JP6983776B2 - グルココルチコイド誘発腫瘍壊死因子受容体(gitr)に対する抗体およびその使用 - Google Patents
グルココルチコイド誘発腫瘍壊死因子受容体(gitr)に対する抗体およびその使用 Download PDFInfo
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Description
本出願は、それぞれ2015年11月19日および2016年3月4日出願の米国仮出願62/257,599号および62/303,990号に基づく優先権を主張する。上記出願の内容を、引用により本明細書に包含させる。
本出願は、ASCII形式で電子的に提供されており、引用により本明細書にその全体を包含させる配列表を含む。該ASCIIコピーは2017年11月17日に作成し、2016-11-15_MXI-547PC_ST25.txtなる名称であり、1,011,555バイトサイズである。
TNFRSF18、AITR、CD357およびGITR−Dとしても知られる共刺激性分子であるグルココルチコイド誘発TNFR関連タンパク質(GITR)は、元々デキサメサゾンで処置されたマウスT細胞株において同定されたTNF受容体ファミリーのメンバーである(Nocentini et al., PNAS 1997;94:6216-21)。TNF受容体ファミリーの他の関連メンバーは、CD40、CD27、4−1BBおよびOX40を含む。GITR発現はナイーブCD4+細胞およびCD8+細胞で低いが、制御性T細胞で構成的に発現される(Tone et al., PNAS 2003;100:15059-64)。一方で、その発現がエフェクターT細胞で誘発されたら、GITR結合は、その活性化、増殖およびサイトカイン産生を促進する(Watts, Annual Reviews in Immunology 2005;23:23-68)。CD4+CD25+制御性T細胞(Treg)について、Shimizuは、混合培養抑制アッセイを使用して、GITR結合はその機能を抑制すると報告している(Shimizu et al., Nature Immunology 2002;3:135-42)。しかしながら、Stephans et al (JI 2004 15;173(8):5008-20)によるその後の研究で、Tエフェクター(Teff)細胞上のGITR結合は、それらをTreg抑制に低感受性とすることを特定し、Treg−Teff細胞共培養において観察される抑制低下を説明する。DTA−1(ラット抗マウスGITR)抗体介在GITR刺激は、複数の腫瘍モデルにおいて抗腫瘍免疫を促進する。
ここに提供されるのは、GITRと特異的に結合し、望ましい機能的性質を有する、モノクローナル抗体、特にヒトモノクローナル抗体などの単離抗体である。これらの性質は、ヒトGITRへの高親和性結合、サルGITR(例えば、カニクイザルGITR)への結合および抗原特異的T細胞応答を刺激する能力である。ここに記載する抗体は、腫瘍担持またはウイルス担持(ウイルス感染)対象におけるような、抗原特異的T細胞応答刺激およびサンプル中のGITRタンパク質検出に使用できる。
(a)可溶性ヒトGITRに結合;
(b)膜結合ヒトGITRに結合;
(c)膜結合カニクイザルGITRに結合;
(d)T細胞活性化、例えば、抗原特異的T細胞活性化誘発または増強;
(e)GITRリガンドの3A9−hGITR細胞上のGITRへの結合阻害;
(f)GITRリガンドの活性化T細胞上のGITRへの結合の、最大でも部分的阻害;
(g)成熟ヒトGITR上の立体構造エピトープ(配列番号4)に結合;
(h)O結合およびNグリコシル化および非グリコシル化ヒトGITRの両方への結合;
(i)Fc受容体への結合の非存在下でアゴニスト活性を有するが、Fc受容体への結合がアゴニスト活性をさらに増強;および
(j)抗体28F3、3C3−1、3C3−2、2G6、8A6、9G7−1、9G7−2、14E3、19H8−1、19H8−2、19D3、18E10および6G10の1以上と、ヒトGITRへの結合について何れかの方向でまたは双方向で競合。
(a)配列番号13および14;
(b)配列番号26および27;
(c)配列番号39および40;
(d)配列番号52および53;
(e)配列番号52および54;
(f)配列番号71および72;
(g)配列番号84および85;
(h)配列番号97および98;
(i)配列番号97および99;
(j)配列番号115および116;
(k)配列番号128および129;
(l)配列番号128および130;および
(m)配列番号335および336
から選択される可変重鎖および可変軽鎖対である3可変重鎖CDRおよび3可変軽鎖CDRを含み、(1)配列番号223〜226、283〜290、383〜446および480〜543からなる群から選択されるアミノ酸配列または(2)配列番号223〜226、283〜290、383〜446および480〜543と最大5アミノ酸異なるかまたはそれと少なくとも95%、96%、97%、98%または99%同一である重鎖定常領域であって、ここで、該アミノ酸修飾が配列番号223〜226、283〜290、383〜446および480〜543における天然に存在するヒト重鎖定常領域に存在しない特定のアミノ酸におけるものではないものを含む、おいてではないものを含む、重鎖定常領域を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分である。
(a)配列番号20、21および22をそれぞれ含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列および/または配列番号23、24および25をそれぞれ含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列;
(b)配列番号33、34および35をそれぞれ含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列および/または配列番号36、37および38をそれぞれ含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列;または
(c)配列番号46、47および48をそれぞれ含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列および/または配列番号49、50および51をそれぞれ含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列;
(d)配列番号62、63および64をそれぞれ含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列および/または配列番号65、66および67をそれぞれ含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列;
(e)配列番号62、63および64をそれぞれ含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列および/または配列番号68、69および70をそれぞれ含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列;
(f)配列番号78、79および80をそれぞれ含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列および/または配列番号81、82および83をそれぞれ含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列;
(g)配列番号91、92および93をそれぞれ含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列および/または配列番号94、95および96をそれぞれ含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列;
(h)配列番号106、107および108をそれぞれ含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列および/または配列番号109、110および111をそれぞれ含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列;
(i)配列番号106、107および108をそれぞれ含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列および/または配列番号112、113および114をそれぞれ含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列;
(j)配列番号122、123および124をそれぞれ含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列および/または配列番号125、126および127をそれぞれ含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列;
(k)配列番号138、139および140をそれぞれ含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列および/または配列番号141、142および143をそれぞれ含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列;
(l)配列番号138、139および140をそれぞれ含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列および/または配列番号144、145および146をそれぞれ含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列;または
(m)配列番号342、343および344をそれぞれ含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列および/または配列番号345、346および347をそれぞれ含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列および(1)配列番号223〜226、283〜290、383〜446および480〜543からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域または(2)配列番号223〜226、283〜290、383〜446および480〜543と最大5アミノ酸異なるかまたはそれと少なくとも95%、96%、97%、98%または99%同一である重鎖定常領域であって、ここで、該アミノ酸修飾が、配列番号223〜226、283〜290、383〜446および480〜543に存在しない特定のアミノ酸であって、天然に存在するヒト重鎖定常領域に存在しないものにおけるものを含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分である。
(a)それぞれ配列番号13および14;
(b)それぞれ配列番号26および27;
(c)それぞれ配列番号39および40;
(d)それぞれ配列番号52および53;
(e)それぞれ配列番号52および54;
(f)それぞれ配列番号71および72;
(g)それぞれ配列番号84および85;
(h)それぞれ配列番号97および98;
(i)それぞれ配列番号97および99;
(j)それぞれ配列番号115および116;
(k)それぞれ配列番号128および129;
(l)それぞれ配列番号128および130;および
(m)それぞれ配列番号335および336
からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも85%同一、例えば、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%同一である重鎖および軽鎖可変領域配列を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分である。
(a)それぞれ配列番号15および16;
(b)それぞれ配列番号17および19;
(c)それぞれ配列番号18および19;
(d)それぞれ配列番号28および29;
(e)それぞれ配列番号30および32;
(f)それぞれ配列番号31および32;
(g)それぞれ配列番号41および42;
(h)それぞれ配列番号43および45;
(i)それぞれ配列番号44および45;
(j)それぞれ配列番号55および56;
(k)それぞれ配列番号55および57;
(l)それぞれ配列番号58および60;
(m)それぞれ配列番号59および60;
(n)それぞれ配列番号58および61;
(o)それぞれ配列番号59および61;
(p)それぞれ配列番号73および74;
(q)それぞれ配列番号75および77;
(r)それぞれ配列番号76および77;
(s)それぞれ配列番号86および87;
(t)それぞれ配列番号88および90;
(u)それぞれ配列番号89および90;
(v)それぞれ配列番号102および104;
(w)それぞれ配列番号103および104;
(x)それぞれ配列番号100および101;
(y)それぞれ配列番号100および371;
(z)それぞれ配列番号102および105;
(za)それぞれ配列番号103および105;
(zb)それぞれ配列番号117および118;
(zc)それぞれ配列番号119および121;
(zd)それぞれ配列番号120および121;
(ze)それぞれ配列番号131および132;
(zf)それぞれ配列番号134および136;
(zg)それぞれ配列番号135および136;
(zh)それぞれ配列番号131および133;
(zi)それぞれ配列番号134および137;
(zj)それぞれ配列番号135および137;
(zk)それぞれ配列番号337および338;
(zl)それぞれ配列番号339および341;および
(zm)それぞれ配列番号340および341
からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%同一である重鎖および軽鎖配列を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分である。
ここに記載されるのは、GITRに特異的に結合し、それにより下流GITRシグナル伝達を活性可する、単離抗体、特にモノクローナル抗体、例えば、ヒトモノクローナル抗体(“アゴニスト抗GITR抗体”)である。ある実施態様において、ここに記載する抗体は特定の重鎖および軽鎖生殖系列配列に由来し、そして/または特定のアミノ酸配列を含むCDR領域などの特定の構造特性を含む。ここに提供されるのは、単離抗体、このような抗体を含むイムノコンジュゲートおよび二重特異性分子の製造方法、このような抗体を含むように製剤された医薬組成物である。またここに提供されるのは、単独でまたは他の免疫刺激剤(例えば、抗体)および/または癌治療と組み合わせた、該抗体を免疫応答増強のために使用する方法である。従って、ここに記載する抗GITR抗体を、例えば、腫瘍増殖阻害およびウイルス感染処置を含む、広範な治療適用における処置に使用し得る。
本記載がよりよく理解され得るために、いくつかの用語をまず定義する。さらなる定義は、詳細な記載をとおして示される。
MAQHGAMGAFRALCGLALLCALSLGQRPTGGPGCGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTRCCRDYPGEECCSEWDCMCVQPEFHCGDPCCTTCRHHPCPPGQGVQSQGKFSFGFQCIDCASGTFSGGHEGHCKPWTDCTQFGFLTVFPGNKTHNAVCVPGSPPAEPLGWLTVVLLAVAACVLLLTSAQLGLHIWQLRSQCMWPRETQLLLEVPPSTEDARSCQFPEEERGERSAEEKGRLGDLWV
MAQHGAMGAFRALCGLALLCALSLGQRPTGGPGCGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTRCCRDYPGEECCSEWDCMCVQPEFHCGDPCCTTCRHHPCPPGQGVQSQGKFSFGFQCIDCASGTFSGGHEGHCKPWTDCCWRCRRRPKTPEAASSPRKSGASDRQRRRGGWETCGCEPGRPPGPPTAASPSPGAPQAAGALRSALGRALLPWQQKWVQEGGSDQRPGPCSSAAAAGPCRRERETQSWPPSSLAGPDGVGS
MAQHGAMGAFRALCGLALLCALSLGQRPTGGPGCGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTRCCRDYPGEECCSEWDCMCVQPEFHCGDPCCTTCRHHPCPPGQGVQSQGKFSFGFQCIDCASGTFSGGHEGHCKPWTDCTQFGFLTVFPGNKTHNAVCVPGSPPAEPLGWLTVVLLAVAACVLLLTSAQLGLHIWQLRKTQLLLEVPPSTEDARSCQFPEEERGERSAEEKGRLGDLWV
QRPTGGPGCGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTRCCRDYPGEECCSEWDCMCVQPEFHCGDPCCTTCRHHPCPPGQGVQSQGKFSFGFQCIDCASGTFSGGHEGHCKPWTDCTQFGFLTVFPGNKTHNAVCVPGSPPAEP(配列番号4)
を有する。
MCASGTLCCLALLCAASLGQRPTGGPGCGPGRLLLGTGKDARCCRVHPTRCCRDYQGEECCSEWDCVCVQPEFHCGNPCCTTCQHHPCPSGQGVQPQGKFSFGFRCVDCALGTFSRGHDGHCKPWTDCTQFGFLTVFPGNKTHNAVCVPGSPPAEPPGWLTIILLAVAACVLLLTSAQLGLHIWQLRSQPTGPRETQLLLEVPPSTEDASSCQFPEEERGERLAEEKGRLGDLWV
MTLHPSPITCEFLFSTALISPKMCLSHLENMPLSHSRTQGAQRSSWKLWLFCSIVMLLFLCSFSWLIFIFLQLETAKEPCMAKFGPLPSKWQMASSEPPCVNKVSDWKLEILQNGLYLIYGQVAPNANYNDVAPFEVRLYKNKDMIQTLTNKSKIQNVGGTYELHVGDTIDLIFNSEHQVLKNNTYWGIILLANPQFIS
ここに記載するのは、特定の機能的特性または性質により特徴付けられる抗体、例えば、完全ヒト抗体である。例えば、抗体は、ヒトGITRと特異的に結合する。さらに、抗体は、カニクイザルGITRなどの1以上の非ヒト霊長類からのGITRと交差反応し得る。
(a)カニクイザルGITRに結合;
(b)免疫応答を刺激または増強;
(c)T細胞活性化(例えば、サイトカイン分泌および/または増殖の増強により証明される);
(d)3A9−hGITR細胞のGITRへのGITRLの結合阻害;
(e)GITRリガンドの活性化T細胞上のGITRへの結合の、最大でも部分的阻害;
(f)ヒトGITRのN末端部分における立体構造エピトープへの結合;
(g)グリコシル化および非グリコシル化両方のヒトGITRへの結合;および
(h)Fc受容体への結合の非存在下でアゴニスト活性を有するが、Fc受容体への結合がアゴニスト活性をさらに増強。
(1)例えば、Biacoreにより測定して、例えば10nM以下(例えば、0.01nM〜10nM)のKDで可溶性ヒトGITRに結合;
(2)例えば、スキャッチャードにより測定して、例えば1nM以下(例えば、0.01nM〜1nM)のKDで膜結合ヒトGITRに結合;
(3)例えば、FACSにより測定して、例えば1nM以下(例えば、0.01nM〜1nM)のEC50で膜結合ヒトGITRに結合;
(4)例えば、FACSにより測定して、例えば10nM以下(例えば、0.01nM〜10nM)のEC50でカニクイザルGITRに結合、例えば、膜結合カニクイザルGITRに結合;
(5)(i)GITR発現T細胞におけるIL−2および/またはIFN−γ産生増加および/または(ii)T細胞増殖増強により証明される、CD3結合の存在下(例えば、最適以下の抗CD3濃度の存在下)におけるような、T細胞活性化誘発または増強;
(6)多価架橋を必要としないT細胞活性化の誘発または増強;
(7)Fc受容体への結合の非存在下でアゴニスト活性を有するが、Fc受容体への結合がアゴニスト活性をさらに増強;
(8)例えば、3A9−hGITR細胞を用いるアッセイにおいて、FACSにより測定して、例えば、1μg/mL以下のEC50でGITRリガンドのGITRへの結合を阻害;
(9)GITRリガンドの活性化T細胞上のGITRへの結合の、最大でも部分的阻害;
(10)成熟ヒトGITR(配列番号4)上の立体構造エピトープ、例えば、アミノ酸配列PTGGPGCGPGRLLLGTGT(配列番号217)およびCRDYPGEE(配列番号218)内の不連続エピトープに結合;
(11)O結合およびN結合グリコシル化および非グリコシル化両方のヒトGITRに結合;および
(12)ヒトGITRへの結合について28F3、3C3−1、3C3−2、2G6、8A6、9G7−1、9G7−2、14E3、19H8−1、19H8−2、19D3、18E10および/または6G10と何れかの方向または双方向で競合。
特定のここに記載する抗体は、抗体28F3、19D3、18E10、3C3、2G6、8A6、9G7、14E3、19H8および6G10のCDRおよび/または可変領域配列を有し、実施例1に記載のとおり単離および構造的特徴付けされた抗体、例えば、モノクローナル抗体ならびにその可変領域またはCDR配列と少なくとも80%同一性(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも99%同一性)を有する抗体である。28F3、19D3、18E10、3C3(3C3−1および3C3−2)、2G6、8A6、9G7(9G7−1および9G7−2)、14E3、19H8(19H8−1および19H8−2)および6G10のVHアミノ酸配列は、それぞれ配列番号13、26、39、52、71、84、97、115、128および335に示す。28F3、19D3、18E10、3C3−1、3C3−2、2G6、8A6、9G7−1、9G7−2、14E3、19H8−1、19H8−2および6G10のVLアミノ酸配列は、それぞれ配列番号14、27、40、53、54、72、85、98、99、116、129、130および336に示す。
(a)それぞれ配列番号13および14を含む重鎖および軽鎖可変領域配列;
(b)それぞれ配列番号26および27を含む重鎖および軽鎖可変領域配列;
(c)それぞれ配列番号39および40を含む重鎖および軽鎖可変領域配列;
(d)それぞれ配列番号52および53を含む重鎖および軽鎖可変領域配列;
(e)それぞれ配列番号52および54を含む重鎖および軽鎖可変領域配列;
(f)それぞれ配列番号71および72を含む重鎖および軽鎖可変領域配列;
(g)それぞれ配列番号84および85を含む重鎖および軽鎖可変領域配列;
(h)それぞれ配列番号97および98を含む重鎖および軽鎖可変領域配列;
(i)それぞれ配列番号97および99を含む重鎖および軽鎖可変領域配列;
(j)それぞれ配列番号115および116を含む重鎖および軽鎖可変領域配列;
(k)それぞれ配列番号128および129を含む重鎖および軽鎖可変領域配列;
(l)それぞれ配列番号128および130を含む重鎖および軽鎖可変領域配列;または
(m)それぞれ配列番号335および336を含む重鎖および軽鎖可変領域配列
を含む、単離抗体またはその抗原結合部分である。
(a)配列番号20、33、46、62、78、91、106、122、138および342からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1;
(b)配列番号21、34、47、63、79、92、107、123、139および343からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2;
(c)配列番号22、35、48、64、80、93、108、124、140および344からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3;
(d)配列番号23、36、49、65、68、81、94、109、112、125、141、144および345からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1;
(e)配列番号24、37、50、66、69、82、95、110、113、126、142、145および346からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2;および
(f)配列番号25、38、51、67、70、83、96、111、114、127、143、146および347からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3
を含む単離抗体またはその抗原結合部分であり、ここで、該抗体はヒトGITRに特異的に結合する。
(a)配列番号20〜22;
(b)配列番号33〜35;
(c)配列番号46〜48;
(d)配列番号62〜64;
(e)配列番号78〜80;
(f)配列番号91〜93;
(g)配列番号106〜108;
(h)配列番号122〜124;
(i)配列番号138〜140;または
(j)配列番号342〜344
を含み、ここで、該抗体はヒトGITRに特異的に結合する。
(a)配列番号23〜25;
(b)配列番号36〜38;
(c)配列番号49〜51;
(d)配列番号65〜67;
(e)配列番号68〜70;
(f)配列番号81〜83;
(f)配列番号94〜96;
(g)配列番号109〜111;
(h)配列番号112〜114;
(i)配列番号125〜127;
(j)配列番号141〜143;
(k)配列番号144〜146;または
(l)配列番号345〜347
を含み、ここで、該抗体はヒトGITRに特異的に結合する。
(a)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3はそれぞれ配列番号20〜22を含み、そして軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3はそれぞれ配列番号23〜25を含むか;
(b)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3はそれぞれ配列番号33〜35を含み、そして軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3はそれぞれ配列番号36〜38を含むか;
(c)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3はそれぞれ配列番号46〜48を含み、そして軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3はそれぞれ配列番号49〜51を含むか;
(d)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3はそれぞれ配列番号62〜64を含み、そして軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3はそれぞれ配列番号65〜67を含むか;
(e)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3はそれぞれ配列番号62〜64を含み、そして軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3はそれぞれ配列番号68〜70を含むか;
(f)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3はそれぞれ配列番号78〜80を含み、そして軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3はそれぞれ配列番号81〜83を含むか;
(g)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3はそれぞれ配列番号91〜93を含み、そして軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3はそれぞれ配列番号94〜96を含むか;
(h)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3はそれぞれ配列番号106〜108を含み、そして軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3はそれぞれ配列番号109〜111を含むか;
(i)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3はそれぞれ配列番号106〜108を含み、そして軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3はそれぞれ配列番号112〜114を含むか;
(j)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3はそれぞれ配列番号122〜124を含み、そして軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3はそれぞれ配列番号125〜127を含むか;
(k)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3はそれぞれ配列番号138〜140を含み、そして軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3はそれぞれ配列番号141〜143を含むか;
(l)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3はそれぞれ配列番号138〜140を含み、そして軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3はそれぞれ配列番号144〜146を含むか;または
(m)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3はそれぞれ配列番号342〜344を含み、そして軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3はそれぞれ配列番号345〜347を含み、
ここで、該抗体はヒトGITRに特異的に結合する。
ASTKGP SVFPLAPSSK STSGGTAALG CLVKDYFPEP VTVSWNSGAL TSGVHTFPAV
LQSSGLYSLS SVVTVPSSSL GTQTYICNVN HKPSNTKVDK RVEPKSCDKT HTCPPCPAPE
LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE
EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP
SREEMTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD
KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPG(配列番号7)
RTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC(配列番号12)
(1)例えば、Biacoreにより測定して、例えば10nM以下(例えば、0.01nM〜10nM)のKDで可溶性ヒトGITRに結合;
(2)例えば、スキャッチャードにより測定して、例えば1nM以下(例えば、0.01nM〜1nM)のKDで膜結合ヒトGITRに結合;
(3)例えば、FACSにより測定して、例えば1nM以下(例えば、0.01nM〜1nM)のEC50で膜結合ヒトGITRに結合;
(4)例えば、FACSにより測定して、例えば、10nM以下(例えば、0.01nM〜10nM)のEC50でカニクイザルGITRに結合、例えば、膜結合カニクイザルGITRに結合;
(5)(i)GITR発現T細胞におけるIL−2および/またはIFN−γ産生増加および/または(ii)T細胞増殖増強により証明される、CD3結合の存在下(例えば、最適以下の抗CD3濃度の存在下)におけるような、T細胞活性化の誘発または増強;
(6)多価架橋を必要としないT細胞活性化の誘発または増強;
(7)FACSにより測定して、例えば、1μg/mL以下のEC50でGITRリガンドの3A9−hGITR細胞上のGITRへの結合阻害;
(8)GITRリガンドの活性化T細胞上のGITRへの結合の、最大でも部分的阻害;
(9)成熟ヒトGITR(配列番号4)上の立体構造エピトープ、例えば、アミノ酸配列PTGGPGCGPGRLLLGTGT(配列番号217)およびCRDYPGEE(配列番号218)内の不連続エピトープに結合;
(10)O結合およびN結合グリコシル化および非グリコシル化両方のヒトGITRに結合;
(11)Fc受容体への結合の非存在下でアゴニスト活性を有するが、Fc受容体への結合がアゴニスト活性をさらに増強;および
(12)ヒトGITRへの結合について28F3、3C3−1、3C3−2、2G6、8A6、9G7−1、9G7−2、14E3、19H8−1、19H8−2、19D3、18E10および/または6G10と何れかの方向 または双方向で競合。
QRPTGGPGCGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTRCCRDYPGE(配列番号215)
内のアミノ酸残基に結合する。
QRPTGGPGCGPGRLLLGTGT(配列番号216)
内のアミノ酸残基に結合する。
PTGGPGCGPGRLLLGTGT(配列番号217)およびCRDYPGEE(配列番号218)
内のアミノ酸残基と結合する。
ここでさらに記載するとおり、ここに記載する抗GITR抗体の重鎖定常領域は、任意のアイソタイプ、例えば、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4またはこれらの組み合わせおよび/またはその修飾体であり得る。抗GITR抗体はエフェクター機能を有しても、エフェクター機能が低減していても失われていてもよい。ある実施態様において、抗GITR抗体は、抗体に増強された性質を提供する修飾重鎖定常領域を含む。実施例に示すとおり、IgG2ヒンジを含む修飾重鎖定常領域を有する抗GITR抗体は、非IgG2ヒンジを有する以外同じ可変領域を有する抗体と比較して、より強力なアゴニストである。例えば、IgG2ヒンジ、IgG1アイソタイプのCH2およびCH3ドメインを含み、エフェクター機能を有するかまたは有しない抗体は、抗体とインキュベートしたT細胞からのIFN−γおよびIL−2の分泌増強により測定して、増強されたアゴニスト活性を有する。特異的作用機序に限定されることを望まないが、IgG2ヒンジを有する抗GITR抗体は、より大きな抗体/抗原複合体を形成し、より効果的に内部移行し、それによりアゴニスト活性が増加されると仮説立てられる。大複合体の形成は、他のアイソタイプ(例えば、IgG1、IgG3およびIgG4)のヒンジと比較して、IgG2ヒンジの高い剛性に起因すると考えられる。実施例においてさらに記載するとおり、アゴニスト活性増強は、抗体の高いまたは低い親和性と相関するように見えない。従って、ここで提供されるのは、修飾重鎖定常領域を有する抗GITR抗体であり、ここで、抗GITR抗体は増強されたアゴニスト活性を有し、修飾重鎖定常領域を有する抗体の親和性は、重鎖定常領域が異なる以外、同じ可変領域を有するのと同程度の親和性でGITRに結合する。
ERKCCVECPPCPAPPVAG(配列番号447);
ERKSCVECPPCPAPPVAG(配列番号448);
ERKCSVECPPCPAPPVAG(配列番号449);
ERKXCVECPPCPAPPVAG(配列番号450);
ERKCXVECPPCPAPPVAG(配列番号451);
ERKCCVECPPCPAPPVAGX(配列番号452);
ERKSCVECPPCPAPPVAGX(配列番号453);
ERKCSVECPPCPAPPVAGX(配列番号454);
ERKXCVECPPCPAPPVAGX(配列番号455);
ERKCXVECPPCPAPPVAGX(配列番号456);
ERKCCVECPPCPAPELLGG(配列番号457);
ERKSCVECPPCPAPELLGG(配列番号458);
ERKCCSVECPPCPAPELLGG(配列番号459);
ERKXCVECPPCPAPELLGG(配列番号460);
ERKCXVECPPCPAPELLGG(配列番号461);
ERKCCVECPPCPAPELLG(配列番号462);
ERKSCVECPPCPAPELLG(配列番号463);
ERKCCSVECPPCPAPELLG(配列番号464);
ERKXCVECPPCPAPELLG(配列番号465);
ERKCXVECPPCPAPELLG(配列番号466);
ERKCCVECPPCPAP(配列番号467);
ERKSCVECPPCPAP(配列番号468);
ERKCSVECPPCPAP(配列番号469);
ERKXCVECPPCPAP(配列番号470);または
ERKCXVECPPCPAP(配列番号471)
〔ここで、Xはシステイン以外の任意のアミノ酸である〕
または、アミノ酸残基CVEとCPPの間に1〜5、1〜3、1〜2または1アミノ酸が挿入されている上記配列の何れかの一つを含むIgG2ヒンジを含む、修飾重鎖定常領域を含む。ある実施態様において、THTまたはGGGが挿入される。ある実施態様において、1、1〜2または1〜3アミノ酸がヒンジとCH2ドメインの間に挿入される。例えば、グリシンがヒンジとCH2ドメインの間に挿入され得る。
ある実施態様において、抗GITR抗体は、特定の生殖系列重鎖免疫グロブリン遺伝子からの重鎖可変領域および/または特定の生殖系列軽鎖免疫グロブリン遺伝子からの軽鎖可変領域を含む。
ここに包含されるのは、ここに記載する好ましい抗体のアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖可変領域を有する抗体であり、該抗体は、ここに記載する抗GITR抗体の所望の機能的性質を保持する。
(a)重鎖可変領域は、配列番号13、26、39、52、71、84、97、115、128および335からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%同一であるまたは配列番号13、26、39、52、71、84、97、115、128および335からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して1、2、3、4、5、1〜2、1〜3、1〜4、1〜5、1〜10、1〜15、1〜20、1〜25または1〜50アミノ酸変化(すなわち、アミノ酸置換、付加または欠失)を含むアミノ酸配列を含む;
(b)軽鎖可変領域は、配列番号14、27、40、53、54、72、85、98、99、116、129、130および336からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%同一であるまたは配列番号14、27、40、53、54、72、85、98、99、116、129、130および336からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して1、2、3、4、5、1〜2、1〜3、1〜4、1〜5、1〜10、1〜15、1〜20、1〜25または1〜50アミノ酸変化(すなわち、アミノ酸置換、付加または欠失)を含むアミノ酸配列を含む;
(c)抗体はGITRに特異的に結合する、そして
(d)抗体は、次の機能的性質の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11または全てを示す:
(1)例えば、Biacoreにより測定して、例えば10nM以下(例えば、0.01nM〜10nM)のKDで可溶性ヒトGITRに結合;
(2)例えば、スキャッチャードにより測定して、例えば1nM以下(例えば、0.01nM〜1nM)のKDで膜結合ヒトGITRに結合;
(3)例えば、FACSにより測定して、例えば1nM以下(例えば、0.01nM〜1nM)のEC50で膜結合ヒトGITRに結合;
(4)例えば、FACSにより測定して、例えば、10nM以下(例えば、0.01nM〜10nM)のEC50でカニクイザルGITRに結合、例えば、膜結合カニクイザルGITRに結合;
(5)(i)GITR発現T細胞におけるIL−2および/またはIFN−γ産生増加および/または(ii)T細胞増殖増強により証明される、CD3結合の存在下(例えば、最適以下の抗CD3濃度の存在下)におけるような、T細胞活性化の誘発または増強;
(6)多価架橋を必要としないT細胞活性化の誘発または増強;
(7)FACSにより測定して、例えば、1μg/mL以下のEC50でGITRリガンドの3A9−hGITR細胞上のGITRへの結合阻害;
(8)GITRリガンドの活性化T細胞上のGITRへの結合の、最大でも部分的阻害;
(9)成熟ヒトGITR(配列番号4)上の立体構造エピトープ、例えば、アミノ酸配列PTGGPGCGPGRLLLGTGT(配列番号217)およびCRDYPGEE(配列番号218)内の不連続エピトープに結合;
(10)O結合およびN結合グリコシル化および非グリコシル化両方のヒトGITRに結合;
(11)Fc受容体への結合の非存在下でアゴニスト活性を有するが、Fc受容体への結合がアゴニスト活性をさらに増強;
(12)28F3、3C3−1、3C3−2、2G6、8A6、9G7−1、9G7−2、14E3、19H8−1、19H8−2、19D3、18E10および6G10とヒトGITRへの結合について何れかの方向でまたは双方向で競合する。
(a)重鎖は配列番号15、17、18、28、30、31、41、43、44、55、58、59、73、75、76、86、88、89、100、102、103、117、119、120、131、134、135、227〜275、337、339、340、348〜352、361および362からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%同一であるまたは配列番号15、17、18、28、30、31、41、43、44、55、58、59、73、75、76、86、88、89、100、102、103、117、119、120、131、134、135、227〜275、337、339、340、348〜352、361および362からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して1、2、3、4、5、1〜2、1〜3、1〜4、1〜5、1〜10、1〜15、1〜20、1〜25または1〜50アミノ酸変化(すなわち、アミノ酸置換、付加または欠失)を含むアミノ酸配列を含むが、ただし、ある実施態様において、配列がエフェクターレス重鎖のものであるならば、重鎖をエフェクターレスとする変異は修飾されない(すなわち、A234、E235、A237、S330およびS331は修飾しない);
(b)軽鎖は、配列番号16、19、29、32、42、45、56、57、60、61、74、87、90、101、104、105、118、121、132、133、136、137、338、341および371からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%同一であるまたは配列番号16、19、29、32、42、45、56、57、60、61、74、87、90、101、104、105、118、121、132、133、136、137、338、341および371からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して1、2、3、4、5、1〜2、1〜3、1〜4、1〜5、1〜10、1〜15、1〜20、1〜25または1〜50アミノ酸変化(すなわち、アミノ酸置換、付加または欠失)を含むアミノ酸配列を含む;
(c)抗体はGITRに特異的に結合する、そして
(d)抗体は、次の機能的性質の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11または全てを示す:
(1)例えば、Biacoreにより測定して、例えば10nM以下(例えば、0.01nM〜10nM)のKDで可溶性ヒトGITRに結合;
(2)例えば、スキャッチャードにより測定して、例えば1nM以下(例えば、0.01nM〜1nM)のKDで膜結合ヒトGITRに結合;
(3)例えば、FACSにより測定して、例えば1nM以下(例えば、0.01nM〜1nM)のEC50で膜結合ヒトGITRに結合;
(4)例えば、FACSにより測定して、例えば、10nM以下(例えば、0.01nM〜10nM)のEC50でカニクイザルGITRに結合、例えば、膜結合カニクイザルGITRに結合;
(5)(i)GITR発現T細胞におけるIL−2および/またはIFN−γ産生増加および/または(ii)T細胞増殖増強により証明される、CD3結合の存在下(例えば、最適以下の抗CD3濃度の存在下)におけるような、T細胞活性化の誘発または増強;
(6)多価架橋を必要としないT細胞活性化の誘発または増強;
(7)FACSにより測定して、例えば、1μg/mL以下のEC50でGITRリガンドの3A9−hGITR細胞上のGITRへの結合阻害;
(8)GITRリガンドの活性化T細胞上のGITRへの結合の、最大でも部分的阻害
(9)成熟ヒトGITR(配列番号4)上の立体構造エピトープ、例えば、アミノ酸配列PTGGPGCGPGRLLLGTGT(配列番号217)およびCRDYPGEE(配列番号218)内の不連続エピトープに結合;
(10)O結合およびN結合グリコシル化および非グリコシル化両方のヒトGITRに結合;
(11)Fc受容体への結合の非存在下でアゴニスト活性を有するが、Fc受容体への結合がアゴニスト活性をさらに増強;および
(12)28F3、3C3−1、3C3−2、2G6、8A6、9G7−1、9G7−2、14E3、19H8−1、19H8−2、19D3、18E10および6G10とヒトGITRへの結合について何れかの方向でまたは双方向で競合する。
SYGXH(配列番号372)(ここで、Xは任意のアミノ酸、例えば、MまたはFである);
X1YGX2H(ここで、X1は任意のアミノ酸、例えば、S、NまたはDであり;
X2は任意のアミノ酸、例えば、MまたはFである);および
X1YGX2X3(ここで、X1は任意のアミノ酸、例えば、S、NまたはDであり;X2は任意のアミノ酸、例えば、MまたはFであり、X3は任意のアミノ酸、例えば、HまたはQである)。
VIWYX1GSNKX2YADSVKG(配列番号373)(ここで、X1は任意のアミノ酸、例えば、EまたはAであり;X2は任意のアミノ酸、例えば、YまたはFである);および
VIWYX1GSNKX2YX3DSVKG(配列番号374)(ここで、X1は任意のアミノ酸、例えば、E、A、GまたはDであり;X2は任意のアミノ酸、例えば、YまたはFであり;X3は任意のアミノ酸、例えば、AまたはVである)。
GGSX1VRGDYYYGMDV(配列番号375)(ここで、X1は任意のアミノ酸、例えば、MまたはV、L、IまたはAである)。
GGSX1VRGX2YYYGMDV(配列番号376)(ここで、X1は任意のアミノ酸、例えば、MまたはV、L、IまたはAであり;X2は任意のアミノ酸、例えば、DまたはEである。X1およびX2の特定の組み合わせは、実施例に示す)。
GG(6−7aa)MDVWYYX1MDVW(配列番号377)(ここで、X1は任意のアミノ酸、例えば、G、SまたはVである。ある実施態様において、6−7アミノ酸は、ここに開示する抗GITR抗体のVHCDR3配列におけるその位置のアミノ酸に対応する)。
RASQGISSXLA(配列番号378)(ここで、Xは任意のアミノ酸、例えば、AまたはW(またはA、WまたはY)である);および
RASQG(2−3aa)SX1LA(配列番号379)(ここで、X1は任意のアミノ酸、例えば、W、YまたはAであり、2−3アミノ酸は任意のアミノ酸、例えば、GI、SVSまたはSVTである)。
DASSLXS(配列番号380)(ここで、Xは任意のアミノ酸、例えば、EまたはQである);および
X1ASSX2X3X4(ここで、X1は任意のアミノ酸、例えば、A、DまたはGであり;X4は任意のアミノ酸、例えば、LまたはRであり;X3は任意のアミノ酸、例えば、Q、EまたはAであり;X4は任意のアミノ酸、例えば、SまたはTである)。
QQXNSYPYT(配列番号381)(ここで、Xは任意のアミノ酸、例えば、FまたはYである);および
QQX1X2SX3PX4T(配列番号382)(ここで、X1は任意のアミノ酸、例えば、FまたはYであり;X2は任意のアミノ酸、例えば、NまたはGであり;X3は任意のアミノ酸、例えば、YまたはSであり;X4は任意のアミノ酸、例えば、Y、W、I、PまたはQである)。
抗GITR抗体は、CDR1、CDR2およびCDR3配列を含む重鎖可変領域およびCDR1、CDR2およびCDR3配列を含む軽鎖可変領域を含み、ここで、これらのCDR配列の1以上は、ここに記載する好ましい抗体(例えば、28F3、19D3、18E10、3C3、2G6、8A6、9G7、14E3、19H8および6G10)に基づく特定のアミノ酸配列またはその保存的修飾体を含み、ここで、該抗体は、ここに記載する抗GITR抗体の所望の機能的性質を保持する。従って、単離抗GITR抗体またはその抗原結合部分は、CDR1、CDR2およびCDR3配列を含む重鎖可変領域およびCDR1、CDR2およびCDR3配列を含む軽鎖可変領域を含んでよく、ここで、
(a)重鎖可変領域CDR3配列は、配列番号22、35、48、64、80、93、108、124、140および344からなる群から選択されるアミノ酸配列およびその保存的修飾体、例えば、1、2、3、4、5、1〜2、1〜3、1〜4または1〜5保存的アミノ酸置換体を含む;
(b)軽鎖可変領域CDR3配列は、配列番号25、38、51、67、70、83、96、111、114、127、143、146および347からなる群から選択されるアミノ酸配列およびその保存的修飾体、例えば、1、2、3、4、5、1〜2、1〜3、1〜4または1〜5保存的アミノ酸置換体を含む;
(c)抗体はGITRに特異的に結合する、そして
(d)抗体は、次の機能的性質の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11または全てを示す:
(1)例えば、Biacoreにより測定して、例えば10nM以下(例えば、0.01nM〜10nM)のKDで可溶性ヒトGITRに結合;
(2)例えば、スキャッチャードにより測定して、例えば1nM以下(例えば、0.01nM〜1nM)のKDで膜結合ヒトGITRに結合;
(3)例えば、FACSにより測定して、例えば1nM以下(例えば、0.01nM〜1nM)のEC50で膜結合ヒトGITRに結合;
(4)例えば、FACSにより測定して、例えば、10nM以下(例えば、0.01nM〜10nM)のEC50でカニクイザルGITRに結合、例えば、膜結合カニクイザルGITRに結合;
(5)(i)GITR発現T細胞におけるIL−2および/またはIFN−γ産生増加および/または(ii)T細胞増殖増強により証明される、CD3結合の存在下(例えば、最適以下の抗CD3濃度の存在下)におけるような、T細胞活性化の誘発または増強;
(6)多価架橋を必要としないT細胞活性化の誘発または増強;
(7)FACSにより測定して、例えば、1μg/mL以下のEC50でGITRリガンドの3A9−hGITR細胞上のGITRへの結合阻害;
(8)GITRリガンドの活性化T細胞上のGITRへの結合の、最大でも部分的阻害;
(9)成熟ヒトGITR(配列番号4)上の立体構造エピトープ、例えば、アミノ酸配列PTGGPGCGPGRLLLGTGT(配列番号217)およびCRDYPGEE(配列番号218)内の不連続エピトープに結合;
(10)O結合およびN結合グリコシル化および非グリコシル化両方のヒトGITRに結合;
(11)Fc受容体への結合の非存在下でアゴニスト活性を有するが、Fc受容体への結合がアゴニスト活性をさらに増強;および
(12)ヒトGITRへの結合について28F3、3C3−1、3C3−2、2G6、8A6、9G7−1、9G7−2、14E3、19H8−1、19H8−2、19D3、18E10および/または6G10と何れかの方向または双方向で競合。
また提供されるのは、特定のここに記載する抗GITR抗体(例えば、抗体28F3、19D3、18E10、3C3、2G6、8A6、9G7、14E3、19H8および6G10)とGITRへの結合について競合する抗体である。このような競合抗体は、標準GITR結合アッセイにおける、モノクローナル抗体28F3、19D3、18E10、3C3−1、3C3−2、2G6、8A6、9G7−1、9G7−2、14E3、19H8−1、19H8−2および6G10の1以上のGITRへの結合を競合的に阻害するそれらの能力に基づき、同定され得る。例えば、組み換えヒトGITRタンパク質をプレートに固定化し、各種の濃度の非標識第一抗体を添加し、プレートを洗浄し、標識第二抗体を添加し、標識の量を測定する、標準ELISAアッセイまたは競合的ELISAアッセイを使用し得る。非標識(第一)抗体(“遮断抗体”とも称する)の濃度増加が、標識(第二)抗体の結合を阻害するならば、第一抗体はプレート上の標的への第二抗体の結合を阻害すると言えるまたは第二抗体の結合と競合すると言える。これに加えてまたはこれとは別に、BIAcore解析を使用して、抗体が競合する能力を評価できる。試験抗体がここに記載する抗GITR抗体のGITRへの結合を阻害する能力は、試験抗体がGITRへの結合について該抗体と競合し得ることを示す。
VHおよびVL領域
また提供されるのは、出発物質としてここに開示するVHおよび/またはVL配列の1以上の抗体を、修飾抗体の改変のために使用して製造できる改変および修飾抗体であり、この修飾抗体は、出発抗体から変えられた性質を有し得る。抗体は、可変領域(すなわち、VHおよび/またはVL)の一方または両方の中、例えば1以上のCDR領域内および/または1以上のフレームワーク領域内の1以上の残基の修飾により改変され得る。これに加えてまたはこれとは別に、抗体を、例えば、抗体のエフェクター機能を変えるために、定常領域内の残基を修飾することにより改変し得る。
ここに記載する抗GITR可変領域は、Fc、例えば、任意のアロタイプまたはイソアロタイプ、例えば、IgG1についてG1m、G1m1(a)、G1m2(x)、G1m3(f)、G1m17(z);IgG2についてG2m、G2m23(n);IgG3についてG3m、G3m21(g1)、G3m28(g5)、G3m11(b0)、G3m5(b1)、G3m13(b3)、G3m14(b4)、G3m10(b5)、G3m15(s)、G3m16(t)、G3m6(c3)、G3m24(c5)、G3m26(u)、G3m27(v);およびKについてKm、Km1、Km2、Km3であり得るIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4 Fcと結合(例えば、共有結合または縮合)できる(例えば、Jefferies et al. (2009) mAbs 1:1参照)。
ここに記載する抗体は、軽鎖または重鎖可変領域に1以上のグリコシル化部位を含み得る。このようなグリコシル化部位は、改変された抗原結合により、抗体の免疫原性増加または抗体のpK改変をもたらし得る(Marshall et al (1972) Annu Rev Biochem 41:673-702; Gala and Morrison (2004) J. Immunol 172:5489-94; Wallick et al (1988) J Exp Med 168:1099-109; Spiro (2002) Glycobiology 12:43R-56R; Parekh et al (1985) Nature 316:452-7; Mimura et al. (2000) Mol Immunol 37:697-706)。グリコシル化は、N−X−S/T配列を含むモチーフで起こることが知られている。いくつかの例において、抗GITR抗体が可変領域グリコシル化を含まないことが好ましい。これは、可変領域にグリコシル化モチーフを含まない抗体の選択またはグリコシル化領域内の残基の変異により達成され得る。
上記のとおり、ここに開示するVHおよびVL配列を有する抗GITR抗体を使用して、VHおよび/またはVL配列またはこれに結合する定常領域の修飾により、新規抗GITR抗体を作ることができる。それ故に、ここに記載する他の態様において、ここに記載する抗GITR抗体、例えば28F3、19D3、18E10、3C3、2G6、8A6、9G7、14E3、19H8および6G10の構造特性を使用して、ヒトGITRおよびカニクイザルGITRへの結合などのここに記載する抗体の少なくとも一つの機能的性質を保持する構造上関連する抗GITR抗体が作製される。例えば、28F3、19D3、18E10、3C3、2G6、8A6、9G7、14E3、19H8および6G10の1以上のCDR領域またはその変異物を既知フレームワーク領域および/または他のCDRと組み換えにより組み合わせ、上記のとおり、さらなる、組み換えにより改変された、ここに記載する抗GITR抗体を作製することができる。他のタイプの修飾は、先のセクションで記載したものを含む。改変方法のための出発物質は、ここに提供するVHおよび/またはVL配列の1以上またはそのCDR領域の1以上である。改変抗体を作製するために、ここに提供するVHおよび/またはVL配列の1以上またはそのCDR領域の1以上を有する抗体を実際に製造する(すなわち、タンパク質として発現させる)必要はない。むしろ、配列に含まれる情報を出発物質として使用して、元の配列に由来する“第二世代”配列を作り、次いで、“第二世代”配列を作製し、タンパク質として発現させる。
(a)(i)配列番号20、33、46、62、78、91、106、122、138および342からなる群から選択されるCDR1配列、配列番号21、34、47、63、79、92、107、123、139および343からなる群から選択されるCDR2配列および/または配列番号22、35、48、64、80、93、108、124、140および344からなる群から選択されるCDR3配列を含む重鎖可変領域抗体配列および(ii)配列番号23、36、49、65、68、81、94、109、112、125、141、144および345からなる群から選択されるCDR1配列、配列番号24、37、50、66、69、82、95、110、113、126、142、145および346からなる群から選択されるCDR2配列および/または配列番号25、38、51、67、70、83、96、111、114、127、143、146および347からなる群から選択されるCDR3配列を含む軽鎖可変領域抗体配列を提供し、
(b)重鎖可変領域抗体配列および/または軽鎖可変領域抗体配列内の少なくとも1アミノ酸残基を改変させて、少なくとも1個の改変抗体配列を作製し、そして
(c)改変抗体配列をタンパク質として発現させる
ことを含む、方法である。
(1)例えば、Biacoreにより測定して、例えば10nM以下(例えば、0.01nM〜10nM)のKDで可溶性ヒトGITRに結合;
(2)例えば、スキャッチャードにより測定して、例えば1nM以下(例えば、0.01nM〜1nM)のKDで膜結合ヒトGITRに結合;
(3)例えば、FACSにより測定して、例えば1nM以下(例えば、0.01nM〜1nM)のEC50で膜結合ヒトGITRに結合;
(4)例えば、FACSにより測定して、例えば、10nM以下(例えば、0.01nM〜10nM)のEC50でカニクイザルGITRに結合、例えば、膜結合カニクイザルGITRに結合;
(5)(i)GITR発現T細胞におけるIL−2および/またはIFN−γ産生増加および/または(ii)T細胞増殖増強により証明される、CD3結合の存在下(例えば、最適以下の抗CD3濃度の存在下)におけるような、T細胞活性化の誘発または増強;
(6)多価架橋を必要としないT細胞活性化の誘発または増強;
(7)FACSにより測定して、例えば、1μg/mL以下のEC50でGITRリガンドの3A9−hGITR細胞上のGITRへの結合阻害;
(8)GITRリガンドの活性化T細胞上のGITRへの結合の、最大でも部分的阻害;
(9)成熟ヒトGITR(配列番号4)上の立体構造エピトープ、例えば、アミノ酸配列PTGGPGCGPGRLLLGTGT(配列番号217)およびCRDYPGEE(配列番号218)内の不連続エピトープに結合;
(10)O結合およびN結合グリコシル化および非グリコシル化両方のヒトGITRに結合;
(11)Fc受容体への結合の非存在下でアゴニスト活性を有するが、Fc受容体への結合がアゴニスト活性をさらに増強;および
(12)ヒトGITRへの結合について28F3、3C3−1、3C3−2、2G6、8A6、9G7−1、9G7−2、14E3、19H8−1、19H8−2、19D3、18E10および/または6G10と何れかの方向または双方向で競合
を含む、ここに記載する抗GITR抗体の機能的性質の1個、数個または全てを保持するものである。
ここに記載する他の態様は、ここに記載する抗体をコードする核酸分子に関する。核酸は、細胞全体、細胞ライセートまたは一部精製されたまたは実質的に純粋な形態で存在し得る。核酸は、アルカリ/SDS処理、CsClバンディング、カラムクロマトグラフィー、制限酵素、アガロースゲル電気泳動および当分野で周知のその他を含む標準技術により、他の細胞成分または他の混入物、例えば、他の細胞性核酸(例えば、他の染色体DNA、例えば、自然では単離DNAと結合している染色体DNA)またはタンパク質から精製されたとき、“単離される”または“実質的に純粋にされる”。F. Ausubel, et al., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York参照。ここに記載する核酸は、例えば、DNAでもRNAでもよく、イントロン配列を含んでも含まなくてもよい。ある実施態様において、核酸はcDNA分子である。
ここに記載するモノクローナル抗体は、Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975)により記載される標準体細胞ハイブリダイゼーション技法などの、多様な既知技術を使用して産生される。体細胞ハイブリダイゼーションが、好ましいが、原則として、モノクローナル抗体を産生する他の技術、例えば、Bリンパ球のウイルス性または発癌性形質転換、ヒト抗体遺伝子のライブラリーを使用するファージディスプレイ技法も使用できる。
GITRに対する完全ヒト抗体を産生するために、例えば、Lonberg et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851およびWO98/24884号に他の抗原について記載されるとおり、ヒト免疫グロブリン遺伝子(例えば、HCo12、HCo7またはKMマウス)を含むトランスフェニックまたはトランスクロモソーマルマウスを、GITR抗原の精製または富化調製物および/またはGITRまたはそのフラグメントを発現する細胞で免疫化させ得る。あるいは、マウスを、ヒトGITRまたはそのフラグメントをコードするDNAで免疫化し得る。好ましくは、マウスは、最初の注入時6〜16週齢である。例えば、組み換えGITR抗原の精製または富化調製物(5〜50μg)を使用して、HuMAbマウスを腹腔内免疫化できる。GITR抗原の精製または富化調製物を使用する免疫化が抗体を産生させないとき、マウスをまた免疫応答を促進するために、GITRを発現する細胞、例えば、細胞株でも免疫化し得る。細胞株の例は、GITRを過発現する安定なCHOおよびRaji細胞株を含む。
ここに記載するヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを産生するために、免疫化マウスからの脾細胞および/またはリンパ節細胞を単離し、マウス骨髄腫細胞株などの適切な不死化細胞株に融合させ得る。得られたハイブリドーマを、抗原特異的抗体の産生についてスクリーニングし得る。例えば、免疫化マウスからの脾臓リンパ球の単一細胞懸濁液を、Sp2/0非分泌性マウス骨髄腫細胞(ATCC、CRL 1581)と、50%PEGを用いて融合させ得る。細胞を、平底マイクロタイタープレートに約2×105で播種し、続いて10%Fetal Clone血清、18%“653”条件培地、5%オリゲン(IGEN)、4mM L−グルタミン、1mM ピルビン酸ナトリウム、5mM HEPES、0.055mM 2−メルカプトエタノール、50単位/ml ペニシリン、50mg/ml ストレプトマイシン、50mg/ml ゲンタマイシンおよび1X HAT(Sigma)含有選択培地で、2週間インキュベートした。約2週間後、細胞を、HATがHTに置き換えられた培地で培養してよい。次いで個々のウェルを、ヒトモノクローナルIgMおよびIgG抗体についてELISAでスクリーニングし得る。広範なハイブリドーマ増殖が生じたら、培地を通常10〜14日後観察し得る。抗体分泌ハイブリドーマを再播種し、再スクリーニングし、ヒトIgGについてなお陽性であるならば、該モノクローナル抗体を少なくとも2回限界希釈によりサブクローン化できる。次いで、安定なサブクローンをインビトロで培養して、特徴付けのために組織培養培地で少量の抗体を産生できる。
抗体を、当分野で周知のとおり、例えば、組み換えDNA技術と遺伝子導入方法の組み合わせを使用して、宿主細胞トランスフェクトーマにおいて産生させ得る(Morrison, S. (1985) Science 229:1202)。
28F3 VHシグナル配列:
MEFGLSWVFLVALLRGVQC(配列番号315)
ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTTAAGAGGTGTCCAGTGT(配列番号316)
28F3 VLシグナル配列:
MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC(配列番号317)
ATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTTCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGAT(配列番号318)
18E10 VHシグナル配列:
MEFGLSWVFLVALLRGVQC(配列番号315)
ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTTAAGAGGTGTCCAGTGT(配列番号316)
18H10 VLシグナル配列:
MDMRVLAQLLGLLLLCFPGARC(配列番号317)
ATGGACATGAGGGTCCTCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGTTTCCCAGGTGCCAGAT(配列番号318)
19D3 VHシグナル配列:
MEFGLSWVFLVALLRGVQC(配列番号315)
ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTTAAGAGGTGTCCAGTGT(配列番号316)
19D3 VLシグナル配列:
MRVLAQLLGLLLLCFPGARC(配列番号319)
ATGAGGGTCCTCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGTTTCCCAGGTGCCAGATGT(配列番号320)
3C3 VHシグナル配列:
MKHLWFFLLLVAAPRWVLS(配列番号321)
ATGAAACACCTGTGGTTCTTCCTCCTCCTGGTGGCAGCTCCCAGATGGGTCCTGTCC(配列番号322)
3C3 VL1シグナル配列:
MDMRVLAQLLGLLLLCFPGARC(配列番号323)
ATGGACATGAGGGTCCTCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGTTTCCCAGGTGCCAGATGT(配列番号324)
3C3 VL2シグナル配列:
MEAPAQLLFLLLLWLPDTTG(配列番号325)
ATGGAAGCCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGA(配列番号326)
8A6 VHシグナル配列:
MEFGLNWVFLVALLRGVQC(配列番号327)
ATGGAGTTTGGGCTGAACTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTTAAGAGGTGTCCAGTGT(配列番号328)
8A6 VLシグナル配列:
MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC(配列番号317)
ATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTTCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGT(配列番号318)
9G7 VHシグナル配列:
MEFGLSWIFLAAILKGVQC(配列番号329)
ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGATTTTCCTTGCTGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGT(配列番号330)
9G7 VL1およびVL2シグナル配列:
METPAQLLFLLLLWLPDTTG(配列番号331)
ATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGA(配列番号332)
14E3 VHシグナル配列:
MKHLWFFLLLVAAPRWVLS(配列番号333)
ATGAAACACCTGTGGTTCTTCCTCCTCCTGGTGGCAGCTCCCAGATGGGTCCTGTCC(配列番号334)
14E3 VLシグナル配列:
MDMRVLAQLLGLLLLCFPGARC(配列番号323)
ATGGACATGAGGGTCCTCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGTTTCCCAGGTGCCAGATGT(配列番号324)
19H8VHシグナル配列:
MEFGLSWVFLVALLRGVQC(配列番号315)
ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTTAAGAGGTGTCCAGTGT(配列番号316)
19H8 VL1シグナル配列:
MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC(配列番号317)
ATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTTCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGT(配列番号318)
19H8 VL2シグナル配列:
MEAPAQLLFLLLLWLPDTTG(配列番号325)
ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGA(配列番号326)
6G10 VHシグナル配列:
MEFGLSWVFLVALLRGVQC(配列番号315)
ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTTAAGAGGTGTCCAGTGT(配列番号316)
6G10 VLシグナル配列:
MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC(配列番号317)
ATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTTCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGT(配列番号318)
ここに記載する抗体を、例えば、標準ELISAにより、GITRへの結合について試験し得る。簡潔にいうと、マイクロタイタープレートを、PBS中1〜2μg/mlの精製GITRで被覆し、次いで5%ウシ血清アルブミンのPBS溶液で遮断する。抗体希釈物(例えば、GITR免疫化マウスからの血漿希釈物)を各ウェルに添加し、1〜2時間、37℃でインキュベートする。プレートをPBS/Tweenで洗浄し、次いでホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)にコンジュゲートした二次試薬(例えば、ヒト抗体について、ヤギ−抗ヒトIgG Fc特異的ポリクローナル試薬)と、1時間、37℃でインキュベートする。洗浄後、プレートをABTS基質(Moss Inc, product: ABTS-1000)で展開し、OD415〜495で分光光度計により分析する。免疫化マウスからの血清を、さらに、フローサイトメトリーにより、ヒトGITRを発現する細胞株に結合するが、GITRを発現しない対照細胞株には結合しないことについてスクリーニングする。簡潔にいうと、抗GITR抗体の結合を、GITR発現CHO細胞と、抗GITR抗体を、1:20希釈でインキュベートすることにより評価する。細胞を洗浄し、結合をPE標識抗ヒトIgG Abで検出する。フローサイトメトリー解析を、FACScanフローサイトメトリー(Becton Dickinson, San Jose, CA)を使用して実施する。好ましくは、最高力価を生ずるマウスを融合に使用する。
ここに記載する抗体を、サンプル試験およびインビボ造影を含む診断目的で使用でき、この目的のために、抗体(またはその結合フラグメント)を、イムノコンジュゲートを形成するために適切な検出可能剤とコンジュゲートさせ得る。診断目的で、適切な薬剤は、全身造影のための放射性同位体、およびサンプル試験のための放射性同位体、酵素、蛍光標識および他の適当な抗体タグを含む、検出可能標識である。
ここに記載する抗体を、二重特異性分子の形成のために使用し得る。抗GITR抗体またはその抗原結合部分を、少なくとも2個の異なる結合部位または標的分子に結合する二重特異性分子を産生するために、他の機能的分子、例えば、他のペプチドまたはタンパク質(例えば、受容体に対する他の抗体またはリガンド)で誘導体化するかまたはそれと結合できる。例えば、抗GITR抗体を、ここに記載するタンパク質(例えば、PD−1、PD−L1またはLAG−3に対する抗体)などの組み合わせ処置の標的として使用できる可能性のある、何らかのタンパク質に特異的に結合する抗体またはscFvと結合させ得る。ここに記載する抗体は、実際2を超える異なる結合部位および/または標的分子に結合する多特異的分子を産生するために、1を超える他の機能的分子で誘導体化するかまたはそれと結合でき、このような多特異的分子も、ここで使用する用語“二重特異性分子”に包含されることが意図される。ここに記載する二重特異性分子を産生するために、ここに記載する抗体を、二重特異性分子がもたらされるように、他の抗体、抗体フラグメント、ペプチドまたは結合模倣体などの1以上の他の結合分子と機能的に結合(例えば、化学カップリング、遺伝子融合、非共有結合またはその他)させ得る。
さらに提供されるのは、薬学的に許容される担体と製剤した、抗GITR抗体の一つもしくはこの組み合わせまたはここに記載する他の標的に対する抗体もしくはその抗原結合部分との組み合わせを含む、組成物、例えば、医薬組成物である。このような組成物は、抗体またはイムノコンジュゲートまたはここに記載する二重特異性分子の1個または組み合わせ(例えば、2種以上)を含み得る。例えば、ここに記載する医薬組成物は、標的抗原の各種のエピトープに結合するまたは相補的活性を有する、抗体の組み合わせ(またはイムノコンジュゲートまたは二重特異性)を含み得る。
ここに記載する抗体、抗体組成物および方法は、例えば、GITRシグナル伝達活性化による免疫応答の増強またはGITRの検出が関与する、多数のインビトロおよびインビボ有用性を有する。好ましい実施態様において、ここに記載する抗体はヒト抗体である。例えば、ここに記載する抗GITR抗体を、培養中の細胞に、インビトロまたはエクスビボでまたはヒト対象に、例えば、インビボで、多様な疾患における免疫を増強するために、投与し得る。従って、ここに提供されるのは、対象における免疫応答が修飾されるように、ここに記載する抗体またはその抗原結合部分を対象に投与することを含む、対象における免疫応答を修飾する方法である。好ましくは、応答は、増強、刺激または上方制御される。
抗GITR抗体によるGITRの活性化は、患者における癌細胞に対する免疫応答を増強できる。ここに提供されるのは、対象が処置される、例えば、癌腫瘍の増殖が阻害または低減されるおよび/または腫瘍が退縮するおよび/または長期生存が達成されるように、ここに記載する抗GITR抗体を対象に投与することを含む、癌を有する対象を処置する方法である。抗GITR抗体を、癌腫瘍の増殖阻害のために単独で使用し得る。あるいは、抗GITR抗体を、下記のとおり、他の薬剤、例えば、他の免疫原性剤、標準癌処置または他の抗体と組み合わせて使用し得る。
ここに記載する方法を、特定の毒素または病原体に曝されている患者の処置にも使用し得る。従って、ここに記載する他の態様は、対象が感染性疾患について処置されるように、対象に抗GITR抗体またはその抗原結合部分を投与することを含む、対象における感染性疾患を処置する方法を提供する。これに加えてまたはこれとは別に、抗体はキメラまたはヒト化抗体であり得る。
抗GITR抗体は、自己免疫性応答を誘発および増幅させ得る。実際、腫瘍細胞およびペプチドワクチンを使用する抗腫瘍応答の誘導は、多くの抗腫瘍応答に抗自己反応性が関与することを明らかにする(an Elsas et al. (2001) J. Exp. Med. 194:481-489; Overwijk, et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96: 2982-2987; Hurwitz, (2000) supra; Rosenberg & White (1996) J. Immunother Emphasis Tumor Immunol 19 (1): 81-4)。それ故に、疾患処置のために効率的に自己タンパク質に対する免疫応答を産生するためのワクチン接種プロトコールを考案するために、各種の自己タンパク質と組み合わせた抗GITR抗体の使用を考えることが可能である。例えば、アルツハイマー病は、脳におけるアミロイド沈着におけるAβペプチドの不適切な蓄積を伴い、アミロイドに対する抗体応答は、これらのアミロイド沈着を浄化することができる(Schenk et al., (1999) Nature 400: 173-177)。
ここに記載する抗GITR抗体を、抗GITR抗体と目的の抗原(例えば、ワクチン)の共投与による抗原特異的免疫応答刺激に使用し得る。従って、ここに提供されるのは、対象に(i)抗原および(ii)抗GITR抗体またはその抗原結合部分を、対象における該抗原に対する免疫応答が増強されるように投与することを含む、対象における抗原に対する免疫応答を増強する方法である。抗体は、ヒト抗ヒトGITR抗体(例えばここに記載するヒト抗GITR抗体の何れか)であり得る。これに加えてまたはこれとは別に、抗体はキメラまたはヒト化抗体であり得る。抗原は、例えば、腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原または病原体からの抗原であり得る。このような抗原の非限定的例は、上記腫瘍抗原(または腫瘍ワクチン)または上記ウイルス、細菌または他の病原体からの抗原などの上のセクションに記載したものを含む。
上に提供する組み合わせ治療に加えて、抗GITR抗体、例えば、ここに記載するものを、例えば、下記のとおり、癌の処置のための組み合わせ治療において使用し得る。
(1)上記のCTLA−4、PD−1、PD−L1、PD−L2およびLAG−3および次のタンパク質TIM−3、ガレクチン9、CEACAM−1、BTLA、CD69、ガレクチン−1、TIGIT、CD113、GPR56、VISTA、B7−H3、B7−H4、2B4、CD48、GARP、PD1H、LAIR1、TIM−1およびTIM−4の何れかなどのT細胞活性化(例えば、免疫チェックポイント阻害剤)を阻害するタンパク質のアンタゴニスト(阻害剤または遮断剤);および/または
(2)B7−1、B7−2、CD28、4−1BB(CD137)、4−1BBL、ICOS、ICOS−L、OX40、OX40L、CD70、CD27、CD40、DR3およびCD28HなどのT細胞活性化を刺激するタンパク質のアゴニスト。
アルキル化剤(窒素マスタード、エチレンイミン誘導体、アルキルスルホネート、ニトロソウレアおよびトリアゼンを含むが、これらに限定されない):ウラシルマスタード、クロルメチン、シクロホスファミド(シトキサンTM) フォスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ピポブロマン、トリエチレンメラミン、トリエチレンチオホスホルアミン、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ダカルバジンおよびテモゾロミド。
代謝拮抗剤(葉酸アンタゴニスト、ピリミジンアナログ、プリンアナログおよびアデノシンデアミナーゼ阻害剤を含むが、これらに限定されない):メトトレキサート、5−フルオロウラシル、フロクスウリジン、シタラビン、6−メルカプトプリン、6−チオグアニン、リン酸フルダラビン、ペントスタチンおよびゲムシタビン。
1. ヒトグルココルチコイド誘導性TNF受容体(GITR)に結合し、次の性質を示す単離抗体またはその抗原結合部分:
(a)可溶性ヒトGITRに結合;
(b)膜結合ヒトGITRに結合;
(c)膜結合カニクイザルGITRに結合;
(d)T細胞活性化誘発または増強;
(e)GITRリガンドの3A9−hGITR細胞上のGITRへの結合阻害;
(f)GITRリガンドの活性化T細胞上のGITRへの結合の最大で部分的に阻害;
(g)成熟ヒトGITR上の立体構造エピトープ(配列番号4)に結合;
(h)O結合およびNグリコシル化および非グリコシル化両方のヒトGITRに結合;
(i)Fc受容体への結合の非存在下でアゴニスト活性を有するが、Fc受容体への結合がアゴニスト活性をさらに増強;および
(i)抗体28F3、3C3−1、3C3−2、2G6、8A6、9G7−1、9G7−2、14E3、19H8−1、19H8−2、19D3、18E10および6G10の1以上とヒトGITRへの結合について何れかの方向でまたは双方向で競合。
(a)配列番号13および14;
(b)配列番号26および27;
(c)配列番号39および40;
(d)配列番号52および53;
(e)配列番号52および54;
(f)配列番号71および72;
(g)配列番号84および85;
(h)配列番号97および98;
(i)配列番号97および99;
(j)配列番号115および116;
(k)配列番号128および129;
(l)配列番号128および130;および
(m)配列番号335および336。
(a)配列番号20、21および22をそれぞれ含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列および/または配列番号23、24および25をそれぞれ含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列;
(b)配列番号33、34および35をそれぞれ含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列および/または配列番号36、37および38をそれぞれ含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列;
(c)配列番号46、47および48をそれぞれ含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列および/または配列番号49、50および51をそれぞれ含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列;
(d)配列番号62、63および64をそれぞれ含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列および/または配列番号65、66および67をそれぞれ含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列;
(e)配列番号62、63および64をそれぞれ含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列および/または配列番号68、69および70をそれぞれ含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列;
(f)配列番号78、79および80をそれぞれ含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列および/または配列番号81、82および83をそれぞれ含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列;
(g)配列番号91、92および93をそれぞれ含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列および/または配列番号94、95および96をそれぞれ含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列;
(h)配列番号106、107および108をそれぞれ含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列および/または配列番号109、110および111をそれぞれ含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列;
(i)配列番号106、107および108をそれぞれ含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列および/または配列番号112、113および114をそれぞれ含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列;
(j)配列番号122、123および124をそれぞれ含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列および/または配列番号125、126および127をそれぞれ含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列;
(k)配列番号138、139および140をそれぞれ含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列および/または配列番号141、142および143をそれぞれ含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列;
(l)配列番号138、139および140をそれぞれ含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列および/または配列番号144、145および146をそれぞれ含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列;または
(m)配列番号342、343および344をそれぞれ含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列および/または配列番号345、346および347をそれぞれ含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列。
(a)それぞれ配列番号13および14;
(b)それぞれ配列番号26および27;
(c)それぞれ配列番号39および40;
(d)それぞれ配列番号52および53;
(e)それぞれ配列番号52および54;
(f)それぞれ配列番号71および72;
(g)それぞれ配列番号84および85;
(h)それぞれ配列番号97および98;
(i)それぞれ配列番号97および99;
(j)それぞれ配列番号115および116;
(k)それぞれ配列番号128および129;
(l)それぞれ配列番号128および130;および
(m)それぞれ配列番号335および336。
(a)それぞれ配列番号15および16;
(b)それぞれ配列番号17および19;
(c)それぞれ配列番号18および19;
(d)それぞれ配列番号28および29;
(e)それぞれ配列番号30および32;
(f)それぞれ配列番号31および32;
(g)それぞれ配列番号41および42;
(h)それぞれ配列番号43および45;
(i)それぞれ配列番号44および45;
(j)それぞれ配列番号55および56;
(k)それぞれ配列番号55および57;
(l)それぞれ配列番号58および60;
(m)それぞれ配列番号59および60;
(n)それぞれ配列番号58および61;
(o)それぞれ配列番号59および61;
(p)それぞれ配列番号73および74;
(q)それぞれ配列番号75および77;
(r)それぞれ配列番号76および77;
(s)それぞれ配列番号86および87;
(t)それぞれ配列番号88および90;
(u)それぞれ配列番号89および90;
(v)それぞれ配列番号102および104;
(w)それぞれ配列番号103および104;
(x)それぞれ配列番号100および101;
(y)それぞれ配列番号100および371;
(z)それぞれ配列番号102および105;
(za)それぞれ配列番号103および105;
(zb)それぞれ配列番号117および118;
(zc)それぞれ配列番号119および121;
(zd)それぞれ配列番号120および121;
(ze)それぞれ配列番号131および132;
(zf)それぞれ配列番号134および136;
(zg)それぞれ配列番号135および136;
(zh)それぞれ配列番号131および133;
(zi)それぞれ配列番号134および137;
(zj)それぞれ配列番号135および137;
(zk)それぞれ配列番号337および338;
(zl)それぞれ配列番号339および341;および
(zm)それぞれ配列番号340および341。
ヒト抗GITRモノクローナル抗体を、Hco7、Hco27、Hco20、Hco12、Hco17およびHc2系統のHuMAb(登録商標)トランスジェニックマウス(“HuMAb”は、Medarex, Inc., Princeton, New Jerseyの商標である)およびKMマウス(PCT公開WO02/43478号に記載のとおり、KMマウス(登録商標)系統はSC20導入染色体を含む)において産生した。HC2/KCo27 HuMAbマウスおよびKMマウスを、開示全体を本明細書に引用により包含させる、米国特許5,770,429号および5,545,806号に記載のとおり産生した。
実施例1いおいて産生したヒトモノクローナル抗GITR抗体を、表面にGITRを発現する活性化ヒトおよびcyno T細胞への結合について試験した。
ヒトまたはカニクイザルから単離した末梢血単核細胞(PBMC)を、プレート被覆抗CD3抗体(クローン:ヒトT細胞活性化のためにUCHT1;クローン:カニクイザルT細胞活性化のためにSP34;両者ともBD Biosciencesから)および可溶性抗CD28抗体(クローン:ヒトおよびカニクイザルの両方についてCD28.2、BD Biosciences)を、4日間(ヒト)/または5日間(カニクイザル)活性化させた。細胞を、フィコエリスリン(PE)コンジュゲート抗ヒトIgG抗体(Jackson ImmunoResearch)を使用する蛍光活性化細胞分類(FACS)ベースのアッセイにおいてGITR mAb結合について試験した。サンプルを、BD FACS Canto Flow Cytometerで解析した。
抗GITR抗体の可溶性GITRへの結合を、Biacoreにより決定した。抗GITR抗体をヒトカッパ被覆チップ(約5KRU;Southernbiotech cat#2060-01)で捕捉し、組み換えヒトGITR(rHGITR/Fc:R&D systems, CAT#689-GR)を、500nM、250nM、125nM、62nMおよび31nM濃度でチップをとおして流した。mAb/容積の捕捉濃度は2〜40μg/mL(10μL/分で5μL)であった。抗原結合時間は15μL/分で5分であり、抗原解離時間は6分であり、再生を50mM HCl/50mM NaOHで行った(100μL/分で各12μL)。28F3およびいくつかの他の抗GITR抗体で得られた結果を表5に示す。
Biacore実験を、チップを抗CH1(Invitrogen Ref# 054500)で被覆した以外、上記のとおり実施した。表6に示す結果は、全3個の抗体が同等な結合特徴を有し、KDは3.93×10−8M〜4.39×10−8Mの範囲であることを示す。
活性化ヒトT細胞および異所性にヒトGITRを発現するマウスT細胞ハイブリドーマ3A9細胞株(3A9−hGITR)での
抗GITR抗体のGITRに対する結合をスキャッチャード解析により決定した。このアッセイを、28F3.IgG1.1(重鎖について配列番号18および軽鎖について配列番号19)で4.59mg/mLで実施した。
活性化ヒトT細胞でのスキャッチャード解析を次のとおり実施した。ヒトドナーから得たT細胞を培養培地(10%FBS、2mM L−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、2−メルカプトエタノール添加RPMI)で洗浄し、1μg/mL抗CD28(CD28.2、BD#555725)および100U/mL IL−2(Peprotech#200-02)を添加した同じ培養培地に106細胞/mLで再懸濁した。各5×106細胞を、20ug抗CD3(5mL、4μg/mL、一夜、4℃;UCHT−1、BD#555329)で被覆した6ウェルプレートの3ウェルに播種した。細胞を3日間、37℃でインキュベートし、これらの細胞の半分をスキャッチャード解析に使用した(“3日目”解析)。残りの半分の消費培地を5mLの新鮮培地で置き換え、細胞をさらに1日インキュベートし、次いで、これらの細胞でのスキャッチャード解析(“4日目”解析)に使用した。
スキャッチャード解析について、28F3.IgG1.1を、IODO-GEN(登録商標)固相ヨウ素化剤(1,3,4,6−テトラクロロ−3a−6a−ジフェニルグリコウリル;Pierce #28601)を使用して125I−Na(Perkin Elmer # NEZ033H001MC(1mCi)で放射ヨウ素化した。過剰のアイオダイドを脱塩カラム(Pierce #43243)を使用して除去した。標識抗体のフラクションを回収し、Wizard 1470ガンマカウンター(Perkin-Elmer)で放射活性を解析した。各フラクションの125I−28F3.IgG1.1濃度をInvitrogenのQubitTM蛍光光度計で計算した。放射性純度を、ピークタンパク質および放射性フラクションの薄層クロマトグラフィー(Pinestar Technology #151-005)により確立した。
3A9−huGITR細胞への放射性ヨウ素化28F3.IgG1.1結合を、3A9−huGITR細胞と125I−28F3.IgG1.1のタイトレーションをインキュベートすることにより示した。非特異的結合を100倍モル濃度過剰の非標識抗体のタイトレーションの存在下の結合により決定し、総CMPから減算して特異的結合を計算した。125I−28F3.IgG1.1濃度対CPMの直線状標準曲線を最大nM結合125I−28F3.IgG1.1の外挿に使用し、それにより細胞あたりの受容体数を計算した。3A9−huGITR細胞あたりのヒトGITR分子は約180,000であった。スキャッチャード解析の結果は、28F3.IgG1.1が0.5nMのKDで3A9−huGITR細胞に特異的に結合することを示す。
他の実験において、ヒトおよびcynoドナーからの活性化CD4+およびCD8+T細胞への28F3.IgG1および28F3.IgG1.1の結合を決定した。ヒトおよびcyno CD4+およびCD8+T細胞をヒトおよびcynoドナーから単離し、活性化のために抗CD3および抗CD28抗体で処理した。結果は、28F3.IgG1および28.IgG1.1が、それぞれ0.55nMおよび0.67nMのEC50で活性化ヒトCD4+細胞に同様に結合し、それぞれ0.56nMおよび0.65nMのEC50で活性化ヒトCD8+細胞に同様に結合することを示す。28F3.IgG1および28.IgG1.1は、それぞれ1nMおよび0.86nMのEC50で活性化cyno CD4+細胞に結合し、それぞれ1.26nMおよび0.74nMのEC50で活性化cyno CD8+細胞に同様に結合する。
HuMAb抗GITR抗体がGITRリガンドのGITRへの結合を阻害するか否かを決定するために、異所性にヒトGITRを発現するマウスT細胞ハイブリドーマ3A9細胞株(GITR−3A9細胞)を、10−4μg/mL〜100μg/mLの濃度範囲のGITR mAbとプレインキュベートし、続いて10ng/mL濃度のGITRリガンド(R&D Systems#6987-GL)とインキュベートした。細胞上のGITRリガンドの結合を、PEコンジュゲート抗ヘマグルチニン(HA)タグ抗体を使用するFACSベースのアッセイで決定し、サンプルを、BD FACS Canto Flow Cytometerで解析した。図34Aおよび34Bに示すとおり、これらの条件下、抗体19D3、28F3およびGITR.3(3C3)は全てGITR−LのGITR−3A9細胞への結合を遮断し、EC50値はそれぞれ0.7546、0.2783および0.06934であった。同様の結果が抗体19H8で得られた。
他のセットの実験を各種の条件下で行い、さらに抗GITR抗体がGITRへのGITR−L結合を阻害する程度を評価した。これらの実験において、1.06×10−9〜100mg/ml濃度の可溶性、組み換えhGITR−L三量体を活性化ヒトT細胞に添加し、0.016ug/mlのEC50値でCD4+およびCD8+T細胞に用量依存的様式で結合した(図34C)。実験を次のとおり実施した。1.06e−9〜100μg/mL濃度の組み換えhGITR−L三量体(R&D Systems Cat. 6987-GL)をPHA活性化T細胞に添加した。30分の一次インキュベーション後、細胞結合GITR−LをPEコンジュゲート抗HAタグ(Miltenyi Cat. 120-002-687)を使用して検出した。サンプルをFACS Canto Flow Cytometer(BD, San Jose)で得て、Flowjoソフトウェア(Tree Star, Inc, Ashland, OR)で解析した。
活性化T細胞を、1.06×10−9〜100ug/ml濃度範囲の28F3−hIgG1で活性化したとき、0.6ug/ml(約90%飽和)でのGITR−Lの結合は影響されなかった(図34E)。しかしながら、GITR−Lを、ほぼEC50である20ng/mlの低濃度で添加したとき、その結合は、予め結合した28F3−hIgG1により、0.076mg/mlのIC50で部分的に遮断された(図34F)。実験を次のとおり実施した。PHA活性化T細胞を、0.00056〜100μg/mL濃度範囲の28F3−hIgG1とプレインキュベートし、続いて0.6ug/mlまたは20ng/mL GITR−Lを添加した。細胞結合GITR−LをPEコンジュゲート抗HAタグを用いて検出した。無関係のhIgG1を28F3−hIgG1のアイソタイプ対照として包含させ、一次抗体のないサンプルを、遮断がないときのGITR−Lの結合を示すために使用した。サンプルをFACS Canto Flow Cytometer(BD, San Jose)で得て、Flowjoソフトウェア(Tree Star, Inc, Ashland, OR)で解析した。
これらのデータは、28F3−hIgG1が、GITR−LによるGITRのインビボ結合を一部可能にし得る部分的リガンドブロッカーであることを示す。
抗体ビニング実験を、次の抗ヒトGITR抗体で実施した。28F3、18E10、19D3、14E3、8A6、9G7、3C3および6G10。
抗GITR抗体をSensor Chip CM5チップ(Series S, GE Healthcare CAT# BR-1005-30)表面、フローセル2、フローセル3およびフローセル4(5000RU)に固定化し、フローセル1を陰性対照として使用した。抗体を、出発濃度で120μg/mL(2×)に希釈した。一連の希釈を緩衝液で抗体を1:3濃度で8つの異なる濃度(120μg/ml〜0.0μg/ml、2X)に希釈することにより行い、タイトレーション曲線を得た。各抗体濃度を二分した。濃度シリーズの最初の半分において、各ウェルに40nM(2×)GITR抗原(rHGITR/Fc CAT# 689-GR)を添加し、最終濃度シリーズ(60μg/ml〜0.0μg/ml)および20nMの最終抗原濃度を作った。濃度シリーズの第二の半分において、抗原の代わりに、緩衝液を、抗体を同じ濃度にするために添加し、この半分をブランクとした。複合体を2時間インキュベートした。40μL複合体を、抗体被覆表面に30μL/分流速で注入した。Biacore T200装置を使用し、ランニング緩衝液は、HBE−EP、GE Healthcare CAT# BR-1001-88、濾過、脱気、0.01M HEPES、pH7.4、0.15 NaCl、3mM EDTA、0.005%界面活性剤P20であった。表面を25mM NaOH(Order code: BR-1003-58, GE Healthcare)で、100μL/分で5秒再生した。データを、Microsoft Excelを使用して解析し、抗体の濃度シリーズを対応する応答単位に対してプロットし、タイトレーション曲線を得た。
結果は、全ての試験した抗体が一つの群にビン分類されることを示し、これらが全てヒトGITRの細胞外領域の類似する領域に結合することを示す。
この実施例は、抗GITR抗体28F3および3C3が非変性ヒトGITRに結合するが、変性ヒトGITRに結合せず、該結合はNまたはO結合グリコシル化により影響されないことを示す。
N結合グリコシル化を有するまたは有しない天然または変性GITRへの抗GITR抗体の結合を、次のとおり決定した。天然(すなわち、非変性)および変性ヒトGITRのサンプルを酵素N−グリカナーゼPNGase F存在下または非存在下、37℃でPBS中、一夜インキュベートして、Nグリコシル化を外した。GITRの変性を、37℃で50mM ジチオスレイトールおよび4M 塩酸グアニジンによる45分の還元により行い、続いて100mM ヨードアセトアミドで20分、室温でアルキル化した。N結合グリコシル化を伴うまたは伴わない天然ヒトGITRのサンプルをSDSゲル電気泳動に付し、N結合グリコシル化を伴うまたは伴わない変性GITRのサンプルを変性SDSゲル電気泳動に付した。該タンパク質を、ウェスタンブロット解析のためにニトロセルロース膜に移した。該膜を28F3抗体とインキュベートした。結合を抗ヒトIgG重鎖および軽鎖に特異的なホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート(HRP標識)二次抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.)とのインキュベーション、続くフィルムに捕捉された発光検出により検出した。図35に示す結果は、抗GITR Ab 28F3が天然GITRにのみ結合し、変性形態には結合せず、グリコシル化の存在または非存在は結合に影響しないことを示す。抗GITR抗体3C3で類似する結果が得られた。
それ故に、抗GITR抗体28F3および3C3は、立体配座特性を有し、N結合およびO結合グリコシル化に非依存的なエピトープに結合する。
ヒトGITRへの28F3および3C3の結合のパターンを、これらの抗体の天然ヒトGITRから産生されたペプチドへの結合のSDS−PAGEおよびウェスタンブロット解析による試験により探索した。実験を次のとおり実施した。まず、天然ヒトGITRを、2%w/w比でエンドプロテイナーゼArg−C、エンドプロテイナーゼLys−C、トリプシン、エンドプロテイナーゼGlu−CまたはエンドプロテイナーゼAsp−Nと37℃でPBS中、5時間、変性剤非存在下インキュベートすることによりタンパク質分解させた。各消化から2μgの反応混合物全体を、次いで非変性SDS−PAGE電気泳動に付し、ウェスタンブロット解析のためのニトロセルロースに移した。ウェスタンブロット斑を、次いで28F3または3C3抗体とインキュベートし、結合を抗ヒトIgG重鎖および軽鎖に特異的なホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP標識)コンジュゲート二次抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.)とのインキュベーション、続くフィルムに捕捉された発光検出により検出した。図36に示す結果は、28F3と3C3の結合パターンが異なることを示し、これらの抗体がヒトGITRの正確に同じ領域に結合するわけではないことを示唆する。
28F3が結合するGITR上の領域を、溶液中での各種の非変性ヒトGITRのフラグメントへの該抗体の結合を試験することにより決定した。実験を次のとおり実施した。ヒトGITRペプチドフラグメントを、ヒトGITRと、2%w/w比でエンドプロテイナーゼArg−C、エンドプロテイナーゼLys−C、トリプシン、エンドプロテイナーゼGlu−CまたはエンドプロテイナーゼAsp−Nと37℃でPBS中、5時間、変性剤非存在下インキュベートすることにより産生した。次いで、ペプチド混合物を抗GITR Abビーズと、PBS中、室温で2時間インキュベートした。一部のサンプルを各種の酵素と、PBS中1時間インキュベーションすることによるインサイチュ二次開裂に付した。非結合ペプチドを、抗GITR AbビーズをPBSで2回洗浄することにより除去した。抗GITR Ab 28F3に結合したペプチドを2%ギ酸で溶出し、次いでLC−MSによる配列同定に付した。図37にヒートマップとして示す結果は、28F3が、成熟ヒトGITR(配列番号4)のアミノ酸残基1〜39に対応する次のN末端アミノ酸ストレッチQRPTGGPGCGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTRCCRDYPGE(配列番号215)内または短フラグメントQRPTGGPGCGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTR(配列番号370)内の立体構造エピトープに結合することを示す。
ヒトGITRの細胞外ドメインのO結合グリコシル化は知られていないまたは報告されていない。しかしながら、配列番号215の残基T18およびT20は、Oグリコシル化コンセンサス配列を含む。これらの残基は、エピトープ配列で下線を付す:
QRPTGGPGCGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTRCCRDYPGE(配列番号215)。それ故に、O結合グリコシル化が28F3のヒトGITRへの結合に影響するか否かを決定した。
28F3の配列番号215からなるグリコシル化または非グリコシル化ペプチドへの結合を次のとおり実施した。ヒトGITRの部分的グリコシル化および非グリコシル化N末端ペプチドを、マウスFcに結合するインタクト天然ヒトGITR細胞外ドメインのタンパク質分解により産生した。配列番号215のアミノ酸残基1〜39からなる非グリコシル化GITRペプチドも、有機合成により産生した。28F3のペプチドへの結合の方法は、先のセクションに記載している(28F3被覆ビーズ使用)。図38Bに示すとおり、2個のペプチドは28F3被覆ビーズに結合することが判明し、これらは、LC−MSによりO結合グリコシル化がないN末端ペプチド(図38A)および他方は配列番号215のT18および/またはT20にO結合グリコシル化を有する同じN末端ペプチド(図38D)であるとして同定された。
それ故に、28F3は、アミノ酸T18および/またはT20にO結合糖を有していてもいなくても、ヒトGITRのN末端領域に結合する。
先の実施例に記載した実験の一部として、どこのO結合グリコシル化も有しない配列番号215を有する合成ペプチドを、まず28F3被覆ビーズに結合させ、次いでさらにエンドプロテイナーゼAsp−Nでのインサイチュ消化により開裂させた。アミノ酸配列QRPTGGPGCGPGRLLLGTGT(配列番号216)からなり、O結合グリコシル化されていないアミノ酸残基T18およびT20を含む残存ペプチドは28F3に結合した(図38E)。それ故に、28F3は、配列番号216からなる20量体に結合する。
水素/重水素交換マススペクトロメトリー(HDX−MS)方法は、主鎖アミド水素原子の重水素交換の速度および程度のモニタリングにより、溶液中のタンパク質配置および配座動力学を探索する。HDXのレベルは、主鎖アミド水素原子およびタンパク質水素結合の溶媒近接性による。HDXによるタンパク質質量増加は、MSにより厳密に測定できる。この技法を酵素消化と組み合わせたとき、ペプチドレベルでの構造特性が解明され、表面露出ペプチドを内側に折りたたまれているものと分けることが可能となる。一般に、重水素標識およびその後の反応停止実験と、続くオンラインペプシン消化、ペプチド分離およびMS解析を行う。
HDX−MSによるGITRにおける28F3.IgG1 mAb(それぞれ配列番号17および19からなる重鎖および軽鎖を有する)のエピトープマッピングの前に、非重水素化実験を実施して、組み換えヒトGITR/Fcの共通消化性ペプチド(R&D Systems、10μM、アミノ酸置換T20Aを含む)および組み換えヒトGITR/Fcと28F3.IgG1 mAbのタンパク質複合体(1:2モル濃度比、10μMおよび20μM)のリストを作成し、GITR N末端領域について86%の配列包括度を達成した(図39A)。この実験において、10mM リン酸緩衝液(pH7.0)を標識工程中使用し、続いて反応停止緩衝液(200mM リン酸緩衝液および4M GdnClおよび0.5M TCEP、pH2.5、1:1、v/v)を添加した。エピトープマッピング実験について、5μLの各サンプル(GITR/FcまたはGITR/Fcと28F3.IgG1 mAb(1:2モル濃度比))を、55μLのD2O緩衝液(10mM リン酸緩衝液、D2O、pD7.0)で希釈し、室温で標識反応を開始させた。反応を20秒、1分、10分、60分および240分の各種の時間実施した。各標識反応時間の最後に、反応を反応停止緩衝液(1:1v/v)添加により停止させ、50μLの反応停止サンプルを解析のためにWaters HDX-MSシステムに注入した。観察された共通消化性ペプチドを、28F3.IgG1 mAbの非存在下/存在下、重水素取り込みレベルについてモニターした。
ペプチド領域1:PTGGPGCGPGRLLLGTGA(配列番号217)
ペプチド領域2:CRDYPGEE(配列番号218)
相対的重水素取り込みレベルの変化に基づき、2ペプチド領域を領域1>2とランク付けでき、領域1は重水素取り込みで最も有意に変化し、領域2は統計的有意であった。
抗GITR抗体を、該抗体とインキュベートしたT細胞により分泌されるIL−2およびIFN−γの量を測定することにより、インビトロでT細胞活性を増強する能力について試験した。
異所性にヒトGITRを発現するマウスT細胞ハイブリドーマ3A9細胞株(3A9−hGITR)を、存在する19D3、18E10および28F3抗体の量を増やしながら、抗CD3モノクローナル抗体被覆プレートで培養した。5×104 3A9−hGITR細胞を、1μg/ml抗CD3抗体(クローン145−2C11;BD Biosciences)で被覆したプレートで培養し、記載する濃度の抗体で24時間処理した。図40に示すとおり、抗体3C3(GITR.3)、28F3、19D3および18E10は、全て、T細胞からのIL−2分泌を用量依存的様式で増強させた。予想どおり、対照hIgG1およびhIgG2抗体は3A9−hGITR細胞からのIL−2分泌を増加させなかった。
抗GITR抗体が刺激性CD3シグナル存在下3A9−hGITR細胞からのIL−2分泌を増強したことから、該抗体が特異的抗原により活性化された3A9−hGITR細胞からのIL−2分泌を増強する能力について試験した。5×104 3A9−hGITR細胞を、0.4μM HEL48−63ペプチドおよび記載する抗体の存在下、2.5×104 LK35.2抗原提示細胞と24時間共培養した。図41Aおよび41Bに示すとおり、抗体18E10、13H2(28F3と同一の抗体)、28F3、3C3および19D3は、3A9−hGITR細胞からのIL−2分泌を用量依存的様式で増強した。
他の抗GITR抗体で刺激したドナーT細胞によるIFN−γの分泌も示した。アッセイを上記のとおり実施した。図42Aに示すとおり、抗体28F3、3C3、19D3および18E10は、全てCD3+T細胞からのIFN−γ分泌を用量依存的様式で増強し、抗体28F3および3C3が試験した抗体で最大効果を示した。
他の実験において、抗GITR抗体、特に、28F3存在下のT細胞増殖が混合リンパ球反応(MLR)で示された。
纏めると、これらのデータは、抗体18E10、19D3および28F3が、T細胞からのサイトカイン分泌を増強するアゴニスト抗GITR抗体として機能することを示す。
アゴニスト抗TNFR抗体は、インビボ活性のためにFcγRIIB共結合が必要であると報告されている(Li et al., Cell Cycle 2012;11:3343-3344)。この要件が抗GITR抗体にまで拡張されるか否かを決定するために、3A9−hGITR細胞を、実施例13に記載のとおりLK35.2細胞およびHEL48−63ペプチドと共培養し、完全長抗GITR抗体28F3(hIgG2)、28F3のF(ab’)2フラグメントまたは28F3のFabフラグメントで処理し、mIL−2産生について評価した。図43に示す結果は、完全長28F3および28F3のF(ab’)2フラグメントの両方がmIL−2産生を増強したが、28F3のFabフラグメントの効果は弱く、一価ではなく、二価の結合が抗GITR抗体28F3の効果に寄与することを示唆する。これらの結果は、纏めて、FcγRIIB共結合はインビトロでのアゴニスト抗GITR抗体のT細胞増強効果に必要ではないが、FcγRIIB受容体の結合はアゴニスト活性を増強し得ることを示唆する。抗GITR抗体は、アゴニズムを増加させるためにFcγRIIB受容体への結合が増大するよう改変され得る。
どの組織がGITRを発現するかを決定するために、抗GITR抗体28F3を各種の組織におけるGITRの免疫組織化学的検出のために使用した。非リンパ系組織で特異的染色は見られなかった(心臓、肝臓、肺、腎臓、皮膚、末梢神経、甲状腺、精巣、前立腺を含む)。陽性染色はリンパ系(扁桃、脾臓および胸腺を含む)およびリンパ系富(結腸、胃、子宮の粘膜固有層)組織におけるリンパ球および/または単核細胞の散在サブセットでのみ観察された。扁桃における染色を図44に示す。陽性染色は、濾胞間/傍濾胞領域および胚中心における散乱リンパ球で観察された。単核細胞(上皮の真下)および上皮浸潤リンパ球の散乱クラスターも陽性に染色された。
DTA−1は、アゴニストラット抗マウスGITR抗体(Shimizu et al., 2002; eBioscience, San Diego, CA)である。このIgG2b抗体は、B16黒色腫の処置の間TregおよびTeffの両方を調節することが示されている。さらに、TeffおよびTreg両者によるGITR発現が、DTA−1の完全な効果に必要であった。Cohen et al. (2010)は、DTA−1によるGITRライゲーションはTreg抑制活性を全体的に抑止しないが、Treg腫瘍浸潤を障害し、抑制の局在的な抑止を暗示する腫瘍内Treg内のFoxp3発現の喪失に至る。正味の結果は腫瘍内Teff:Treg比の増強ならびに腫瘍内でのTeff活性化および機能の増強である。DTA−1は、GITRとGITRリガンド(GITRL)の相互作用を遮断し、可溶性抗体は、インビトロで細胞応答の促進に効果的である。各種の腫瘍モデルにおける腫瘍増殖の阻害にも有効である(例えば、Turk et al., 2004; Cohen et al., 2010参照)。
各種の抗GITR(DTA−1)アイソタイプの抗腫瘍活性を、ステージ分類MC38結腸腺癌腫瘍モデルで評価した。C57BL/6マウスに、2×106 MC38腫瘍細胞を各皮下注射した。7日後、マウスを5処置群に無作為化し、試験抗体を7日目、10日目および14日目に、200μl容積中、用量あたり200μgで次のとおりIPで投与した。群1:マウスIgG1対照(IgG);群2:抗GITRラットIgG2b Ab(DTA−rG2b);群3:抗GITRマウスIgG1 Ab(DTA−mG1)および群4:抗GITRマウスIgG 2a Ab(DTA−mG2a)。腫瘍および脾臓を15日目に摘出した。
図45Cは、IgG1抗GITR処置腫瘍は、マウスIgG1対照処置腫瘍と同等な速度で増殖し(図45A)、マウスのモニタリングの最後まで10マウスのいずれも無腫瘍(TF)とはならなかったことを示す。しかしながら、DTA−rG2b(図45B)およびDTA−mG2a(図45D)は腫瘍増殖速度を有意に減少させ、それぞれ10マウス中3匹および2匹がTFとなった。
各種の抗GITRアイソタイプで処置したマウスの群の平均腫瘍体積および中央腫瘍体積の変化を、図46Aおよび46Bにプロットする。これらのプロットは、IgG2bアイソタイプの抗GITR抗体がMC38腫瘍増殖で最も強力な阻害性効果を示し、IgG2aアイソタイプがわずかに効力が弱いことを示す、図45に示す個々のマウスデータを確認する。IgG1アイソタイプは腫瘍増殖のわずかな阻害を示し、平均および中央腫瘍体積は、マウスIgG対照で処置したマウスのものと同等であった。
TILにおいて、9D9−m2aは、マウスIgG1対照両方と比較して、CD8+細胞のパーセンテージの少なくとも2倍増加をもたらした(図47D)。マウスIgG1アイソタイプ対照と比較して、DTA−m2aはあまり顕著な効果を示さず、CD8+細胞のパーセンテージを約50%増加させ、一方DTA−m1およびDTA−r2bは、CD8+細胞のパーセンテージの増加をもたらさないかまたは最低限度の増加しかなかった(図47D)。9D9−m2aは、マウスIgG1アイソタイプ対照と比較してCD4+細胞のパーセンテージをわずかに増加させ、一方DTA−m1はCD4+を変化させなかった(図47E)。対照的に、DTA−m2aおよびDTA−r2bの両方は、マウスIgG1アイソタイプの両方と比較してCD4+パーセンテージを40〜50%減少させた(図47E)。
MC38 TILおよび脾臓におけるT細胞の各種のサブセット上のGITR発現レベルのフローサイトメトリー測定は、GITRが腫瘍部位でTreg上に最も高度に発現され、その発現レベルは末梢におけるTregまたは腫瘍部位でのCD8+Teffより高く、これは、末梢におけるCD8+またはCD4+Teffより高い発現となったことを示した。GITR発現の最低相対レベルは、腫瘍部位のCD4+Teffで見られた。これらのデータは、Fc融合タンパク質の標的が腫瘍部位でのTeff上の標的の発現に比して腫瘍部位でのTreg上で高度に発現され、Fc融合タンパク質が標的細胞枯渇に介在する活性化FcRに結合するならば、T細胞枯渇活性がT細胞応答の刺激を助け、それによりFc融合タンパク質の抗腫瘍有効性を増強する機構を示唆する。
DTA−1バリアントで遭遇する凝集のため(e商業的に入手したDTA−r2bの元の形態以外)、新規セットのアイソタイプバリアントを再改変して、凝集しないDTA−1抗体を得た。観察された凝集は、改変アイソタイプバリアントの軽鎖に不注意に取り込まれていた余分なアミノ酸の痕跡であり、この外来のアミノ酸の除去により問題は軽減された。再改変抗体を、この実験#2において使用した。再改変抗GITR(DTA−1;GITR.7シリーズ)アイソタイプの抗腫瘍活性をステージ分類MC38モデルを使用して表かした。C57BL/6マウスに2×106 MC38細胞を各皮下にインプラントした。7日後、マウスを、約148mm3/2の同等な平均腫瘍体積を有するように7処置群に無作為化し、試験抗体を、7日目、10日目および14日目に、(200μg用量て投与したmIgG対照以外)、用量あたり200μgで次のとおりIPで投与した。群1:マウスIgG1対照(mIgGまたは“アイソタイプ”);群2:抗GITRマウスIgG1Ab(mGITR.7.mg1);群3:抗GITRマウスIgG1D265Aアイソタイプ(mGITR.7.mg1−D265A);群4:抗GITRマウスIgG2a Ab(mGITR.7.mg2a);群5:抗GITRマウスIgG2b Ab(mGITR.7.mg2b)および群6:抗GITRラットIgG2b Ab(mGITR.7.r2bまたはDTA−1−rG2b)。腫瘍および脾臓を15日目に摘出した。
図48Bおよび48Cは、IgG1およびIgG1−D265A抗GITR処置腫瘍が、マウスIgG1対照で処置した腫瘍と同等の速度で増殖することを示す(図48A)。各場合、インプラント後35日のマウスのモニタリングの最後まで、9マウスのいずれもTFとならなかった。しかしながら、実験MC38 #1の結果に類似して、mGITR.7.mg2a(図48D)は腫瘍増殖の最大阻害を誘発し、9マウス中2匹がTFとなった。マウスおよびラット抗GITR−2b抗体も、同程度腫瘍増殖速度を減少させたが(図48Eおよび48F)、ラット2b抗体は1匹のTFマウスを生じたのに対し、マウス2b抗体は、インプラント後35日でTFマウスを生じさせなかった。
処置マウスからのTILおよび脾臓におけるTregの集団に対する各種の抗GITRアイソタイプの効果を図50に示す。実験#1で観察されたとおり、試験したアイソタイプバリアントのいずれも、脾臓におけるCD4+Foxp3+Tregのパーセンテージに莫大な効果はなく、最強効果は、ラット抗GITR IgG2bアイソタイプでの処置により誘発された40%未満の増加であり、一方マウス抗GITR IgG2bアイソタイプは、CD4+Foxp3+Tregのパーセンテージをわずかに減少させた。試験した他の抗GITRアイソタイプおよび抗CTLA−4 IgG2a(9D9−mG2a)抗体は、Tregのパーセンテージをわずかに増加させた(図50A)。
実験MC38 #2で得られたデータは実験#1で得られたデータとほぼ一致し、抗体の凝集が該抗体の活性を過度に妨害しなかったことを示唆する。おそらく、凝集抗体はマウス体内で急速に拡散し、それ故に、抗体凝集はインビボアッセイで顕著な問題ではない可能性がある。
抗GITRの抗腫瘍活性を、A/JマウスにおけるSa1N肉腫モデルでも評価した。マウスにインプラントあたり2×106 Sa1N細胞を皮下注射した。7日後、腫瘍体積を決定し、マウスを同等な平均腫瘍体積(約75mm3/2)となるよう、処置群に無作為化した。実施例10、実験MC38 #1において記載したとおり各種のアイソタイプを有するように改変した抗GITR(DTA−1)抗体を、7日目、10日目および12日目に用量あたり200μgでIPで投与した。
腫瘍増殖に対する効果を図51に示す。IgG2a抗GITR抗体での処置は腫瘍増殖を完全に阻害し、全10マウスはインプラント後約20日目TFであり(図51B)、ラットIgG2bアイソタイプは同等の効果を有し、10マウス中9匹が、約20日目TFであった(図51C)。IgG1(図51D)およびIgG1D265A(図51E)アイソタイプは、IgG1アイソタイプ対照処置腫瘍の非阻害増殖と比較したらある程度腫瘍を阻害したが(図51A)、これはmIgG2aおよびrIgG2bアイソタイプで見られる阻害よりはるかに少なかった。図52Aおよび52Bに示す平均腫瘍体積および中央腫瘍体積の変化は、mIgG1およびmIgG1−D265Aアイソタイプにより示される腫瘍増殖のはるかに低い阻害と比較して、腫瘍増殖に対するmIgG2aおよびrIgG2b抗体の実質的に完全な阻害性効果を示した。
纏めると、図51および52のデータは、はるかに低い抗腫瘍活性を示すmIgG1(およびmIgG1−D265A)アイソタイプとは対照的に、抗GITR mIgG2aおよびrIgG2bアイソタイプが強力な抗腫瘍活性を示すMC38腫瘍モデル(実施例10)で得られたデータを確認する。mIgG1およびD265Aバリアント抗体のSa1Nモデルにおける抗腫瘍活性は、Treg枯渇がないGITRのアゴニズムの効果に一致する。
末梢におけるTregの効果と対照的に、抗GITR m2aおよびr2bアイソタイプならびに抗CTLA−4 2bアイソタイプは、全て腫瘍部位のTregのレベルを少なくとも3.5倍減少させた(図53B)。TILにおいて、抗GITR IgG1アイソタイプおよびIgG1−D265A変異体の両方は、Tregのパーセンテージの約35%の小さな減少を誘発したのに対し、抗CTLA−4 IgG1−D265A変異体はTregのパーセンテージを変化させなかった(図53B)。それ故に、MC38腫瘍モデルにおいて観察されたとおり、抗GITR mG2aおよびrG2bアイソタイプは、IgG1およびIgG1−D265A抗体よりはるかに顕著なTreg枯渇を腫瘍環境で誘発し、これは腫瘍増殖阻害と相関すること。
相乗的抗腫瘍効果が、DTA−1抗体を、抗腫瘍機構に対する阻害性シグナルを提供する分子であるPD−1と拮抗する抗体と組み合わせることにより得られるか否かを決定するために、ステージ分類MC38結腸腺癌モデルを使用して腫瘍体積に対するこれら抗体の組み合わせの効果を評価した。マウスを、7日、10日および14日に(A)対照mIgG1、(B) mIgG+DTA−1、(C) mIgG+PD−1(クローン4H2、BMS)および(D) PD−1+DTA−1で処理した。
腫瘍増殖に対する効果を図54に示す。DTA−1抗体または抗PD−1抗体個々での処置は、ある程度腫瘍増殖を阻害し、各々10マウス中2匹がTFとなった。対照的に、DTA−1抗体と抗PD−1抗体の組み合わせは、30日までにTFマウスの数を実質的に増加させ、10マウス中7匹がTFとなった。予想どおり、対照mIgGを投与したマウスでTFマウスはいなかった。
これらの結果は、アゴニスト抗GITR抗体とアンタゴニスト抗PD−1抗体の組み合わせが、腫瘍増殖阻害に相乗的に作用することを示唆する。
この実施例は、28F3のVH CDR3におけるあるアミノ酸残基を、結合親和性に顕著に影響することなく他のアミノ酸に置換できることを示す。
28F3の48変異体を、VH CDR3の次のアミノ酸M102、D106およびM111(ナンバリングは配列番号13に従う)の1以上を変異させることにより作製し、次3A9−hGITR細胞への結合およびプレート結合抗CD3存在下3A9−hGITR細胞のIL−2分泌の活性を試験した。実験を上記のとおり実施した。
結果を図55Aおよび55B(3A9−hGITR細胞への結合)、図56A〜F(IL−2分泌)および表7に示す。
この実施例は、IgG2ヒンジを有するGITR抗体が、IgG1ヒンジを有する同じ抗体と比較して、T細胞からのIL−2およびIFN−γ分泌を誘発する能力が増加することを示す。
上記CHO−OKT3および3A9アッセイにおいて、IgG2定常領域を有するハイブリドーマ由来抗体が、重鎖定常領域がIgG1またはエフェクターレスIgG1(IgG1.1)のものにスイッチされた同じ抗体よりも、サイトカイン分泌刺激がより強力であることが観察された。それ故に、IgG2定常領域またはヒンジの効果を、これらのアッセイにおいて抗GITR抗体でさらに試験した。
抗ヒトGITR抗体の重鎖可変領域を、次の重鎖定常領域に結合させた。
次に、IgG1定常領域またはIgG2ヒンジ/IgG1 Fcドメインを有するGITR抗体の能力を、実施例13に記載するとおり、OKT3発現CHO細胞で刺激したT細胞からのIL−2およびIFN−γ分泌を誘発する能力について試験した。図58Aおよび58Bに示すとおり、IgG2ヒンジ/IgG1 Fcドメインを有する抗体(“抗GITR.G2.g1f”)は、IgG1定常領域を有する抗体(“抗GITR.g1f”)より高い程度でT細胞からIFN−γおよびIL−2分泌を誘発した。類似する結果がこれらの定常ドメインのエフェクターレスバージョンで得られた(図58C)。
抗IgG2ヒンジを有するGITR抗体でのT細胞活性化増加をさらに確認するために、各種の実験構成でIL−2分泌を試験した。この実験において、GITR抗体が3A9−hGITR細胞(ヒトGITRを異所性に発現するマウスT細胞ハイブリドーマ3A9細胞株)からのIL−2分泌を誘発する能力を実施例13に記載のとおり試験した。図59に示すとおり、IgG2ヒンジを有する全抗体(抗GITR.g2、抗GITR.g2.g1fおよび抗GITR.g2.g1.1f)は、IgG1定常領域含有カウンターパート(抗GITR.g1fおよび抗GITR.g1.1f”)より高い程度で3A9−hGITR細胞からのIL−2分泌を誘発した。
これらの結果は、纏めて、IgG2ヒンジおよびg1またはg1.1定常領域を有する抗GITR抗体が、IgG1ヒンジを有する同じ抗体より強力であることを示唆する。IgG2ヒンジ含有GITR抗体の効果改善を説明する可能性のある機構は、IgG1ヒンジを含む同じ抗体と比較して、内部移行増加および/または細胞表面でのこれらの抗体の複合体形成増加である。
GITRはマウスおよびヒト両方の制御性T(Treg)細胞で発現される。文献におけるデータは、アゴニスト抗GITR抗体が、Treg細胞存在下、マウスCD4+Foxp3− Tエフェクター(Teff)細胞の増殖を駆動することを示している。さらに、この効果は、Treg細胞サプレッサー機能に対する直接効果ではなく、主にTeff細胞への抗GITR抗体結合により駆動されることが示唆されている。他の刊行物は、抗GITR抗体がTreg細胞増殖を駆動し、Foxp3喪失により特徴付けられるTreg細胞系譜不安定性を誘発し得ることを示す。
Treg細胞機能に対する抗GITR抗体の効果を試験するために、Teff細胞がAPCおよびタイトレーション数のTreg細胞存在下、抗CD3および抗マウスGITR mAb DTA−1の各種のアイソタイプで刺激された、マウスTreg細胞抑制アッセイを実施した。結果は、DTA−1抗体処置が、アイソタイプ対照と比較して増殖を増加させたことを示す。さらに、IgG1、2a、2bおよび不活性IgG1 D265Aアイソタイプは、Teff細胞増殖の増加に全て効果的であり、それによりFcR結合がこのシステムにおける抗GITR抗体機能に必要ではないことを示す。
先の実験から、Teff増殖増加がTregおよび/またはTeff細胞に作用する抗GITR抗体によるものであるか否か明確ではなかった。この疑問に取り組むため、ヒトGITR“ノック・イン”(huGITR KI)マウスを使用した。これらのマウスにおいて、マウスGITRをコードする遺伝子であるTnfrsf18をヒトTNFRSF18遺伝子に置き換え、ヒトGITRを野生型マウスにおけるmuGITRと同様にに発現させ、ヒトGITRはTeffおよびTreg細胞両方で発現され、後者のレベルが高かった。抗ヒトGITR mAb 28F3はhuGITR KIマウスからのTeff細胞の増殖を駆動できることが判明した。28F3がマウスGITRではなくヒトGITRに結合するため、GITRがTeffおよびTreg細胞を差次的に標的とするTreg抑制アッセイシステムの設定が可能であった。このシステムは、28F3と、ヒトIgG1または不活性IgG1.1 Fc領域の間の機能的差異の試験も可能とした。
結果を図60に示す。予想どおり、28F3がTregおよびTeff細胞の両方に結合できたとき、Teff細胞増殖の増加が観察され、この効果は28F3がTeff細胞のみに結合できた条件で維持された。対照的に、28F3がTreg細胞にしか結合できなかったとき、Teff増殖のアイソタイプ対照を超える増加はなかった。アイソタイプに関して、28F3が効果を示した条件下で、IgG1およびIgG1.1 Fcで差異はなかった。これは、Fc架橋が抗GITRアゴニズムに必要ではないことを示す上記データと一致する。纏めると、このシステムにおいて、抗GITR抗体は、Treg細胞サプレッサー能の阻害を介してではなく、主にTeff細胞機能を調節する能力により作用する。しかしながら、これは、抗GITR抗体がTreg細胞増殖を駆動するまたはADCCまたはADCPのためのTreg特異的標的を提供する可能性のため、インビボでのTreg細胞に対するGITRシグナル伝達の役割を除外しない。
28F3.IgG1fおよび28F3.IgG1.1fのインビトロADCC活性を、エフェクターとしてNK92/CD16細胞または初代NK細胞およびGITRを発現することが知られる多様な細胞を標的として使用して評価した。
アッセイ3日前、標的CD4+およびCD8+T細胞サブセットを陰性選択により単離し、Tregをさらに CD4+T細胞からCD25陽性選択により単離した。T細胞サブセットの各々をCD2/CD3/CD28ビーズ(Miltenyi Biotec)で3日刺激し、GITRの上方制御を誘発した。アッセイ1日前、初代NK細胞を陰性選択(StemCell Technologies, Inc)により新鮮PBMCから単離し、一夜、500IU/mL組み換えIL−2(R&D Systems)および1uMヒドロコルチゾン(StemCell)添加MyeloCult H5100培地(StemCell)でインキュベートした。アッセイ当日、エフェクター細胞(初代NK細胞またはNK92/CD16)を、特定のエフェクター対標的比で、1ug/mL 28F3.IgG1fおよび28F3.IgG1.1f存在下、Calcein AM標識活性化T細胞とインキュベートした。
初代NK細胞またはNK92/CD16細胞をエフェクターとして使用して、28F3.IgG1は活性化CD4+TエフェクターおよびTreg細胞の溶解を誘発したが、活性化CD8+T細胞の観察された溶解は少なかった(図61)。予想どおり、28F3.IgG1.1は、エフェクターとしてNK92または初代NK細胞を使用して、いずれの標的細胞のADCCも介在しなかった。それ故に、28F3.IgG1は活性化CD4+TエフェクターおよびTreg細胞および程度は少ないが活性化CD8+T細胞の溶解を誘発し、28F3.IgG1により誘発された溶解レベルは、標的細胞上のGITR発現レベルと比例するように見える。
この実施例は、28F3.IgG1および28F3IgG1.1がヒト免疫系およびヒトGITRタンパク質を有するC57BL/6マウスにおけるMC38腫瘍に抗腫瘍活性を有し、該抗腫瘍活性が28F3.IgG1で強まることを示す。
MC38細胞を、10%熱不活性化ウシ胎児血清(FBS)、2mM L−グルタミン、4.5g/L(45%) グルコース(10mL/L)および1mM ピルビン酸ナトリウム(10mL/L)含有DMEM培地で培養した。細胞を、2日毎に1:10に分けた。マウスの2コホートを使用し、両コホートについて、各マウスの右脇腹に、0.2mL PBS中75万MC38細胞を1cm3シリンジおよび25ゲージ半インチ針を使用して皮下にインプラントした。コホート1について、インプラント後7日目、40マウスを腫瘍体積(L×W×H/2)により各12〜13マウスの3群に無作為化した。全群、約174mm3/2の平均腫瘍体積を有した。7日目、10日目および14日目、媒体対照またはmAbを10mg/kgで投与した。コホート2について、インプラント後7日目、10マウスを、腫瘍体積(L×W×H/2)により各5マウスの2群に無作為化した。全群、約69mm3/2の平均腫瘍体積を有した。7日目、10日目および14日目、媒体対照または28F3.IgG1 mAbを10mg/kgで投与した。
マウスに、表9に要約する濃度および日で腹腔内(IP)投与した。
この腫瘍調査において、コホート1をインプラント後52日目に終了した。腫瘍体積および体重の平均、標準偏差(SD)および中央値の計算にMicrosoft Excelを使用した。平均および中央値を、それぞれ、各処置群の実験動物が100%および少なくとも60%残っているとき計算した。コホート2におけるマウスからの腫瘍を、15日目に摘出した。
結果は、試験中の全マウスが生存していた最終日である、腫瘍インプラント後22日目に、10mg/kg用量の28F3.IgG1は、アイソタイプ対照抗体と比較して、MC38異種移植で67%平均腫瘍増殖阻害(TGI)を示した。腫瘍TGIを表10において処置群毎に要約する。処置群毎の腫瘍増殖曲線を図62A〜62Cに示す。処置群毎の平均および中央腫瘍増殖曲線を図63A〜63Bに示す。平均および中央体重変化が20%未満であったことから、いずれの処置群でも毒性は明白ではなかった。マウス体重および経時的パーセンテージ変化を図64A〜64Bに示す。
28F3.IgG1がT細胞集団に有する効果を試験するために、インプラント後15日目各処置群の5マウスから組織を摘出した。脾臓および腫瘍を、gentleMACS Octo DissociatorTM(Miltenyi, San Diego, CA)で処理した。単一細胞懸濁液を、フローサイトメトリー(FACS)を使用してT細胞マーカーで染色した。抗体蛍光を、Fortessa(BD Biosciences, San Jose, CA)でのフローサイトメトリーにより検出し、結果をコンピュータープログラム、Flowjo(Flowjo, LLC, Ashland, OR)で解析した。
図65および66に示す結果は、アイソタイプ対照と比較した、28F3.IgG1で処置したマウスにおける枯渇と一致するTreg細胞のパーセンテージ減少を示す(図65)。逆に、28F3.IgG1群でCD8+T細胞のパーセンテージの増加はなかった(図66)。
それ故に、アイソタイプ対照と比較して、28F3.IgG1で処置したマウスにおける免疫モニタリングは、TGIにTreg枯渇およびCD8+T細胞増加が介在し得ることを示唆する。
この実施例は、架橋28F3.IgG1がT細胞のIFN−γ分泌を増強し、T細胞増殖を促進するその効力を増加させることを示す。
T細胞を、各種の濃度の抗GITR抗体または対照薬剤の存在下、CHO−OKT3細胞またはCHO−OKT3−CD32a高と共培養し、インターフェロン−γ(IFN−γ)分泌および細胞増殖のレベルを測定した。CHO−OKT3−CD32高細胞株は、親CHO−OKT3クローンより極めて高レベルのFc受容体CD32aおよびわずかに高いOKT3発現を有する。
アッセイを次のとおり実施した。レスポンダーT細胞を、製造業者のプロトコールに従い、CD4 T細胞単離キット(Life technologies, Cat. 113.31D)およびCD25マイクロビーズ(Miltenyi, Cat. 130-092-983)を用いてFicoll勾配(Amersham Bioscience 17-1440-03)から単離したヒトPBMCから得た。抗CD3scFv(OKT3)を発現するCHO細胞(CHO−OKT3)または抗CD3scFvを発現するCHO細胞およびCD32aをRPMI培地で2回洗浄し、50キロラド線量での照射に付した。細胞を採取し、培養培地(10%ウシ胎児血清、2mM L−グルタミン、55nM β−メルカプトエタノール、1mM ピルビン酸ナトリウムおよび100U/mLペニシリン/ストレプトマイシン添加RPMI−1640)に2.5×105/mLで再懸濁した。96ウェルTCグレード平底プレート(Costar)のウェルあたり、2.5×104 CHO細胞および1×105 T細胞を播種した。細胞を、20μg/mLから開始するGITR抗体の8点、4倍タイトレーションとインキュベートした。無関係のhIgG1を、アイソタイプ対照として20μg/mLで添加した。細胞のみのサンプル、何ら処理しないベースライン活性を示すために包含させた。各サンプルからの上清を、IFN−γ測定(BD optEIA human IFN-g ELISA Kit; BD Bioscience#555142)のために3日目に採取した。細胞増殖を、インキュベーションの最後の8時間の3H−チミジン取り込みにより評価した。図67および68に示す結果は、28F3.IgG1存在下、CHO−OKT3細胞と共培養したものと比較して、CHO−OKT3−CD32a高と共培養したT細胞からより多くのIFN−γが分泌されることを示す(図67)。予想どおり、CD32aに結合しないエフェクターレス28F3.IgG1.1f抗体で有意な差は観察されなかった。さらに、28F3.IgG1存在下、CHO−OKT3細胞と共培養したものより多いT細胞増殖がCHO−OKT3−CD32a高と共培養したT細胞で観察され、この効果はエフェクターレス28F3.IgG1.1f抗体で観察されなかった(図68)。それ故に、架橋28F3.IgG1は、T細胞のIFN−γ分泌を増強し、T細胞増殖を促進するその効力を増加させる。この増強効果は、低レベルのCD32aを発現するCHO−OKT3細胞と増殖させたT細胞でも観察された。GITR.6 g1.1fは、可溶性であるときと比べて、交差結合であるとき、高レベルのIFN−γを示した。これは、CHO−OKT3細胞と比較して、CHO−OKT3−CD32a高細胞で発現されるOKT3レベルがわずかに高いことを反映している可能性がある。交差結合GITR.6g1fで観察された増加は不活性アイソタイプより大きく、架橋の正の利益を示唆する。G1fバージョンは、可溶性抗体が背景を超えるアゴニズムがほとんどない低用量で高レベルのIFN−γを促進し、同様に架橋の正の役割を示唆する。
それ故に、28F3.IgG1およびエフェクターレス28F3.IgG1抗体の両方とも、IFN−γ産生を刺激し、T細胞増殖を刺激するが、しかしながら、架橋28F3.IgG1は、T細胞のIFN−γ分泌を増強し、T細胞増殖を促進するその効力をさらに増加させる。
この実施例は、IgG2アイソタイプのCH1ドメインが、IgG1アイソタイプのCH1ドメインを有する抗体と比較して、抗GITR抗体誘発T細胞活性を増強することを示す。
表11に示す修飾重鎖定常領域を、抗GITR抗体の可変領域と結合させた。ドナーCD4+T細胞を、OKT3−scFv発現CHO細胞および各種の抗GITR抗体とインキュベートし、分泌されるIL−2のレベルを測定した。これは、実施例20に記載のとおり実施した。
それ故に、この実施例は、アゴニスト抗GITR抗体におけるIgG2ヒンジおよびIgG2 CH1ドメインの存在は、IgG2アイソタイプのヒンジおよび/またはCH1ドメインを含まない同じ抗体と比較して、抗体のアゴニスト活性をさらに増強させることを示す。IgG2アイソタイプのヒンジおよびCH1ドメインの両方を有する抗体は、IgG2アイソタイプのヒンジを有するが、CH1を有しない抗体と比較して、強いアゴニスト効果を有する。さらに、IgG2からのCH1ドメインを有する抗体は、IgG1アイソタイプからのCH1ドメインを有する抗体より強いアゴニスト活性を有する。IgG2からのヒンジおよびIgG1からのCH1ドメインを有する抗体は、IgG1アイソタイプからのCH1およびヒンジを有する抗体より強いアゴニスト活性を有する。
この実施例は、IgG2のCH1およびヒンジを含む修飾重鎖定常領域を有する抗体が、IgG1のCH2およびCH3ドメインを含むとき、FcγRに結合することを示す。
可変ドメインによる抗原結合に加えて、抗体は、定常ドメインとの相互作用によりFcガンマ受容体(FcgR)と結合できる。これらの相互作用は、抗体依存的細胞細胞毒性(ADCC)および抗体依存的細胞貪食活性(ADCP)などのエフェクター機能に介在する。エフェクター機能活性はIgG1アイソタイプで高いが、IgG2およびIgG4については、これらのアイソタイプがFcgRへの親和性が低いため、極めて低いかまたはない。さらに、IgG1のエフェクター機能は、FcgR親和性および選択性を改変するための定常領域内のアミノ酸残基の変異により修飾され得る。
抗体のFcガンマ受容体(FcγRまたはFcgR)への結合を、Biacore表面プラズモン共鳴(SPR)およびFortebio Biolayer Interferometry(BLI)を含むバイオセンサーテクノロジーを使用して試験した。SPR試験をBiacore T100装置(GE Healthcare)で25℃で実施した。マウス抗6xHis抗体からのFabフラグメントを約3000RU密度にEDC/NHSを使用してCM5センサーチップ上に固定化した。各種のhisタグ付FcgR(7ug/ml)を、10ul/分で、30秒の接触時間を使用してC末端hisタグにより捕捉し、1.0uM抗体の結合を、10mM NaPO4、130mM NaCl、0.05%p20(PBS−T)、pH7.1のランニング緩衝液で評価した。これらの実験に使用いたFcgRは、CD64(FcgRI)、CD32a−H131(FcgRIIa−H131)、CD32a−R131(FcgRIIa−R131)、CD32b(FcgRIIb)、CD16a−V158(FcgRIIIa−V158)、CD16b−NA1(FcgRIIIb−NA1)およびCD16B−NA2(FcgRIIIb−NA2)を含む。BLI実験をFortebio Octet RED装置(Pall, Fortebio)で、25℃で10mM NaPO4、130mM NaCl、0.05%p20(PBS−T)、pH7.1で実施した。抗体を、プロテインA被覆センサーで非希釈発現上清から捕捉してとり、1μM hCD32a−H131、hCD32a−R131、hCD32b、hCD16a−V158または0.1μM hCD64検体の結合が続いた。
次のセットの構築物を、そうしなければエフェクター機能陰性であるIgG2アイソタイプへのエフェクター機能の改変に使用した。この調査に関して、上記変異をIgG2.3定常領域またはIgG2.3G1−AYと称するIgG2.3/IgG1fハイブリッドに行った(表12)。抗体は、小規模で上清に発現させ、Fortebio Octet BioLayer Interferometryバイオセンサーテクノロジーを使用してFcgRへの結合について試験した。抗体が上清に低濃度で存在したため、実験を、プロテインA被覆センサーを使用して抗体oを上清から捕捉し、その後、溶液でのFcgR検体の結合により実施した。野生型IgG1、SE、P238D、V4およびV12抗体を含む精製および上清対照IgG1fも比較のために包含させ、これらの対照抗体の各々予測されるFcgR結合性を示した(図71)。IgG2.3抗体も予測される結合プロファイルを示し、CD32a−H131へのみ感知できる結合をした。しかしながら、IgG2.3にS267E、L328F、P238D、P271G、H268D、A330R、G237DまたはE233D変異を導入するための全変異は、対応する改変IgG1 mAbのFcgR親和性の再現に失敗した(図71)。対照的に、IgG2.3G1−AY構築物は、野生型IgG1のFcgR結合性を完全に保持し、同時にIgG2.3のCH1およびヒンジ領域を保持することが可能であった。さらに、S267E、L328F、P238D、P271G、H268D、A330R、G237DおよびE233Dを含む全IgG2.3G1−AY変異体は、同じ変異を有するIgG1バージョンmAbと同等なFcgR結合性を示した(図71)。これは、野生型または変異体IgG1のエフェクター機能と組み合わせたIgG2のCH1およびヒンジ領域を有する抗体のエンジニアリングの成功を示す。
GITR発現を誘発するために、細胞を、72時間、37℃で20ng/ml抗CD3+1000ng/ml CD28とインキュベートした。T細胞活性化の別方法として、大バッチの活性化CD4+T細胞を3段階培養プロトコールにより製造した。簡潔にいうと、CD4+T細胞を1μg/ml可溶性CD28添加プレート結合CD3(1.5μg/ml)で、72時間、37℃で刺激し、20u/ml IL−2存在下、14日培養で増大させ、最後に10μg/ml PHA、2u/ml IL−2および1μg/ml CD28を72時間、37℃で添加することにより活性化のさらなるラウンドに付した。刺激T細胞を、384ウェルPDL造影プレートに2時間播種して、細胞を接着させ、15分、4℃に冷却し、次いでAlexa 488標識GITR抗体を別々に1時間添加した。プレートを最後にHCSにより造影し、データを細胞あたりの総強度として報告した。
3つの異なるGITR抗体を、上記T細胞活性化方法を使用して評価している。G1アイソタイプとしてのGITR.6抗体およびFc受容体に結合できない不活性(IgG1.1)アイソタイプ、ならびにIgG1ヒンジの代わりにIgG2ヒンジとのキメラである。
GITR抗体誘発内部移行をCD3刺激CD4+T細胞で、Alexaクエンチアッセイ形式で評価した。新たに得たCD4陽性T細胞を上記条件下インキュベートして、GITR発現を誘発した。刺激後、細胞を新鮮培地に再懸濁し、内部移行アッセイのために次のとおり播種した。細胞を上記抗体とインキュベートし、温培地で洗浄し、37℃で記載する時間インキュベートして、その後固定および消光した。内部移行抗体を0時に観察された小さな消光不可能なシグナルを超える蛍光の増加として測定し、細胞に最初に結合していた総蛍光“非消光対照”に対して正規化した。図72に示すとおり、GITRライゲーションは、各抗体試験で30〜60分にピークの速い内部移行をもたらすのに対し、対照抗体は、原形質膜への局在化を維持することが判明した。結果は、IgG2ヒンジ領域がGITRライゲーション誘発内部移行を増強することを示す。
抗GITRアゴニスト抗体の機構をさらに探索するために、NFkBおよびP38シグナル伝達経路などのT細胞活性化に関与する数シグナル伝達経路をモニターした。
健常ドナー(M6576)からのCD4+およびCD8+T細胞を、プレート被覆0.4μg/ml抗CD3および0.4μg/ml抗CD28で活性可した。3日後、細胞を回収し、シグナル伝達活性化のために384ウェル造影プレートに播種した。細胞をプレート上で2時間定着させた後、抗GITR抗体で15分処理し、シグナル伝達事象をアッセイプレートにホルムアルデヒドを最終10%まで添加することにより停止させた。細胞を次いでシグナル伝達検出のために透過性とし、ホスホロ−p65 NFKB抗体で染色した。図74Aおよび74Bに示すとおり、GITR.6.G2およびGITR.6.G2.G1f抗体は、CD4+およびCD8+T細胞両方で、GITR.6.G1fと比較して高いシグナル伝達応答を有した。内部移行とシグナル伝達経路活性化を結びつける直接的証拠はないが、G2アイソタイプがGITR.6についてIgG1と比較して抗体機能的活性の両方の態様を改善するように見えることに注目することは興味深い。
各抗体のシグナル伝達活性を定量するために、各抗体のEC50およびEmaxの両方を、両パラメータがシグナル伝達事象の完全な程度の捕捉に必須であるため、計算した。GITR.6.G2.G1fの応答レベルを100%対照として、選択し、他の全ての抗体をそれに対し正規化した。抗CD3および抗CD28抗体により活性化したCD4+およびCD8+T細胞集団の両方について表14に示すとおり、効力(EC50)および有効性(Emax%)の両方の観点で、GITR抗体に対して、ある範囲の活性があった。GITR.6.G2、GITR.6.G2.G1fおよびGITR.6.G1fは、約10nM範囲の類似する効力(EC50)を示したが、有効性(Emax)は各種のアイソタイプについてかなり異なり、G1抗体がG2またはキメラアイソタイプほど効率的にシグナル伝達しないことを示唆する。
28F3の重鎖定常領域を有する抗GITR抗体(GITR.6)を製造し、上清を48時間ではなく40時間で回収する以外、実施例25に記載のIL−2産生アッセイにおけるとおり試験した。結果を図76A〜Dに示す。
当業者は、定常的なものを超える実験を使用することなく、ここに開示する具体的実施態様の多くの均等物を認識するかまたは確認することができる。このような均等物は、添付する特許請求の範囲に包含されることが意図される。
Claims (15)
- ヒトグルココルチコイド誘導性TNF受容体(GITR)に結合し、配列番号394のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域、またはそれと1つのアミノ酸置換、付加または欠失により異なる重鎖定常領域を含み、(a)該1つのアミノ酸置換が、配列番号394のアミノ酸位置16、20、21、75、76、82、86、97、100、102、104、および105ではない、(b)該1つのアミノ酸欠失が、配列番号394のアミノ酸位置16、20、21、75、76、82、86、97、100、104、および105ではない、および(c)該1つのアミノ酸付加が、配列番号394のアミノ酸位置16、20、21、75、76、82、86、97、100、102、104、および105のいずれかに隣接していない、抗体。
- (a)配列番号20、21および22をそれぞれ含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列および配列番号23、24および25をそれぞれ含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列;
(b)配列番号33、34および35をそれぞれ含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列および配列番号36、37および38をそれぞれ含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列;
(c)配列番号46、47および48をそれぞれ含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列および配列番号49、50および51をそれぞれ含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列;
(d)配列番号62、63および64をそれぞれ含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列および配列番号65、66および67をそれぞれ含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列;
(e)配列番号62、63および64をそれぞれ含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列および配列番号68、69および70をそれぞれ含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列;
(f)配列番号78、79および80をそれぞれ含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列および配列番号81、82および83をそれぞれ含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列;
(g)配列番号91、92および93をそれぞれ含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列および配列番号94、95および96をそれぞれ含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列;
(h)配列番号106、107および108をそれぞれ含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列および配列番号109、110および111をそれぞれ含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列;
(i)配列番号106、107および108をそれぞれ含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列および配列番号112、113および114をそれぞれ含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列;
(j)配列番号122、123および124をそれぞれ含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列および配列番号125、126および127をそれぞれ含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列;
(k)配列番号138、139および140をそれぞれ含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列および配列番号141、142および143をそれぞれ含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列;
(l)配列番号138、139および140をそれぞれ含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列および配列番号144、145および146をそれぞれ含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列;または
(m)配列番号342〜344をそれぞれ含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列および配列番号345〜347をそれぞれ含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列
を含む、請求項1に記載の抗体。 - 次のものからなる群から選択される重鎖および軽鎖可変領域配列を含む、請求項1または2に記載の抗体:
(a)それぞれ配列番号13および14;
(b)それぞれ配列番号26および27;
(c)それぞれ配列番号39および40;
(d)それぞれ配列番号52および53;
(e)それぞれ配列番号52および54;
(f)それぞれ配列番号71および72;
(g)それぞれ配列番号84および85;
(h)それぞれ配列番号97および98;
(i)それぞれ配列番号97および99;
(j)それぞれ配列番号115および116;
(k)それぞれ配列番号128および129;
(l)それぞれ配列番号128および130;および
(m)それぞれ配列番号335および336。 - 活性化FcγRへの結合が増強されたFcを含む、請求項1〜3の何れかに記載の抗体。
- 第二結合特異性を有する分子に結合した、請求項1〜4の何れかに記載の抗体を含む、二重特異性分子。
- 請求項1〜4の何れかに記載の抗体の重鎖および軽鎖をコードする、核酸。
- 請求項6に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
- (i)請求項7に記載の発現ベクター、または(ii)請求項1〜4の何れかに記載の抗体の重鎖をコードする核酸を含む発現ベクターおよび請求項1〜4の何れかに記載の抗体の軽鎖をコードする核酸を含む別の発現ベクターでトランスフォームされた、細胞。
- 薬剤に結合した請求項1〜4の何れかに記載の抗体を含む、イムノコンジュゲート。
- 請求項1〜5および9の何れかに記載の抗体、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートおよび担体を含む、組成物。
- 請求項1〜5および9の何れかに記載の抗体、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートおよび使用指示を含む、キット。
- 請求項1〜5および9の何れかに記載の抗体、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートを含む、対象における腫瘍の増殖を阻害するための組成物。
- 治療有効量の請求項1〜5および9の何れかに記載の抗体、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートを含む、処置を必要とする対象における癌を処置するための組成物。
- さらに1以上の付加的治療剤を投与することを含む、請求項12または13に記載の組成物。
- 付加的治療剤が抗PD1抗体、抗LAG−3抗体、抗CTLA−4抗体または抗PD−L1抗体である、請求項14に記載の組成物。
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