticorpo de IgG, IgA e IgD, a região de Fc compreende dois fragmentos proteicos idênticos derivados do segundo (CH2) e do terceiro (CH3) domínios constantes das duas cadeias pesadas do anticorpo; regiões de Fc de IgM e IgE compreendem três domínios constantes de cadeia pesada (domínios CH 2 a 4) em cada cadeia polipeptídica. Para IgG, a região de Fc compreende domínios de imunoglobulina CH2 e CH3 e a dobradiça entre os domínios CH1 e CH2. Embora a definição das delimitações da região de Fc de uma cadeia pesada de imunoglobulina possa variar, conforme definido no presente documento, a região de Fc de cadeia pesada de IgG humana é definida como se estendendo de um resíduo de aminoácido D221 para IgG1, V222 para IgG2, L221 para IgG3 e P224 para IgG4 até o terminal carbóxi da cadeia pesada, em que a numeração é de acordo com o índice de EU como em Kabat. O domínio CH2 e de uma região de Fc de IgG humana se estende do aminoácido 237 ao aminoácido 340, e o domínio CH3 é posicionado no lado de terminal C de um domínio CH2 em uma região de Fc, isto é, se estende do aminoácido 341 ao aminoácido 447 ou 446 (se o resíduo de lisina de terminal C estiver ausente) ou 445 (se os resíduos de glicina e lisina de terminal C estiverem ausentes) de uma IgG. Conforme usado no presente documento, a região de Fc pode ser um Fc de sequência nativa, incluindo qualquer variante alotípica ou um Fc variante (por exemplo, um Fc de ocorrência não natural). Fc também pode se referir a essa região em isolamento ou no contexto de um polipeptídeo proteico que compreende Fc, como uma "proteína de ligação compreendendo uma região de Fc", também referido como uma "proteína de fusionamento de Fc" (por exemplo, um anticorpo ou imunoadesão).

[114] Uma "região de Fc de sequência nativa" ou "Fc de sequência nativa" compreende uma sequência de aminoácidos que é idêntica à sequência de aminoácidos de uma região de Fc encontrada na natureza. Regiões de Fc humano de sequência nativa incluem uma região de Fc de IgG1 humana de sequência nativa; região de Fc de IgG2 humana de sequência nativa; região de Fc de IgG3 humana de sequência nativa; e região de Fc de IgG4 humana de sequência nativa bem como variantes de ocorrência natural das mesmas. O Fc de sequência nativa inclui os vários alótipos de Fes (consulte, por exemplo, Jefferis et al. (2009) mAbs 1: 1).

[115] O termo "epítopo" ou "determinante antigênico" se refere a um sítio em um antígeno (por exemplo, IL-7Rɑ) ao qual uma imunoglobulina ou anticorpo se liga especificamente, por exemplo, conforme definido pelo método específico usado para identificar o mesmo. Epítopos podem ser formados tanto a partir de aminoácidos contíguos (usualmente, um epítopo linear) quanto a partir de aminoácidos não contíguos justapostos por dobramento terciário de uma proteína (usualmente, um epítopo conformacional). Epítopos formados a partir de aminoácidos contíguos são tipicamente, mas nem sempre, retidos na exposição a solventes desnaturantes, enquanto epítopos formados por dobramento terciário são perdidos tipicamente no tratamento com solventes desnaturantes. Um epítopo inclui tipicamente pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 aminoácidos em uma conformação espacial exclusiva. Métodos para determinar quais epítopos são ligados por um determinado anticorpo (isto é, mapeamento de epítopo) são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, ensaios de immunoblotting e imunoprecipitação, em que peptídeos sobrepostos ou contíguos (por exemplo, de IL-7Rɑ) são testados quanto à reatividade com um determinado anticorpo (por exemplo, anticorpo anti-IL-7R). Métodos de determinação de conformação espacial de epítopos incluem técnicas no assunto e aquelas descritas no presente documento, por exemplo, cristalografia de raio X, análise mutacional de antígeno, ressonância magnética nuclear bidimensional e HDX-MS (consulte, por exemplo, Epítopo Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Volume 66, G. E. Morris, Ed. (1996)).

[116] O termo "mapeamento de epítopo" se refere ao processo de identificação das determinantes moleculares para reconhecimento de anticorpo-antígeno.

[117] O termo "liga ao mesmo epítopo" com referência a dois ou mais anticorpos significa que os anticorpos se ligam ao mesmo segmento de resíduos de aminoácido, conforme determinado por um determinado método. Técnicas para determinar se anticorpos se ligam "ao mesmo epítopo em IL-7Rɑ" com os anticorpos descritas no presente documento incluem, por exemplo, métodos de mapeamento de epítopo, como análise de raio X de cristais de complexos de antígeno:anticorpo que fornece resolução atômica do epítopo e espectrometria de massa de troca de hidrogênio/deutério (HDX-MS). Outros métodos monitoram a ligação do anticorpo a fragmentos de antígeno ou variações mutadas do antígeno em que a perda de ligação devido a uma modificação de um resíduo de aminoácido contido na sequência de antígenos é frequentemente considerada uma indicação de um componente de epítopo. Além disso, métodos combinatórios computacionais para mapeamento de epítopo também podem ser usados. Esses métodos dependem da capacidade do anticorpo de interesse por isolar por afinidade peptídeos curtos específicos de bibliotecas de peptídeo de exibição de fago combinatórias. Espera-se que anticorpos que têm as mesmas VH e VL ou as mesmas sequências de CDR1, 2 e 3 se liguem ao mesmo epítopo.

[118] Anticorpos que "competem com outro anticorpo para se ligar a um alvo" se referem a anticorpos que inibem (parcial ou completamente) a ligação do outro anticorpo ao alvo. Se dois anticorpos competirem entre si para se ligar a um alvo, isto é, se e em que medida um anticorpo inibe a ligação do outro anticorpo a um alvo pode ser determinado usando experimentos de competição conhecidos, por exemplo, análise de ressonância de plasmon de superfície (SPR) BIACORE™. Em certas modalidades, um anticorpo compete com, e inibe a ligação de outro a um alvo em pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100%. O nível de inibição ou competição pode ser diferente dependendo de qual anticorpo é o "anticorpo de bloqueio" (isto é, o anticorpo frio que é incubado primeiramente com o alvo). Ensaios de competição podem ser conduzidos conforme descrito, por exemplo, em Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harb Protoc; 2006; doi:

10.1101/pdb.prot4277 ou no Capítulo 11 de "Using Anticorpos" por Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, EUA 1999. Dois anticorpos "competem de modo cruzado" se anticorpos se bloqueiam em pelo menos 50%, isto é, independentemente da possibilidade de um ou o outro anticorpo estar em contato primeiramente com o antígeno no experimento de competição.

[119] Ensaios de ligação competitivas para determinar se dois anticorpos competem ou competem de modo cruzado para se ligarem incluem: competição para se ligar a células T que expressam IL-7Rɑ, por exemplo, por citometria de fluxo, como descrito nos Exemplos. Outros métodos incluem: SPR (por exemplo, BIACORE™), radioimunoensaio direto ou indireto de fase sólida (RIA), imunoensaio enzimático direto ou indireto de fase sólida (EIA), ensaio de competição em sanduíche (consulte Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242 (1983)); EIA de biotina-avidina direto de fase sólida (consulte Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614 (1986)); ensaio com marcação direto de fase sólida, ensaio em sanduíche com marcação de fase sólida (consulte Harlow and Lane, Anticorpos: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)); RIA com marcação direto de fase sólida usando marcação de 1 a 125 (consulte Morel et al., Mol. Immunol. 25(1):7 (1988)); EIA de biotina-avidina direto de fase sólida (Cheung et al., Virology 176:546 (1990)); RIA com marcação direto. (Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32.77 (1990)).

[120] Conforme usado no presente documento, os termos "ligação específica", "ligação seletiva", "liga seletivamente" e "liga especificamente" se referem à ligação de anticorpo a um epítopo em um antígeno predeterminado. Tipicamente, o anticorpo (i) se liga e uma constante de equilíbrio de dissociação (KD) de aproximadamente menos de 10-7 M, como aproximadamente menos de 10-8 M, 10-9 M ou 10-10 M ou ainda inferior quando determinada por, por exemplo, tecnologia de ressonância de plasmon de superfície (SPR) em um instrumento BIACORE™ 2000 usando o antígeno predeterminado, por exemplo, IL- 7Ra humano recombinante, como o analito e o anticorpo como o ligante, ou análise Scatchard de ligação do anticorpo a células positivas de antígeno, e (ii) se liga ao antígeno predeterminado com uma afinidade que é pelo menos duas vezes maior que sua afinidade para se ligar a um antígeno não específico (por exemplo, BSA, caseína) diferente do antígeno predeterminado ou antígeno intimamente relacionado. Consequentemente, um anticorpo que "se liga especificamente ao IL- 7Rɑ humano " se refere a um anticorpo que se liga ao IL-7Rɑ humano solúvel ou ligado à célula com uma KD de 10-7 M ou menos, como aproximadamente menos de 10-8 M, 10-9 M ou 10-10 M ou ainda inferior. Um anticorpo que "reage de modo cruzado com IL- 7Rɑ de cinomolgo " se refere a um anticorpo que se liga ao IL-7Rɑ de cinomolgo com uma KD de 10-7 M ou menos, como aproximadamente menos de 10-8 M, 10-9 M ou 10-10 M ou ainda inferior. Em certas modalidades, tais anticorpos que não reagem de modo cruzado com IL-7Rɑ de uma espécie não humana exibe essencialmente ligação indetectável contra essas proteínas em ensaios de ligação padrão.

[121] Pretende-se que o termo "kassoc" ou "ka", conforme usado no presente documento, se refira à taxa de associação de uma interação de anticorpo- antígeno particular, enquanto se pretende que o termo "kdis" ou "kd,", conforme usado no presente documento, se refira à taxa de dissociação de uma interação de anticorpo-antígeno particular. Pretende-se que o termo "KD", conforme usado no presente documento, se refira à constante de dissociação, que é obtida a partir da razão de kd para ka (isto é, kd/ka) e é expressa como uma concentração molar (M). Valores de KD para anticorpos podem ser determinados usando métodos bem estabelecidos na técnica. Métodos disponíveis para determinar a KD de um anticorpo incluem ressonância de plasmon de superfície, um sistema de biossensor, como um sistema BIACORE® ou citometria de fluxo ou análise Scatchard.

[122] Conforme usado no presente documento, o termo "alta afinidade" para um anticorpo de IgG se refere a um anticorpo que tem uma KD de 10-8 M ou menos, 10-9 M ou menos ou 10-10 M ou menos para um antígeno alvo. Entretanto, a ligação de "alta afinidade" pode variar para outros isótipos de anticorpo. Por exemplo, a ligação de "alta afinidade" para um isótipo de IgM se refere a um anticorpo que tem uma KD de 10-10 M ou menos ou 10-8 M ou menos.

[123] O termo "EC50" no contexto de um ensaio in vitro ou in vivo usando um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo se refere à concentração de um anticorpo ou de uma porção de ligação a antígeno do mesmo que induz uma resposta que é 50% da resposta máxima, isto é, meio termo entre a resposta máxima e a linha de base.

[124] O termo "de ocorrência natural" conforme usado no presente documento quando aplicado a um objeto se refere ao fato de que um objeto pode ser encontrado na natureza. Por exemplo, uma sequência de polipeptídeos ou polinucleotídeos que está presente em um organismo (incluindo vírus) que pode ser isolada de uma fonte na natureza e que não foi modificada intencionalmente por homem no laboratório não ocorre naturalmente.

[125] Um "polipeptídeo" se refere a uma cadeia compreendendo pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivamente ligados sem nenhum limite superior no comprimento da cadeia. Um ou mais resíduos de aminoácido na proteína podem conter uma modificação como, mas sem limitação, glicosilação, fosforilação ou formação de ligação de dissulfeto. Uma "proteína" pode compreender um ou mais polipeptídeos.

[126] Pretende-se que o termo "molécula de ácido nucleico", conforme usado no presente documento, inclua moléculas de DNA e moléculas de RNA. Uma molécula de ácido nucleico pode ser de fita única ou fita dupla, e pode ser cDNA.

[127] “Substituições de aminoácido conservativas" se refere a substituições de um resíduo de aminoácido com um resíduo de aminoácido que tem uma cadeia lateral similar. Famílias de resíduos de aminoácido que têm cadeias laterais similares foram definidas na técnica. Essas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, histidina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares sem carga (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptofano), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Em certas modalidades, um resíduo de aminoácido não essencial previsto em um anticorpo anti-IL-7R é substituído com outro resíduo de aminoácido da mesma família de cadeia lateral. Métodos de identificação de substituições conservativas de nucleotídeo e aminoácido que não eliminam a ligação de antígeno são bem conhecidos na técnica (consulte, por exemplo, Brummell et al., Biochem. 32: 1180- 1187 (1993); Kobayashi et al. Protein Eng. 12(10):879-884 (1999); e Burks et al. Proc. Natl. Acad. Set. USA94:412- 417 (1997)).

[128] Para ácidos nucleicos, o termo "homologia substancial"

indica que dois ácidos nucleicos ou sequências designadas dos mesmos, quando idealmente alinhados e comparados, são idênticos com inserções ou deleções nucleotídicas apropriadas, em pelo menos aproximadamente 80% dos nucleotídeos, pelo menos aproximadamente 90% a 95% ou pelo menos aproximadamente 98% a 99,5% dos nucleotídeos. Alternativamente, a homologia substancial existe quando os segmentos hibridizarão sob condições de hibridização seletiva com o complemento da fita.

[129] Para polipeptídeos, o termo "homologia substancial" indica que dois polipeptídeos ou sequências designadas dos mesmos, quando idealmente alinhados e comparados, são idênticos com inserções ou deleções de aminoácido apropriadas, em pelo menos aproximadamente 80% dos aminoácidos, pelo menos aproximadamente 90% a 95% ou pelo menos aproximadamente 98% a 99,5% dos aminoácidos.

[130] O percentual de identidade entre duas sequências é uma função do número de posições idênticas compartilhado pelas sequências (isto é, % de homologia = n° de posições idênticas/n° total de posições x 100), considerando o número de vãos, e o comprimento de cada vão, que precisa ser introduzido para alinhamento ideal das duas sequências. A comparação de sequências e determinação de percentual de identidade entre duas sequências podem ser realizadas usando um algoritmo matemático, por exemplo, conforme descrito nos exemplos não limitantes abaixo.

[131] O percentual de identidade entre duas sequências de nucleotídeos pode ser determinado usando o programa GAP no pacote de software GCG (disponível em worldwideweb.gcg.com), usando uma matriz NWSgapdna.CMP e um peso de vão de 40, 50, 60, 70 ou 80 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6. O percentual de identidade entre duas sequências de nucleotídeos ou aminoácidos também pode ser determinado usando o algoritmo de E. Meyers e W.

Miller (CABIOS, 4: 11-17 (1989)) que foi incorporado no programa ALIGN (versão 2.0), usando uma tabela de resíduo de peso PAM120, uma penalidade de comprimento de vão de 12 e uma penalidade de vão de 4. Além disso, o percentual de identidade entre duas sequências de aminoácidos pode ser determinado usando o algoritmo de Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)) que foi incorporado no programa GAP no pacote de software GCG (disponível em http://www.gcg.com), usando uma matriz Blossum 62 ou uma matriz PAM250, e um peso de vão de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ou 4 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6.

[132] As sequências de ácidos nucleicos e proteínas descritas no presente documento podem ser usadas adicionalmente como uma "sequência de consultas" para realizar uma pesquisa contra bases de dados públicas, por exemplo, para identificar sequências relacionadas. Tais pesquisas podem ser realizadas usando os programas NBLAST e XBLAST (versão 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10; As pesquisas de nucleotídeos de BLAST podem ser realizadas com o programa NBLAST, pontuação = 100, comprimento de palavra = 12 para obter sequências de nucleotídeos homólogas às moléculas de ácido nucleico descritas no presente documento. As pesquisas de proteína de BLAST podem ser realizadas com o programa XBLAST, pontuação= 50, comprimento de palavra = 3 para obter sequências de aminoácidos homólogas às moléculas de proteína descritas no presente documento. Para obter alinhamentos com vãos para propósitos de comparação, BLAST com vão pode ser utilizado conforme descrito em Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402. Ao utilizar programas BLAST e BLAST com vão, os parâmetros padrão dos respectivos programas (por exemplo, XBLAST e NBLAST) podem ser usados. Consulte worldwideweb.ncbi.nlm.nih.gov.

[133] Os ácidos nucleicos podem estar presentes em todas as células, em um lisato celular ou em uma forma parcialmente pura ou substancialmente pura. Um ácido nucleico é "isolado" ou "tornado substancialmente puro" quando purificado de outros componentes celulares ou outros contaminantes, por exemplo, outros ácidos nucleicos celulares (por exemplo, as outras partes do cromossomo) ou proteínas, por técnicas padrão, incluindo tratamento alcalino/SDS, banda de CsCl, cromatografia de coluna, eletroforese em gel de agarose e outras bem conhecidas na técnica. Consulte, L. Ausubel, et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987).

[134] Ácidos nucleicos, por exemplo, cDNA, podem ser mutados de acordo com técnicas padrão para fornecer sequências de genes. Para sequências de codificação, essas mutações podem afetar sequência de aminoácidos conforme desejado. Em particular, sequências de DNA substancialmente homólogas ou derivadas de comutadores de V, D, J nativos e constantes e outras tais sequências descritas no presente documento são contemplados (em que "derivada" indica que uma sequência é idêntica ou modificada a partir de outra sequência).

[135] Pretende-se que o termo "vetor” conforme usado no presente documento se refira a uma molécula de ácido nucleico que tem capacidade para transportar outro ácido nucleico ao qual o mesmo foi ligado. Um tipo de vetor é um "plasmídeo" que se refere a uma alça de DNA de fita dupla circular na qual segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Outro tipo de vetor é um vetor viral, em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligados no genoma viral. Determinados vetores têm capacidade para replicação autônoma numa célula hospedeira na qual são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos que têm uma origem bacteriana de replicação e vetores de mamífero epissomais). Outros vetores (por exemplo, vetores mamíferos não epissomais) podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira após a introdução na célula hospedeira, e são, desse modo, replicados juntamente com o genoma hospedeiro. Além disso, certos vetores têm capacidade para direcionar a expressão de genes aos quais os mesmos são ligados operativamente. Tais vetores são referidos como "vetores de expressão recombinante" (ou, simplesmente, "vetores de expressão") no presente documento. Em geral, os vetores de expressão de utilidade em técnicas de DNA recombinante estão frequentemente na forma de plasmídeos. No presente relatório descritivo, "plasmídeo" e "vetor" podem ser usados de modo intercambiável, pois o plasmídeo é a forma de vetor mais comumente usada. Entretanto, também são incluídas outras formas de vetores de expressão, como vetores virais (por exemplo, retrovírus com replicação defeituosa, adenovírus e vírus adenoassociados), que desempenham funções equivalentes.

[136] Pretende-se que o termo “célula hospedeira recombinante" (ou, simplesmente, "célula hospedeira") conforme usado no presente documento se refira a uma célula que compreende um ácido nucleico que não está naturalmente presente na célula, e pode ser uma célula na qual um vetor de expressão recombinante foi introduzido. Deve ser entendido que se pretende que tais termos não se refiram apenas à célula em questão particular, mas à progênie de tal célula. Devido ao fato de que certas modificações podem ocorrer em gerações seguintes devido à mutação ou influências ambientais, como a progênie não pode, de fato, ser idêntica à célula parental, mas são ainda incluídas no escopo do termo "célula hospedeira" conforme usado no presente documento.

[137] Conforme usado no presente documento, o termo "resposta imune" é conforme entendido na técnica, e, em geral, se refere a uma resposta biológica dentro de um vertebrado contra agentes estranhos ou anormais, por exemplo, células cancerosas, cuja resposta protege o organismo contra esses agentes e doenças causadas pelos mesmos. Uma resposta imune é mediada pela ação de uma ou mais células do sistema imunológico (por exemplo, um linfócito T, linfócito B, célula exterminadora natural (NK), macrófago, eosinófilo, célula de mastócito, célula dendrítica ou neutrófilo) e macromoléculas solúveis produzidas por qualquer uma dessas células ou do fígado (incluindo anticorpos, citocinas e complemento), o que resulta em direcionamento alvejamento seletivo, ligação, dano, destruição e/ou eliminação dos invasores do corpo vertebrado de patógenos, células ou tecidos infectados com patógenos, células cancerosas ou outras células anormais, ou, em casos de autoimunidade ou inflamação patológica, células ou tecidos humanos normais. Uma reação imunológica inclui, por exemplo, ativação ou inibição de uma célula T, por exemplo, uma célula T efetora, uma célula Th, uma célula CD4+, uma célula T CD8+ ou uma célula Treg, ou ativação ou inibição de qualquer outra célula do sistema imunológico, por exemplo, célula NK.

[138] Conforme usado no presente documento, o termo “resposta imune aberrante" se refere à falha de um sistema imunológico do indivíduo para se distinguir de não próprio ou à falha em responder a antígenos estranhos. O termo também abrange resposta hiperimunes a antígeno estranhos como no caso de distúrbios alérgicos. Assim, a resposta está presente tanto em distúrbios autoimunes quanto em distúrbios alérgicos. Respostas imunes aberrantes incluem, mas sem limitação, lesão de tecido e inflamação causadas pela produção de anticorpos para o próprio tecido de um organismo, produção prejudicada de citocinas e dano no tecido causado pode mecanismos de ação citotóxicos ou não citotóxicos. Em algumas modalidades, as respostas imunes aberrantes são respostas imunes inapropriadamente reguladas que levam a sintomas de paciente. Tipicamente, as respostas autoimunes ocorrem quando o sistema imunológico de um indivíduo reconhece autoantígenos como estranhos, levando à produção de células imunes efetoras autorreativas. As células imunes efetoras autorreativas incluem células de uma variedade de linhagens, incluindo, mas sem limitação, células T citotóxicas, células T auxiliares e células B. Embora os mecanismos precisos difiram, a presença de células imunes efetoras autorreativas em um paciente que sofre de um distúrbio autoimune pode levar à destruição de tecidos e células do paciente, resultando em sintomas patológicos. Similarmente, a presença de células que sofrem uma reação hipersensível a antígenos estranhos aos quais indivíduos normais respondem de uma maneira mais restrita é indicativa de hipersensibilidade (alergia). Exemplos incluem, mas sem limitação, alergias alimentares, rinite alérgica e asma alérgica. Inúmeros ensaios para determinar a presença de tais células em um paciente, e, portanto, a presença de um distúrbio autoimune, como distúrbio autoimune específico de antígeno em um paciente, ou um distúrbio alérgico, são conhecidas por aqueles técnicos no assunto e podem ser empregadas prontamente nos métodos em questão.

[139] Conforme usado no presente documento, o termo "doença autoimune" se refere a uma doença ou distúrbio em que o sistema imunológico produz uma resposta imune (por exemplo, resposta de uma célula B ou uma célula T) contra um antígeno que é parte do hospedeiro normal (isto é, um autoantígeno) com lesão consequente em tecidos. Um autoantígeno pode ser derivado de uma célula hospedeira, ou pode ser derivado de um organismo comensal, como os micro-organismos (conhecidos como organismos comensais) que coloniza normalmente superfícies de mucosa.

[140] Doenças autoimunes exemplificativas que afetam mamíferos incluem artrite reumatoide, oligoartrite juvenil, artrite induzida por colágeno, artrite induzida por adjuvante, síndrome de Sjogren,

esclerose múltipla, encefalomielite autoimune experimental, doença inflamatória intestinal (por exemplo, doença de Crohn, colite ulcerativa), vulgar pemphigus, psoríase, vitiligo, diabetes tipo 1, diabetes não obeso, miastenia gravis, doença de Grave, tireoidite de Hashimoto, colangite esclerosante, sialadenite esclerosante, lúpus eritematoso sistêmico, trombocitopenia autoimune púrpura, esclerose sistêmica de Hashimoto, síndrome de Goodpasture, doença de Addison, esclerose sistêmica, anemia hemolítica autoimune, anemia perniciosa e similares.

[141] Conforme usado no presente documento, o termo "doença intestinal inflamatória" (IBD) se refere a um grupo heterogêneo de distúrbios inflamatórios crônicos de trato gastrointestinal. Em algumas modalidades, a IBD inclui doença de Crohn (CD) e colite ulcerativa (UC).

[142] Conforme usado no presente documento, o termo "agente imunossupressor" se refere a uma molécula, como um composto químico, molécula pequena, esteroide, molécula de ácido nucleico ou outro agente biológico que pode diminuir uma resposta imune, como uma reação inflamatória. Agentes imunossupressores incluem, mas sem limitação, um agente de uso no tratamento de artrite (agente antiartrite). Exemplos não limitantes específicos de agentes imunossupressores são agentes anti-inflamatórios não esteroidais, ciclosporina A, FK506 e anti-CD4. Em exemplos adicionais, o agente é um modificador de resposta biológica, como KINERET® (anakinra), ENBREL® (etanercept) ou REMICADE® (infliximabe), um fármaco antirreumático modificador de doença (DMARD), como ARAVA® (leflunomida), um anti-inflamatório não esteroidal (NSAIDs), especificamente um inibidor da Ciclo-Oxigenase-2 (COX-2), como CELEBREX® (celecoxibe) e VIOXX® (rofecoxibe), ou outro produto, como HYALGAN® (hialuronano) e SYNVISC® (hylan G-F20). A rapamicina é um exemplo adicional de um agente imunossupressor.

[143] O termo "inflamação" ou um "processo inflamatório"

conforme usado no presente documento se refere a uma série complexa de eventos, incluindo dilatação de arteríolas, capilares e vênulas, com permeabilidade e fluxo sanguíneo aumentados, exsudação de fluidos, incluindo proteínas plasmáticas e migração de leucócito no foco inflamatório. A inflamação pode ser medida por quaisquer métodos bem conhecidos na técnica, como o número de leucócitos, o número de neutrófilos polimorfonucleares (PMN), uma medida do grau de ativação de PMN, como quimioluminescência intensificada luminal ou uma medida da quantidade de citocinas pró-inflamatórias (por exemplo, IL-6 ou TNF-α) presente.

[144] Um "imunomodulador" ou "imunorregulador" se refere a um agente, por exemplo, um agente que alveja um componente de uma via de sinalização que pode estar envolvida na modulação, regulação ou modificação de uma resposta imune. “Modular", "regular" ou "modificar" uma resposta imune se refere a qualquer alteração em uma célula do sistema imunológico ou na atividade de tal célula (por exemplo, uma célula T efetora, como uma célula Thl). Tal modulação inclui uma estimulação ou supressão do sistema imunológico que pode ser manifestada por um aumento ou diminuição no número de vários tipos de célula, um aumento ou diminuição na atividade dessas células ou quaisquer outras alterações que podem ocorrer no sistema imunológico. Imunomoduladores tanto inibitórios quanto estimulatórios foram identificados, alguns dos quais podem ter função melhorada em um microambiente tumoral. Em algumas modalidades, o imunomodulador alveja uma superfície na superfície de uma célula T. Um "alvo imunomodulatório" ou "alvo imunorregulatório" é uma molécula, por exemplo, uma molécula de superfície celular, que é alvejada para ligação por, e cuja atividade é alterada pela ligação de uma substância, agente, fração, composto químico ou molécula. Os alvos imunomodulatórios incluem, por exemplo, receptores na superfície de uma célula ("receptores imunomodulatórios") e ligantes de receptor ("ligantes imunomodulatórios").

[145] "Imunoterapia" se refere ao tratamento de um indivíduo aflito com ou em risco de contrair ou sofrer uma recorrência de uma doença por um método compreendendo induzir, melhorar, suprimir ou, de outro modo, modificar o sistema imunológico ou uma resposta imune.

[146] Conforme usado no presente documento, o termo "células T patogênicas" se refere a células T (por exemplo, células T CD4 + ou CD8+) que causam os sintomas e/ou dano subjacentes associados a uma doença ou distúrbio, por exemplo, uma doença inflamatória, por exemplo, uma doença intestinal inflamatória. Em algumas modalidades, o termo é intercambiável com "células T efetoras" (T ea), que se referem a células T (por exemplo, células T CD4+ e CD8+) com atividades citolíticas bem como células T auxiliares (Th), por exemplo, células Thl, que pode secretar citocinas inflamatórias (por exemplo, TNF-α, IFN-γ ou IL-17) e também ativar e direcionar outras células imunes (por exemplo, monócitos) para produzir mediadores pró-inflamatórios, e causar, desse modo, os sintomas e/ou dano subjacentes associados à doença ou distúrbio. Em algumas modalidades, as células T efetoras são células Th 17, que se referem a células T CD4+ que produzem a IL-17 de citocina pró-inflamatória. Em algumas modalidades, as células T efetoras são linfócitos T citotóxicos (CTLs), que se referem a células T CD8+ que têm a capacidade para exterminar outras células (por exemplo, através da liberação de perforina ou granzima B).

[147] Conforme usado no presente documento, o termo "células T reguladoras" (Tregs) se refere a uma população de células T com a capacidade para reduzir ou suprimir a indução e proliferação de células T efetoras, e modular, desse modo, uma resposta imune. Em algumas modalidades, Tregs podem suprimir uma resposta imune ao secretar citocinas anti-inflamatórias, como IL-10, TGF-β e IL-35, que pode interferir na ativação e na diferenciação de células T virgens em células T efetoras. Em algumas modalidades, Tregs também podem produzir moléculas citolíticas, como Granzima B, que podem induzir a apoptose de células T efetoras. Em algumas modalidades, as células T reguladoras são células T reguladoras naturais (nTregs) (isto é, desenvolvidas dentro timo). Em algumas modalidades, as células T reguladoras são células T reguladoras induzidas (iTregs) (isto é, células T virgens que se diferenciam em Tregs no tecido periférico após a exposição a certos estímulos). Métodos para identificar Tregs são conhecidos na técnica. Por exemplo, Tregs expressam certos marcadores fenotípicos (por exemplo, CD25, Foxp3 ou CD39) que podem medir usando citometria de fluxo. Consulte, por exemplo, a Publicação Internacional n° WO 2017/062035 Al; Gu J., et al., Cell Mol Immunol 14(6): 521-528 (2017). Em algumas modalidades, as Tregs são células T CD45RA- CD39+.

[148] Conforme usado no presente documento, o termo "ligado" se refere à associação de duas ou mais moléculas. A ligação pode ser covalente ou não covalente. A ligação também pode ser genética (isto é, recombinantemente fusionada). Tais ligações podem ser alcançadas usando uma ampla variedade de técnicas reconhecidas no assunto, como conjugação química e produção de proteína recombinante.

[149] Conforme usado no presente documento, "administrar" se refere à introdução física de uma composição que compreende um agente terapêutico para um indivíduo, usando qualquer um dos vários métodos e sistemas de entrega conhecidos para aqueles técnicos no assunto. Diferentes vias de administração para os anticorpos anti-IL-7R descritos no presente documento incluem vias de administração intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutânea, espinhal ou outras vias de administração parenteral, por exemplo, por injeção ou infusão. A expressão "administração parenteral" conforme usado no presente documento significa modos de administração diferentes de administração enteral e tópica, usualmente, por injeção, e inclui, sem limitação, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intralinfática, intralesional, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, injeção e infusão intradérmica, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnoide, intraespinhal, epidural e intraesternal e infusão, bem como eletroporação in vivo. Alternativamente, um anticorpo descrito no presente documento pode ser administrado através de uma via não parenteral, como uma via de administração tópica, epidérmica ou mucosal, por exemplo, intranasal, oral, vaginal, retal, sublingual ou topicamente. A administração também pode ser realizada, por exemplo, uma vez, uma pluralidade de vezes e/ou ao longo de um ou mais períodos prolongados.

[150] Conforme usado no presente documento, os termos "inibe" e "bloqueia" (por exemplo, referindo-se à inibição/bloqueio de ligação de IL-7 ao IL-7Rɑ em células) são usados de modo intercambiável e abrange inibição/bloqueio tanto parcial quanto completo. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-IL-7R inibe a ligação de IL-7 ao IL-7Rɑ em pelo menos aproximadamente 50%, por exemplo, aproximadamente 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou 100%, determinada, por exemplo, conforme descrito adicionalmente no presente documento. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-IL-7R inibe a ligação de IL-7 ao IL-7Rɑ em não mais de 50%, por exemplo, em aproximadamente 40%, 30%, 20%, 10%, 5% ou 1%, determinada, por exemplo, conforme descrito adicionalmente no presente documento.

[151] Os termos "tratar", "tratando" e "tratamento" conforme usado no presente documento se referem a qualquer tipo de intervenção ou processo realizado em, ou administrando um agente ativo ao indivíduo com o objetivo de reverter, aliviar, melhorar, inibir ou retardar ou prevenir a progressão, desenvolvimento, gravidade ou recorrência de um sintoma, complicação, condição ou índices bioquímicos associados a uma doença ou sobrevida geral melhorada. O tratamento pode ser de um indivíduo que tem uma doença ou um indivíduo que não tem uma doença (por exemplo, para profilaxia).

[152] O termo "dose eficaz" ou "dosagem eficaz" é definido como uma quantidade suficiente para alcançar ou pelo menos alcançar parcialmente um efeito desejado. Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" ou "dosagem terapeuticamente eficaz” de um fármaco ou agente terapêutico é qualquer quantidade do fármaco que, quando usado sozinho ou em combinação com outro agente terapêutico, promove regressão de doença evidenciada por uma diminuição na gravidade de sintomas de doença, um aumento na frequência e duração de períodos sem sintoma de doença ou uma prevenção de deficiência ou incapacidade devido à aflição de doença. Uma quantidade ou dosagem terapeuticamente eficaz de um fármaco inclui uma "quantidade profilaticamente eficaz" ou uma "dosagem profilaticamente eficaz” que é qualquer quantidade do fármaco que, quando usado sozinho ou em combinação com outro agente terapêutico para um indivíduo em risco de desenvolvimento de uma doença ou de sofrimento de uma recorrência de doença, inibe o desenvolvimento ou recorrência da doença. A capacidade de um agente terapêutico para promover a regressão de doença ou inibir o desenvolvimento ou recorrência da doença pode ser avaliada usando uma variedade de métodos conhecidos para o profissional experiente, como em indivíduos humanos durante testes clínicos, em sistemas de modelo animal preditivo de eficácia em seres humanos ou por ensaio da atividade do agente em ensaios in vitro.

[153] O termo "paciente" inclui ser humano e outros indivíduos mamíferos que recebem tratamento terapêutico ou terapêutico.

[154] Conforme usado no presente documento, o termo "indivíduo"

inclui qualquer animal humano ou não humano. Por exemplo, os métodos e composições descritos no presente documento podem ser usados para tratar um indivíduo que tem câncer. O termo "animal não humano" inclui todos os vertebrados, por exemplo, mamíferos ou não mamíferos, como primatas não humanos, ovelha, cão, vaca, galinhas, anfíbios, répteis, etc.

[155] O termo dose ou dosagem "com base em peso" conforme referido no presente documento significa que uma dose que é administrada a um paciente é calculada com base no peso do paciente. Por exemplo, quando um paciente com peso corporal de 60 kg exige 3 mg/kg de um anticorpo anti-IL-7R, pode-se calcular e usar a quantidade apropriada do anticorpo anti-IL-7R (isto é, 180 mg) para administração.

[156] O uso do termo "dose fixa" em relação a um método da revelação significa que dois ou mais diferentes anticorpos em uma única composição (por exemplo, anticorpo anti-IL-7R e um segundo anticorpo, por exemplo, um anticorpo anti-TNFR) estão presentes na composição em razões particulares (fixas) entre si. Em algumas modalidades, a dose fixa tem como base o peso (por exemplo, mg) dos anticorpos. Em certas modalidades, a dose fixa tem como base a concentração (por exemplo, mg/ml) dos anticorpos. Em algumas modalidades, a razão dos dois anticorpos (por exemplo, anti-IL-7R e anti-TNFR) é pelo menos aproximadamente 1:1, aproximadamente 1:2, aproximadamente 1:3, aproximadamente 1:4, aproximadamente 1:5, aproximadamente 1:6, aproximadamente 1:7, aproximadamente 1:8, aproximadamente 1:9, aproximadamente 1:10, aproximadamente 1:15, aproximadamente 1:20, aproximadamente 1:30, aproximadamente 1:40, aproximadamente 1:50, aproximadamente 1:60, aproximadamente 1:70, aproximadamente 1:80, aproximadamente 1:90, aproximadamente 1:100, aproximadamente 1:120, aproximadamente 1:140, aproximadamente 1:160, aproximadamente 1:180,

aproximadamente 1:200, aproximadamente 200:1, aproximadamente 180:1, aproximadamente 160:1, aproximadamente 140:1, aproximadamente 120:1, aproximadamente 100:1, aproximadamente 90:1, aproximadamente 80:1, aproximadamente 70:1, aproximadamente 60:1, aproximadamente 50:1, aproximadamente 40:1, aproximadamente 30:1, aproximadamente 20:1, aproximadamente 15:1, aproximadamente 10:1, aproximadamente 9:1, aproximadamente 8:1, aproximadamente 7:1, aproximadamente 6:1, aproximadamente 5:1, aproximadamente 4:1, aproximadamente 3:1 ou aproximadamente 2:1 mg do primeiro anticorpo (por exemplo, anticorpo anti-IL-7R) para mg de segundo anticorpo. Por exemplo, uma razão de 2:1 de um anticorpo anti-IL-7R e um anticorpo receptor anti-TNF, como atrosab, pode significar que um frasco ou uma injeção pode conter aproximadamente 480 mg do anticorpo anti-IL-7R e 240 mg do anticorpo anti-TNFR ou aproximadamente 2 mg/ml do anticorpo anti-IL-7R e 1 mg/ml do anticorpo anti-TNFR.

[157] O uso do termo "dose fixa" em relação aos métodos e dosagens descritos no presente documento significa uma dose que é administrada a um paciente sem considerar o peso ou área de superfície corporal (BSA) do paciente. A dose fixa não é, portanto, fornecida como uma dose em mg/kg, mas, preferencialmente, como uma quantidade absoluta do agente (por exemplo, o anticorpo anti-IL-7R). Por exemplo, uma pessoa de 60 kg e uma pessoa de 100 kg receberia a mesma dose de um anticorpo (por exemplo, 480 mg de um anticorpo anti-IL-7R).

[158] Conforme usado no presente documento, os termos "ug" e "uM" são usados de modo intercambiável com "µg" e "µM", respectivamente.

[159] Vários aspectos descritos no presente documento são descritos em detalhe adicional nas seguintes subseções. I. ANTICORPOS DE IL-7R ANTI-HUMANOS

[160] São descritos no presente documento anticorpos, por exemplo, anticorpos humanos completos, que são caracterizados por características ou propriedades funcionais particulares. Por exemplo, os anticorpos se ligam especificamente ao IL- 7Rɑ humano, e, mais especificamente, um domínio particular (por exemplo, um domínio funcional) dentro do domínio extracelular de IL-7Rɑ humano. Em algumas modalidades, os anticorpos se ligam especificamente ao sítio em IL- 7Rɑ ao qual IL-7 se liga. Em certas modalidades, os anticorpos são anticorpos antagonistas, isto é, os mesmos inibem ou suprimem expansão mediada por IL-7 e/ou sobrevivência de células T patogênicas (por exemplo, células T efetoras CD8 +). Em certas modalidades, anticorpos anti-IL-7R revelados no presente documento reagem de modo cruzado com IL-7Rɑ de um ou mais primatas não humanos, como IL-7Rɑ de cinomolgo. Em algumas modalidades, os anticorpos se ligam especificamente à região extracelular de IL-7Rɑ humano e a região extracelular de IL-7Rɑ de cinomolgo. Em certas modalidades, os anticorpos se ligam ao IL-7Rɑ humano com alta afinidade.

[161] Anticorpos anti-IL-7R descritos no presente documento exibem uma ou mais das seguintes propriedades funcionais:

[162] (a) tem capacidade para se ligar ao IL-7Rɑ humano solúvel e/ou ligado à membrana;

[163] (b) tem capacidade para se ligar ao IL-7Rɑ de cinomolgo solúvel e/ou ligado à membrana;

[164] (c) tem capacidade para se ligar ao IL-7Rɑ expresso em células T (CD4+CD45RA+, CD4+CD45RA-, CD8+CD45RA+ e/ou CD8+CD45RA-) no sangue total, por exemplo, sangue total humano;

[165] (d) não tem capacidade para se ligar ao IL-7Rɑ expresso em células não T (por exemplo, monócitos) no sangue total, por exemplo, sangue total humano;

[166] (c) não tem capacidade para bloquear de modo eficaz a ativação mediada por linfopoietina estromal tímica (TSLP) de monócitos;

[167] (f) não tem capacidade para antagonizar a sinalização de receptor de IL-7 após a ligação ao IL-7Rɑ, por exemplo, ativação mínima de pSTAT5;

[168] (g) tem capacidade para restaurar uma função de células regulatórias T (Treg) e/ou promover uma sobrevivência de Treg;

[169] (h) tem capacidade para bloquear uma expansão de IL-17 e/ou células produtoras de IFN-gama;

[170] (i) tem capacidade para manter uma remissão livre de fármaco mais longe que por meio de, por exemplo, CTLA4-Ig (ORENCIA®);

[171] (j) tem capacidade para bloquear inflamação e danos à mucosa (por exemplo, induzidos por células T patogênicas) em um tecido intestinal;

[172] (k) tem capacidade para diminuir uma frequência de células T efetoras, por exemplo, nos nodos linfáticos mesentéricos (MLN) e/ou lâmina própria (LP);

[173] (l) tem capacidade para tratar um indivíduo com uma doença inflamatória, por exemplo, doença intestinal inflamatória;

[174] (m) tem capacidade para se ligar ao IL-7Rɑ humano em um epítopo selecionado do grupo que consiste em: 24SQLEVNGSQHSLTCAF39 (SEQ ID NO: 8), 73FIETKKFLLIGKSNIC88 (SEQ ID NO: 9), 89VKVGEKSLTCKKIDLTT105 (SEQ ID NO: 10), 136QKKYVKVLMHDVAY149 (SEQ ID NO: 11), 181YEIKVRSIPDHYFKGF196 (SEQ ID NO: 12) e combinações dos mesmos, por exemplo, conforme determinado por espectrometria de hidrogênio/deutério (HDX-MS); /ou

[175] (n) tem capacidade para se ligar ao IL-7Rɑ humano em um ou mais resíduos de aminoácido selecionados do grupo que consiste em H33, E75, F79, I82, K84, M144, R186, H191, Y192 e combinações dos mesmos, por exemplo, conforme determinado por abordagens de área de contato de proteína com base em espectrometria, como oxidação fotoquímica de proteína (FPOP) e marcação de éster de glicina etílico (GEE).

[176] Em algumas modalidades, anticorpos anti-IL-7R descritos no presente documento se ligam ao IL-7Rɑ humano com alta afinidade, por exemplo, com uma KD de 10-7 M ou menos, 10-’8 M ou menos, 10-9 M ou menos, 10-10 M ou menos, 10-11 M ou menos, 10-12 M ou menos, 10-12M a 10-7M, 10-11M a 10’ -7M, 10-10M a 10-7M ou 10-9M a 10-7 M. Em certas modalidades, um anticorpo anti-IL-7R se liga ao IL-7Rɑ humano solúvel, por exemplo, conforme determinado por BIACORE™, com uma K D de 10-7 M ou menos, 10-8 M ou menos, 10-9 M (1 nM) ou menos, 10-10 M ou menos, 10-12M a 10-7M, 10-11M a 10-7M, 10-10M a 10-7M, 10-9M a 10-7M ou 10-8M a 10-7M. Em certas modalidades, um anticorpo anti-IL-7R se liga ao IL-7Rɑ humano de ligação (por exemplo, ligação de membrana), como em células T humanas, mas não em células não T humanas, por exemplo, conforme determinado por citometria de fluxo e plotagem Scatchard, com uma KD de 10-7 M ou menos, 10-8 M ou menos, 10-9 M (1 nM) ou menos, 5x10-10 M ou menos, 10-10 M ou menos, 10-12M a 10- 7 M, 10-11M a 10-8M, 10-10M a 10-8M, 10-9M a 10-8M, 10-11M a 10-9 M ou 10-10 M a 10-9 M. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-IL-7R revelado no presente documento se liga ao IL-7Rɑ humano de ligação (por exemplo, ligação de membrana celular), com em células T humanas, mas em células não T humanas, por exemplo, conforme determinado por citometria de fluxo com uma EC 50 de 10 ug/ml ou menos, 5 ug/ml ou menos, 1 ug/ml ou menos, 0,9 ug/ml ou menos, 0,8 ug/ml ou menos, 0,7 ug/ml ou menos, 0,6 ug/ml ou menos, 0,5 ug/ml ou menos, 0,4 ug/ml ou menos, 0,3 ug/ml ou menos, 0,2 ug/ml ou menos,

0,1 ug/ml ou menos, 0,05 ug/ml ou menos ou 0,01 ug/ml ou menos. Em algumas modalidades, anticorpos anti-IL-7R descritos no presente documento se ligam ao IL-7Rɑ de cinomolgo, por exemplo, com uma K D de 10-7 M ou menos, 10-8 M ou menos, 10-9 M ou menos, 10-10 M ou menos, 10-11 M ou menos, 10-12 M ou menos, 10-12 M a 10-7 M, 10-11 M a 10-7 M, 10-10 M a 10-7 M ou 10-9 M a 10-7 M. Em certas modalidades, um anticorpo anti-IL-7R se liga ao IL-7Rɑ de cinomolgo solúvel, por exemplo, conforme determinado por BIACORE™, com uma K D de 10-7 M ou menos, 10-8 M ou menos, 10-9 M (1 nM) ou menos, 10-10 M ou menos, 10-12 M a 10-7 M, 10-11 M a 10-7 M, 10-10 M a 10-7 M, 10-9 M a 10- 7 M ou 10-8 M a 10-7 M. Anticorpos anti-IL-7R da presente revelação podem se ligar ao IL-7Rɑ de cinomolgo de ligação (por exemplo, ligação de membrana), como em células T de cinomolgo, mas em células não T de cinomolgo, por exemplo, com uma EC50 de 100 nM ou menos, 10 nM ou menos, 100 nM a 0,01 nM, 100 nM a 0,1 nM, 100 nM a 1 nM ou 10 nM a 1 nM, por exemplo, conforme medido por citometria de fluxo. Em certas modalidades, um anticorpo anti-IL-7R se liga ao IL-7Rɑ de cinomolgo de ligação (por exemplo, ligação de membrana celular), como em células T de ligação, mas não em células não T de cinomolgo, por exemplo, conforme determinado por citometria de fluxo e plotagem Scatchard, com uma KD de 10-7 M ou menos, 10-8 M ou menos, 10-9 M (1 nM) ou menos, 5x10-10 M ou menos, 10-10 M ou menos, 10-12M a 10- 7 M, 10-11M a 10-8M, 10-10M a 10-8M, 10-9M a 10-8M, 10-’11 M a 10-’9M ou 10-’10M a 10-9M.

[177] Ensaios padrão para avaliar a capacidade de ligação dos anticorpos para o IL-7Rɑ de várias espécies são conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo, ELISAs, Western blots e RIAs. Ensaios adequados também são descritos nos Exemplos. A cinética de ligação (por exemplo, afinidade de ligação) dos anticorpos também pode ser avaliada por ensaios padrão conhecidos na técnica, como análise

Biacore. Ensaios para avaliar os efeitos dos anticorpos sobre propriedades funcionais de células imunes (por exemplo, ligação de ligante, ativação/fosforilação de STAT5, produção de citocina) são descritos em mais detalhe infra e nos Exemplos.

[178] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-IL-7R revelados no presente documento são seletivos para IL-7Rɑ expresso em células T (por exemplo, CD4 +CD45RA+, CD4+CD45RA, CD8+CD45RA+, CD8+CD45RA), mas não em células não T (por exemplo, monócitos). Consequentemente, em algumas modalidades, os anticorpos anti-IL-7R podem bloquear de modo eficaz a ligação de IL-7 ao IL-7Rɑ em células T, mas não bloqueia a ligação de TSLP ao IL- 7Rɑ expressa em células não T (por exemplo, monócitos). Em algumas modalidades, os anticorpos anti-IL-7R podem inibir ou reduzir fosforilação mediada por IL-7 de STAT5 ("ativação de pSTAT5") em células T. Em algumas modalidades, a ativação de pSTAT5 é inibida ou reduzida em pelo menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% em comparação a uma referência (por exemplo, células T correspondentes que não são tratadas com os anticorpos anti- IL-7R revelados no presente documento). Em algumas modalidades, os anticorpos anti-IL-7R revelados no presente documento não reduzem ou previnem ativação mediada por TSLP de monócitos.

[179] Em algumas modalidades, anticorpos anti-IL-7R descritos no presente documento têm capacidade para modular (por exemplo, aumentar) a razão de células T reguladoras para células T efetoras em um indivíduo em necessidade dos mesmos. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-IL-7R modulam a razão ao restaurar uma função e/ou promover a sobrevivência de Tregs (por exemplo, células T CD45RA- CD39+) no indivíduo. Em certas modalidades, os anticorpos anti- IL-7R da presente revelação aumentam uma função Treg (por exemplo, capacidade para suprimir proliferação de célula T e/ou produção de IL-

10) em pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 100% em comparação a uma referência (por exemplo, uma Treg correspondente em um indivíduo que não recebeu o anticorpo anti-IL-7R). Em algumas modalidades, a frequência de Tregs no indivíduo é aumentada em pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 100% em comparação a uma referência (por exemplo, uma Treg correspondente em um indivíduo que não recebeu o anticorpo anti-IL-7R).

[180] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-IL-7R revelados no presente documento modulam a razão de células T reguladoras para células T efetoras ao bloquear uma expansão de células T efetoras (por exemplo, IL-17 e/ou células T produtoras de IFN- γ) no indivíduo. Em certas modalidades, a frequência de células T efetoras no indivíduo é diminuída em pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 100% em comparação a uma referência (por exemplo, um Treg correspondente em um indivíduo que não recebeu o anticorpo anti-IL-7R). Em certas modalidades, os anticorpos anti-IL-7R da presente revelação modulam a razão tanto ao restaurar uma função e/ou promover a sobrevivência de Tregs quanto ao bloquear a expansão de células T efetoras no indivíduo.

[181] Em algumas modalidades, a razão de células T reguladoras para células T efetoras é aumentada em pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 100% em comparação a uma referência (por exemplo, a razão correspondente em um indivíduo que não recebeu o anticorpo anti-IL-7R).

[182] Em algumas modalidades, anticorpos anti-IL-7R descritos no presente documento se ligam a um epítopo, por exemplo, um epítopo conformacional, na porção extracelular de IL-7Rɑ humano, por exemplo, no domínio semelhante à Ig da região extracelular, isto é, aminoácidos 21 a 239 de SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, um anticorpo anti- IL-7R se liga a, a um epítopo dentro, uma região que consiste em resíduos de aminoácido 44 a 59 de SEQ ID NO: 1 (isto é, resíduos 24 a 39 de SEQ ID NO: 6 (SQLEVNGSQHSLTCAF, "Epítopo 1"; SEQ ID NO: 8). Em algumas modalidades, um anticorpo anti-IL-7R se liga a, ou a um epítopo dentro, uma região que consiste em resíduos de aminoácido 93 a 108 de SEQ ID NO: 1 (isto é, resíduos 73 a 88 de SEQ ID NO: 6) (FIETKKFLLIGKSNIC, "Epítopo 2"; SEQ ID NO: 9). Em outras modalidades, um anticorpo anti-IL-7R se liga a, ou a um epítopo dentro, uma região que consiste em resíduos de aminoácido 109 a 125 de SEQ ID NO: 1 (isto é, resíduos 89 a 105 de SEQ ID NO: 6) (VKVGEKSLTCKKIDLTT, "Epítopo 3"; SEQ ID NO: 10). Em algumas modalidades, um anticorpo anti-IL-7R se liga a, ou a um epítopo dentro, uma região que consiste em resíduos de aminoácido 156 a 169 de SEQ ID NO: 1 (isto é, resíduos 136 a 149 de SEQ ID NO: 6) (QKKYVKVLMHDVAY, "Epítopo 4"; SEQ ID NO: 11). Em outras modalidades, um anticorpo anti-IL-7R se liga a, ou a um epítopo dentro, uma região que consiste em resíduos de aminoácido 201 a 216 de SEQ ID NO: 1 (isto é, resíduos 181 a 196 de SEQ ID NO: 6) (YEIKVRSIPDHYFKGF, "Epítopo 5"; SEQ ID NO: 12).

[183] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-IL-7R da presente revelação se liga a um epítopo (ou região de IL-7Rɑ humano) compreendendo um ou mais resíduos de aminoácido H53, E95, F99, I102, K104, M164, R206, H211 e Y212 de SEQ ID NO: 1 (isto é, H33,

E75, F79, I82, K84, M144, R186, H191 e Y192 de SEQ ID NO: 6). Em algumas modalidades, um anticorpo anti-IL-7R revelado no presente documento não se liga significativamente ou apenas com afinidade de ligação significativamente reduzida a um IL- 7Rɑ humano em que um ou mais resíduos de aminoácido H53, E95, F99, I102, K104, M164, R206, H211 e Y212 de SEQ ID NO: 1 são alterados ´para outro aminoácido, por exemplo, em uma substituição de aminoácido não conservativa.

[184] Em algumas modalidades, anticorpos anti-IL-7R revelados no presente documento não são anticorpos nativos ou não são anticorpos de ocorrência natural. Por exemplo, em certas modalidades, os anticorpos anti-IL-7R têm modificações pós-tradução que são diferentes daquelas de anticorpos que são de ocorrência natural, como ao ter mais, menos ou um tipo diferente de modificação de pós- tradução.

[185] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-IL-7R não têm atividade antagonista conforme determinado, por exemplo, ao medir ativação de pSTAT após cultivar células T com o anticorpo anti-IL-7R, em que tais anticorpos não melhoram atividade além do anticorpo anti- IL-7R sozinho. Em certas modalidades, anticorpos anti-IL-7R bloqueiam a interação de IL-7Rɑ com IL-7 sem promover atividade agonista.

[186] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-IL-7R da presente revelação não têm capacidade para bloquear ativação mediada por linfopoietina estromal tímica (TSLP) de monócitos.

[187] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-IL-7R têm capacidade para manter uma remissão livre de fármaco mais longe que por meio de, por exemplo, CTLA4-Ig (ORENCIA®).

[188] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-IL-7R têm capacidade para bloquear inflamação e danos à mucosa (por exemplo, induzidos por células T patogênicas) em um tecido intestinal. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-IL-7R têm capacidade para diminuir uma frequência de células T efetoras, por exemplo, nos nodos linfáticos mesentéricos (MLN) e/ou lâmina própria (LP). Em algumas modalidades, os anticorpos anti-IL-7R têm capacidade para tratar um indivíduo com uma doença inflamatória, por exemplo, doença intestinal inflamatória.

[189] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-IL-7R da presente revelação compreende uma CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada e uma CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve, em que a CDR3 de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 15. Em algumas modalidades, a CDR1 de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 13. Em algumas modalidades, a CDR2 de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 14. Em certas modalidades, a CDR1 de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 16. Em outras modalidades, a CDR2 de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 17. Em algumas modalidades, a CDR3 de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 18.

[190] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-IL-7R compreende uma CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada e uma CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve, em que a CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada compreende as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 apresentadas como SEQ ID NOs: 13, 14 e 15, respectivamente, em que as CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve compreende as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 apresentadas como SEQ ID NOs: 16, 17 e 18, respectivamente, e em que o anticorpo anti-IL-7R tem uma ou mais propriedades reveladas no presente documento.

[191] Em alguns aspectos, um anticorpo anti-IL-7R da presente revelação compreende uma cadeia pesada CDR1, CDR2 e CDR3 e uma CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve, em que a CDR3 de cadeia pesada compreende uma ou mais modificações de aminoácido (por exemplo, uma, duas, três ou quatro substituições, por exemplo, como aquelas mostradas na Figura 18B como tendo uma razão de enriquecimento de ≥ 1,00) relativa à SEQ ID NO: 15. Em alguns aspectos, a CDR1 de cadeia pesada compreende uma ou mais modificações de aminoácido (por exemplo, uma, duas ou três substituições, por exemplo, como aquelas mostradas na Figura 18E como tendo uma razão de enriquecimento de ≥ 1,00) relativa à SEQ ID NO: 13. Em certos aspectos, a CDR2 de cadeia pesada compreende uma ou mais modificações de aminoácido (por exemplo, uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito ou nove substituições, por exemplo, como aquelas mostradas na Figura 18F como tendo uma razão de enriquecimento de ≥ 1,00) relativa à SEQ ID NO: 14. Em aspectos adicionais, a CDR1 de cadeia leve compreende uma ou mais modificações de aminoácido (por exemplo, uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito ou nove substituições, por exemplo, como aquelas mostradas na Figura 18C como tendo uma razão de enriquecimento de ≥ 1,00) relativa à SEQ ID NO: 16. Em alguns aspectos, a CDR2 de cadeia leve compreende uma ou mais modificações de aminoácido (por exemplo, uma, duas, três, quatro, cinco ou seis substituições, por exemplo, como aquelas mostradas na Figura 18D como tendo uma razão de enriquecimento de ≥ 1,00) relativa à SEQ ID NO: 17. Em certos aspectos, a CDR3 de cadeia leve compreende uma ou mais modificações de aminoácido (por exemplo, uma, duas, três, quatro, cinco, seis ou sete substituições, por exemplo, como aquelas mostradas na Figura 18A como tendo uma razão de enriquecimento de ≥ 1,00) relativa à SEQ ID NO: 18.

[192] Em alguns aspectos, a CDR1 de cadeia pesada de um anticorpo anti-IL-7R revelado no presente documento compreende a sequência de aminoácidos GX1X2FDDHAX3H (SEQ ID NO: 260), em que X1 é F ou Y; X2 é T, P, A, S, V, L, I, M, H, F, Y, N, D, E ou Q; e X3 é L ou M. Em certos aspectos, X2 é D ou E. Em aspectos adicionais, X2 é D. Em outros aspectos, X2 é E. Exemplos não limitantes de sequências de CDR1 de cadeia pesada de um anticorpo IL-7R revelado no presente documento são fornecidos na Tabela 13.

[193] Em alguns aspectos, a CDR2 de cadeia pesada de um anticorpo anti-IL-7R revelado no presente documento compreende a sequência de aminoácidos GIX1WX2SRGX3GYX4X5X6X7X8X9 (SEQ ID NO: 261), em que X1 é S ou T; X2 é H ou N; X3 é I ou V; X4 é G, A, S, T, V, L, I, R, H ou N; X5 é P, T, N, D, E, Q, S, H ou Y; X6 é P, G, A, S, T, V, R, H, F. Y, N, D ou E; X7 é V ou I; X8 é A, S, T, V, L, I, M, K, R, H, F, Y, N, D, E ou Q; e X9 é G, H, D ou Q. Em certos aspectos, X1 é T. Exemplos não limitantes de sequências de CDR2 de cadeia pesada de um anticorpo IL-7R revelado no presente documento são fornecidos na Tabela 14.

[194] Em alguns aspectos, a CDR3 de cadeia pesada de um anticorpo anti-IL-7R revelado no presente documento compreende a sequência de aminoácidos DEYX1X2GYYX3LDX4 (SEQ ID NO: 262), em que X1 é S, T, N, D ou E; X2 é L, M, R ou S; X3 é G, A, S, T, V, M, N, E ou Q; e X4 é A, S, T, V, R, H, Y, W, N, E, Q ou M. Em certos aspectos, X3 é A, S ou T. Em alguns aspectos, X3 é A. Em outros aspectos, X3 é S. Em aspectos adicionais, X3 é T. Em alguns aspectos, X4 é E. Exemplos não limitantes sequências de CDR3 de cadeia pesada de um anticorpo IL-7R revelado no presente documento são fornecidos na Tabela 15.

[195] Em alguns aspectos, a CDR1 de cadeia leve de um anticorpo anti-IL-7R da presente revelação compreende a sequência de aminoácidos X1X2X3X4X5X6X7SX8X9A (SEQ ID NO: 263), em que X1 é

S, T, V, K. R, H, Y ou I; X2 é A, S, T ou V: X3 é P. G, A, S, T, V, L, I, M, K, R, H, N, E ou Q; X4 é P. G, A, S, T, V, L. I, M, H, F, Y, N, D, E ou Q; X5 é P. G, A, S, T, H, E, Q, M, N ou D; X6 é P, G, A. S, T, V, L, I ou N; X7 é S, T, V, L, I, M, H, F, Y, N, D, E ou Q; X8 é P ou A; e X9 é A, L ou V. Em certos aspectos, X6 é P. Em alguns aspectos, X8 é P. Em aspectos adicionais, X7 é D ou E. Em certos aspectos, X7 é D. Em alguns aspectos, X7 é E. Exemplos não limitantes de sequências de CDR1 de cadeia leve de um anticorpo IL-7R revelado no presente documento são fornecidos na Tabela 16.

[196] Em alguns aspectos, a CDR2 de cadeia leve de um anticorpo anti-IL-7R revelado no presente documento compreende a sequência de aminoácidos DX1X2X3X4X5X6 (SEQ ID NO: 264), em que X1 é G, A, S, M, H, N, D, E ou Q; X2 é G, A, S, T, V, M, H, F, Y, N, D, E ou Q; X3 é A, S, F, Y, W, N, D, E ou L; X4 é P, S, T, L, K, H ou N; X5 é D, E ou Q; e X6 é G, S, T, N, D, Q, P ou E. Exemplos não limitantes de sequências de CDR2 de cadeia leve de um anticorpo IL-7R revelado no presente documento são fornecidos na Tabela 17.

[197] Em alguns aspectos, a CDR3 de cadeia leve de um anticorpo anti-IL-7R revelado no presente documento compreende a sequência de aminoácidos X1X2FX3X4YPLX5X6X7 (SEQ ID NO: 265), em que X1 é M ou Q; X2 é G, A, D, E ou Q; X3 é N ou E; X4 é P, A ou S; X5 é T, I, M, K, W, N, E ou Q; X6, é L ou I; e X7 é T, M, K, H, Y, E ou Q. Em certos aspectos, X2 é A. Em alguns aspectos, X4 é P ou A. Em certos aspectos, X4 é P. Em outros aspectos, X4 é A. Exemplos não limitantes de sequências de CDR3 de cadeia leve de um anticorpo IL-7R revelado no presente documento são fornecidos na Tabela 18.

[198] Em alguns aspectos, um anticorpo anti-IL-7R revelado no presente documento compreende uma CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada e uma CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve, em que:

[199] (i) a CDR1 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NOs: 31 a 46;

[200] (ii) a CDR2 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 14;

[201] (iii) a CDR3 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 15;

[202] (iv) a CDR1 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 16;

[203] (v) a CDR2 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 17; e

[204] (vi) a CDR3 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 18.

[205] Em alguns aspectos, um anticorpo anti-IL-7R revelado no presente documento compreende uma CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada e uma CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve, em que:

[206] (i) a CDR1 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 13;

[207] (ii) a CDR2 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NOs: 47 a 96

[208] (iii) a CDR3 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 15;

[209] (iv) a CDR1 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 16;

[210] (v) a CDR2 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 17; e

[211] (vi) a CDR3 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 18.

[212] Em alguns aspectos, um anticorpo anti-IL-7R revelado no presente documento compreende uma CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada e uma CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve em que:

[213] (i) a CDR1 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 13;

[214] (ii) a CDR2 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 14;

[215] (iii) a CDR3 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NOs: 97 a 122:

[216] (iv) a CDR1 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 16;

[217] (v) a CDR2 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 17; e

[218] (vi) a CDR3 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 18.

[219] Em alguns aspectos, um anticorpo anti-IL-7R revelado no presente documento compreende uma CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada

[220] e uma CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve, em que:

[221] (i) a CDR1 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 13;

[222] (ii) a CDR2 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 14;

[223] (iii) a CDR3 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 15;

[224] (iv) a CDR1 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NOs: 123 a 194;

[225] (v) a CDR2 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 17; e

[226] (vi) a CDR3 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 18.

[227] Em alguns aspectos, um anticorpo anti-IL-7R revelado no presente documento compreende uma CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada e uma CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve, em que:

[228] (i) a CDR1 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 13;

[229] (ii) a CDR2 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 14;

[230] (iii) a CDR3 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 15;

[231] (iv) a CDR1 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 16;

[232] (v) a CDR2 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NOs: 195 a 237; e

[233] (vi) a CDR3 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 18.

[234] Em alguns aspectos, um anticorpo anti-IL-7R revelado no presente documento compreende uma CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada e uma CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve, em que:

[235] (i) a CDR1 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 13;

[236] (ii) a CDR2 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 14;

[237] (iii) a CDR3 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 15;

[238] (iv) a CDR1 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 16;

[239] (v) a CDR2 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 17; e

[240] (vi) a CDR3 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NOs: 238 e 259.

[241] Em alguns aspectos, um anticorpo anti-IL-7R revelado no presente documento compreende uma CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada e uma CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve, em que:

[242] (i) a CDR1 de cadeia pesada compreende qualquer uma das sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOs: 13 e 31 a 46;

[243] (ii) a CDR2 de cadeia pesada compreende qualquer uma das sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOs: 14 e 47 a 96;

[244] (iii) a CDR3 de cadeia pesada compreende qualquer uma das sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOs: 15 e 97 a 122;

[245] (iv) a CDR1 de cadeia leve compreende qualquer uma das sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOs: 16 e 123 a 194;

[246] (v) a CDR2 de cadeia leve compreende qualquer uma das sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOs: 17 e 195 a 237; e/ou

[247] (vi) a CDR3 de cadeia leve compreende qualquer uma das sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOs: 18 e 238 a 259.

[248] Em alguns aspectos, a CDR1 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 43 ou SEQ ID NO: 44. Em alguns aspectos, a CDR2 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 47. Em alguns aspectos, a CDR3 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107 ou SEQ ID NO: 120. Em alguns aspectos, a CDR1 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 190 ou SEQ ID NO: 192. Em alguns aspectos, a CDR3 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 240, SEQ ID NO: 244 ou SEQ ID NO: 245.

[249] Em alguns aspectos, um anticorpo IL-7R revelado no presente documento compreende uma CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada e uma CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve, em que:

[250] (i) a CDR1 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 43 ou SEQ ID NO: 44;

[251] (ii) a CDR2 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 14;

[252] (iii) a CDR3 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 15;

[253] (iv) a CDR1 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 16;

[254] (v) a CDR2 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 17; e

[255] (vi) a CDR3 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 18.

[256] Em alguns aspectos, um anticorpo IL-7R revelado no presente documento compreende uma CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada e uma CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve, em que:

[257] (i) a CDR1 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 13;

[258] (ii) a CDR2 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 47;

[259] (iii) a CDR3 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 15;

[260] (iv) a CDR1 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 16;

[261] (v) a CDR2 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 17; e

[262] (vi) a CDR3 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 18.

[263] Em alguns aspectos, um anticorpo IL-7R revelado no presente documento compreende uma CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada e uma CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve, em que:

[264] (i) a CDR1 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 13;

[265] (ii) a CDR2 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 14;

[266] (iii) CDR3 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107 ou SEQ ID NO: 120;

[267] (iv) a CDR1 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 16;

[268] (v) a CDR2 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 17; e

[269] (vi) a CDR3 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 18.

[270] Em alguns aspectos, um anticorpo IL-7R revelado no presente documento compreende uma CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada e uma CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve, em que:

[271] (i) a CDR1 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 13;

[272] (ii) a CDR2 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 14;

[273] (iii) a CDR3 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 15;

[274] (iv) a CDR1 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 190 ou SEQ ID NO: 192;

[275] (v) a CDR2 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 17; e

[276] (vi) a CDR3 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 18.

[277] Em alguns aspectos, um anticorpo IL-7R revelado no presente documento compreende uma CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada e uma CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve, em que:

[278] (i) a CDR1 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 13;

[279] (ii) a CDR2 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 14;

[280] (iii) a CDR3 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 15;

[281] (iv) a CDR1 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 16;

[282] (v) a CDR2 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 17; e

[283] (vi) a CDR3 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 240, SEQ ID NO: 244 ou SEQ ID NO: 245.

[284] Em alguns aspectos, um anticorpo IL-7R revelado no presente documento compreende uma CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada e uma CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve, em que uma das CDRs de cadeia pesada ou cadeia leve compreende uma modificação de aminoácido revelada no presente documento e outras CDRs de cadeia pesada ou cadeia leve não são modificadas em relação às CDRs correspondentes do anticorpo 18B1 (também referido como “Anticorpo A” no presente documento) revelado no presente documento. Em alguns aspectos, duas das CDRs de cadeia pesada ou cadeia leve compreendem uma modificação de aminoácido revelada no presente documento e as outras CDRs de cadeia pesada ou cadeia leve não são modificadas em relação às CDRs correspondentes do anticorpo 18B1. Em aspectos adicionais, três das CDRs de cadeia pesada ou cadeia leve compreendem uma modificação de aminoácido revelada no presente documento e as outras CDRs de cadeia pesada ou cadeia leve não são modificadas em relação às CDRs correspondentes do anticorpo 18B1. Em certos aspectos, quatro das CDRs de cadeia pesada ou cadeia leve compreendem uma modificação de aminoácido revelada no presente documento e as outras CDRs de cadeia pesada ou cadeia leve não são modificadas em relação às CDRs correspondentes do anticorpo 18B1. Em aspectos adicionais, cinco das CDRs de cadeia pesada ou cadeia leve compreendem uma modificação de aminoácido revelada no presente documento e as outras CDRs de cadeia pesada ou cadeia leve não são modificadas em relação às CDRs correspondentes do anticorpo 18B1. Em alguns aspectos, todas as seis CDRs de cadeia pesada e cadeia leve compreendem uma modificação de aminoácido revelada no presente documento em relação às CDRs correspondentes do anticorpo 18B1. Conforme descrito no presente documento, o anticorpo 18B1 compreende CDR1 de cadeia pesada apresentada na SEQ ID NO: 13, CDR2 de cadeia pesada apresentada na SEQ ID NO: 14, CDR3 de cadeia pesada apresentada na SEQ ID NO: 15, CDR1 de cadeia leve apresentada na SEQ ID NO: 16, CDR2 de cadeia leve apresentada na SEQ ID NO: 17 e CDR3 de cadeia leve apresentada na SEQ ID NO: 18.

[285] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-IL-7R revelado no presente documento compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) e uma região variável de cadeia leve (VL), em que a VH compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos aproximadamente 80%, pelo menos aproximadamente 85%, pelo menos aproximadamente 90%, pelo menos aproximadamente 95%, pelo menos aproximadamente 96%, pelo menos aproximadamente 97%, pelo menos aproximadamente 98%, pelo menos aproximadamente 99% ou aproximadamente 100% idêntica à sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 19, em que a VL compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos aproximadamente 80%, pelo menos aproximadamente 85%, pelo menos aproximadamente 90%, pelo menos aproximadamente 95%, pelo menos aproximadamente 96%, pelo menos aproximadamente 97%, pelo menos aproximadamente 98%, pelo menos aproximadamente 99% ou aproximadamente 100% idêntica à sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 20, e em que o anticorpo anti-IL-7R tem uma ou mais propriedades reveladas no presente documento.

[286] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-IL-7R compreende uma VH e uma VL, em que a VH compreende as CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 19, em que a VL compreende as CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve de SEQ ID NO: 20, e em que o anticorpo anti-IL-7R tem uma ou mais propriedades reveladas no presente documento.

[287] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-IL-7R da presente revelação compete de modo cruzado para se ligar a um IL-7Rɑ humano com anticorpo anti-IL-7R de referência, que compreende uma VH e uma VL, em que a VH compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 19 e em que a VL compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 20. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-IL-7R revelado no presente documento se liga ao mesmo epítopo em IL-7Rɑ humano como um anticorpo anti- IL-7R de referência, que compreende uma VH e uma VL, em que a VH compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 19 e em que a VL compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 20. Em algumas modalidades, tanto o anticorpo anti-IL-7R quanto o anticorpo de referência se ligam a um epítopo selecionado do grupo que consiste em SQLEVNGSQHSLTCAF (SEQ ID NO: 8), FIETKKFLLIGKSNIC (SEQ ID NO: 9), VKVGEKSLTCKKIDLTT (SEQ ID NO: 10), QKKYVKVLMHDVAY (SEQ

ID NO: 11), YEIKVRSIPDHYFKGF (SEQ ID NO: 12). Em algumas modalidades, tanto o anticorpo anti-IL-7R quanto o anticorpo de referência se ligam a um epítopo que compreende um ou mais resíduos de aminoácido H53, E95, F99, I102, K104, M164, R206, H211 e Y212 de SEQ ID NO: 1 (isto é, H33, E75, F79, I82, K84, M144, R186, H191 e Y192 de SEQIDNO: 6).

[288] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-IL-7R revelado no presente documento inibe a ligação de um anticorpo anti-IL-7R de referência ao IL-7Rɑ humano em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou em 100%. Os anticorpos concorrentes ao mesmo epítopo, a um epítopo sobreposto ou a epítopos adjacentes (por exemplo, conforme evidenciado por impedimento estérico). Se dois anticorpos competem entre si para se ligar a um alvo pode ser determinado usando experimentos de competição conhecidos na técnica, como RIA e ElA.

[289] Um domínio de VH ou uma ou mais CDRs do mesmo descrito no presente documento pode ser ligado a um domínio constante para formar uma cadeia pesada, por exemplo, uma cadeia pesada de comprimento total. Similarmente, um domínio de VL ou uma ou mais CDRs do mesmo descrito no presente documento pode ser ligado a um domínio constante para formar uma cadeia leve, por exemplo, uma cadeia leve de comprimento total. Uma cadeia pesada de comprimento total (com a exceção da lisina de terminal C (K) ou com a exceção da glicina e lisina (GK) de terminal C que pode estar ausente) e uma cadeia leve de comprimento total para formar um anticorpo de comprimento total.

[290] Em algumas modalidades, um domínio de VH descrito no presente documento pode ser fusionado ao domínio constante de uma IgG humana, por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4, que é de ocorrência natural ou modificada, por exemplo, conforme descrito adicionalmente no presente documento. Por exemplo, um domínio de VH pode compreender a sequência de aminoácidos de qualquer domínio de VH descrito no presente documento fusionado em uma IgG humana, por exemplo, uma região constante de IgG1, como a seguinte sequência de aminoácidos de domínio constante de IgG1 humana do tipo selvagem:

[291] ou aquela de uma variante alotípico de SEQ ID NO: 23 e tem as seguintes sequências de aminoácidos:

[292] (SEQ ID NO: 24; resíduos de aminoácido específicos de alótipo estão em negrito e sublinhado).

[293] Em algumas modalidades, um domínio de VH de um anticorpo anti-IL-7R pode compreender a sequência de aminoácidos de qualquer domínio de VH descrita no presente documento fusionada em uma região constante sem função efetora, por exemplo, as seguintes sequências de aminoácidos de domínio constante de IgG1 humana sem função efetora:

[294] (SEQ ID NO: 25; "IgG1.1f," compreendendo substituições

L234A, L235E, G237A, A330S e P331S, que são sublinhadas).

[295] ou

[296] (SEQ ID NO: 26; "IgG1.3f," compreendendo substituições L234A, L235E e G237A, que são sublinhadas).

[297] Por exemplo, uma variante alotípica de IgG1 compreende uma K97R, D239E e/ou L241M (sublinhada e em negrito acima) e numeração de acordo com àquela nas SEQ ID NOs: 24-26. Dentro da região pesada de comprimento total e de acordo com a numeração de EU, essas substituições de aminoácido são enumeradas K214R, D356E e L358M. Em algumas modalidades, a região constante de um anticorpo anti-IL-7R pode compreender adicionalmente uma ou mais mutações ou substituições em aminoácidos L1 17, A1 18, G120, A213 e P214 (sublinhados acima) conforme enumerado nas SEQ ID NOs: 24-26 ou L234, A235, G237, A330 e P331, por numeração EU. Em modalidades adicionais, a região constante de um anticorpo anti-IL-7R compreende uma ou mais mutações ou substituições em aminoácidos L1 17A, A1 18E, G120A, A213S, e P214S de SEQ ID NO: 23 ou L234A, L235E, G237A, A330S e P331S por numeração EU. A região constante de um anticorpo anti-IL-7R também pode compreender uma ou mais mutações ou substituições L1 17A, A1 18E e G120A de SEQ ID NO: 23 ou L234A, L235E e G237A por numeração EU.

[298] Um domínio de VL descrito no presente documento pode ser fusionado no domínio constante de uma cadeia leve Kappa ou Lambda humana. Por exemplo, um domínio de VL de um anticorpo anti-IL-7R pode compreender a sequência de aminoácidos de qualquer domínio de VL descrito no presente documento fusionado na seguinte sequência de aminoácidos de cadeia leve kappa de IgG1 humana:

[299] Em certas modalidades, a região constante de cadeia pesada compreende uma lisina ou outro aminoácido no terminal C, por exemplo, compreende os seguintes últimos aminoácidos: LSPGK (SEQ ID NO: 28) na cadeia pesada. Em certas modalidades, a região constante de cadeia pesada não tem um ou mais aminoácidos no terminal C, e tem, por exemplo, a sequência de terminal C LSPG (SEQ ID NO: 29) ou LSP.

[300] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-IL-7R da presente revelação compreende uma cadeia pesada (HC) e uma cadeia leve (LC), em que a HC compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 21 e em que a LC compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 22. II. ANTICORPOS MODIFICADOS E MANIPULADOS

[301] Também são fornecidos anticorpos manipulados e modificados que podem ser preparados usando um anticorpo que tem um ou mais dentre as sequências de VH e/ou VL reveladas no presente documento como material de partida para manipular um anticorpo modificado, cujo anticorpo modificado pode ter propriedades alteradas do anticorpo de partida. Um anticorpo pode ser manipulado ao modificar um ou mais resíduos dentro de uma ou ambas as regiões (isto é, VH e/ou VL), por exemplo, dentro de uma ou mais regiões CDR e/ou dentro de uma ou mais regiões de estrutura. Adicional ou alternativamente, um anticorpo pode ser manipulado ao modificar resíduos dentro da região (ou regiões), por exemplo, alterar a função (ou funções) efetora do anticorpo.

[302] Um tipo de manipulação de região variável que pode ser realizado é enxerto de CDR. Anticorpos interagem com antígenos alvo predominantemente através de resíduos de aminoácido que estão localizados nas seis regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de cadeia pesada e leve. Por esse motivo, as sequências de aminoácidos dentro de CDRs são mais diversas entre anticorpos individuais que sequências fora de CDRs. Devido ao fato de que as sequências de CDR são responsáveis pela maioria de interações de anticorpo-antígeno, é possível expressar anticorpos recombinantes que imitam as propriedades de anticorpos de ocorrência natural específicos ao construir vetores de expressão que incluem as sequências de CDR do anticorpo de ocorrência natural específicos enxertado em sequências de estruturas de um anticorpo diferente com diferentes propriedades (consulte, por exemplo, Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332:323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321 :522-525; Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Set. EUA, 86: 10029-10033; Patente nº US

5.225.539 de Winter, e Patentes n° US 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 e 6.180.370 de Queen et al.).

[303] Consequentemente, uma modalidade descrita no presente documento pertence a um anticorpo monoclonal isolado compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) e uma região variável de cadeia leve (VL), em que a VH compreende sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 apresentadas como SEQ ID NOs: 13, 14 e 15, respectivamente, em que a VL compreende sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 apresentadas como SEQ ID NOs: 16, 17 e 18, respectivamente, e em que o anticorpo tem uma ou mais propriedades reveladas no presente documento. Assim, os anticorpos anti-IL-7R revelados no presente documento podem conter as sequências de CDR de VH e VL recitadas acima e ainda podem conter diferentes sequências de estruturas.

[304] Tais sequências de estruturas podem ser obtidos a partir de bases de dados de DNA públicas ou referências publicadas que incluem sequências de genes de anticorpo de linha germinativa. Por exemplo,

sequências de DNA de linha germinativa para genes de região variável de cadeia pesada e leve humanos podem ser encontrados na base de dados de sequência de linha germinativa humana "VBase" (disponível na Internet em www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase) bem como em Rabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication n° 91-3242; Tomlinson, I. M., et al. (1992) "The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals aproximadamente Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops" I. Mol. Biol. 227:776-798; and Cox, J. P. L. et al. (1994) "A Directory of Human Germ- line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur. J. Immunol. 24:827- 836; cujos conteúdos de cada um são incorporados expressamente a título de referência no presente documento.

[305] Em algumas modalidades, as sequências de estruturas para uso nos anticorpos anti-IL-7R descritos no presente documento são aquelas que são estruturalmente similares às sequências de estruturas usadas pelos anticorpos anti-IL-7R descritas no presente documento. As sequências de CDR1, 2 e 3 de VH e a sequências de CDR1, 2 e 3 de VL podem ser enxertadas em regiões de estrutura que têm a sequência idêntica àquela encontrada no gene de imunoglobulina de linha germinativa a partir do qual a sequência de estruturas deriva, ou as sequências de CDR podem ser enxertadas em regiões de estrutura que contêm uma ou mais mutações quando em comparação às sequências de linha germinativa. Por exemplo, constatou-se que, em certos exemplos, é benéfico mutar resíduos dentro das regiões de estrutura para manter ou melhorar a capacidade de ligação a antígeno do anticorpo (consulte, por exemplo, Patentes n° US 5.530.101;

5.585.089; 5.693.762 e 6.180.370 de Queen et al).

[306] Anticorpos anti-IL-7R manipulados descritos no presente documento incluem aqueles em que modificações foram feitas em resíduos de estrutura dentro de VH e/ou VL, por exemplo, para aprimorar as propriedades do anticorpo. Tipicamente, tais modificações de estrutura são feitas para diminuir a imunogenicidade do anticorpo. Por exemplo, uma abordagem consiste em "retromutar" um ou mais resíduos de estrutura para a sequência de linha germinativa correspondente. Mais especificamente, um anticorpo que sofreu mutação somática pode conter resíduos de estrutura que diferem da sequência de linha germinativa a partir da qual o anticorpo é derivado. Tais resíduos podem ser identificados ao comparar as sequências de estruturas de anticorpo com as sequências de linha germinativa a partir das quais o anticorpo é derivado. Para retornar as sequências de regiões de estrutura para a sua configuração de linha germinativa, as mutações somáticas podem ser "retromutadas" para a sequência de linha germinativa, por exemplo, por mutagênese direcionada ao sítio ou mutagênese mediada por PCR. Tais anticorpos "retromutados" também são destinados a ser abrangidos. Outro tipo de modificação de estrutura envolve mutar um ou mais resíduos dentro da região de estrutura ou ainda dentro de uma ou mais regiões CDR para remover epítopos de célula T para, desse modo, reduzir a imunogenicidade potencial do anticorpo. Essa abordagem também é referida como "desimunização" e é descrita em detalhe adicional na Publicação de Patente n° US 20030153043 por Carr et al.

[307] Outro tipo de modificação de região variável consiste em mutar resíduos de aminoácido dentro das regiões CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de VH e/ou VL para, desse modo, aprimorar uma ou mais propriedades de ligação (por exemplo, afinidade) do anticorpo de interesse. A mutagênese direcionada ao sítio ou mutagênese mediada por PCR podem ser realizadas para introduzir a mutação (ou mutações) e o efeito sobre a ligação de anticorpo ou outra propriedade funcional de interesse pode ser avaliado em ensaios in vitro ou in vivo conforme descrito no presente documento e fornecidos nos Exemplos. Em algumas modalidades, modificações conservativas (conforme discutido acima) são introduzidas. As mutações podem ser substituições, adições ou deleções de aminoácido. Além disso, tipicamente, não mais de um, dois, três, quatro ou cinco resíduos dentro de uma CDR região são alterados.

[308] Consequentemente, também são fornecidos no presente documento anticorpos anti-IL-7R isolados que compreendem uma VH e uma VL, em que a VH compreende (i) uma região CDR1 compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 13 (DHAMH) ou uma sequência de aminoácidos que tem uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácido quando em comparação à SEQ ID NO: 13; (ii) uma região CDR2 compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 14 (GISWNSRGIGYADSVKG) ou uma sequência de aminoácidos que tem uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácido quando em comparação à SEQ ID NO: 14; e (iii) uma CDR3 região que compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 15 (DEYSRGYYVLDV) ou uma sequência de aminoácidos que tem uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácido quando em comparação à SEQ ID NO: 15; em que a VL compreende (iv) uma região CDR1 compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 16 (RASQGISSALA) ou uma sequência de aminoácidos que tem uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácido quando em comparação à SEQ ID NO: 16; (v) uma região CDR2 que compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 17 (DASSLES) ou uma sequência de aminoácidos que tem uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácido quando em comparação à SEQ ID

NO: 17; e (vi) uma CDR3 região que compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 18 (QQFNSYPLWIT), ou uma sequência de aminoácidos que tem uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácido quando em comparação à SEQ ID NO: 18; e em que os anticorpos têm uma ou mais propriedades reveladas no presente documento. Exemplos não limitantes, como sequências de CDR de VH e VL são fornecidas na Tabela 13 (CDR1 de VH), Tabela 14 (CDR2 de VH), Tabela 15 (CDR3 de VH), Tabela 16 (CDR1 de VL), Tabela 17 (CDR2 de VL) e Tabela 18 (CDR3 de VL).

[309] Resíduos de metionina em CDRs de anticorpos podem ser oxidados, resultando em degradação potencial química e redução consequente em potência do anticorpo. Consequentemente, também são fornecidos anticorpos anti-IL-7R que têm um ou mais resíduos de metionina nas CDRs de cadeia pesada e/ou leve substituídas com resíduos de aminoácido que não sofrem degradação oxidativa.

[310] Similarmente, sítios de desamidação podem ser removidos de anticorpos anti-IL-7R revelados no presente documento, particularmente, nas CDRs.

[311] Regiões variáveis de anti-IL-7R descritas no presente documento podem ser ligadas (por exemplo, covalentemente ligadas ou fusionadas) a um Fc, por exemplo, uma IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 Fc, que pode ser de qualquer alótipo ou isoalótipo , por exemplo, para IgG1: G1m, G1m1(a), G1m2(x), G1m3(f), G1m17(z); para IgG2: G2m, G2m23(n); para IgG3: G3m, G3m21(g1), G3m28(g5), G3m11(b0), G3m5(b1), G3m13(b3), G3m14(b4), G3m10(b5), G3m15(s), G3m16(t), G3m6(c3), G3m24(c5), G3m26(u), G3m27(v); e para K: Km, Km1, Km2, Km3 {consulte, por exemplo, Jefferies et al. (2009) mAbs 1:1).

[312] Em certas modalidades, regiões variáveis de anti-IL-7R descritas no presente documento são ligadas e um Fc sem função efetora ou, principalmente, sem função efetora, por exemplo, IgG1. 1f ou IgG1.3f.

[313] Em geral, regiões variáveis descritas no presente documento podem ser ligadas a um Fc que compreende uma ou mais modificações, tipicamente, para alterar uma ou mais propriedades funcionais do anticorpo, como meia-vida sérica, fixação de complemento, ligação de receptor de Fc e/ou citotoxicidade celular dependente de antígeno. Adicionalmente, um anticorpo descrito no presente documento pode ser modificado quimicamente (por exemplo, uma ou mais frações químicas podem ser ligadas ao anticorpo) ou pode ser modificado para alterar sua glicosilação, para alterar uma ou mais propriedades funcionais do anticorpo. Cada uma dessas modalidades é descrita em detalhe adicional abaixo. A numeração de resíduos na região de Fc é aquela o índice EU de Kabat.

[314] A região de Fc abrange domínios derivados da região constante de uma imunoglobulina, incluindo um fragmento, análogo, variante, mutante ou derivado da região constante. Imunoglobulinas adequadas incluem IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 e outras classes como IgA, IgD, IgE e IgM, A região constante de uma imunoglobulina é definida como polipeptídeo de ocorrência natural ou sinteticamente produzido homólogo à região de terminal C de imunoglobulina, e pode incluir um domínio CH1, uma dobradiça, um domínio CH2, um domínio CH3 ou um domínio CH4 separadamente ou em combinação.

[315] As moléculas de Ig interagem com múltiplas classes de receptores celulares. Por exemplo, as moléculas de IgG interagem com três classes de receptores Feγ (FcγR) específicos para a classe de IgG de anticorpo, a saber, FcγRI, FcγRII e FcγRIII. As sequências importantes para a ligação de IgG para os receptores FcγR foram relatadas como estando localizadas nos domínios CH2 e CH3. A meia- vida sérica de um anticorpo é influenciada pela capacidade daquele anticorpo para se ligar a um receptor de Fc (FcR).

[316] Em certas modalidades, a região de Fc é uma região de Fc variante, por exemplo, uma sequência de Fcs que foi modificada (por exemplo, por substituição, deleção e/ou inserção de aminoácido) em relação a uma sequência de Fcs parenterais (por exemplo, um polipeptídeo de Fc não modificado que é modificado subsequentemente para gerar uma variante) para fornecer características estruturais desejáveis e/ou atividade biológica,

[317] Em geral, variantes da região constante ou porções das mesmas, por exemplo, domínios CH1, CL, dobradiça, CH2 ou CH3 podem compreender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais mutações, e/ou, no máximo, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 mutações ou 1 a 10 ou 1 a 5 mutações ou compreendem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos aproximadamente 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica àquela da região ou domínio do tipo selvagem correspondente (domínio CH1, CL, dobradiça, CH2 ou CH3, respectivamente), desde que a região constante de cadeia pesada que compreende a variante específica retenha a atividade biológica necessária.

[318] Por exemplo, um elemento pode fazer modificações na região de Fc a fim de gerar uma variante de Fc que (a) tem citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) aumentada ou diminuída, (b) citotoxicidade mediada por complemento (CDC) aumentada ou diminuída, (c) tem afinidade para C1q aumentada ou diminuída e/ou (d) tem afinidade aumentada ou diminuída para um receptor de Fc em relação ao Fc parental. Tais variantes de região de Fc compreenderão pelo menos uma modificação de aminoácido na região de Fc. A combinação de modificações de aminoácido é considerada como sendo particularmente desejável. Por exemplo, a região de Fc variante pode incluir duas, três, quatro, cinco, etc.

substituições na mesma, por exemplo, das posições de região de Fc específicas identificadas no presente documento.

[319] Uma região de Fc variante também pode compreender uma alteração de sequência em que aminoácidos envolvidos em formação de ligação de dissulfeto são removidos ou substituídos com outros aminoácidos. Tal remoção pode evitar reação com outras proteínas contendo cisteína presentes na célula hospedeira usada para produzir os anticorpos anti-IL-7R descritos no presente documento. Mesmo quando resíduos de cisteína são removidos, domínios de Fc de cadeia única ainda podem formar um domínio de Fc dimérico que é mantido junto de modo não covalente. Em outras modalidades, a região de Fc pode ser modificada para tornar a mesma mais compatível com uma célula hospedeira selecionada. Por exemplo, um elemento pode remover a sequência de PA próxima ao terminal N de uma região de Fc típica nativa, que pode ser reconhecida por uma enzima digestiva em E. coli como prolina iminopeptidase. Em outras modalidades, um ou mais sítios de glicosilação dentro do domínio de Fc podem ser removidos. Os resíduos que são glicosilados tipicamente (por exemplo, asparagina) podem conferir resposta citolítica. Tais resíduos podem ser deletados ou substituídos com resíduos não glicosilados (por exemplo, alanina). Em outras modalidades, os sítios envolvidos em interação com complemento, como o sítio de ligação a C1q, podem ser removidos da região de Fc. Por exemplo, um elemento pode deletar ou substituir a sequência de EKK de IgG1 humana. Em certas modalidades, os sítios que afetam a ligação a receptores de Fc podem ser removidos, preferencialmente, sítios diferentes de sítios de ligação a receptor de salvamento. Em outras modalidades, uma região de Fc pode ser modificada para remover um sítio de ADCC. Os sítios de ADCC são conhecidos na técnica; consulte, por exemplo, Molec. Immunol. 29 (5): 633-9 (1992) em relação a sítios de ADCC em IgG1. Exemplos específicos de domínios de Fc variante são revelados, por exemplo, nos documentos WO 97/34631 e WO 96/32478.

[320] Em uma modalidade, a região de dobradiça de Fc é modificada de modo que o número de resíduos de cisteína na região de dobradiça seja alterado, por exemplo, aumentado ou diminuído. Essa abordagem é descrita adicionalmente na Patente n° US 5.677.425 de Bodmer et al. O número de resíduos de cisteína na região de dobradiça de Fc é alterado, por exemplo, para facilitar a montagem das cadeias leves e pesadas ou aumentar ou diminuir a estabilidade do anticorpo. Em uma modalidade, a região de dobradiça de Fc de um anticorpo é mutada para diminuir a meia-vida biológica do anticorpo. Mais especificamente, uma ou mais mutações de aminoácido são introduzidas na região de interface de domínio CH2-CH3 do fragmento de dobradiça de Fc de modo que o anticorpo prejudique a ligação de proteína A estafilocócica (SpA) em relação à ligação de SpA de domínio de dobradiça de Fc nativo. Essa abordagem é descrita em detalhe adicional na Patente n° US 6.165.745 de Ward et al.

[321] Ainda em outras modalidades, a região de Fc é alterada ao substituir pelo menos um resíduo de aminoácido com um resíduo de aminoácido diferente para alterar a função (ou funções) efetoras do anticorpo. Por exemplo, um ou mais aminoácidos selecionados de resíduos de aminoácido 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320, 322, 330 e/ou 331 podem ser substituídos com um resíduo de aminoácido diferente de modo que o anticorpo tenha uma afinidade alterada para um ligante efetor, mas retém a capacidade ligação a antígeno do anticorpo parental. O ligante efetor no qual a afinidade é alterada pode ser, por exemplo, um receptor Fc ou o componente C1 do complemento. Essa abordagem é descrita em detalhe adicional nas Patentes n° US

5.624.821 e 5.648.260, ambas de Winter et al.

[322] Em outro exemplo, um ou mais aminoácidos selecionados de resíduos de aminoácido 329, 331 e 322 podem ser substituídos com um resíduo de aminoácido diferente de modo que o anticorpo tenha a ligação a C1q alterada e/ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC) reduzida ou abolida. Essa abordagem é descrita em detalhe adicional na Patente n° US 6.194.551 de Idusogie et al.

[323] Em outro exemplo, um ou mais resíduos de aminoácido nas posições de aminoácido 231 e 239 são alterados para, desse modo, alterar a capacidade do anticorpo para fixar o complemento. Essa abordagem é descrita adicionalmente na Publicação PCT WO 94/29351 de Bodmer et al.

[324] Ainda em outro exemplo, a região de Fc pode ser modificada para diminuir citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) e/ou diminuir a afinidade para um receptor Fcγ ao modificar um ou mais aminoácidos nas seguintes posições: 234, 235, 236, 238, 239, 240, 241 , 243, 244, 245, 247, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 262, 263, 264, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 313, 315, 320, 322, 324, 325, 326, 327, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 433, 434, 435, 436, 437, 438 ou 439. Substituições exemplificativas incluem 236A, 239D, 239E, 268D, 267E, 268E, 268F, 324T, 332D e 332E. Variantes exemplificativas incluem 239D/332E, 236A/332E, 236A/239D/332E, 268F/324T, 267E/268F, 267E/324T e 267E/268F7324T. Outras modificações para melhorar interações de FcγR e complemento incluem, mas sem limitação, substituições 298 A, 333A, 334A, 326A, 2471, 339D, 339Q, 280H, 290S, 298D, 298V, 243L, 292P, 300L, 396L, 3051 e 396L. Essas e outras modificações são are revisadas em Strohl, 2009, Current Opinion in Biotechnology 20:685-

691.

[325] As modificações de Fc que aumentam a ligação a um receptor Fcγ incluem modificações de aminoácido em qualquer uma ou mais dentre as posições de aminoácido 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 279, 280, 283, 285, 298, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 312, 315, 324, 327, 329, 330, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 379, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 ou 439 da região de Fc, em que a numeração dos resíduos na região de Fc é aquela do índice EU como em Rabat (documento WO00/42072).

[326] Outras modificações de Fc que podem ser feitas a Fcs são aquelas para reduzir ou ablacionar a ligação a FcγR e/ou proteínas de complemento, reduzindo ou ablacionando, desse modo, funções efetoras mediadas por Fc como ADCC, ADCP e CDC. Modificações exemplificativas, mas sem limitação, substituições, inserções e deleções nas posições 234, 235, 236, 237, 267, 269, 325, 328, 330 e/ou 331 (por exemplo, 330 e 331), em que a numeração é de acordo com o índice EU. Substituições exemplificativas incluem, mas sem limitação, 234A, 235E, 236R, 237A, 267R, 269R, 325L, 328R, 330S e 331S (por exemplo, 330S e 331S), em que a numeração é de acordo com o índice EU. Uma variante de Fc pode compreender 236R/328R. Outras modificações para reduzir interações de FcγR e complemento incluem substituições 297A, 234A, 235A, 237A, 318A, 228P, 236E, 268Q, 309L, 330S, 331 S, 220S, 226S, 229S, 238S, 233P e 234V bem como remoção da glicosilação na posição 297 por meios mutacionais ou enzimáticos ou por produção em organismos como bactérias que não glicosilam proteínas. Essas e outras modificações são revisadas em Strohl, 2009, Current Opinion in Biotechnology 20:685-691.

[327] Opcionalmente, a região de Fc pode compreender um resíduo de aminoácido de ocorrência não natural em posições adicionais e/ou alternativas conhecidas para um técnico no assunto (consulte, por exemplo, Patentes n° US 5.624.821; 6.277.375;

6.737.056; 6.194.551; 7.317.091; 8.101.720; Publicações de Patente PCX WO 00/42072; WO 01/58957; WO 02/06919; WO 04/016750; WO 04/029207; WO 04/035752; WO 04/074455; WO 04/099249; WO 04/063351; WO 05/070963; WO 05/040217, WO 05/092925 e WO 06/0201 14).

[328] As variantes de Fc que melhoram afinidade para um receptor FcγRIIb inibitório também podem ser usadas. Tais variantes podem fornecer uma proteína de fusionamento de Fc com atividades imunomodulatórias relacionadas a células de FcγRIIb, incluindo, por exemplo, células B e monócitos. Em uma modalidade, as variantes de Fc fornecem seletivamente afinidade melhorada para FcγRIIb em relação a um ou mais receptores de ativação. As modificações para alterar a ligação a FcγRIIb incluem uma ou mais modificações em uma posição selecionada do grupo que consiste em 234, 235, 236, 237, 239, 266, 267, 268, 325, 326, 327, 328, 330, 331 e 332 de acordo com o índice EU. Substituições exemplificativas para melhorar afinidade de FcγRIIb incluem, mas sem limitação, 234A, 234D, 234E, 234F, 234W, 235D, 235E, 235F, 235R, 235Y, 236D, 236N, 237A, 237D, 237N, 239D, 239E, 266M, 267D, 267E, 268D, 268E, 327D, 327E, 328F, 328W, 328Y, 330S, 331S e 332E. Substituições exemplificativas incluem 235Y, 236D, 239D, 266M, 267E, 268D, 268E, 328F, 328W e 328Y. Outras variantes de Fc para melhorar a ligação a FcγRIIb incluem 235Y/267E, 236D/267E, 239D/268D, 239D/267E, 267E/268D, 267E/268E e 267E/328F.

[329] As afinidades e propriedades de ligação de uma região de Fc para seu ligante podem ser determinadas por uma variedade de métodos de ensaio in vitro (ensaios com base bioquímica ou imunológica) conhecidos na técnica incluindo, mas sem limitação, métodos de equilíbrio (por exemplo, ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA) ou radioimunoensaio (RIA)) ou cinética (por exemplo,

análise BIACORE™), e outros métodos como ensaios de ligação indireta, ensaios de inibição competitiva, transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET), eletroforese em gel e cromatografia (por exemplo, filtração em gel). Esses e outros métodos podem utilizar uma marcação em um ou mais componentes que são examinados e/ou empregar uma variedade de métodos de detecção incluindo, mas sem limitação, marcações cromogênicas, fluorescentes, luminescentes ou isotópicas. Uma descrição detalhada de afinidades e cinética de ligação pode ser encontrada em Paul, W. E., ed., Fundamental immunology, 4ª Edição, Lippincott-Raven, Filadélfia (1999), que foca em interações de anticorpo-imunógeno.

[330] Em certas modalidades, o anticorpo é modificado para aumentar sua meio-vida biológica. Várias abordagens são possíveis. Por exemplo, isso pode ser feito ao aumentar a afinidade de ligação da região de Fc para FcRn, por exemplo, um ou mais dentre os seguintes resíduos podem ser mutados: 252, 254, 256, 433, 435, 436, conforme descrito na Patente n° US nº 6.277.375. Substituições exemplificativas específicas incluem uma ou mais dentre as seguintes: T252L, T254S e/ou T256F. Alternativamente, para aumentar a meia-vida, o anticorpo pode ser alterado dentro da região de CH1 ou CL para conter uma ligação a epítopo de receptor de salvamento retirado de duas alças de um domínio CH2 de uma região de Fc de uma IgG, conforme descrito nas Patentes n° US 5.869.046 e 6.121.022 de Presta et al. Outras variantes exemplificativas que aumentam a ligação a FcRn e/ou aprimoram propriedades farmacocinéticas incluem substituições nas posições 259, 308, 428 e 434, incluindo, por exemplo, 2591, 308F, 428L, 428M, 434S, 4341 1. 434F, 434Y e 434X1. Outras variantes que aumentam a ligação de Fc a FcRn incluem: 250E, 250Q, 428 L, 428F, 250Q/428L (Hinton et al. 2004, J. Biol. Chem. 279(8): 6213-6216, Hinton et al. 2006 Journal of Immunology 176:346-356), 256A, 272A, 286A,

305A, 307A, 307Q, 31 1A, 312A, 376A, 378Q, 380A, 382A, 434A (Shields et al., Journal of Biological Chemistry, 2001, 276(9):6591- 6604), 252F, 252T, 252Y, 252W, 254T, 256S, 256R, 256Q, 256E, 256D, 256T, 309P, 31 1 S, 433R, 433S, 4331, 433P, 433Q, 434H, 434F, 434Y, 252Y/254T/256E, 433K/434F/436H, 308T/309P/311S (Dall'Acqua et al. Journal of Immunology, 2002, 169:5171-5180, DalfAcqua et al., 2006, Journal of Biological Chemistry 281:23514-23524). Outras modificações para modular a ligação a FcRn são descritas em Yeung et al., 2010, J Immunol, 182:7663-7671.

[331] Em certas modalidades, os isótipos de IgG híbridos com características biológicas particulares podem ser usados. Por exemplo, uma variante híbrida der IgG1/IgG3 pode ser construída ao substituir posições de IgG1 na região de CH2 e/ou CH3 com os aminoácidos de IgG3 em posições em que dois isótipos diferem. Assim, um anticorpo de IgG de variante híbrida pode ser construído que compreende uma ou mais substituições, por exemplo, 274Q, 276K, 300F, 339T, 356E, 358M, 384S, 392N, 397M, 4221, 435R e 436F. Em outras modalidades descritas no presente documento, uma variante híbrida de IgG1/IgG2 pode ser construída ao substituir posições de IgG2 na região de CH2 e/ou CH3 com aminoácidos de IgG1 em posições em que os dois isótipos diferem. Assim, pode ser construído um anticorpo de IgG de variante híbrida que compreende uma ou mais substituições, por exemplo, um ou mais dentre as seguintes substituições de aminoácido: 233E, 234L, 235L, -236G (com referência a uma inserção de uma glicina na posição 236) e 327A.

[332] Além disso, os sítios de ligação em IgG1 humana para FcγRI, FcγRII, FcγRIII e FcRn foram mapeados e variantes com a ligação aprimorada foram descritas (consulte Shields, R.L. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604). Mutações específicas nas posições 256, 290, 298, 333, 334 e 339 foram mostradas como aprimorando a ligação a

FcγRIII. Adicionalmente, os seguintes mutantes de combinação foram mostrados como aprimorando a ligação a FcγRIII: T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A e S298A/E333A/K334A, que foram mostrados como exibindo a ligação a FcγRIIIa melhorada e atividade de ADCC (Shields et al., 2001). Outras variantes de IgG1 com ligação fortemente melhorada a FcγRIIIa foram identificadas, incluindo variantes com mutações S239D/I332E e S239D/I332E/A330L que mostraram o maior aumento em afinidade para FcγRIIIa, uma diminuição em ligação a FcγRIIb, e atividade citotóxica forte em macacos cinomolgos (Lazar et al., 2006). A introdução das mutações triplas em anticorpos como alemtuzumabe (específico de CD52), trastuzumabe (específico de HER2/neu), rituximabe (específico de CD20) e cetuximabe (específico de EGFR) traduzido em atividade de ADCC bastante melhorada in vitro, e a variante de S239D/I332E mostrou uma capacidade melhorada para depletar células B em macacos (Lazar et al., 2006). Além disso, mutantes de IgG1 contendo mutações L235V, F243L, R292P, Y300L e P396L que exibem ligação melhorada a FcγRIIIa e, concomitantemente, atividade de ADCC melhorada em camundongos transgênicos que expressam FcγRIIIa humano em modelos de malignidade de célula B e câncer de mama foram identificados (Stavenhagen et al., 2007; Nordstrom et al., 2011). Outros mutantes de Fc que podem ser usados incluem: S298A/E333A/L334A, S239D/I332E, S239D/I332E/A330L, L235V/F243L/R292P/Y300L/P396L e M428L/N434S.

[333] Em certas modalidades, é escolhido um Fc que reduziu a ligação a FcγRs. Um Fc exemplificativo, por exemplo, Fc de IgG1, com ligação a FcγR reduzida compreende as seguintes três substituições de aminoácido: L234A, L235E e G237A.

[334] Em certas modalidades, é escolhido um Fc que reduziu fixação de complemento. Um Fc exemplificativo, por exemplo, Fc de

IgG1, com fixação de complemento reduzida tem as duas seguintes substituições de aminoácido: A330S e P331S.

[335] Em certas modalidades, é escolhido um Fc que não tem essencialmente nenhuma função efetora, isto é, tem a ligação a FcγRs reduzida e fixação de complemento reduzida. Um Fc exemplificativo, por exemplo, Fc de IgG1, que não tem função efetora compreende as seguintes cinco mutações: L234A, L235E, G237A, A330S e P331S.

[336] Ao usar um domínio constante de IgG4, pode incluir a substituição S228P, que imita a sequência de dobradiça em IgG1 e, desse modo, estabiliza moléculas de IgG4.

[337] Ainda em outras modalidades, a glicosilação de um anticorpo é modificada. Por exemplo, um anticorpo aglicosilado pode ser feito (isto é, o anticorpo não tem glicosilação). A glicosilação pode ser alterada, por exemplo, para aumentar a afinidade do anticorpo para antígeno. Tais modificações de carboidrato podem ser realizadas, por exemplo, ao alterar um ou mais sítios de glicosilação dentro da sequência de anticorpos. Por exemplo, podem ser feitas uma ou mais substituições de aminoácido que resultam em eliminação de um ou mais sítios de glicosilação de estrutura de região variável para, desse modo, eliminar a glicosilação naquele sítio. Tal aglicosilação pode aumentar a afinidade do anticorpo para antígeno. Tal abordagem é descrita em detalhe nas Patentes n° US 5.714.350 e 6.350.861 de Co et al.

[338] A glicosilação da região constante em N297 pode ser prevenida ao mutar o resíduo N297 para outro resíduo, por exemplo, N297A e/ou ao mutar um aminoácido adjacente, por exemplo, 298 para, desse modo, reduzir a glicosilação em N297.

[339] Adicional ou alternativamente, pode ser feito um anticorpo que ter um tipo alterado de glicosilação, como um anticorpo hipofucosilado que tem quantidades reduzidas de resíduos de fucosila ou um anticorpo que tem estruturas de GlcNac de bissecção aumentadas. Tais padrões de glicosilação alterados demonstraram aumentar a capacidade de ADCC de anticorpos. Tais modificações de carboidratos podem ser realizadas, por exemplo, ao expressar o anticorpo em uma célula hospedeira com mecanismos de glicosilação alterada. Células com mecanismos de glicosilação alterada foram descritas na técnica e podem ser usadas como células hospedeiras em que expressam anticorpos anti-IL-7R recombinantes descritos no presente documento para, desse modo, produzir um anticorpo com glicosilação alterada. Por exemplo, o documento EP 1.176.195 de Hanai et al. descreve uma linhagem celular com um gene FUT8 funcionalmente interrompido, que codifica uma fucosil transferase, de modo que anticorpos expressos em tal linhagem celular exibam hipofucosilação. A Publicação PCT WO 03/035835 de Presta descreve uma linhagem celular de CHO variante, células Led 3, com capacidade reduzida para ligar fucose a carboidrato ligados a Asn(297), resultando também em hipofucosilação de anticorpos expressos naquela célula hospedeira (também consulte Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740). A Publicação PCT WO 99/54342 de Umana et al. descreve linhagens celulares manipuladas para expressar glicosol transferases modificadoras de glicoproteínas (por exemplo, beta(l,4)-N- acetilglucosaminiltransferase III (GnTIII)) de modo que anticorpos expressos nas linhagens celulares manipuladas exibam estruturas de GlcNac de bissecção aumentadas, o que resulta em atividade de ADCC aumentada dos anticorpos (também consulte Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17: 176-180).

[340] Outra modificação dos anticorpos anti-IL-7R descritos no presente documento é peguilação. Um anticorpo pode ser peguilado, por exemplo, para aumentar a meia-vida biológica (por exemplo, soro) do anticorpo. Para peguilar um anticorpo, reage-se tipicamente o anticorpo ou fragmento do mesmo com polietileno glicol (PEG), como um derivado de éster ou aldeído reativo de PEG, sob condições em que um ou mais grupos PEG se ligam ao anticorpo ou fragmento de anticorpo. Em algumas modalidades, a peguilação é executada através de uma reação de acilação ou uma reação de alquilação com uma molécula de PEG reativa (ou um polímero solúvel em água reativo análogo). Conforme usado no presente documento, pretende-se que o termo "polietileno glicol" abranja qualquer uma das formas de PEG que foi usada para derivar outras proteínas, como mono (CI-CIO) alcoxi ou ariloxi-polietileno glicol ou polietileno glicol-maleimida. Em certas modalidades, o anticorpo a ser peguilado é um anticorpo aglicosilado. Métodos para peguilar proteínas são conhecidos na técnica e podem ser aplicados aos anticorpos anti-IL-7R descritos no presente documento. Consulte, por exemplo, o documento EP 0 154 316 de Nishimura et al. e o documento EP 0 401 384 de Ishikawa et al. III. PROPRIEDADES FÍSICAS DE ANTICORPO

[341] Os anticorpos anti-IL-7R, por exemplo, aqueles descritos no presente documento têm algumas ou todas as características físicas descritas no presente documento, como as características descritas nos Exemplos.

[342] Os anticorpos anti-IL-7R descritos no presente documento podem conter um ou mais sítios de glicosilação na região variável de cadeia leve ou pesada. Tais sítios de glicosilação podem resultar em imunogenicidade do anticorpo aumentada ou em uma alteração da pK do anticorpo devido à ligação a antígeno alterada (Marshall et al., (1972) Anna Rev Biochem 41:673-702; Gala and Morrison (2004) J. Immunol 172:5489-94; Wallick et al., (1988) J Exp Med 168: 1099-109; Spiro (2002) Glycobiology 12:43R-56R; Parekh et al., (1985) Nature 316:452- 7; Mimura et al., (2000) Mol Immunol 37:697- 706). A glicosilação foi conhecida como ocorrendo em motivos contendo uma sequência N-X- S/T. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-IL-7R não contém glicosilação de região variável. Isso pode ser alcançado ao selecionar anticorpos que não contêm o motivo de glicosilação na região variável ou ao mutar resíduos dentro da região de glicosilação.

[343] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-IL-7R descritos no presente documento não contêm sítios de isomerismos de asparagina. A desamidação de asparagina pode ocorrer em sequências N-G ou D-G e resulta na criação de um resíduo de ácido isoaspártico que introduz um encrespamento na cadeia polipeptídica e diminui sua estabilidade (efeito de ácido isoaspártico).

[344] Cada anticorpo terá um único ponto isoelétrico (pi), que está, em geral, na faixa de pH entre 6 e 9,5. O pi para um anticorpo de IgG1 está tipicamente dentro da faixa de pH de 7 a 9,5 e o pi para anticorpo de IgG4 está tipicamente dentro da faixa de pH de 6 a 8. Há uma especulação de que anticorpos com um pi fora da faixa normal podem ter algum desdobramento e instabilidade sob condições in vivo. Assim, um anticorpo anti-IL-7R pode conter um valor de pi que está na faixa normal. Isso pode ser alcançado ao selecionar anticorpos com um pi na faixa normal ou ao mutar resíduos de superfície carregados.

[345] Cada anticorpo terá uma temperatura de fusão característica, com uma temperatura de fusão superior indicando maior estabilidade geral in vivo (Krishnamurthy R and Manning M C (2002) Curr Pharm Biotechnol 3:361-71). Em geral, a TMi (a temperatura de desdobramento inicial) pode ser maior que 60 °C, maior que 65 °C ou maior que 70 °C. O ponto de fusão de um anticorpo pode ser medido usando calorimetria de varredura diferencial (Chen et al., (2003) Pharm Res 20: 1952-60; Ghirlando et al., (1999) Immunol Lett 68:47-52) ou dicroísmo circular (Murray et al., (2002) J. Chromatogr Sci 40:343-9).

[346] Em uma modalidade, são selecionados anticorpos que não se degradam rapidamente. A degradação de um anticorpo pode ser medida usando eletroforese capilar (CE) e MALDI-MS (Alexander A J and Hughes D E (1995) Anal Chem 67:3626-32).

[347] Em algumas modalidades, são selecionados anticorpos que têm efeitos de agregação mínimos, que pode levar ao acionamento de uma resposta imune indesejada e/ou propriedades farmacocinéticas alteradas ou desfavoráveis. Em geral, os anticorpos são aceitáveis com agregação de 25% ou menos, 20% ou menos, 15% ou menos, 10% ou menos ou 5% ou menos. A agregação pode ser medida por várias técnicas, incluindo coluna de exclusão de tamanho (SEC), cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) e espalhamento de luz. IV. MÉTODOS DE MANIPULAÇÃO DE ANTICORPOS

[348] Conforme discutido acima, os anticorpos anti-IL-7R que têm sequências de VH e VL revelados no presente documento podem ser usados para criar novos anticorpos anti-IL-7R ao modificar as sequências de VH e/ou VL ou a região (ou regiões) constante ligada às mesmas. Assim, em outro aspecto descrito no presente documento, as características estruturais de um anticorpo anti-IL-7R descritas no presente documento são usadas para criar anticorpos anti-IL-7R estruturalmente relacionados que retêm pelo menos uma propriedade funcional dos anticorpos anti-IL-7R descritos no presente documento, como ligação ao IL-7Rɑhumano e ao IL-7Rɑde cinomolgo. Por exemplo, uma ou mais regiões CDR de um anticorpo anti-IL-7R revelado no presente documento podem ser combinados recombinantemente com regiões de estrutura conhecidas e/ou outras CDRs para criar anticorpos anti-IL-7R recombinantemente manipulados adicionais conforme discutido acima. Outros tipos de modificações incluem aqueles descritos na seção anterior. O material de partida para o método de manipulação é uma ou mais das sequências de VH e/ou VL fornecidas no presente documento ou uma ou mais regiões CDR das mesmas. Para criar o anticorpo manipulado, não é necessário preparar realmente (isto é,

expressar como uma proteína) um anticorpo que tem uma ou mais das sequências de VH e/ou VL fornecidas no presente documento ou uma ou mais regiões CDR das mesmas. Preferencialmente, as informações contidas na sequência (ou sequências) são usadas como o material de partida para criar uma sequência (ou sequências) de "segunda geração” derivada da sequência (ou sequências) parenteral e, então, a sequência (ou sequências) de "segunda geração” é preparada e expressa como uma proteína.

[349] Consequentemente, são fornecidos no presente documento métodos para preparar um anticorpo anti-IL-7R compreendendo:

[350] (a) fornecer: (i) uma sequência de anticorpos de região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de CDR1s apresentada como SEQ ID NO: 13 ou qualquer uma das sequências fornecidas na Tabela 13, uma sequência de CDR2 apresentada como SEQ ID NO: 14 ou qualquer uma das sequências fornecidas na Tabela 14, e/ou uma sequência de CDR3 apresentada como SEQ ID NO: 15 ou qualquer uma das sequências fornecidas na Tabela 15; e (ii) uma sequência de anticorpos de região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de CDR1s apresentada como SEQ ID NO: 16 ou qualquer uma das sequências fornecidas na Tabela 16, uma sequência de CDR2 apresentada como SEQ ID NO: 17 ou qualquer uma das sequências fornecidas na Tabela 17, e/ou uma sequência de CDR3 apresentada como SEQ ID NO: 18 ou qualquer uma das sequências fornecidas na Tabela 18;

[351] (b) alterar pelo menos um resíduo de aminoácido contido na sequência de anticorpos de região variável de cadeia pesada e/ou na sequência de anticorpos de região variável de cadeia leve para criar pelo menos uma sequência de anticorpos alterada; e

[352] (c) expressar a sequência de anticorpos alterada como uma proteína.

[353] Técnicas de biologia molecular padrão podem ser usadas para preparar e expressar a sequência de anticorpos alterada. Em algumas modalidades, o anticorpo codificado pela sequência (ou sequências) de anticorpos alterada é aquele que retém uma, algumas ou todas as propriedades funcionais dos anticorpos anti-IL-7R descritos no presente documento. As propriedades funcionais dos anticorpos alterados podem ser avaliadas usando ensaios padrão disponíveis na técnica e/ou descritas no presente documento, como aquelas apresentadas nos Exemplos (por exemplo, ELISAs, FACS).

[354] Em algumas modalidades, mutações podem ser introduzidas aleatória ou seletivamente ao longo de toda ou parte de uma sequência de codificação de anticorpo anti-IL-7R e os anticorpos anti-IL-7R modificados resultantes podem ser triados quanto à atividade de ligação e/ou outras propriedades funcionais conforme descrito no presente documento. Métodos mutacionais foram descritos na técnica. Por exemplo, a Publicação PCT WO 02/092780 de Short descreve métodos para criar e triar mutações de anticorpo usando mutagênese por saturação, montagem de ligação sintética ou uma combinação das mesmas. Alternativamente, a Publicação PCT WO 03/074679 de Lazar et al. descreve métodos de uso de métodos de triagem computacional para otimizar propriedades físico-químicas de anticorpos. V. ÁCIDOS NUCLEICOS, VETORES E CÉLULA

[355] Também são descritos no presente documento moléculas de ácido nucleico que codificam os anticorpos anti-IL-7R descritos no presente documento. Os ácidos nucleicos podem estar presentes em todas as células, em um lisato celular ou em uma forma parcialmente pura ou substancialmente pura. Um ácido nucleico é "isolado" ou "tornado substancialmente puro" quando purificado de outros componentes celulares ou outros contaminantes, por exemplo, outros ácidos nucleicos celulares (por exemplo, outros ácidos nucleicos celulares (por exemplo, outro DNA cromossômico, por exemplo, o DNA cromossômico que é ligado ao DNA isolado na natureza) ou proteínas, por técnicas padrão, incluindo tratamento alcalino/SDS, banda de CsCl, cromatografia de coluna, enzimas restrição, eletroforese em gel de agarose e outros bem conhecidos na técnica. Consulte, F. Ausubel, et al., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York. Um ácido nucleico descrito no presente documento pode ser, por exemplo, DNA ou RNA e pode conter ou não sequências intrônicas. Em certas modalidades, o ácido nucleico é uma molécula de cDNA.

[356] Ácidos nucleicos descritos no presente documento podem ser obtidos usando técnicas de biologia molecular padrão. Para anticorpos expressos por hibridomas (por exemplo, hibridomas preparados a partir de camundongos transgênicos que portam genes de imunoglobulina humanos conforme descrito adicionalmente abaixo), os cDNAs que codificam as cadeias leves e pesadas do anticorpo feitos pelo hibridoma podem ser obtidos por técnicas de amplificação de PCR padrão ou clonagem de cDNA. Para anticorpos obtidos a partir de uma biblioteca de gene de imunoglobulina (por exemplo, usando técnicas de exibição de fago), o ácido nucleico que codifica o anticorpo pode ser recuperado a partir da biblioteca.

[357] Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos descritos no presente documento são aqueles que codificam as sequências de VH e VL dos anticorpos anti-IL-7R da presente revelação. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos descritos no presente documento codificam sequências de VH e VL que são homólogas aos anticorpos anti-IL-7R revelados no presente documento. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos codificam sequências de VH e VL que são pelo menos 70% idênticas, por exemplo, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 99% idênticas a moléculas de ácido nucleico que codificam as sequências de VH e VL dos anticorpos anti-IL-7R revelados no presente documento.

[358] Em algumas modalidades, as moléculas de ácido nucleico descritas no presente documento podem ser modificadas para deletar sequências específicas, por exemplo, sequências de reconhecimento de enzima de restrição. Em algumas modalidades, as moléculas de ácido nucleico compreendem substituições conservativas (isto é, substituições que não alteram a sequência de aminoácidos resultante após a tradução de molécula de ácido nucleico), por exemplo, para otimização por códon.

[359] Um método para fabricar um anticorpo anti-IL-7R conforme revelado no presente documento pode compreender expressar a cadeia pesada e as cadeias leves em uma linhagem celular que compreende as sequências de nucleotídeos que codificam as cadeias pesadas e leves com um peptídeo de sinal, por exemplo, SEQ ID NOs: 21 e 22, respectivamente. As células hospedeiras que compreendem essas sequências de nucleotídeos são abrangidas no presente documento. Em algumas modalidades, as células hospedeiras são derivadas de uma linhagem celular CHOZN.

[360] Uma vez que fragmentos de DNA que codificam segmentos de VH e VL são obtidos, esses fragmentos de DNA podem ser manipulados adicionalmente por técnicas de DNA recombinante padrão, por exemplo, para converter os genes de região variável em genes de cadeia de anticorpo de comprimento total, em genes de fragmento Fab ou em um gene de scFv. Nessas manipulações, um fragmento de DNA que codificam VL ou VH é ligado operativamente a outro fragmento de DNA que codificam outra proteína, como uma região constante de anticorpo ou um ligante flexível. O termo “operativamente ligado”, conforme usado nesse contexto, se destina a significar que os dois fragmentos de DNA são unidos de modo que as sequências de aminoácidos codificadas pelos dois fragmentos de DNA permaneçam na armação.

[361] O DNA isolado que codifica a região de VH pode ser convertido em um gene de cadeia pesada de comprimento total ao ligar operativamente o DNA que codifica VH a outra molécula de DNA que codifica regiões constantes de cadeia pesada (dobradiça, CH1, CH2 e/ou CH3). As sequências de genes de região constante de cadeia pesada humanos são conhecidas na técnica (consulte, por exemplo, Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) e fragmentos de DNA que abrangem essas regiões podem ser obtidos por amplificação de PCR padrão. A região constante de cadeia pesada pode ser uma região constante de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM ou IgD, por exemplo, uma região de IgG1. Para um gene de cadeia pesada de fragmento Fab, o DNA que codifica VH pode ligado operativamente a outra molécula de DNA que codifica apenas a região constante de CH1 de cadeia pesada.

[362] O DNA isolado que codifica região de VL pode ser convertido em um gene de cadeia leve de comprimento total (bem como um gene de cadeia leve de Fab) ao ligar operativamente o DNA que codifica VL a outra molécula de DNA que codifica a região constante de cadeia leve, CL. As sequências de genes de região constante de cadeia leve humanos são conhecidas na técnica (consulte, por exemplo, Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) e fragmentos de DNA que abrangem essas regiões podem ser obtidos por amplificação de PCR padrão. A região constante de cadeia leve pode ser uma região constante kappa ou lambda.

[363] A presente revelação fornece adicionalmente células (por exemplo, células hospedeiras) que expressam (por exemplo, recombinantemente) anticorpos anti-IL-7R descritos no presente documento e polinucleotídeos relacionados e vetores de expressão. Também são fornecidos no presente documento vetores compreendendo polinucleotídeos que compreendem sequências de nucleotídeos que codificam anticorpos anti-IL-7R ou um fragmento do mesmo. Em algumas modalidades, os vetores podem ser usados para expressar recombinantemente anticorpos anti-IL-7R descritos no presente documento em células hospedeiras, em células mamíferas, por exemplo, células CHOZN. Em algumas modalidades, os vetores podem ser usados para terapia de gene. Tais vetores para a revelação incluem vetores de expressão, vetores virais e vetores plasmídicos.

[364] Conforme usado no presente documento, um vetor de expressão se refere a qualquer construto de ácido nucleico que contém os elementos necessários para a transcrição e tradução de uma sequência de codificação inserida ou, no caso de um vetor viral de RNA, os elementos necessários para replicação e tradução, quando introduzidos em uma célula hospedeira apropriada. Os vetores de expressão podem incluir plasmídeos, fagomídeos, vírus e derivados dos mesmos.

[365] Os vetores de expressão da revelação podem incluir polinucleotídeos que codificam o anticorpo ou porção de ligação a antígeno do mesmo descrito no presente documento. Em algumas modalidades, as sequências de codificação para o anticorpo ou porção de ligação a antígeno do mesmo são ligadas operativamente a uma sequência de controle de expressão. Conforme usado no presente documento, duas sequências de ácidos nucleicos são ligadas operativamente quando as mesmas são ligadas covalentemente de forma que permita que cada sequência de ácidos nucleicos de componente retenha sua funcionalidade. Diz-se que uma sequência de codificação e uma sequência de controle de expressão de gene são ligadas operativamente quando as mesmas são ligadas covalentemente de forma que coloque a expressão ou transcrição e/ou tradução da sequência de codificação sob a influência ou controle da sequência de controle de expressão de gene. Diz-se que sequências de DNA são ligadas operativamente se a indução de um promotor na sequência de expressão do gene 5 ‘ resultar na transcrição da sequência de codificação e se a natureza da ligação entre as duas sequências de DNA (1) não resultar na introdução de uma mutação por mudança da matriz de leitura, (2) interferir na capacidade da região de promotor para direcionar a transcrição da sequência de codificação, ou (3) interferir na capacidade do transcrito de RNA correspondente para ser traduzido em uma proteína. Assim, uma sequência de expressão de gene seria ligada operativamente a uma sequência de ácidos nucleicos de codificação se a sequência de expressão de gene tivesse capacidade para efetuar a transcrição daquela sequência de ácidos nucleicos de codificação de modo que o transcrito resultante é traduzido no anticorpo desejado ou porção de ligação a antígeno do mesmo.

[366] Os vetores virais incluem, mas sem limitação, sequências de ácidos nucleicos dos seguintes vírus: retrovírus, como vírus da leucemia murina Moloney, vírus do sarcoma murino Harvey, vírus do tumor mamário murino e vírus do sarcoma de Rous; lentivírus; adenovírus; vírus adenoassociado; Vírus do tipo SV40; poliomavírus; Vírus Epstein- Barr; vírus do papiloma; vírus do herpes; vírus vaccinia; vírus da poliomielite; e vírus de RNA, como um retrovírus Um elemento pode empregar prontamente outros vetores bem conhecidos na técnica. Certos vetores virais têm como base em vírus eucarióticos não citopáticos em que genes não essenciais foram substituídos com o gene de interesse. Vírus não citopáticos incluem retrovírus, cujo ciclo de vida envolve transcrição reversa de RNA viral genômico em DNA com integração pró-viral subsequente em DNA celular hospedeiro. Os retrovírus foram aprovados para testes de terapia de gene humano. Os mais úteis são aqueles retrovírus que são deficientes de replicação (isto é, que têm capacidade para direcionar síntese das proteínas desejadas, mas não têm capacidade para fabricar uma partícula infecciosa). Tais vetores de expressão retrovirais geneticamente alterados têm utilidade geral para tradução de alta eficiência de genes in vivo. Protocolos padrão para produzir retrovírus deficiente de replicação (incluindo as etapas de incorporação de material genético exógeno em um plasmídeo, transfecção de uma linhagem celular de empacotamento com plasmídeo, produção de retrovírus recombinantes pela linhagem celular de empacotamento, coleção de partículas virais de meios de cultura de tecido e infecção das células alvo com partículas virais) são fornecidos em Kriegler, M., Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, W.H. Freeman Co., New York (1990) e Murry, E. J., Methods in Molecular Biology, Vol. 7, Humana Press, Inc., Cliffton, N.J. (1991).parei VI. PRODUÇÃO DE ANTICORPOS

[367] Anticorpos anti-IL-7R descritos no presente documento podem ser produzidos usando uma variedade de técnicas conhecidas, como a técnica de hibridização de célula somática padrão descrita por Kohler e Milstein, Nature 256: 495 (1975). Embora procedimentos de hibridização de célula somática sejam preferenciais, a princípio, outras técnicas para produzir anticorpos monoclonais também podem ser usados, por exemplo, transformação viral ou oncogênica de linfócitos B, técnica de exibição de fago usando bibliotecas de genes de anticorpo humano.

[368] O sistema animal preferencial para preparar hibridomas é o sistema murino. A produção de hibridoma no camundongo é um procedimento muito bem estabelecido. Protocolos e técnicas de imunização para isolamento de esplenócitos imunizados para fusionamento são conhecidos na técnica. Padrões de fusionamento (por exemplo, células de mieloma murinas) e procedimentos de fusionamento também são conhecidos.

[369] Os anticorpos anti-IL-7R quiméricos ou humanizados descritos no presente documento podem ser preparados com base na sequência de um anticorpo monoclonal murino preparado conforme descrito acima. O DNA que codifica imunoglobulinas de cadeia pesada e leve pode ser obtido a partir do hibridoma murino de interesse e manipulado para conter sequências de imunoglobulinas não murinas (por exemplo, humanas) usando técnicas de biologia molecular padrão. Por exemplo, para criar um anticorpo quimérico, as regiões variáveis murinas podem ser ligadas a regiões constantes humanas usando métodos conhecidos na técnica (consulte, por exemplo, a Patente n° US

4.816.567 de Cabilly et al.). Para criar um anticorpo humanizado, as regiões CDR murinas podem ser inseridas em uma estrutura humana usando métodos conhecidos na técnica (consulte, por exemplo, a Patente n° US 5.225.539 de Winter, e as Patentes n° US 5.530.101;

5.585,089; 5.693.762 e 6.180,370 de Queen et al).

[370] Em uma modalidade, os anticorpos anti-IL-7R descritos no presente documento são anticorpos monoclonais humanos. Tais anticorpos monoclonais humanos direcionados contra IL-7Rɑ podem ser gerados usando camundongos transgênicos ou transcromossômicos que portam partes do sistema imunológico humano em vez do sistema murinho. Esses camundongos transgênicos e transcromossômicos incluem camundongos referidos como camundongos HuMAb e camundongos KM no presente documento, respectivamente, e são referidos coletivamente como "camundongos de Ig humano" no presente documento.

[371] O HUMAB-MOUSE® (Medarex, Inc.) contém minilocalizações de gene de imunoglobulina humana que codificam sequências de imunoglobulinas de cadeia pesada (µ e γ) e leve κ humanas não redispostas, juntamente com mutações alvejadas que inativam as localizações de cadeia p e k endógena (consulte, por exemplo, Lonberg, et al., (1994) Nature 368(6474): 856-859). Consequentemente, os camundongos exibem expressão reduzida de IgM ou κ murina, e, em resposta à imunização, os transgenes cadeia pesada e leve humanos introduzidos sofrem comutação de classe e mutação somática para gerar IgGK monoclonal humana de alta afinidade (Lonberg, N. et al. (1994), revisado acima em Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93, e Harding, F. e Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546). A preparação e uso de camundongos HuMab e as modificações genômicas portadas por tais camundongos são descritos adicionalmente em Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al., (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 90:3720- 3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al. (1994) Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6: 579-591; e Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851. Consulte adicionalmente as Patentes n° US

5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.789.650; 5.877.397;

5.661.016; 5.814.318; 5.874.299; e 5.770.429; todas de Lonberg e Kay; Patente n° US 5.545.807 de Surani et al.,', Publicação PCT n° WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 e WO 99/45962, todas de Lonberg e Kay; e Publicação PCT n° WO 01/14424 de Korman et al.

[372] Em certas modalidades, os anticorpos anti-IL-7R descritos no presente documento são criados usando um camundongo que porta sequências de imunoglobulinas humanas em transgenes e transcromossomos, como um camundongo que porta um transgene de cadeia pesada humano e um transcromossomo de cadeia leve humano. Tais camundongos referidos como “camundongos KM” no presente documento são descritos em detalhe na Publicação PCT WO 02/43478 de Ishida et al.

[373] Ainda adicionalmente, sistemas animais transgênicos alternativos que expressam genes de imunoglobulina humanos estão disponíveis na técnica e podem ser usados para criar anticorpos anti-IL- 7R descritos no presente documento. Por exemplo, um sistema transgênico alternativo referido como XENOMOUSE® (Abgenix, Inc.) pode ser usado; tais camundongos são descritos, por exemplo, nas Patentes n° US 5.939.598; 6.075.181; 6.114.598; 6.150.584 e 6.162.963 de Kucherlapati et al.

[374] Além disso, sistemas animais transcromossômicos alternativos que expressam genes de imunoglobulina humanos estão disponíveis na técnica e podem ser usados para criar anticorpos anti-IL- 7R descritos no presente documento. Por exemplo, os camundongos que portam tanto um transcromossomo de cadeia pesada humano quanto um cromossomo de cadeia leve humano, referidos como “camundongos TC" podem ser usados; tais camundongos são descritos em Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727). Adicionalmente, vacas que portam transcromossomos de cadeia pesada e leve humanos foram descritas na técnica (Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20:889-894) e podem ser usadas para criar anticorpos anti-IL-7R descritos no presente documento.

[375] Sistemas murinos adicionais descritos na técnica para criar anticorpos humanos, por exemplo, anticorpos anti-IL-7R humanos, incluem (i) o camundongo VELOCLMMUNE® (Regeneron Pharmaceuticals, Inc.), em que as regiões variáveis de cadeia pesada e leve de camundongo endógeno foram substituídas, através de recombinação homóloga, com regiões variáveis de cadeia pesada e leve humanas, ligadas operativamente às regiões constantes de camundongo endógeno, de modo que os anticorpos quiméricos (ser humano V/camundongo C) são criados nos camundongos, e, então, convertidos subsequentemente em anticorpos completamente humanos usando técnicas de DNA recombinante padrão; e (ii) o camundongo MEMO® (Merus Biopharmaceuticals, Inc.), em que o camundongo contém regiões variáveis de cadeia pesada humanas não redispostas, mas uma região variável de cadeia leve comum humana redisposta. Tais camundongos e uso dos mesmos para criar anticorpos, são descritos, por exemplo, nos documentos WO 2009/15777, US 2010/0069614, WO 2011/072204, WO 2011/097603, WO 2011/163311, WO 2011/163314, WO 2012/148873, US 2012/0070861 e US 2012/0073004.

[376] Anticorpos anti-IL-7R monoclonais humanos descritos no presente documento também podem ser preparados usando métodos de exibição de fago para triar bibliotecas de genes de imunoglobulina humanos. Tais métodos de exibição de fago para isolar anticorpos humanos são estabelecidos na técnica. Consulte por exemplo: As Patentes n° US 5.223.409; 5.403.484; e 5.571.698 de Uadner et al.; Patentes n° US 5.427.908 e 5.580.717 de Dower et al.; Patentes n° US

5.969.108 e 6.172.197 de McCafferty et al.; e Patentes n° US 5.885.793;

6.521.404; 6.544.731; 6.555.313; 6.582.915 e 6.593.081 de Griffiths et al.

[377] Anticorpos anti-IL-7R monoclonais humanos descritos no presente documento também podem ser preparados usando camundongos SCID em que células imunes humanas foram reconstruídas de modo que uma resposta de anticorpo humano possa ser gerada após imunização. Tais camundongos são descritos, por exemplo, nas Patentes n° US 5.476.996 e 5.698.767 de Wilson et al.

VI.A. IMUNIZAÇÕES

[378] Para gerar anticorpos completamente humanos para IL-7Rɑ, camundongos transgênicos ou transcromossômicos contendo genes de imunoglobulina humana (por exemplo, camundongos Hco12, HCo7 ou KM) podem ser imunizados com uma preparação purificada ou enriquecida do antígeno IL-7Rɑ e/ou células que expressam IL-7Rɑ ou fragmento do mesmo conforme descrito para outros antígenos, por exemplo, por Uonberg et al., (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild et al., (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851 e o documento WO 98/24884. Alternativamente, os camundongos podem ser imunizados com DNA que codifica IL-7Rɑ ou fragmento do mesmo. Em algumas modalidades, os camundongos podem ter 6 a 16 semanas de idade após a primeira infusão. Por exemplo, uma preparação purificada ou enriquecida (5 a 50 µg) do antígeno IL-7Rɑ recombinante pode ser usada para imunizar intraperitonealmente os camundongos HuMAb. No evento em que imunizações que usam uma preparação purificada ou enriquecida do antígeno IL-7Rɑ não resultam em anticorpos, os camundongos também podem ser imunizados com células que expressam IL-7Rɑ, por exemplo, uma linhagem celular, para promover respostas imunes. Linhagens celulares exemplificativas incluem linhagem celular CHO estável que superexpressa IL-7Rɑ (CHOZN).

[379] A experiência cumulativa com vários antígenos mostrou que camundongos transgênicos HuMAb respondem melhor quando inicialmente imunizados de modo intraperitoneal (IP) ou subcutâneo (SC) com antígeno em adjuvante de Ribi, seguido por imunização IP/SC em semanas alternadas (até um total de 10) com antígeno em adjuvante de Ribi. A resposta imune pode ser monitorada durante o protocolo de imunização com amostras plasmáticas que são obtidas por sangramentos retro-orbitais. O plasma pode ser triado por ELISA e FACS (conforme descrito abaixo), e camundongos com tituladores suficientes de imunoglobulina humana de anti-IL-7R podem ser usados para fusionamentos. Camundongos podem ser reforço intravenoso com antígeno 3 dias antes de sacrifício e remoção do baço e nodos linfáticos. Espera-se que seja necessário realizar 2 a 3 fusionamentos para cada imunização. Entre 6 e 24 camundongos são imunizados tipicamente para cada antígeno. Usualmente, cepas de HCo7, Hco12 e KM são usadas. Além disso, transgenes tanto de HCo7 quanto de Hco1l2 podem ser reproduzidos juntamente em um único camundongo que tem dois diferentes transgenes de cadeia pesada humanos (HCo7/Hco12). VI.B. GERAÇÃO DE HIBRIDOMAS QUE PRODUZEM ANTICORPOS MONOCLONAIS PARA IL-7Rɑ

[380] Para gerar hibridomas que produzem anticorpos anti-IL-7R monoclonais humanos descritos no presente documento, os esplenócitos e/ou células de nodo linfático de camundongos imunizados podem ser isolados e fusionados em uma linhagem celular imortalizada apropriada, como uma linhagem celular de mieloma murinas. Os hibridomas resultantes podem ser triados para a produção de anticorpos específicos de antígeno. Por exemplo, as únicas suspensões celulares de linfócitos esplênicos de camundongos imunizados podem ser fusionadas em células de mieloma murinas não secretoras Sp2/0 (ATCC, CRL 1581) com PEG. As células podem ser colocadas em placa em placa microtituladora de fundo plano, seguido por incubação em meio seletivo. Após várias semanas, células podem ser cultivadas em meio. Os poços individuais podem, então, ser triados por ELISA para anticorpos de IgM e IgG monoclonais humanos. Uma vez que o crescimento de hibridoma extensivo ocorre, o meio pode ser observado usualmente após 10 a 14 dias. Os hibridomas secretores de anticorpo podem ser substituídos, triados novamente, e, se ainda positivo para IgG humana, os anticorpos monoclonais podem ser subclonados pelo menos duas vezes ao limitar a diluição. Os subclones estáveis podem,

então, ser cultivados in vitro para gerar pequenas quantidades de anticorpo em meio de cultura de tecido para caracterização.

[381] Para purificar anticorpos monoclonais humanos, hibridomas selecionados podem ser crescidos em frascos giratórios de dois litros para purificação de anticorpo monoclonal. Os sobrenadantes podem ser filtrados e concentrados antes de cromatografia por afinidade com proteína A-sefarose (Pharmacia, Piscataway, N.J.). A IgG eluída pode ser verificada por eletroforese em gel e cromatografia líquida de alto desempenho para garantir pureza. A solução tampão pode ser trocada em PBS, e a concentração pode ser determinada por OD280 usando coeficiente de extinção de 1,43. Os anticorpos monoclonais podem ser tomados em alíquotas e armazenados. VI.C. GERAÇÃO DE TRANSFECTOMAS QUE PRODUZEM ANTICORPOS MONOCLONAIS PARA IL-7Rɑ

[382] Os anticorpos podem ser produzidos em um transfectoma d célula hospedeira usando, por exemplo, uma combinação de técnicas de DNA recombinante e métodos de transfecção de gene conforme é bem conhecido na técnica (Morrison, S. (1985) Science 229: 1202).

[383] Por exemplo, para expressar anticorpos ou fragmentos de anticorpo dos mesmos, os DNAs que codificam cadeias leves e pesadas de comprimento parcial ou total podem ser obtidos por técnicas de biologia molecular padrão (por exemplo, amplificação de PCR ou clonagem de cDNA usando um hibridoma que expressa o anticorpo de interesse) e os DNAs podem ser inseridos em vetores de expressão, de modo que os genes sejam ligados operativamente a sequências de transcrição e tradução. Nesse contexto, o termo “operativamente ligado” se destina a significar que um gene de anticorpo é ligado em um vetor de modo que sequências de controle transcricional ou translacional dentro do vetor cumpram sua função pretendida de regular a transcrição e tradução do gene de anticorpo. O vetor de expressão e as sequências de controle de expressão são escolhidos de modo a ser compatíveis com a célula hospedeira de expressão usada. O gene de cadeia leve de anticorpo e o gene de cadeia pesada de anticorpo podem ser inseridos em vetor separado ou ambos os genes são inseridos no mesmo vetor de expressão. Os genes de anticorpo são inseridos no vetor (ou vetores) de expressão por métodos padrão (por exemplo, ligação de sítios de restrição complementares no fragmento de gene de anticorpo e vetor, ligação de extremidade cegas se nenhum sítio de restrição estiver presente). As regiões variáveis de cadeia leve e pesada dos anticorpos anti-IL-7R descritos no presente documento podem ser usadas para criar genes de anticorpo de comprimento total de qualquer isótipo de anticorpo ao inserir os mesmos em vetores de expressão que já codificam regiões constantes de cadeia pesada e regiões constantes de cadeia leve do isótipo desejado de modo que o segmento de VH é ligado operativamente ao segmento (ou segmentos) de CH dentro do vetor e o segmento de VL é ligado operativamente ao segmento de C L dentro do vetor.

[384] Adicional ou alternativamente, o vetor de expressão recombinante pode codificar um peptídeo sinal que facilita a secreção da cadeia de anticorpo de uma célula hospedeira. O gene de cadeia de anticorpo pode ser clonado no vetor, de modo que o peptídeo sinal seja ligado na armação à terminação amino do gene de cadeia de anticorpo. O peptídeo sinal pode ser um peptídeo sinal de imunoglobulina ou um peptídeo sinal heterólogo (isto é, um peptídeo sinal de uma proteína não imunoglobulina). Sequências peptídicas de sinal que podem ser usadas são conhecidas na técnica. Consulte, por exemplo, Publicação Internacional n° WO 2018/013818 A2.

[385] Além dos genes de cadeia de anticorpo, vetores de expressão recombinantes podem portar sequências regulatórias que controlam a expressão dos genes de cadeia de anticorpo em uma célula hospedeira. O termo “sequência reguladora” se destina a incluir promotores, intensificadores e outros elementos de controle de expressão (por exemplo, sinais de poliadenilação) que controlam a transcrição ou tradução dos genes de cadeia de anticorpo. Tais sequências reguladoras são descritas, por exemplo, em Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)). Será observado por aqueles técnicos no assunto que o projeto do vetor de expressão, incluindo a seleção de sequências regulatórias, podem depender de tais fatores como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão de proteína desejado, etc. Sequências regulatórias preferenciais para expressão de célula hospedeira mamífera inclui elementos virais que direcionam altos níveis de expressão proteica em células mamíferas, como promotores e/ou melhoradores derivados de citomegalovírus (CMV), Vírus Símio 40 (SV40), adenovírus, (por exemplo, o promotor tardio principal de adenovírus (AdMLP) e polioma. Alternativamente, sequências regulatórias não virais podem ser usadas, como o promotor de ubiquitina ou promotor de β-globina. Ainda adicionalmente, elementos regulatórios compostos de sequências de diferentes fontes, como o sistema de promotor SRa, que contém sequências do promotor SV40 inicial e a repetição de terminal de vírus da leucemia de células T humanas tipo 1 (Takebe, Y. et al. (1988)AfoZ. Cell. Biol. 8:466-472).

[386] Além dos genes de cadeia de anticorpo e sequências regulatórias, vetores de expressão recombinantes podem portar sequências adicionais, como sequências que regulam replicação do vetor em células hospedeiras (por exemplo, origens de replicação) e genes marcadores selecionáveis. O gene marcador selecionável facilita a seleção de células hospedeiras em que o vetor foi introduzido (consulte, por exemplo, Patentes n° US 4.399.216, 4.634.665 e

5.179.017, todas de Axel et al). Por exemplo, tipicamente, o gene marcador selecionável confere resistência a fármacos, como G418, higromicina ou metotrexato em uma célula hospedeira em que o vetor foi introduzido. Genes marcadores selecionáveis preferenciais incluem o gene de di-hidrofolato redutase (DHFR) (para uso em células hospedeiras de dhfr com seleção/amplificação de metotrexato) e o gene neo (para seleção de G418).

[387] Para expressão das cadeias leve e pesada, o vetor de expressão (ou vetores de expressão) que codificam as cadeias pesada e leve é transfectado em uma célula hospedeira por técnicas padrão. Pretende-se que as várias formas do termo "transfecção abranjam uma ampla variedade de técnicas comumente usadas para a introdução de DNA exógeno em uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica, por exemplo, eletroporação, precipitação de fosfato de cálcio, transfecção de DEAE-dextrano e similares.

[388] Embora seja teoricamente possível expressar os anticorpos anti-IL-7R descritos no presente documento em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas, a expressão de anticorpos em células eucarióticas e, mais preferencialmente, células hospedeiras mamíferas, é a mais preferencial devido ao fato de que tais células eucarióticas e, em particular, células mamíferas, são mais prováveis que células procarióticas de reunir e secretar um anticorpo apropriadamente dobrado e imunologicamente ativo. A expressão procariótica de genes de anticorpo foi relatada como sendo ineficaz para produção de altos rendimentos de anticorpo ativo (Boss, M. A. and Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6: 12-13).

[389] Certas células hospedeiras mamíferas para expressar os anticorpos anti-IL-7R recombinantes descritos no presente documento incluem Ovário de Hamster Chinês (células CHO) (incluindo células dhfr-CHO, descritas em Urlaub e Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 77:4216-4220, usado com um marcador selecionável de DHFR,

por exemplo, conforme descrito em R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 759:601-621), células de mieloma de NSO, células COS e células SP2. Em particular, para uso com células de mieloma de NSO, outro sistema de expressão é o sistema de expressão de gene GS revelado nos documentos WO 87/04462, WO 89/01036 e EP 338,841. Quando vetores de expressão recombinantes que codificam genes de anticorpo são introduzidos em células hospedeiras mamíferas, os anticorpos são produzidos ao cultivar as células hospedeiras por um período de tempo suficiente para permitir a expressão do anticorpo nas células hospedeiras ou, mais preferencialmente, secreção do anticorpo no meio de cultura em que as células hospedeiras são crescidas. Anticorpos podem ser recuperados do meio de cultura com o uso de métodos padrão de purificação de proteína. VII. IMUNOCONJUGADOS, DERIVADOS DE ANTICORPO E

DIAGNÓSTICOS

[390] Os anticorpos anti-IL-7R descritos no presente documento podem ser usados para propósitos de diagnóstico, incluindo teste de amostra e imageamento in vivo, e, para esse propósito, o anticorpo (ou fragmento de ligação do mesmo) pode ser conjugado a um agente detectável apropriado para formar um imunoconjugado. Para propósitos de diagnóstico, agentes apropriados são marcações detectáveis que incluem radioisótopos, para imageamento de corpo inteiro, e radioisótopos, enzimas, marcações fluorescentes e outras identificações de anticorpo adequadas para teste de amostra.

[391] As marcações detectáveis que podem ser ligados a qualquer anticorpo de IL-7R descrito no presente documento podem ser qualquer um dos vários tipos atualmente usados no campo de diagnósticos in vitro, incluindo marcações particulados incluindo sóis de metal, como ouro coloidal, isótopos, como I125 ou Tc99 apresentado, por exemplo, com um agente quelante peptídica do tipo N2S2, N3S ou N4, cromóforos incluindo marcadores fluorescentes, marcadores luminescentes, marcadores fosforescentes e similares, bem como marcações enzimáticas que convertem um determinado substrato em um marcador detectável, e identificações polinucleotídicas que são reveladas após a amplificação, como por reação em cadeia de polimerase. Tais identificações adequadas incluem peroxidase de rábano silvestre, fosfatase alcalina e similares. Por exemplo, a identificação pode ser a fosfatase alcalina enzimática, detectada ao medir a presença ou formação de quimioluminescência após a conversão de substratos de 1,2 dioxetano, como adamantil metoxi fosforiloxi fenil dioxetano (AMPPD), fosfato de dissódio 3-(4-(metoxispiro{1,2-dioxetano-3,2'-(5'- cloro)triciclo{3.3.1.1 3,7}decan}-4- il) fenil (CSPD) bem como CDP e CDP-STAR® ou outros substratos luminescentes bem conhecidos para aqueles técnicos no assunto, por exemplo, os quelatos de lantanídeos adequados, como Térbio(III) e Európio(III). O meio de detecção é determinado pela identificação escolhida. A aparência da identificação ou seus produtos de reação pode ser obtida a olho nu, no caso em que a identificação é particulado e se acumula em níveis apropriados, ou usando instrumentos, como um espectrofotômetro, um luminômetro, um fluorímetro e similares, todos de acordo com a prática padrão.

[392] Em algumas modalidades, os métodos de conjugação resultam em ligações que são substancialmente (ou quase) não imunogênicas, por exemplo, de peptídeo (isto é, amida), sulfeto, (estericamente impedida), dissulfeto, hidrazona e outras ligações. Essas ligações são quase não imunogênicas e mostram estabilidade razoável no soro (consulte, por exemplo, Senter, P. D., Curr. Opin. Chem. Biol. 13 (2009) 235-244; documento WO 2009/059278; documento WO 95/17886).

[393] Dependendo da natureza bioquímica da fração e o anticorpo, diferentes estratégias de conjugação podem ser empregadas. No caso de a fração ocorrer naturalmente ou ser recombinante entre 50 e 500 aminoácidos, há procedimentos padrão em livros de texto que descrevem a química para síntese de conjugados proteicos, que podem ser seguidos facilmente pelos técnicos no assunto (consulte, por exemplo, Hackenberger, C. P. R., e Schwarzer, D., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 47 (2008) 10030-10074). Em uma modalidade, a reação de uma fração de maleinimida com um resíduo de cisteína contido no anticorpo ou na fração é usada. Essa é uma química de acoplamento especialmente adequada no caso, por exemplo, de um fragmento de Fab ou Fab' de um anticorpo ser usado. Alternativamente, em uma modalidade, o acoplamento à extremidade de terminal C do anticorpo ou fração é realizado. A modificação de terminal C de uma proteína, por exemplo, de um fragmento Fab, pode ser realizada conforme descrito (Sunbul, M. and Yin, J., Org. Biomol. Chem. 7 (2009) 3361-3371).

[394] Em geral, a reação específica de sítio e acoplamento covalente tem como base a transformação de um aminoácido natural em um aminoácido com uma reatividade que é ortogonal à reatividade dos outros grupos funcionais presentes. Por exemplo, uma cisteína específica em um contexto de sequência rara pode ser convertida enzimaticamente em um aldeído (consulte Frese, M. A., and Dierks, T., ChemBioChem. 10 (2009) 425-427). Também é possível obter uma modificação de aminoácido ao utilizar a reatividade enzimática específica de certas enzimas com um aminoácido natural em um determinado contexto de sequência (consulte, por exemplo, Taki, M. et al., Prot. Eng. Des. Sei. 17 (2004) 119-126; Gautier, A. et al. Chem. Biol. 15 (2008) 128-136; e Formação catalisada por protease de ligações C- N é usada por Bordusa, F., Highlights in Bioorganic Chemistry (2004) 389-403). A reação específica de sítio e o acoplamento covalente também podem ser alcançados pela reação seletiva de aminoácidos terminais com reagentes de modificação apropriados.

[395] A reatividade de uma cisteína de terminal N com benzonitrilas (consulte Ren, H. et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 48 (2009) 9658-9662) pode ser usada para alcançar um acoplamento covalente específico de sítio.

[396] A ligação química nativa também pode depender de resíduos de cisteína de terminal C (Taylor, E. Vogel; Imperiali, B, Nucleic Acids and Molecular Biology (2009), 22 (Protein Engineering), 65-96).

[397] O documento US6437095 Bl descreve um método de conjugação que tem como base a reação mais rápida de uma cisteína dentro de um trecho de aminoácidos negativamente carregados com uma cisteína localizada em um trecho de aminoácidos positivamente carregados.

[398] A fração também pode ser um peptídeo sintético ou imitação de peptídeo. No caso de um polipeptídeo é sintetizado quimicamente, os aminoácidos com reatividade química ortogonal podem ser incorporados durante a síntese (consulte, por exemplo, de Graaf, A. J. et al., Bioconjug. Chem. 20 (2009) 1281-1295). Uma vez que uma grande variedade de grupos funcionais ortogonais está em jogo e pode ser introduzida em um peptídeo sintético, a conjugação de tal peptídeo a um ligante é uma química padrão.

[399] A fim de obter um polipeptídeo monomarcado, o conjugado com estequiometria de 1:1 pode ser separado por cromatografia de outros produtos colaterais de conjugação. Esse procedimento pode ser facilitado ao usar um membro de par de ligação marcado com corante e um ligante carregado. Ao usar esse tipo de membro de par de ligação altamente de modo negativo carregado, polipeptídeos monoconjugados são separados facilmente de polipeptídeos não marcados e polipeptídeos que portam mais de um ligante, uma vez que a diferença em carga e peso molecular pode ser usada para separação. O corante fluorescente pode ser útil para purificar o complexo de componentes não ligados, como um aglutinante monovalente marcado.

[400] Em uma modalidade, a fração ligada a um anticorpo anti-IL- 7R é selecionada do grupo que consiste em uma fração de ligação, em uma fração de marcação e uma fração biologicamente ativa.

[401] Os anticorpos anti-IL-7R descritos no presente documento também podem ser conjugados a um agente terapêutico para formar um imunoconjugado, como um conjugado de anticorpo-fármaco (ADC). Agentes terapêuticos adequados incluem antimetabólitos, agentes alquilantes, aglutinantes de ranhura menor de DNA, intercaladores de DNA, reticuladores de DNA, inibidores de histona desacetilase, inibidores de exportação nuclear, inibidores de proteassoma, inibidores de topoisomerase I ou II, inibidores de proteína de choque térmico, inibidores de tirosina quinase, antibióticos e agentes antimitóticos. No ADC, o anticorpo e o agente terapêutico são, preferencialmente, conjugados através de um ligante clivável, como uma peptidila, dissulfeto ou ligante de hidrazona. Em outras modalidades, o ligante é um ligante de peptidila, como Val-Cit, Ala-Vai, Val-Ala-Val, Lys-Lys, Pro- Val-Gly-Val-Val (SEQ ID NO: 30), Ala-Asn-Val, Val-Leu-Lys, Ala-Ala- Asn, Cit-Cit, Val-Lys, Lys, Cit, Ser ou Glu. Os ADCs podem ser preparados conforme descrito nas Patentes n° US 7.087.600;

6.989.452; e 7.129.261; Publicações PCT WO 02/096910; WO 07/038658; WO 07/051081; WO 07/059404; WO 08/083312; e WO 08/103693; Publicações de Patente US 20060024317; 20060004081; e

20060247295.

[402] Os anticorpos anti-IL-7R, por exemplo, aqueles técnicos no assunto descritos no presente documento, também podem ser usados para detectar IL-7Rɑ, como IL-7Rɑ humano, por exemplo, IL-7Rɑ humano em tecidos ou amostras de tecido. Os anticorpos podem ser usados, por exemplo, em um ensaio ELISA ou em citometria de fluxo. Em certas modalidades, um anticorpo anti-IL-7R está em contato com células, por exemplo, células em um tecido, por um tempo apropriado para ligação específica para ocorrer, e, então, um reagente, por exemplo, um anticorpo que detecta o anticorpo anti-IL-7R, é adicionado. Ensaios exemplificativos são fornecidos nos Exemplos. O anticorpo anti-IL-7R pode ser um anticorpo completamente humano, ou pode ser um anticorpo quimérico, como um anticorpo que tem regiões variáveis humanas e regiões constantes murinas ou uma porção das mesmas. As etapas de lavagem podem ser incluídas após a incubação com o anticorpo e/ou reagente de detecção. Os anticorpos anti-IL-7R para uso nesses métodos não têm capacidade para ser ligado a uma identificação ou agentes de detecção, como um agente de detecção separado podem ser usados.

[403] Outros usos para anticorpos anti-IL-7R, por exemplo, como monoterapia ou terapia de combinação, dão fornecidos em qualquer outro lugar no presente documento, por exemplo, na seção pertencente a usos terapêuticos. VIII. MOLÉCULAS BIESPECÍFICAS

[404] Os anticorpos descritos no presente documento podem ser usados para formar moléculas biespecíficas. Um anticorpo anti-IL-7R revelado no presente documento pode ser derivado ou ligado a outra molécula funcional, por exemplo, a outro peptídeo ou proteína (por exemplo, outro anticorpo ou ligante para um receptor) para gerar uma molécula biespecífica que se liga a pelo menos dois diferentes sítios de ligação ou moléculas alvo. Várias citocinas foram descritivas como desempenhando um papel importante no início de muitas doenças inflamatórias, como em doença intestinal inflamatória. Exemplos não limitantes de tais citocinas incluem TNF-α, TL1α, IL-1β, IL-6, IL-18, IL- 12, IL-23, IL-17 e IL-27. Sanchez-Munoz F., et al., World J Gastroenterol 14(27): 4280-4288 (2008). Conforme descrito acima, células T regulatórias também são consideradas importantes em tratamento de doenças inflamatórias. Algumas das citocinas que são conhecidas como sendo importantes na indução de células T regulatórias incluem TGF-β, IL-10 e IL-2. Hoeppli R.E., et al., Front Immunol 6:61 (2015). Consequentemente, os anticorpos anti-IL-7R revelados no presente documento podem ser ligados a um anticorpo que se liga especificamente a qualquer uma das citocinas acima e regula, desse modo, o início de doenças inflamatórias e/ou a indução de células T regulatórias. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-IL-7R podem ser ligados a um anticorpo que trata uma doença ou distúrbio, por exemplo, uma doença inflamatória. Exemplos não limitantes de tais anticorpos incluem Natalizumabe (TYSABRI®), Infliximabe, Adalimumabe, Ustekinumabe, Golimumabe, Tocilizumabe, Vedolizumabe, Secokinumabe.

[405] O anticorpo descrito no presente documento pode ser, de fato, derivado ou ligado a mais de uma outra molécula funcional para gerar moléculas multiespecíficas que se ligam a dois diferentes sítios de ligação e/ou moléculas alvo; também se pretende que tais moléculas multiespecíficas sejam abrangidas pelo termo "molécula biespecífica" conforme usado no presente documento. Para criar uma molécula biespecífica descrita no presente documento, um anticorpo descrito no presente documento pode ser ligado funcionalmente (por exemplo, por acoplamento químico, fusionamento genético, associação não covalente ou de outro modo) a uma ou mais moléculas de ligação, como outro anticorpo, porção de ligação a anticorpo do mesmo, peptídeo ou mimético de ligação, de modo que resulte uma molécula biespecífica.

[406] Consequentemente, são fornecidas no presente documento moléculas biespecíficas que compreende pelo menos uma primeira especificidade de ligação para IL-7Rɑ e uma segunda especificidade de ligação para um segundo epítopo alvo. Em algumas modalidades, as moléculas biespecíficas podem incluir adicionalmente uma terceira especificidade de ligação.

[407] Em algumas modalidades, as moléculas biespecíficas descritas no presente documento compreendem como uma especificidade de ligação de pelo menos um anticorpo incluindo, por exemplo, um Fab, Fab', F(ab') 2, Fv ou um Fv de cadeia única (scFv). O anticorpo também pode ser um dímero de cadeia leve ou cadeia pesada ou qualquer fragmento mínimo do mesmo, como um Fv ou um construto de cadeia único conforme descrito em Ladner et al., Patente n° U.S.

4.946.778, cujo conteúdo é incorporado expressamente a título de referência.

[408] Embora os anticorpos monoclonais humanos sejam preferenciais, outros anticorpos que podem ser usados nas moléculas biespecíficas descritas no presente documento são anticorpos monoclonais murinos, quiméricos e humanizados.

[409] As moléculas biespecíficas descritas no presente documento podem ser preparadas ao conjugar as especificidades de ligação constituintes usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, cada especificidade de ligação da molécula biespecífica pode ser gerada separadamente e, então, conjugada entre si. Quando as especificidades de ligação são proteínas ou peptídeos, uma variedade de agentes de acoplamento ou reticulação pode ser usada para conjugação covalente. Exemplos de agentes de reticulação incluem a proteína A, carbodi-imida, N- succinimidil-S-acetil-tioacetato (SATA), 5,5'-ditiobis(ácido 2-nitrobenzoico) (DTNB), o-fenilenodimaleimida (oPDM), N-succinimidil-3-(2-piridylditio)propionato (SPDP) e ciclohaxano-1-carboxolato de sulfossuccinimidil 4-(N-maleimidometil) (sulfo-SMCC) (consulte, por exemplo, Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160: 1686; Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA82:8648). Outros métodos incluem aqueles descritos em Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. n° 78, 118-132; Brennan et al. (1985) Science

229:81-83), e Glennie et al. (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375). Alguns agentes de conjugação são SATA e sulfo-SMCC, ambos disponíveis junto à Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).

[410] Quando as especificidades de ligação são anticorpos, os mesmos podem ser conjugados através de ligação de sulfidrila da região de dobradiça de terminal C das duas cadeias pesadas. Em uma modalidade particular, a região de dobradiça é modificada para conter um número ímpar de resíduos de sulfidrila, preferencialmente, um, antes da conjugação.

[411] Alternativamente, ambas as especificidades de ligação podem ser codificadas no mesmo vetor e expressas e reunidas na mesma célula hospedeira. Esse método é particularmente útil em que a molécula biespecífica é uma proteína de fusionamento mAb x mAb, mAb x Fab, mAb x (scFv) 2, Fab x F(ab')2 ou ligante x Fab. Um anticorpo biespecífico pode compreender um anticorpo que compreende um scFv no terminal C de cada cadeia pesada. Uma molécula biespecífica descrita no presente documento pode ser uma molécula de cadeia única compreendendo um anticorpo de cadeia única e um determinante de ligação, ou uma molécula biespecífica de cadeia única que compreende dois determinantes de ligação. As moléculas biespecíficas podem compreender pelo menos duas moléculas de cadeia única. Métodos para preparar moléculas biespecíficas são descritos, por exemplo, na Patente n° US 5.260.203; Patente n° US 5.455.030; Patente n° US

4.881.175; Patente n° US 5.132.405; Patente n° US 5.091.513; Patente n° US 5.476.786; Patente n° US 5.013.653; Patente n° US 5.258.498; e Patente n° US 5.482.858.

[412] A ligação das moléculas biespecíficas a seus alvos específicos pode ser confirmada usando métodos reconhecidos na técnica, como ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA), radioimunoensaio (RIA), análise de FACS, bioensaio (por exemplo,

inibição de crescimento) ou ensaio Western Blot. Cada um desses ensaios detecta, em geral, a presença de complexos de proteína- anticorpo de interesse particular ao empregar um reagente marcado (por exemplo, um anticorpo) específico para o complexo de interesse. IX. KITS

[413] São fornecidos no presente documento kits que compreendem um ou mais anticorpos anti-IL-7R descritos no presente documento ou porções de ligação a antígeno dos mesmos, moléculas biespecíficas ou imunoconjugados dos mesmos. Em algumas modalidades, é fornecido no presente documento um pacote ou kit farmacêutico compreendendo um ou mais recipientes preenchidos com um ou mais ingredientes das composições farmacêuticas descritas no presente documento, como um ou mais anticorpos fornecidos no presente documento ou uma porção de ligação a antígeno dos mesmos, opcionalmente, uma instrução para uso. Em algumas modalidades, os kits contêm uma composição farmacêutica descrita no presente documento e qualquer agente profilático ou terapêutico, como aqueles descritos no presente documento. X. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS

[414] São fornecidas no presente documento composições que compreendem um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo descrito no presente documento que tem o grau de pureza desejado num veículo, excipiente ou estabilizante fisiologicamente aceitável (Remington’s Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA). Veículos, excipientes ou estabilizantes aceitáveis são não tóxicos para receptores nas dosagens e concentrações empregadas, e incluem tampões, como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicas; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (como cloreto de octadecildimetilbenzilamônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio;

fenol, butila ou álcool benzílico; alquilparabenos, como metila ou propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclo-hexanol; 3-pentanol; e m- cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos de aproximadamente 10 resíduos); proteínas, como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, como polivinilpirrolidona; aminoácidos, como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos, incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes como EDTA; açúcares como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contraíons formadores de sal, como sódio; complexos de metal (por exemplo, complexos Zn-proteína); e/ou tensoativos não iônicos, como TWEEN®, PLURONICS® ou polietilenoglicol (PEG).

[415] Em uma modalidade específica, as composições farmacêuticas compreendem um anticorpo ou porção de ligação a antígeno do mesmo, uma molécula biespecífica ou um imunoconjugado descrito no presente documento, e, opcionalmente, um ou mais agentes profiláticos ou terapêuticos adicionais em um veículo farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade específica, as composições farmacêuticas compreendem uma quantidade eficaz de um anticorpo ou porção de ligação a antígeno do mesmo descrito no presente documento, e, opcionalmente, um ou mais agentes profiláticos ou terapêuticos em um veículo farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, o anticorpo é o único ingrediente ativo incluído na composição farmacêutica. As composições farmacêuticas descritas no presente documento podem ser úteis na modulação (por exemplo, redução ou inibição) de atividade de IL-7 em uma célula T (por exemplo, célula T patogênica) e no tratamento de uma doença ou distúrbio, como uma doença inflamatória, por exemplo, doença intestinal inflamatória.

[416] Conforme usado no presente documento, "veículo farmaceuticamente aceitável" inclui qualquer um e todos os solventes,

meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de retardamento de absorção e similares que são fisiologicamente compatíveis. Em algumas modalidades, o veículo é adequado para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, parenteral, espinhal ou epidérmica (por exemplo, por injeção ou infusão). Dependendo da via de administração, o composto ativo, isto é, anticorpo, imunoconjugado ou molécula biespecífica, pode ser revestido em um material para proteger o composto da ação de ácidos e outras condições naturais que podem inativar o composto.

[417] Consequentemente, um objetivo da presente revelação consiste em fornecer uma formulação farmacêutica, que aprimora a estabilidade dos anticorpos anti-IL-7R e, assim, permite seu armazenamento a longo prazo. Em algumas modalidades, a formulação farmacêutica revelada no presente documento compreende: (a) um anticorpo anti-IL-7R; (b) um agente tamponante; (c) um agente estabilizante; (d) um sal; (e) um agente avolumador; e/ou (f) um tensoativo. Em algumas modalidades, a formulação farmacêutica é estável por pelo menos 1 mês, pelo menos 2 meses, pelo menos 3 meses, pelo menos 6 meses, pelo menos 1 ano, pelo menos 2 anos, pelo menos 3 anos, pelo menos 5 anos ou mais. Em algumas modalidades, a formulação é estável quando armazenada a 4 °C, 25 °C ou 40 °C.

AGENTE TAMPONANTE

[418] Os agentes tamponantes úteis para a presente invenção pode ser um ácido ou base fraca usado para manter a acidez (pH) de uma solução próxima a um valor escolhido após a adição de outro ácido ou base. Agentes tamponantes adequados podem maximizar a estabilidade das formulações farmacêuticas ao manter controle de pH da formulação. Agentes tamponantes adequados também podem garantir compatibilidade fisiológica ou otimizar solubilidade. Reologia, viscosidade e outras propriedades também podem ser dependentes do pH da formulação. Agentes tamponantes comuns incluem, mas sem limitação, histidina, citrato, succinato, acetato e fosfato. Em algumas modalidades, um agente tamponante compreende histidina (por exemplo, L-histidina) com agentes de isotonicidade e, potencialmente, ajuste de pH com um ácido ou base conhecido na técnica. Em certas modalidades, o agente tamponante é L-histidina. Em certas modalidades, o pH da formulação é mantido entre aproximadamente 2 e aproximadamente 10 ou entre aproximadamente 4 e aproximadamente 8.

AGENTE ESTABILIZANTE

[419] Agentes estabilizantes são adicionados a um produto farmacêutico a fim de estabilizar aquele produto. Tais agentes podem estabilizar proteínas de diversas formas diferentes. Agentes estabilizantes comuns incluem, mas sem limitação, aminoácidos, como glicina, alanina, lisina, arginina ou treonina, carboidratos, como glicose, sacarose, trealose, raffmose ou maltose, polióis, como glicerol, manitol, sorbitol, ciclodextrinas ou dextranos de qualquer tipo e peso molecular ou PEG. Em um aspecto da invenção, o agente estabilizante é escolhido a fim de maximizar a estabilidade de polipeptídeo FIX em preparações liofilizadas. Em certas modalidades, o agente estabilizante é sacarose e/ou arginina.

AGENTE AVOLUMADOR

[420] Agentes avolumadores podem ser adicionados a um produto farmacêutico a fim de adicionar volume e massa ao produto, facilitando, desse modo, a medição precisa e o manuseio do mesmo. Agentes avolumadores comuns incluem, mas sem limitação, lactose, sacarose, glicose, manitol, sorbitol, carbonato de cálcio ou estearato de magnésio.

TENSOATIVO

[421] Os tensoativos são substâncias anfipáticos com grupos liofílicos e liofóbicos. Um tensoativo pode ser aniônico, catiônico, zwitteriônico ou não iônico. Exemplos de tensoativos não iônicos incluem, mas sem limitação, etoxilato de alquila, etoxilato de nonilfenol, etoxilato de amina, óxido de polietileno, óxido de polipropileno, álcoois graxos, como álcool cetílico álcool oleílico, cocamida MEA, cocamida DEA, polisorbatos ou óxido de dodecil dimetilamina. Em algumas modalidades, o tensoativo é polissorbato 20 ou polissorbato 80.

[422] Em algumas modalidades, a formulação farmacêutica da presente revelação compreende:

[423] (a) aproximadamente 0,25 mg/ml a 250 mg/ml (por exemplo, 10 a 200 mg/ml) de um anticorpo anti-IL-7R;

[424] (B) aproximadamente 20 mM de histidina;

[425] (c) aproximadamente 260 mM de sacarose;

[426] (d) aproximadamente 0,5 mM de DTPA; e

[427] (e) aproximadamente 0,05% de Tween-80.

[428] A formulação pode compreender adicionalmente um ou mais dentre um sistema de tampão, um conservante, um agente de tonicidade, um agente quelante, um estabilizante e/ou um tensoativo bem como várias combinações dos mesmos. O uso de conservantes, agentes isotônicos, agentes quelantes, estabilizantes e tensoativos em composições farmacêuticas é bem conhecido para o técnico no assunto. Faz-se referência a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19ª edição, 1995.

[429] Em algumas modalidades, a formulação farmacêutica é uma formulação aquosa. Tal formulação é tipicamente uma solução ou uma suspensão, mas também pode incluir coloides, dispersões, emulsões e materiais de múltiplas fases. O termo "formulação aquosa" é definido como uma formulação que compreende pelo menos 50% em p/p de água. De modo semelhante, o termo "solução aquosa” é definido como uma solução compreendendo pelo menos 50 % em p/p de água, e o termo "suspensão aquosa" é definido como uma suspensão que compreende pelo menos 50 % em p/p de água.

[430] Em algumas modalidades, a formulação farmacêutica é uma formulação seca por congelamento à qual o médico ou paciente adiciona solventes e/ou diluentes antes do uso.

[431] As composições farmacêuticas descritas no presente documento também podem ser administradas em terapia de combinação, isto é, combinadas com outros agentes. Por exemplo, a terapia de combinação pode incluir um anticorpo de IL-7R descrito no presente documento combinado com pelo menos um outro agente terapêutico. Exemplos de agentes terapêuticos que podem ser usados em terapia de combinação podem incluir outros compostos, fármacos e/ou agentes usados para o tratamento de uma doença ou distúrbio (por exemplo, um distúrbio inflamatório). Tais compostos, fármacos e/ou agentes podem incluir, por exemplo, fármacos anti-inflamatórios ou anticorpos que bloqueiam ou reduzem a produção de citocinas inflamatórias. Em algumas modalidades, os agentes terapêuticos podem incluir um anticorpo anti-IP-10, um anticorpo anti-TNF-α (por exemplo, adalimumabe (HUMIRA ®), golimumabe (SIMPONI®), infliximabe (REMICADE®), certolizumabe pegol (CIMZIA®)), interferon beta-1a (por exemplo, AVONEX®, REBIF®), interferon beta-1b (por exemplo, BETASERON®, EXTAVIA®), acetato de glatiramer (por exemplo, COPAXONE®, GLATOPA®), mitoxantrona (por exemplo, NOVANTRONE®), fármacos anti-inflamatórios não esteroidais (NSAIDs), analgésicos, corticosteroides e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, os agentes terapêuticos podem incluir compostos, fármacos e/ou agentes que podem induzir a geração de células T regulatórias (por exemplo, células T regulatórias induzidas). Exemplos não limitantes de tais agentes terapêuticos incluem TGF-β,

IL-10, IL-2 e combinações dos mesmos.

[432] Os compostos farmacêuticos descritos no presente documento podem incluir um ou mais sais farmaceuticamente aceitáveis. Um "sal farmaceuticamente aceitável" se refere a um sal que retém a atividade biológica desejada do composto parenteral e não confere quaisquer efeitos toxicológicos indesejados (consulte, por exemplo, Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66: 1-19). Exemplos de tais sais incluem sais de adição e sais de adição de base. Sais de adição de ácido incluem aqueles derivados de ácidos inorgânicos não tóxicos, como clorídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromídrico, iodídrico, fosforoso e similares bem como ácidos orgânicos não tóxicos, como ácidos mono e dicarboxílico alifáticos, ácidos alcanoicos substituídos com fenila, ácidos hidroxi alcanoicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfônicos alifáticos e aromáticos e similares. Sais de adição de base incluem aqueles derivados de metais alcalinoterrosos, como sódio, potássio, magnésio, cálcio e similares bem como de aminas orgânicas não tóxicas, como N,N'-dibenziletilenodiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilenodiamina, procaína e similares.

[433] Uma composição farmacêutica descrita no presente documento também pode incluir um antioxidante farmaceuticamente aceitável. Exemplos de antioxidantes farmaceuticamente aceitáveis incluem: (1) antioxidantes solúveis em água, como ácido ascórbico, cloridrato de cisteína, bissulfato de sódio, metabissulfito de sódio, sulfito de sódio e similares; (2) antioxidantes solúveis em óleo, como palmitato de ascorbila, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propila, alfatocoferol e similares; e (3) agentes quelantes metálicos, como ácido cítrico, ácido etilenodiamina tetra- acético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico e similares.

[434] Exemplos de veículos aquosos e não aquosos adequados que podem ser usados nas composições farmacêuticas descritas no presente documento incluem água, etanol, polióis (como glicerol, propileno glicol, polietileno glicol e similares), e misturas adequadas dos mesmos, óleos vegetais, como óleo de oliva, e ésteres orgânicos injetáveis, como oleato de etila. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de materiais de revestimento, como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula exigido no caso de dispersões e pelo uso de tensoativos.

[435] Estas composições também podem conter adjuvantes, tais como conservantes, agentes umectantes, agentes emulsionantes e agentes dispersantes. A prevenção de presença de micro-organismos pode ser garantida tanto por procedimento de esterilização, supracitados, quanto pela inclusão de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabeno, clorobutanol, ácido fenol sórbico e similares. Pode ser desejável incluir agentes isotônicos, como açúcares, cloreto de sódio e similares nas composições. Adicionalmente, absorção prolongada da forma farmacêutica injetável pode ser provocada pela inclusão de agentes que atrasam a absorção, tal como monoestearato de alumínio e gelatina.

[436] Veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para preparação extemporânea de soluções ou dispersão injetáveis estéreis. O uso de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é conhecido na técnica. Exceto na medida em que se contempla qualquer meio ou agente convencional seja incompatível com o composto ativo, uso do mesmo nas composições farmacêuticas descritas no presente documento. Uma composição farmacêutica pode compreender um conservante ou pode ser desprovido de um conservante. Os compostos ativos suplementares podem ser incorporados nas composições.

[437] As composições terapêuticas precisa ser tipicamente e estáveis sob as condições de fabricação e armazenamento. A composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, lipossomo ou outra estrutura ordenada adequada à alta concentração de fármaco. O veículo pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol e polietileno glicol líquido e similares), e misturas adequadas dos mesmos. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento, como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula exigido no caso de dispersão e pelo uso de tensoativos. Em muitos casos, as composições podem incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois, como manitol, sorbitol ou cloreto de sódio na composição. Absorção prolongada das composições injetáveis pode ser ocasionada ao incluir na composição um agente que retarda absorção, por exemplo, sais monoestearatos e gelatina.

[438] Soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas ao incorporar o composto ativo na quantidade exigida em um solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, como exigido, seguido por microfiltração de esterilização. Em geral, dispersões são preparadas ao incorporar o composto ativo em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes exigidos daqueles enumerados no presente documento. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, alguns métodos de preparação são secagem a vácuo ou secagem por congelamento (liofilização) que produzem um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente desejado adicional de uma solução filtrada anteriormente estéril do mesmo.

[439] A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com um veículo material para produzir uma forma de dosagem única variará dependendo do indivíduo a ser tratado, e o modo de administração particular. A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com um material veículo para produzir uma forma de dosagem única será, em geral, aquela quantidade da composição que produz um efeito terapêutico. Em geral, dentre cem por cento, essa quantidade variará de aproximadamente 0,01 por cento a aproximadamente noventa e nove por cento de ingrediente ativo, de aproximadamente 0,1 por cento a aproximadamente 70 por cento ou de aproximadamente 1 por cento a aproximadamente 30 por cento de ingrediente ativo em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável.

[440] Os regimes de dosagem são ajustados para fornecer a resposta desejada ideal (por exemplo, uma resposta terapêutica). Por exemplo, um bolo único pode ser administrado, diversas doses divididas podem ser administradas ao longo do tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada conforme indicado pelas exigências da situação terapêutica. É especialmente vantajoso formular composições parenterais em forma de dosagem unitária para facilidade de administração e uniformidade de dosagem. A forma unitária de dosagem conforme usado no presente documento se refere a unidades fisicamente distintas adequadas como dosagens unitárias para os indivíduos a serem tratados; cada unidade contém uma quantidade predeterminada de composto ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em conjunto com o veículo farmacêutico exigido. A especificação para as formas unitárias de dosagem descritas no presente documento é ditada por e diretamente dependente (a) das características únicas do composto ativo e do efeito terapêutico particular a ser atingido, e (b) das limitações inerentes na técnica de composição de tal composto ativo para o tratamento de sensibilidade nos indivíduos.

[441] Para administração de um anticorpo anti-IL-7R, por exemplo, descrito no presente documento, a dosagem varia de aproximadamente

0,0001 a 100 mg/kg, e, mais usualmente, 0,01 a 5 ou 10 mg/kg, do peso corporal hospedeiro. Por exemplo, as dosagens podem ser 0,3 mg/kg de peso corporal, 1 mg/kg de peso corporal, 3 mg/kg de peso corporal, 5 mg/kg de peso corporal ou 10 mg/kg de peso corporal ou dentro da faixa de 1 a 10 mg/kg. Um regime de tratamento exemplificativo envolve a administração uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada três semanas, uma vez a cada quatro semanas, uma vez por mês, uma vez a cada 3 meses ou uma vez a cada 6 meses.

[442] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-IL-7R é administrado em uma dose fixa (regime de dose fixa). Em outras modalidades, o anticorpo anti-IL-7R é administrado em uma dose fixa com outro anticorpo. Em certas modalidades, o anticorpo anti-IL-7R é administrado em uma dose com base em peso corporal.

[443] Em alguns métodos, dois ou mais anticorpos monoclonais com diferentes especificidades de ligação são administradas simultaneamente, caso em que a dosagem de cada anticorpo administrada está dentro das faixas indicadas. O anticorpo é administrado usualmente em múltiplas ocasiões. Intervalos entre dosagens únicas podem ser, por exemplo, semanais, mensais, trimestrais ou anuais. Intervalos também podem ser irregulares conforme indicado ao medir níveis sanguíneos de anticorpo para o antígeno alvo no paciente. Em alguns métodos, a dosagem é ajustada para alcançar uma concentração de anticorpo plasmática de aproximadamente 1 a 1000 µg/ml e, em alguns métodos, aproximadamente 25 a 300 µg/ml.

[444] Um anticorpo pode ser administrado como uma formulação de liberação sustentada, caso em que se exige administração menos frequente. A dosagem e frequência variam dependendo da meia-vida do anticorpo no paciente. Em geral, os anticorpos humanos mostram a meia-vida mais longa, seguidos por anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos e anticorpos não humanos. A dosagem e frequência de administração pode variar dependendo de se o tratamento é profilático ou terapêutico. Em aplicações profiláticas, uma dosagem relativamente baixa é administrada em intervalos relativamente não frequentes durante um período de tempo longo. Alguns pacientes continuam a receber tratamento para o resto de suas vidas. Em aplicações terapêuticas, uma dosagem relativamente alta em intervalos relativamente curtos é exigida às vezes até que a progressão da doença seja reduzida ou finalizada, e até que o paciente mostre melhoria parcial ou completa de sintomas de doença. Posteriormente, o paciente pode ser administrado em um regime profilático.

[445] Os níveis de dosagem reais dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas descritos no presente documento podem ser variados com a finalidade de obter uma quantidade do ingrediente ativo que é eficaz para alcançar a resposta terapêutica desejada para um paciente particular, composição e modo de administração, sem ser tóxica para o paciente. O nível de dosagem selecionado dependerá de uma variedade de fatores farmacocinéticos incluindo a atividade das composições particulares descritas no presente documento empregadas, ou o éster, sal ou amida das mesmas, a via de administração, o tempo de administração, a taxa de excreção do composto particular que é usado, a duração do tratamento, outros fármacos, compostos e/ou materiais usados em combinação com as composições particulares empregadas, a idade, sexo, peso, condição, saúde geral e histórico médico anterior do paciente a ser tratado e fatores similares bem conhecidos nas técnicas médicas.

[446] Uma composição descrita no presente documento pode ser administrada através de uma ou mais vias de administração usando um ou mais dentre uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Conforme será observado pelo técnico no assunto, a via e/ou modo de administração dependerá dos resultados desejados. As vias de administração para os anticorpos anti-IL-7R descritos no presente documento podem incluir vias de administração intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, subcutânea, espinhal ou parenteral, por exemplo, por injeção ou infusão. A expressão “administração parenteral" conforme usado no presente documento significa modos de administração diferentes de administração enteral ou tópica, usualmente, por injeção, e inclui sem limitação injeção ou infusão intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnoide, intraespinhal, epidural e intrastemal.

[447] Alternativamente, um anticorpo descrito no presente documento poderia ser administrado potencialmente através de uma via não parenteral, como uma via de administração tópica, epidérmica ou mucosal, por exemplo, intranasal, oral, vaginal, retal, sublingual ou topicamente.

[448] Os compostos ativos podem ser preparados com veículos que protegerão o composto contra liberação rápida, como uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes, adesivos transdérmicos e sistemas de entrega microencapsulados. Polímeros biocompatíveis e biodegradáveis podem ser usados, como acetato de etileno vinila, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésterese ácido polilático. Muitos métodos para a preparação de tais formulações são patenteados ou, em geral, conhecidos para aqueles técnicos no assunto. Consulte, por exemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

[449] As composições terapêuticas podem ser administradas com dispositivos médicos conhecidos na técnica. Por exemplo, em uma modalidade particular, uma composição terapêutica descrita no presente documento pode ser administrada com um dispositivo de injeção hipodérmica sem agulho, como os dispositivos revelados nas Patentes n° US 5.399.163; 5.383.851; 5.312.335; 5.064.413; 4.941.880;

4.790.824; ou 4.596.556. Exemplos de implantes e módulos bem conhecidos para uso com anticorpos anti-IL-7R descritos no presente documento incluem: a Patente n° US 4.487.603, que revela uma bomba de microinfusão implantável para dispensar medicação em uma taxa controlada; a Patente n° US 4.486.194, que revela um dispositivo terapêutica para administrar medicamentos através da pele; a Patente n° US 4.447.233, que revela uma bomba de infusão de medicação para entregar medicação em uma taxa de infusão precisa; a Patente n° US

4.447.224, que revela um aparelho de infusão implantável de fluxo variável para entrega de fármaco contínua; a Patente n° US 4.439.196, que revela um sistema de entrega de fármaco osmótica que tem compartimentos com múltiplas câmaras; e a Patente n° US 4.475.196, que revela um sistema de entrega de fármaco osmótica. Essas patentes são incorporadas a título de referência no presente documento. Muitos outros tais implantes, sistemas de entrega e módulos são conhecidos para aqueles técnicos no assunto. XI. USOS E MÉTODOS

[450] Os anticorpos anti-IL-7R da presente revelação e as composições que compreendem tais anticorpos (por exemplo, composição farmacêutica, formulações, polinucleotídeos, vetores e células) podem ser usados para o tratamento de uma doença inflamatória (por exemplo, ao modular a razão de células T regulatórias para células T efetoras em um indivíduo).

[451] Consequentemente, em um aspecto, a presente revelação fornece métodos para tratar uma doença inflamatória em um indivíduo em necessidade dos mesmos, compreendendo administrar uma dose terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-IL-7R ao indivíduo. Exemplos de doenças inflamatórias que podem ser tratadas cm os presentes anticorpos anti-IL-7R incluem, mas sem limitação, doença inflamatória intestinal (DII), doença de Crohn (CD), colite ulcerativa (UC), síndrome do intestino irritável, artrite reumatoide (AR), psoríase, artrite psoriática, lúpus eritematoso sistêmico (SLE), nefrite lúpica, diabetes tipo I, doença de Grave , esclerose múltipla (MS), miocardite autoimune, doença de Kawasaki, doença arterial coronariana, doença pulmonar obstrutiva crônica, doença pulmonar intersticial, tireoidite autoimune, esclerodermia, esclerose sistêmica, osteoartrite, dermatite atópica, vitiligo, doença do enxerto contra hospedeiro, síndrome de Sjogren, autoimune nefrite, síndrome de Goodpasture, polineuropatia desmielinizante inflamatória crônica, alergia, asma e outras doenças autoimunes resultantes de inflamação aguda ou crônica.

[452] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-IL-7R são adequados para uso no tratamento de indivíduos com doença intestinal inflamatória. A Doença Inflamatória Intestinal (DII) é uma doença que pode afetar qualquer parte do trato gastrointestinal da boca ao ânus, causando uma ampla variedade de sintomas. A IBD causa principalmente dor abdominal, diarreia (que pode ser sangrenta), vômito ou perda de peso, mas também pode causar complicações fora do trato gastrointestinal, como erupções cutâneas, artrite, inflamação dos olhos, fadiga e falta de concentração. Os pacientes com IBD podem ser divididas em duas classes principais, aqueles com colite ulcerativa (UC) e aqueles com doença de Crohn (CD). A DC geralmente envolve o íleo e o cólon, mas pode afetar qualquer região do intestino e costuma ser descontínua (áreas focalizadas de doença que se espalham por todo o intestino). A UC envolve sempre o reto (cólon) e é mais contínua. Na DC, a inflamação é transmural, resultando em abscessos, fístulas e estenoses, enquanto na UC, a inflamação é tipicamente confinada à mucosa. Não há nenhuma cura farmacêutica ou cirúrgica para doença de Crohn, enquanto alguns pacientes com UC podem ser curados por remoção cirúrgica do cólon. As opções de tratamento são restritas para controlar sintomas, mantendo a remissão e prevenindo a recaída. A eficácia na doença inflamatória intestinal na clínica pode ser medida como uma redução na pontuação do Índice de Atividade da Doença de Crohn (CDAl) para DC, que é uma escala de pontuação que tem como base testes laboratoriais e um questionário de qualidade de vida. Em modelos animais, a eficácia é principalmente medida pelo aumento do peso e também pelo índice de atividade da doença (DAI), que é uma combinação da consistência das fezes, peso e sangue nas fezes.

[453] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-IL-7R da presente revelação são adequados para uso no tratamento de indivíduos com artrite reumatoide. A artrite reumatoide (RA) é uma doença sistêmica que afeta quase, senão todo o corpo, e é uma das formas mais comuns de artrite. A mesma é caracterizada por inflamação das juntas, que causa dor, rigidez, calor, vermelhidão e inchaço. Essa inflamação é uma consequência de consequência da invasão das articulações por células inflamatórias, e essas células inflamatórias liberam enzimas que podem digerir o osso e a cartilagem. Como um resultado, essa inflamação pode levar a danos graves aos ossos e cartilagens e à deterioração das articulações e dores intensas, entre outros efeitos fisiológicos. A articulação envolvida pode perder seu formato e alinhamento, resultando em dor e perda de movimento. Há vários modelos animais para artrite reumatoide conhecidos na técnica. Por exemplo, no modelo de artrite induzida por colágeno (CIA), camundongos desenvolveram uma artrite inflamatória que se assemelha artrite reumatoide humana. Uma vez que CIA compartilha as mesmas características imunológicas e patológicas similares à RA, isso torna um modelo adequado para triar compostos anti-inflamatórios humanos potenciais. A eficácia nesse modelo é medida ao diminuir o inchaço de juntas. A eficácia na RA na clínica é medida pela capacidade para reduzir os sintomas em pacientes, que é medida como uma combinação de edema articular, taxa de sedimentação de eritrócitos, níveis de proteína C reativa e níveis de fatores séricos, como anticorpos anti-proteína citrulinada.

[454] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-IL-7R conforme revelado no presente documento são adequados para uso no tratamento de indivíduos com psoríase. A psoríase é um distúrbio inflamatório mediado por célula T da pele que pode causar desconforto considerável. A mesma é uma doença para a qual não existe cura e afeta pessoas de todas as idades. Embora indivíduos com psoríase moderada possam controlar frequentemente sua doença com agentes tópicos, mais de um milhão de pacientes em todo o mundo exigem tratamento de luz ultravioleta ou terapia imunossupressora sistêmica. Infelizmente, a inconveniência e riscos de radiação ultravioleta e as toxicidades de muitas terapias limitam seu uso a longo prazo. Além disso, pacientes têm usualmente recorrência de psoríase, e, em alguns casos, reaparecem logo após a interrupção de terapia imunossupressora. Um modelo recentemente desenvolvido de psoríase com base na transferência de células CD4+ T imita muitos aspectos de psoríase humana e, portanto, pode ser usado para identificar compostos adequados para uso em tratamento de psoríase (Davenport et al., Internat. Immunopharmacol 2. 653-672, 2002). A eficácia nesse modelo é uma medida por redução em patologia cutânea usando um sistema de pontuação. Similarmente, a eficácia em pacientes é medida por uma diminuição em patologia cutânea.

[455] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-IL-7R são adequados para uso no tratamento de indivíduos com artrite psoriática. A artrite psoriática (AP) é um tipo de artrite inflamatória que ocorre em um subconjunto de pacientes com psoríase. Nesses pacientes, a patologia/sintomas cutânea é acompanhada por um inchaço nas juntas similares àquele observado em artrite reumatoide. Apresenta áreas vermelhas e irregulares de inflamação da pele com descamação. A psoríase afeta frequentemente as pontas dos cotovelos e joelhos, o couro cabeludo, o umbigo e ao redor das áreas genitais ou ânus. Aproximadamente 10% dos pacientes que têm psoríase também desenvolveram uma inflamação de suas juntas associada.

[456] Em termos da presente revelação, tratamentos profiláticos, paliativos, sintomáticos e/ou curativos podem representar aspectos separados da revelação. Um anticorpo da invenção pode ser administrado parenteralmente, como intravenosa, como intramuscular, como subcutaneamente. Alternativamente, um anticorpo da invenção pode ser administrado através de uma via não parenteral, como oral ou topicamente. Um anticorpo da invenção pode ser administrado profilaticamente. Um anticorpo da invenção pode ser administrado terapeuticamente (sob demanda).

[457] Todas as referências citadas acima bem como todas as referências citadas no presente documento são incorporadas em suas totalidades a título de referência no presente documento.

[458] Os seguintes exemplos são oferecidos a título de ilustração e não a título de limitação.

EXEMPLOS EXEMPLO 1: CARACTERIZAÇÃO DO ANTICORPO ANTI-IL-7R

HUMANO

[459] Um anticorpo anti-IL-7R revelado no presente documento (compreendendo VH conforme apresentado na SEQ ID NO: 19 e VL conforme apresentado na SEQ ID NO: 20, consulte a Tabela 12) ("Anticorpo A") foi ensaiado para se ligar a células que expressam IL- 7Ra. IL-7Ra é expresso principalmente em células T humanas e em menor extensão em monócitos.

[460] Conforme mostrado na Tabela 1 (abaixo), o Anticorpo A teve capacidade para se ligar a IL-7Rɑ expresso em vários subconjuntos de células T (CD4+ CD45RA+, CD4+CD45RA-, CD8+CD45RA+ e CD8+CD45RA-) de sangue total (valor de EC50 que varia de cerca de 1,4 a 3,3 nM). Além disso, o Anticorpo A não antagoniza a sinalização de IL-7Rɑ (consulte a Tabela 2) e teve capacidade para bloquear de modo eficaz IL-7 a ligação ao IL-7Rɑ expresso em células T CD4 +CD45RA+ (conforme medido por ativação de pSTAT5). Em comparação a um anticorpo anti-IL-7R de referência ("PFE A3312F"), o Anticorpo A foi muito mais potente em bloqueio da ligação de IL-7 a IL-7Rɑ. Quando as células T CD4+CD45RA+ de sangue total foram estimuladas com IL-7 (por exemplo, 2,0 ng/ml) na presença de Anticorpo A, houve uma ativação de pSTAT5 mínima (IC50 = 2,1±1,4 nM). Em contrapartida, com PFE A3312F, a ativação de pSTAT5 foi significativamente superior (IC50 = 15,8±4,0). TABELA 1. PROPRIEDADES IN VITRO DE ANTICORPO A EM COMPARAÇÃO A UM ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-IL-7R DE REFERÊNCIA (PFE A3312F) Anticorpo Anti-IL- Tipo de célula Subconjuntos Ensaio Estímulos PFE A3312F 7R CD4+CD45RA+ 1,4 ±0,7 1,5 ±0,5 células T CD4+CD45RA- EC50 nM de 3,3 ± 1,6 3,1 ±0,9 -- (Sangue Total) CD8+CD45RA+ Ligação 2,0 ±0,9 1,7 ±0,4 CD8+CD45RA- 1,9± 1,4 2,7 ±0,8 células T CD4+CD45RA+ pSTAT5 IC50 IL-7 (0,25 ng/ml) 0,6 ±0,7 1,0 ±0,9 (Sangue Total) CD4+CD45RA+ (nM) IL-7 (2,0 ng/ml) 2,1 ± 1,4 15,8 ±4,0 IC50 de Monócitos Purificado Produção de TSLP 24 ±4,5 0,08 ±0,3 MCP1 (nM)

[461] O Anticorpo A também diferiu do anticorpo de referência em sua capacidade para bloquear ativação mediada por TSLP de monócitos. Conforme mostrado na Tabela 1 (última fileira), os monócitos que foram estimulados com TSLP na presença de PFE A3312F falharam em produzir proteína quimioatrativa de monócito 1 (MCP-1) (IC50 = 0,08±0,3 nM), sugerindo que PFE A3312F teve capacidade para se ligar a IL-7Rɑ expresso nos monócitos e bloquear de modo eficaz a ligação de TSLP a IL-7Rɑ. Em contrapartida, com o Anticorpo A, os monócitos estimulados por TSLP produziram quantidades significativamente superiores de MCP1 (IC50 = 24±4,5).

[462] A seguir, para avaliar se a incapacidade par bloquear ativação estimulada por TSLP de monócito foi devido a questões de ligação, o sangue total de doadores humanos foi incubado com concentrações variadas de Anticorpo A. Então, a intensidade de fluorescência média (MFI) da ligação de Anticorpo A a IL-7Rɑ expressa em células não T (CD3-) foi medida usando citometria de fluxo. Conforme mostrado na Figura 1, mesmo em concentrações tão alta quanto 70 nM, houve uma ligação mínima de Anticorpo A às células não T.

[463] Coletivamente, os dados acima indicados que, em comparação a outros anticorpos conhecidos (PFE A3312F), o anticorpo anti-IL-7R revelado no presente documento (Anticorpo A) é mais potente em bloquear de ligação de IL-7 e é seletivo para IL-7Rɑ expresso em células T, mas não em células não T (por exemplo, monócitos e outras células CD3- no sangue total). EXEMPLO 2: ANÁLISE DA ATIVIDADE AGONÍSTICA DO ANTICORPO ANTI-IL-7R

[464] A seguir, para avaliar se a ligação do anticorpo anti-IL-7R pode induzir a sinalização de IL-7Rɑ células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) e sangue total foram incubados com diferentes concentrações de Anticorpo A (100, 50, 25, 13, 6, 3, 2, 1 e 0 nM). Um anticorpo de controle de isótipo e IL-7 (2 nM) foram usados como controles negativos e positivos, respectivamente.

[465] Conforme mostrado na Tabela 2, em todas as concentrações testadas, o Anticorpo A não induziu ativação de pSTAT5 quando em comparação ao controle negativo. Esse resultado demonstra que o Anticorpo A não antagoniza a sinalização após a ligação a IL-7Rɑ TABELA 2. ATIVIDADE AGONÍSTICA IN VITRO EM PBMCS

HUMANAS SANGUE TOTAL HUMANO CONFORME AVALIADO

USANDO ATIVAÇÃO DE PSTAT5 PBMCs Anticorpo d355 + BMS DR sozinho d173 + BMS DR sozinho d341 +BMS DR sozinho anti-IL-7R Anticorpo anti- Anticorpo anti- Anticorpo anti- (Anticorpo IL-7R sozinho IL-7R sozinho IL-7R sozinho A) (nM) % de controle % de controle % de controle (ativação de (ativação de (ativação de pSTAT5) pSTAT5) pSTAT5) 100 786 2 1836 6 1083 2 50 868 2 915 0 1386 3 25 894 3 1072 1 1333 3 13 1038 4 1060 1 1373 3 6 941 3 1031 1 1476 4 3 938 3 1467 4 1711 5 2 896 3 1075 1 1582 4 1 1174 5 1467 4 1787 5 0 597 0 841 0 797 0 Controle de 934 3 1174 2 1325 3 Isótipo Estímulos de IL-7 de 11520 100 16575 100 19406 100 2 nM Anticorpo Sangue Total anti-IL-7R d232 + BMS DR sozinho d331 + BMS DR sozinho d344 + BMS DR sozinho (Anticorpo Anticorpo anti- Anticorpo anti- Anticorpo anti- A) (nM) IL-7R sozinho IL-7R sozinho IL-7R sozinho % de controle % de controle % de controle (ativação de (ativação de (ativação de pSTAT5) pSTAT5) pSTAT5) ativação) ativação) ativação) 100 14704 -4 1055 -10 8328 -20 50 17982 0 1001 -15 9524 -9 25 16463 -2 1140 -3 11526 10 13 15041 -4 1031 -12 11212 7 6 19004 1 976 -17 10891 4 3 15281 -4 958 -19 9132 -13 2 21046 3 1016 -14 14779 41 1 17489 -1 1045 -11 10224 -2 0 18350 0 1178 0 10459 0 Controle de 18648 0 952 -19 14024 34 Isótipo Estímulos de IL-7 de 85984 100 7371 526 33102 216 2 nM EXEMPLO 3: REATIVIDADE CRUZADA DO ANTICORPO ANTI-IL-7R

EM MACACO CINOMOLGO

[466] Para avaliar a reatividade cruzada de Anticorpo A, a afinidade de ligação a IL- 7Rɑ humano ou cinomolgo foi avaliada usando Ressonância de Plasmon de Superfície (SPR). Brevemente, os experimentos foram realizados em um instrumento BIACORE™ T200 (GE Healthcare, Chicago, IL, EUA) em um tampão de execução que consiste em 10 mM de NaPO4, 130 mM de NaCl, 0,05% de p20 (PBS- T) em pH 7,4 ou pH 6,0. A superfície de chip foi preparada ao imobilizar a proteína A nas células de fluxo 1, 2, 3 e 4 de um chip de sensor CM5 usando etil (dimetilaminopropil) carbodi-imida/NHS em uma densidade de 4000 RU. O Anticorpo A foi capturado usando um tempo de contato de 30 segundos em 10 µl/min. Os construtos de domínio extracelular purificados (internamente gerados) de IL7R humano identificado com his ou IL7R de cinomolgo foram testados para ligação usando uma diluição em série de 2 vezes de 500 nM a 7,8 nM, com tempo de associação de 180 s e tempo de dissociação de 360 s em 30 µl/min. A regeneração entre ciclos foi realizada usando injeções de 2 x 30 segundos de 10 mM de glicina-HCL de pH 1,5. Os dados foram analisados usando o software Biacore T200 (GE Healthcare), e ajustados a um modelo Langmuir de 1:1.

[467] Conforme mostrado na Tabela 3, o Anticorpo A teve capacidade para se ligar a IL-7Rɑ tanto humano quanto de cinomolgo com afinidade similar. Por exemplo, em pH 7,4, o Anticorpo A ligado a IL-7Rɑ humano e de cinomolgo com valores de KD de 1,3 nM e 1,7 nM, respectivamente. Em pH 6,0, a ligação foi aproximadamente 4 vezes mais fraca, sugerindo que a ligação de anti-IL-7R a IL-7Rɑ tanto humano quanto de cinomolgo é dependente de pH. Em contrapartida, PFE A3312F não demonstrou ligação dependente de pH, com valores de KD de 4,4 nM em pH 7,4 e 3,9 nM e pH 6,0. A análise de SPR também demonstrou a ligação muito fraca a todos os FcγRs humanos e de cinomolgo em pH neutro, e a ligação mais forte em pH 6,0, conforme esperado para isótipo hIgG1.3f. TABELA 3. AFINIDADE DE LIGAÇÃO DE ANTICORPO ANTI-IL-7R (ANTICORPO A) PARA IL-7Rɑ HUMANO OU DE CINOMOLGO Alvo Temperatura pH ka (1/Ms) kd (1/s) KD (nM) IL-7Rɑ 7,4 3,1E+05 4,0E-04 1,3 37 °C humano 6,0 2,4E+05 1,3E-03 5,3 IL-7Rɑ de 7,4 2,9E+05 5,0E-04 1,7 37 °C cinomolgo 6,0 2,3E+05 1,6E-03 7,0

[468] Para confirmar os dados de reatividade cruzada acima, a ligação celular e bloqueio funcional também foram avaliados. Brevemente, uma única dose (0,1, 0,5 ou 3,0 mg/kg) de Anticorpo A foi administrada a macacos cinomolgos. Então, no dia 8 após a administração, PBMCs foram isoladas dos animais. Para medir a capacidade para bloquear a ligação de IL-7 a IL-7Rɑ de cinomolgo, as PBMCs foram estimuladas com IL-7 de cinomolgo recombinante (5 pM) por 15 minutos e atividade de pSTAT5 e ocupação de receptor em células CD4+ T foram avaliadas usando citometria de fluxo.

[469] Conforme mostrado na Figura 2A, em uma concentração de anticorpo anti-IL-7R sérica de cerca de 310 a 350 ng/ml (~2,1 a 2,3 nM), maior que 95% do IL-7Rɑ expresso em células T CD4+ de cinomolgo foi ocupado. Similarmente, conforme mostrado na Figura 2B, houve uma correlação inversa direta entre concentração de anticorpo anti-IL-7R sérica e a atividade de pSTAT5. Em concentração sérica entre 670 e 2200 ng/ml (4,5-15 nM), houve inibição de STAT5 maior que 90%. Com base nesses resultados, seriam necessárias concentrações mínimas de aproximadamente 2 a 15 nM para bloquear totalmente o IL-7Rɑ in vivo.

[470] Os dados acima demonstram coletivamente que o anticorpo anti-IL-7R revelado no presente documento (Anticorpo A) é reativo completamente de modo cruzado em macacos cinomolgos e pode se ligar de modo eficaz e bloquear a sinalização induzida por IL- 7de IL- 7Rɑde cinomolgo. EXEMPLO 4: CARACTERÍSTICAS ADICIONAIS DO ANTICORPO ANTI-IL-7R

[471] As características analíticas e biofísicas de Anticorpo A são fornecidas na Tabela 4.

[472] As propriedades analíticas e biofísicas de Anticorpo A foram favoráveis para desenvolvimento contínuo. A identidade do anticorpo foi confirmada por análise de espectrometria de massa (Análise de Massa

Intacta & Mapeamento de Peptídeo). O anticorpo era > 99% monomérica conforme testado por cromatografia de exclusão de tamanho analítica. Um único sítio de glicosilação de N foi confirmado em N297 na cadeia pesada com um perfil de glicano correspondente ao perfil de glicano de anticorpos monoclonais expressos em CHO (G0F, G1F & G2F). O perfil da variante de carga, conforme determinado por focagem isoelétrica capilar com imagem, mostrou um pl para o pico principal em 8,5 (60%) com 34% de variantes ácidas e 6% básicas. A estabilidade térmica (Tm1 = 70,0 °C, Tm2 = 75,4 °C, Tm3 = 84,2 °C) estava dentro da faixa para um anticorpo monoclonal de IgG1.3f humano típico. TABELA 4. CARACTERÍSTICAS ANALÍTICAS E BIOFÍSICAS DO ANTICORPO ANTI-IL-7R Propriedade Método Resultados LC-MS Massa Intacta confirmada Mapa de Sequência confirmada por mapa de peptídeo tríptico Identidade peptídeo de com 100% de cobertura de cadeia pesada e cadeia LC-MS/MS leve. Ocupação de glicosilação de 99,8%) SEC 99,6% de monômero, 0,4% de HMW Pureza/Homogenei SEC-MALS Massa de monômero esperada dade 56% de G0F, 40% de G1F e 4% G2F observados em LC-MS cadeia pesada.

Pico Principal pl = 8,53 (59,8%); Variantes ácidas = cIEF 34,4%; Variantes Básicas = 5,8% Reduzido: 2 bandas predominantes de ~50 kDa & ~25 kDa SDS-PAGE Não Reduzido: Banda predominante de ~150 kDa com fragmentos menores de ~100 kDa, ~25 kDa (artefatos de condições de execução de SDS) Estabilidade DSC Tm1 = 70,0 °C, Tm2 = 75,4 °C, Tm3 = 84,2 °C Térmica

[473] Características de estabilidade de Anticorpo A são fornecidas na Tabela 5. TABELA 5. ESTABILIDADE DO ANTICORPO ANTI-IL-7R (ANTICORPO A) Método (ou Propriedade Resultados Métodos)

Congelamento/Descongela mento UV, SEC, DLS, Nenhum risco de estabilidade de (2 h @ -80 °C, 4 h @ RT x iCIEF congelamento/descongelamento revelado 3)

Pelo menos 150 mg/ml em tampão de Perfil de formulação de plataforma (20 mM de UV, SEC Solubilidade/Concentração histidina, 260 mM de sacarose, 0,05 mM de DTPA, 0,05% de Tween-80, pH 6,0)

Triagem de pH para Optim2 Estabilidade conformacional ideal = pH 6 a Estabilidade (início de Tm e 8 Conformacional e Coloidal Tagg) Estabilidade coloidal ideal = pH 5 a 6

Triagem de Tampão e Optim2 (início Estabilizantes: sacarose, sorbitol, glicerol Excipiente de Tm e Tagg)

12 w @ 40 °C = nenhuma alteração em HMW ou LMW observada

12 w @ 25 °C = <0,1%/aumento mensal em Estabilidade Acelerada 150 SEC, cIEF, HIC, HMW 0,3%/aumento mensal em LMW mg/ml 12 w @ 4 °C, 25 °C LC-MS/MS e 40 °C em formulação de (mapeamento 12 w @ 40 °C = ~1%/aumento mensal em plataforma truncada (20 de peptídeo e HMW ~1,3%/aumento mensal em LMW mM de histidina, 260 mM massa intacta), Nenhum aumento em Rh ou Pd observado de sacarose, 0,05 mM de Biacore, DTPA, 0,05% de Tween- bioensaio, UV- 12 w @ 40 °C = 5,5%/desamidação de N54 80, pH 6,0) Vis, DLS mensal em CDR2 de HC, 3,4%/desamidação de D30/31 mensal em CDR1 de HC, 10%/desamidação de VSNK mensal

Estudo de Estabilidade de 350 rpm @ TA Nenhuma formação de HMW induzida por Agitação (Conduzido em em tampão de agitação observada

Método (ou Propriedade Resultados Métodos) 150 mg/ml) formulação ± 0,05% de PS80 por 7 dias Solução atingiu 8 cP em 100 mg/ml e 18,8 Determinar perfil cP em 140 mg/ml. Viscosidade foi prevista de Avaliação de Viscosidade como limitando concentração de concentração/vi formulação passível de seringa em ~125 scosidade mg/ml

[474] Uma avaliação de formulação preliminar, incluindo a pesquisa de pH ideal, composição de tampão e excipientes, e um estudo de estabilidade acelerado foi realizada para o anticorpo anti-IL- 7R divulgado neste documento usando material derivado de HEK. Nenhuma questão de estabilidade física foi observada durante o estresse de congelamento-descongelamento (5 ciclos) em uma formulação de plataforma truncada (20 mM de histidina, 260 mM de sacarose, 0,05 mM de DTPA, pH 6,0), ou devido a estresses de agitação, com ou sem tensoativo, a 150 mg/ml. A adição de um tensoativo não foi avaliada durante essas investigações. Estudos de degradação forçada a 150 mg/ml foram configurados a 4, 25 e 40°C. As modificações químicas na região CDR foram observadas sob a condição de maior estresse (3 meses a 40 °C), que se correlacionou com mudanças tanto em KD quanto em Rmáx em um ensaio de atividade de SPR. As alterações químicas menores foram observadas nos mesmos sítios de CDR sob armazenamento a 25 °C. Nenhuma alteração foi observada na atividade de amostras armazenadas a 4 ou 25 °C. As alterações esperadas de desamidação de VSNK também foram observadas.

[475] As avaliações de viabilidade realizadas usando material derivado de HEK também demonstraram mudanças dependentes do tempo e da temperatura em variantes tanto HMW quanto LMW (aumentos de ~ 1%/mês e ~ 1,3%/mês, respectivamente, a 40°C). O HMW permaneceu inalterado sob armazenamento a 4°C, enquanto aumentava 0,3%/mês a 25°C A formação de LMW observada sob armazenamento a 40 °C foi caracterizada por massa precisa como a espécie cumulativa de 1 perda de Fab bem como o braço de Fab, supostamente o resultado de clipagem química em uma sequência conservada na região superior da dobradiça. Alterações em HMW e LMW a partir desses estudos derivados de HEK estão dentro das expectativas para um mAb IgG1.3 e suportam a progressão da molécula.

[476] A limitação de viscosidade para o Anticorpo A foi observada como um risco na otimização inicial do chumbo. O perfil de viscosidade- concentração medido durante as avaliações de formulação demonstrou viscosidade de 8 cP em 100 mg/ml e ~19 cP em 140 mg/ml. Com base no perfil de viscosidade de Anticorpo A, estima-se que a concentração de ~ 125 mg/ml seria o limite superior do que seria passível de seringa usando um dispositivo convencional. EXEMPLO 5: FARMACOCINÉTICA (PK) DO ANTICORPO ANTI-IL-7R

EM CAMUNDONGOS DE TRANSFERÊNCIA DE PBMC HUMANA DE NOD SCID GAMA(NSG)

[477] Como o Anticorpo A não reage de modo cruzado com o IL- 7Rɑ murino, os camundongos de transferência de PBMC humana de NSG possibilitam a avaliação da influência de eliminação mediada por alvo em PK. Adicionalmente, o Anticorpo A foi mostrado exibindo afinidade de ligação dependente de pH diferencial a IL-7Rɑ, por exemplo, em relação a PFE A3312F (consulte o Exemplo 3). Para mAbs que exibem meia-vida curta devido à eliminação mediada pelo alvo, a ligação a antígeno dependente do pH resultou em um perfil de PK melhorado. Consulte Igawa T., et al., Nat Biotechnol 28(11): 1203-7

(2010). Portanto, esse modelo também foi usado para avaliar se a ligação de alvo dependente de pH traduzisse em farmacocinética aprimorada.

[478] Brevemente, os camundongos de transferência de PBMC humana de NSG receberam uma única administração de Anticorpo A ou do anticorpo PFE A3312F de referência. Os camundongos receberam intravenosamente uma dentre as duas doses: 0,5 mg/kg ou 5 mg/kg. Então, os camundongos foram sangrados em vários pontos de tempo após a administração, e a concentração de anticorpo sérica foi determinada. Conforme mostrado na Figura 3, a PK de PFE A3312F era não linear, uma vez que a eliminação sanguínea (CL) diminuiu 5,7 vezes entre as doses de 0,5 e 5 mg/kg (consulte a Tabela 6), presumivelmente devido à distribuição do fármaco mediada pelo alvo (TMDD). Embora a PK de Anticorpo A em 5 mg/kg seja similar ao PFE A3312F, um aprimoramento significativo na exposição foi observado na dose inferior (0,5 mg/kg). Sem se ater a qualquer teoria, uma vez que a eliminação do fármaco mediada pelo alvo é, em geral, mais aparente em uma faixa de dose mais baixa, a PK melhorada observada na dose mais baixa foi postulada como sendo devido à afinidade de ligação dependente do pH diferencial do Anticorpo anti-IL-7R para IL-7Rɑ. TABELA 6. PARÂMETROS FARMACOCINÉTICOS APÓS UMA

ÚNICA DOSE IV EM CAMUNDONGOS DE TRANSFERÊNCIA DE

PBMC HUMANA DE NSG Anti-IL-7R Anticorpo (Anticorpo A) PFE A3312F Dose IV (mg/kg) 0,5 5,0 0,5 5,0 N (número de camundongos) 6 6 5 5 AUClast (pM*h) 4,1 51,2 0,7 49,6 T1i/2 (h) 38 54 56 39 CL (ml/h/kg) 0,8 0,6 4,0 0,7 EXEMPLO 6: FARMACOCINÉTICA (PK) DO ANTICORPO ANTI-IL-7R

EM MACACOS CINOMOLGOS

[479] Para avaliar adicionalmente a PK do Anticorpo A, os macacos cinomolgos receberam uma dose única do Anticorpo A ou o anticorpo de referência PFE A3312F em uma das seguintes doses: 0,1 mg/kg, 0,5 mg/kg ou 3 mg/kg por via intravenosa. Então, os animais tiveram o sangue retirado em vários pontos de tempo pós- administração, e as potências in vivo (PK, RO e ativação de pSTAT5 ex vivo) dos anticorpos foram comparadas.

[480] Conforme mostrado na Figura 4, em animais que receberam ≥ 0,5 mg/kg de cada um dos anticorpos, os anticorpos antifármacos (ADA) (linha pontilhada) foram detectados no e após o dia 10, resultando concentrações séricas de anticorpo inferiores (linha contínua) nos animais. Conforme mostrado na Figura 5, a farmacocinética do Anticorpo A e PFE A3312F foram não lineares nas doses testadas, sugerindo TMDD. Entretanto, conforme mostrado na Tabela 7, as exposições médias (AUCs) do Anticorpo A foram mais altas (1,6 a 2,1 vezes) em relação a PFE A3312F. Similarmente, os valores de liberação do Anticorpo A também foram mais altos: nas doses de f 0,1, 0,5 e 3 mg/kg, os valores foram 1,15 ± 0,20, 0,64 ± 0,10 e 0,44 ± 0,02 ml/h/kg, respectivamente, ao mesmo tempo que aqueles de A3312F foram 1,76 ± 0,22, 1,16 ± 0,39 e 0,94 ± 0,12 ml/h/kg, respectivamente (Tabela 7). TABELA 7. PARÂMETROS FARMACOCINÉTICOS APÓS UMA

ÚNICA DOSE IV EM CAMUNDONGOS DE TRANSFERÊNCIA DE

PBMC HUMANA DE NSG Anti-IL-7R Anticorpo (Anticorpo A) PFE A3312F Dose IV 0,1 0,5 3 0,1 0,5 3 (mg/kg) N (número de 3 3 3 3 3 3 camundongos)

Anti-IL-7R Anticorpo (Anticorpo A) PFE A3312F AUClast (µM*h) 0,6 ± 1 5,3 ±0,8 46,4 ±2,4 0,4 ±0,1 3,1 ± 1,1 21,8 ± 2,7 CL (ml/h/kg) 1,15 ±0,20 0,64 ±0,10 0,44 ± 0,02 1,76 ±0,22 1,16 ± 0,39 0,94 ±0,12 Vss (ml/kg) 39 ± 1 42 ±0 41 ± 1 41 ±0 48 ± 1 49 ± 1

[481] Houve uma boa correlação entre a inibição de pSTAT5 e a concentração sérica do Anticorpo A nos macacos cinomolgos. Consulte a Figura 6. Com exposição aumentada ao Anticorpo A (conforme evidenciado pelo aumento na concentração sérica de anticorpo), houve uma diminuição correspondente na ativação de pSTAT5 mediada por IL-7. Isso foi verdadeiro em ambos os macacos que receberam o presente anticorpo anti-IL-7R ou PFE A3312 (IC50 = ~ 2 nm).

[482] Durante o período de avaliação de 3 semanas, não houve nenhuma observação clínica relacionada ao anticorpo anti-IL-7R ou efeito adverso no peso corporal, hematologia (com diferencial de WBC), química clínica de soro ou fenotipagem de célula T/B/NK (CD4+e CD8+ mostrados nas Figuras 7A a 7C).

[483] Os resultados acima sugerem que, em comparação ao anticorpo de referência, o anticorpo anti-IL-7R revelado no presente documento (Anticorpo A) tem potência in vivo similar, mas exibe farmacocinética melhorada em macacos cinomolgos com problemas de toxicidade mínima. EXEMPLO 7: ANÁLISE DA IMUNOGENICIDADE DO ANTICORPO ANTI-IL-7R

[484] O risco de imunogenicidade potencial do Anticorpo A foi avaliado por métodos in silico assim como por ensaios de proliferação de DC:células T in vitro. A análise de iDAB in silico mostrou algum potencial de ligação para a CDR3 de VL e uma mutação de framework na posição 71 da VH de uma serina para uma fenilalanina (F71S). O ensaio de proliferação de DC:células T in vitro, que consistiu em 40 doadores de PBMC incubados com células dendríticas pulsadas com o Anticorpo A, mostrou respostas imunogênicas significativas (~30-50% dos doadores) para as bateladas não RACIR do Anticorpo A (consultar P1-066930-3 e P1-066930-9 na Figura 8). De modo interessante, esses resultados correlacionados à gravidade observada de ADA nos estudos de macaco anteriormente descritos (consultar, por exemplo, o Exemplo 6). A batelada RACIR do Anticorpo A teve imunogenicidade mínima nos doadores (~ 12,5%), em comparação à proteína de controle (Avastina). Dada a baixa resposta para o material RACIR no ensaio, foi previsto que o Anticorpo A seria seguro para usar em clínica, por exemplo, para tratar uma doença inflamatória revelada no presente documento. EXEMPLO 8: ANÁLISE DA CAPACIDADE DO ANTICORPO ANTI-IL- 7R PARA BLOQUEAR A SINALIZAÇÃO DE IL-7 EM CÉLULAS T

HUMANAS

[485] Para avaliar adicionalmente a capacidade do Anticorpo A para inibir a ligação de IL-7 a IL-7Rα, sangue periférico de voluntários saudáveis (NHV), pacientes com colite ulcerativa (UC) e pacientes com doença de Crohn (CD) foi adquirido. Então, as PBMCs foram incubadas ex vivo e estimuladas com IL-7 na presença do Anticorpo A por aproximadamente 15 minutos. Em seguida, a atividade de pSTAT5 nas células T foi analisada com o uso de citometria de fluxo.

[486] Conforme mostrado na Tabela 8, houve atividade mínima de pSTAT5 nas células T de todos os indivíduos testados, sugerindo que o Anticorpo A pode bloquear efetivamente a ligação de IL-7 a IL- 7Rɑ humano de pacientes saudáveis e doentes. Nenhuma diferença estatística foi observada entre as respostas de doador de CD ou UC e NHV. Esse resultado mostra que o anticorpo anti-IL-7R revelado no presente documento (Anticorpo A) poderia ser eficaz no tratamento de doenças inflamatórias in vivo bloqueando-se eficazmente a sinalização de IL-7 em células T patogênicas.

TABELA 8. PARÂMETROS FARMACOCINÉTICOS APÓS UMA

ÚNICA DOSE IV EM CAMUNDONGOS DE TRANSFERÊNCIA DE

PBMC HUMANA DE NSG IC50 (nM) CD4+CD45RA+ CD4+CD45RA- CD8+CD45RA+a CD8+CD45RA-b NHV (n=19) 0,60 ± 0,3 0,52 ± 0,3 0,43 ± 0,29 0,38 ± 0,30 UC (n=21) 0,34 ± 0,2 0,28 ± 0,2 0,29 ± 0,40 0,22 ± 0,18 CD (n=10) 0,36 ± 0,3 0,36 ± 0,4 0,29 ± 0,22 0,23 ± 0,30 ab IC50 foram calculadas apenas quando as células T CD8 responderam a IL-7 EXEMPLO 9: ANÁLISE DE MAPEAMENTO DE EPÍTOPO

[487] A espectrometria de massa de troca de hidrogênio/deutério (HDX-MS), em combinação com técnicas de áreas de contato de marcação covalente ortogonal, como oxidação fotoquímica rápida de proteínas (FPOP) e marcação de éster etílico de glicina (GEE) foram utilizadas para sondar epítopos de ligação de hIL7Rɑ mediante interação com Anticorpo A. HDX-MX

[488] Antes de experimentos de mapeamento de epítopo, experimentos não deuterados foram executados para gerar uma lista de peptídeos comuns para hIL7Rα humano recombinante (10 µM), gerado internamente, e complexos de proteína de hIL7Rα com Fab do Anticorpo A (razão molar de 1:1). As amostras foram injetadas na coluna de enzima pepsina Waters Enzymate BEH (2,1 X 30 mm) e digeridas por 3 min a 15 °C. A câmara de resfriamento do sistema UPLC, que alojou todos os elementos cromatográficos, foi mantida a 0,0 ± 0,1 °C por todo o tempo das medições. Os peptídeos injetados foram aprisionados e dessalinizados por 3 min a 40 µl/min e, então, separados em 6 min por um gradiente de 5-40% de acetonitrila-água a 65 µl/min. A coluna de separação foi uma coluna de 1,0 mm x 100,0 mm ACQUITY UPLC BEH C18 (Waters) contendo partículas de 1,7 µm, e a retropressão teve como média 58,61 Mpa (8500 psi) a 0,1 °C. O espectrômetro de massa Xevo G2 foi usado para aquisição de dados. A configuração do instrumento foi da seguinte forma: tensão capilar 3,2 kV, energia de colisão de armadilha 6 V, tensão de cone de amostragem 35 V, temperatura de fonte 80 °C e temperatura de dessolvação 175 °C. Espectros de massa foram adquiridos ao longo de uma faixa m/z de 100 a 1900. A precisão de massa foi garantida por calibração com [Glul]- fibrinopeptídeo B 500 nM e foi menor do que 10 ppm através de todos os experimentos. A identificação dos peptídeos pépticos foi realizada através de uma combinação da análise de massa exata e MSE com o uso de ProteinLynx Global SERVER 2.5 (Waters).

[489] Nos experimentos de HDX-MS, 5 µl de cada amostra (hIL7Rα ou hIL7Rα com Fab do Anticorpo A, respectivamente) foram diluídos em 55 µl de tampão D2O (tampão de fosfato 10 mM, D 2O, pH 7,0) para iniciar as reações de marcação. As reações foram executadas por diferentes períodos de tempo: 1 min, 10 min e 240 min. Ao final de cada período de reação de marcação, a reação foi bruscamente arrefecida adicionando-se tampão de arrefecimento brusco (tampão de fosfato 100 mM com GdnCl 4 M e TCEP 0,4 M, pH 2,5, 1:1, v/v). 50 µl da amostra bruscamente arrefecida foram digeridos online com o uso das mesmas exatas condições que em experimentos não deuterados. Todos os experimentos de comparação foram realizados sob condições experimentais idênticas de modo que os níveis de deutério não tenham sido corrigidos para troca de volta e sejam, portanto, relatados como relativos. Todos os experimentos foram realizados em duplicata. O erro da medição da massa de cada peptídeo foi ± 0,20 Da nessa configuração experimental, consistente com os valores anteriormente obtidos. A absorção de deutério foi calculada pela subtração do centroide da distribuição isotópica para íons de peptídeo da proteína não deuterada do centroide da distribuição isotópica para íons de peptídeo da amostra marcada com deutério. Os níveis de deutério relativos resultantes foram plotados versus o tempo de troca com uso do programa de software DYNAMX 3.0™ (Waters).

FFOP

[490] Experimentos de FPOP foram realizados em hIL7Rα e complexo de hIL7Rα/Fab (Anticorpo A) (razão molar de 1:1, concentração final 10 µM). Um laser excimer KrF foi usado para gerar radicais hidroxila pela fotólise de H2O2, e o comprimento de onda de excitação foi definido como sendo 248 nm. Imediatamente antes da marcação, 5 µl de histidina e H2O2, cada, foram adicionados a uma alíquota de proteína. O volume final da solução de proteína foi de 50 µl, e as concentrações finais de histidina e H 2O2 foram 500 µM e 15 mM, respectivamente. A energia do laser foi ajustada a 28 mJ/pulso (7,4 Hz). Tanto FPOP quanto nenhum experimento de controle de laser foram realizados em triplicatas. Cada réplica foi coletada em um tubo de microcentrífuga contendo 11 µl de solução de arrefecimento brusco (800 nM de tetrâmero de catalase e 200 mM de metionina). As amostras foram desnaturadas, reduzidas, alquiladas e digeridas com quimotripsina. A aquisição de dados foi realizada no espectrômetro de massa Thermo Q Exactive Plus com o sistema UPLC Waters Acquity. O mecanismo de pesquisa Byonic foi usado para fornecer sítios de oxidação de identificação e cobertura de sequenciamento. Os níveis de oxidação relativos para peptídeos trípticos foram calculados com o uso do software Byologic (Protein Metrics, San Carlos, CA). Apenas peptídeos com diferença estatisticamente significativa em relação à oxidação entre estado livre e ligado (com base no valor p do teste T de student <0,01) foram considerados para análise adicional. A análise de nível de resíduo foi feita com o software Byologic e manualmente verificada para cada réplica. Apenas resíduos com diferença estatisticamente significativa na oxidação entre Anticorpo A livre de hIL7Rα e hIL7Rα/Fab (com base no valor p de teste T de student <0,01) foram considerados resíduos protegidos.

MARCAÇÃO DE GEE

[491] A marcação de GEE foi iniciada misturando-se 10 µl de cada amostra (hPAI1 ou hPAI1 com mAb a 1 mg/ml) com 1 µl de GEE 2 M e 1 µl de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodi-imida (EDC) 50 mM à temperatura ambiente por 1 min. A reação foi bruscamente arrefecida adicionando-se 10 µl de acetato de amônio 1 M à amostra. 17,5 µl de cada amostra marcada com GEE foram submetidos à digestão enzimática. A amostra foi desnaturada na presença do tensoativo Rapigest 0,5%, reduzida por DTT a 56 °C por 30 min, alquilada por IAM à temperatura ambiente por 30 min no escuro e digerida por quimotripsina a 37 °C de um dia para o outro em Tris pH 7,4 seguido por arrefecimento brusco ácido. As amostras digeridas foram analisadas em espectrometria de massa Thermo Q Exactive Plus, e os níveis de modificação de GEE foram monitorados em hIL7Rα na ausência/presença do Anticorpo A.

RESULTADOS

[492] Conforme mostrado na Figura 9, a cobertura de sequência de 97,3% de hIL7R foi obtida com o uso de análise de HDX-MS. A análise revelou os seguintes epítopos descontínuos, que cobrem quatro regiões distintas dentro do hIL7R: (i) Região 1: 24 SQLEVNGSQHSLTCAF39; (ii) Região 2: 73 FIETKKFLLIGKSNIC88, 89 VKVGEKSLTCKKIDLTT105; (iii) Região 3: 136 QKKYVKVLMHDVAY149; 181 e (iv) Região 4: YEIKVRSIPDHYFKGF196. Com base nas diferenças de absorção de deutério relativas, as regiões de peptídeo podem ser classificadas como a região 1> 2, 3, 4, com a região 1 tendo a alteração mais significativa na absorção de deutério (Figura 10). Com a análise por FPOP, os seguintes cinco epítopos do hIL7R foram 24 identificados: (i) Região 1: SQLEVNGSQHS35; (ii) Região 2:

FIETKKF79 e 80 LLIGKSNICVKVGEKSL95; (iii) Região 3: 144 MHDVAY149; e (iv) Região 4: 182 EIKVRSIPDHYFKGF193. Esses epítopos sobrepuseram as regiões descontínuas identificadas acima com o uso da análise por HDX-MS.

Também, conforme mostrado na Tabela 9, os epítopos identificados também exibiram diminuição nos níveis de oxidação em comparação aos controles.

Os resíduos mais protegidos foram identificados da seguinte forma: (i) Região 1: H33; (ii) Região 2: F79,I82 e K84; (iii) Região 3: M144; e (iv) Região 4: R186, H191 e Y192. TABELA 9. EXTENSÃO DE NÍVEL DE RESÍDUO DA OXIDAÇÃO APÓS FPOP PARA PEPTÍDEOS QUIMIOTRÍPTICO DE HIL7RΑ 24SQLEVDGSQ 73FIETKKF7 80LLIGKSNICVKVG 144 Peptídeo 182EIKVRSIPDHYF193 HSL35 9 EKSL96 MHDVAY149

Resíduo AA M14 H14 Y14 H33 F73 F79 I82 K84 R186 H191 Y192 nº 4 5 9

% de 29,2 Oxidação 0,13 1,40 0,83 3,35 1,25 0,05 0,36 1,15 0,09 2,61 2 de IL7R

% de Oxidação 16,4 de 0,07 1,35 0,38 1,18 0,37 0,05 0,33 0,19 0,03 0,28 2 Anticorpo A IL7R

0,00 0,00 0,10 0,29 0,000 0,0000 0,0000 valor p 0,001 0,287 0,00001 0,0001 03 01 7 6 1 02 01

STDEV(IL7 0,01 0,09 0,07 0,09 0,12 0,93 0,00 0,04 0,12 0,00 0,09 R)

STDEV(Anti corpo A 0,01 0,09 0,05 0,13 0,02 1,64 0,00 0,07 0,02 0,00 0,04 IL7R)

Os resíduos que mostram uma diferença significativa no nível de oxidação (valor p <0,01) mediante a ligação ao Anticorpo A em comparação ao controle de hIL7Rα são considerados os resíduos mais protegidos. Os cálculos representam n=3 réplicas por condição.

[493] Por último, a marcação de GEE (que foi usada para fornecer dados complementares em resíduos com propensão de oxidação limitada, o que pode ser silencioso para FPOP, em particular ácido aspártico e ácido glutâmico) identificaram E75 como o resíduo mais protegido em hIL7Rα mediante a interação com o Anticorpo A (Tabela 10). TABELA 10. EXTENSÃO DA MARCAÇÃO DE GEE PARA PEPTÍDEOS QUIMIOTRÍPTICOS DE HIL7Rɑ 24SQLEVDGSQH 80LLIGKSNICVKV 182EIKVRSIPDH Peptídeo 73FIETKKF79 144MHDVAY149 SL35 GEKSL96 YF193 Resíduo n° E27 E75 E93 D146 E182/D 190 % de Marcação de 0,16 4,07 0,76 ND 1,75 GEE de IL7R % de marcação de GEE de Anticorpo A 0,16 2,65 0,65 ND 1,43 IL7R valor p 0,460 0,004 0,020 NA 0,017 STDEV(IL7R) 0,01 0,27 0,06 NA 0,13 STDEV(IL7R_mAb) 0,02 0,42 0,02 NA 0,12 Os resíduos que mostram uma diferença significativa no nível de marcação de GEE (valor p <0,01) mediante a ligação ao Anticorpo A em comparação ao controle de hIL7Rα são considerados os resíduos mais protegidos. Os cálculos representam n=2 réplicas por condição.

[494] Com base na análise acima, epítopos de hIL7Rα mediante a interação com o Anticorpo A foram mapeados à sequência linear de hIL7Rα. (Figura 11A) e adicionalmente mapeados à estrutura de cristal (Figura 11B).

[495] Em suma, os experimentos de espectrometria de massa de troca de hidrogênio/deutério (HDX-MS) indicaram que os sítios de ligação a Anticorpo A em IL7Rα humano são mapeados aos resíduos nas seguintes sequências de peptídeos: SQLEVNGSQHSLTCAF39, 73 FIETKKFLLIGKSNIC88, 89 VKVGEKSLTCKKIDLTT105, 136 QKKYVKVLMHDVAY149 e 181 YEIKVRSIPDHYFKGF196. Abordagens de área de contato de proteína com base em espectrometria de massa incluindo FPOP e marcação de GEE forneceram resolução de aminoácidos de sítios de ligação a Anticorpo A em IL7Rα humano nos seguintes aminoácidos: H33, E75, F79, I82, K84, M144, R186, H191 e Y192. EXEMPLO 10: DOSE HUMANA PROJETADA

[496] PK/RO/PD humanas para o anticorpo anti-IL-7R revelado no presente documento foram projetados com o uso de um modelo de distribuição de fármaco mediado por alvo mecanístico que foi recentemente relatado para PFE A3312F (nbc.aapsmeeting.org/event/member/373852) (Figuras 12A e 12B). Esse modelo mecanístico teve a capacidade para capturar o curso de tempo de PK/RO/PD após a administração de mAb PFE A3312F no estudo clínico humano.

[497] Para permitir a simulação de PK e PD humanas do anticorpo anti-IL-7R, ao mesmo tempo que a maioria dos parâmetros de modelo foram similares ao modelo relatado, presumiu-se que a liberação fosse 2 vezes menor em seres humanos (em relação a PFE A3312F). Isso foi sustentado pelo CL 2 vezes menor em relação a A3312F observado em macacos a uma dose farmacologicamente relevante (3 mg/kg; Figura 4). Adicionalmente, a afinidade de ligação do anticorpo anti-IL-7R foi similar entre macacos e seres humanos, particularmente a pH 7,4 (consultar o Exemplo 3). Portanto, as projeções de PK presumiram que essa diferença em CL seria transferida para seres humanos. Dada a potência in vivo similar do presente anticorpo anti-IL-7R e A3312F em macacos (Figura 5), presumiu-se que a cinética de ligação desses dois anticorpos fosse similar em seres humanos

[498] A dose humana eficaz foi projetada alvejando-se 95% de RO no mínimo após dosagem de uma vez a cada duas semanas. O estudo de PK/PD de macaco demonstrou que mais do que 95% de RO resultou em 90% de inibição de pSTAT5. Consulte o Exemplo 3. Portanto, RO em vez da cobertura de pSTAT5 foi usada para projeções de dose devido ao fato de que a inibição de pSTAT5 foi mais variável em macacos e seres humanos.

[499] Integrando as informações acima, foi estimado que uma dose de manutenção SC de 110 mg para um adulto de 70 kg em semanas alternadas (Q2W) alcançaria 95% de RO de IL-7R durante o tratamento com o presente anticorpo anti-IL-7R. A dose de carregamento SC para permitir a obtenção dessa RO após a primeira dose foi calculada como sendo 140 mg (Figura 13).

[500] A exposição de estado estacionário humano previsto e os parâmetros PK nessa dose são listados na Tabela 11. Conforme esperado, devido à farmacocinética não linear, a meia-vida projetada do anticorpo anti-IL-7R em seres humanos foi protegida para aumento com dose crescente. A meia-vida projetada foi de 53 horas na dose eficaz de 110 mg, mas foi estimada como sendo mais longa a doses mais altas (por exemplo, 85 horas a 125 mg). TABELA 11. PARÂMETROS FARMACOCINÉTICOS APÓS UMA

ÚNICA DOSE IV EM CAMUNDONGOS DE TRANSFERÊNCIA DE

PBMC HUMANA DE NSG Estimativas de Parâmetro PK e Dose Humana Projetada do Parâmetro PK Anticorpo Anti-IL-7R 110 mg de SC a cada 2 semanas Cmáxss (nM) 40,6 AUC(tau)ss (nM*h) 7893 CL (ml/h/kg) 0,56 Ctroughss (nM) 6,0 Terminal T1/2 (h) 53

EXEMPLO 11: ANÁLISE DE VARREDURA DE MUTAÇÃO DO ANTICORPO 18B1

[501] A fim de executar a varredura de mutação, o anticorpo 18B1 (Anticorpo A, Tabela 12) foi primeiramente reformatada como scFv e confirmou a ligação contra a ligação de hIL-7R de comprimento completo por meio de uma exibição de mRNA (Xu L et al. (2002) Chemistry & Biology 9: 933; Roberts RW e JW Szostak (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 94:12297; Kurz et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28(18):E83). Os dados de ligação do anticorpo reformatado são fornecidos nas Figuras 14A e 14B.

[502] Uma vez que a ligação foi confirmada, foi construída, em seguida, uma biblioteca de varredura de mutação em que cada variante de biblioteca continha apenas uma única mutação dentro da CDR. Todas as seis CDRs do anticorpo sofreram mutação, com cada posição na CDR com mutação para todos os aminoácidos possíveis nessa posição. As posições específicas que sofreram mutação são mostradas na Figura 15. Essa biblioteca de variantes de scFv 18B1 foi obtida através de uma única rodada de seleção contra hIL-7R com o uso de exibição de mRNA. Os resultados da única rodada de seleção são fornecidos na Figura 16. A saída de seleção foi analisada por meio de sequenciamento da próxima geração (NGS), e mapas de calor foram gerados para visualizar dados de NGS e identificar prontamente 1) posições de CDR críticas para ligação, 2) posições de CDR em que as mutações são toleradas e 3) mutações que podem melhorar a ligação do anticorpo a hIL-7R. As Figuras 17A e 17B fornecem um esquema do processo geral. Os resultados de mapa de calor são fornecidos nas Figuras 18A-18F.

[503] Variantes de substituição de alanina do anticorpo 18B1 foram feitas para confirmar os dados de NGS acima. Em suma, uma série de variantes de mutação única foi projetada em que a mutação de alanina única foi introduzida a uma posição na CDR. Isso foi feito para todas as posições das seis CDRs, exceto para posições de CDR que já codificam uma alanina. Essas variantes de substituição de alanina tiveram o gene sintetizado, foram expressas temporariamente em Expi293 como IgG1.3 e foram purificadas com o uso de resina de proteína A.

[504] As variantes de substituição de alanina e 18B1 foram testadas quanto à sua ligação a hIL-7R por meio de biacore. Em suma, o chip CM5 (com Fc na superfície de chip) foi usado para capturar 12,5 nM do anticorpo, hIL-7R foi introduzido como ligante a 30, 10 e 3,3 nM em HBS-P, pH 7,4, 37 °C. Consultar as Figuras 20A e 20B. A afinidade (KD) de cada ligação de variante a hIL-7R foi obtida com o uso dessa abordagem e comparada à razão de enriquecimento (ER) obtida através da análise de mapa de calor de NGS para a mesma variante. A Figura 19 fornece os valores para cada uma das variantes de anticorpo.

[505] Conforme mostrado na Figura 21, diversas das variantes 18B1 tiveram a capacidade para se ligar a hIL-7R com afinidade similar ao anticorpo 18B1 (isto é, Anticorpo A). E, conforme mostrado nas Figuras 22 e 23, as mutações de alanina com a CDR3 de cadeia pesada e a CDR3 de cadeia leve pareceram ter o maior impacto na ligação. Por último, conforme mostrado na Figura 24, os resultados mostrados nos mapas de calor se correlacionaram bem aos valores de K D medidos para as variantes de alanina. A Figura 25 fornece uma estrutura de cristal do fragmento Fab do anticorpo 18B1 em que os resíduos que são críticos para ligação (vermelho) e resíduos que melhorariam a ligação (azul) são mostrados. EXEMPLO 12: ANÁLISE DE INTERNALIZAÇÃO DO ANTICORPO 18B1 MEDIANTE A LIGAÇÃO À CADEIA DO RECEPTOR DE IL-7 (IL- 7Rɑ)

[506] Para caracterizar os anticorpos anti-IL-7R revelados no presente documento, o anticorpo 18B1 (isto é, Anticorpo A) foi testado quanto a sua internalização mediante a ligação a IL-7Rα expresso em leucócitos de macaco. Em suma, macacos cinomolgos receberam uma administração subcutânea do composto 18B1 em uma das seguintes doses: (i) 2 mg/kg, (ii) 10 mg/kg e (iii) 50 mg/kg. Os animais que não receberam o anticorpo 18B1 foram usados como controles. Então, em vários pontos de tempo pós-administração, sangue periférico foi coletado dos animais, e a intensidade de fluorescência média (MFI) da expressão de IL-7Rα em leucócitos CD3+ foi avaliada com o uso de citometria de fluxo.

[507] Conforme mostrado na Figura 26, a expressão de IL-7Rα nos leucócitos CD3+ permaneceu amplamente consistente pela duração do experimento em todos os animais tratados com o anticorpo 18B1. Em comparação aos animais de controle, a administração do anticorpo 18B1 não resultou na expressão diminuída de IL-7Rα nos leucócitos CD3+.

[508] Esse resultado demonstra que o anticorpo 18B1 revelado no presente documento não induz a internalização do IL-7Rα mediante a ligação, o que confirma que o anticorpo não tem qualquer efeito agonístico. EXEMPLO 13: ANÁLISE DA POTÊNCIA DO ANTICORPO 18B1

[509] A avaliação da potência dos anticorpos anti-IL-7R revelados no presente documento, a capacidade do anticorpo 18B1 para inibir a resposta de anticorpo induzida por hemocianina de lapa de fechadura (KLH) foi medida. Em suma, macacos cinomolgos (tanto machos quanto fêmeas) receberam uma administração subcutânea do composto 18B1 em uma das seguintes doses: (i) 2 mg/kg, (ii) 10 mg/kg e (iii) 50 mg/kg. Os animais que não receberam o anticorpo 18B1 foram usados como controles. Então, no dia 15 após a administração de anticorpo, todos os animais foram imunizados com KLH (10 mg; por via intramuscular no quadríceps posterior). Então, em vários pontos no tempo, o sangue periférico foi coletado dos animais (da veia femoral, cefálica ou safena) e os tituladores finais (EPT) de IgM específica de KLH e anticorpos IgG nos soros foram medidos com o uso de ELISA.

[510] Conforme mostrado nas Figuras 27A e 27B, mediante a imunização com KLH, um aumento nos anticorpos IgM e IgG específicos para KLH foi observado em todos os grupos de tratamento. Para resposta de IgM específica para KLH, não houve nenhuma diferença significativa dentre os grupos de tratamento (consultar a Figura 27A). Entretanto, em animais tratados com o anticorpo 18B1, houve uma diminuição estatisticamente significativa (até 80% de supressão) em respostas de IgG específica para KLH em 2 (“dia 29”), 3 (“dia 36”) e 4 (“dia 43”) semanas após a imunização com KLH em comparação aos animais de controle (isto é, animais que foram imunizados com KLH, mas não receberam o anticorpo 18B1) (consultar, a Figura 27B). A inibição observada da resposta de IgG específica para KLH foi independente de dose, na medida em que a resposta pareceu ser comparável em todos os animais tratados com o anticorpo 18B1, independentemente da dosagem.

[511] Os dados acima demonstram a potência dos anticorpos anti- IL-7R revelados e que até mesmo a uma dose tão baixa quanto 2 mg/kg, o anticorpo 18B1 pode inibir eficazmente a resposta de IgG específica para KLH. Sem ater-se a qualquer teoria, a supressão da reposta de IgG específica para KLH, mas não IgM sugere que o anticorpo 18B1 pode inibir a recombinação de comutação de classe de anticorpo em células B que passam por comutação de isotipo. EXEMPLO 14: ANÁLISE DE MAPEAMENTO DE EPÍTOPO

ADICIONAL

[512] Para caracterizar adicionalmente os anticorpos anti-IL-7R da presente revelação, os epítopos de ligação de três anticorpos de referência (isto é, 4A8, 13A10 e PFE A3312F) foram determinados e comparados aos epítopos de ligação do anticorpo 18B1 (Anticorpo A, Tabela 12). Os epítopos de ligação foram determinados conforme anteriormente descrito no Exemplo 9.

[513] Conforme mostrado nas Figuras 28A-28C, com base nos experimentos de HDX-MS, os sítios de ligação para o anticorpo 4A8 foram mapeados aos resíduos nas seguintes sequências de peptídeos: 57 (i) LVEVKCLNF65, (ii) 73 FIETKKFLLIGKSNIC88, (iii) 136 QKKYVKVLMHDVAY149 e (iv) 181 YEIKVRSIPDHYFKGF196. Os sítios de ligação para o anticorpo 13A10 foram mapeados às seguintes 73 sequências de peptídeos: (i) FIETKKFLLIGKSNIC88, (ii) 89 VKVGEKSLTCKKIDLTT105, (iii) 136 QKKYVKVLMHDVAY149 e (iv) 181 YEIKVRSIPDHYFKGF196. E os sítios de ligação para PFE A3312F foram mapeados às seguintes sequências de peptídeos: (i) 24 SQLEVNGSQHSLTCA38, (ii) 52 EICGALVEVKCLNF65, (iii) 73 FIETKKFLLIGKSNIC88, (iv) 89 VKVGEKSLTCKKIDLTT105, (v) 104 TTIVKPEAPFDLSV117, (vi) 109 PEAPFDLSVIYRE121, (vii) 136 QKKYVKVLMHDVAY149, (viii) 169 TLLQRKLQPAAM180 e (ix) 181 YEIKVRSIPDHYFKGF196. As Figuras 29A-29C mostram os sítios de ligação para 4A8, 13A10 e PFE A3312F mapeados em uma estrutura de cristal da proteína de IL-7Rα humana.

[514] Em comparação aos dados fornecidos no Exemplo 9 (consultar também as Figuras 10 e 11B), os resultados acima demonstram que o anticorpo 18B1 revelado no presente pedido se ligam a regiões diferentes na proteína de IL-7Rα humana em comparação aos anticorpos de referência descritos nesse Exemplo. TABELA 12. SEQ ID Descrição Sequências Região Variável de 19 Cadeia Pesada (VH) de

SEQ ID Descrição Sequências Anti-IL-7R Anticorpo (Anticorpo A) Região Variável de Cadeia Leve (VL) de 20 Anti-IL-7R Anticorpo (Anticorpo A) Anti-IL-7R 21 Cadeia Pesada de Anticorpo (Anticorpo A) Cadeia Leve de Anti-IL- 22 7R Anticorpo (Anticorpo A) TABELA 13. SEQUÊNCIAS DE CDR1 DE CADEIA PESADA

EXEMPLIFICATIVAS 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 "18B1" (SEQ ID NO: 31) G F T F D D H A M H F2 7Y (SEQ ID NO: 32) G Y T F D D H A M H T28P (SEQ ID NO: 33) G F P F D D H A M H T2 8A (SEQ ID NO: 34) G F A F D D H A M H T2 8V (SEQ ID NO: 35) G F V F D D H A M H T2 8L (SEQ ID NO: 36) G F L F D D H A M H T28I (SEQ ID NO: 37) G F I F D D H A M H T2 8M (SEQ ID NO: 38) G F M F D D H A M H T2 8H (SEQ ID NO: 39) G F H F D D H A M H T28F (SEQ ID NO: 40) G F F F D D H A M H T2 8Y (SEQ ID NO: 41) G F Y F D D H A M H T2 8N (SEQ ID NO: 42) G F N F D D H A M H T2 8D (SEQ ID NO: 43) G F D F D D H A M H T2 8E (SEQ ID NO: 44) G F E F D D H A M H

T2 8Q (SEQ ID NO: 45) G F Q F D D H A M H M34L (SEQ ID NO: 46) G F T F D D H A L H TABELA 14. SEQUÊNCIAS DE CDR2 DE CADEIA PESADA

EXEMPLIFICATIVAS 50 51 52 52a 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 "18B1" (SEQ ID G I S W N S R G I G Y A D S V K G NO: 14) S52T (SEQ ID G I T W N S R G I G Y A D S V K G NO: 47) N53H (SEQ ID G I S W H S R G I G Y A D S V K G NO: 48) I57V (SEQ ID G I S W N S R G V G Y A D S V K G NO: 49) A6 0G (SEQ ID G I s W N S R G I G Y G D S V K G NO: 50) A6 0S G I s W N S R G I G Y S D S V K G (SEQ ID NO: 51) A6 0T (SEQ ID G I S W N S R G I G Y T D S V K G NO: 52) A6 0V (SEQ ID G I S W N S R G I G Y V D S V K G NO: 53) A6 0L

G I S W N S R G I G Y L D S V K G (SEQ ID

50 51 52 52a 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

NO: 54)

A60I (SEQ ID G I S W N S R G I G Y I D S V K G NO: 55)

A6 0R (SEQ ID G I S W N S R G I G Y R D S V K G NO: 56)

A6 0H (SEQ ID G I S W N S R G I G Y H D S V K G NO: 57)

A6 0N (SEQ ID G I S W N S R G I G Y N D S V K G NO: 58)

D61P (SEQ ID G I S W N S R G I G Y A P S V K G NO: 59)

D61T (SEQ ID G I S W N S R G I G Y A T S V K G NO: 60)

D61N (SEQ ID G I S W N S R G I G Y A N S V K G NO: 61)

D61E (SEQ ID G I S W N S R G I G Y A E S V K G NO: 62)

D61Q (SEQ ID G I S W N S R G I G Y A Q S V K G NO: 63)

D61S (SEQ ID G I S W N S R G I G Y A S S V K G NO: 64)

D61H (SEQ ID G I S W N S R G I G Y A H S V K G NO: 65)

50 51 52 52a 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

S62P (SEQ ID G I S W N S R G I G Y A D P V K G NO: 66)

S62G (SEQ ID G I S W N S R G I G Y A D G V K G NO: 67)

S62A (SEQ ID G I S W N S R G I G Y A D A V K G NO: 68)

S62T (SEQ ID G I S W N S R G I G Y A D T V K G NO: 69)

S62V (SEQ ID G I S W N S R G I G Y A D V V K G NO: 70)

S62R (SEQ ID G I S W N S R G I G Y A D R V K G NO: 71)

S62H (SEQ ID G I S W N S R G I G Y A D H V K G NO: 72)

S62F (SEQ ID G I S W N S R G I G Y A D F V K G NO: 73)

S62Y (SEQ ID G I S W N S R G I G Y A D Y V K G NO: 74)

S62N (SEQ ID G I S W N S R G I G Y A D N V K G NO: 75)

S62D (SEQ ID G I S W N S R G I G Y A D D V K G NO: 76)

S62E G I S W N S R G I G Y A D E V K G

50 51 52 52a 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 (SEQ ID NO: 77) V6 3I (SEQ ID G I S W N S R G I G Y A D S I K G NO: 78) K64A (SEQ ID G I S W N S R G I G Y A D S V A G NO: 79) K64S (SEQ ID G I S W N S R G I G Y A D S V S G NO: 80) K64T (SEQ ID G I S W N S R G I G Y A D S V T G NO: 81) K64V (SEQ ID G I S W N S R G I G Y A D S V V G NO: 82) K64L (SEQ ID G I S W N S R G I G Y A D S V L G NO: 83) K64I (SEQ ID G I S W N S R G I G Y A D S V I G NO: 84) K64M (SEQ ID G I S W N S R G I G Y A D S V M G NO: 85) K64R (SEQ ID G I S W N S R G I G Y A D S V R G NO: 86) K64H (SEQ ID G I S W N S R G I G Y A D S V H G NO: 87) K64F

G I S W N S R G I G Y A D S V F G (SEQ ID

50 51 52 52a 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 NO: 88) K64Y (SEQ ID G I S W N S R G I G Y A D S V Y G NO: 89) K64N (SEQ ID G I S W N S R G I G Y A D S V N G NO: 90) K64D (SEQ ID G I S W N S R G I G Y A D S V D G NO: 91) K64E (SEQ ID G I S W N S R G I G Y A D S V E G NO: 92) K64Q (SEQ ID G I S W N S R G I G Y A D S V Q G NO: 93) G6 5H (SEQ ID G I S W N S R G I G Y A D S V K H NO: 94) G6 5D (SEQ ID G I S W N S R G I G Y A D S V K D NO: 95) G65Q (SEQ ID G I S W N S R G I G Y A D S V K Q NO: 96) TABELA 15. SEQUÊNCIAS DE CDR3 DE CADEIA PESADA

EXEMPLIFICATIVAS 95 96 97 98 99 100 100a 100b 100c 100d 101 102 "18B1" (SEQ ID D E Y S R G Y S V L D V NO: 15) S98T D E Y T R G Y S V L D V

95 96 97 98 99 100 100a 100b 100c 100d 101 102 (SEQ ID NO: 97) S98N

D E Y N R G Y S V L D V (SEQ ID NO: 98) S98D (SEQ ID D E Y D R G Y S V L D V NO: 99) S98E (SEQ ID D E Y E R G Y S V L D V NO: 100) R99L (SEQ ID D E Y S L G Y S V L D V NO: 101) R99M (SEQ ID D E Y S M G Y S V L D V NO: 102) R99S (SEQ ID D E Y S S G Y S V L D V NO: 103) V100cG (SEQ ID D E Y S R G Y S G L D V NO: 104) V100cA (SEQ ID D E Y S R G Y S A L D V NO: 105) V100cS (SEQ ID D E Y S R G Y S S L D V NO: 106) V100cT (SEQ ID D E Y S R G Y S T L D V NO: 107)

95 96 97 98 99 100 100a 100b 100c 100d 101 102

V100cM (SEQ ID D E Y S R G Y S M L D V NO: 108)

V100cN (SEQ ID D E Y S R G Y S N L D V NO: 109)

V100cE (SEQ ID D E Y S R G Y S E L D V NO: 110)

V100cQ (SEQ ID D E Y S R G Y S Q L D V NO: 111)

V102A (SEQ ID D E Y S R G Y S V L D A NO: 112)

V102S (SEQ ID D E Y S R G Y S V L D S NO: 113)

V102T (SEQ ID D E Y S R G Y S V L D T NO: 114)

V102R (SEQ ID D E Y S R G Y S V L D R NO: 115)

V102H (SEQ ID D E Y S R G Y S V L D H NO: 116)

V102Y (SEQ ID D E Y S R G Y S V L D Y NO: 117)

V102W (SEQ ID D E Y S R G Y S V L D W NO: 118)

V102N D E Y S R G Y S V L D N

95 96 97 98 99 100 100a 100b 100c 100d 101 102 (SEQ ID NO: 119) V102E (SEQ ID D E Y S R G Y S V L D E NO: 120) V102Q (SEQ ID D E Y S R G Y S V L D Q NO: 121) V102M (SEQ ID D E Y S R G Y S V L D M NO: 122) TABELA 16. SEQUÊNCIAS DE CDR1S DE CADEIA LEVE

EXEMPLIFICATIVAS 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 "18B1" (SEQ ID NO: 16) R A S Q G I S S A L A R24S (SEQ ID NO: 123) S A S Q G I S S A L A R24T (SEQ ID NO: 124) T A S Q G I S S A L A R24V (SEQ ID NO: 125) V A S Q G I S S A L A R24K (SEQ ID NO: 126) K A S Q G I S S A L A R24H (SEQ ID NO: 127) H A S Q G I S S A L A R24Y (SEQ ID NO: 128) Y A S Q G I S S A L A R24I I A S Q G I S S A L A (SEQ ID NO: 129) A2 5S (SEQ ID NO: 130) R S S Q G I S S A L A A2 5T (SEQ ID NO: 131) R T S Q G I S S A L A A2 5V (SEQ ID NO: 132) R V S Q G I S S A L A S26P (SEQ ID NO: 133) R A P Q G I S S A L A S26G (SEQ ID NO: 134) R A G Q G I S S A L A S2 6A (SEQ ID NO: 135) R A A Q G I S s A L A

S26T (SEQ ID NO: 136) R A T Q G I S s A L A

S2 6V (SEQ ID NO: 137) R A V Q G I S s A L A

S26L (SEQ ID NO: 138) R A L Q G I S s A L A

S26I (SEQ ID NO: 139) R A I Q G I S s A L A

S26M (SEQ ID NO: 140) R A M Q G I S s A L A

S26K (SEQ ID NO: 141) R A K Q G I S s A L A

S26R (SEQ ID NO: 142) R A R Q G I S s A L A

S26H (SEQ ID NO: 143) R A H Q G I S s A L A

S26N (SEQ ID NO: 144) R A N Q G I s s A L A

S26E (SEQ ID NO: 145) R A E Q G I s s A L A

S26Q (SEQ ID NO: 146) R A Q Q G I S S A L A

Q27P (SEQ ID NO: 147) R A S P G I S S A L A

Q2 7G (SEQ ID NO: 148) R A S G G I S S A L A

Q2 7A (SEQ ID NO: 149) R A S A G I S S A L A

Q27S (SEQ ID NO: 150) R A S S G I S S A L A

Q2 7T (SEQ ID NO: 151) R A S T G I S s A L A

Q2 7V (SEQ ID NO: 152) R A S V G I S s A L A

Q2 7L (SEQ ID NO: 153) R A S L G I S s A L A

Q27I (SEQ ID NO: 154) R A S I G I S s A L A

Q2 7M (SEQ ID NO: 155) R A S M G I S s A L A

Q2 7H (SEQ ID NO: 156) R A S H G I S s A L A

Q27F (SEQ ID NO: 157) R A S F G I S s A L A

Q2 7Y (SEQ ID NO: 158) R A S Y G I S s A L A

Q2 7N (SEQ ID NO: 159) R A S N G I S s A L A

Q2 7D (SEQ ID NO: 160) R A S D G I s s A L A

Q2 7E (SEQ ID NO: 161) R A S E G I s s A L A

G2 8P (SEQ ID NO: 162) R A S Q p I S S A L A

G2 8A (SEQ ID NO: 163) R A S Q A I S S A L A

G2 8S (SEQ ID NO: 164) R A S Q s I S S A L A

G2 8T (SEQ ID NO: 165) R A S Q T I S S A L A

G2 8H (SEQ ID NO: 166) R A S Q H I S S A L A

G2 8E (SEQ ID NO: 167) R A S Q E I S S A L A

G2 8Q (SEQ ID NO: 168) R A S Q Q I S S A L A

G2 8M (SEQ ID NO: 169) R A S Q M I S s A L A

G2 8N (SEQ ID NO: 170) R A S Q N I S s A L A

G2 8D (SEQ ID NO: 171) R A S Q D I S s A L A

I29P (SEQ ID NO: 172) R A S Q G P S s A L A

I29G (SEQ ID NO: 173) R A S Q G G S s A L A

I29A (SEQ ID NO: 174) R A S Q G A S s A L A

I29S (SEQ ID NO: 175) R A S Q G S S s A L A

I29T (SEQ ID NO: 176) R A S Q G T S s A L A

I29V (SEQ ID NO: 177) R A S Q G V S s A L A

I29L (SEQ ID NO: 178) R A S Q G L S s A L A

I29N (SEQ ID NO: 179) R A S Q G N S S A L A

S30T (SEQ ID NO: 180) R A S Q G I T S A L A

S3 0V (SEQ ID NO: 181) R A S Q G I V S A L A

S30L (SEQ ID NO: 182) R A S Q G I L S A L A

S30I (SEQ ID NO: 183) R A S Q G I I S A L A

S3 0M (SEQ ID NO: 184) R A S Q G I M S A L A

S3 OH (SEQ ID NO: 185) R A S Q G I H S A L A

S30F (SEQ ID NO: 186) R A S Q G I F S A L A

S3 0Y (SEQ ID NO: 187) R A S Q G I Y S A L A

S3 ON (SEQ ID NO: 188) R A S Q G I N S A L A

S3 0D (SEQ ID NO: 189) R A S Q G I D S A L A

S30E (SEQ ID NO: 190) R A S Q G I E S A L A

S30Q (SEQ ID NO: 191) R A S Q G I Q S A L A

A32P (SEQ ID NO: 192) R A S Q G I S S P L A L3 3A (SEQ ID NO: 193) R A S Q G I S S A A A L3 3V (SEQ ID NO: 194) R A S Q G I S S A V A TABELA 17. SEQUÊNCIAS DE CDR2 DE CADEIA LEVE

EXEMPLIFICATIVAS 50 51 52 53 54 55 56 "18B1" (SEQ ID NO: 17) D A S S L E S A51G (SEQ ID NO: 195) D G S S L E S A51S (SEQ ID NO: 196) D S S S L E S A51M (SEQ ID NO: 197) D M S S L E S A51H (SEQ ID NO: 198) D H S S L E S A51N (SEQ ID NO: 199) D N S S L E S A51D (SEQ ID NO: 200) D D S S L E S A51E (SEQ ID NO: 201) D E S S L E S A51Q (SEQ ID NO: 202) D Q S S L E S S52G (SEQ ID NO: 203) D A G S L E S S52A (SEQ ID NO: 204) D A A S L E S S52T (SEQ ID NO: 205) D A T S L E S S52V (SEQ ID NO: 206) D A V S L E S S52M (SEQ ID NO: 207) D A M S L E S S52H (SEQ ID NO: 208) D A H S L E S S52F (SEQ ID NO: 209) D A F S L E S S52Y (SEQ ID NO: 210) D A Y S L E S S52N (SEQ ID NO: 211) D A N S L E S S52D (SEQ ID NO: 212) D A D S L E S S52E (SEQ ID NO: 213) D A E S L E S S52Q (SEQ ID NO: 214) D A Q S L E S

S53A (SEQ ID NO: 215) D A S A L E S

S53F (SEQ ID NO: 216) D A S F L E S

S53Y (SEQ ID NO: 217) D A S Y L E S

S53W (SEQ ID NO: 218) D A S W L E S

S53N (SEQ ID NO: 219) D A S N L E S

S53D (SEQ ID NO: 220) D A S D L E S

S53E (SEQ ID NO: 221) D A S E L E S

S53L (SEQ ID NO: 222) D A S L L E S

L54P (SEQ ID NO: 223) D A S S P E S

L54S (SEQ ID NO: 224) D A S S S E S

L54T (SEQ ID NO: 225) D A S S T E S

L54K (SEQ D A S S K E S

ID NO: 226)

L54H (SEQ ID NO: 227) D A S S H E S

L54N (SEQ ID NO: 228) D A S S N E S

E55D (SEQ ID NO: 229) D A S S L D S

E55Q (SEQ ID NO: 230) D A S S L Q S

S56G (SEQ ID NO: 231) D A S S L E G

S56T (SEQ ID NO: 232) D A S S L E T

S56N (SEQ ID NO: 233) D A S S L E N

S56D (SEQ ID NO: 234) D A S S L E D

S56Q (SEQ ID NO: 235) D A S S L E Q

S56P (SEQ ID NO: 236) D A S S L E P

S56E (SEQ ID NO: 237) D A S S L E E

TABELA 18. SEQUÊNCIAS DE CDR3 DE CADEIA LEVE

EXEMPLIFICATIVAS 89 90 91 92 93 94 95 95a 95b 96 97 "18B1" (SEQ ID NO: 18) Q Q F N S Y P L W I T Q89M (SEQ ID NO: 238) M Q F N S Y P L W I T Q90G (SEQ ID NO: 239) Q G F N S Y P L W I T Q9 0A (SEQ ID NO: 240) Q A F N S Y P L W I T Q90D (SEQ ID NO: 241) Q D F N S Y P L W I T Q90E (SEQ ID NO: 242) Q E F N S Y P L W I T N92E (SEQ ID NO: 243) Q Q F E S Y P L W I T S93P (SEQ ID NO: 244) Q Q F N P Y P L W I T S93A (SEQ ID NO: 245) Q Q F N A Y P L W I T W95bT (SEQ ID NO: 246) Q Q F N S Y P L T I T W95bl (SEQ ID NO: 247) Q Q F N S Y P L I I T W95bM (SEQ ID NO: 248) Q Q F N S Y P L M I T W95bK (SEQ ID NO: 249) Q Q F N S Y P L K I T W95bN (SEQ ID NO: 250) Q Q F N S Y P L N I T W95bE (SEQ ID NO: 251) Q Q F N S Y P L E I T W95bQ (SEQ ID NO: 252) Q Q F N S Y P L Q I T I96L (SEQ ID NO: 253) Q Q F N S Y P L W L T T97M (SEQ ID NO: 254) Q Q F N S Y P L W I M T97K (SEQ ID NO: 255) Q Q F N S Y P L W I K T97H (SEQ ID NO: 256) Q Q F N S Y P L W I H T97Y (SEQ ID NO: 257) Q Q F N S Y P L W I Y T97E (SEQ ID NO: 258) Q Q F N S Y P L W I E T97Q (SEQ ID NO: 259) Q Q F N S Y P L W I Q

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo isolado ou porção de ligação a antígeno do mesmo, que se liga especificamente a uma cadeia alfa de um receptor de IL-7 humana ("anticorpo anti-IL-7R"), caracterizado pelo fato de que compreende uma CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada e uma CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve, em que o anticorpo (a) tem capacidade para se ligar às células T (CD4+CD45RA+, CD4+CD45RA", CD8+CD45RA+ e/ou CD8+CD45RA) no sangue total com uma EC 50 de aproximadamente 5 nM ou menos (por exemplo, menos de aproximadamente 3 nM); (b) não tem capacidade para se ligar às células não T no sangue total; (c) não tem capacidade para bloquear de maneira eficaz a ativação mediada por linfopoietina estromal tímica (TSLP) dos monócitos; (d) não antagoniza a sinalização do receptor de IL-7 mediante a ligação ao receptor de IL-7, por exemplo, ativação mínima de pSTAT5; ou (e) qualquer combinação dos mesmos.

2. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a CDR3 de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 15 (DEYSRGYYVLDV).

3. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo tem uma ou mais propriedades selecionadas do grupo que consiste em: (a) tem capacidade para se ligar seletivamente a uma cadeia alfa de um receptor de IL-7 (IL-7R) humana ou de cinomolgo; (b) tem capacidade para se ligar a uma cadeia alfa de IL-7R solúvel e ligada a uma membrana; (c) tem capacidade para bloquear uma expansão e/ou sobrevivência de células T patogênicas quando administrado a um indivíduo em necessidade do mesmo; (d) tem capacidade para restaurar uma função de célula T reguladora (Treg) e/ou promover uma sobrevivência de Treg quando administrado a um indivíduo em necessidade do mesmo; (e) tem capacidade para manter uma remissão livre de fármaco mais longe que por meio de CTLA4-Ig (ORENCIA®); (f) tem capacidade para bloquear inflamação e danos à mucosa, por exemplo, induzidos por células T patogênicas, dentro de um tecido intestinal de um indivíduo em necessidade do mesmo; (g) tem capacidade para diminuir uma frequência de células T efetoras nos nodos linfáticos mesentéricos (MLN) e/ou na lâmina própria (LP) em um indivíduo em necessidade do mesmo; (h) tem capacidade para reduzir ou inibir a ativação de pSTAT mediada por IL-7 nas células T (por exemplo, CD4+CD45RA+); (i) tem capacidade para bloquear a expansão de células produtoras de IL-17 e/ou IFN-gama; (j) tem capacidade para tratar um indivíduo com uma doença inflamatória (por exemplo, doença intestinal inflamatória); e (k) qualquer combinação dos mesmos.

4. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a CDR1 de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 13 (DHAMH).

5. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a CDR2 de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 14 (GISWNSRGIGYADSVKG).

6. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a CDR1 de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 16 (RASQGISSALA).

7. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a CDR2 de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 17 (DASSLES).

8. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a CDR3 de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 18 (QQFNSYPLWIT).

9. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) e uma região variável de cadeia leve (VL), em que a VH compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos aproximadamente 80%, pelo menos aproximadamente 85%, pelo menos aproximadamente 90%, pelo menos aproximadamente 95%, pelo menos aproximadamente 96%, pelo menos aproximadamente 97%, pelo menos aproximadamente 98%, pelo menos aproximadamente 99% ou aproximadamente 100% idêntica à sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 19.

10. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a VL compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos aproximadamente 80%, pelo menos aproximadamente 85%, pelo menos aproximadamente 90%, pelo menos aproximadamente 95%, pelo menos aproximadamente 96%, pelo menos aproximadamente 97%, pelo menos aproximadamente 98%, pelo menos aproximadamente 99% ou aproximadamente 100% idêntica à sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 20.

11. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que se liga especificamente à cadeia alfa do receptor de IL-7 humana em um epítopo selecionado do grupo que consiste em: 24 SQLEVNGSQHSLTCAF39 (SEQ ID NO: 8); 73 FIETKKFLLIGKSNIC88 89 (SEQ ID NO: 9); VKVGEKSLTCKKIDLTT105 (SEQ ID NO: 10); 136 QKKYVKVLMHDVAY149 (SEQ ID NO: 11); 181 YEIKVRSIPDHYFKGF196 (SEQ ID NO: 12); e combinações dos mesmos.

12. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, que se liga especificamente à cadeia alfa do receptor de IL-7 humana em um epítopo, caracterizado pelo fato de que compreende um ou mais resíduos de aminoácido selecionados do grupo que consiste em H33, E75, F79, I82, K84, M144, R186, H191, Y192 e combinações dos mesmos.

13. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é selecionado do grupo que consiste em uma IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 e em uma variante da mesma.

14. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo IgG1.

15. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que compreende uma IgG1 Fc sem função efetora.

16. Anticorpo isolado ou porção de ligação a antígeno do mesmo, que se liga especificamente a uma cadeia alfa de um receptor de IL-7 humana ("anticorpo anti-IL-7R"), caracterizado pelo fato de que compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 21 e em que a cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 22.

17. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que se liga à cadeia alfa do receptor de IL-7 humana com uma KD inferior a 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM ou 1 nM (por exemplo, 1,3 nM), como medido por ressonância de plasmon de superfície.

18. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que se liga à cadeia alfa do receptor de IL-7 de cinomolgo com uma KD inferior a 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM ou 1 nM (por exemplo, 1,7 nM), como medido por ressonância de plasmon de superfície.

19. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 17 ou 18, caracterizado pelo fato de que a ligação à cadeia alfa do receptor de IL- 7 humana ou à cadeia alfa do receptor de IL-7 de cinomolgo é dependente de pH.

20. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que se liga à cadeia alfa do receptor de IL-7 humana com uma KD de aproximadamente 1,3 nM a pH 7,4 e com uma KD de aproximadamente 5,3 nM a pH 6.

21. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 19 ou 20, caracterizado pelo fato de que se liga à cadeia alfa do receptor de IL-7 de cinomolgo com uma KD de aproximadamente 1,7 nM a pH 7,4 e com uma KD de aproximadamente 7,0 nM a pH 6.

22. Anticorpo isolado ou porção de ligação a antígeno do mesmo, que se liga especificamente a uma cadeia alfa de um receptor de IL-7 humana (“anticorpo anti-IL-7R”), caracterizado pelo fato de que compreende uma CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada (HC) e uma CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve (LC), em que a CDR1 de HC compreende a sequência de aminoácidos GX1X2FDDHAX3H (SEQ ID NO: 260), em que X1 é F ou Y; X2 é T, P, A, S, V, L, I, M, H, F, Y, N, D, E ou Q e X3 é L ou M.

23. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que X2 é D ou E.

24. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 22 ou 23, caracterizado pelo fato de que a CDR2 de HC compreende a sequência de aminoácidos GIX1WX2SRGX3GYX4X5X6X7X8X9 (SEQ ID NO: 261), em que X1 é S ou T; X2 é H ou N; X3 é I ou V; X4 é G, A, S, T, V, L, I, R, H ou N; X5 é P, T, N, D, E, Q, S, H ou Y; X6 é P, G, A, S, T, V, R, H, F, Y, N, D ou E; X7 é V ou I; X8 é A, S, T, V, L, I, M, K, R, H, F, Y, N, D, E ou Q e X9 é G, H, D ou Q.

25. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que X1 é T.

26. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 25, caracterizado pelo fato de que a CDR3 de HC compreende a sequência de aminoácidos DEYX1X2GYYX3LDX4 (SEQ ID NO: 262), em que X1 é S, T, N, D ou E; X2 é L, M, R ou S; X3 é G, A, S, T, V, M, N, E ou Q e X4 é A, S, T, V, R, H, Y, W, N, E, Q ou M.

27. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que X3 é A, S ou T.

28. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 26 ou 27, caracterizado pelo fato de que X4 é E.

29. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 28, caracterizado pelo fato de que a CDR1 de LC compreende a sequência de aminoácidos X1X2X3X4X5X6X7SX8X9A (SEQ ID NO: 263), em que X1é S, T, V, K, R, H, Y ou I; X2 é A, S, T ou V; X3 é P, G, A, S, T, V, L, I, M, K, R, H, N, E ou Q: X4 é P, G, A, S, T, V, L, I, M, H, F, Y, N, D, E ou Q; X5 é P, G, A, S, T, H, E, Q, M, N ou D; X6 é P, G, A, S, T, V, L, I ou N; X7 é S, T, V, L, I, M, H, F, Y, N, D, E ou Q; X8 é P ou A e X9 é A, L ou V.

30. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que X6 é P.

31. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 29 ou 30, caracterizado pelo fato de que X8 é P.

32. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 31, caracterizado pelo fato de que X7 é D ou E.

33. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 32, caracterizado pelo fato de que a CDR2 de LC compreende a sequência de aminoácidos DX1X2X3X4X5X6 (SEQ ID NO: 264), em que X1é G, A, S, M, H, N, D, E ou Q; X2 é G, A, S, T, V, M, H, F, Y, N, D, E ou Q; X3 é A, S, F, Y, W, N, D, E ou L; X4 é P, S, T, L, K, H ou N; X5 é D, E ou Q e X6 é G, S, T, N, D, Q, P ou E.

34. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 33, caracterizado pelo fato de que a CDR3 de LC compreende a sequência de aminoácidos X1X2FX3X4YPLX5X6X7 (SEQ ID NO: 265), em que X1 é M ou Q; X2 é G, A, D, E ou Q; X3 é N ou E; X4 é P, A ou S; X5 é T, I, M, K, W, N, E ou Q; X6 é L ou I e X7 é T, M, K, H, Y, E ou Q.

35. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que X2 é A.

36. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 34 ou 35, caracterizado pelo fato de que X4 é P ou A.

37. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 36, caracterizado pelo fato de que a CDR1 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NOs: 31 a 46.

38. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que a CDR1 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 43 ou SEQ ID NO: 44.

39. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 38, caracterizado pelo fato de que a CDR2 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NOs: 47 a 96.

40. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que a CDR2 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 47.

41. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 40, caracterizado pelo fato de que a CDR3 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NOs: 97 a 122.

42. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que a CDR3 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107 ou SEQ ID NO: 120.

43. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 42, caracterizado pelo fato de que a CDR1 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NOs: 123 a 194.

44. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que a CDR1 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 190 ou SEQ ID NO: 192.

45. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 44, caracterizado pelo fato de que a CDR2 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NOs: 195 a 237.

46. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 45, caracterizado pelo fato de que a CDR3 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NOs: 238 a 259.

47. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 46,

caracterizado pelo fato de que a CDR3 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 240, SEQ ID NO: 244 ou SEQ ID NO: 245.

48. Anticorpo isolado ou porção de ligação a antígeno do mesmo, que se liga especificamente a uma cadeia alfa de um receptor de IL-7 humana (“anticorpo anti-IL-7R”), caracterizado pelo fato de que compreende uma CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada (HC) e uma CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve (LC), em que: (i) a CDR1 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NOs: 31 a 46; (ii) a CDR2 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 14; (iii) a CDR3 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 15; (iv) a CDR1 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 16; (v) a CDR2 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 17; e (vi) a CDR3 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 18.

49. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que a CDR1 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 43 ou SEQ ID NO: 44.

50. Anticorpo isolado ou porção de ligação a antígeno do mesmo, que se liga especificamente a uma cadeia alfa de um receptor de IL-7 humana (“anticorpo anti-IL-7R”), caracterizado pelo fato de que compreende uma CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada (HC) e uma CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve (LC), em que: (i) a CDR1 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 13; (ii) a CDR2 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NOs: 47 a 96; (iii) a CDR3 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 15; (iv) a CDR1 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 16; (v) a CDR2 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 17; e (vi) a CDR3 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 18.

51. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que a CDR2 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 47.

52. Anticorpo isolado ou porção de ligação a antígeno do mesmo, que se liga especificamente a uma cadeia alfa de um receptor de IL-7 humana (“anticorpo anti-IL-7R”), caracterizado pelo fato de que compreende uma CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada (HC) e uma CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve (LC), em que: (i) a CDR1 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 13; (ii) a CDR2 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 14; (iii) a CDR3 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NOs: 97 a 122; (iv) a CDR1 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 16; (v) a CDR2 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 17; e (vi) a CDR3 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 18.

53. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que a CDR3 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107 ou SEQ ID NO: 120.

54. Anticorpo isolado ou porção de ligação a antígeno do mesmo, que se liga especificamente a uma cadeia alfa de um receptor de IL-7 humana (“anticorpo anti-IL-7R”), caracterizado pelo fato de que compreende uma CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada (HC) e uma CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve (LC), em que: (i) a CDR1 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 13; (ii) a CDR2 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 14; (iii) a CDR3 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 15; (iv) a CDR1 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NOs: 123 a 194; (v) a CDR2 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 17; e (vi) a CDR3 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 18.

55. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de que a CDR1 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 190 ou SEQ ID NO: 192.

56. Anticorpo isolado ou porção de ligação a antígeno do mesmo, que se liga especificamente a uma cadeia alfa de um receptor de IL-7 humana (“anticorpo anti-IL-7R”), caracterizado pelo fato de que compreende uma CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada (HC) e uma

CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve (LC), em que: (i) a CDR1 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 13; (ii) a CDR2 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 14; (iii) a CDR3 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 15; (iv) a CDR1 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 16; (v) a CDR2 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NOs: 195 a 237; e (vi) a CDR3 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 18.

57. Anticorpo isolado ou porção de ligação a antígeno do mesmo, que se liga especificamente a uma cadeia alfa de um receptor de IL-7 humana (“anticorpo anti-IL-7R”), caracterizado pelo fato de que compreende uma CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada (HC) e uma CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve (LC), em que: (i) a CDR1 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 13; (ii) a CDR2 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 14; (iii) a CDR3 de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 15; (iv) a CDR1 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 16; (v) a CDR2 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 17; e (vi) a CDR3 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NOs: 238 a 259.

58. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que a CDR3 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 240, SEQ ID NO: 244 ou SEQ ID NO: 245.

59. Ácido nucleico, caracterizado pelo fato de que codifica o anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 58.

60. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende o ácido nucleico, como definido na reivindicação 59.

61. Célula, caracterizada pelo fato de que compreende o vetor, como definido na reivindicação 60.

62. Célula, de acordo com a reivindicação 61, caracterizada pelo fato de que é células CHO, células HEK293, células HBK, células COS, células NSO ou células HT1080.

63. Imunoconjugado, caracterizado pelo fato de que compreende o anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 58, ligado a um agente.

64. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 58, o ácido nucleico, como definido na reivindicação 59, o vetor, como definido na reivindicação 60, a célula, como definido na reivindicação 61 ou 62, ou o imunoconjugado, como definido na reivindicação 63, e um veículo.

65. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende o anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 58, o ácido nucleico, como definido na reivindicação 59, o vetor, como definido na reivindicação 60, a célula, como definido na reivindicação 61 ou 62, ou o imunoconjugado, como definido na reivindicação 63, e uma instrução para uso.

66. Método para inibir a atividade de IL-7 em um indivíduo em necessidade do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar o anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 58, o ácido nucleico, como definido na reivindicação 59, o vetor, como definido na reivindicação 60, a célula, como definido na reivindicação 61 ou 62, ou o imunoconjugado, como definido na reivindicação 63, ao indivíduo.

67. Método para inibir a proliferação de células T efetoras e/ou induzir geração e/ou sobrevivência de células T reguladoras em um indivíduo em necessidade do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar o anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 58, o ácido nucleico, como definido na reivindicação 59, o vetor, como definido na reivindicação 60, uma célula, como definido na reivindicação 61 ou 62, ou o imunoconjugado, como definido na reivindicação 63, ao indivíduo.

68. Método para tratar uma doença inflamatória ou uma doença autoimune em um indivíduo em necessidade do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar o anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 58, o ácido nucleico, como definido na reivindicação 59, o vetor, como definido na reivindicação 60, a célula, como definido na reivindicação 61 ou 62, ou o imunoconjugado, como definido na reivindicação 63, ao indivíduo.

69. Método, de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pelo fato de que a doença inflamatória ou a doença autoimune é selecionada do grupo que consiste em uma doença intestinal inflamatória (DII), síndrome do intestino irritável, artrite reumatoide (AR), psoríase, artrite psoriática, lúpus eritematoso sistêmico (LES), nefrite lúpica, vasculite, sepse, síndrome da resposta inflamatória sistêmica (SIRS), diabetes tipo I, doença de Grave, esclerose múltipla (EM), miocardite autoimune, doença de Kawasaki, doença arterial coronariana, doença pulmonar obstrutiva crônica, doença pulmonar intersticial, tireoidite autoimune, esclerodermia, esclerose sistêmica,

osteoartrite, dermatite atópica, vitiligo, doença do enxerto contra o hospedeiro, síndrome de Sjögren, nefrite autoimune, síndrome de Goodpasture, polineuropatia desmielinizante inflamatória crônica, alergia, asma, outras doenças autoimunes que são um resultado de inflamação ou aguda ou crônica e quaisquer combinações das mesmas.

70. Método, de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pelo fato de que a doença inflamatória ou a doença autoimune é uma doença intestinal inflamatória.

71. Método, de acordo com a reivindicação 69 ou 70, caracterizado pelo fato de que a doença intestinal inflamatória é colite ulcerativa ou doença de Crohn.

72. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 66 a 71, caracterizado pelo fato de que o indivíduo não respondeu adequadamente à terapia anterior com o inibidor de TNF-α (respondedor inadequado anti-TNF-α).

73. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 66 a 72, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente administrar um ou mais produtos terapêuticos adicionais.

74. Método, de acordo com a reivindicação 73, caracterizado pelo fato de que os produtos terapêuticos adicionais compreendem um anticorpo anti-TNF-α.

75. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 66 a 74, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é administrado ao indivíduo em uma dose fixa ou uma dose com base no peso corporal.

76. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 66 a 75, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é administrado por via intravenosa, subcutânea, intramuscular, intradérmica ou intraperitoneal.

77. Método, de acordo com a reivindicação 76, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é administrado por via intravenosa ou subcutânea.

78. Método para produzir um anticorpo que se liga especificamente a uma cadeia alfa de um receptor de IL-7 humana ("anticorpo anti-IL-7R"), caracterizado pelo fato de que compreende cultivar a célula, como definido na reivindicação 61 ou 62, sob condições adequadas e isolar o anticorpo.